BE1031925A1 - Eine orale, leberzielgerichtete nanoemulsion zur beladung mit pirfenidon sowie deren herstellungsverfahren und anwendung - Google Patents

Eine orale, leberzielgerichtete nanoemulsion zur beladung mit pirfenidon sowie deren herstellungsverfahren und anwendung Download PDF

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BE1031925A1 BE20245892A BE202405892A BE1031925A1 BE 1031925 A1 BE1031925 A1 BE 1031925A1 BE 20245892 A BE20245892 A BE 20245892A BE 202405892 A BE202405892 A BE 202405892A BE 1031925 A1 BE1031925 A1 BE 1031925A1
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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt eine orale, leberzielgerichtete Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon sowie ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Anwendung bereit. Die Nanoemulsion wird im Wesentlichen durch Protein-Polysaccharid-Folsäure-Konjugate gebildet, die aus Zeinpeptid, Dextran und Folsäure hergestellt und mit Pirfenidon beladen sind. Weiterhin wird die Anwendung der Nanoemulsion bei der Herstellung von Medikamenten zur Vorbeugung oder Behandlung von Leberfibrose bereitgestellt, insbesondere von Leberfibrose, die durch eine TACE-Operation hervorgerufen wird. Die erfindungsgemäße Nanoemulsion weist eine gute Stabilität, eine hohe Wirkstoffbeladung und ein einfaches Herstellungsverfahren auf. Die oberflächenmodifizierte Folsäure kann die intestinale epitheliale Penetration der wirkstoffbeladenen Nanoemulsion fördern, die Akkumulation der wirkstoffbeladenen Nanoemulsion in der Leber erhöhen und schließlich auf aktivierte hepatische Sternzellen abzielen, um eine antifibrotische Wirkung zu entfalten, so dass Pirfenidon bei einer niedrigeren oralen Dosis eine höhere antifibrotische Wirkung aufweisen kann. Die erfindungsgemäße Protein-Polysaccharid-Folsäure-Nanoemulsion kann als orale Verabreichungsplattform für das antifibrotische Medikament Pirfenidon dienen.

Description

' BE2024/5892
EINE ORALE, LEBERZIELGERICHTETE NANOEMULSION ZUR BELADUNG MIT
PIRFENIDON SOWIE DEREN HERSTELLUNGSVERFAHREN UND ANWENDUNG
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung gehört zum technischen Gebiet der oralen, leberzielgerichteten
Formulierungen und betrifft insbesondere eine orale, leberzielgerichtete Nanoemulsion zur
Beladung mit dem antifibrotischen Medikament Pirfenidon sowie ein Verfahren zu deren
Herstellung. Darüber hinaus betrifft sie die Verwendung der Pirfenidon-Nanoemulsion zur
Vorbeugung oder Behandlung von Leberfibroseerkrankungen, die durch verschiedene Faktoren verursacht werden.
STAND DER TECHNIK
Leberfibrose ist ein pathophysiologischer Prozess, der hauptsächlich durch die übermäßige
Ablagerung von extrazellulärer Matrix (insbesondere Kollagen) in der Leber gekennzeichnet ist, was zu Zerstörung der Leberstruktur und -funktion führt. Wenn die Faktoren, die die
Leberschädigung verursachen, nicht langfristig beseitigt werden können, kann dies zu einer
Störung der Leberstruktur, einer knotigen Regeneration der Leberzellen und der Bildung einer
Pseudolobulusstruktur, d. h. einer Leberzirrhose, führen. Leberfibrose ist histologisch reversibel und kann durch eine frühzeitige, aktive Behandlung rückgängig gemacht werden. Zahlreiche experimentelle Beweise haben gezeigt, dass die Aktivierung von hepatischen Sternzellen (HSCs) die zytologische Grundlage für die Entstehung von Leberfibrose ist. Aktivierte HSCs können durch
Proliferation und Sekretion von extrazellulärer Matrix (ECM) an der Bildung von Leberfibrose und dem Umbau der intrahepatischen Struktur beteiligt sein und die Entstehung und Entwicklung von
Leberfibrose fördern. Derzeit gibt es jedoch keine für die klinische Behandlung von Leberfibrose zugelassenen Medikamente. Pirfenidon (PFD) ist das erste neue Breitspektrum-Antifibrotikum, das in der Klinik eingesetzt wird. Sein einzigartiger Mechanismus der Entzündungshemmung,
Antifibrose und antioxidativen Stresswirkung verzögert nicht nur das Fortschreiten im chronischen
Stadium der Fibrose, sondern kann auch die akute Entzündung, die durch idiopathische
Lungenfibrose (IPF) verursacht wird, wirksam lindern. Die Food and Drug Administration der
Vereinigten Staaten und die Europäische Arzneimittel-Agentur haben PFD für die klinische
Behandlung von Patienten mit IPF zugelassen.
Die klinische Verabreichung von PFD erfolgt hauptsächlich oral, was einen großen Vorteil in
Bezug auf die Verbesserung der Compliance der Patienten darstellt. Nach der oralen Resorption wird PFD jedoch weit im Gewebe verteilt und kann in Geweben wie Leber, Niere, Herz und Lunge nachgewiesen werden. Klinische Studien haben gezeigt, dass die orale Einnahme von PFD systemische Nebenwirkungen hervorrufen kann, wie z. B. ausgeprägte gastrointestinale Symptome,
Hautreaktionen auf Sonnenlicht oder ultraviolette Strahlung sowie Gewichtsverlust. Derzeit werden die durch PFD verursachten Nebenwirkungen hauptsächlich durch Dosisreduktion oder Absetzen
* BE2024/5892 der Behandlung kontrolliert. Daher ist die Frage, wie die gezielte Verteilung von PFD im
Lebergewebe und die Aufnahme in die Zielzellen erhöht werden können, um bei einer niedrigeren
Dosierung eine bessere therapeutische Wirkung zu erzielen und das Auftreten von toxischen
Nebenwirkungen zu vermeiden, ein dringendes Problem, das bei der klinischen Anwendung von
PFD zur Behandlung von Leberfibrose gelöst werden muss. In den letzten Jahren hat die kombinierte Strategie der oralen Verabreichung und der zielgerichteten Therapie immer mehr
Aufmerksamkeit erregt. Orale Targeting ist eine nicht-invasive Verabreichungsstrategie, die mithilfe von Nanotransportsystemen über den oralen Weg ein systemisches oder entferntes
Targeting erreicht. Sie kann Zielgewebe oder -zellen genauer und effizienter erkennen und bietet gleichzeitig die Vorteile einer bequemen Verabreichung und einer guten Compliance.
Orales Targeting muss die Magen-Darm-Barriere überwinden und die AbstoBung durch das
Immunsystem umgehen, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass das Drug-Delivery-System in den systemischen Kreislauf gelangt und schließlich seine vorgegebene Targeting-Funktion erfüllt.
Nanoemulsionen als vielversprechende orale Drug-Delivery-Systeme wurden bereits zur
Behandlung verschiedener Krankheiten eingesetzt. Aufgrund ihrer leichten Resorbierbarkeit können Nanoemulsionen die Bioverfügbarkeit und Wirksamkeit von Medikamenten deutlich verbessern. Viele Nahrungsproteine sind nährstoffreich, ungiftig, kostengünstig und haben gute
Emulgierfähigkeiten, sodass sie als Emulgatoren für Nanoemulsionen verwendet werden können.
Zein ist ein natürliches Pflanzenprotein, das aus Maisproteinpulver gewonnen wird und eine große
Anzahl hydrophober Reste und polarer Gruppen enthält. Es ist ein typisches amphiphiles Polymer.
Proteine tragen jedoch oft eine gewisse Ladung und bilden eine dünne Grenzfläche in der
Proteinemulsion, sodass Proteinemulsionen stark von den Umweltfaktoren im Magen-Darm-Trakt (pH-Wert, Ionenstärke und enzymatische Hydrolyse usw.) beeinflusst werden.
Darüber hinaus müssen orale Nano-Drug-Delivery-Systeme nicht nur die
Magen-Darm-Verdauung überstehen, sondern auch in der Lage sem, biologische
Membranbarrieren zu durchbrechen, was ebenfalls weiterer Forschung bedarf.
