BE793180A - Composes utiles en fluorometrie - Google Patents

Composes utiles en fluorometrie

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BE793180A
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W Leimgruber
M Weigele
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Hoffmann La Roche
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Description


   <EMI ID=1.1> 

  
réactifs réagissant avec des composés contenant une amine primaire, de préférence les polypeptides et les amino-acides,

  
afin de former des produits fluorescents. En outre, l'invention

  
 <EMI ID=2.1> 

  
termédiaires dans cette préparation et à des méthodes pour déterminer les composés contenant une amine primaire.

  
En particulier, la présente invention a trait à une

  
nouvelle série de composés représentés par la formule générale

  

 <EMI ID=3.1> 


  
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou

  
d'halogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou alcoxy

  
 <EMI ID=4.1> 

  
ou aryle.

  
Ces composés produisent des substances hautement fluorescentes

  
lors de la réaction avec des composés contenant une aminé primaire,

  
 <EMI ID=5.1> 

  
représente un hydrocarbure monovalent, saturé, linéaire ou

  
ramifié, contenant jusqu'à 8 atomes -de carbone; le terme "alcoxy

  
inférieur" signifie un groupement contenant un groupe alcoyle

  
attaché à un atome d'oxygène et dont la valence libre provient

  
de l'oxygène ; le terme "aryle" représente un système cyclique

  
aromatique pouvant être substitué par un ou plusieurs des groupes

  
suivants : halogène (c'est-à-dire fluor, chlore, brome ou iode),

  
alcoyle inférieur, alcoxy inférieur, nitro, cyano,etc. Comme  <EMI ID=6.1> 

  
naphtyle, furyle, thiényle, pyrrolyle, imidazolyle, pyridyle, pyrimidyle, indolyle, quinolyle, oxazolyle, isoxazolyle, etc.

  
Les composés préférés de formule générale I sont ceux dans lesquels R représente un atome d'hydrogène. Comme exemples de composés préférés de formule générale I, on peut citer les suivants:

  
4-phénylspiro[furane-2(3H),l'-phtalan]-3,3'-dione

  
 <EMI ID=7.1> 

  
3,3'-dione 

  
4-(3,4,5-triméthoxyphényl)spiro[furane-2(3H),l'-phtalan]3,3'-dione

  
 <EMI ID=8.1> 

  
3,3'-dione 

  
4-(3-chlorophényl)spiro[furane-2(3H),l'-phtalan]-3,3'-dione   <EMI ID=9.1> 

  
3,3<1>-diore.

  
Les composés de formule générale

  

 <EMI ID=10.1> 


  
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou alcoxy

  
 <EMI ID=11.1> 

  
ou aryle,

  
peuvent être préparés en mettant en contact un composé de formule générale 
 <EMI ID=12.1> 
 dans laquelle R et R' ont la même signification que

  
 <EMI ID=13.1> 

  
chacun un groupe alcoyle inférieur ou, pris ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont attachés, un noyau hétérocyclique saturé à 5 ou 6 membres et possèdant au moins un atome d'azote ou d'oxygène comme hétéro-atome additionnel,

  
avec un agent aqueux.

  
Les énamines de formule générale 'II peuvent être converties

  
 <EMI ID=14.1> 

  
aqueuse à un pH neutre, acide ou basique. Ainsi, un acide tel qu'un acide minéral, par exemple l'acide chlorhydrique; ou une base faible telle qu'un bicarbonate de métal alcalin, par exemple le bicarbonate de soude, peuvent être présents dans le milieu d'hydrolyse. En général., il est préférable d'effectuer l'hydrolyse susmentionnée en présence d'une base faible telle qu'un bicarbonate de métal alcalin. Par hydrolyse et acidification du milieu de réaction (au cas ou l'hydrolyse est effectuée en milieu neutre ou basique), les fluorogènes cycliques de formule

  
 <EMI ID=15.1> 

  
est effectuée se trouve avantageusement entre environ 0 et environ
100[deg.], bien qu'une température entre environ 10 à 40[deg.] soit préférée, tout spécialement la température ambiante.

  
Les composés de formule générale II sont nouveaux et peuvent être préparés par réaction de composes de formule générale

  

 <EMI ID=16.1> 


  
 <EMI ID=17.1> 

  
ci-dessus, 

  
 <EMI ID=18.1> 

  
t.butoxy-méthane.

  
Le groupement amino

  

 <EMI ID=19.1> 


  
,comme indiqué dans la formule

  
 <EMI ID=20.1> 

  

 <EMI ID=21.1> 


  
dans laquelle R3 et . R 4 "représentent chacun un groupe alcoyle inférieur;

  
les tris(amino secondaire)méthanes ont la formule générale 
 <EMI ID=22.1> 
 et les bis(amino secondaire)alcoxy inférieur-méthanes ont la formule générale

  

 <EMI ID=23.1> 


  
 <EMI ID=24.1> 

  
Comme groupes amino

  

 <EMI ID=25.1> 


  
,on peut citer par exemple ceux dans

  
 <EMI ID=26.1> 

  
forment un noyau hétérocyclique à 5 ou 6 membres, par exemple pipéridino, morpholino, pyrrolidino, pipérazino, imidazolidino, pyrazolidino, etc. Comme exemples de groupes alcoxy inférieurs OR3 et OR 41 on peut citer les groupes méthoxy, éthoxy; propoxy, n-butoxy, etc. Comme exemples de groupements alcoxy inférieurs OR 51 on peut citer les groupes méthoxy, éthoxy, t.butoxy, etc.

  
Cette réaction peut être effectuée dans un solvant organique inerte, de préférence un formamide, spécialement le diméthylformamide. On peut également utiliser un excès d'agent d'aminométhénylation comme solvant. Une mise en oeuvre particulièrement

  
 <EMI ID=27.1> 

  
disubstitué de formule générale

  

 <EMI ID=28.1> 


  
comme agent d'amino-méthénylàtion, et un mélange de

  
 <EMI ID=29.1>  comprenant un formamide de formule générale ;

  

 <EMI ID=30.1> 


  
et une

  
amine secondaire de formule générale 1

  

 <EMI ID=31.1> 


  
Dans un aspect de

  
 <EMI ID=32.1> 

  
et la diméthylamine. Il est préférable d'utiliser entre environ

  
1 et environ 5 moles d'amine secondaire par mole de composé de formule générale III dans cette réaction. La préparation de l'énamine peut être effectuée à une température entre environ

  
0[deg.] à environ 100[deg.], bien qu&#65533;une température entre environ 10 et

  
40[deg.] soit préférée, tout spécialement la température ambiante.

  
Les composés de formule générale III sont nouveaux et peuvent exister en formes dicéto et .énolisées. Il s'entend que

  
la relation des formes tautomères du composé peut varier selon

  
le solvant, la température, le pH etc. Dans la partie expérimentale et les revendications, les composés de formule générale III sont indiqués par leur forme énolique uniquement pour des rasons

  
de commodité.

  
Les composés de formule générale III peuvent être préparés en mettant un composé de formule générale

  

 <EMI ID=33.1> 


  
dans laquelle R et R' ont la même signification que ci-dessus,

  
en contact avec une base dans un milieu aqueux.

