La présente invention concerne un nouvel antibiotique ainsi qu'un procède pour préparer ce dernier.
La demanderesse a isolé diverses souches de microorganismes du sol afin d'étudier leur capacité de production d'antibiotiques. Au cours des études ayant abouti à l'invention, elle a trouvé qu'une souche nouvellement isolée et désignée sous le nom da KC-6643 est capable de produire deux variétés d'un nouvel antibiotique ayant d'excellentes activités antibactériennes vis-à-vis des bactéries gram-pcsitives
et gram-négatives, et est parvenue à isoler- ledit antibiotique à partir du bouillon de culture correspondant, réalisant ainsi l'invention.
Lesdites deux variétés de l'antibiotique: conforme à l'invention sont mutuellement apparentées, de façon étroite,
par leur structure. J.insi qu'il apparaît d'âpres leurs propriétés physico-chimiques et leurs propriétés biologiques
qui seront décrites ci-après, ledit antibiotique est une nouvelle substance différente de tous les antibiotiques
ccnnus.
L'invention vise plus particulièrement un antibiotique qui est produit à partir de souches appartenant au genre Streptomyces, ledit antibiotique étant représenté par la
formule (I)' :
<EMI ID=1.1>
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe
-S03H.
Dans la description suivante, on désignera le mélange
des deux variétés mentionnées ci-dessus du nouvel antibiotique, en tant que substance KA-6643. L'une de ces deux variétés (R de la formule (I) est un atome d'hydrogène) est par ailleurs désignée sous le nom de substance KA-6643-A, tandis
que l'autre variété (R de la formule (I) est le groupe -S03H) est désignée sous le nom de substance KA-6643-B D'autres objectifs, caractéristiques et avantages de l'invention seront clairement compris à la lecture de la description suivante de certains de ses modes de réalisation préférés, conjointement en référence aux dessins annexés, étant entendu que l'on peut mettre en oeuvre ladite invention selon de nombreuses variantes et modifications sans toutefois s'écarter de son cadre et de son esprit..
Dans les dessins mentionnés ci-dessus : La Figure 1 représente un graphique illustrant le spectre d'absorption dans l'ultraviolet du sel de sodium de la substance KA-6643-A La Figure 2 représente un graphique du spectre. d'absorption dans l'infrarouge dudit sel de sodium ; La Figure 3 représente un graphique du spectre de <EMI ID=2.1> La Figure 4 représente un graphique du spectre <EMI ID=3.1>
substance KA-6643-A ; La Figure 5 représente un graphique du spectre de <EMI ID=4.1> La Figure 6 représente un graphique du spectre de résonance magnétique nucléaire du C dudit ester La Figure 7 représente un graphique du spectre d'absorp- <EMI ID=5.1> La Figure 8 représente un graphique du spectre d'absorption dans l'infrarouge du sel disodique ; et La Figure 9 est un graphique du spectre de résonance magnétique nucléaire dudit sel disodique.
L'organisme de l'invention producteur de.la substance
<EMI ID=6.1>
Il y a lieu de noter que l'on observe les caractéristiques morphologiques dans divers milieux ISP en effectuant une culture à 27[deg.]C pendant 21 jours par les méthodes classiques et que l'on exprime la couleur pour la culture au stade de développement conformément à la classification apparaissant dans l'ouvrage Cclor Harmony Manual (publié par la firme Container Corporation of America), sauf mention contraire .
<EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
linéaires. Chaque spore a une dimension de 0,4 à 0,5 IL x 0,9
<EMI ID=9.1>
une chaîne de vingt spores ou davantage, dont la surface est lisse. Les chaînes de spores sont souvent fusionnées ensemble en formant une structure en sclérotium ou amas d'hyphes, et l'on observe la fragmentation du substrat mycélium dans certains milieux utilisés dans les études taxonomiques.