INHALT DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Ziel der Erfindung: Um die Mängel des Stands der Technik zu beheben, stellt die vorliegende
Erfindung eine orale, leberzielgerichtete Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon sowie ein
Verfahren zu deren Herstellung und deren Anwendung bereit.
Technische Lösung: Um das oben genannte Ziel der Erfindung zu erreichen, wird die vorliegende Erfindung durch die folgenden technischen Lösungen realisiert:
Eine orale, leberzielgerichtete Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon, wobei die
Nanoemulsion im Wesentlichen durch Protein-Polysaccharid-Folsäure-Konjugate gebildet wird, die aus Zeinpeptid, Dextran und Folsäure hergestellt und mit Pirfenidon beladen sind.
Als konkrete Ausführungsform umfasst das Pirfenidon Pirfenidon oder ein Derivat davon.
Als konkrete Ausführungsform wird das Zeinpeptid hauptsächlich durch das folgende
* BE2024/5892
Verfahren hergestellt:
Zuerst wird Zein in einer wässrigen Ethanollösung gelöst, Alkali wird für eine
Alkalihydrolysereaktion zugegeben, nach Beendigung der Reaktion werden Ethanol und Wasser aus der Lösung entfernt, der pH-Wert wird auf sauer eingestellt, die Lösung wird stehengelassen, der Überstand wird verworfen, der Niederschlag wird gewaschen, dann wird der Niederschlag gelöst und schließlich wird die Lösung gefriergetrocknet, um das Zeinpeptid zu erhalten; bevorzugt beträgt die Konzentration der wässrigen Ethanollösung 65-75 %, das Alkali wird aus
Natriumhydroxid ausgewählt, das Massenverhältnis von Zein zu Natrrumhydroxid beträgt 1:(1-3); die Alkalihydrolysereaktion wird unter Rühren durchgeführt, die Reaktionstemperatur beträgt 35-40 °C, die Reaktionszeit beträgt 30-40 h.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung der oralen, leberzielgerichteten Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon bereit, das die folgenden Schritte umfasst: (1) Zuerst werden Dextran und Folsäure entnommen, um Dextran-Folsäure-Konjugate herzustellen, die dann mit Zeinpeptid umgesetzt werden, um
Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymere zu synthetisieren; (2) Die Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymere werden entnommen und mit entionisiertem
Wasser zu einer Lösung als Wasserphase versetzt; Pirfenidon wird in Öl gelöst und dient als
Ölphase; (3) Die Ölphase und die Wasserphase werden gemischt, um die Nanoemulsion herzustellen.
Als konkrete Ausführungsform beträgt in Schritt (1) das Molverhältnis von Dextran zu
Folsäure 1:(0,2-0,6), bevorzugt 1,04:0,4; die Reaktion zur Herstellung der
Dextran-Folsäure-Konjugate wird in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart von EDCI und DMAP unter Rühren durchgeführt, die Temperatur der Reaktion beträgt 35-40 °C, die
Reaktionszeit beträgt 20-28 h, bevorzugt 37 °C für 24 h; nach Beendigung der Reaktion wird dialysiert und gefriergetrocknet, um die Dextran-Folsäure-Konjugate zu erhalten; bevorzugt wird das organische Lösungsmittel aus Dimethylsulfoxid ausgewählt.
Als konkrete Ausführungsform beträgt in Schritt (1) das Massenverhältnis von Zeinpeptid zu
Dextran-Folsäure-Konjugate 1:(4-8), bevorzugt 1:6; die Synthese der
Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymere erfolgt durch Maillard-Reaktion und umfasst die folgenden Schritte:
Zeinpeptid und Dextran-Folsäure-Konjugate werden gemischt und gelöst, gefriergetrocknet, das gefriergetrocknete Pulver wird in einen mit gesättigtem KBr gefüllten, abgeschlossenen Raum gegeben und bei 55-65 °C und 75-85 % Luftfeuchtigkeit 20-28 h lang umgesetzt. Bevorzugt wird die Reaktion bei 60 °C und 79 % Luftfeuchtigkeit für 24 h durchgeführt.
Als konkrete Ausführungsform wird in Schritt (2) das Öl aus einem oder mehreren von mittelkettigen Triglyceriden, Sojaöl, Maisöl, Erdnussöl und Rizinusöl ausgewählt. Bevorzugt
* BE2024/5892 werden mittelkettige Triglyceride.
Als konkrete Ausführungsform wird in Schritt (3) die Ölphase und die Wasserphase gemischt, wobei das Massenverhältnis von Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymeren in der Wasserphase zu
Pirfenidon in der Olphase, bezogen auf die Masse des Zeins in den
Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymeren, 1:(1-4) beträgt, bevorzugt 1:2,5.
Als konkrete Ausführungsform umfasst in Schritt (3) das Verfahren zur Herstellung der
Nanoemulsion Folgendes: Mischen der Ölphase und der Wasserphase und anschlieBendes
Ultraschallbehandeln, um eine Primäremulsion zu erhalten; Hochdruckhomogenisieren der
Primäremulsion, um die Nanoemulsion zu erhalten; bevorzugt wird die Ultraschallbehandlung bei 60-70 W in einem Eiswasserbad für 2,5-3,5 min (3 s Puls, 3 s Pause) durchgeführt, weiter bevorzugt bei 65 W in einem Eiswasserbad für 3 min (3 s Puls, 3 s Pause); die
Hochdruckhomogenisierung wird bei 5000-7000 psi 2-4 mal durchgeführt, weiter bevorzugt bei 6000 psi 3 mal.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der oralen, leberzielgerichteten
Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon bei der Herstellung eines Medikaments zur
Vorbeugung oder Behandlung von Leberfibrose bereit.
Weiterhin wird die Leberfibrose durch eme TACE-Operation hervorgerufen.
Die vorliegende Erfindung erhält zunächst durch eine Veresterungsreaktion ein
Dextran-Folsäure (DEX-FA)-Konjugat und synthetisiert mittels einer grünen und sicheren
Maillard-Reaktion mit Zeinpeptid (ZP) Zeinpeptid-Dextran-Folsäure (ZD-FA)-Polymere. Orales
Lebertargeting unterscheidet sich vom konventionellen Targeting über den Blutkreislauf, da es nicht nur die Überwindung der Magen-Darm-Barriere, sondern auch ein effektives Targeting des
Krankheitsherds erfordert. Daher verwendet die vorliegende Erfindung Zeinpeptid als Grundlage für die Nanoemulsion, das nicht nur eine gute Biokompatibilität aufweist, sondern sich auch leicht mit anderen Liganden verbinden lässt, um die Mängel herkömmlicher Proteine auszugleichen. So kann beispielsweise die Verwendung von hydrophilerem Dextran (DEX) in der Wasserphase eine ausgedehnte räumliche Netzwerkstruktur bilden, die eine sterische Hinderung erzeugt und den
Nachteil von Protememulsionen ausgleicht, die anfällig für Umwelteinflüsse 1m
Magen-Darm-Trakt (pH-Wert, Ionenstärke und enzymatische Hydrolyse usw.) sind, um die
Stabilität des Abgabesystems zu verbessern. Daher kann die Herstellung von Nanoemulsionen durch Pfropfen von Zeinpeptid (ZP) mit DEX zur Synthese eines Konjugats die
Magen-Darm-Verdauung überstehen und die Stabilität des Systems im Magen-Darm-Trakt erhöhen. Darüber hinaus ist die Expression des Folsäurerezeptors a (FRa) während des
Aktivierungsprozesses von HSCs signifikant hochreguliert. Die vorliegende Erfindung nutzt FA zur
Ligandenmodifikation, was nicht nur den FA-Rezeptor auf intestinalen Epithelzellen targetieren und die Darmwandpermeabilität der Nanoemulsion verbessern kann, sondern auch die gezielte
Wirkung der Nanoemulsion auf aktivierte HSCs erhöht, um die therapeutische Wirkung des
) BE2024/5892
Medikaments auf die Leberfibrose besser auszuüben.
