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Dérivés de Céphalosporine C.
La présente invention se rapporte à des produits de transformation de Céphalosporine C et à leurs dérivés, ainsi Que'-- des procédés pour la préparation de ces composés.
Le brevet anglais n 810.196 décrit un procédé de sépa- ration d'un nouvel antibiotique, la Céphalosporine C, à partir des produits d'un processus de fermentation utilisant une espace de Céphalosporiun. La structure de la Céphalosporine C était alors inconnue et de ce fait a rendu plus difficiles les travaux sur la préparation et l'identification des produits de transfor- mation et dérivés de la Céphalosporine C qui pourraient également présenter des activités biologiques utiles.
Certains travaux, toutefois, ont été effectués sur le traitement par les acides de la Céphalosporine C. C'est ainsi
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que les auteurs de la présente invention, Newton et Abraham, indi- quent dans le Biochemical Journal, Vol. 62, pages 651, 657 que la Céphalosporine C est relativement stable à l'égard des acides et ne perd pas une mesure décelable d'activité par séjour dans de l'acide chlorhydrique 0,1 N à la température ordinaire pendant
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4 heures. De méme, Newton et Abraham dans Nature, Vol. 175 page 548, indiquent que la Céphalosporine C est stable en solution -,au pH 2,5 à la température ordinaire.
Cette publication décrit également l'hydrolyse de la Céphalosporine C par un acide,
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la Céphalosporine C fournissant une mole d'anh-dride carbonique et de l'acide D-a-aminoadipique. Ce traitement par l'acide qui
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en fait est exécuté en utilisant de l'acide chlorhydrique c-ud concentré pendant un certain temps, voisin de 18 heuresouvre la molécule de Céphalosporine C et en détruit toute l'activité.
Dans le Symposium de la Fondation Ciba sur les Amino
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Acides et Peptides à Activité Antircétabolique, 1958,Dn--es 2C5- 223, est décrite la préparation de plusieurs composés actifs partir de Céphalosporine C. Il y est dit que le Ira Lièrent de la Céphalosporine C par de l'acide chlorhydrique 0,1 N à 20 C fournit au moins deux composes acides et trois co..posés neutres, tous positifsà la ninhydrine.
Les composés neutres sont facilement séparés l'un de
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l'autre sur#s chromatogrammes de papier passés dans un mélange butanol-acide acétique-eau (4: 1:4). Un d'entre eux, (RF 0,14) exerce une activité antibactérienne et a été appelé
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Céphalosporine Cc. La préparation et les propriétés de la Cépha- losporine Cc sont décrites avec plus de détails dans la âe:l: nàe de brevet anglais n 8544/58. Le tableau à la page 3 de cette de- mande indique le rendeent de Céphalosporine Cc obtenu d?ns diffé- re.tes conditions acides.
Le Symposium n'indique rien sur les produits acides de l'hydrolyse sauf qu'ils sont positifs à la ninhydrine dans les concentrations obtenues par le traitement acide de Céphalosporine
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C par de l'acide chlorhydrique 0,1 N à 20 C. La durée du traite-
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ment acide avant séparation de ces produits d'hydrolyse n'est pas indiquée dans la publicatio mais les auteurs de la présente in-
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vention qui sont également les auteurs de la publication confirment que la durée de traitement était de l'ordre de 6 à 9 jours.
Les inventeurs ont à présent établi la structure de la Céphalosporine C et ont également découvert qu'en traitait la Céphalosporine C par un acide dans certaines conditions, la olé-
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c1rie fie Cephalosporine C peut être divisée e - dex parties, un noyau complexe et une chaîne latérale qui est l'acide c-aminc- adipique et¯est attachée au noyau complexe en position 7 (la posi-
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tion 7 étant définie plus loin). Dans la présente de-rde , des composés ayant une structure de ce type, c'est-à-dire un :1o'-a": complexe présentant la structure d'anneaux basiques a@, noyau de Céphalosporine C et une chaîne latérale d'acide c-aino&diplcue attachée en position 7, sont considérés com-:e présentant le type de structure noyau/chaîne latérale.
