LEVURES TRANSFORMEES PRODUISANT DU LYSOZYME, PLASMIDES UTILISESPOUR CETTE TRANSFORMATION, ET LEURS UTILISATIONS.
LEVURES TRANSFORMEES PRODUISANT DU LYSOZYME,PLASMIDES UTILISES POUR CETTE TRANSFORMATION,
ET LEURS UTILISATIONS.
La présente invention se rapporte à des levures renques capables,par transformation avec de l'ADN d'origine étrangère, de produire des enzymes du type 1,4-�N-acétylmuramidase.
On sait que les 1,4-p-N-acétylmuramidases sont des enzymes capables de cliver spécifiquement le lien glycosidique qui relie la N-acétylglucosamine à l'acide N-acétylmuramique qui interviennent dans la constitution des peptidoglycanes formant la paroi cellulaire des bactéries. Il en résulte une lyse de celle-ci, ce qui entraîne la mort des cellules. Ces enzymes, plus communément appelées lysozymes, agissent donc comme des bactéricides et il est admis que c'est cette propriété qui explique leur présence généralisée dans la plupart des fluides biologiques des animaux supérieurs. On en trouve en effet, en concentrations variées, dans le sang, les larmes, la salive, le lait, etc... des mammifères. On en trouve également dans le règne végétal, notamment dans le fruit du papayer.
Cependant, c'est du blanc d'oeuf de poule, où il se trouve en quantité relativement importante, que le lysozyme est extrait à l'échelle industrielle par différents procédés d'adsorption et/ ou de précipitation (brevet belge n[deg.] 694.538, 1967).
Les applications actuelles du lysozyme de poule se situent pour une bonne part dans le domaine pharmaceutique où on l'utilise pour lutter contre diverses infections. D'autres applications se situent dans le domaine alimentaire. On sait,par exemple, que le lysozyme peut être utilisé efficacement dans la fabrication des fromages à pâte pressée, cuite, pour empêcher le développement au cours de la maturation de ferments butyriques responsables de défauts de fabrication pouvant aller jusqu'à l'éclatement des meules (brevet français n[deg.] 80 03321,
1981). On peut l'utiliser également pour la préservation de divers aliments périssables, en particulier ceux à base de viande (A.Akashi, Jap.J.Zootechnical Sci. 42, 1971, 289).,
ou des vins (brevet japonais 3115/71,1971) ou du Sake(M.Yajima et al., J.Ferm.Technol.46, 1968, 782). On peut l'employer aussi pour la maternisation du lait de vache (brevet japonais n[deg.] 16780/70, 1970), etc...
Ces différentes applications représentent un marché potentiel considérable dans la mesure où le lysozyme peut être produit aisément, en quantité importante et avec un prix de revient suffisamment faible. Actuellement, les différents procédés permettant de l'extraire du blanc d'oeuf ne sont commercialement acceptables que dans la mesure où celui-ci peut être réutilisé dans l'alimentation après traitement. La capacité de production du lysozyme se trouve donc pour une part conditionnée par le marché du blanc d'oeuf, ce qui pose un problème d'autant plus difficile à résoudre que l'écoulement dans les aliments standardisés du blanc d'oeuf traité se heurte à des difficultés techniques et même, dans certains pays, à des obstacles législatifs.
Ces problèmes liés à la disponibilité des sources naturelles du lysozyme deviennent insurmontables lorsqu'il s'agit de lysozymes de mammifères, soit que leur concentration de départ soit trop faible, comme c'est le cas pour le lysozyme présent dans le lait de vache, soit que la disponibilité de la matière première soit pratiquement nulle comme c'est le cas pour le lysozyme humain. On voit donc qu'il est nécessaire de pouvoir disposer d'une technique permettant de produire du lysozyme en évitant les problèmes mentionnés ci-dessus.