Zweitens verwendet die vorliegende Erfindung ein
Mikrojet-Hochdruckhomogenisierungsverfahren zur Herstellung einer PFD-beladenen
Nanoemulsion (PFD@ZD-FA) zur oralen Verabreichung zur Behandlung von CCl4-induzierter
Leberfibrose oder TACE-induzierter Leberfibrose. Die Ergebnisse zeigen, dass die FA-modifizierte
Protein-Polysaccharid-Nanoemulsion PFD effektiv einkapseln, den Transport durch die
Dünndarmepithelzellen verbessern und die orale Bioverfügbarkeit von PFD erhöhen kann. Darüber hinaus verlängert die Nanoemulsion die Verweildauer von PFD im Magen-Darm-Trakt und reichert sich nach TACE gezielt im Leberbereich an, insbesondere mit einer gezielten Wirkung auf aktivierte HSCs, was zu einer höheren antifibrotischen Wirkung von PFD bei niedriger Dosierung führt. Daher hat die in dieser Studie entwickelte PFD@ZD-FA-Nanoemulsion ein großes Potenzial für die orale, zielgerichtete Behandlung von Leberfibrose.
Vorteilhafte Wirkungen: Die in der vorliegenden Erfindung hergestellte PFD-Nanoemulsion weist eine gute Stabilität, eine hohe Wirkstoffbeladung und ein einfaches Herstellungsverfahren auf. Die oberflächenmodifizierte FA kann die intestinale epitheliale Penetration der wirkstoffbeladenen Nanoemulsion fördern, die Akkumulation der wirkstoffbeladenen
Nanoemulsion in der Leber erhöhen und schließlich auf HSCs abzielen, um eine antifibrotische
Wirkung zu entfalten, so dass PFD bei einer niedrigeren oralen Dosis eme höhere antifibrotische
Wirkung aufweisen kann. Die im Rahmen dieses Projekts entwickelte @ZD-FA-Nanoemulsion kann als orale Verabreichungsplattform für das antifibrotische Medikament PFD dienen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
Figur 1A-1B zeigt die Herstellung und Charakterisierung der erfindungsgemäßen
Protein-Polysaccharid-Folsäure-Konjugate.
Figur 2A-2C zeigt die Ergebnisse der Formulierungscharakterisierung von PFD@ZD-FA.
Figur 3A-3C zeigt die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchung von PFD@ZD-FA.
Figur 4A-4J zeigt die Ergebnisse der In-vitro-Permeabilitätsstudie von PFD@ZD-FA.
Figur 5A-5B zeigt die Ergebnisse der pharmakokinetischen Studie von PFD@ZD-FA.
Figur 6A-6C zeigt die Ergebnisse der Lebertargeting-Studie nach oraler Verabreichung von
PFD@ZD-FA.
Figur 7A-7B zeigt die Ergebnisse der HSCs-Targetimg-Studie in der Leber nach oraler
Verabreichung von PFD@ZD-FA.
Figur 8 zeigt die Ergebnisse der Studie zur antifibrotischen Wirkung von PFD@ZD-FA gegen
CCl4-induzierte Leberfibrose: Messung der Lebergewebesteifigkeit mittels
Ultraschall-Scherwellen-Elastographie.
Figur 9 zeigt die Ergebnisse der Studie zur antifibrotischen Wirkung von PFD@ZD-FA gegen
CCl4-induzierte Leberfibrose: Histopathologische Färbung des Lebergewebes.
° BE2024/5892
Figur 10 zeigt die Ergebnisse der Studie zur antifibrotischen Wirkung von PFD@ZD-FA gegen TACE-induzierte Leberfibrose: Messung der Lebergewebesteifigkeit (peritumorales
Lebergewebe) mittels Ultraschall-Scherwellen-Elastographie.
Figur 11 zeigt die Ergebnisse der Studie zur antifibrotischen Wirkung von PFD@ZD-FA gegen TACE-induzierte Leberfibrose: Histopathologische Färbung des Lebergewebes.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung kann anhand der folgenden Beispiele besser verstanden werden.
Die in den Beispielen beschriebenen Inhalte dienen jedoch lediglich der Veranschaulichung der
Erfindung und sollen und werden den in den Patentansprüchen im Einzelnen beschriebenen
Umfang der Erfindung nicht einschränken.
Beispiel 1: Herstellung und Charakterisierung der Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymere
Experimentelle Methode: Folsäure (FA, 0,4586 g, 1,04 mmol) wurde in 20 ml
Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, und dann wurden nacheinander 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochloriıd (EDCI, 0,199 g, 1,04 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (DMAP, 0,127 g, 1,04 mmol) und Dextran (DEX, 10 kDa, 4 g, 0,4 mmol) zugegeben. Anschließend wurde die Reaktion 24 h lang bei 37 °C unter magnetischem Rühren durchgeführt, und dann wurde das Produkt 24 h lang gegen Phosphatpuffer (PBS, 0,01 M, pH 7,4) und Wasser dialysiert (MWCO, 14 kDa). Schließlich wurden die
Polysaccharid-Folsäure-Konjugate (DEX-FA) durch Gefriertrocknung erhalten. Die Struktur von
DEX-FA wurde mittels 'H-NMR charakterisiert.
Die Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymere (ZD-FA) wurden mittels Maillard-Reaktion hergestellt. Zunächst wurde Zem (5 g) in einer Konzentration von 10 mg/ml in 70%iger
Ethanollösung gelöst, und festes NaOH wurde zugegeben, bis eine Endkonzentration von 0,5 mol/l erreicht war. Dann wurde die Lösung 36 h lang bei 37 °C in einem Wasserbad unter Rühren einer
Alkalihydrolysereaktion unterzogen. Nach Beendigung der Reaktion wurden Ethanol und Wasser durch Rotationsverdampfung aus der Lösung entfernt, und dann wurde der pH-Wert der erhaltenen
Lösung mit 5 molfl HCI auf 3,1 eingestellt, wobei die Lösung während der pH-Einstellung trüb wurde und die Menge des Niederschlags allmählich zunahm. Nach dem Stehenlassen der Lösung über Nacht wurde der Überstand verworfen, der Zeinpeptid-Niederschlag am Boden wurde dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen, dann wurde eine bestimmte Menge entionisiertes Wasser zu dem Niederschlag gegeben, und 2 mol NaOH wurden zugegeben, bis ein pH-Wert von 9,0 erreicht war, um den Niederschlag vollständig zu lösen. Schließlich wurde die Lösung gefriergetrocknet, um das Zempeptid (ZP) zu erhalten. ZP und DEX-FA wurden in einem
Massenverhältnis von 1:6 in entionisiertem Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde mit 1 mol/l
NaOH auf 8,8 eingestellt. Nach dem Gefriertrocknen der Reaktionslösung wurde das gefriergetrocknete Pulver in einen mit gesättigtem KBr gefüllten, abgeschlossenen Behälter gegeben und 24 h lang bei 60 °C und 79 % Luftfeuchtigkeit umgesetzt, um ZD-FA zu erhalten.
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Gleichzeitig wurde das Protein-Polysaccharid-Konjugat ohne Folsäuremodifikation (ZD) auf die gleiche Weise synthetisiert. Um die Bildung von ZD und ZD-FA zu bestätigen, wurden die
FTIR-Spektren von FA, DEX, ZP, ZD und ZD-FA in KBr-Presslingen mit einem
Infrarotspektrometer aufgezeichnet.
Experimentelle Ergebnisse: Das /H-NMR-Spektrum von DEX-FA zeigte die charakteristischen Peaks von DEX und FA (Figur 1A). Das charakteristische Signal von DEX (Proton, a) wurde bei 4,68 ppm beobachtet. Gleichzeitig bestätigten die charakteristischen
Resonanzsignale von FA bei 8,64 (Pteridinproton, ß), 7,58 und 6,64 ppm (y- und S-aromatische
Protonen) das Vorhandensein von FA-Resten. Die Bildung von ZD und ZD-FA wurde durch FT-IR weiter verifiziert. Die FT-IR-Spektren von FA, DEX, ZP, ZD und ZD-FA sind in Figur 1B dargestellt. ZP zeigte charakteristische Peaks bei 3445 cm”, 1656 cm“ und 1556 cm”, die den
Schwingungen der Hydroxyl-, Amid I- und Amid H-Gruppen zugeordnet wurden. Bei
Wellenzahlen von 1656 cm! und 1556 cm! war die Absorptionsintensität von ZD und ZD-FA geringer als die von ZP. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Carbonylgruppe von DEX mit der
Aminogruppe in ZP eine Maillard-Reaktion eingegangen ist, was zu einem Verbrauch der zu
Aminogruppen und Carbonylgruppen gehörenden Banden führt. Darüber hinaus war die
Absorptionsintensität von ZD bei Wellenzahlen von 1017-1155 em” signifikant höher als die von
ZP, was darauf hindeutet, dass die neu gebildete C-N- kovalente Bindung im Konjugat eme starke
Streckschwingung aufweist. Bemerkenswerterweise zeigten ZD-FA und ZD ähnliche
FT-IR-Spektren. Dies könnte auf die Überlappung der Amid I- und Amid II-Peaks von ZP bei 1656 und 1556 cm mit den charakteristischen Peaks von FA bei 1628 cm”, 1601 cm ‘und 1510 cm! zurückzuführen sein.