  
Les composés de' formule générale VII sont généralement connus et peuvent être préparés à partir de l'acide o-acétyl-

  
 <EMI ID=34.1>  

  
Lorsque certains membres de. composés représentés' par la formule générale VII n'ont pas été décrits précédemment, ceux-ci

  
peuvent être préparés de la même manière que les composés connus.

  
Le lactone énolique de formule générale VII est hydrolysé en l'acide céto-carboxylique de formule générale III par hydrolyse aqueuse basique suivie d'acidification. Des bases appropriées pour la réaction d'hydrolyse comprennent les hydroxydes de métaux alcalins, par exemple l'hydroxyde de sodium, les carbonate de métaux alcalins, par exemple le carbonate de sodium, et les bicarbonate de métaux alcalins, par exemple le bicarbonate de soude. Une base préférée est un hydroxyde de métal alcalin tel que l'hydroxyde de sodium. La température de l'hydrolyse est située entre environ 0[deg.] et environ 100[deg.], de préférence entre environ 10 et environ 40[deg.]. La réaction d'hydrolyse est avantageusement mise en oeuvre dans un milieu aqueux. Si on le désire, on peut utiliser un co-solvant organique tel qu'un alcanol inférieur ou un éther organique.

   Une fois la réaction terminée,

  
le mélange de réaction est acidifié afin de libérer l'acide carboxylique résultant de la réaction dans le but de l'isoler.

  
Eh outre, les composés préférés de formule générale III, dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, peuvent être préparés selon le schéma de réaction suivant :

  

 <EMI ID=35.1> 
 

  
La substance de départ pour le \procédé ci-dessus est la 1,3-indanedione VIII facilement obtenable et relativement peu coûteuse. Une synthèse appropriés pour la préparation de

  
 <EMI ID=36.1> 

  
J.Chem. Educ., vol. 42, page 268 (1965).

  
, Le premier échelon de cette réaction comprend la condensation de la 1,3-indanedione avec l'aldéhyde d'alcoyle inférieur ou d'aryle approprié de formule générale IX. Cette condensation peut être effectuée par un nombre de moyens bien connus. La condensation de la 1,3-indanedione avec le benzaldéhyde a été décrite par Ionescu, Bull. Soc. Chem. France, 1930, page 210. Cette condensation comprend l'utilisation d'hydroxyde de

  
sodium dans un solvant alcoolique. D'autres conditions de réaction spécialement appropriées pour.la présente condensation sont celles utilisées pour la condensation standard de Knoevenagel. Dans ce procédé, la condensation entre la 1,3indanedione et l'aldéhyde est mise en oeuvre en présence d'une

  
 <EMI ID=37.1> 

  
l'eau de réaction. Les amines secondaires appropriées pour cette condensation comprennent les amines acycliques, telles que la diéthylamine et les amines cycliques, telles que la pipéridine, la morpholine ou la pyrrolidine. normalement ,

  
il est nécessaire d'utiliser qu'une quantité catalytique, par exemple 0,1 à 1,0 mole %, de l'amine secondaire. Les solvants appropriés pour cette réaction de condensation compr ennent

  
ceux formant des composés azéotropes avec de l'eau, tels que

  
le benzène, le toluène ou le xylène. Fréquemment, il est désirable d'utiliser comme solvant , ou comme co-solvant avec l'un des solvants susmentionnés, une amine aromatique telle

  
que la pyridine ou une amine tertiaire telle que la triéthylamine. Il est préférable d'éliminer l'eau du mélange de réaction soit par distillation azéotrope, soit en séparant l'eau au moyen d'un séparateur approprié tel que les' filtres moléculaires. 

  
La réaction de condensation est normalement effectuée

  
à température élevée, de préférence à la température de reflux

  
 <EMI ID=38.1>   <EMI ID=39.1> 

  
tion à la température de reflux du mélange de réaction ou aux environs de cette température.

  
 <EMI ID=40.1> 

  
indanedione de formule X est époxydée pour obtenir l'époxyde de formule générale XI. L'époxy.dation est mise en oeuvre au moyen de peroxyde d'hydrogène en présence d'un catalyseur basique en faible concentration dans un solvant inerte.

  
En général, on utilise une quantité molaire de peroxyde

  
 <EMI ID=41.1> 

  
préférable de.-l'utiliser en léger excès, par exemple de
10 à 20 %. 

  
Les solvants inertes appropriés pour la réaction d'épo-

  
 <EMI ID=42.1> 

  
tels que le méthanol, et des mélanges de ces derniers.

  
Comme catalyseurs basiques, on peut utiliser un hydroxyde de métal alcalin, tel que l'hydroxyde de sodium, ou un carbonate de métal alcalin, tel que le carbonate de sodium. La quantité

  
de catalyseur basique utilisée est d'environ 0,1 à environ' 5 moles %. La concentration du catalyseur dans le mélange de réaction devrait être maintenue au-dessous de la quantité 0,1 molaire

  
afin d'éviter l'ouverture du noyau époxyde.

  
 <EMI ID=43.1> 

  
général entre enviion 0[deg.] et environ 25[deg.], de préférence entre 0 et 10[deg.].

  
La séquence d'addition des réactifs n'est pas critique, bien qu'il soit généralement préféré d'ajouter le peroxyde d'hydrogène et le catalyseur basique au composé de formule générale X. De manière préférable, le catalyseur basique est additionné lentement, en dernier,.ce qui permet de mieux contrôler la température. 

  
 <EMI ID=44.1> 

  
composé de formule générale III' est effectuée par une nouvelle réaction de scission basique en milieu aqueux, dans laquelle le noyau époxyde,ainsi que le noyau cyclopentanedione sont ouverts.

  
Les bases appropriées pour cette réaction de scission sont les bases fortes telles que les hydroxydes de métaux alcalins, par exemple l'hydroxyde de sodium. Afin d'obtenir une conversion maximum, il est nécessaire d'utiliser un équivalent molaire d'une base, bien que généralement un excès molaire d'environ 2 à 10 de base soit. utilisé. La concentration de la base dans le milieu de réaction est de préférence supérieure

  
 <EMI ID=45.1> 

  
concentration environ 5,0 molaire, de préférence environ 2 molaire.

  
Comme solvants appropriés, on peut mentionner l'eau

  
et les mélanges d'eau avec des solvants organiques miscibles

  
à l'eau, tels que les alcanols inférieurs, par exemple le méthanol ou l'éthanol, les éthers, tels que le tétrahydrofuranne ou le dioxane, etc. 

  
La température de la réaction de scission n'est pas' critique et.peut être située entre environ 0[deg.] et la température de reflux du mélange de réaction. Il est en général préférable de mettre en oeuvre cette réaction 4 une température entre environ 20[deg.].et environ 40[deg.].

  
Le produit de réaction formé se présente sous forme

  
de sel de métal alcalin en solution. Le composé de formule générale III' est isolé du milieu de réaction par acidification afin de libérer l'acide de son sel de métal alcalin. Cette acidification peut être effectuée par traitement du mélange

  
de réaction brut avec un acide plus fort que l'acide de formule générale III' . Les acides appropriés comprennent par exemple les acides minéraux, par exemple l'acide chlorhydrique et l'acide sulfurique; les acides sulfoniques organiques, par

  
 <EMI ID=46.1>  mule générale III' peut ensuite être isolé par des méthodes classiques telles que l'extraction, la cristallisation etc.