L'objet principal de la présente invention est de fournir des levures rendues capables de produire du lysozyme par les techniques classiques du génie génétique. De manière plus spécifique, il s'agit de levures transformées de manière telle que leur ADN comprenne au moins une copie d'un fragment codant
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trouve exprimé sous forme de la protéine active correspondante. C'est un autre objet de l'invention de fournir des levures ainsi transformées mais également capables d'excréter le lysozyme qu'elles produisent de manière à faciliter la séparation et la purification de celui-ci. Les plasmides permettant d'assurer cette transformation constituent également un objet de l'invention, de même que le procédé permettant de produire du lysozyme par culture des levures ainsi transformées. Ces objets ainsi que d'autres implications et avantages de la présente invention apparaissent plus clairement dans la description détaillée que voici.
Il est connu de reprogrammer génétiquement des levures en les transformant avec un fragment d'ADN porteur d'une partie codante constituée par un gène hétérologue ou par le produit de la transcription inverse de l'ARN messager correspondant. Pour cela, on utilise en général comme vecteurs du fragment en question des plasmides capables de se répliquer de manière autonome dans la cellule de levure grâce à la présence d'une origine de réplication reconnue par la machinerie de réplication de la cellule hôte. Le vecteur doit également comporter un gène marqueur permettant la visualisation et la sélection des cellules qui ont effectivement été transformées
par le plasmide. Enfin, la partie codante doit être précédée d'un promoteur,c'est-à-dire une séquence reconnue par l'ARN polymérase de la cellule hôte de manière à assurer de façon efficace la transcription de la partie codante en ARN messager correspondant.
En pratique, ces techniques ont été surtout appliquées aux levures de l'espèce Saccharomyces cerevisiae pour laquelle un grand nombre de vecteurs d'expression comportant ces diffé- rents éléments ont été construits. Ceux-ci comportent en général l'origine de réplication du plasmide 2-microns présent dans la plupart des souches de cette espèce ou encore un segment de réplication autonome ARS d'origine chromosomique. Comme gène marqueur, on utilise en général un gène codant pour une enzyme intervenant dans la biosynthèse d'un métabolite essentiel, par exemple un acide aminé. Dans ce cas, on utilise comme cellule hôte une souche de levure devenue.,.par mutation,auxotrophe pour ce métabolite.
En cultivant cette souche sur un milieu exempt du métabolite en question, seules pourront se développer les cellules transformées par un plasmide porteur du gène manquant. Les gènes LEU2 ou TRP1 codant respectivement pour une enzyme intervenant dans la biosynthèse de la leucine et du tryptophane sont des exemples types de tels marqueurs. Ces vecteurs d'expression doivent également comporter ou ou de préférence plusieurs sites de restriction où insérer la partie codante intéressante ainsi que les différents éléments nécessaires à l'optimalisation de son expression : promoteurs, terminateurs, et autres éléments de contrôle.
Souvent ces plasmides comportent en outre des séquences bactériennes capables d'assurer leur réplication et leur sélection chez un hôte bactérien intermédiaire, par exemple Escherichia coli. Comme exemples classiques de tels plasmides navettes, on peut citer YEpl3 (J.R.Broach et al. Gene 8,1979,
121),pFLl-4(M.R.Chevallier et al., Gène 11 , 1980,ll),pJDB207(J.D. Beggs,
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pMHl58 et pJO158 (M.Heusterspreute et al., Gene, sous presse).
Selon un mode préféré de l'invention, principalement lorsque la cellule hôte appartient à l'espèce S.cerevisiae, on utilise un plasmide comportant au moins les fonctions
REP de la séquence du plasmide endogène 2-microns. Cellesci apportent en général au plasmide une plus grande stabilité, spécialement si la cellule hôte a été au préalable curée de ses plasmides 2-microns (C.P. Hollenberg, Curr.Top. Microbiol.Immunol. 96, 1982, 119; R.M.Walmsley et al.,Mol.Gen. Genet. 1983, 361). Des exemples classiques de tels vecteurs sont les plasmides pJDB219 et pJDB248 (J.D.Beggs, Nature 275,
1978, 104). Un autre vecteur de ce type est décrit dans les exemples qui suivent.