II. Caractéristiques de Culture dans Divers Milieux
(1) Gélose saccharose-nitrate
Croissance : bonne, s'étalant à plat, incolore chamois (2fb)
Mycélium aérien : modéré, pulvérulent, blanc (a)
<EMI ID=10.1>
(2) Gélose glucose-asparagine
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
Mycélium aérien . nul
Pigment soluble : nul
(3) Gélose glycérine-asparagine
Croissance : bonne, verruqueuse, ridée, chamois
(2fg) - bambou (2gc)
Mycélium aérien : bon, pulvérulent, perle (3ba) Pigment soluble : nul
<EMI ID=13.1>
Croissance : bonne, ridée, butyreuse , bambou (2gc) miel doré (2ic)
Mycélium aérien : bon, pulvérulent, blanc (a) perle (3ba)
Pigment soluble : nul
(5) Gélose-tyrosine
Croissance : benne, notablement verruqueuse, ridée, cannelle gélatineuse (3�e) <EMI ID=14.1>
ridée, incolore comme la gélatine - jaune clair
(il a)
Mycélium aérien : nul
Pigment soluble : nul
(7) Gélose extrait de viande - extrait de malte
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
Mycélium aérien : bon, pulvérulent, blanc (a) perle (3ba)
Pigment soluble : nul
(8) Gélose farine d'avoine
Croissance : modérée, s'étalant à plat, crème
<EMI ID=17.1>
Mycélium'aérien : modéré, pulvérulent, blanc (a) Piament soluble : nul
(9) -Gélose peptone - levure fer
Crcissance : bonne, notablement verrugueuse,
<EMI ID=18.1>
Mycélium aérien : nul
Pigment soluble : nul
III. Propriétés Physiologiques
(1) Intervalle des températures de croissance :
3[deg.]C - 35[deg.]C
(2) Intervalle des températures de croissance optima-
<EMI ID=19.1>
(3) Liquéfaction de la gélatine : positive
(4) Hydrolyse de l'amidon : positive
(5) Coagulation du lait écrémé : négative
Peptisation du lait écrémé : positive
<EMI ID=20.1>
IV. Utilisation de Sources Carbonées
On a étudié l'utilisation de sources carbonées dans
<EMI ID=21.1> <EMI ID=22.1>
<EMI ID=23.1>
D-glucose, D-furactosey
<EMI ID=24.1>
V- La souche de l'invention contient l'acide LL-diaminopimélique dans ses parois cellulaires.
Compte-tenu des propriétés précitées, on présume que la souche KC-6643 appartient au genre Streptomyces, mais qu'elle présente des propriétés caractéristiques, telles
<EMI ID=25.1>
chaînes de spores et analogues qui sont légèrement différentes de celles des mycëlia typiques .du genre Streptomyces.
Toutefois, il est largement connu que les souches classées comme appartenant au genre Streptomyces prennent souvent des structures particulières, comme' par exemple une fragmentation des hyphes dans le milieu et une anomalie des chaînes de spores, si bien que, par suite, on considère qu'il est. convenable de classer la souche KC-6643 comme une scuche
<EMI ID=26.1>
En cherchant parmi les souches de nature dans laquelle la chaîne de spores est linéaire, la surface des spores est lisse, le mycélium aérien est de couleur blanche, l'envers de la colonnie ne présente aucune teinte caractéristique, et
<EMI ID=27.1>
parmi les souches quelconques connues, indiquées dans "Bergey's Manuel of Determinative Bacteriology" 8ëme Edition, ISP de
<EMI ID=28.1>
man, 2 (1961) , on peut mentionner cette souche .possible comprenant Streptomyces albovinaceus (ISP 5136) , Streptomyces aureocircuratus (ISP 5386) , Streptomyces baarnensis (ISP 5232), Streptomyces chrvsomallus (ISP 5128), Streptomyces candidas
<EMI ID=29.1>
griseolôalbus (ISP 5468).
