BE547383A

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Publication number: BE547383A
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Description


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   La présente invention concerne un procédé de préparation des co- balamines en utilisant des espèces spéciales nouvelles de Nocardia. Comme on le sait, le terme   "cobalamine"   est employé généralement pour désigner soit    la vitamine B12 sous la forme contenant le groupement OU, soit des substances différant de celle-ci seulement par le remplacement du groupement CN par d'autres anions, ou des composés analogues à B 12 D'autres mioroorganismes employés industriellement pour la production dés cobalamines sont le strep-   tomyces griseus, Str. auréofaoiens, Str. olivaoeus, bacillus mégathérium, lactobacillus caséi et le   propionibaotérium   freudenreichii, etc... 



   L'espèce décrite a été isolée dans les   labpratroies   de la deman- deresse (avec de nombreuses autres espèces) en partant du contenu de l'appa- reil digestif des bovidés et se différencie non seulement par ses caracté- ristiques du point de vue morphologie et culture, mais aussi par son aptitu- de à la production de quantités considérables de cobalamines. 



   Description et classification des colonies : 
Caractères morphologiques : mycélium formé par des hyphes ayant un diamètre de 0,6 - 0,8 u, d'abord sinueux puis plus ou moins pliés en formant des angles, peu ramifiés à partir de leur douzième heure, s'écar- tant radialement à partir d'une surface centrale. Lorsqu'ils sont âgés de 
20 à 24 heures, commence la fragmentation des hyphes sous forme de bacilles possédant   l'épaisseur   des hyphes et une longueur variant entre 8 et 20; cette fragmentation s'étend en quelques heures à la colonie pratiquement toute entière. 



   Les fragments peuvent être droits, pliés, en formant un angle plus ou moins obtus, ou courbés différemment ; le mycélium et les fragments sont aisément colorés avec les colorants usuels :   fuchsine,   bleu de méthylène, etc... Ils sont agram-positifs, ne sont pas   résistants   aux acides ét   ne 'sont   que partiellement résistants à l'alcool 
Caractères généraux Sur un milieu de culture viande-agar-agar, on obtient une très bonne croissance en 24 heures. Les colonies forment une peau épaisse présentant la couleur du miel, ridée ou plissée, avec la con- sistance de la crème. Dans les cultures vieilles de plus de 15 jours, on note un pigment brun dans le substratum. 



   Sur un milieu de culture pomme de   terre-agar-agar,   on obtient une croissance modérée, et une peau qui est généralement lisse, avec des parties ondulées et plissées, incolore, sans consistance. 



   Sur un   milieuasp¯aragine-agar-agar,   on obtient une croissance modé- rée, sous forme d'une peau épaisse humide, incolore, soulevée, qui est plis- sée dans les parties 'les plus épaisses du milieu agar-agar incliné. 



   Sur un milieu nutritif   glycérinate     agar-agar,   on obtient une crois- sance extrêmement bonne sous forme d'une plique, analogue au point de vue forme au corail, de couleur crème très foncée, et sans consistance. Un pig- ment ambré se trouve à l'état diffus dans le substratum lorsque la culture est vieille de 15 jours. 



   Sur un milieu Saboraud agar-agar, on obtient une croissance extrê- mement bonne en plique en forme de corail, très épaisse, incolore, sans con- sistance. 



   Sur un bouillon de culture à base de viande, les espèces croissent sous forme de mucilage qui se dépose au fond du tube à essais. Le bouillon est clair. Dans le lait, lorsqu'elles sont âges de 8 jours, elles forment un coagulum et ce dernier précipite, laissant un sérum limpide. Il ne se forme pas de peptones ; le pH reste inchangé. Elles rendent fluide la gélatine. 



  Activité diastasique :négative. Ne sont pas pathogènes. pH optimum : 

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 6,8 - 7,2; température optimum : 34 - 36 C. 



   Caractères différentiels : Elles produisent des cobalamines. 



   Dans une culture agitée après 120 heures d'incubation, il diffu- se un pigment brun-rougeâtre intense. 



