<EMI ID=1.1>
à activité antivirale et un procédé de préparation pour de telles compositions. L'invention se rapporte plus particulièrement à la préparation de compositions qui, administrées à des hommes ou à des animaux, provoquent une résistance aux virus dans des organismes et des cellules vivante �t/ou induisent la formation de substances antivirales naturelles.
On prépare une composition antivirale selon l'invention à partir d'un ou de plusieurs composants inducteurs suscitant une
<EMI ID=2.1>
qui développent l'activité des inducteurs.
On sait que la résistance virale de tinsus et cellules vivants peut être induite par des virus, mais aussi par des composés d'ori gine naturelle ou synthétique. On peut ainsi provoquer une résistance aux virus à l'aide d'acides ribonucléiques naturels, cornue
<EMI ID=3.1>
tinine, des polysaccharides (N.B. Finter : Interferons, Philad�,'-..
1966, W.B. Saunders Co.).
On a constaté que des acides polyribonucléiques d'origine naturelle ou synthétique sont les inducteurs les plus actifs
(M.Harris : Science 170, 1068/1970/). Des mélanges simples (non
<EMI ID=4.1>
une chaîne du complexe est un acide désoxyribonucléique et l'
<EMI ID=5.1>
modifiés (comme des acides nucléiques renfermant des nucléotide%. contenant du soufre) ainsi que des composants analogues (produitr par introduction de nucléotides modifiés dans la molécule avant polymérisation) possèdent aussi un pouvoir inducteur de substance* antivirales.
<EMI ID=6.1>
<EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
<EMI ID=11.1>
<EMI ID=12.1>
On sait également que l'effet des inducteurs de type acide nucléique est plus impcrtant en présence de certains polycations. Par exemple, les inducteurs sont activés par la polylysine
<EMI ID=13.1>
Appl. Microbiol. 22, 380/1971), la polyornithine et la polyarginine. Le polycation le plus souvent étudié et le plus largement employé est le DEAE-dextrane (Dianzani, F. et coll.:Ann. N.Y. Acad. Sci.
<EMI ID=14.1>
Le brevet français n[deg.] 2 092 875 décrit la préparation de composés complexes induisant plus fortement la production d'ir.terféron que les seuls composants de caractère acide nucléique.
<EMI ID=15.1>
<EMI ID=16.1>
<EMI ID=17.1>
diluée, avec un polycation présentant des sites moléculaire* - tifs ou cationiques.
<EMI ID=18.1>
<EMI ID=19.1> b) les polymères de synthèse d'amino acides cationiques (poly polyornithine), <EMI ID=20.1> zime) ; et <EMI ID=21.1>
<EMI ID=22.1>
<EMI ID=23.1>
haut. Parmi les polycations énumérés ci-dessus, le DEAE-D exerce l'activation la plus importante pour un acide nucléique polymère
<EMI ID=24.1>
logiques de résistance au virus.
La présente invention se propose de fournir des polycations
<EMI ID=25.1>
duits déjà connus.
On a eu la surprise de constater que, par rapport à tous . composés connus pour leur effet d'activation, en particulier 1' polymères synthétiques d'amino acides cationiques naturels (par
<EMI ID=26.1>
peptides polycationiques de synthèse formés : <EMI ID=27.1>
<EMI ID=28.1>
tuants spécifiques basiques, ou <EMI ID=29.1>
au moins partiellement sur les groupes amino libres.
<EMI ID=30.1>
<EMI ID=31.1>
plus haut, on constate une activité avec des rapports inducteur:
activateur qui varient non seulement entre 2.10 -2 et 10 mais entre 10 et 10 . Le rapport utilisé de préférence maintenant,
<EMI ID=32.1>
aussi du mode d'administration de la composition.
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
l'invention pour former les complexes, peuvent être préparés selon des méthodes connues à partir de polypeptides contenant
<EMI ID=35.1>
ou carboxylique libres), par amidation d'au moins une partie des groupes carboxyliques libres avec des diamines ou des hydroxyalkylamines ou par alkylation d'au moins une partie de" groupes amino libres à l'aide d'agents d'alkylation.