Enfin, pour assurer à la partie codante intéressante un niveau d'expression aussi élevé que possible, il est nécessaire de lui associer un promoteur aussi efficace que possible.Divers promoteurs forts sont connus chez la levure, notammant le promoteur de l'alcool déshydrogénase (ADHl),de l'énolase (EN08 et EN046), de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
(GAP63 et GAP491), de la phosphoglycérate kinase (PGK)
(M.J.Dobson et al., Nucleic Acids Res.10, 1982, 2625), de la phosphatase alcaline (PH03 et PH05) (Brevet européen 0100561, Al, 1984) ou encore le promoteur _p.415 dont il sera question plus loin.
Ces différentes techniques qui ont été appliquées avec succès au clônage et à l'expression de nombreux gènes hétérologues dans la levure peuvent être évidemment mises à profit pour assurer l'expression dans celle-ci de gènes de lysozymes
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midase. Des exemples de constructions particulières sont donnés à titre d'illustration dans le présent brevet mais il est évident qu'il existe beaucoup d'autres possibilités et que diverses combinaisons d'origines de réplication, de gènes marqueurs, de promoteurs efficaces et d'autres éléments de structure peuvent être mises en oeuvre pour arriver à des résultats similaires. Les cellules transformées obtenues dans ces différents cas doivent dès lors être considérées comme comprises dans le domaine de la présente invention.
De même, bien que la plupart de ces techniques aient été surtout appliquées à la transformation de la levure
S. cerevisiae, les cellules transformées obtenues au départ d'autres espèces et genres de levures susceptibles d'être transformées par des vecteurs d'expression du type de ceux renseignés ci-dessus et de leurs variantes font également partie de la présente invention. Comme exemple d'autres le- vures, on peut citer Saccharomycopsis lipolytica,Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, etc... Toutefois, selon un mode préféré de l'invention, on utilisera comme cellules hôtes des levures transformables du genre Saccharomyces et de préférence celles appartenant à l'espèce S.cerevisiae. Comme exemples de souches transformables appartenant à cette espèce, on peut citer AH22 et GRF18 parmi bien d'autres.
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rentes sortes de levures conformément à la présente invention peuvent avoir des origines diverses. Il peut s'agir, par exemple, du lysozyme de poule qui, comme on l'a dit ci-dessus, est déjà produit industriellement. Cependant, il est évident que des parties d'ADN codant pour des lysozymes d'autres sources peuvent être exprimées de la même façon dans la levure, ceci d'autant plus que ces différents lysozymes présentent entre
eux, à des degrés divers,des homologies très marquées
(P.Jollès et al., Mol.&Cell.Biochemistry 63,1984, 165). On peut par exemple exprimer dans la levure le lysozyme d'oie dont l'activité spécifique est nettement plus élevée que celle du lysozyme de poule (R.C.Canfield et al.,in Lysozyme, Ed.E.F. Osserman et al., Académie Press 1974,p.63). Il en va de même pour le lysozyme humain, également très actif et particulièrement indiqué pour les usages pharmaceutiques ainsi que pour la formulation des laits maternisés. On peut citer encore le lysozyme de papaye ou celui codé par les virus bactériens.
Lorsque, conformément à la présente invention, une souche de levure a été amenée par manipulation génétique à produire du lysozyme de l'une ou l'autre origine, il est nécessaire, pour tirer parti de cette propriété nouvelle, de la multiplier par fermentation dans les conditions les plus favorables à sa croissance. On obtient ainsi une biomasse qui, telle quelle, peut trouver des applications dans l'alimentation animale ou humaine. On sait, par exemple, que les autolysats de levure sont de plus en plus utilisés comme additifs dans divers aliments (pâtés de viande, soupes, sauces, etc..), non seulement en raison de leur valeur alimentaire propre,mais ) aussi de leurs propriétés organoleptiques.