Les propriétés bii)loE';':::"eS de la Céphalosporine C dépendent principalement de la structure plus complexe du noyau et les inventeurs s'attendaient à ce cue car addition d'autres chaînes latérales de noyau en utilisant des pro-
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cédés chimiques connus en soi, des dérivés du noyau puissent être préparés avec des propriétés semblables mais codifiées ou ne-:t être une activité plus grande que celle de la Céphalosporine C ell - même. Ils considèrent donc que la découverte du type de structure
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noya/chaÍne latérale pour la Céphalosporine C et celle d'un piro- cédé de séparation et d'isolation du noyau a une grarde -.:crtr ce dans le dosaine des antibiotiques.
La Céphalosporine C mise à part, il existe certains pro- duits de transformation de ce corps qui ont déjà été préparés et identifiés et qui présentent également le type de structure noyau/ chaîne latéral e. Un de ces composés est la Céphalosporine C dont
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- . - c "' en a parlé plus haut.
D'autres composés sont décrits d2S les de- mandes de brevet anglais n 8545/58 et 27835/58, des substances antibiotiques qui sont des produits de transforsistion de 1= éntibiotiues QUi - sont des Droduits - L%i - 41.L 1= /
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Céphalosporine C et sont appelés des composés Céphalosporine CA On peut les obtenir en traitant la Céphalosporine C en solution
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aqueuse par une base tertiaire faible, par exemple, la ryridine, la collidine ou la quinoline. Si l'on utilise la pyridi-.e, l'a==t3- biotique obtenu est appelé la Céphalosporine CA (pyridine).
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Suivant l'invention, dans un procédé de préparati0:- du noyau de Céphalosporine C, de Céphalosporine Cc et d'une î..é':;- losporine CA' on traite la Céphalosporine C, la Céphalosporine C' une Céphalosporine C ou un dérivé d'un de ces exposés o la chaîne latérale est protégée par un groupe qui n'en est pas d@ta- ché au cours de l'hydrolyse par un acide dans des conditions telies et pendant une durée telle que se produise la séparation de la chaîne latérale ou de la chaîne latérale protégée du noyau, et on isole le noyau des produits d'hydrolyse de la réaction. Les no vaux
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peuvent être obtenus sous for.Le libre plutôt que sous for:ie de leur sel d'acide par un réglage approprié du pH de la solution.
Par exenple, lorsque la solution est réglée à un pH d'environ 4,5, les noyaux libres peuvent en être isoles. On remarquera que le terre acide comprend les matières d'écange d'ions acides.
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Un groupe protecteur convenant particule re .e:-:t est le groupe z:4-dinitrophényle ; un autre groupe utile est le groupe 2-nitro-4-carbométhoxy. Ces dérivés à chaîne latérale protégée peuvent être préparés de toute façon appropriée. C'est ainsi, par
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exemple, que les dérivés 2:4-dinitrop^ényle de la Céphalosporine C peuvent être préparés en faisant réagir la Céphalosporine C avec le 1-fluoro-,:h-dinitrobenz:ne et le dérivé de 2-nitro-4-carboxéthorf en faisant réagir la Céphalosporine C avec le 1-fluoro-?-nitr*-4- carbométhoxybenzene.
Suivant une forme préférée de 3.'inventicn, dans un procédé de préparation du noyau de Céphalosporine C, on traite le dérivé 2:4-dinitrophényle de Céphalosporine C par un acide dans des condi- tions et pendant une'durée telle que la séparation de la chaîne latérale protégée et du noyau s'effectue et on isole le noyau des produits d'hydrolyse de la réaction.
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L'hydrolyse de la Céphalosporine C, Cc ou CA ou de leurs dérivés à chaîne latérale protégée est effectuée de préfé- rence en utilisant un acide minéral dilué, et l'acide chlorhydrique dilué convient particulièrement. D'autres acides appropriés sont les acides sulfoniques et les résines de polystyrène sulfonées.
Pour l'exécution de ce procédé, la solution traitée par l'acide contenant la Céphalosporine C, Cc' CA ou un dérivé protégé par une chaîne latérale est généralement laissée à reposer jusqu'à ce qu'on ait obtenu un rendement relativement élevé de noyau, et la durée de ce séjour dépend de la sévérité des conditions nais est normalement de l'ordre de quelques jours. Les noyau:: pe@vent être alors séparés des produits de répction par des procédés con- nus en soi, par exemple l'électrophorse sur papier et/ou la chro- matographie sur papier.