<EMI ID=36.1>
en faisant réagir un dérivé réactif d'un polypeptide contenant des groupes carboxyliques libres, par exemple un ester d'acide poly-DL-amino-malonique, d'acide poly-L-aspartique ou poly-L-glutamique ou des copolym�res de ces amino-acides dicarboxyliques
<EMI ID=37.1>
méthodes pour les préparer : <EMI ID=38.1>
amino-2-éthylamine; b) Polypeptides polycationiques obtenus par réaction d'ester poly-aminomalonique ou a-ester méthylique d'acide 6-polyaspat tique ou des dérivés copolymêres de ces amino-acides, formés avec d'autres amino-acides ou leurs dérivés, avec des diamines primaires-tertiaires, ainsi que différents sels d'ammonium
<EMI ID=39.1>
stituants en position quaternaire sont des groupes hydrocarbonés
<EMI ID=40.1>
(groupes carboxy, acide sulfonique, etc.) et un ester carboxylique ou des cycles hétérocycliques (brevet de Grande-Bretagne
<EMI ID=41.1>
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
quaternaire peuvent être des groupes alkyles ou aralkyles, sub-
<EMI ID=44.1>
xyéthyle, benzyle ou p-chlorobenzyle (brevet hongrois n[deg.] 150 576).
d) . Amino-3-propylamides d'acide a-poly(L ou D)-aspartique,
<EMI ID=45.1>
<EMI ID=46.1>
e) Polypeptides polycationiques formés par réaction de y-esters <EMI ID=47.1>
cine, des diamines NI-mono ou dialkylées ou leurs mélanges;
<EMI ID=48.1>
et les divers dérivés quaternaires de ces polycations (brevet hongrois n[deg.] 150 756).
<EMI ID=49.1>
dérivés carboxamides par ces diamines; ainsi que des dérivés d'acide polyglutamique polycationiques modifiés par l'amino-2éthylamine et contenant aussi des "réticulations" composées
<EMI ID=50.1>
Hung. 54, 65/1967/).
h) Dérivés d'acide a-poly-L-glutamique modifiés par la diméthyl-
amino-2-éthylamine et contenant aussi des unités transformée?
<EMI ID=51.1>
<EMI ID=52.1>
<EMI ID=53.1>
k) Copolypeptides contenant la lysine et d'autres amino-acides
(comme l'alanine) et leurs dériver quaternaire? (brevet
<EMI ID=54.1>
La présente invention �urnit donc un procède de préparation de complexes ayant une activité antivirale accrue, qui consiste
<EMI ID=55.1>
aqueux, avec un polypeptide polycationique de synthèse construit totalement ou en partie à oartir d'unités d'n-aminoacide de formule générale :
<EMI ID=56.1>
dans laquelle :
A représente un groupe :
<EMI ID=57.1>
<EMI ID=58.1>
<EMI ID=59.1>
cyclique à 5 ou 6 éléments, contenant éventuellement un autrehétéroatome.
<EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
carbone;
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
, n peut être zéro,
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1> cationique synthétique (appelé par la suite : activateur) sont mises en contact dans des solutions aqueuses, de préférence dans des solutions préparées avec une solution de chlorure de sodium physiologique.
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
et/ou du chlorure de sodium, et éventuellement aussi d'autrer adjuvants pharmaceutiques connus en eux-mômes.
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
des compositions les renfermant sont décrits plus loin.
<EMI ID=70.1>
<EMI ID=71.1>
teur ou un mélange d'activateurs. Les compositions (solution'
<EMI ID=72.1>
<EMI ID=73.1>
lisants et autres adjuvants.
Par la suite, on désigne chaque type d'activateurs par lettre "A" suivie d'un indice caractéristique de la qualité. :
<EMI ID=74.1>
même catégorie. La première donnée numérique est la viscosité
<EMI ID=75.1>
dichloroacétique à 0,5%. La seconde donnée numérique représc ' le degré de substitution par les groupes cationiques caractér.r
<EMI ID=76.1>
rents types d'activateurs :
<EMI ID=77.1>
carboxyliques libres sont convertis en dérivés carboxamides
<EMI ID=78.1>
<EMI ID=79.1>
numériques entre parenthèses.
<EMI ID=80.1>
libres sont convertis en dérivés carboxamides avec de la diéthylamino-2-éthylamine , à des degrés divers, ainsi que l'indiquent les secondes valeurs numériques entre parenthèses.
<EMI ID=81.1>
carboxyliques libres sont convertis en dérivés carboxamides
<EMI ID=82.1>
dans le pourcentage indiqué.
<EMI ID=83.1>
libres sont convertis en dérivés carboxamides substitués par
<EMI ID=84.1>
et 8% d'imidazolyl-2-éthyle.
A6 Méthosulfate d'un dérivé de polylysine, dont les groupes
amino libres sont méthylés.
A7 Méthosulfate d'un dérivé de polyornithine dont !en groupes
amino libres sont méthylés.
<EMI ID=85.1>
liques libres sont convertis en dérivés carboxamides à l'a-'. de diéthylamino-2-éthylamine, dans le pourcentage indiqué.