  
Les diverses conversions conduisant au composé de formule générale I peuvent être mises en oeuvre avec isolation et purification du produit à chaque étape ou, de préférence, avec isolation et purification uniquement du fluorogène final de formule générale I.

  
L'utilisation de la ninhydrine comme réactif colorimétrique pour la détection et le titrage d'amino-acides, d'aminés et de peptides est connue depuis près de 60 ans. Elle sert de base pour le procédé bien connu de Stein-Moore actuellement largement

  
 <EMI ID=47.1> 

  
la ninhydrine et la phénylalanine, et ont découvert que la fluorescence était fortement renforcée par l'addition de divers peptides. Plus tard, Udenfriend et coll.,Anal. Biochem.
42, 222, 237 (1971), ont décrit un procédé de titration fluorométrique pour des composés contenant une amine primaire, spécialement des peptides et des amino-acide-s, comprenant une réaction entre le composé-contenant l'aminé primaire, la ninhydrine et un aldéhyde, de préférence le phénylacétaldéhyde. Ce procédé a prouvé être bien plus efficace et sensible que les procédés

  
 <EMI ID=48.1> 

  
les fluorogènes de formule générale I réagissent facilement avec les composés contenant une amine primaire, en particulier avec les peptides, les amino-acides et les amines biogènes, par exemple les catécholamines, pour former des substances hautement fluorescentes. Ainsi, les composés de formule générale I servent de réactifs hautement sensibles pour la détection de composés contenant une amine primaire. Du fait que les composés de formule générale I sont stables en milieu aqueux, la détection' de composés contenant une amine primaire présents dans de

  
tels milieux est rendue très pratiquable. Ceci est spécialement

  
 <EMI ID=49.1> 

  
néralement trouvés et analysés en milieu aqueux. 

  
La réaction entre les fluorogènes de formule générale 1 et les composés contenant une aminé primaire est rapide et quantitative. La réaction peut être effectuée à un pH entre environ 4 et environ 11. Cependant, la vitesse et-\la totalité de la réaction du fluorogène avec le composé contenant l'amine primaire sont optima à un pH entre environ 8 et 9. Ainsi, la réaction d'un composé de formule générale I avec une simple aminé primaire,

  
 <EMI ID=50.1> 

  
formule générale I pour la détection de composés contenant

  
une amine primaire est supérieure à la technique comme décrite ci-dessus comprenant une réaction ternaire entre un composé contenant une amine primaire, la ninhydrine et le phénylacétaldéhyde. En outre, une supériorité des réactifs et méthodes de la présente invention peut être vue en ce que, dans les procédés connus, il est nécessaire de chauffer le mélange des réactifs

  
à une température d'environ 60[deg.] pendant 15 à 30 minutes afin

  
de développer la fluorescence maximum, tandis que, au contraire, les réactifs de la présente invention développent instantanément

  
la fluorescence maximum à la température ambiante. La fluorescence obtenue en utilisant des concentrations égales de composés contenant une aminé primaire et de réactifs de la présente invention est généralement de 10 à 50 fois plus grande que celle obtenue-selon les techniques connues. Ainsi, les réactifs de

  
la présente invention peuvent être utilisés pour détecter des quantités extrêmement minimes de composés contenant une aminé primaire, ce qui était impossible auparavant. Grâce à la sensitivité.des réactifs de la présente invention, de petites quantités de peptides et d'amino-acides peuvent être détectées.

  
Par exemple, on peut détecter et examiner des quantités de peptides biologiquement actifs, isolés de certains organes .ou d'un simple animal de laboratoire.

  
L'utilisation des réactifs de la présente invention pour

  
la détection de composés contenant une amine primaire peut être illustrée de multiples façons. Par exemple, la présence de composés contenant une amine primaire en solution peut être   <EMI ID=51.1> 

  
 <EMI ID=52.1> 

  
cence. Il est préférable d'avoir le composé contenant l'amine primaire en solution dans un milieu aqueux et de le traiter avec une solution du fluorogène dans un solvant non-hydroxylique

  
 <EMI ID=53.1> 

  
On préfère une quantité de fluorogène en excès molaire de 10 à

  
5000 fois, la quantité molaire en excès de 50 à 1000 fois étant spécialement préférée.

  
En outre, les fluorogènes de la présente invention peuvent être utilisés pour détecter la présence de composés contenant

  
une aminé primaire, et spécialement les amino-acides, dans les systèmes de chromatographie sur papier ou à couche mince. Dans une telle technique, le réactif dans un solvant, de préférence un solvant organique volatile, contenant éventuellement un tampon à pH,

  
est appliqué au système chromatographique, en général comme

  
spray, et le chromatogramme sur papier ou'à couche mince est

  
examiné sous une source de lumière fluorescente. Le développement

  
de la fluorescence est instantané à la température ambiante et, ainsi, il n'est pas nécessaire de chauffer le chromatogramme

  
afin de développer la fluorescence. Ceci offre un avantage

  
décisif sur les techniques connues.

  
Une autre application des fluorogène.s de la présente invention est leur utilisation dans l'analyse automatique d'aminoacides. Dans un tel procédé, un échantillon prélevé de l'éffluent d'une colonne à chromatographier est mélangée avec le réactif fluorogénique de formule générale I au pH désiré, et le mélange

  
est immédiatement analysé au moyen d'un spectrofluoromètre.

  
De cette manière, en variant la fluorescence du courant continu

  
de l'échantillon, on peut détecter la présence et la concentration de différents amino-acides.

  
Les exemples permettront d'apprécier la préparation des nouveaux fluorogène.s de la présente invention et leur 'utilisa-

  
 <EMI ID=54.1>  

  
 <EMI ID=55.1> 

  
maire .

Exemple 1

  
A une solution de 20 g de 3-benzylidène-4-céto-3,4-dihy-

  
 <EMI ID=56.1> 

  
 <EMI ID=57.1> 

  
L'acide o-(a-hydroxy-cinnamoyl)-benzoïque précipité est extrait deux fois avec du chloroforme. Les extraits organiques sont lavés avec de l'eau, séchés sur du sulfate de sodium et évaporés à siccité sous pression réduite. Le résidu est dissous dans

  
80 ml de diméthylformamide. La solution est refroidie à 0[deg.]

  
 <EMI ID=58.1> 

  
la solution de diméthylformamide est versée dans de l'eau glacée. La solution aqueuse alcaline qui en résulte est extraite avec

  
de l'éther. L'extrait-éthéré est éliminé et la phase aqueuse acidifiée avec de l'acide chlorhydrique dilué. La 4-phénylspiro[furan-2(3H)-l-phtalan]-3,3'-dione désirée est extraite

  
3 fois avec un mélange éther/benzène (1:1). Les extraits combinés sont séchés sur du sulfate de sodium et évaporés sous pression

  
 <EMI ID=59.1> 

  
dans de l'éther et séparé par filtration pour donner 12,0 g de substance pure fondant à 153[deg.].

  
Les composés mentionnés dans la table I sont préparés

  
 <EMI ID=60.1> 

  
table II. 