La présence de lysozyme dans les levures de départ présente l'avantage de préserver dans une certaine mesure les autolysats de la contamination bactérienne dont ils sont facilement l'objet ainsi que les produits alimentaires auxquels ils sont incorporés. On sait d'autre part que la présence de lysozyme permet de réduire la température de stérilisation des aliments (brevet britannique
n[deg.] 1.438.560, 1976).
D'autre part, les levures conformes à la présente invention peuvent être également utilisées comme source de lysozyme purifié, par séparation de celui-ci d'avec la levure ellemême. Il est clair cependant que cette opération peut présen� ter des difficultés considérables si le lysozyme se trouve associé, à l'intérieur de la cellule, aux autres protéines de celle-ci. C'est donc un aspect important de la présente invention de fournir des levures capables d'excréter-le lysozyme qu'elles produisent, que celui-ci se trouve libéré dans le milieu de culture d'où il pourra être récupéré par des méthodes
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vet belge n[deg.] 694.538, 1967), ou qu'il reste associé à la paroi de la levure d'où il devra être détaché par d'autres méthodes. De fait, nous avons constaté, et ceci constitue en soi un fait surprenant, que la séquence signal de 18 acides aminés présente à l'extrémité N-terminale du prélysozyme et qui permet la sécrétion de la protéine dans le lumen du réticulum endoplasmique des cellules de l'oviducte de poule est également reconnue par les cellules de levure. Les exemples qui suivent montrent en effet que lorsque l'ADN codant pour le prélysozyme de poule est exprimé dans la levure, le produit de cette expression est excrété par celle-ci.
Il en résulte qu'il suffit de fusionner le fragment de 54 nucléotides codant pour cette séquence signal avec l'ADN codant pour la partie structurale d'autres protéines, en particulier le lysozyme d'autres origines, pour que cellesci, une fois produites dans la levure, soient également excrétées.
Mais l'aspect le plus fondamental et le plus inattendu / de la présente invention est le fait qu'un gène de lysozyme puisse être exprimé dans la levure sans y exercer d'effet léthal, notamment par lyse des cellules. Le seul exemple connu de clonage et d'expression d'un gène de lysozyme dans une cellule hétérologue est celui du gène de lysozyme de poule dans des lignées de cellules humaines Hela et MCF-7 (P.D.Matthias et al., The EMBO J. 1, 1982, 1207), encore que l'expression du gène
n'y ait été mise en évidence que par la production de l'ARN messager correspondant et non de la protéine elle-même. Aucun exemple d'expression d'un gène de lysozyme dans une bactérie
n'a été rapporté à ce jour, ce qui peut s'expliquer par le fait que le lysozyme produit par la bactérie devrait normalement provoquer la lyse de celle-ci. Or, il est connu que le lysozyme est capable également d'attaquer la paroi des cellules de levure, principalement par hydrolyse de sa composante chitinique (G.N. Maksimova et al., Prikl.Biochim.Mikrobiol. 18, 1982, 529).
Comme on sait que le bourgeonnement des levures s'accompagne de
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la cellule-mère, on pouvait s'attendre à ce que la production et l'excrétion du lysozyme par les cellules de levure n'entraîne de graves altérations de leur fonction multiplicative. On pouvait s'attendre également à ce que la régénération de la paroi au départ de protoplastes après transformation de ceuxci ne s'en trouve compromise. Il est donc surprenant que par les techniques classiques du génie génétique, on puisse amener les levures non seulement à exprimer un qène de lysozyme mais encore que les cellules ainsi transformées puissent produire
et excréter celui-ci tout en se multipliant de manière active.
Ceci apparaîtra clairement dans les exemples qui suivent. Notons que ceux-ci sont donnés uniquement à titre d'illustration, toute autre construction conduisant à la production
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levure étant considéré comme faisant partie de la présente invention.