<EMI ID=86.1>
liques libres sont convertis en dérivés carboxamides à l'a de diméthylamino-2-éthylamine dans le pourcentage indique.
<EMI ID=87.1>
carboxyliques libres sont convertis en dérivés carboxamides portant comme substituants des radicaux méthyldiéthylammonio2-éthyle, dans le pourcentage indiqué.
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
de l'alcool.
Les quantités absolue et relative de chaque composant des compositions selon l'invention peuvent varier dans de très larges mesures, en fonction des particularités de l'organisme traité
et du mode d'administration.
La préparation des compositions est illustrée par les exemple''suivants, qui ne sont pas limitatifs de la portée de l'invention.
<EMI ID=92.1>
<EMI ID=93.1>
NaCl physiologique. On neutralise le mélange et le soumet à une filtration stérile, puis on le mélange de façon stérile avec 100 ml de solution physiologique stérile qui renferme 1,0 microgramme d'inducteur par ml de solution. On peut répartir stérilement cette composition dans des ampoules et la conserver � l'état gel�.
<EMI ID=94.1>
I/f A2(0,90; 93%) - puly I:C (12,2; 6,3) I/g A4( - ; 92%) - poly I:C (12,2; 6,3)
<EMI ID=95.1>
<EMI ID=96.1>
<EMI ID=97.1>
si ce n'est que les solutions contiennent 10% de dextrane.
<EMI ID=98.1>
lidone.
<EMI ID=99.1>
<EMI ID=100.1>
\ <EMI ID=101.1>
On procède tel que décrit pour les compositions I/a à I/i,
si ce n'est que l'on répartit la solution stérile dans des ampoules de 10 ml et qu'on les soumet 1 une lyophilisation de façon stérile. Compositions VII/a à VII/e.
On procède tel que décrit pour les compositions I/a à I/e,
si ce n'est que l'on dissout les chlorhydrates neutres des activateurs et que l'on ne neutralise pas la solution.
Compositions VIII/a à VIII/h.
On dissout 100 mg d'activateur dans 100 ml de solution de chlorure de sodium physiologique. Après neutralisation et filtr�- tton stérile, on mélanqe la solution de façon stérile avec 100 ml de solution physiologique contenant 1,0 microgramme/ml d'inducteur. On peut répartir les compositions résultantes dans des ampoules
de 10 ml dans des conditions stériles ou les conserv..r à l'étai.
ou lyophilisé.
Des couples d'activateur-inducteur sont par exemple :
<EMI ID=102.1>
VIII/c A1(0,49; 96%) - poly I:C (12,2; 6,3)
<EMI ID=103.1>
VIII/h A5( - ) - poly I:C (12,2; 6,3) Compositions IX/a a IX/j.
<EMI ID=104.1>
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
<EMI ID=108.1>
IX/g A1(0,92; 94%) - statolon
<EMI ID=109.1>
IX/i A6( - ) - poly I:C (12,2; 6,3)
<EMI ID=110.1>
Compositions X/a à X/d.
On dissout 10C mg d'activateur dans 100 ml de solution physiologique. On neutralise la solution et on la soumet à une fil-
<EMI ID=111.1>
de solution physiologique stérile contenant 0,05 microgramme/ml d'inducteur. Les compositions obtenues peuvent être réparties en ampoules ou conservées à l'état gelé ou lyophilisé.
Des paires activateur-inducteur peuvent être par exemple composées de :
X/a A1(0,49; 96%) - statolon
X/b A1(0,52; 93%) - statolon
<EMI ID=112.1>
X/d A9(0,98; 91%) - poly I:C (12,2; 6,3)
<EMI ID=113.1>
On procède tel que décrit pour les compositions X/a à X/d,
<EMI ID=114.1>
gramme/ml d'inducteur au lieu de 0,05 microgramne.
<EMI ID=115.1> <EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
Compositions XII/a à XII/i.
On dissout 4,0 g d'activateur dans 100 ml de solution physio-
<EMI ID=118.1>
à 100 ml de solution physiologique contenant 100 microgrammes d'inducteur par ml. On lyophilise la solution obtenue, puis la mélange avec 1,0 kg de lactose et 1,0 kg d'amidon pour fabriquer des pilules. Chaque pilule doit contenir 2 mg d'activateur et 5,0 microgrammes d'inducteur.
<EMI ID=119.1>
décrits pour les compositions I.
<EMI ID=120.1>
On dissout 2,5 mg d'un sel d'activateur dans 50 ml d'eau distillée; on filtre la solution de façon stérile, puis on la mélange à 50 ml d'eau distillée stérile, contenant 125 mg d'indu teur. Il peut se former une légère opalescence. La composition
<EMI ID=121.1>
puis lyophilisée.
