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MÉMOIREDESCRIPTIF
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OttOWt A L'AfUt 0*UN < CtMANTZ ON- . :'. - \ BREVET D'INVENTION . 1,, I
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popqmaa PAPI
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i SIGMA-TAU INDUSTRIE FARMACEUTICHE RIUNITE S. p. A. pour Procédé et compositions pour combattre la croissance de tumeurs.
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Demande de brevet aux Etats-Unis d'Amérique n'417179 du 13 septembre 1982 en faveur de A. L. SHUG.
.
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La présente invention concerne un procédé pt des compositions pour combattre la croissance de tumeurs.
Plus spécifiquement, l'invention concerna un procédé et des compositions qui favorisent une diminution de la dimension des tumcurs établies.
Il y a plus de 50 ans, Otto Warburq a decouvert que les cellules des tumeurs malignes convertissant
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=',",.'' le gludise en acide lactique besucoup plus rapidement que la plupart des cellules normales, c'est-à-dire que la glycolyse constitue leur principale source d'énergie--,, de croissance ("effet Warburq"). (O. Warburg, Thé Prime Cause and Prevention of Cancer, Triltach, Wurzburg, J
Allemagne, 1967, pages 6-16, Biochem. Z. 142, 317 -ris23)).
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Plus récemment, Racker et al. ont mis AD évidence une haute activité d'ATPase (ATP p Pi) dans le tissu tumoral et ont avancé l'hypothèse j ., 1 qu'une augmentation de l'ATPase est nécessaire pour la haute activité glycolytique. dea cellules tumorales du fait que l'hydrolyse de l'ATP en ADP + Pi est connue comme étant l'acte cinétique limitant la vitesse de consommation du glucose (Racker, E. et Spector, M. Science 213,303 (1981 . Par'conséquent, bien que la découverte de Racker et al. confirme "l'effet wrburq", la raison pour laquelle la glycolyse aérobie dans les cellules tumorales est très rapide n'a pas été élucidée.
Ln Demanderesse a découvert à présent que la croissance des tumeurs peut être combattue avec succès par administration de quantités relativement importantes de L-carnitine à un animal porteur de t time, urs.
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"\
La Demanderesse a découvert aussi que la croissance des tumeurs malignes in vitro peut être reprîmes par la présence de la L-carnitine.
LaDemanderesseadécouvertenoutrequesi La L-carnitine est administrée à un animal ou utilisée
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ciann un milieu in vitro conjointement avec la cystein, 1,, répression et la rétrogradation reelle ac la crcis- .. < ) n'r ut d l. t forin. tttt) des t. umc'ur. s f-'t-'t tftu\ht i. tvrpr tqi-t-s.
Il est bit-n connu que la L-r. trnttin'' < st ; yn-
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@ thétisée normalement chez l'homme dans le foie et les reins à partir de la lysine et de la méthionine ; qu'elle est apportée au muscle cardiaque, aux muscles 1 du squelette et aux autres tissus par le courant san-
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guin et que sa fonction principale est de faciliter, l'ox'uationdes acidoa graa dana lea mitochondnes ! (Fritz, I. B. Physio. Rêva. 41, 52 (1961)).
Il est connu aussi que la stimulation de l'oxydation des acides gras par la carnitine est assurée par l'action.' conjointe de la carnitine transférase I, de la carni- tine tranalocaae et de la carnitin transférase II, parce que l'acyl-CoA n'est pas à même de traverser la membrane interne des mitochondries (Bremer, J., Trends in biochemical Science, 2 207, (1977)).
Bien que l'explication théorique ci-après ne soit pas à envisager comme limitant la validité de l'invention, l'hypothèse avancée est que du fait que les cellules tumorales nécessitent une glycolyse rapide
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pour leur croissance et que du fait que la carnitinel - 1 stimule l'oxydation des acides gras, une administration de carnitine en quantités élevées pourrait forcer les cellules malignes à consommer les acides gras comme sources d'énergie, ce qui pourrait prévenir cette glycolyse et avoir des effets nuisibles pour ces cellules tumorales.
Il est apparu que le métabolisme des acides gras stimulé par la carnitine pourrait être nuisible pour ces cellules de trois façons possibles. i. Si l'aptitude à oxyder les acides gras en C02 et li20 est diminuée, mais si l'activité de la car-
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nitine transfeirase est normal , une activation . iccruc de acides qras pourrait conduire une . tccumution d'acyl carnitLne à lonquc chaine er (.) f CoA estf'r d'acides rns (dont-la pré;ence' < 'tt, t'H'r\t' < nd l'ischémie, voir Shu'), A.).. e < Al.. Arch. hiochem. t'iophys.