   En comparant la description aveccelle du type Nocardia Trévisan, on constate une concordance entre les deux. Dans le but de définir l'iden- tité spécifique des colonies on a consulté les tables de Krassilnikov (1941) et Wakeman et Henrici   (1943),   mais ni l'une, ni l'autre ne permet la clas- sification des espèces. Aucune des espèces décrites ne présente les carac- tères correspondant à ceux de la colonie essayée ; et ainsi il faut en con- clure que cette colonie n'a pas été isolée jusqu'ici, ou au moins décrite et nommée et, en conséquence, on propose le nom   binome     Nocardiarugosa   avec la description donnée plus haut. 



   Les bouillons de fermentation de la colonie, isolés dans les la- boratoires de la demanderesse, contiennent un facteur de croissance pour les calonies :   Lactobacillus leichmanii ATCC 4797 exige de la vitamine B12 ou les désoxyribonucléotides-nucléosides.   



  Lactobacillus lactis DORNER   (ATCC   10697) E. Coli 113/3 exige la vitamine B12 ou la méthionine. L'identité du facteur de croissance avec les substances du groupe des cobalamines a été mise en évidence par chromatographie et électrophorèse sur papier, suivies de bio- autographies sur plaques de E. Coli 113/3. 



  Méthodes biologiques pour l'évaluation de l'activité B12 des bouillons de fermentation : l) - Une méthode par le lactobacillus lactis DORNER ATCC 10697. 



  2) - Une méthode par le lactobacillus leichmanii ATCC 4797. 



  3) - Une méthode par le Escherichia coli 113/3 en milieu liquide. 



  4) - Une méthode par le   Esoheriohia   113/3 sur plaques. 



  Technique de la fermentation : 
Le milieu utilisé pour la fermentation est le milieu convenable pour la croissance et la multiplication des espèces. Il consiste essentiel- lement en une source d'hydrates de carbone, une source d'azote et un certain nombre de sels. Les hydrates de carbone peuvent être : glucose, maltose, saccharose, dextrine, lactose, mannose, galactose, ou ils peuvent être four- nis par des substances contenant des hydrates de carbone telles que des dé- coctions de grains, des mélasses, de l'extrait de malt et analogues. 



   On peut utiliser aussi différentes graisses telles que l'huile de lard, l'huile de sésame et l'huile d'arachide:. 



   La source d'azote peut être des peptones, des hydrolysats de ca- séine, des extraits de viande, des extraits de levure, la caséine, le sulfa- te d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'asparagine, la cystéine, le   trßpto-   phane, la tyrosine, la cystine. 



   Dans les bouillons de culture, on aura aussi, suivant le cas.. 



    Na2HPO4, KH2PO4, CaCO , MgCl2, CaCl2, CUSO , FeSO4, ZnSO4, MgSO et du cobaIt sous forme de chlorure ou de nitrate ou sous forme de composés organiques.   



   Ce qui est d'une importance fondamentale pour l'obtention de ren- dements élevés en vitamines, c'est la   présence,dans   le bouillon de culture, de substances tensio-actives, par exemple celles qui appartiennent aux sé- 

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 ries des esters partiels des anhydrides d'hexitol et acides gras, ou leurs dérivés   polyoxyalcoyléniques   (désignés par les marques de fabrique   "Tween",   "Span", etc...). 



   Le pH de bouillon est ajusté à 6,7 - 6,9 avec de l'acide chlorhy- drique ou de l'hydroxyde de sodium ; le bouillon est stérilisé et une partie est ensemencée en utilisant une culture bien développée dérivant d'un Roux d'agar-agar nutritif. On soumet à l'incubation.dans uneaération convenable et sous agitation, à une température de l'ordre de 30 à 37 C pendant un temps suffisant pour avoir une bonne croissance des micro-organismes, ce qui se produit en générale après 24-28 heures. La suspension ainsi obtenue est utilisée pour ensemencer la liqueur pour la véritable opération de fer-   mentation.   La quantité de bouillon d'énsemencement utilisée varie entre 5 et   10 %   de la quantité de bouillon pour la   fabrication.en   sens inverse du degré de croissance. 