  
 <EMI ID=61.1> 

  

 <EMI ID=62.1> 
 

  
 <EMI ID=63.1> 

  
(Suite)

  

 <EMI ID=64.1> 


  
Les substances de départ peuvent être préparées de la manière suivante :

  
 <EMI ID=65.1> 

  
 <EMI ID=66.1> 

  
50 ml de benzène est chauffée à reflux sous azote jusqu'à ce que la quantité théorique d'eau (0,05 mole) soit récoltée dans une trappe de Dean-Stark (environ-2 heures). Le mélange de réaction est ensuite refraidi à 10[deg.] et le produit séparé par filtration. La masse de filtration est recristallisée dans le benzène et  <EMI ID=67.1> 

  
dans à 177[deg.].

  
De manière analogue, les composés mentionnés dans la table II sont préparés à partir de 1,4-chromanedione et des aldéhydes correspondants. 

  
 <EMI ID=68.1> 
 <EMI ID=69.1> 
  <EMI ID=70.1> 

  
(Suite)
 <EMI ID=71.1> 
  <EMI ID=72.1> 

  
A une solution de 12,5 g de 3-benzylidène-4-céto-3,4dihydro-isocoumarine,préparée selon les indications de l'exemple 1, dans 200 ml de méthanol, on ajoute 50 ml d'hydroxyde de so-

  
 <EMI ID=73.1> 

  
ture ambiante pendant 90 minutes, puis versé sur de la glace. Le mélange aqueux résultant est acidifié avec 50 ml d'acide <EMI ID=74.1> 

  
Les extraits sont combinés, séchés sur du sulfate de sodium et évaporés dans le vide. Le résidu contenant l'acide o-(a-hydroxy-

  
 <EMI ID=75.1> 

  
A cette solution, on ajoute 30 g de tris-(pipéridino)-méthane. Le mélange est remué à la température ambiante pendant 5 heures,

  
 <EMI ID=76.1> 

  
Le mélange alcalin aqueux est extrait avec de l'éther. L'extrait éthéré est rejeté. La couche, aqueuse est acidifiée avec de l'acide

  
 <EMI ID=77.1> 

  
de méthylène. Des extraits organiques sont combinés lavés avec de l'éther, séchés sur du sulfate de sodium et évaporés a

  
 <EMI ID=78.1> 

  
de chlorure de méthylène et traité avec 1 g de norite à la température de reflux. La solution chaude est filtrée. Le filtrat est concentré à 50 ml et dilué avec 100 ml d'éther. De ce mélange ,

  
 <EMI ID=79.1> 

  
tionnées à la table II.

Exemple 3

  
 <EMI ID=80.1>   <EMI ID=81.1> 

  
avec de l'acide chlorhydrique dilué et extraite avec du chlorure de méthylène. L'extrait organique est séché sur du sulfate de sodium.et concentré dans le vide. Le concentré est appliqué

  
à une courte colonne de gel de silice (4,5 g) et éluée avec

  
'du chlorure de méthylène. L'éluat est évaporé dans le vide et

  
le résidu est recristallisé dans un mélange chlorure de méthylène/ éther. On obtient ainsi 110 mg de 4-phénylspiro[furan-2(3H),l'phtalan]-3,3'-dione fondant à 151-154[deg.].

  
La substance de départ peut être préparée de la 'manière suivante : 

  
A une suspension de 2,5 g de 3-benzylidène-4-céto-3,4dihydroisocoumarine,préparée selon les indications de l'exemple l,dans 50 ml de méthanol, on ajoute 10 ml d'hydroxyde de sodium

  
 <EMI ID=82.1> 

  
1 heure. Il en résulte une solution rouge foncé . La solution est diluée avec de l'eau, acidifiée avec 10 ml d'acide chlorhy-

  
 <EMI ID=83.1> 

  
Les extraits organiques sont combinés, lavés avec de l'eau, séchés sur du sulfate de sodium et évaporés dans le vide à
20-30[deg.]. Le résidu est dissous dans du chlorure de méthylène

  
à la température ambiante. On ajoute de l'éther de pétrole à la solution jusqu'à ce que. une turbidité apparaisse. Le mélange résultant est maintenu à la température ambiante pendant 16 heures, après quoi l'acide désiré qui a cristallisé est séparé par filtration. Les cristaux sont lavés sur le filtre avec un mélange chlorure de méthylène/éther de pétrole (1:9) et

  
 <EMI ID=84.1> 

  
cinnamoyl)-benzolque fondant à 99-105[deg.],

  
Les composés mentionnés dans la table III sont préparés de manière analogue en partant des 3-arylidène-4-céto-3,4-dihydro- <EMI ID=85.1> 

  
Table III
 <EMI ID=86.1> 
  <EMI ID=87.1> 

  
cinnamoyl)-benzoïque, préparée selon les indications de l'exemple 3,dans 30 ml de diméthylformamide, on ajoute 5 g de tris-(di-

  
 <EMI ID=88.1> 

  
ambiante pendant 3 1/2 heures. La plupart de l'agent de formylation en excès et le solvant sont ensuite éliminés sous pression <EMI ID=89.1>  dissous dans 10 ml de diméthylformamide, puis cette solution est'versée dans 100 ml d'eau. Le mélange alcalin résultant est extrait avec du chlorure de méthylène. L'excès organique est éliminé. La phase aqueuse est acidifiée avec de l'acide chlorhydrique dilué et extraite deux.fois avec du chlorure de méthylène. Les phases organiques sont combinées, lavées avec

  
 <EMI ID=90.1> 

  
siccité sous pression réduite. L'huile résiduelle est dissoute dans de l'éther. Des cristaux se précipitent de la -solution éthérée après réfrigération. Ils sont récoltés par filtration 'et donnent 2,4 g de 4-(2-méthoxyphényl)spiro[furan-2(3H),'l'phtalan]-3,3'-dione fondant à 152-154[deg.]. 

  
 <EMI ID=91.1> 

  
en les spirolactones correspondantes mentionnées à la.table I par des procédés analogues.

Exemple 5

  
A une solution remuée de 16,08 g (0,06 mole) d'acide

  
 <EMI ID=92.1> 

  
de l'exemple 3,dans 60 ml d'une solution 2N de diméthylasine . dans le diméthylformamide (préparée par dilution de 90 g de

  
 <EMI ID=93.1>   <EMI ID=94.1> 

  
pendant 2 heures. Il est ensuite versé dans 500 si d'eau glacée. La solution aqueuse est soigneusement acidifiée au pH 4 avec de

  
 <EMI ID=95.1> 

  
avec 3 fois 600 ml d'un-mélange éther/benzène (1:1). Les extraits sont combinés, lavés avec 500 ml de bicarbonate de soude aqueux à lido, et finalement avec de l'eau. La solution organique est séchée'sur du sulfate de sodium et évaporée sous pression.réduite. Le résidu solide est dissous dans 50 ml de chlorure de

  
 <EMI ID=96.1> 

  
d'éther. Par réfrigération, on obtient 9,03 g de 4-phénylspiro[furan-2(3H),l'-phtalan]-3,3'-dione sous forme de cristaux

  
blancs fondant à 154-155[deg.]. Une seconde récolte de 1,54 g de produit de pureté égale est obtenue par concentration de la liqueur-mère et addition d'éther. Les composés mentionnés à la table III peuvent être convertis en les spirolactones correspondantes mentionnés à la table I par des- procédés analogues.