En utilisant ces procédés, les noyaux sépa- rés peuvent généralement être identifiés sur le papier par le fait qu'ils ne présentent pas d'activité antibiotique par eux-mêmes aux concentrations utilisées.(L'essai consiste à placer le papier d'électrophorèse en contact avec ces plaques ensemencées de Star:-::,.- lococcus aureus /--Souche Oxford-7 mais possèdent une activité après un traitement par le chlorure de phénylacétyle provoquant la phénylacétylation. Ce traitement peut être avantageusement effec- tué en pulvérisant d'abord sur le papier de la M-pyridine dans de l'acétone à 50% puis du chlorure de phénylacétyle (1,25% volue/ volume) dans l'acétone.
Le dérivé phénylacétyle peut être séparé par des moyens chromatographiques et électrophorétiques.
Dans une òr---ne de l'invention, la Céphalosporine Cc trai- tée par un acide dans des conditions et pendant une durée telle que la chaîne latérale se sépare du noyau est préparée in situ à partir de Céphalosporine C. Le traitement acide de la Céphalos- porine C décrit dans la demande de brevet anglais n 8544/58 donne de la Céphalosporine cc et en continuant ce traitement acide au delà des conditions optima pour obtenir de la Céphalosporine C on arrive aux conditions optina pour la production du noyau de
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Céphalosporine Cc On a trouvé depuis le dépôt de la demande de brevet n 8544/58 que de l'acide chlorhydrique 0,
5 N à N pendant moins de 1 jour constitue les conditions préférées pour la pro- duction de Céphalosporine Cc et, par conséquent des conditions préférées pour la production du noyau de cette Cépha.losporine com- prennent le traitement de la Céphalosporine C par de l'acide chlo hydrique 0,5 N à N pendant 2 à 4 jours.
Dans une autre forme de l'invention, des noyaux de compo- sés de Céphalosporine CA sont préparés par un procédé s ivant lequel on traite la Céphalosporine C ou un dérive protégé par une chaîne latérale de Céphalosporine C par un acide de fanon à former le noyau, puis on traite le'noyau ainsi formé par une base tertiaire faible pour foriner le noyau de Céphalosporine CA
Les conditions dE réaction pour la préparation du noyau. de Céphalosporine C à partir d'un dérivé protegé par une chaîne latérale de Céphalosporine C entraînent de prférerce l'emrloi d'acide chlorhydrique, particulièrement aux concentrations compri- ses entre 0,1 et 0,3 N. La réaction est de préférence exécutée dans un solvant organique miscible à l'eau, par exemple l'acéto- nitrile.
Avantageusement, la réaction est effectuée dans l'obseu- rité et en atmosphère inerte, par exemple en atmosphère d'azote.
Les conditions de réaction pour la préparation de nova@x de composés de Céphalosporine C, Cc et CA à partir de compos s de Céphalosporine C, cc et CA respectivement peuvent varier conside- rablement mais un procédé préféré comprend l'emploi d'acide chlon- hydrique à une concentration allant du pH 0 au pH 2,5 à une tempé- rature comprise entre -10 et + 50 C environ pendant une durée de 12 heures environ à 30 jours, les conditions étant choisies l'in- térieur de ces limites de façon à obtenir un rendement élevé de produits d'hydrolyse. Un procédé qui convient remarquablement bien comprend l'emploi d'acide chlorhydriuue 0,1 N à une température d'environ 20 C pendant 3 jours environ.
Lors du traitement de la Céphalosporine C par un acide, d'une concentration dans la gamme indiquée plus haut, au :noins
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deux réactions s'amorcent.Ces réactions sont (1) l'hydrolyse de la Céphalosporine C qui ouvre les liaisons joignant le noyau à la chaîne latérale et (2) la réaction de l'acide avec la molécule de 'Céphalosporine C pour fournir la Céphalosporine Cc. En outre, aussitôt qu'une certaine quantité de Céphalosporine Cc est obte- nue dans le mélange de réaction, une. troisième réaction s'amorce, l'hydrolyse de la Céphalosporine Cc ouvrant la liaison joignant le noyau de la Céphalosporine Cc à la chaîne latérale. En plus, une certaine quantité de noyau de Céphalosporine Cc se forme par réaction de l'acide avec le noyau de Céphalosporine C.