   Le bouillon est ensuite amené dans les conditions déjà décrites pour le préensemencement ; des prélèvements journaliers sont effectués dans le but de contrôler le cours de la proissance, le   pH5   la production de vita-    mines B12, la consommation de substances azotées et d'hydrates de carbone, et de detecter des pollutions fortuites.   



   La fermentation peut être considérée comme complète lorsque le résultat de deux dosages-successifs de la vitamine produite montre qu'il n'y a plus eu accroissement de la concentration dans la liqueur, ce qui se produit normalement après 120 heures environ de fermentation. Le bouillon de culture semble,à ce stade,d'une densité moyenne avec un pH d'environ 6, d'u- ne couleur brun-rougeâtre, sans odeur désagréable ni persistante. 



   A la fin du processus de fermentation, on a trouvé que la masse des substances possédant une activité APF et particulièrement les substances du   oupe   des cobalamines sont contenues dans les tissus cellulaires et, en conséquence,, sont localisées dans la phase solide de la masse de fermentation. 



   Pour utiliser ces substances actives pour compléter des aliments, on peut choisir n'importe quel procédé connu, pourvu qu'il soit susceptible de fournir le produit de fermentation sous une forme pouvant'être conservée et convenant pour l'administration. Parmi ces procédés, on peut indiquer, à titre d'exemple, les   suivants   a) La masse fermentée est acidifiée à un pH de l'ordre de 3 à 6 et amenée dans un autoclave à 120 C pendant 30 à 60 minutes ; ensuite elle est concentrée sous vide, à une température ne dépassant pas 40 C jusqu'à 1/10 
1/20 du volume de départ.

   Cette masse sirupeuse obtenue est séchée et broyée, donnant une poudre stable et prête pour l'emploi. b) La masse fermentée est soumise à la centrifugation, la phase liquide est rejetée,   tandis,   que la masse solide est lavée à l'eau, passée dans   un.autoclave   à 120 C pendant 30 à 60 minutes, séchée, pulvérisée et administrée telle quelle. c) La phase solide de la masse de fermentation, séparée par centri- fugation et lavage comme décrit sous b), est dissoute dans un volume d'eau représentant 10 - 50 % du volume de départ de. la masse fermentée. La suspen- sion est acidifiée à un pH de 3 à 6 et maintenue dans un autoclave à 120 C pendant 30 à 60 minutes.

   Par centrifugation ou filtration,   on, 'obtient   un ex- trait aqueux contenant les principes actifs, qui est concentré et séché sous vide, donnant une proportion élevée d'une poudre stable, prête à l'emploi. 



   Le choix de l'une ou l'autre des méthodes ou une combinaison de celles-ci dépend de la concentration et du degré d'activité désiré pour les composés. 

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   On décrit ci-dessous cinq opérations de fermentation qui sont données à titre illustratif et non limitatif de la présente invention. 



    Exemple 1    
 EMI4.1 
 Composition du bouillon de cu7,ture : 
 EMI4.2 
 
<tb> Dextrine <SEP> 8%
<tb> 
<tb> 
<tb> Mélasse <SEP> 0,4%
<tb> 
<tb> 
<tb> Peptone <SEP> 1 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
 
 EMI4.3 
 CaCO 0,5% NaC1 bzz 
 EMI4.4 
 
<tb> (NE <SEP> )2SO4 <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> FeSO <SEP> 5 <SEP> p.p.m. <SEP> (parties <SEP> par <SEP> million)
<tb> 
 
 EMI4.5 
 MgC03 0,2% CaC12 10 P*P*M* Eau de source. P P.mo 
Dans une cuve de fermentation en acier de 70 litres de capacité,, on stérilise 50 litres de bouillon à une température de 121 C pendant 50 minutes.

   On ajuste le pH à une valeur de 6,20 - 6,45 à la fin de la stéri- 
 EMI4.6 
 lisation Après refroidissement à 33 C, on ensemence en introduisant 100 cm d'une suspension obtenue en lavant une culture sur un Roux nutritif d'agar- agaro La masse est soumise à l'incubation pendant un temps allant de 25 à 40 heures à 33 C, avec une aération correspondant au soufflage de 30-50 li- tres d'air par minute et une agitation variant entre 150 et 300 tours.    mg/cm3. A la fin de l'incubation, le poids du mycélium sec varie de 3 à mg/cm .    