<EMI ID=30.1>
différente de la souche KC-6643, par le fait qu'elle a une <EMI ID=31.1>
et en outre dans sa capacité d'utiliser des sources carbonées
<EMI ID=32.1>
diffère de la scuche KC-6643 par le fait qu'elle- s'avère médiocre dans la formation de son mycélium aérien et qu'elle
<EMI ID=33.1>
présente un caractère faible dand l'hydrolyse de l'amidon et montre des degrés différents de capacité d'utilisation de
<EMI ID=34.1>
mais non pas le L-rhamnose). La souche Strepteomyces candidas
(ISP 5141) diffère de la souche KC-6643 par le fait qu'elle
<EMI ID=35.1>
gélose saccharose-nitrate et ne se développe que difficilement
<EMI ID=36.1>
,des scurces carbonées (c'est-à-dire qu'elle .utilise le
<EMI ID=37.1>
<EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
base de gélose saccharose-nitrate et dans la formation de son mycélium aérien, ainsi que dans son pouvoir de liquéfaction
<EMI ID=40.1>
sation de sources carbonées (c'est-à-dire qu'elle utilise le
<EMI ID=41.1>
La souche Streptomvces griseoloalbus (ISP 5468) diffère de
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
<EMI ID=44.1>
carbonées (c'est-à-dire qu'elle utilise le D-mannitol) et par la teinte légèrement jaunâtre de son mycélium aérien.
La souche Streptomvces baarnensis (ISP 5232) est relativement
<EMI ID=45.1>
mais elle en est différente par le fait qu'elle s'avère médiocre dans sa croissance 3 5[deg.]C et produit un pigment brun soluble dans un milieu à base de gélatine, et qu'elle est également médiocre dans sa capacité d'utilisation.de
sources carbonées (c'est-à-dire qu'elle utilise le D-mannitol
<EMI ID=46.1>
(ISP 5128) est très similaire, dans ses caractéristiques de
<EMI ID=47.1>
ou dans un milieu à base de lait écrémé. En outre, elle diffère de la souche KC-6643 par sa production d'un pigment soluble jaune dans plusieurs milieux et dans sa capacité d'utilisation de sources carbonées (c'est-à-dire, qu'elle utilise le D-mannitol, mais non pas l'inositol).
Comme souches capables d'engendrer un produit similaire à un métabolite de la souche KC-6643, on connaît 32 souches
<EMI ID=48.1>
myces flavovirence, Streptomyces flaves, Streptomyces flavoviridis, Streptomyces algenteolus, Streptomyces shioyaensis, Streptomyces lipmanii, Streptomyces cremeus et Streptcmyces gedanensis. Toutefois, aucune de ces souches connues n'a une nature telle que son mycélium aérien soit de couleur blanche et qu'elle utilise l'inositol, mais non pas le D-mannitcl.
En se fondant sur les résultats précités, la demanderesse a décidé de considérer la souche KC-6643 comme une
<EMI ID=49.1>
désignée en tant que souche Streptomyces sp. KC-6643.
Cette souche a été déposée à l'organisme Fermentation Research Institute cf the Agency.of Industrial Science & Technology, situé N[deg.] 1 - 3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaragi-ken, Japon, le 7 avril 1978, où elle a été enregistrée sous 'le n[deg.] FERM-P 4467. Ladite souche a également été déposée
<EMI ID=50.1>
Drive, Rockville, Maryland, U.S.A., le 12 mars 1979, où elle a été enregistrée suivant le protocole ATCC, sous le numéro ATCC 31493.
En ce qui concerne la mise en oeuvre de l'invention, on peut utiliser non seulement la souche KC-6643, mais également ses mutants spontanés et artificiels.
La culture de la souche de l'invention est réalisable <EMI ID=51.1>
<EMI ID=52.1>
<EMI ID=53.1>
<EMI ID=54.1>
res, d'acide, organiques, d'huiles végétales et analogues. Les sources d'azote comprennent la farine de soja, des extraits de levure, des levures sèches, la peptcne, des
<EMI ID=55.1>
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
potassium, phosphate de sodium, sulfate de magnésium,
<EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
substances .paniques et inorganiques qui favorisent. la
<EMI ID=64.1>
emploie une- méthode de culture aérée, il est préférable
<EMI ID=65.1>
grasse, un� huila de silicone ou une paraffine.
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
une. culture en phase liquide, en particulier une culture
<EMI ID=68.1>
secouée ou encore, par culture réservoir. Lorsqu'on poursuit cette culture pendant 2 à 10 jours, la substance active s'accumule dans le bouillon.de culture. La culture se termine au moment où la quantité du produit accumulé dans le . bouillon de culture atteint un maximum.
Afin d'isoler la substance KA-6643, à partir du bouillon de culture ainsi obtenu, et de purifier la substance isolée, on peut utiliser diverses méthodes connues qui sont couramment employées dans un tel but.