Beispiel 2: Herstellung und Charakterisierung von PFD@ZD-FA
Experimentelle Methode: ZD-FA wurde zu einer 10 mg/ml (entsprechend der
ZP-Konzentration) Lösung in entionisiertem Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde mit 1 mol/l
HCI auf 4,5 eingestellt, um die Wasserphase zu erhalten. PFD wurde in mittelkettigen Triglyceriden zu ciner Konzentration von 100 mg/ml gelöst, um die Ölphase zu erhalten. Dann wurden die
Ölphase und die Wasserphase in einem Ol-Wasser-Volumenverhältnis von 1:4 gemischt. Die
Lösung wurde geschüttelt und dann 3 mm lang bei 65 W in einem Eiswasserbad mit Ultraschall behandelt (3 s Puls, 3 s Pause), um eine primäre Emulsion zu erhalten. AnschlieBend wurde die
Emulsion dreimal bei 6000 psi mit einem Mikrojet-Hochdruckhomogenisator homogenisiert, um
PFD@ZD-FA zu erhalten. PFD@Z und PFD@ZD wurden auf die gleiche Weise hergestellt.
Die PartikelgröBe (PS), der Polydispersitätsindex (PDI) und das Zetapotenzial der
PFD-beladenen Nanoemulsionen wurden mit einem Zetasizer Nano ZS gemessen. Die
Wirkstoffemkapselungsrate (LE) und die Wirkstoffbeladung (LC) von PFD wurden mittels
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einem UV-Detektor bestimmt. Die
Detektion von PFD erfolgte mit einer mobilen Phase aus Acetonitril/Wasser (65:35, v/v) bei einer
, BE2024/5892
Wellenlänge von à = 316 nm. Die LE (%) und LC (%) von PFD wurden nach den folgenden
Formeln berechnet:
LE (Gew.%) = ET > 100 (1)
LC (Gew.-%) = a Wists * 100 2)
Experimentelle Ergebnisse: Wie in Figur 2A gezeigt, betrug die PartikelgröBe der mit ZP als
Emulgator hergestellten wirkstoffbeladenen Nanoemulsion PFD@Z etwa 117,77 nm mit einem
PDI von 0,3. Nach der Einführung von DEX verringerte sich die PartikelgröBe der Nanoemulsion signifikant, und die PartikelgröBe von PFD@ZD betrug nur 28,48 nm. Im Vergleich zu PFD@ZD war die Partikelgrôbe von PFD@ZD-FA mit 44,79 nm etwas größer. Der PDI von PFD@ZD und
PFD@ZD-FA war geringer als der von PFD@Z. Die Ergebnisse zeigen, dass die Einführung von
DEX die Emulgierfähigkeit von ZP verstärkt und klemere Tröpfchen bildet, und dass die
Einführung von FA einen geringen Einfluss auf die Emulgierfähigkeit hat. Alle Nanoemulsionen waren negativ geladen (Figur 2B), die Einführung von DEX hatte fast keinen Einfluss auf das
Potenzial, während die Einführung von FA das Potenzial weiter verringerte. Die PFD-beladenen
Nanoemulsionen wiesen alle eine gute Beladung mit PFD auf, die LE lag bei über 80 %, und die
LE von PFD@ZD und PFD@ZD-FA war etwas höher als die von PFD@Z (Figur 2C).
Beispiel 3: Stabilitätsuntersuchung von PFD@ZD-FA
Experimentelle Methode: Die Stabilität der Nanoemulsionen bei 4 °C wurde untersucht, indem die Veränderungen von PS und PDI von PFD@Z, PFD@ZD und PFD@ZD-FA über 28 Tage hinweg überwacht wurden. Darüber hinaus wurde die gastrointestinale Stabilität der
PFD-Nanoemulsionen in vitro untersucht. Kurz gesagt, wurden PFD@Z, PFD@ZD und
PFD@ZD-FA in den ersten 2 h mit simuliertem Magensaft (SGF) gemischt und dann in simulierten
Darmsaft (SIF) überführt, und dann wurden die Mischungen in einen Schüttler (100 rpm/min, 37 + 0,5 °C) gestellt. Schließlich wurden die Veränderungen der PS der Nanoemulsionen zu den vorgegebenen Zeitpunkten mit einem Zetasizer Nano ZS gemessen. Um die Freisetzung von PFD zu bewerten, wurden PFD@Z, PFD@ZD und PFD@ZD-FA jeweils in Dialyseschläuche (MWCO, 3,5 kDa) gegeben und in den ersten 2 h in 20 ml SGF dispergiert und dann in SIF überführt. In einem Schüttelinkubator (100 rpm/min, 37 + 0,5 °C) wurden zu den vorgegebenen Zeitpunkten 0,5 ml Medium entnommen und durch die gleiche Menge an frischem Medium ersetzt. Die freigesetzte
Menge an PFD wurde mittels HPLC analysiert.
Experimentelle Ergebnisse: Die Stabilität der Nanoemulsionen bei 4 °C wurde untersucht, indem die Veränderungen von PS und PDI über 28 Tage hinweg überwacht wurden (Figur 3A). Im
Vergleich zu PFD@ZD und PFD@ZD-FA zeigte PFD@Z einen schnelleren Anstieg der PS.
Darüber hinaus zeigten PFD@ZD und PFD@ZD-FA eine ausgezeichnete Stabilität in SGF und SIF (Figur 3B). PFD@Z wurde in SGF und SIF schnell freigesetzt, die kumulative Freisetzungsmenge erreichte innerhalb von 12 h 43,39 %, während die kumulative Freisetzungsmenge von PFD@ZD
) BE2024/5892 und PFD@ZD-FA signifikant verzögert und reduziert war (Figur 3C). Die Ergebnisse zeigen, dass die polysaccharıdmodifizierten Nanoemulsionen eine gute Stabilität in SGF und SIF aufweisen.
Beispiel 4: In-vitro-Permeabilitätsstudie von PFD@ZD-FA
Experimentelle Methode: Die Permeabilität der Nanoemulsionen durch die Schleimschicht wurde mit einem Transwell-System gemessen. Kurz gesagt, wurde eine 10 mg/ml Mucinlösung durch Auflösen von Schweinemagenmucin in PBS hergestellt, und 0,2 ml Mucin wurden in die obere Kammer des Transwells (12 Einsätze/24-Well-Platte, Porengröße 3 um) gegeben, während die untere Kammer mit 0,8 ml PBS gefüllt wurde. Dann wurden 0,2 ml freies PFD, PFD@Z,
PFD@ZD und PFD@ZD-FA (1 mg/ml PFD) in die obere Kammer gegeben. Nach der Inkubation in einem 37 °C Wasserbad wurden zu den Zeitpunkten 0,5, 1, 2 und 4 h jeweils 0,5 ml Lösung aus der unteren Kammer zur Analyse entnommen. Die Konzentration von PFD in der unteren Kammer wurde mittels HPLC bestimmt, und das Verhältnis von PFD, das die Schleimschicht durchdrungen hatte, wurde für jede Gruppe berechnet.