COURTE DESCRIPTION DES FIGURES
Pour les exemples donnés ci-après on se réfère aux dessins annexés dans lesquels :
La FIG.l représente la construction du plasmide plys5 qui sera ensuite utilisé pour la reconstruction du cADN complet du lysozyme de poule. Pour réaliser cette construction, on est parti du cosmide pFF2-lys-16 contenant un insert de 40 kb comprenant le gène entier de lysozyme. Un fragment HindIII de 2,1 kb comprenant le premier exon de ce gène a ensuite été in-
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La FIG.2 montre comment le cADN complet du lysozyme a été reconstruit au sein du plasmide plyslO par ligation d'un fragment AccI-HgaI provenant de plys5 et contenant l'extrémité 5' terminale du gène de lysozyme avec deux autres fragments provenant du plasmide pBR-lys-1 et contenant le reste du cADN de lysozyme.
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lysozyme débarrassé, par digestion avec l'exonucléase Bal31, de la partie non traduite de sa région 5' terminale.
La FIG.4 représente la construction de vecteurs d'expression du lysozyme par ligation univoque de fragments purifiés provenant des plasmides
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d'E.coli traitées à l'EDTA pour les rendre sensibles à l'action du lysozyme.
La FIG.6 représente la construction du plasmide YEpB2 par ligation de fragments obtenus par action de l'enzyme de restriction PstI sur le plasmide pBR322 et sur le plasmide endogène 2-microns de la levure.
La FIG.7 représente la construction du vecteur d'expression du lysozyme plys50 par ligation univoque de cinq fragments purifiés obtenus au
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EXEMPLE 1
1.1 Construction d'un clone de cADN complet de lysozyme de poule plyslO
La construction d'un clone complet de cADN a d'abord été effectuée au départ de deux clones différents: pBrlys-1 contenant le cADN de lysozyme de poule dépourvu d'une partie de son extrémité 5'(P.Balducci et al,Nucleic
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génomique de poule comprenant le gène entier du lysozyme introns compris (P.Balducci et al.Nucleic Acids Res.9,
1981,3575)(FIG.1). Aucun de ces deux clones ne convient pour assurer l'expression du lysozyme dans la levure puisque celle-ci est incapable de procéder à la maturation du produit de la transcription des gènes d'eucaryotes supérieurs (J.D. Beggs et al.,Nature 283, 1980, 835).
On pouvait envisager cependant de reconstruire un clone de cADN complet en combinant l'extrémité 3' du cADN incomplet disponible avec l'extrémité 5' du gène complet; on sait en effet, grâce aux données publiées (P.Balducci et al. 1979, réf.cit.; A.Jung et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77, 1980,
5759; M.Grez et al.,Cell 25, 1981, 743) que le gène entier ne comprend pas d'introns dans la région 5' correspondant à la partie manquante du cADN. On a dès lors sous-clôné un fragment d'ADN de 2,1 kb du cosmide pFF2-lys-16 dans pEMBL8 (L.Dente et al., Nucleic Acid Res. 11, 1983, 1645), ce qui a donné le plasmide plys5 (FIG.l). Ce clône contient l'exon 5' proximal complet du gène de lysozyme.
Un site HgaI convenablement situé est présent dans la région commune à plys5 et au clone pBR-lys-1 de cADN. Une triple ligation faisant intervenir les fragments HgaI-
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de plys5 a permis la construction d'un clône (plyslO) contenant le gène entier de lysozyme, y compris le codon d'initiation ATG, mais sans introns (FIG.2). , 1.2 Raccourcissement de la partie non traduite de la région 5' du gène de lysozyme.
La partie non codante de la région 5' du gène de lysozyme présent dans le plasmide plyslO a été supprimée par ouverture du plasmide à l'endroit du site de restriction unique AccI et digestion avec la nucléase Bal31.0n obtient ainsi une population de plasmides raccourcis qui ont ensuite été clivés au site unique PstI; les fragments compris entre le site PstI et l'extrémité digérée par Bal31 ont été insérés entre les sites PstI et SmaI du plasmide YEpZlOO ,comme décrit dans le brevet belge déposé ce jour par la demanderesse et intitulé "Promoteurs assurant l'expression de gènes étrangers chez la levure,plasmides comportant ces promoteurs et leurs utilisations pour la production de polypeptides".