Par exemple, en soumet tout d'abord le bouillon de culture à une centrifugation ou une filtration pour en éliminer les mycélia, puis on soumet le filtrat à toute combinaison arbitraire des traitements suivants- À savoir que l'on fait passer le filtrat à travers une résine échangeuse
<EMI ID=69.1> absorbé par la résine, et on obtient le produit recherché
<EMI ID=70.1>
méthanolique aqueuse du sel. Des exemples de ladite résine échangeuse d'ions comprennent les résines échangeuses ' , d'anions, fortement.basiques, telles que "Dowex 1 x 2"
(mise sur le marché par la firme the Dow Chemical Co.) , "Diaion PA-318, 316, 3065, 308 et 312" (mises sur le marche par la firme Mitsubishi Chem. Ind. Ltd.), "Amberlite IRA-400,
401 et 410" (mises sur le marché par la firme Rchm & Haas Co.) et analogues, et des résines échangeuses d'anions faiblement
<EMI ID=71.1>
rente, on soumet le filtrat de culture à une adsorption avec un adsorbant, tel que le carbone actif, et on obtient le produit recherché par élution avec du méthanol aqueux, de l'acétone aqueuse ou analogues.
Ensuite, on fait passer la fraction active, . comprenant
<EMI ID=72.1>
fortement basique, telle que, par exemple, "Dcwex 1 x 2" de façon qu'elle absorbe la substance KA-6643, après quoi on élue progressivement la substance en faisant varier graduellement la concentration saline dans une solution tamponnée au phosphate. Dans cette opération d'ëlution, en élue la substance KA-6643-A dans un stade initial, avec une élution consécutive de la substance KA-6643-B, en séparant ainsi, l'une de l'autre, la substance KA-5G43-A et la substance KA-6643-B. De façon différente, on peut faire passer la fraction active à travers une colonne garnie d'un polymère réticulé hydrophobe modérément polaire cu non polaire, tel que,
<EMI ID=73.1>
séparer la substance KA-6643-A et la substance KA-6643-B par suite de la différence de leur pouvcir d'adsorption respectif.
On soumet de plus la substance KA-6643-A et la substance KA-6643-B, ainsi obtenues, à une filtration sur gel,
en utilisant un gel tel que "Bicgel P-2" (mis sur le marché par la firme BIO.RAD Lab.) ou "Sephadex G-1C" (mis sur le marché par la firme Pharmacia.Fine Chemicals), ou on la soumet à une chromatographie en phase inversée en utilisant
<EMI ID=74.1>
la firme Waters Associates, Inc.), en obtenant ainsi la
<EMI ID=75.1>
pures.
Si) nécessaire, on peut convertir la substance KA-6643-A ainsi que la substance KA-6643-B suivant toute manière . ; . courante en leurs sels de métaux alcalins, sels de métaux alcalino-terreux, sels d'aminés primaires, secondaires eu tertiaires, ou sels d'ammonium quaternaire.
La substance KA-6643 conforme à l'invention possède les. propriétés physico-chimiques et biologiques suivantes et
<EMI ID=76.1>
ries gram-positives et gram-négatives. De plus, cette substance présente une excellente activité antibactérienne vis-àvis des bactéries qui sont résistantes à divers types d'antibiotiques à structure de 0-lactame et possède une activité
<EMI ID=77.1>
(I) Propriétés physico-chimiques A) Sel de sodium de la substance KA-6643-A
(1) Aspect : poudre blanche
(2) Point de fusion : graduellement décompose au-dessus
de 145[deg.]C
(3) Spectre d'absorption ultraviolette : lorsqu'il est
mesuré en solution aqueuse, le spectre est sensible-ment le même que représenté dans la Figure 1 avec un
<EMI ID=78.1>
<EMI ID=79.1>
(4) Spectre d'absorption infrarouge : lorsqu'il est
relevé dans KBr, la substance présente sensiblement le même spectre que celui représenté dans la Figure 2.
(5) Solubilité dans les solvants : aisément soluble dans
l'eau, mais sensiblement insoluble dans l'acétone,.