Caco-2-Zellen wurden als In-vitro-Modell für das gastrointestinale Epithel verwendet. Kurz gesagt, wurden Caco-2-Zellen mit einer Dichte von 5 x 10* Zellen/Well in die obere Kammer des
Transwells (Porengröße 0,4 um) ausgesät und 21 Tage lang in MEM-Medium mit 20 % v/v fötalem
Kälberserum (FBS) kultiviert. Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) der
Caco-2-Zellmonoschicht wurde mit einem Voltmeter gemessen. Wenn der TEER-Wert 500 Q-cm? erreichte, wurden die nachfolgenden Experimente durchgeführt. Für die Probenvorbereitung wurden freiem PFD, PFD@Z, PFD@ZD und PFD@ZD-FA (1 mg/ml PFD) mit PBS verdünnt.
Dann wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden 30 min lang bei 37 °C mit vorgewärmtem
PBS äquilibriert. Anschließend wurde das PBS in der oberen Kammer durch 0,2 ml Probe und das in der unteren Kammer durch 0,8 ml frisches PBS ersetzt. Nach 2 h Inkubation wurden 0,5 ml
Lösung aus der unteren Kammer entnommen und der Gehalt an PFD mittels HPLC quantitativ analysiert. Der apparente Permeabilitätskoeffizient (Papp) von PFD wurde wie folgt berechnet:
Pap = eu 6) wobei Q die kumulative Menge an PFD (ng) ist, die in die untere Kammer transportiert wurde,
A die Fläche der Caco-2-Zellmonoschicht (cm”) ist, Co die anfängliche PFD-Konzentration in der oberen Kammer (ng/ml) ist und / die Dauer des Permeabilitätsexperiments (s) ist. Um die zelluläre
Aufnahme zu untersuchen, wurden die Zellen gesammelt, lysiert und mit Acetonitril extrahiert. Die zelluläre Aufnahme von PFD wurde dann mittels HPLC bestimmt. Darüber hinaus wurden während des Permeabilitätsexperiments verschiedene Inhibitoren hinzugefügt, um den transzellulären Mechanismus von PFD@ZD-FA zu untersuchen. Kurz gesagt, wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden 30 min lang mit vorgewärmtem PBS inkubiert, dann wurde die
Caco-2-Monoschicht gewaschen und 30 min lang mit 37 °C PBS, das Colchicin (4 ug/ml),
Chlorpromazin (10 ug/ml), Genistein (100 ug/ml) und FA (10 ug/ml) enthielt, inkubiert, und dann wurden die Zellen 2 h lang mit PFD@ZD-FA (0,2 ml, 10 mg/ml PFD) behandelt, um den Papp von
PFD zu berechnen. Schließlich wurden die TEER-Werte gemessen, um den Einfluss der
PFD-Formulierungen auf die Integrität der Caco-2-Monoschicht zu überwachen. Zunächst wurde der anfängliche TEER-Wert der Caco-2-Zellmonoschicht gemessen. Dann wurde das Medium in der oberen Kammer durch 0,2 ml PFD-Formulierung (1 mg/ml PFD) ersetzt. Nach 2 h wurde die
PFD-Formulierung aus der oberen Kammer entfernt und durch PBS ersetzt, und der TEER-Wert der Caco-2-Zellmonoschicht wurde nach den verschiedenen Behandlungen erneut gemessen.
Für die Bildgebung wurden mit Nilrot (NR) markierte Nanoemulsionen hergestellt. Ratten mit
CCls-induzierter Leberfibrose wurden zufällig in 3 Gruppen (n = 3) eingeteilt und erhielten eine orale Gabe von freies NR/PFD, NR/PFD@ZD und NR/PFD@ZD-FA (2 mg/kg NR, 100 mg/kg
PFD). Die Ratten wurden 0,5, 2, 6 und 12 h nach der Verabreichung getötet. Der Zwölffingerdarm, das Jejunum und das Ileum wurden entnommen, geöffnet und vorsichtig mit PBS gespült. Die
Gewebe wurden in OCT eingebettet, gefroren und geschnitten, und dann mit DAPI gefärbt.
Schließlich wurden die Fluoreszenzbilder der Dünndarmschnitte unter einem konfokalen
Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) beobachtet und aufgenommen.
Experimentelle Ergebnisse: Es wurden In-vitro-Modelle der Schleimschicht und der
Caco-2-Zellmonoschicht etabliert, um die intestinale Schleimbarriere bzw. die intestinalen
Epithelzellen und deren Tight Junctions zu simulieren (Figur 4A). Zu den Zeitpunkten 0,5, 1, 2 und 4 h wurde die Menge an PFD gemessen, die die Schleimschicht durchdrungen hatte, um die
Effizienz der Schleimpenetration zu bestimmen. Die PFD-Penetration aller PFD-Nanoemulsionen nahm mit der Zeit zu. Zum Zeitpunkt 1 h war die Penetration von PFD bei PFD@ZD und
PFD@ZD-FA signifikant höher als bei freiem PFD und PFD@Z, und zum Zeitpunkt 4 h zeigte
PFD@ZD-FA die höchste Penetration (Figur 4B). Es wird vermutet, dass die DEX-Modifikation die Stabilität und die transmukosale Permeabilität der PFD-Nanoemulsionen verbessert, und dass
PFD@ZD-FA die beste Permeabilität durch die Schleimschicht aufweist. Darüber hinaus wurde
Papp als Hauptindikator zur Bewertung der Permeabilität verwendet, um den Transport von
PFD-Nanoemulsionen durch die Caco-2-Zellmonoschicht zu bewerten (Figur 4C). Im Vergleich zu freiem PFD erhöhten die Nanoemulsionen die Permeabilität von PFD durch die intestinalen
Epithelzellen signifikant, insbesondere in der PFD@ZD-FA-Gruppe. Sowohl der transzelluläre
Weg als auch der parazelluläre Transport könnten zur PFD-Permeabilität beitragen. Die Rolle des transzellulären Weges bei der PFD-Permeabilität wurde durch die zelluläre Aufnahme der
PFD-Formulierungen durch Caco-2-Zellen bewertet (Figur 4D). Die Nanoemulsionen erhöhten die zelluläre Aufnahme von PFD, insbesondere PFD@ZD-FA, was möglicherweise auf die Förderung der Folsäurerezeptor-vermittelten Endozytose zurückzuführen ist. Um den Mechanismus der zellulären Aufnahme von PFD@ZD-FA weiter zu untersuchen, wurden verschiedene
Aufnahmeinhibitoren hinzugefügt, um deren Einfluss auf die Aufnahme von PFD@ZD-FA durch
Caco-2-Zellen zu untersuchen (Figur 4E). Die Ergebnisse zeigten, dass Colchicin, Chlorpromazin
U BE2024/5892 und Genistein den Papp-Werte von PFD signifikant reduzierten, was darauf hindeutet, dass
PFD@ZD-FA hauptsächlich über Makropinozytose-, Clathrin- und Caveolin-vermittelte Wege aufgenommen werden. Wichtig ist, dass die kompetitive Hemmung der Endozytose von
PFD@ZD-FA durch freie FA die Rolle der Folsäurerezeptor-vermittelten Aufnahme in
Caco-2-Zellen bestätigt. Darüber hinaus wurde der TEER, der die Integrität der
Monoschichtmembran widerspiegelt, verwendet, um den Einfluss der Nanoemulsionen auf die
Tight Junctions zwischen den Zellen zu bewerten, die eng mit dem parazellulären Transport zusammenhängen (Figur 4F). Die Zugabe von PFD-beladenen Nanoemulsionen zur apikalen Seite der Zellmonoschicht führte zu einer sofortigen Verringerung des TEER, der sich nach Entfernung der Formulierung allmählich erholte. Dies deutet darauf hin, dass die Nanoemulsionen die Tight
Junctions zwischen den Zellen vorübergehend und reversibel öffnen können, was bestätigt, dass der parazelluläre Transport zum transzellulären Transport von PFD-Nanoemulsionen beiträgt.