La conséquence de cette opération est triple : (1) la partie non traduite de la région 5' précédant le codon ATG du lysozyme est supprimée, (2) les sites AccI et SmaI sont détruits et (3) un site BamHI aisément manipulable (immédiatement adjacent au site Smal dans YEpZlOO) se trouve attaché au commencement du gène de lysozyme. Le
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1.3 Construction des vecteurs d'expression du lysozyme.
Le cADN complet du lysozyme se trouve maintenant situé entre un site unique BamHI à son extrémité 5' et un site unique SphI à l'extrémité 3'. Puisque ce cADN comporte son propre codon d'initiation ATG,sa fusion avec un promoteur exempt d'ATG et terminé par un site BamHI devait donnerune unité d'expression fonctionnelle qu'il ne restait plus qu'à associer dans un plasmide à l'origine de réplication etau
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et la sélection dans E. coli ) ainsi qu'àl'origine de réplication du 2-microns et du gène LEU2(pour la réplication et la sélection dans la levure).
Cette construction a été réalisée par ligation simultanée des cinq fragments suivants : (a) un fragment <EMI ID=16.1>
tant le cADN complet du lysozyme; (c) un fragment EcoRISphI provenant du plasmide pKOl (K.McKenney et al.,in Gene amplification and analysis, Ed.J.G.Chirikjan & T.Panas, Elsevier/North Holland,N-ew York,1981 p.383) pour servir de jonction entre le fragment (b) et le fragment (d) ci-après;
(d) un fragment PstI-EcoRI provenant du plasmide YEpZ415 comportant l'origine de réplication et la moitié du gène <EMI ID=17.1>
de pJDB207 comprenant le segment 2-microns-LEU2 et l'autre moitié du gène de &-lactamase. Avant ligation, ces différents fragments avaient été purifiés et comme ils comportent des bouts collants différents et complémentaires les uns des autres, un seul plasmide viable pouvait résulter de l'opération : plysÀ29 (FIG.4).
En procédant de la même façon avec deux autres fragments dérivés par délétion du promoteur p415 (p415�4 et p415A4), deux autres plasmides furent obtenus : plysà49 et
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par le fait que la promoteur s'y trouve positionné à des distances variées du cADN de lysozyme, ce qui au niveau de la transcription doit se traduire par des distances différentes entre le début (l'extrémité 5') des ARN messagers correspondants et le site naturel AUG de départ de la traduction de ceux-ci.
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Les plasmides construits comme décrit ci-dessus ont ensuite été utilisés pour une transformation de la souche GRF18 (Leu-,His-) de la levure- S.cerevisiae suivie d'une sélection des clones prototrophes pour la leucine (Leu+).
Ceux-ci furent ensuite broyés avec des billes de verre et les broyats obtenus furent clarifiés par centrifugation.
L'activité lysozymique de ceux-ci fut testée en mesurant la décroissance de la densité optique d'une suspension
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1970,639). Dans la FIG.5, les valeurs initiales de l'OD650 étaient identiques pour chaque clone (0,7), mais pour plus de clarté, elles ont été décalées sur le diagramme. Les résultats de la FIG.5 dé-
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tats similaires furent obtenus avec une méthode où les cellules utilisées comme indicateur de l'action du lysozyme sont celles de la bactérie Micrococcus lysodeikticus (G.Alderton et al.,J.Biol.Chem.157,1945,
43).