<EMI ID=80.1>
pétrole
(6) Spectre de résonance Magnétique nucléaire : spectre
<EMI ID=81.1>
<EMI ID=82.1>
représenté dans la Figure 3.
(7) Chromatographie sur couche mince
Indice Rf : 0,6 [plaque : cellulose sur feuille d'aluminium pour chromatographie sur couche mince, mise sur . le marché sous le nom de F254, 0,2 mm (par la firme
<EMI ID=83.1>
propylique-eau, (7:7:6)J
Indice Rf : 0,55 [plaque : gel.de silice sur feuille d'aluminium pour' chromatographie sur couche mince,
<EMI ID=84.1>
(par la firme Merck & Co., Inc.), solvants : alcool
<EMI ID=85.1>
(8) Chromatographie en phase liquide de haute performance
Temps d'élution . 10,5 minutes
<EMI ID=86.1>
la firme Waters- Associates, Inc.), 4 x 300 mm Solvant : méthanol-solution de tampon au phosphate 0,01 M (1:9), pH 6,8
Débit : 1 mA/minute
<EMI ID=87.1>
obtenue par spectrométrie de masse de l'ester mcnométhylique)
<EMI ID=88.1>
d'après la formule moléculaire de l'ester méthylique, <EMI ID=89.1>
de masse)
(11) Stabilité : les durées de demi-vie à différentes
valeurs de pH sont les suivantes :
<EMI ID=90.1>
Solvant :
pH 4,0 - 7,0 : solution tampcn de Mac Ilvanine
(phosphate de sodium-acide citrique)
pH 10,0 : solution tampcn au carbonate de sodium-
bicarbonate de sodium 0,1 M
Mesure : Spectrcscopie d'absorption ultraviolette
<EMI ID=91.1> <EMI ID=92.1>
(1) Aspect : solide incclore
(2) Poids moléculaire : 356 (spectrométrie de masse)
<EMI ID=93.1>
<EMI ID=94.1>
<EMI ID=95.1>
<EMI ID=96.1>
le méthanol a une absorption maximale à 243 nm et :
300 nm et une absorption minimale à 274 nm.
(6) Spectre d'absorption infrarouge :
Lorsqu'il est mesuré dans KBr, la substance a sensiblement le même spectre que celui représente dans la Figure 4.
(7) Spectre de résonance magnétique nucléaire
<EMI ID=97.1> <EMI ID=98.1> silane. comice étalon interne, le spectre cbtenu est sensiblement le même que celui représente dans la
<EMI ID=99.1>
<EMI ID=100.1>
<EMI ID=101.1>
silane comme étalon interne, le spectre obtenu est sensiblement le même que celui représenté dans la Figure 6.
(8) Chromatographie sur ccuche mince
Indice Rf : 0, 44 [plaque : gel de silice sur feuillu d'aluminium pour chromatographie sur ccuqhe mince,
<EMI ID=102.1>
(Merck & Co., Inc.) ; solvants : chlorure de méthylène
-méthanol (9:11)] <EMI ID=103.1> <EMI ID=104.1>
(1) Aspect : poudre blanche
(2) Point de fusion : aucun point défini n'est indiqué et
virage graduel du jaune au brun au-delà d'environ
130*C
(3) Analyse élémentaire
<EMI ID=105.1>
(4) Spectre d'absorption ultraviolette : sensiblement le
même - que celui représenté dans la Figure 7 et ayant des bandes d'absorption maximale à 240 nm et 285 nm et une bande d'absorption minimale à 265 nm.
(5) Spectre d'absorption infrarouge :
Le spectre d'absorption infrarouge de la substance,
<EMI ID=106.1>
même que celui représenté dans la Figure 8.
(6) Spectre de résonance magnétique nucléaire
<EMI ID=107.1>
comme étalon interne, le spectre de résonance magnétique nucléaire est sensiblement le même que celui représenté dans la Figure 9.
<EMI ID=108.1>
(9) Stabilité :
Les durées de.jdemi-vie, à différentes valeurs de pH, sont les suivantes :
<EMI ID=109.1>
Le solvant et la mesure sont les mêmes que dans le cas de la substance KA-6643-A.
(10) Chromatographie sur couche mince : les résultats sont
représentés dans le Tableau I.