Exemple 6

  
En partant des acides 2-acétylbenzoiques appropriés.substitués en position 5, et en préparant, d'abord selon des procédés connus, les 1,4-isochromanediones substituées en position 7 correspondantes, et ensuite_selon le procédé de l'exemple 1 les 3-benzylidène-4-céto-3,4-dihydroisocoumarines substituées en position 7, on obtient la série suivante d'intermédiaires et de fluorogènes:

  
 <EMI ID=97.1> 

  
3,4-dione, 

  
5'-méthyl-4-phénylspiro[furane-2(3H),1'-phtalan]-3,3'-dione,

  
 <EMI ID=98.1> 

  
3,4-dione,

  
ri  <EMI ID=99.1> 

  
l-diméthylamino-2-phényl-4-(2-carboxy-4-chloro-phényl)-l-butène3,4-dione,

  
 <EMI ID=100.1> 

  
exothermique. La température est maintenue au-dessous de 35[deg.] par refroidissement extérieur. On continue de remuer pendant 3 1/2 heures. Le mélange de réaction est ensuite versé dans 2 litres d'eau. La solution alcaline qui en résulte est lavée avec 500 ml d'éther. L'extrait éthéré est rej.eté. La phase

  
 <EMI ID=101.1> 

  
extraite avec du chloroforme. L'extrait chloroformé est lavé avec de l'eau, séché sur du sulfate de sodium et évaporé sous pression réduite. Le résidu cristallisé est trituré avec 500 ml

  
 <EMI ID=102.1> 

  
à 106-115[deg.]. On obtient un produit analytiquement pur fondant à 106-115[deg.] par recristallisation dans un mélange chlorure de méthylène/éther de pétrole.

  
En procédant-de la manière décrite ci-dessus et en

  
 <EMI ID=103.1>   <EMI ID=104.1> 

  
indolyl; 2-naphtyl ; 1-naphtyl.

  
Les substances de départ peuvent être préparées de la manière suivante :

  
Dans un ballon de 1 litre, muni d'un séparateur d'eau de Dean-Stark et d'un condenseur à reflux, on place 73,0 g de

  
 <EMI ID=105.1> 

  
53,0 g de benzaldéhyde et finalement 0,5 ml de pipéridine. Le mélange-est chauffé à reflux sous azote jusqu'à ce que la quan-

  
 <EMI ID=106.1> 

  
d' eau. On laisse ensuite refroidir à la température ambiante.

  
Il se précipite un-produit cristallisé, que l'on sépare par filtration, lave sur le filtre avec un mélange éther/éther

  
de pétrole (point d'ébullition 30-60[deg.]) (1:1) et sèche à l'air pour obtenir 91,0 g de cristaux vert pâle fondant à 150-152[deg.].

  
Le filtrat est évaporé à siccité sous pression réduite. Le résidu est redissous dans du chloroforme, puis la solution obtenue est filtrée à travers du gel de silice (environ 400 g). Le filtrat est évaporé à siccité et le résidu recristallisé dans un mélange benzène/éther afin d'obtenir une récolte additionnelle de 12,1 g de cristaux vert pâle fondant à 150-152[deg.]. Le ren-

  
 <EMI ID=107.1> 

  
dione, suffisamment pure pour l'échelon suivant.

  
Un échantillon d'analyse, recristallisé dans le méthanol, possède un point de fusion de 152-153[deg.]. 

  
En travaillant de la manière décrite ci-dessus et en remplaçant le benzaldéhyde par l'aldéhyde approprié de formule générale IX, on obtient les composés de formule générale X dans  <EMI ID=108.1> 

  
3-indolyl; 2-naphtyl-; 1-naphtyl; n-propyl.

  
Dans un tricol de 2 litres, équipé d'un agitateur et d'un entonnoir à robinet, on place 96,0 g de 2-benzylidène-indane-l,3dione, 1000 ml de méthanol et 60 ml de peroxyde d'hydrogène à

  
 <EMI ID=109.1> 

  
telle que la température reste au-dessous de 15[deg.]. Une fois l'addition terminée, on continue de remuer à la température ambiante pendant encore 30 minutes. Le mélange est ensuite versé dans

  
4,5 litres d' eau. Le précipité cristallisé obtenu est récolté

  
par filtration et lavé sur le filtre plusieurs fois avec de l'eau. La substance est séchée jusqu'au lendemain dans le vide

  
 <EMI ID=110.1> 

  
de cristaux blancs fondant à 154-156[deg.]. Le produit est assez pur pour être utilisé dans l'échelon suivant.

  
Un échantillon analytique, recristallisé dans l'acétate d'éthyle, présente un point de fusion de 158[deg.].

  
En procédant selon la manière décrite ci-dessus et en rem-

  
 <EMI ID=111.1>   <EMI ID=112.1> 

  
Procédure:- 

  
Dans un tube à essai, on place :
a) 1 ml de solution de peptide (20 nanomoles de leucyl-alanine dans 1 ml de tampon de phosphate au pH 8) et b) 2 ml de solution tampon au pH 8 (Fisher). Tout en agitant avec un vibro-mélangeur, on ajoute rapidement <EMI ID=113.1>  lactone de la table I dans 100 ml d'acétonitrile).

  
La concentration finale est :

  
leucyl-alànine : 5 nanomoles/ml

  
 <EMI ID=114.1>   <EMI ID=115.1> 

  
tampon aqueux: 75%

  
La fluorescence est mesurée immédiatement.

  
Instrumentation :

Spectrofluoromètre de Farrand

  
Excitation: 390 nm; fentes 10,10 Emission: 385 nm; fentes 20,20 Sensitivité = 1

  
Résultats :

  
 <EMI ID=116.1> 

  
comme réactif, on observe une intensité de fluorescence de

  
80, par rapport à une intensité de fluorescence de 70 (avec les mêmes dispositifs d'excitation et d'émission) pour une solution

  
 <EMI ID=117.1> 

  
La susdite expérience est répétée en utilisant l'éthylamine en lieu et place de leucyl-alanine, et l'éthanol en lieu et place de l'acétonitrile. L'intensité de fluorescence obtenue par l'utilisation de diverses spirolactones comme réactifs selon la table I est montrée à la table IV. On a assigné arbitrairement la valeur 100 à l'intensité de fluorescence obtenue en utilisant la 4-phénylspiro[furane-2(3H),1'-phtalan]-3,3'-dione, et les autres intensités sont relatives à cette valeur. 

  
 <EMI ID=118.1> 

  

 <EMI ID=119.1> 
 

  
 <EMI ID=120.1> 

  
1. Un composé de formule générale

  

 <EMI ID=121.1> 


  
dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou alcoxy inférieur et R' représente un groupe alcoyle inférieur ou aryle.