C'est ainsi, que si.-le traitement de la Céphalosporine C par l'acide est effec- tué dans le but d'obtenir le noyau de Céphalosporine C, les con- ditions de réaction sont choisies de façon à obtenir une propor- tion relativement élevée de noyau de Céphalosporine C et une pro- portion relativement faible de noyau de Céphalosporine Cc De même, si la réaction est effectuée dans le but d'obtenir le noyau de Céphalosporine Cc, les conditions de réaction sont choisies de façon à obtenir une proportion relativement élevé de noyau de Céphalosporine Cc.
Les conditions les plus avantageuses pour la réaction peuvent être établies par des expériences simples et on a trouvé qu'au départ de Céphalosporine C, l'acide chlorhydrique 0,ln à 20 C pendant 3 jours environ procure un bon rendement de noyau de Céphalosporine C et l'acide chlorhydr que 0,5 N à 1 N à 20 C pendant 3 jours environ procure un bon rendement de noyau de Céphalosporince Cc Ces conditions peuvent être comparées au traitement par l'acide chlorhydrique 0,1 N à 20 C pendant 5 jours environ au bout desquels on obtient d'après le tableau 3 de la demande de brevet anglais n 8544/57 les meilleurs rendements de Céphalosporine Cc susceptible d'être obtenus à l'aide d'acide chlorhydrique 0,
1 N et au bout desquels le noyau de Céphalosporine C qui s'est formé à un stade antérieur a pratiquement disparu.
On notera que le noyau de Céphalosporine C n'est pas un des composes acides relevés .:lais non caractérisés dans le Symposium Ciba cité plus haut pour les raisons suivantes.Tout d'abord, aprèstraitement de la Céphalosporine C par de l'acide chlorhy-
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drique 0,1 N à 20 C pendant plus de 5 jours on peut supposer qu'il ne reste pratiquement plus de noyau de Céphalosporine C. Les condi- tions optima,. pour obtenir les noyaux de Céphalosporine C sont de l'acide chlorhydrique 0,1 N pendant 3 jours et l'éventail des temps pour lesquels on obtient des rendements significatifs de noyau est étroit. C'est ainsi qu'après plus de 4 jours, il ne reste pra- tiquement pas de noyau de Céphalosporine C dans la solution.
En second lien' les expériences subséquentes ont montré que le noyau de Céphalospor@@@@@@ serait pas prés@@@@quantités suffisa pour donner une réaction positive à la ninhydrine, même si le trai- teillent n'avait duré que penda t la durée optimum de 3 jours. Dans ces conditions optima, le noyau est décelé à un moment ultérieur par phénylacétylation et par un essai d'activité comme indiqué plus haut. En tout cas, même lorsqu'une solution contenant le noyen de Céphalosporine C est concentrée au point qu'une réaction positive de la ninhydrine se produise à un degré décelable, on n'obtient pas la couleur bleue ou pourpre typique.
On obtient plu- tôt une couleur jaune brunâtre. Le noyau de Céphalosporine C n'est donc pas positif à la ninhydrine dans le sens généralement accerté,
L'invention procure en outre le noyau de Céphalosporine
C un produit de transformation de Céphalosporine C qui a été appelé l'acide 7-aminocéphalosporanique qui correspond à la structure
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et ses sels de sodium, potassium, ammonium et diacide fort.
Le noyau lui-seine et les sels d'acide minéraux ont une importance particulière, spécialement le chlorhydrate .On notera que le noyau a une structure stérique semblable à la partie correspondante de la Céphalosporine C obtenue par fermentation à partir de Céphalo -
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Sporium. Le noyau lui-même peut être encore identifié par les pro- priétés suivantes après phénylacétylation comme décrit plus haut.
1. La fraction de noyau de Céphalosporine C de la prépara- tion migreun peu plus vite que la Céphalosporine C vers l'anode par électrophorèse au pH 7 (avec de l'acétate de collidine aqueux comme solvant).