<EMI ID=110.1>
<EMI ID=111.1>
<EMI ID=112.1>
<EMI ID=113.1>
<EMI ID=114.1>
Solvants : Acétcnitrile-eau (3:2), méthode ascendante
<EMI ID=115.1>
(12) Chromatographie en phase liquide de haute performance
<EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
Temps de rétention : 23, 5 minutes
<EMI ID=120.1>
En utilisant un dispositif d'électrophorèse sur papier à haute tension et en faisant migrer la substance dans une solution de tampon au phosphate 1/30 M (pH 7,0) à 3.000 V pendant 30 minutes, on trouve que la subs- tance de l'invention se déplace vers l'anode, de 8,5 cm. La Pénicilline N, testée d'une façon similaire, s'est déplacée vers L'anode de 4,4 cm.
(II) Propriétés biologiques
(1) Spectre antibact�rien
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
raison avec ceux de l'aminobenzyl pénicilline (AB-Pc)
<EMI ID=123.1>
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
A.insi qu'il apparaît d'après ce qu'il procède,
<EMI ID=126.1>
<EMI ID=127.1>
positives comprenant celles qui résistent à divers antibiotiques de la série des pénicillines et des céphalosporines.
(2) Activité inhibitrice de 0-lactamase
(i) Action améliorant l'activité antibactérienne visà-vis des bactéries résistantes aux 8-lactames Dans la gélose Penassay (dont on dissout 12 g dans
<EMI ID=128.1>
Co., Ltd.), on inocule Escherichia Coli EC-1 (PC ase) et Citrcbacter 24 (CS.ase) qui sont des organismes producteurs'
<EMI ID=129.1>
<EMI ID=130.1>
solidifier en obtenant un milieu d'essai.
Dans ce milieu à base de gélose, on place des disques de pâte à papier de 8 mm de diamètre, dans-lesquels
<EMI ID=131.1>
des antibiotiques en laissant suivre par une culture à 37[deg.]C pendant 18 heures, puis on effectue la mesure du diamètre de la zone d'inhibition autour de chaque disque- Les résultats sont représentés dans le tableau III.
Tableau III
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1> <EMI ID=134.1>
hydrclase pénicillinique EC 3.5.2.6 (Tokyo Chem. Syn. Ce-, Ltd.) dérivée de bactéries appartenant au genre Bacillus, on trouve que l'indice! 50 de la substance KA-6643-A est de
<EMI ID=135.1>
12,8 ng/mt..
<EMI ID=136.1>
<EMI ID=137.1>
857 (1977)J.
Par suite, on peut s'attendre à ce que les substances KA-6643-A et KA-6643-B montrent des effets synergiques
<EMI ID=138.1>
<EMI ID=139.1>
A la lumière des différentes propriétés indiquées ci-dessus, on peut ranger les substances de l'invention
<EMI ID=140.1> <EMI ID=141.1>
SY2-A), qui présente un spectre d'absorption ultraviolette similaire à celui des substances de l'invention, ledit antibiotique conmi est différent des substances KA-6643-A et KA-6643-B sous les aspects suivants.
<EMI ID=142.1>
Soumis à une électrophorèse sur papier à 3.000 V pendant 25 minutes
Solvant : solution de tampon au phosphate 0,1 M
(pH 8,0)
KA-6643-A : se déplace du cote de l'anode de 5 cm MM 4550 : se déplace du côté de l'anode de 10,2 cm
(2) Chromatographie en phase liquide de haute performance
<EMI ID=143.1>
4 x 30 cm
Solvant : solution de tampon au phosphate 0,05 M
(pH 7,0)
Débit : 1 mt/minute
<EMI ID=144.1>
<EMI ID=145.1>
<EMI ID=146.1>
<EMI ID=147.1>
Comme la substance KA-6643 conforme à l'invention présente un groupe carboxyle dans sa molécule, on peut l'utiliser sous la forme d'un acide libre, mais on l'utilise de préférence sous la forme de sels. Des sels convenables sont, par exemple, les sels de métaux alcalins ou de métaux alcalino-terreux, tels que le sodium, le potassium, le calcium et analogues, ainsi que les sels d'ammonium, tels que l'ammonium, la triméthylamine, la diméthylamine et analogues. De plus, on peut utiliser ladite substance sous la forme de ses esters d'alkyle inférieure, tels que l'ester méthylique, l'ester éthylique et analogues, ou d'esters d'acides gras supérieurs.