If 7. 25, (78)'). 't-'
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produits ac sont révélés inhiber un certain nombre de systèmes des mtochondrle8 et pourraient lyser les membranes des mitochondries et des cellules en raison de leur puissant effet détergent (Shug
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A. L., Texas Reports on Bio. and Med. 39, 409 ; (1979) ; Powell, G. et al. J. Cher. 256.
12740 (1981)).r'J 2. Comme l'actlvatin dt'sacidesoras consommo,'de l'ATP et produit.-MP + PPi + acyl CoA, l'acti-j *IV vat'ion des acides gras stimulée par la carnitin dans les cellules tumorales, où l'oxydation a été ralentie, devrait conduire a une baisse du taux d'ATP, à une baisse de la formation d'ADP+P1 par l'ATPasc et à une baisse de la glycolyse.
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3. L'oxydation des acides gras atimulée par la carnitine peut 'trt.-favorable aux ceHules normales (huq, A. L. et al., Acaumc Press, NY. NY, Carnitine Bioaynthesis. Metabolism and Functions, paqfs 321-340 (1980)) en stimulant leur métabolesme produisant de l'énergie et en produisant une plus grande quantité d'ATP, ce qui rend disponible une plus grande quantité d'énergie pour la synthèse des substances anti-tumorales, par exemple l'in- terféron. Ceci, en association avec l'accroissement connu de l'apport de sang au tissu tumoral etl'absorptionaccruedesubstratscaractéristiques des ce]lules tumorales, a pour effet que la
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c.'tmn adminmtrcf en doses élevées devrait rt d-truirt-les cellules tumorales.
!..'r) Vt.'ntion est illustrée par les exemples ru t'unît-.
1. \ 1 MILl - '.))):'Jt-f'exemples ci-aprt's. on ndmintri-i L'aritte cie la 't'' < ))t ')n uu . torft)delab.'t. ')tht < t :' < 't ) Mt < rf !' t. On odnufntrc In D-carnltlnc .'t"'t.'rt
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sous forme de la base libre.
On utilise des femelles de rats SpragueDawles développant spontanément une tumeur mammaire' bénigne bien encapsulée (ces tumeurs sont considérées
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comme étant des f1broadénomes classïquea'formés de h, j' t- !'fizz noeuds et de faisceaux de collagène dense). On choi,ait six animaux portant des tumeurs de différentes jj) . 1 1 dimensions pour chaque groupe qu'on soumet au traite ment. Tous les animaux reçoivent un aliment r 1che l' ! en gra1sse..'i. r On infecte aux six animaux d'un groupe i. p.
1 3 q/kg de L-carnitine deux fois par jour. On administre une dose semblable de D-carnitine aux six animaux d'un second groupe. On administre aux six animaux d'un troisième groupe 3 g/kg de L-carnitine et 1 g/kg de cystéine, deux fois par jour. On poursuit les in-
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jections dans chaque cas pendant 25 jours en évaluant 1 la dimension de la tumeur aux jours 8, 15, 9,22 et 25. On observe les animaux pendant encore 17 Jours et on évalue la dimension des tumeurs au 36e jour et au 43e.
Les résultats sont rassemblés au tableau ci-après.
TABLEAU 1
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<tb>
<tb> Dimension <SEP> moyenne <SEP> des <SEP> tumeurs <SEP> (mm)
<tb> Jour <SEP> Témoin <SEP> L-carnitine <SEP> L-carnitine
<tb> + <SEP> L-cystéine
<tb> 1 <SEP> 38, <SEP> 1 <SEP> 41, <SEP> 9 <SEP> 25, <SEP> 4
<tb> 8 <SEP> 36, <SEP> 1 <SEP> 36, <SEP> 8 <SEP> 24, <SEP> 4
<tb> 15 <SEP> 36. <SEP> 1 <SEP> 36. <SEP> 8 <SEP> 24. <SEP> 4
<tb> 19 <SEP> 39. <SEP> 1 <SEP> 33, <SEP> 0 <SEP> 20, <SEP> 1
<tb> 22 <SEP> 39, <SEP> 1 <SEP> 33,0 <SEP> 20, <SEP> 1
<tb> 25 <SEP> 42, <SEP> 2 <SEP> 35, <SEP> 6 <SEP> 19,1
<tb> Evolution <SEP> moyenne <SEP> de <SEP> la <SEP> tumeur <SEP> :
<tb> 4, <SEP> 1 <SEP> (6, <SEP> 4) <SEP> (6. <SEP> 4)
<tb>
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4. 1 Pourcentage d'évolution ;
1 +0, 66% -15,15% -25, 0% Traitement interrompu au jour 25 :
36 62, 2 35,6 19, 1
43 63,5 38, 1 20,1 Evolution de la tumeur du jour 1 au jour 43
25,4 (3, 8) (5,3) Pourcentage d'évolution : +66,6% -9.09% -21, 0%
Il ressort de manière évidente des données ci-dessus que la carniine, administrée seule ou conjointement avec la cystéine, est efficace pour réduire la dimension des tumeurs.