2. La fraction de noyau de Céphalosporine C migre à la moitié
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o..#sse de la C65.bz:a.rpor*ne C vers ";:;.-.:In., ",11 4,5 Çzy,,q,¯ de l'acétate de pyridine,aqueux comme solvant).
3. La fra(tion de noyau de Céphalosporine C reste près du point d'origine par électrophorèse au pH 4,0 (dans acétate de pyri- dine aqueux) ne montrant qu'une migration relativement faible vers l'anode. Dans ces conditions, la Céphalosporine C migre encore vers l'anode presque aussi rapidement qu'au pH 7.
4. Après électrophorèse dans de l'acide acétique à 10%, élution du papier et hydrolyse dans HCL-N à 105 pendant 16 heures, le composé fournit un peu de glycine (54 micro grammes donnant une tache d'intensité semblable à la tache de glycine obtenue par hydro- lyse de 50 microgrammes de Céphalosporine C) mais pas d'acide a-aminoadipique. Il ne contient donc pas la chaîne latérale de la molécule de Céphalosporine C.
5. La fraction de noyau de Céphalosporine C présente un RF
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semblable à celui de la N-phénylacétyl Céphalosporine C (0,0$-0,15) dans un mélange butanol-éthanol-eau (4:1:5 en volume).
6. Après chromatographie dans un mélange butanol-éthanol- eau ou après électrophorèse, puis pulvérisation du papier par de la pénicillinase dans une solution à 0,1% de gélatine (concentra- tion d'enzyme 10 fois supérieure à celle requise pour rendre inac-
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tive une tache de 50 microgrammes de benzylpénicil- ine) la frac- tion fournit une tache d'activité apparentent inchangée après pulvé- risation au chlorure de phénylacétyle et à la pyridine.
7. Appliquée sur du papier,pulvérisée à l'acétate de pyridine
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pH 7 (2M), suspendue à l'état humide sur la vapeur d'une solution d'acétate de pyridine 2M à 37 pendant 16 heures, séchée, soumise à de l'électrophorèse au pH 7, puis phénylacétylée, une tache active (due au dérivé phénylacétyle du noyau de Céphalosporine Ca (pyri-
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dine)) apparaît en position neutre ainsi qu'une tache en position légèrement plus voisine de l'anode que celle occupée par la Céphalosporine C.
8. Après électrophorèse sur le papier, le noyau donne avec la ninhydrine une couleur jaune brunâtre qui, par la suite se
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'''''''''''\!1ièù'igê.--en gris-bleu'%5fTµiÉmlé que l'acide 6-ailli'pénicillani- que ne donne pas une couleur normale à la ninhydrine). Apres élec- trophorèse sur papier ou chromatographie, on peut facilement le
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détecter (comme la Cephalospcrine C) sous forme de tache noire absorbante en plaçant le papier devant une source de lumière ultra- violette.
L'invention procure également le noyau de Céphalosporine Cc, un produit de transformation de Céphalosporine C et le lactone i
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d'acide àésacétyl-7-aninocéphalosporaniq<e de la formule suivante
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et ses sels diacides forts. Le noyau lui-même et les sels d'acide
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minéraux sont particulièrement importants, plus spécialement le chlorhydrate . On notera que dans le cas du noyau de Céphalosporine C, la structure stérique de la molécule est semblable à celle de la partie correspondante de Céphalosporine C obtenue par fermenta- tion à partir du Céphalosporiun. Ce composé peut être en outre identifié par les propriétés suivantes du noyau aprs phénylacé- tylatin : 1.
Par électrophorèse sur du papier dans de l'acétate de pyridine cornue tampon, (pH 4,5) le noyau de Céphalosporine Cc se déplace
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approximativement de la même distance vers la cathode que le noyau de Céphalosporine C vers l'anode.
2. Par électrophorèse sur du papier avec un tampon formé d'acide acétique à 10%, le noyau de Céphalosporine C migre vers la cathode deux et demi fois plus vite que le noyau de Céphalos porine C.