<EMI ID=122.1>
constitués de :
<EMI ID=123.1>
XIV/c A2(0,90: 93%) - poly I:C (12,2; 6,3)
<EMI ID=124.1>
si ce n'est que l'on dissout 5,0 mg d'activateur et non 2,5 mg, dans les 50 ml d'eau distillée.
Des couples activateur-inducteur peuvent être par exemple :
XV/a A2(0,90; 93%) - poly I:C (12,2: 6.3)
XV/b Al(0,90; 92%) - poly I:C ( 7,3; 3,4) Compositions XVl/a - XVI/b.
<EMI ID=125.1>
<EMI ID=126.1>
<EMI ID=127.1>
Composition XVII.
On procède tel que décrit pour les compositions XIV, si ce n'est que l'on dissout respectivement 5,0 mg d'activateur et
<EMI ID=128.1>
d'activateur et 125 mg d'inducteur.
Un couple activateur-inducteur peut être par exemple :
<EMI ID=129.1>
Composition XVIII.
On procède tel que décrit pour les compositions XIV, si ce n'est que l'on dissout respectivement 5,0 mg d'activateur et
<EMI ID=130.1>
dans 50 ml d'eau.
Un couple activateur -inducteur peut être par exemple :
<EMI ID=131.1>
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
n'est que l'on dissout respectivement 100 mg d'activateur et
<EMI ID=134.1>
<EMI ID=135.1>
qui est décrit dans la composition XVIII.
Les matériaux, méthodes et définitions utilisés dans le* expériences sont les suivants :
<EMI ID=136.1>
nate acide de sodium-acide carbonique.
La culture de tissu foetal humain est préparée de la façon
r
<EMI ID=137.1>
<EMI ID=138.1>
<EMI ID=139.1>
/ <EMI ID=140.1>
<EMI ID=141.1>
<EMI ID=142.1>
L'expression "activité biologique mesurée dans des cultures
<EMI ID=143.1>
<EMI ID=144.1>
<EMI ID=145.1>
concentration de l'activateur mise en oeuvre est à la limite de la non-toxicité.
<EMI ID=146.1>
d'activateur sous l'action de laquelle les cellules subissent des déformations morphologiques observables au microscope. En
<EMI ID=147.1>
<EMI ID=148.1>
<EMI ID=149.1>
<EMI ID=150.1>
<EMI ID=151.1>
d'embryon de poulet.
Pour les examans in vivo, dans des souris albinos CFLP, pesant
20 à 22 g, on procède de la façon suivante :
<EMI ID=152.1>
inoculation, afin d'éviter des infections bactériennes.
<EMI ID=153.1>
<EMI ID=154.1> mine la teneur en interféron du sérum dans des cultures de tissu, dans des tubes de fibroblaste L-929 de souris de 48 heures. Les cultures sont ensemencées avec les échantillons dilués, et l'en-
<EMI ID=155.1>
<EMI ID=156.1>
Ensuite, on réalise l'infection avec 5.10 p.f.u. de VSV, on fait incuber à 37[deg.]C pendant 48 heures et l'on détermine le titre en interféron (Ch. Buckler et coll.: Proc. Soc. Exp. Blol. Med. 136.
394-399, 1971).
Etude de la survie : on administre à des souris par voie intrapéritonéale, le virus Semliki Forent actif sur les souris
(C.J. Boradish et coll.: J. gen. Virol. 12, 141-160, 1971) à une concentration telle que la mortalité est de 100% en quelques jours. On détermine cette concentration au cours d'essais préliminaires.
<EMI ID=157.1>
la manière à tester. Les animaux survivent au moins 21 jours après l'infection.
Dans le cas du virus de la grippe, souche Hongkong 68/1,
la souche de virus a été complètement adaptée au poumon de souris
<EMI ID=158.1>
tuer une souris. L'infection est réalisée par voie trachéale,
<EMI ID=159.1>
<EMI ID=160.1>
sur le système nerveux, l'infection est faite par inoculations intracérébrales de 0,03 ml par souris avec des doses de 10 à
<EMI ID=161.1>
EXEMPLE
On fait incuber des cellules de fibroblaste L-929 de souris
<EMI ID=162.1> <EMI ID=163.1>
ou (à titre de comparaison) de DEAE-dextrane, et du poly I:C
<EMI ID=164.1>
<EMI ID=165.1>
à nouveau incuber à 37[deg.]C pendant 92heures. Ensuite, on détermine la dose efficace minimale de poly I:C en présence de différents activateurs. Les résultats sont rassembler dans le tableau 1.