Il convient de noter également qu'à une dose injectée (i. p.) de 3 q/kg de poids du corps, on observe destauxdeL-carnitinedansleplasmasupérieursà 15mM. Comme la demi-vie de la carnitine dans le plasma n'est que d'environ 30 minutes, il est apparent que des
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c) ncntrat. ons en cnrnitine de lOmM, telles qu'clles cl.-ins le !,, exemples, cl-.-àprès, peuvent itre u'mp.-'rtance clinique, en particulier du fait que dans l'exemple l deux injections de carnitine à raison de q/q d''poids du corps ont été effectuées quotidicn- nement aux rats pendant une longue durée sans effet nuisulaobservable.
EXEMPLE2-
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On tnjecrc respectivement dû la L-carnitinc ''-).') -c.') retint.'. dr. t\''-o de ratft Spr. u- . ('' ; rt. n) I.'t ; nt'-mt.- tumeur m ;) rr.. M. r < : que d-'m l'c'xc'm- : ..-n njtC'e.-tux lntn-. tux tmins une slutcr. i t ('1 i 1 1- (-, i r ri i i à n4, o., t 1-. 1)-r ; j r r i t i n e i. p. (--r 1 (-,- 1 ti., i i t t,- : i ri 1 1 (lut't-- (1. t 11 r 1, t X 1 In 1-1 (1 (C% n 1 tl t t"1 0 1. 1 ;'...' '. ') tqu . r.. it\ tH 'ntqjL'. 1 mular). On in- '''t.'t- < *''rni ! tn'''. 1 h-rnitin ? t. p. < -'n 1 < '.
)"'n't'' ; titom'"'i. th. ' l' < \') n)'t ( l (on in)''')' !. < 'tfn ! tn''n ) ! tfY)' u.'nttt < Ut L < i [.-C'ttn) tt. < ).
( : t.'. utt i < r'. injrrttn (.) < ' jour on jour u' ;') L :''. tj Jt. Ia r, t l, firs t. ur on Jour J tX J
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28e jour. On mesure les tumeurs juste avant le début du programme d'injection et au terme de la période de 28 jours, les résultats étant rassemblés au tableau 2.
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TABLEAU 2 il''/ 1,
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<tb>
<tb> Dimension <SEP> des <SEP> tumeurs
<tb> Rat <SEP> Etat <SEP> initial <SEP> Etat <SEP> au <SEP> jour <SEP> 28
<tb> Témoin <SEP> 76,2x63, <SEP> 5 <SEP> mm <SEP> 215,9 <SEP> x <SEP> 154,2 <SEP> mm
<tb> l-carnitine <SEP> injectée <SEP> 38,1x25,4 <SEP> mm <SEP> 76,2 <SEP> mm
<tb> 55, <SEP> 9x63, <SEP> 5 <SEP> mm
<tb> D-carnitine <SEP> injectée <SEP> 101, <SEP> 6xlOl, <SEP> 6mm <SEP> 166,
9 <SEP> mm
<tb>
L'examen à vue des f1broad8nomee disséqués sur les femelles de rat ayant reçu la L-carnitine révèle que les tumeurs sont très molles, de couleur brunâ- tre et exemptes des signes de croissance lobulaire toujours observés sur les fibroadénomes disséqués chez les animaux témoins. De plus, les fibroadénomes des animaux ayant reçu la L-carnitine accusent des taux exceptionnellement élevés en carnitine libre et carnitine estérifiée.