Die Ratten wurden 0,5, 2, 6 und 12 h nach der Verabreichung getötet, und der Dünndarm wurde präpariert. Die Segmente des Zwölffingerdarms, des Jejunums und des Ileums wurden geschnitten, und die Fluoreszenzintensität an verschiedenen Stellen wurde mittels CLSM beobachtet und quantifiziert (Figur 4G-J). Die Gesamtfluoreszenzintensität der Nanoemulsionen war höher als die von freiem NR/PFD, und die Fluoreszenzintensität von NR/PFD@ZD-FA war in den Dünndarmsegmenten höher als die von NR/PFD@ZD. 2 h nach der oralen Verabreichung war die Fluoreszenzintensität von freiem NR/PFD im Zwölffingerdarm sehr schwach, während die
Nanoemulsionen die Fluoreszenzintensität von NR im Zwölffingerdarm oder Jejunum in unterschiedlichem Maße beibehielten, insbesondere in der NR/PFD@ZD-FA-Gruppe. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Nanoemulsionen eine starke Resistenz gegen den enzymatischen Abbau aufweisen, und dass das Medikament langsam aus dem Magen- und
Darmsaft freigesetzt wird, was zu einer frühen Retention des Medikaments im Dünndarm führt.
Darüber hinaus könnte die hohe Expression des Folsäurerezeptors auf der apikalen
Bürstensaummembran des Zwölffingerdarms und des proximalen Jejunums einer der Gründe für die erhöhte NR-Verteilung in den Zotten des Zwölffingerdarms und des Jejunums in der
NR/PFD@ZD-FA-Gruppe sein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass NR/PFD@ZD-FA den transepithelialen Transport von NR im Zwölffingerdarm und Jejunum effektiv fördern kann, was zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit des Medikaments beiträgt.
Beispiel 5: Pharmakokinetische Studie von PFD@ZD-FA
Experimentelle Methode: Ratten mit CCl-induzierter Leberfibrose wurden zufällig in 4
Gruppen (n = 6) eingeteilt und erhielten eine orale Gabe von freiem PFD, PFD@ZD und
PFD@ZD-FA (100 mg/kg PFD). Gleichzeitig wurde die Pharmakokinetik von freiem PFD in hoher
Dosis (150 mg/kg PFD) bewertet. Zu den vorgegebenen Zeitpunkten wurden die Ratten m jeder
Gruppe anästhesiert, und 0,5 ml Blut wurden aus der Schwanzvene entnommen. Das Blut wurde 5 min lang bei 3000 x g zentrifugiert, um das Plasma zu gewinnen. 100 ul Plasma wurden mit 400 ul
Acetonitril gemischt. Die Mischung wurde 10 min lang bei 4 °C und 10000 x g zentrifugiert, der
Überstand wurde entnommen und mittels HPLC analysiert. Schließlich wurden die wichtigsten pharmakokinetischen Parameter mit der Pharmakokinetik-Software WinNonlin 8.3 analysiert.
Experimentelle Ergebnisse: Um das pharmakokinetische Verhalten von PFD bei Ratten mit
Leberfibrose zu untersuchen, wurde freies PFD in Dosen von 100 mg/kg oder 150 mg/kg oral verabreicht, während PFD@ZD und PFD@ZD-FA in Dosen von 100 mg/kg PFD verabreicht wurden, um die Plasmakonzentrations-Zeit-Kurven zu erhalten (Figur 5A), und die wichtigsten pharmakokinetischen Parameter wurden berechnet (Figur 5B). Im Vergleich zur 100 mg/kg freies
PFD-Gruppe verlängerte die hochdosierte freies PFD-Gruppe (150 mg/kg) die mittlere
Verweildauer (MRT) von PFD um das 1,38-fache und erhöhte die AUCo.„um das 1,61-fache. Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied in der apparenten Plasmaclearance (CL/F) zwischen den beiden Gruppen. Im Vergleich zur freies PFD (100 mg/kg)-Gruppe verlängerten PFD@ZD und
PFD@ZD-FA die MRT von PFD um das 1,85-fache bzw. 1,88-fache. In Bezug auf die AUCow erhöhten PFD@ZD und PFD@ZD-FA die AUCO0-o um das 2,18-fache bzw. 2,80-fache.
Gleichzeitig wurde eine Verringerung der CL/F beobachtet. Die CL/F der PFD@ZD- und
PFD@ZD-FA-Gruppen betrug 46,2 % bzw. 36,5 % der freies PFD (100 mg/kg)-Gruppe. Daher verlängerten die Nanoemulsionen die Blutzirkulationszeit von PFD effektiv und verzögerten die
Clearance durch Niere und Leber. Interessanterweise gab es kaum einen Unterschied in der MRT zwischen der PFD@ZD- und der PFD@ZD-FA-Gruppe. Im Vergleich zur PFD@ZD-Gruppe erhöhten sich Cmax und AUCo.„ In der PFD@ZD-FA-Gruppe um das 1,12-fache bzw. 1,25-fache.
Dies deutet darauf hin, dass PFD@ZD-FA die orale Absorption von PFD besser verbessern kann, was möglicherweise auf die Förderung des Transports von PFD@ZD-FA im Darm durch die
Folsäurerezeptor-vermittelte Endozytose zurückzuführen ist.
Beispiel 6: Lebertargeting-Studie von PFD@ZD-FA nach oraler Verabreichung
Experimentelle Methode: Zunächst wurden mit Lipiodol markierte Nanoemulsionen hergestellt. Ratten mit CCl4-induzierter Leberfibrose (CCl4 wurde mit Olivenöl im Verhältnis 1:3 gemischt und dann intraperitoneal in einer Dosis von 0,1 ml/100 g Körpergewicht über 8 Wochen hinweg verabreicht) wurden zufällig in 3 Gruppen (n = 5) eingeteilt und nach Anästhesie mit 1 %
Isofluran mit Lipiodol/PFD, Lipiodol/PFD@ZD und Lipiodol/PFD@ZD-FA (2 ml/kg Lipiodol, 100 mg/kg PFD) oral behandelt. Zu den Zeitpunkten 0, 0,08, 0,17, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 und 24 h wurden abdominale CT-Scans durchgeführt. Die CT-Scan-Parameter waren wie folgt:
Röhrenspannung 120 kV, Stromstärke 120 mA, Schichtdicke 3,5 mm, Schichtabstand 3,5 mm,
Pitch 0,8, Sichtfeld 22 cm. Die Verteilung der Nanoemulsionen im Magen-Darm-Trakt wurde anhand der Lokalisationsbilder beobachtet, und die CT-Werte der Leber wurden anhand der
Querschnittsbilder gemessen. Die Region of Interest (ROT) wurde im rechten Leberlappen mit einer
Größe von etwa 2 mm? ausgewählt, wobei Artefakte vermieden wurden, und der Mittelwert wurde nach mehreren Messungen berechnet.
Experimentelle Ergebnisse: Die Lipiodol/PFD-Lösung sowie Lipiodol/PFD@ZD und
Lipiodol/PFD@ZD-FA wurden Ratten mit Leberfibrose oral verabreicht, und zu verschiedenen
Zeitpunkten wurden Lokalisationsbilder und Leberquerschnitte aufgenommen. Die
Lokalisationsbilder (Figur 6A) zeigten, dass 0,08 h nach der oralen Verabreichung von 5 Lipiodol/PFD allein ein Lipiodol-Schatten hoher Dichte im Magen erschien, während ein Teil des
Lipiodols aus dem Magen in den Dünndarm entleert wurde. Die Verweildauer von Lipiodol im
Dünndarm betrug etwa 4 h, 6 h später war es im Wesentlichen vollständig vom Dünndarm in den
Dickdarm übergegangen und wurde nach 24 h ausgeschieden. Die Verweildauer von
Lipiodol/PFD@ZD und Lipiodol/PFD@ZD-FA im Dünndarmsegment verlängerte sich auf über 6 h. 6 h später wurde ein Teil der Formulierung aus dem Magen in den Dünndarm entleert. Zum
Zeitpunkt 24 h verblieb noch ein Teil der wirkstoffbeladenen Nanoemulsion im Dickdarm der
Ratten. Die CT-Bilder der Leberquerschnitte (Figur 6B) und die quantitativen Ergebnisse (Figur 6C) zeigten, dass die CT-Werte der Leber in allen Formulierungsgruppen mit der Zeit zunahmen.