Claims (1)

  1. 2. Un.composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que R représente un atome d'hydrogène. <EMI ID=122.1>
    dione.
    6. 4-(4-méthoxyphényl)spiro[furane-2(3G),l'-phtalan]3,3'-dione.
    7. 4-(2,4-diméthoxyphényl)spiro[furane-2(3H),1'-phtalan]3,3'-dione.
    8. 4-(2,5-diméthoxyphényl)spiro[furane-2(3H),1'-phtalan]3,3'-dione.
    <EMI ID=123.1>
    3,3'-dione. <EMI ID=124.1>
    phtalan]-3,3'-dione.
    11. 4-(2,4,5-triméthoxyphényl)spiro[furane-2(3H),l'-
    <EMI ID=125.1>
    dione.
    19. 4-(l-propyl)spiro[furane-2(3H),l'-phtalan]-3,3'dione.
    20. Procédé pour la préparation d'un composé de formule générale <EMI ID=126.1> dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ' ou d'halogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou alcoxy inférieur et R' représente un groupe alcoyle inférieur ou aryle,
    caractérisé en ce qu'un composé de formule générale
    <EMI ID=127.1>
    dans laquelle R et R' ont la même signification que
    <EMI ID=128.1>
    chacun un groupe alcoyle inférieur ou, pris ensemble, avec l'atome d'azote auquel ils sont attachés, un
    <EMI ID=129.1>
    sèdant au moins un atome d'azote ou d'oxygène comme hétéro-atome additionnel,
    est mis en contact avec un milieu aqueux.
    21. Procédé selon la revendication 20 pour la préparation d'un composé de formule générale <EMI ID=130.1> dans laquelle R' représente un groupe alcoyle inférieur ou aryle,
    caractérisé en ce qu'un composé de formule générale
    <EMI ID=131.1>
    <EMI ID=132.1>
    <EMI ID=133.1>
    chacun un-groupe alcoyle inférieur ou, pris ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont attachés, un noyau hétérocyclique saturé à 5 ou 6 membres et possédant au moins un atome d'azote ou d'oxygène corne hétéro-atome additionnel,
    est mis en contact avec un milieu aqueux.
    22. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21, pour la préparation de 4-phénylspiro[furane-2(3H),l'-phtalan]3, 3'-dione, carac térisé e n ce qu'un composé de formule générale II dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, R' repré-
    <EMI ID=134.1> 23. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou. 21 pour
    <EMI ID=135.1>
    <EMI ID=136.1>
    est mis en contact avec un milieu aqueux.
    24. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=137.1>
    <EMI ID=138.1>
    la revendication 22 et R' représente un groupe 3-méthoxyphényle, est mis en contact avec un milieu aqueux.
    25. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=139.1>
    phtalan]-3,3'-dione,caractérisé en ce qu'un composé de formule
    <EMI ID=140.1>
    <EMI ID=141.1>
    phényle,est mis en contact avec un milieu aqueux.
    26. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=142.1>
    <EMI ID=143.1>
    méthoxyphényle,est mis en contact avec un milieu aqueux.
    27. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=144.1>
    phtalan]-3,3'-dione,caractérisé en ce qu'un composé de formule
    <EMI ID=145.1>
    que dans la revendication 22 et R' représente un groupe 2,5diméthoxyphényle,est mis en contact avec un milieu aqueux.
    28. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=146.1>
    phtalan]-3,3'-dione,caractérisé en ce qu'un composé de formule <EMI ID=147.1>
    <EMI ID=148.1>
    triméthoxyphényle,est mis en contact avec un milieu aqueux.
    31. Procédé.suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=149.1>
    que dans la revendication 22 et R' représente un groupe 3',4méthylènedioxyphényl e, est mis en contact avec un milieu aqueux.
    32. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=150.1>
    3,3<1>-dione,caractérisé en ce qu'un composé de formule générale
    <EMI ID=151.1>
    <EMI ID=152.1>
    est mis en contact avec un milieu aqueux.
    33. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=153.1>
    II, dans laquelle R, il 41 et R2 ont la même signification que dans la revendication 22 et R' représente un groupe 4-chlorcphényle, est mis en contact avec un milieu aqueux. 34. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour la préparation de 4-(4-bromophényl)spiro[furane-2(3H),l'-phtalan]3,3'-dione,caractérisé en ce qu'un composé de formule générale
    <EMI ID=154.1>
    la revendication 22 et R' représente un groupe 4-bromophényle, est mis en contact avec un milieu aqueux.
    35. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=155.1>
    la revendication 22 et R' représente un groupe 3-indolyle, est mis en contact avec un milieu aqueux.
    36. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=156.1>
    est mis en contact avec un milieu aqueux.
    37. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=157.1>
    mis en contact avec un milieu aqueux.
    38. Procédé suivant l'une des revendications 20 ou 21 pour
    <EMI ID=158.1>
    3,3<1>-dione,caractérisé en ce qu'un composé de formule générale
    <EMI ID=159.1>
    la revendication 22 et R' représente un groupe 1-propyle&#65533;est mis en contact avec un milieu aqueux.
    39. Procédé selon .l'une des revendications 20 à 38, caractérisé en ce qu'un acide ou une base sont présents dans le milieu aqueux. <EMI ID=160.1>
    que la base est un bicarbonate de métal alcalin.
    41. Procédé selon l'une des revendications 20 à 40, caractérisé en ce que la température est d'environ 10[deg.] à environ 40[deg.].
    42. Procédé pour la préparation d'un composé de formule générale
    <EMI ID=161.1>
    dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou alcoxy inférieur , R' représente un groupe alcoyle inférieur
    <EMI ID=162.1>
    chacun un groupe alcoyle inférieur ou, pris ensemble, avec 1'atome d'azote auquel ils sont attachés, un
    <EMI ID=163.1>
    sèdant au moins un atome d'azote ou d'oxygène cornue hétéro-atome additionnel,
    caractérisé en ce qu'un composé de formule générale <EMI ID=164.1> <EMI ID=165.1>
    ci-dessus,
    <EMI ID=166.1>
    tués de formule générale
    <EMI ID=167.1>
    <EMI ID=168.1>
    <EMI ID=169.1>
    groupe alcoyle inférieur,
    ou des tris(amino secondaire )méthanes de formule générale
    <EMI ID=170.1>
    <EMI ID=171.1>
    ci-dessus,
    ou des tris(amino secondaire )alcoxy inférieur-méthanes de formule générale
    <EMI ID=172.1>
    dans laquelle R,- représente un groupe alcoyle inférieur
    <EMI ID=173.1>
    43. Procédé selon la revendication 42, caractérise, en ce <EMI ID=174.1>
    substitué de formule générale
    <EMI ID=175.1>
    et une amine secondaire de formule générale
    <EMI ID=176.1>
    <EMI ID=177.1>
    ci-dessus,
    45. Procédé selon la revendication 43, caractérisé par le
    <EMI ID=178.1>
    diméthylamine.
    47. Procédé selon l'une des revendications 42 à 46,
    <EMI ID=179.1>
    thylamine sont utilisées par mole d'acide dicéto-carboxylique de départ.
    48. Procédé selon la revendication 42, caractérisé par le
    <EMI ID=180.1> <EMI ID=181.1>
    52. Procédé selon l'une des revendications 42 à 51, caractérisé par le fait que la température est d'environ 10[deg.] à environ 40[deg.].