3. Par chromatographie dans un mélange butanol-éthanol-eau (4:1:5 en volume) le facteur RF du dérivé de noyau de Céphalospo- rine Cc est 0,33 par comparaison avec 0,08 - 0,15 pour le noyau @ Céphalosporine et 0,88 pour le noyau de Céphalosporine CA
L'invention procure également les noyaux de Céphalosporine
CA' des produits de transformation de Céphalosporine C répondant à la structure suivante :
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où. R+ représente une base tertiaire faible définie dans la demande de brevet anglais n 8545/58 et 27.835/58 et leurs sels d'acide fort. Le noyau lui-même et les sels d'acide minéraux, particulière- ment le chlorhydrate, sont spécialement importants.
On notera également que la structure stérique est semblable à celle de la partie correspondante de la Céphalosporine C obtenue par fermentation à partir de Céphalosporium. La base tert aire préférée est la pyridine et le noyau dans lequel R représente la pyridine peut être identifié par les propriétés suivantes : 1. Par électrophorèse au pH 4,0 dans l'acétate de pyridine comme tampon, le noyau de Céphalosporine Ca se déplace vers la cathode d'une distance égale au déplacement de la Céphalosporine C vers l'anode . Lorsque l'électrophorèse est effectuée dans de l'acide acétique à 10%, le noyau de Céphalosporine CA se déplace vers la cathode à une vitesse double de la Céphalosporine CA (pyridine).
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2. Le noyau de Céphalosporine CA (pyridine) n'est pas dé- truit par l'action de pénicillinase dans des conditions détruisent complètement 50 microgrammes de pénicilline G.
3. Noyau de Céphalosporine CA (pyridine) se distingue du noyau de Céphalospotine Cc sur des chromatogrammes sur papier obtenus à l'aide d'un mélange n-butanol-eau (4:1:5 en volume).
Les composés de l'invention définis plus haut, c'est-à- dire les noyaux de Céphalosporine C, Cc et CA sont particuli re- ment importants parce qu'ils sont des produits intermédiaires à partir desquels d'autres dérivés de Céphalosporine C peuvent être préparés, ces autres dérivés présentent une activité piolgique.
Les exemples suivants illustrent l'invention : EXEMPLE 1. - Préparation de l'acide 7-amino-céphalosporanique (a) Préparation du dérivé l-fluoro-2:4-dinitrobenzine (FDNB) de Céphalosporine C
On dissout 31,7 g du sel de sodium de Céphalosp- rine C (pureté 85-90%) dans 635 cm3 d'eau contenant 25,5 g de bicarbonate de sodium anhydre. On ajoute à cette solution agitée 25,5 cm3 de FDNB dissous dans 635 cm3 d'alcool éthylique. On agite ce mélange dans l'obscurité à la température ordinaire pendant 2 1/2 meures encore. Le pH de la solution est alors réglé à 5 au moyen d'acide chlorhydrique concentré et l'alcool est chassé par distillation dans le vide. L'excès de FDNB se sépare à ce stade.
Le mélange, après avoir été porté au pH 7 à l'aide de bicarbonate de sodium est extrait par 3 x 1/2 cm3 d'éther pour éliminer l'excès de FDNB et laisser une solution aqueuse limpide.
Le pH est alors réglé à 2,5 à l'aide d'acide chlorhydrique concen- tré. Il se forme un précipité collant qui se dissout lorsque le mélange est extrait par 3 x 1/2 volume d'acétate d'éthyle. Les extraits d'acétate d'éthyle rassemblés sont alors lavés à l'eau, séchés sur du sulfate de sodium anhydre et sèches, ce qui laisse 40,3 g d'un solide jaune.
L'essai biologique par comparaison avec un échantillon pur du dérivé dinitrophéynle de Céphalosporine C assigne un
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degré de pureté d'environ 88% à cette matière.
(B) Hydrolyse acide du dérivé 2,4-dinitrophényle ¯¯¯ de Céphalosporine C
Le dérivé 2:4-dinitrophényle brut de la Céphalosporine C obtenu ci-dessus contient une petite- d'une impureté basique colorée qui est éliminée en dissolvant la matière solide dans l'acé- tate d'éthyle et en lavant par fi.Cl 0,2 N. L'acétate d'éthyle est ensuite séché et éliminé dans le vide. 10,1 g de matière solide sort réduits.à 9,7 g par ce procédé.