De surcroît, l'examen pathologique des tumeurs chez les animaux traités révèle que dans trois cas sur quatre, le tissu de la tumeur est mort.
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EXEMPLE 3-
On évalue les effets de différentes concen- trations en L-carnitine et D-carnitine sur la prolifération de la lignée cellulaire VACO 5 du cancer intestinal humain dans des cultures de tissu suivant les modes opératoires habituels (Symposium- (livre) Progress in Clinical and Riological Research, volume 48.
"Cloning of Human Tumor Stem Cells", par S. E. Salmon, Publisher-Arthur R. Liss Inc., New York. panes 332- 338). On ajoute la L-carnitine et la D-carnitine au
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milieu de croissance pour atteindre les concentrations indiquées au tblenu 3. Les résultats sont éaalement indiquées au tab. donnés au tabLuu 3.
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TABLEAU 3
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<tb>
<tb> Traitement.. <SEP> Taux <SEP> de <SEP> croissance <SEP> Effet
<tb> Néant <SEP> (témoins) <SEP> 95
<tb> L-carnitine <SEP> 5mM <SEP> 26 <SEP> 73% <SEP> d'inhibition
<tb> 1mM <SEP> 40 <SEP> 58% <SEP> "
<tb> 0,1mM <SEP> 52 <SEP> 45%
<tb> D-carnitine <SEP> 5mM <SEP> 92 <SEP> pas <SEP> d'inhibition
<tb> lmM <SEP> 95 <SEP> pas <SEP> d'inhibition
<tb> O, <SEP> lmM <SEP> 113 <SEP> 19% <SEP> de <SEP> stimulation
<tb>
* On mesure la croissance d'après le nombre des colo- ; nies qui apparaissent
La Demanderesse a aussi observé lors d'études in vitro sur des cellules tumorales que la présence j o'. cides gras à longue chaîne, par exemple l'acide pal- mitique, acide myristique, l'acide oléique ou l'acide st :
arlquc, dans le milieu de croissance augmente le pouvoir inhibiteur de la la L-carnitine sur la proli-
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fération des cellules tumorales, comme il ressort de l'exemple ci-aprus.
EXMPn 4On prepare une suspension de cellules isolées
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SKCO qui est une lignée de cellules de tumeur du côlon, 1 tumeur du c6lon, ( t n njoute à des aliquotep de la suspension de la lI . m-nlllne et de la L-carnltlne aux différentes concrntttns * : péc\fiecs au tablcu . On (t.) le les f) ll- - ! Ut' < t=.. ilor sur oroc molle dans dca pluo rt cupule. ** ,, on m'-'t. le tout à incuber pour permettre la romsnce (1\' iules. On utllise t-rois cupules pour chaque traitm'nt. On évalue les r < : sult. its en àfinomnrant lt'S COlnt-'n ui se sont formées c ns chaque cupulr et en - m,) y c n r. c uoç t r o i -, e x pç'-r i e n c, donrr'.-, ci-. iprt-s.
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TABLEAU 4
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Croissance en % du témoin Croissnce (nombre df-colonifs moyenne sous traitement) (nombre de (nombre de colonies Traitement colonies) du témoins) 1. Témoin 152.. - 1. Témoin 152 2. 10 mM D-carnitin 294 183axe 3. 1 mM D-carnitin 231 143% 4. O, lmM D-carnitin 245 152% 5. 10 mM L-carnltlne 97 60X.
6. 1 mM L-carnitin 190 1121% 7, O, lmM L-carnitin 182 113% 8. Témoin 170
La croissance moyenne est la moyenne au nombre réel de colonies trouvées dans les trois cupules pour chaque traitement. Le pourcentage de croissance par rapport au témoin indique le degré de croissance atteint lors des expériences avec carnitine en comparaison des expériences témoins. On calcule ce pourcentage en divisant la croissance moyenne pour chaque traitement par 161 (croissance moyenne pour les deux témoins).
Il ressort de manière évidente des résultats
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\.ci-dessus que la D-carnitin stimule la croissance à toutes les concentrations tandis que la L-carnitine conduit à une baisse de l'efficacité de clonage qui est fonction de ? la quantité croissante de L-carnitine.
EXEMPLE 5
On prépare une suspension de cellules SKCO1 comme dans l'exemple 4. On ajoute à des aliquotes de
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la suspension de cellules de la L-carnitine. de l-a D-carnitin et d de plmitiqe isolcnt c des combinaisons de L-carnitine ou de D-carnitin avec cle l'acide palmitique en les différentes concentration ?