Die CT-Werte der Leber in den Lipiodol/PFD@ZD- und Lipiodol/PFD@ZD-FA-Gruppen waren zu verschiedenen Zeitpunkten signifikant höher als m der Lipiodol/PFD-Gruppe. Zum Zeitpunkt 24 h betrug der CT-Wert der Leber in der Lipiodol/PFD@ZD-FA-Gruppe 95,62, was dem 1,39-fachen bzw. 1,22-fachen des Wertes in der Lipiodol/PFD-Gruppe bzw. der Lipiodol/PFD@ZD-Gruppe entspricht. Die oben genannten Ergebnisse zeigen, dass Lipiodol/PFD@ZD-FA das beladene
Medikament kontinuierlich an den Darm abgeben kann, längere Zeit im Dünndarm verbleibt und nach der effektiven Absorption durch die intestinalen Epithelzellen die Leber erreicht, was dazu beiträgt, dass PFD seine therapeutische Wirkung besser entfalten kann.
Beispiel 7: HSCs-Targeting-Studie in der Leber nach oraler Verabreichung von PFD@ZD-FA
Experimentelle Methode: Fin Leberfibrosemodell wurde durch 8-wôchige intraperitoneale
Injektion von CCl4 (CCl4 wurde mit Olivenöl im Verhältnis 1:3 gemischt, die Dosis betrug 0,1 ml/100 g Körpergewicht) in Ratten etabliert. Nach Abschluss der Modellierung wurden die Ratten mit Leberfibrose zufällig in 3 Gruppen (n = 3) eingeteilt und erhielten eine orale Gabe von freies
NR/PFD, NR/PFD@ZD und NR/PFD@ZD-FA (2 mg/kg NR, 100 mg/kg PFD). 6 h nach der oralen
Gabe wurden die Lebem entnommen und 24 h lang in 4%igem Paraformaldehyd fixiert. Die
Gewebe wurden entwässert, eingebettet und geschnitten. Vor der Färbung wurden die Schnitte entparaffiniert und in Wasser rehydratisiert. Anschließend wurden die Schnitte 1 h lang mit 10%iger Ziegenserum-Blockierungslösung blockiert und über Nacht bei 4 °C mit a-SMA-Antikôrper inkubiert, gefolgt von 1 h Inkubation mit Ziege-Anti-Maus-IgG
H&L-Sekundärantikörper bei Raumtemperatur. Nach der DAPI-Färbung wurden die Schnitte mit einem Antifade-Reagenz eingedeckt. Schließlich wurden alle Schnitte mittels CLSM beobachtet.
Experimentelle Ergebnisse: Ratten mit Leberfibrose erhielten eine orale Gabe von freies
NR/PFD, NR/PFD@ZD und NR/PFD@ZD-FA. 6 h später wurden die Ratten getötet, und das
Lebergewebe wurde entnommen. Die Verteilung von a-SMA-positiven aktivierten HSCs im
Lebergewebe wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Weiterhin wurde bestimmt, ob die NR-markierten Nanoemulsionen von den aktivierten HSCs im Lebergewebe aufgenommen werden können. Das Fluoreszenzsignal von freiem NR in den HSCs des Lebergewebes war sehr schwach, was darauf hindeutet, dass freies NR nach oraler Verabreichung die HSCs in der Leber nicht erreichen kann. Beide NR-markierten Nanoemulsionen erhöhten jedoch das
Fluoreszenzsignal in den HSCs der Leber (Figur 7A). Insbesondere war die Fluoreszenzintensität von NR/PFD@ZD-FA in der Leber 5,73-mal bzw. 1,8-mal so hoch wie die von freiem NR/PFD bzw. NR/PFD@ZD (Figur 7B).
Beispiel 8: Studie zur antifibrotischen Wirkung von PFD@ZD-FA gegen CClı-induzierte
Leberfibrose
Experimentelle Methode: Fin Leberfibrosemodell wurde durch 8-wôchige intraperitoneale
Injektion von CCl4 (zweimal wöchentlich, CCL wurde mit Olivenöl im Verhältnis 1:3 gemischt, die
Dosis betrug 0,1 m1/100 g Körpergewicht) in Ratten etabliert. Die Kontrollgruppe (Normal) erhielt intraperitoneale Injektionen von Olivenöl. Nach Abschluss der Modellierung wurden die Ratten mit
CCl4-induzierter Leberfibrose zufällig in 6 Gruppen (n = 6) eingeteilt: Modellgruppe (PBS), freies
PFD (150 mg/kg), freies PFD (100 mg/kg), PFD@ZD (100 mg/kg) und PFD@ZD-FA (100 mg/kg).
Anschließend wurden die Ratten 4 Wochen lang einmal täglich mit den verschiedenen
PFD-Formulierungen oral behandelt. Die Normal- und die Modellgruppe erhielten eine orale Gabe von physiologischer Kochsalzlösung. Nach der Behandlung wurde die Steifigkeit des
Lebergewebes der Ratten im lebenden Zustand mittels Ultraschall-Scherwellen-Elastographie gemessen. Anschließend wurden die Ratten getötet, und das Lebergewebe wurde histologisch untersucht, einschließlich H&E-Färbung, Sirius Red-Färbung, Masson's Trichrom-Färbung und immunhistochemischer Nachweis von a-SMA und Kollagen III, um den Grad der Leberfibrose zu beurteilen.
Experimentelle Ergebnisse: Um den Einfluss der verschiedenen PFD-Formulierungen auf das
Fortschreiten der Leberfibrose zu untersuchen, wurden Ratten nach der CCl,-induzierten
Leberfibrose mit hochdosiertem (150 mg/kg) oder niedrigdosiertem (100 mg/kg) PFD,
PFD@ZD-Lösung (100 mg/kg) und PFD@ZD-FA (100 mg/kg) 4 Wochen lang einmal täglich oral behandelt. Nach der Behandlung wurde zunächst die Steifigkeit des Lebergewebes mittels
Ultraschall-Scherwellen-Elastographie gemessen (Figur 8). Die Ergebnisse zeigten, dass die Leber in der Modellgruppe im Vergleich zur Normalgruppe eine erhöhte Steifigkeit aufwies. Nach der
Behandlung mit den verschiedenen PFD-Formulierungen reduzierten sowohl hochdosiertes als auch niedrigdosiertes freies PFD die Lebersteifigkeit dosisabhängig, was darauf hindeutet, dass freies PFD eine antifibrotische Wirkung hat. Bei einer Dosis von 100 mg/kg reduzierten die verschiedenen PFD-Emulsionen die Lebersteifigkeit in unterschiedlichem Maße, insbesondere in der PFD@ZD-FA-Gruppe, in der die Lebersteifigkeit nur 67,55 % der Modellgruppe betrug. Die
Ratten wurden getötet, das Lebergewebe wurde entnommen und histologisch untersucht. Wie in
Figur 9 gezeigt, war die Leberoberfläche in der Normalgruppe glatt, während die Leberkapsel in der Modellgruppe verdickt und gräulich-weif war. Nach der Behandlung mit den verschiedenen
PFD-Formulierungen wurde die Dicke der Leberkapsel in unterschiedlichem Maße reduziert, und die gräulich-weiBe Farbe der Oberfläche nahm ab, was darauf hindeutet, dass die verschiedenen 5 PFD-Formulierungen die Leberfibrose abschwächen können. Die histologische Färbung der
Leberschnitte mit Sirius Red, Masson's Trichrom und immunhistochemischen Färbungen bestätigte die oben genannten Befunde weiter. Zunächst zeigte die H&E-Färbung, dass die Hepatozyten in der Normalgruppe regelmäßig angeordnet waren und sich radial von der Zentralvene ausbreiteten.
In der Modellgruppe waren die Zellen vergrößert, das Zytoplasma war blasser gefärbt, es zeigten sich leichte Anzeichen eines Leberödems, und in der Nähe der Portalfelder war eine Fibrose zu erkennen. Die Sirius Red- und Masson's Trichrom-Färbung bestätigten weiter, dass in der
Modellgruppe eine starke Kollagenfaserbildung auftrat. Die Kollagen III- und o-SMA-Färbung bestätigte, dass die verschiedenen PFD-Formulierungen die Ablagerung von Kollagen HI bzw. die
Expression von o-SMA in unterschiedlichem Maße reduzieren konnten, insbesondere in der
PFD@ZD-FA-Gruppe.