On dissout 9,7 g du dérivé DNP de Céphalosporine C dans un mélange d'acétonitrile (100 cm3) eau (65 cm3) et acide chlorhy- drique N (34 cm3). Cette solution est ensuite conservée dans l'ob- scurité à la température ordinaire sous azote pendant 64 heures. On ajoute ensuite 200 cm3 d'eau à la solution et on extrait le tout par 5 x 100 cm3 d'acétate d'éthyle. Le résidu aqueux de 170 cm3 d'acide 7-amino-céphalosporanique est ensuite réglé au pH 7,2 par une solution saturée de bicarbonate de sodium et refroidi à 0 C.
(c) Isolation de l'acide 7-amino-céphalosporanique III (7-ACA)
Après hydrolyse et extraction par l'acétate d'éthyle sous (B) ci-dessus, il reste une solution acide contenant principale- ment le 7-ACA et le 7-ACA -(lactone) ; cette solution est réglée au pH 6,7 et passée dans une colonne de Dowex 1 (Cl-). Le 7-ACA lac- tone passe par la colonne et se retrouve dans le filtrat de ré- sine. Après lavage à l'eau, le 7-ACA peut être lavé à l'acide chlorhydrique 0,05 N . Des fractions contenant le 7-ACA fournissent un précipité cristallin qui semble être la forme zwitterion de la matière tandis que la plus grande partie du 7-ACA reste en solution sous forme de chlorhydrate. Le spectre dans l'infrarouge de la matière solide est indiqué à la Fig.l.
Les solutions de chlorhydra- te peuvent être phénylacétylées pour fournir la benzyl-Céphalospo- rine.
EXEMPLE 2. -
Préparation du noyau de Céphalosporine C à partir de
Céphalosporine C
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On. dissout 2 g du sel de sodium de Céphalosporine C dans 30 cm3 d'eau, on règle le pH à 2,5 par addition de Dowex 50 x 8 (H+), on filtre la résine et on lave avec 10 cm3 d'eau, et on ajoute 10,2 cm3 de N-HC1 au filtrat combiné aux eaux de lavage. La solution est maintenue à 20 C pendant 3 jours et ajoutée à une colonne de Dowex-1 (torse acétate) de 2,1 cm de diamètre x 7 cm.
Le liquide qui s'écoule est recueilli par fractions de 5 cm3 (1 à 12) et la colonne est lavée à l'eau jusqu'à ce qu'on ait re- cueilli un total de 34 fractions. Le lavage peut alors être entre- pris à l'aide d'acide acétique 0,5 N et on obtient encore 66 frac- tions. La densité optique à 260 m u est mesurée pour chaque frac- tion.
Les fractions 2 à 16 sont rassemblées et concentrées dans le vide, ce qui provoque la séparation sous forme cristalline de Céphalosporine Cc (312 mg). Les fractions 36 à 45 contiennent la plus grande partie du noyau de Céphalosporine C qui fournit un dérivé phénylacétyle actif. Ces fractions sont rassemblées et séchées par congélation (40 mg). Par phénylacétylatio, cette matière fournit 250 unités d'activité contre Staph. aureus par mg de produit original.
Le nouveau composé est encore purifié par électrophorèse de la fraction appropriée provenant de la colonne de Dewex-1 (acétatel L'électrophorèse est effectuée dans une cellule d'élec- trophorèse sur papier à passage continu Beckman/spinco Mod le CP.
Le tampon utilisé est préparé en ajoutant de la pyridine à de l'acide acétique 0,05 N jusqu'à ce que le pH atteigne 4,0. La cellule travaille à courant constant (40 mA), le potentiel ?tant 880v. L'échantillon, dans un tampon de 20 cm3 est amené sur le rideau en 24 heures et on recueille 32 fractions, les fractions étant numérotées de la cathode (1) à l'anode (32).
Le volume de chaque fraction est approximativement 12 cm3 A la fin de l'expé- rience, le rideau de papier est pulvérisé à la ninhydrine. Cette opération révèle une bande bien marquée de matière n'ayant que /
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très peu de-mobilité qui s'écoule du rideau dans les fractions 13 à 15, une bande de matière fortement acide qui s'est écoulée dans la mèche constituant l'anode et une faible bande d'un produit (cor-
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respondant à l'aeideax-aminoadipiq-ae) qui a migré vers l'anode et s'est écoulée hors du rideau dans la fraction 24.