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précisées au tableau 5 et on étale les suspendrons sur M.'rQc molle dans des plaques à cupules suivant le mode opératoire de l'exemple 4. Les résultats obtenus, exprimés par le pourcentage d'inhibition de la croissanve par rapport à la moyenne des témoins indiquée au tableau 4, sont précisés au tableau ci-dessous.
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<tb>
<tb>
Additions <SEP> aux <SEP> suspensions <SEP> % <SEP> d'inhibition
<tb> de <SEP> cellules <SEP> de <SEP> la <SEP> croisance
<tb> tr
<tb> 1. <SEP> L-carnitine <SEP> (10mM) <SEP> 30
<tb> 2. <SEP> L-carnitine <SEP> (lmm) <SEP> 25
<tb> 3. <SEP> L-carnitine <SEP> (O, <SEP> lmM) <SEP> 10
<tb> 4. <SEP> L-carnitine <SEP> (10mM0 <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 01mM <SEP> acide <SEP> palmitique' <SEP> (cultures <SEP> perdues)
<tb> 5. <SEP> L-crnltlne <SEP> (1 <SEP> mM) <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 01mM <SEP> acide <SEP> palmitique <SEP> 65
<tb> G. <SEP> b-carnitine <SEP> (O, <SEP> 1mM)+ <SEP> 0,01mM <SEP> acide <SEP> palmitique
<tb> 7. <SEP> L-carnitine <SEP> (0,01mM) <SEP> +0,01mM <SEP> acide <SEP> palmtique <SEP> 20
<tb> 8. <SEP> D-carnitine <SEP> (lOmM) <SEP> faible <SEP> stimulation
<tb> de <SEP> croissance
<tb> 9. <SEP> D-carnitine <SEP> (1mM0 <SEP> 0
<tb> 10.
<SEP> D-carnitine <SEP> (O, <SEP> lmM) <SEP> 0
<tb> 11. <SEP> D-carnitine <SEP> (10mM) <SEP> +0,01mM <SEP> acide <SEP> palmtique <SEP> 10
<tb> 12. <SEP> D-c. <SEP> armitine <SEP> (1mM) <SEP> + <SEP> 0,01mM <SEP> acide <SEP> palmitique <SEP> 10
<tb> 13. <SEP> Acide <SEP> palmitique <SEP> (0,01mM) <SEP> 15
<tb> 14. <SEP> Acide <SEP> palmitique <SEP> (0,05mM) <SEP> 65
<tb>
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Il ressort de manière évidente des résultats ci-Ut'usup que la L-carnitine a un effet ant1-prollfér.-tt f pur la liante de cellules SKCOl du cancer du côlon ' t qu'-ft cff-t est accru par la combinaison de la t-r. (-c],.-acide palmitique.
En utiJiantl. t mctme lignée de cellules que d. n.'- 'ox). mplt- , on injecte 0 des souris nus par \-n h. pr. dttiQuo ac cellules de tumeurs viables ., connu qu'uru-nllc'inction nduit In ''f'. :..-..) nc a. l. in cutnc ? cne/le souris nuc. ipro's ilitil (. ction hypodc-rmiquf--, on ii,.It CI-tti\ riut-.--, (jo la-iolutinn F) Iiyhtt) lo-
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gique salée, tandis qu'on injecte aux souris expér1men-.
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tales de la L-caDnitine en dose de 3 g/k9 de po : ds du corps.
On observe chez les souris recevant i, injec- tion de solution physiologique salée qua'les lésions cutanées prévues croissent de la manière : normale, tandis que les souris ayant reçu la L-carnitine en injection ne présentent pas de lésion cutanée.
De, manière générale, des quantités de carnitine de 1 à environ 5 g/kg de poids du mammifère peuvent être administrées sans risque auxfins del'invention et lorsque de la cystéine est adminlstree sl- multanément, la quantité de cystéine peut s'échelonner d'environ 0,5 à environ 1,5 g/kg de poids du corps du. mammifère. Lorsqu'un acide gras est administré conjointement à la L-carnitine, les quantités peuvent établir une concentration d'environ 0. 4mM à environ 1,2 mM dans le sang du mammifère. Des quantités d'acide gras su- périeures à celles établissant des concentrations supérieures à 1,2 mM dolvent être évitées en raison des effets toxiques possibles que peuvent exercer ces con-' centrations plus élevées.