   Le bouillon de culture est utilisé pour ensemencer le milieu d'une cuve de fermentation possédant un volume plus grand. L'opération dans la deuxième cuve est conduite pendant 120-140 heures dans les conditions décri- tes pour le préensemencement. La concentration finale en vitamine B12 varie 
 EMI4.7 
 de 3 à 5 gamma/cm3f le poids sec varie de 12 à l4pcm . 



   Le mycélium est ensuite séparé du bouillon par filtration ; on l'ex- trait à l'eau et on l'utilise pour compléter des aliments concentrés ou bien ou le purifie encore. 



  Exemple 2 : Bouillon de culture. 
 EMI4.8 
 
<tb> 



  Glucose <SEP> 4%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Décoction <SEP> de <SEP> grains <SEP> 2%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Huile <SEP> d'arachide <SEP> 0,3 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> CaCO3, <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> KH-PO <SEP> 0,2 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Na2HPO4 <SEP> 0,5%
<tb> 
 
 EMI4.9 
 Câ. 12 10 pop.m. 
 EMI4.10 
 
<tb> 



  Eau <SEP> de <SEP> source.
<tb> 
 



   Le milieu est stérilisé à   120 C   pendant 90 minutes avant d'ajou- ter le.glucose qui a déjà été stérilisé à   115 C   pendant 20 minutes et qui est ajouté dans des conditions stériles. 



   L'opération est conduite comme dans l'exemple 1. Rendements les meilleurs : 2 à 4 gamma par cm3 après 110 heures. 



    Exemple 3 -.    



  Bouillon deculture : 
 EMI4.11 
 "*' ( gamma.:millionième de gramme) 

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 EMI5.1 
 
<tb> Saccharose <SEP> 7 <SEP> %
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> N-Z/amine <SEP> 1%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> (NH)2SO4 <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Cysteine <SEP> 0,05 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,2%
<tb> 
 
 EMI5.2 
 Na2HPO. 0,5% NaC1 4 1.% CUS04 0,5 popeme FeS04 ioiall7.v CaC12 10 ,7o7ais 
 EMI5.3 
 
<tb> Eau <SEP> de <SEP> source.
<tb> 
 



   La stérilisation est conduite à 120 C pendant 20 minutes et on ef- fectue l'opération comme décrit dans l'exemple 1. Le rendement le plus élevé est obtenu après 130 heures avec 3 - 5 gamma/cm3. 



    Exemple 4 !    Bouillon de culture : 
 EMI5.4 
 
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> malt <SEP> 4 <SEP> %
<tb> Glucose <SEP> 4 <SEP> %
<tb> N-Z/amine <SEP> 1,5 <SEP> %
<tb> Décoction <SEP> de.grains <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb> CaCO3 <SEP> 0,5%
<tb> 
 
 EMI5.5 
 (NH12S04 0,5 % 
 EMI5.6 
 
<tb> NaC4 <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> %
<tb> CaCl2 <SEP> 10 <SEP> p.p.m.
<tb> 



  Eau <SEP> de <SEP> source. <SEP> 
<tb> 
 



   L'opération est conduite comme dans l'exemple 2. 



   Rendement le plus élevé : 3-5 gamma/cm3 par 120 heures. 



  Exemple 5. 



  Bouillon de culture 
 EMI5.7 
 
<tb> Glucose <SEP> 4 <SEP> %
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Lactose
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Peptones <SEP> 1%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,25%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,2%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Na2HPO4 <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> NaCl <SEP> 4 <SEP> 1%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Tween <SEP> 80 <SEP> 0,05 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
 
 EMI5.8 
 CaC1 10 p.pm. 
 EMI5.9 
 
<tb> Eau <SEP> de <SEP> source.
<tb> 
 
 EMI5.10 
 



  La stérilisation est effectuée à 120 C pendant 90 minutes ; on ef- fectue l'opération comme dans l'exemple 1. 