Pour déterminer la position du nouveau composé , des taches de 10 x 10 microlitres de chaque fraction sont appliquées sir du papier et le papier est pulvérisé à la M-pyridine dans 50% d'acé-
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tone, puis par 2% de chlorure de phénylac4tyle dans l'acétone.
Après contact du papier avec des plaques ensemencées du Staph.
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aureus et incubation des plaques, une large zone d'inhibition se présente dans une position correspondant à la fraction 22 et une plus petite dans une position correspondant à la fraction 23.
Le séchage par congélation de la fraction 22 fournit un résidu trop faible que pour être pesé exactement.En solution aqueuse, le spectre d'absorption ultraviolette du produit présente
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un plateau à 260 m / u ,et son poids total (43 micro4ra:..:esl est estimé d'après l'extinction à cette longueur d'onde en prenant pour hypothèse que le poids moléculaire de la substance est celui
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de l'acide 7-aminocéphalosporanique et que son extinction olfcL- laire est la même que celle de la Céphalosporine C. Le produit est phénylacétylé dans de l'acétone aqueuse contenait un phosphate
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comJe tai11pon,pH 6,5. L'activité du dérivé pnényl.act3.e contre le StaDh. aureus correspond à 1450 unités par mg de produit original.
La Céphalosporine C exerce une activité de 8 à 10 unités par mg contre le mené organisme.
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Le groupe amino dans l'acide 6-aiinepénicillanioue (noyau de pénicilline) présente une basicité relativement faible, le
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point isoélectrlque du composé étant signalé au pH 4,3 (Bateelor, Doyle, Naylor et Rolinson ,1959).Ceci se comprend fcle.ent :=aLsctei le grou:e naîno est ppsr rapport à un groupe CON et -un groupe CH-S-. Pcur des raisons se.;blabies, groupe aJ:ino de l'acide 7-a.Jino- Pour des raisons semblables, le groupe az.,ino de l'acide 7-a.:lino- 1 céphalosporanique peut être faiblement basique et la substance doit migrer vers l'anode au pH 7. Les propriétés du nouveau
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composé obtenu à partir de Céphalosporine C (décrit aux pages 5 et .6)indique qu'il s'agit en fait d'acide 7-aminocéphalosporanique.
;',- 'EXEMPLE-).
Préparation de noyau de Céphalosporine CA (pyridine) ¯partir de Céphalosporine CA (pyridine).
La Céphalosporine CA (pyridine) est maintenue dans du HCl 0,1 N'ou N à la température ordinaire pendant 3 jours ou plus.
Lorsque les produits de la réaction sont analysés par électropho- rèse sur du papier dans un tampon à l'acétate de pyridine (pH 4,0) puis qu'on mette le papier en contact avec des plaquesd'agar ensemencées de Staph. aureus une seule zone active due à la
Céphalosporine CA (pyridine) inchangée est révélera la concentra- tion utilisée. La Céphalosporine CA (pyridine) se comporte com@e si elle ne présentait pas de charge nette au pH 4,0.
Toutefois, d'autres bandes de papier qui ont été pulvérisées à la M-pyridine dans une solution aqueuse d'acétone à 50% et au chlorure de phényl- acétyle à 0,125$ dans l'acétone anhydre,révèlent une autre zone active sur les plaques ensemencées dues au produit de la phényl- acétylation du noyau de Céphalosporine CA (pyridine).Le noyau de Céphalosporine CA se comporte comme une base au pH 4,0. Il migre vers la cathode à une distance un peu plus gra de que la
Céphalosporine elle-même migre vers l'anode dans la même expérience. -
Il reste en position neutre par électrophorèse au pH 7.
Ce comporte- ment est logique par rapport aux propriétés qu'on peut attendre du noyau de Céphalosporine CA (pyridine).(Voir partie 9 de le définition de la fraction du noyau de Céphalosporine C). Un composé présentant les mêmes propriétés est formé par incubation de noyau de Céphalosporine C avec de l'acétate de pyridine 2M au pH 7 pendant
16 heures et fournit un dérivé phénylacétyle actif par phénylacéty- lation.Les propriétés du noyau de Céphalosporine CA sont examinées et coïncident avec les propriétés décrites plus haut.