    53. Procédé sel.on l'une des revendications 42, 48, 49,
    <EMI ID=182.1>
    tris-(pipéridino)méthane.
    55. Procédé selon l'une des revendications 42, 48, 49,
    <EMI ID=183.1>
    avec le tris-(diméthylamino)méthane.
    56. Procédé selon l'une des revendications 42 à 47 pour
    <EMI ID=184.1>
    diméthylacétal,
    57. Procédé pour la préparation d'un composé de formule générale <EMI ID=185.1> <EMI ID=186.1>
    ou aryle,
    ou d'un de ses sels de métal alcalin, caractérisé par le fait que:
    a).' un composé de formule générale <EMI ID=187.1> dans laquelle R' a la même signification'que ci-dessus,
    est mis en contact avec le peroxyde d&#65533;hydrogène et un catalyseur basique dans un solvant inerte afin-d'obtenir un composé de formule générale
    <EMI ID=188.1>
    <EMI ID=189.1>
    et
    b) le composé ainsi formé est mis en contact avec une base forte dans un milieu aqueux.
    58. Un procédé selon la revendication 57, caractérisé par
    <EMI ID=190.1>
    xyde de métal alcalin.
    <EMI ID=191.1>
    <EMI ID=192.1>
    et 5 moles $ d'hydroxyde de métal alcalin par rapport au composé de formule générale X.
    60. Un procédé selon l'une des revendications 57 à 59, caractérisé par le fait que dans l'échelon (a) la concentration
    <EMI ID=193.1>
    61. Un procédé selon l'une des revendications 57 à 60, caractérisé par le fait que dans l'échelon (a) le milieu de réaction contient de l'eau ou un alcanol inférieur.
    <EMI ID=194.1>
    caractérisé par le fait que dans l'échelon (a) la température est entre environ 0[deg.] et 25[deg.].
    63. Un procédé selon l'une des revendications 57 à 62, caractérisé par le fait que dans l'échelon (b) la base forte est un hydroxyde-de métal alcalin.
    <EMI ID=195.1>
    caractérisé par le fait que dans l'échelon (b) on utilise un excès molaire d'hydroxyde de métal alcalin.
    65. Un procédé selon l'une des revendications 57 à 64, caractérisé.par le fait que dans l'échelon (b) la température
    est entre environ 20[deg.] et environ 40[deg.].
    66. Un procédé selon l'une des revendications 57 à 65, caractérisé par le fait que dans l'échelon (b) la concentration en
    <EMI ID=196.1>
    67. Un procédé selon l'une des revendications 57 à 66, caractérisé par le fait que le sel de métal alcalin du composé
    de formule générale III' est converti en l'acide libre par réaction avec un acide fort.
    68. Procédé pour la préparation d'un composé de formule générale <EMI ID=197.1> <EMI ID=198.1>
    ou aryle,
    <EMI ID=199.1>
    composé de formule générale
    <EMI ID=200.1>
    dans laquelle R' a la même signification que ci-dessus,
    est mis en contact avec une base forte en milieu aqueux.
    69. Un procédé. selon la revendication 68, caractérisé par le fait que la base forte est un hydroxyde de métal alcalin.
    <EMI ID=201.1>
    ractérisé par le fait qu'un excès molaire d'hydroxyde de métal alcalin est utilisé.
    71. Un procédé selon l'une des revendications 68 à 70,
    <EMI ID=202.1>
    et 40[deg.].
    <EMI ID=203.1>
    alcalin est ?0,5 molaire.
    <EMI ID=204.1> caractérisé par le fait que le sel de métal alcalin -du compose de formule générale III' est converti en l'acide libre par réaction avec un acide fort.
    74. Un procédé selon l'une des revendications 57 à 67
    <EMI ID=205.1>
    est mise en contact avec le peroxyde d'hydrogène et de l'hydroxyde de sodium dans le méthanol, afin d'obtenir la 3-phénylspiro-
    <EMI ID=206.1>
    en contact avec de l'hydroxyde de sodium aqueux.
    75. Un procédé selon 1.1-une des revendications 68 à 73,
    <EMI ID=207.1>
    l',3'-dione est mise en contact avec.de l'hydroxyde de sodium aqueux.
    76. Procédé pour la préparation d'un composé de formule générale
    <EMI ID=208.1>
    dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou
    -d'halogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou alcoxy <EMI ID=209.1>
    ou aryle,
    caractérisé en ce qu'un composé de formule générale <EMI ID=210.1> <EMI ID=211.1>
    ci-dessus,
    est mis en contact avec un milieu aqueux.
    77. Procédé selon la revendication 76, caractérisé par le fait que la base est un hydroxyde de métal alcalin.
    78. Procédé selon l'une des revendications 76 ou 77, caractérisé par le fait que.la température est d'environ 10 à environ 40[deg.].
    79. Procédé selon l'une des revendications 76 à 78,
    <EMI ID=212.1>
    dihydroisocoumarine est mise en contact avec de l'hydroxyde de sodium aqueux. 80. Un'compose de formule générale
    <EMI ID=213.1>
    dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, ou.un groupe alcoyle inférieur ou alcoxy inférieur et R' représente un groupe alcoyle inférieur ou aryle.
    81. Un composé selon la revendication 80, caractérisé en ce que R représente un atome d'hydrogène.
    <EMI ID=214.1> <EMI ID=215.1>
    <EMI ID=216.1>
    dans laquelle R' représente un groupe alcoyle inférieur ou aryle.
    99. Un composé selon la revendication 98, caractérisé en ce que R' représente un groupe phényle.
    <EMI ID=217.1> <EMI ID=218.1>
    117. Un composé de formule générale <EMI ID=219.1> dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou alcoxy inférieur, R' représente un groupe alcoyle inférieur
    <EMI ID=220.1>
    chacun un groupe alcoyle inférieur ou, pris ensemble avec l'atome d'azote auquel ils sont attachés, un noyau hétérocyclique saturé à 5 ou 6 membres et possédant au moins un atome d'azote ou d'oxygène comme hétéro-atome additionnel.
    118. Un composé selon la revendication 117, caractérisé en ce que R représente un atome d'hydrogène.
    119. Un composé selon l'une des revendications 117 ou 118, caractérisé en ce que R' représente un groupe phényle.
    120. Un composé selon l'une des revendications 117 eu 118,
    <EMI ID=221.1>
    caractérisé en ce que R' représente le groupe 4-méthoxyphényle.
    <EMI ID=222.1>
    1 i <EMI ID=223.1>
    126. Un composé selon l'une des revendications 117 ou 118,
    <EMI ID=224.1>
    phényle.
    127. Un composé selon l'une des revendications 117 ou 118, caractérisé en ce que R' représente le groupe 2,4,5-triméthoxyphényle.
    128. Un composé selon l'une des revendications 117 ou 118,
    <EMI ID=225.1>
    phényle.
    129. Un composé selon l'une des revendications 117 ou 118,
    <EMI ID=226.1>
    130. Un composé selon l'une des revendications 117 ou 118,
    <EMI ID=227.1>
    131. Un composé selon l'une des revendications 117 ou 118,
    <EMI ID=228.1>
    132. Un composé selon l'une des revendications 117 ou 118,
    <EMI ID=229.1>
    133'. Un composé selon l'une des revendications 117 ou 118,
    <EMI ID=230.1>
    134. Un composé selon l'une des revendications 117 ou 118, caractérisé en ce que R' représente le groupe 1-naphtyle.
    <EMI ID=231.1> <EMI ID=232.1>
    butène-3,4-dione.
    137. Réactif pour la détermination de composés contenant une amine primaire, caractérisé en ce qu'il contient un composé de formule générale
    <EMI ID=233.1>
    dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou alcoxy inférieur, et R' représente un groupe alcoyle inférieur ou aryle.
    138. Réactif selon la revendication 137, caractérisé en ce qu'il contient un composé de formule générale I, dans laquelle R représente un atonie d'hydrogène.
    139. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138,
    <EMI ID=234.1>
    phtalan]-3,3'-dione.
    <EMI ID=235.1>
    <EMI ID=236.1>
    142. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138, caractérisé en ce qu'il contient le 4-(4-méthoxyphényl)spiro-
    <EMI ID=237.1> 143. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138, caractérisé en ce qu'il contient le 4-(2,4-diméthoxyphényl)spiro-
    <EMI ID=238.1>
    144. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138, caractérisé en ce qu' il contient le 4-(2,5-diméthoxyphényl)-
    <EMI ID=239.1>
    145. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138, caractérisé en ce qu'il contient le 4-(3,5-diméthoxyphényl)-
    <EMI ID=240.1>
    146. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138, caractérisé en ce qu'il contient le 4-(3,4,5-triméthoxyphényl)-
    <EMI ID=241.1>
    149. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138, caractérisé en ce qu'il contient le 4-(3-chlorophényl)spiro[furane-
    <EMI ID=242.1>
    150. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138, caractérisé en ce qu'il contient le 4-(4-chlorophényl)spiro[furane2(3H),l'-phtalan]-3,3'-dione.
    151. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138, caractérisé en ce qu'il contient le 4-(4-bromophényl)spiro[furane-
    <EMI ID=243.1>
    152. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138, caractérisé en ce qu'il contient le 4-(3-indolyl)spiro[furane- <EMI ID=244.1>
    caractérisé en ce qu'il contient le 4-(2-naphtyl)spiro[furane2(3H),1'-phtalan]-3,3'-dione.
    154. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138, caractérisé en ce qu'il contient le 4-(l-naphtyl)spiro[furane-
    <EMI ID=245.1>
    155. Réactif selon l'une des revendications 137 ou 138,' caractérisé en ce qu'il contient le 4-(l-propyl)spiro[furane-
    <EMI ID=246.1>
    156. Méthode pour déterminer un composé contenant une aminé primaire dans un mélange contenant ce composé, caractérisée en ce qu'on traite ce mélange avec un composé de formule générale
    <EMI ID=247.1>
    dans laquelle R représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, ou un groupe alcoyle inférieur ou alcoxy inférieur et R' représente un groupe alcoyle inférieur
    .ou aryle, afin d'y produire une substance fluorescente, et à faire fluonscer cette substance.
    157. Une méthode selon la revendication 156, caractérisée en ce que le traitement est fait en solution. 158. Une méthode selon l'une des revendications 156 ou 157, caractérisée en ce que le pH de la solution est entre 8 et 9.
    159. Une méthode selon l'une des revendications 156 à 158,
    <EMI ID=248.1>
    <EMI ID=249.1>
    composé contenant l'amine primaire.
    160. Une méthode selon l'une des revendications 156 à 159, caractérisée en ce que le composé contenant l'aminé primaire est
    un a-amino-acide.
    161. Une méthode selon l'une des revendications 156 à 159, caractérisés en ce que le compo'sé contenant -lamine primaire est
    un peptide.
    162. Une méthode selon l'une des revendications 156 à 161, caractérisés en ce qu'on utilise un fluorophotomètre pour faire fluorescer la substance.
    163. Une méthode selon la revendication 156, caractérisée
    en ce que la concentration,en solution, d'un composé connu contenant une amine primaire est déterminée quantitativement par
    a) la détermination de la fluorescence produite par une concentration mesurée du composé contenant l'aminé primaire, b) la détermination de la fluorescence produite par la concentration non connue de ce même composé et c) la détermination de la concentration non connue par multiplica tion de la concentration connue par le rapport des.deux valeurs de fluorescence.
    164. Une méthode selon-la revendication 156, caractérisée
    en ce que le composé contenant l'amine primaire est présent au
    moins sur une partie de la surface d'un support chromatographique
    à papier ou à couche mince, et le composé de formule générale I est appliqué sur cette surface.
    165. Une méthode selon la revendication 164, caractérisée
    <EMI ID=250.1>
    8 et 9.
    166. Une méthode selon l'une des revendications 164 ou 165, caractérisée en ce que le composé de formule générale 1 est présent en excès molaire entre 10 et 5000 en comparaison avec la quantité de. composé contenant l'amine primaire.
    <EMI ID=251.1>
    caractérisée en ce que le composé contenant l'aminé primaire est un a-amino-acide.
    <EMI ID=252.1>
    caractérisée en ce que le composé contenant l'aminé primaire est un peptide.
    169. Une méthode selon la revendication 156, caractérisée en ce que le composé contenant une amine primaire est déterminé par une procédure automatique comprenant ':
    a) le traitement continu d'un courant contenant ledit composé en solution avec un excédent d'un composé de formule générale et b) le passage du mélange obtenu sous (a), à une vitesse cons- <EMI ID=253.1>
    matériel fluorescent présent étant fluorescé et détecté.
    170. Une méthode selon la revendication 169, caractérisée en ce que le courant provient, au moins partiellement,
    de l'effluent d'une colonne à chromatographier .
    171. Une méthode selon l'une des revendications 169 ou 170, caractérisée en ce que le composé de formule générale 1 est présent en excès molaire entre 10 et 5000 en comparaison avec la quantité de composé contenant l'aminé primaire.
    <EMI ID=254.1>
    <EMI ID=255.1>
    tenu entre 8 et 9.
    173. Une méthode selon l'une des revendications 169 à 172, caractérises en ce que le composé contenant une aminé primaire est un a-amino-acide.
    <EMI ID=256.1>
    caractérisas en ce que le composé contenant une amine primaire
    est un peptide.
    175. Une méthode selon l'une des revendications 169 à 174, caractérisée en ce que la quantité t'otale d'un composé particulier contenant une amine primaire en présence dans un courant d'analyse est déterminée quantitativement par
    a) la détermination de la fluorescence produite par une concentration mesurée du composé contenant l'amine primaire, b) la détermination de la fluorescence produite par la concentration non connue de ce même composé et c) La détermination de la concentration non connue par multiplication de la concentration connue par le rapport des deux valeurs de fluorescence.
    176. Une méthode selon l'une des revendications 156 à 175, caractérisée en ce qu'un composé selon l'une des revendications
    2 à 19 est utilisé.
    177. L'utilisation des composés selon l'une des revendica-
    <EMI ID=257.1>
    156 à 175.
    178. Les composés obtenus selon les revendications 20 à 79. <3>
    179. Procédé pour la préparation de composés selon les
    <EMI ID=258.1>
    particulier dans les exemples.
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