Beispiel 9: Studie zur antifibrotischen Wirkung von PFD@ZD-FA gegen TACE-induzierte
Leberfibrose
Experimentelle Methode: Zunächst wurde em VX2-Leberkrebs-Transplantationsmodell in
Kaninchen durch perkutane Ultraschall-geführte Injektion etabliert. Anschließend wurden die
Kaninchen zufällig in 6 Gruppen (n = 6) eingeteilt: Modellgruppe (Modell), TACE + PBS, TACE + freiesPFD (135 mg/kg), TACE + freies PFD (90 mg/kg), TACE + PFD@ZD (90 mg/kg) und TACE + PFD@ZD-FA (90 mg/kg). In der ersten Woche nach der Modellierung wurde mit der oralen
Verabreichung der verschiedenen PFD-Formulierungen begonnen. In der zweiten Woche nach der
Modellierung wurde eine TACE-Behandlung durchgeführt, und nach der Operation wurde die orale
Verabreichung der verschiedenen PFD-Formulierungen 2 Wochen lang fortgesetzt. Anschließend wurde die Steifigkeit des Lebergewebes der Kaninchen innerhalb von 2 cm vom Rand des
VX2-Tumors mittels Ultraschall-Scherwellen-Elastographie gemessen. Die Kaninchen wurden getötet, und Lebergewebeproben aus diesem Bereich wurden entnommen und 24 h lang in 4%igem
Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden die Gewebe entwässert, eingebettet und geschnitten.
Vor der Färbung wurden die Schnitte entparaffiniert und in Wasser rehydratisiert. Die Schnitte wurden mit H&E, Sirius Red und Masson's Trichrom gefärbt, und a-SMA und Kollagen HI wurden immunhistochemisch nachgewiesen, um den Grad der Leberfibrose nach TACE in den Kaninchen zu beurteilen.
Experimentelle Ergebnisse: Die Messung der Lebergewebesteifigkeit mittels
Ultraschall-Scherwellen-Flastographie ergab, dass die Gewebesteifigkeit nach der
TACE-Behandlung erhöht war. Die Behandlung mit den verschiedenen PFD-Formulierungen reduzierte die Lebergewebesteifigkeit signifikant, insbesondere in der PFD@ZD-FA-Gruppe, in der die Reduktion der Lebergewebesteifigkeit am deutlichsten war (Figur 10). Die H&E-Färbung des
Lebergewebes zeigte, dass die Hepatozyten nach der TACE-Behandlung etwas vergrößert und das
Zytoplasma blasser waren. Die Sirius Red- und Masson's Trichrom-Färbung bestätigten, dass die
Färbung des Fasergewebes in der Leber nach der TACE-Behandlung zunahm, während die
Behandlung mit den verschiedenen PFD-Formulierungen den Grad der Leberfibrose in unterschiedlichem Maße verbesserte. Die PFD@ZD-FA-Gruppe konnte den Grad der Leberfibrose am deutlichsten reduzieren. Dies wurde durch die immunhistochemische Färbung weiter bestätigt, die zeigte, dass die Ablagerung von Kollagen III und die Expression von a-SMA in der Leber nach der Behandlung mit PFD@ZD-FA reduziert waren (Figur 11).

Claims (10)

  1. Patentansprüche l. Eine orale, leberzielgerichtete Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanoemulsion im Wesentlichen durch Protein-Polysaccharid-Folsäure-Konjugate gebildet wird, die aus Zeinpeptid, Dextran und Folsäure hergestellt und mit Pirfenidon beladen sind.
  2. 2. Die orale, leberzielgerichtete Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Zeinpeptid hauptsächlich durch das folgende Verfahren hergestellt wird: Zuerst wird Zem in einer wässrigen Ethanollösung gelöst, Alkali wird für eine Alkalihydrolysereaktion zugegeben, nach Beendigung der Reaktion werden Ethanol und Wasser aus der Lösung entfernt, der pH-Wert wird auf sauer eingestellt, die Lösung wird stehengelassen, der Überstand wird verworfen, der Niederschlag wird gewaschen, dann wird der Niederschlag gelöst und schließlich wird die Lösung gefriergetrocknet, um das Zeinpeptid zu erhalten; bevorzugt beträgt die Konzentration der wässrigen Ethanollösung 65-75 %, das Alkali wird aus Natriumhydroxid ausgewählt, das Massenverhältnis von Zein zu Natrrumhydroxid beträgt 1:(1-3); die Alkalihydrolysereaktion wird unter Rühren durchgeführt, die Reaktionstemperatur beträgt 35-40 °C, die Reaktionszeit beträgt 30-40 h.
  3. 3. Verfahren zur Herstellung der oralen, leberzielgerichteten Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: (1) Zuerst werden Dextran und Folsäure entnommen, um Dextran-Folsäure-Konjugate herzustellen, die dann mit Zeinpeptid umgesetzt werden, um Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymere zu synthetisieren; (2) Die Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymere werden entnommen und mit entionisiertem Wasser zu einer Lösung als Wasserphase versetzt; Pirfenidon wird in Öl gelöst und dient als Ölphase; (3) Die Ölphase und die Wasserphase werden gemischt, um die Nanoemulsion herzustellen.
  4. 4. Verfahren zur Herstellung der oralen, leberzielgerichteten Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (1) das Molverhältnis von Dextran zu Folsäure 1:(0,2-0,6) beträgt, die Reaktion zur Herstellung der Dextran-Folsäure-Konjugate in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart von EDCI und DMAP unter Rühren durchgeführt wird, die Temperatur der Reaktion 35-40 °C beträgt, die Reaktionszeit 20-28 h beträgt; nach Beendigung der Reaktion wird dialysiert und gefriergetrocknet, um die Dextran-Folsäure-Konjugate zu erhalten; bevorzugt wird das organische Lösungsmittel aus Dimethylsulfoxid ausgewählt.
  5. 5. Verfahren zur Herstellung der oralen, leberzielgerichteten Nanoemulsion zur Beladung mit
    © BE2024/5892 Pirfenidon gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (1) das Massenverhältnis von Zeinpeptid zu Dextran-Folsäure-Konjugaten 1:(4-8) beträgt; die Synthese der Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymere erfolgt durch Maillard-Reaktion und umfasst die folgenden Schritte: Zeinpeptid und Dextran-Folsäure-Konjugate werden gemischt und gelöst, gefriergetrocknet, das gefriergetrocknete Pulver wird in einen mit gesättigtem KBr gefüllten, abgeschlossenen Raum gegeben und bei 55-65 °C und 75-85 % Luftfeuchtigkeit 20-28 h lang umgesetzt.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung der oralen, leberzielgerichteten Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (2) das Öl aus einem oder mehreren von mittelkettigen Triglyceriden, Sojaöl, Maisöl, Erdnussöl und Rizinusöl ausgewählt wird.
  7. 7. Verfahren zur Herstellung der oralen, leberzielgerichteten Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (3) die Ölphase und die Wasserphase gemischt werden, wobei das Massenverhältnis von Protein-Polysaccharid-Folsäure-Polymeren in der Wasserphase zu Pirfenidon in der Ölphase, bezogen auf die Masse des Zeins in den Protem-Polysaccharid-Folsäure-Polymeren, 1:(1-4) beträgt.
  8. 8. Verfahren zur Herstellung der oralen, leberzielgerichteten Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (3) das Verfahren zur Herstellung der Nanoemulsion Folgendes umfasst: Mischen der Ölphase und der Wasserphase und anschließendes Ultraschallbehandeln, um eine Primäremulsion zu erhalten; Hochdruckhomogenisieren der Primäremulsion, um die Nanoemulsion zu erhalten; bevorzugt wird die Ultraschallbehandlung bei 60-70 W in einem Eiswasserbad für 2,5-3,5 min (3 s Puls, 3 s Pause) durchgeführt; die Hochdruckhomogenisierung wird bei 5000-7000 psi 2-4 mal durchgeführt.
  9. 9, Verwendung der oralen, leberzielgerichteten Nanoemulsion zur Beladung mit Pirfenidon gemäß Anspruch 1 oder 2 bei der Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Behandlung von Leberfibrose.
  10. 10. Verwendung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Leberfibrose durch eine TACE-Operation hervorgerufen wird.
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