Dans un autre type d'essai,le lysozyme put être mis en évidence autour de colonies transformées se développant sur boite de Petri recouvertes d'un tapis de M.lysodeikticus. Dans ce cas, l'expression était visualisée par un halo transparent de bactéries lysées autour des colonies. En accord avec les résultats obtenus au départ de broyats exempts de cellules, le halo de lyse était le plus marqué dans
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producteur de lysozyme. Ce résultat témoigne également de ce que le lysozyme est exporté de la cellule de levure puisqu'il doit nécessairement être extra-cellulaire pour pouvoir lyser l'indicateur bactérien. EXEMPLE 2
2.1 Construction du vecteur d'expression du lysozyme plys50.
Le vecteur pJDB207 sur lequel sont basés les vecteurs
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ne contient pas le plasmide 2-microns entier de la levure et par conséquent dépend de la présence de celui-ci (que l'on trouve dans la plupart des souches de S.cerevisiae) pour se maintenir dans la cellule transformée. Ceci conduit à une situation instable telle que les plasmides du type pJDB207 sont fréquemment perdus par la cellule
(E.Erhaert & C.P.Hollenberg, J.Bacteriol.156, 1983, 625:
M.Jarayam et al. Cell 34, 1983, 95). Au contraire, le plasmide naturel 2-microns se maintient et se transmet de ) manière stable. On sait d'ailleurs que les plasmides construits de telle sorte qu'ils contiennent la totalité du plasmide 2-microns, par exemple le plasmide pJDB219,se maintiennent de manière beaucoup plus stable que ceux du type pJDB207 (C.P.Hollenberg, Curr.Top.Microbiol.Immunol.
96, 1982, 119; R.M. Walmsley et al., Mol.Gen.Genet. 1983,
361).
Ces plasmides sont dès lors plus avantageux pour des cultures de longue durée, en particulier dans les fermentations industrielles.
Pour construire un tel vecteur à base du 2-microns complet, on est parti du plasmide YEpB2 (FIG.6) obtenu antérieurement par ouverture du plasmide 2-microns entier à son site unique PstI et clonage du fragment obtenu dans le site PstI, également unique, de pBR322. Deux fragments produits au départ de YEpB2 et deux autres au départ de plysA49 furent alors combinés pour donner le plasmide plys50 (FIG.7). Dans celui-ci, les trois gènes A, B et C du 2-microns sont intacts et l'expression de la partie codant pour le lysozyme y est assurée par le promoteur p415�4 comme dans le plasmide plysA49 décrit dans l'exemple précédent.
2.2 Expressions du lysozyme par le vecteur plys50.
Après transformation de la souche GRF18(Leu-,His-) de S.cerevisiae par les plasmides plys50 et pJDB207, les cellules transformées obtenues dans les deux cas ont été séparément mises en culture dans un milieu minimum additionné d'histidine (0,002%). Quand les cultures ont atteint la phase stationnaire (poids sec des cellules : environ 1,5 g/1 de culture), les cellules ont été séparées du milieu de culture par centrifugation, remises en suspension dans un tampon phosphate 0,1 M pH7 et broyées au moyen de billes de verre. L'activité lysozymique dans le surnageant et le broyat des deux cultures a été déterminée par leur capacité de lyser les cellules M.lysodeikticus, suivant la méthode de D. Shugar (Biochem.Biophys.Acta, 8,
1952, 302).
Aucune activité lysozymique ne put être mise en évidence dans le cas de la souche transformée par le plasmide pJDB207. Par contre, dans celui de la souche GRF18(plys50), une activité de 162 unités par ml de culture a été détectée avec la répartition suivante : 44 unités associées aux cellules et 118 unités en solution dans le milieu.
En dosant les protéines totales par la méthode de D.Herbert et al.(Methods in Microbiol. 5B, 1971, 209)modifiée selon C.Wang et R.L.Smith (Anal.Biochem. 63, 1975,414) et compte tenu de l'activité spécifique du lysozyme purifié commercial (Boehringer Mannheim), on a pu déduire que le lysozyme produit par la levure dans ces conditions représente environ 1 % des protéines solubles de la levure.
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Baarn, Pays-Bas (Laboratorium voor Microbiologie, Technisch
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REVENDICATIONS
1) Levure transformée caractérisée en ce que son ADN comprend
au moins une copie d'un fragment codant pour une
1,4- p -N-acétylmuramidase et que ce fragment s'y trouve exprimé sous forme de la protéine active correspondante.