On peut encore comprendre davantage l'invention en se référant aux formulations et résultats expérimentaux suivants, qui sont présentés a titre d'illustration et sans
<EMI ID=148.1>
Exemple 1
<EMI ID=149.1>
<EMI ID=150.1>
<EMI ID=151.1>
<EMI ID=152.1>
et on introduit des portions respectives de 100 mi dudit milieu dans un ballon Erlenmeyer de 500 mt que l'on soumet
<EMI ID=153.1>
de la souche KC-6643 et on effectue une culture secouée à
27[deg.]C pendant 4 jours à 220 tours/minute.
(ii) Après l'achèvement de la culture ; on ajoute de la
<EMI ID=154.1>
<EMI ID=155.1>
on élimine les mycelia par filtration. On fait passer le
<EMI ID=156.1>
<EMI ID=157.1>
<EMI ID=158.1>
lant une fraction active. On fait passer la fraction active résultante à travers une colonne (4 x 30 cm) de carbone actif et, après lavage avec de l'eau, on la traite alors avec de l'acétone aqueuse à 50 % en volumes en recueillant une fraction active. On fait passer la fraction active ainsi collectée, à travers une colonne (4 x 40 on) d'une résine
<EMI ID=159.1>
et l'on fait suivre par un lavage avec de l'eau, puis par
<EMI ID=160.1>
de pH 7,0, contenant 0,2 M de chlorure de sodium, en recueillant une fraction active. On fait passer la fraction active ainsi collectée à travers une colonne (3 x 30 cm) de carbone actif, que l'on lave avec de l'eau et élue avec de l'acétone aqueuse à 50 % en volumes en recueillant une fraction active:
<EMI ID=161.1>
une colonne (4 x 30 cm) d'une résine échangeuse d'anions, fortement basique, "Dowex 1 x 2" (passant par un tamis
<EMI ID=162.1>
on fait suivre par un lavage avec de l'eau avant de la soumettre à une élution à gradient de concentration suivant
<EMI ID=163.1>
<EMI ID=164.1>
et une solution contenant 0,4 M.de chlorure de sodium,
en divisant ainsi la fraction en deux fractions supplémentaires, dont l'une est la fraction initialement éluée, tandis que l'autre est la fraction éluée consécutivement,. et on recueille les deux fractions séparément.
(iv) On concentre la fraction active élude initialement, ainsi recueillie (d'environ 1 i) pour l'amener à environ
100 mt sous pression réduite à une température inférieure à
30[deg.]C. On fait passer le concentrât à travers une colonne de "Diaion HP-20" qui a été préalablement lavée avec une
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de la même façon que dans le stade (iv), en obtenant ainsi
240 mg d'une poudre brute de KA-6643-B.
Exemple 2
(i) Dans un milieu répondant à la composition de 2 % d'amidon, 1,5 % de farine de soja, 0,28 % de phosphate monopotassique, 0,18 % de phosphate disodique.dodécahydraté,
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de magnésium. heptahydraté et 0,001 % de sulfate ferreux,
et que l'on a amené à un pH 6,0 et stérilisé, on inocule des mycelia de souche KC-6643, en faisant suivre par une préculture à 27[deg.]C pendant environ 48 heures en obtenant un premier milieu d'ensemencement. Dans chacun de deux réservoirs ayant respectivement un volume de 200 t, on introduit
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ci-dessus, mais présentant une addition de 1 % d'huile de graines de coton. On inocule la première culture d'ensemen-
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pendant 4 jours.
(il) Après l'achèvement de la culture, on ajoute au
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Perlite 4109 (mise sur le marche par la firme Dicalite
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élimine les mycelia par filtration.