TABLEAU 1
<EMI ID=166.1>
EXEMPLE 2
On fait incuL - des cellules de fibroblaste L-9?9
<EMI ID=167.1>
par un milieu de culture frais contenant : <EMI ID=168.1>
I/A - I/g VIII/a - VIII/h Il/a - Il/g IX/a - IX/j III/a - Ill/g X/a - X/d
<EMI ID=169.1>
<EMI ID=170.1> pour 100 ml de milieu.
On fait incuber les cultures de cellules à 37[deg.]C pendant
<EMI ID=171.1>
<EMI ID=172.1>
On ne constate aucun développement de virus sur l'une quelconque des cultures de cellules traitées et cela est vérifié par évaluation microscopique et/ou comptage de plaquer.
EXEMPLE 3
On fait incuber une culture de tissu dérivée de foetus humai:. primaire dans le milieu de culture de tjssu, puis on remplace
le milieu originel par un milieu frais qui renferme 10% de l'une des compositions suivantes :
I/h - I/i
<EMI ID=173.1>
<EMI ID=174.1>
IV/h - IV/i
V/h - V/i
VII/h - VII/i
XI/f, XI/c, Xl/g
<EMI ID=175.1>
<EMI ID=176.1>
une seule pilule de l'une des compositions XIII/h ou XIII/i pour
100 ml de milieu.
On fait incuber les cultures de cellules à 37"C pendant
12 heures, puis on les lave et les oppose au VSV et les fait incuber à nouveau à 37[deg.]C pendant 72 heures. On ne constate aucun développement de virus dans les cultures traitées, que ce soit par examens microscopiques et/ou comptage de plaques.
EXEMPLE 4
On dissout le contenu d'une seule ampoule de la composition XIV/a, b ou c, dans 1 ml de solution physiologique saline stérile.
<EMI ID=177.1>
le tableau '.' .
1 <EMI ID=178.1>
<EMI ID=179.1>
EXEMPLE 5
<EMI ID=180.1>
le virus Semliki Forcst (SFV), puis on administre par voie intr�péritonéale 0,1 ml d'une solution obtenue par mélange du contenu
<EMI ID=181.1>
<EMI ID=182.1>
après l'infection. Les données de survie des animaux sont rassem-
<EMI ID=183.1>
TABLEAU 3
<EMI ID=184.1>
<EMI ID=185.1>
<EMI ID=186.1>
TABLEAU 5
<EMI ID=187.1>
<EMI ID=188.1>
<EMI ID=189.1>
TABLEAU 7
<EMI ID=190.1>
<EMI ID=191.1>
<EMI ID=192.1>
EXEMPLE 6
<EMI ID=193.1>
HongKong 68/1 du virus de la grippe adapté aux souris.
On administre de plus, par voie intrapéritonéale juste après l'i:�fection, 0,1 ml d'une solution contenant le contenu d'une seule ampoule de composition XV/b dans 1 ml de solution physiologique; on répète cette opération une fois par jour pendant les deux jour, suivant le traitement. La moyenne de durée de survie réciproque
<EMI ID=194.1>
les groupes traités.
EXEMPLE 7
On procède tel que décrit dans 1'exemple 6, si ce n'est que
<EMI ID=195.1>
durée de survie réciproque est de 0,140 pour les témoins et de
<EMI ID=196.1>
tion.
EXEMPLE 8
<EMI ID=197.1>
<EMI ID=198.1>
<EMI ID=199.1>
1.- Procédé de préparation de complexes présentant une acti- vité antivirale supérieure, caractérisé en ce que l'on met en
<EMI ID=200.1>
dans des cellules vivantes, la production d'agents antiviraux naturels et/ou possédant intrinsèquement une activité antivirale, avec un polypeptide polycationique de synthèse, construit totale-
-ment ou en partie à l'aide d'unités d'a-aminoacide de formule générale :
<EMI ID=201.1>
dans laquelle :
A représente un grcupe :
<EMI ID=202.1>
ou
<EMI ID=203.1>
<EMI ID=204.1>
<EMI ID=205.1>
des groupes alkyles de 1 à 4 atomes de carbone, ou
<EMI ID=206.1>
<EMI ID=207.1>
atome;
R3 est un groupe alkyle de 1 à 4 atomes de carbone;
<EMI ID=208.1>
carbone;
<EMI ID=209.1>
<EMI ID=210.1>
, n peut être zéro;
ou avec un sel d'addition d'acide ou un dérive d'ammonium quaternaire d'un tel polypeptide polycationique de synthèse.
<EMI ID=211.1>