  Production : 3 - 5 gamma/om3 Littérature 1) Brownlee K.A. & Lapedes D.N. - The-effect of design upon the error of a microbiological assay for Vitamin B. J. Bact. 62, 433, 1951. 



  2) -Chiao J.S. & Peterson W.H. !licrobzolog,ca1 assay of Vitamin B with a mutant strain of Escherichia coli. Applied Nlâ.é¯rob.olog' 1.s 42, ,ÎÎ53 3) Davis B.D. & Mingioli E. S. - Mutants of Escherichia coli requiring methio- nine or Vitamin B'2 - J. Baat., 60. 17, 1950. 



  4) Foster Jockey ZaI2y J.A. Woodruff H.P. - Cup assay with Vitamin B, 2 as a standard - Science, 110, 507, 1949. 



  5) Harrison Eau Leàs K.A. & Wood F. - The assay of Vitamin B 2. 6. Microbio- 

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 logical estimation with a mutant of Escherichia coli by the plate method. 



  Analyst, 76. 696, 1951. 



  6) Hoff-Jorgensen E. Methods of biochemical analysis, 1954, Vol. 1, pag. 105 Interscience   Publishers   Inc. New York. 



  7) Krassilnikov N.A. The guide to the ray fungi Actionmycetales.   Izv. Akad.   



  Nauk.   URSSo     Moscou.   



  8) Rickes E.L.   Wood'T.R.   Production of L.L.D.-active substances by Strépto- myceso Brevent   U.S.A   2703303 du 1er mars 1955. 



  9) Waksman S.A. & Henrici A.R. The nomenclature and classification of the   actionmycetes.   



  J.Bact. 46, 1943, 337-341.

Claims

RESUME.

L'invention vise @ 1.- Un procédé pour la production de cobalamines en utilisant l'ac- tivité de fermentation d'un microorganisme de l'espèce Nocardia dans un bouil- lon de culture nutritif ; ce procédé pouvant, en outre, comporter tout.ou partie des caractéristiques suivantes ;

a) Le microorganisme utilisé est de l'espèce Nocardia rugosa. b) Le milieu nutritif utilisé pour la fermentation contient cer- tains composés susceptibles de fournir le carbone, l'azote, des sels organi- ques, et des stimulants avec des propriétés tensio-actives. c) Les composés susceptibles de fournir le carbone sont des hydrates de carbone (glucose, maltose, saccharose, dextrine, etc...). d) Les composés susceptibles de fournir l'azote sont les peptones, la caséine ou un de ses hydrolysats, des extraits de viande ou de levure, un amino-acide, le sulfate ou le nitrate d'ammonium, des résidus, contenant de l'azote, des industries utilisant des céréales, (décoctions de grains et produits similaires), des résidus solubles, contenant de l'azote, provenant de la distillation des céréales , des mélasses de canne à sucre et de bette- raves, et des produits analogues.

e) Les substances appartenant aux groupes des esters partiels des anhydrides d'hexitol et des acides gras ou leurs dérivés polyoxyalcoyléniques sont utilisés comme stimulants possédant des propriétés tensio-actives. f) Après les phases de préparation habituelles, on fait une fermen- tation submergée, en présende d'air, tout en agitant le bouillon à une tempé- rature de l'ordre de 32-37 C, en présence d'agents anti-émulsifiants. g) L'extraction de la substance ayant l'activité de la vitamine B12 est réalisée (en séparant préalablement le mycélium du bouillon de culture) par les procédés connus susceptibles de donner un produit de fermentation sous une forme pouvant être conservée, et convenant pour l'incorporation aux aliments.

2:- Un procédé pour utiliser les substances ayant une activité ana- logue à la vitamine B12 qui sont formées dans la fermentation selon un ou plusieurs des points qui précèdent, dans lequel le bouillon de fermentation est séché et le solide obtenu est employé comme substance stable convenant pour l'administration par intégration dans les aliments.

30- Un procédé selon un ou plusieurs des points qui précèdent, dans lequel le mycélium du bouillon de fermentation .est isolé et mis sous une for- me stable convenant pour l'administration ou bien est traité ensuite suivant <Desc/Clms Page number 7> les procédés connus de façon à obtenir un produit plus concentré.