On amène le filtrat résultant (150 t) à une conductivité de 1,5 mt/cm et on le fait passer 3 travers une colonne (21,5 x 45 cm) d'une résine échangeuse d'anions,
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<EMI ID=176.1> <EMI ID=177.1> tampon au phosphate 0,01 M. (pH 7,0) contenant 2 M de chla-
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<EMI ID=179.1>
à 10 % en poids/volume de chlorure de sodium, on l'élue avec de l'eau désionisée au débit de 200 mi/minute en recueillant une fraction active.
(iii) On fait passer la fraction active ainsi recueillie à travers une colonne (6 x 70 cm) d'une résine échangeuse
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avec une solution de tampon au phosphate 0,01 M (pH 7,0) contenant du chlorure de sodium 0,15 M. Puis, on élue la fraction active restante avec une solution de tampon au
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(iv) On soumet la fraction initialement éluëe, obtenue dans le stade (iii),, au même traitement que décrit dans le stade (iv) de l'Exemple 1, en obtenant ainsi 700 mg de poudre brute de la substance KA-6643-A.
(v) On fait ,passer la fraction active élude consécuti-
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que l'on a préalablement traité avec une solution aqueuse .. de chlorure de sodium à 20 % en poids/volume, puis on l'élue
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recueillant une fraction active. On dilue la fraction active
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passer à travers une colonne (3 x 30 cm) d'une résine ëchangeuse d'anions faiblement basique, "DEAE-Sephadex A-25"
(Pharmacia Fine Chemicals) que l'on amenée à un pH de 7 , 0 en utilisant une solution dé tampon au phosphate 0,01 M,
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avec une solution de tampon au phosphate (pH 7,0) contenant <EMI ID=188.1>
xecueillant une fraction active. On concentre l'éluat ainsi recueilli, sous pression réduite à une température inférieu-
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(3,5 x 40 cm) de "Diaion HP-20" que l'on a préalablement traité avec une solution aqueuse de chlorure de sodium à
10 % en poids/volume et on l'élue avec de l'eau désionisée
<EMI ID=190.1>
ve. On concentre la fraction active sous pression réduite à
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poudre brute de la substance KA-6643-B.
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d'eau désionisée et on la fait passer à travers une colonne
(2 x 30 ou) de "Diaion HP-20", puis on l'élue avec de l'eau désionisée' à un débit de 1 m[pound]/minute en recueillant une fraction active. On concentre la fraction active ainsi recueillie, sous pression réduite et on l'a fait passer à travers une colcnne de "Sephadex G-10", en faisant suivre par un développement avec de l'eau désionisée à un débit de
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lise en cbtenant 80 mg d'une poudre brute.
(vi) On dissout 80 mg de la poudre ainsi obtenue, dans
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"Bcndapack C.g/Polasil B" (Waters Associâtes, Inc.) que l'on . a préalablement traité avec une solution de tampon au phosphate 0,1 M, en faisant suivre par une élution avec la même
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une fraction active. On fait passer la fraction active à travers une colonne (0,9 x 5 cm) de carbone actif,
on la lave avec de l'eau désionisée et on l'élue avec de l'acétone contenant de l'eau à raison de 50 % en poids/ volume, en recueillant une fraction active. On concentre la
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on la lyophilise en obtenant 35 mg d'une poudre purifiée de KA-6643-B.
Exemple 3
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désicnisée, puis on la fait passer à travers une colonne
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tes, Inc.) pour chromatographie en phase liquide de haute performance, et on l'élue avec une solution de tampon au phosphate 0,01 M de pH 6,8 contenant 2 % de méthanol à un
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On concentre la fraction active ainsi recueillie,
<EMI ID=203.1>
travers une colonne (2 x 15 cm) de "Diaion HP-20",
que l'en a lave avec une solution saline, en faisant suivre par une élution avec de l'eau désionisée à un débit de
1 m�/minute, en.recueillant une fraction active. On concentre la fraction à 1 mi, puis on la fait passer à travers une colonne (3 x 150 cm) de "Sephadex G-10", et on l'élue avec
<EMI ID=204.1>
on concentre la fraction active résultante à 2 mi sous pression réduite et on la lyophilise en obtenant 4 mg d'un produit purifié du sel de sodium de KA-6643-A.
REVENDICATIONS
<1>. A titre de produits industriels nouveaux, les com- posés de formule :
<EMI ID=205.1>
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou un groupe
-S03ü.