BE1026457A1

BE1026457A1 - Procédé et dispositif pour la détection et différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes par oligochromatographie

Info

Publication number: BE1026457A1
Application number: BE20185469A
Authority: BE
Inventors: Laetitia Avrain; Florence Naze; Thierry Leclipteux; Pascal Mertens; Olivia Lefevre
Original assignee: Coris Bioconcept
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2020-01-30
Also published as: WO2020008009A1; EP3818181A1; BE1026457B1

Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de détection et de différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes, en particulier une bactérie, comprenant une étape d’amplification d’une ou plusieurs cibles d’ADN, précédée ou non d'une étape de transcription inverse d’un ou plusieurs ARN, et suivie d’une étape de détection par oligochromatographie des produits amplifiés et de différenciation (ou discrimination) de mutations ponctuelles (mutations par substitution, insertion ou délétion de bases nucléiques).

Description

BE2018/5469 Procédé et dispositif pour la détection et différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes par oligochromatographie

La présente invention se rapporte à une méthode de détection et de différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes, en particulier une bactérie, comprenant une étape d'amplification d'une ou plusieurs cibles d'ADN, précédée ou non d'une étape de transcription inverse d'un ou plusieurs ARN, et suivie d'une étape de détection par oligochromatographie des produits amplifiés et de différenciation (ou discrimination) de mutations ponctuelles (mutations par substitution, insertion ou délétion de bases nucléiques).

Les mutations ponctuelles, ou polymorphismes (mono)nucléotidiques, peuvent être responsables de pathologies chez les êtres vivants ou encore permettre à certains microorganismes de s'adapter à un environnement défavorable, comme dans le cas de l'apparition d'une résistance à des agents anti-infectieux.

Les techniques disponibles actuellement permettent difficilement d'identifier rapidement plusieurs polymorphismes nucléotidiques c'est-à-dire de détecter l'insertion ou la délétion d'une base nucléotidique, de même que la substitution d'une base nucléotidique de type sauvage par une autre base nucléotidique (mutée), capables, éventuellement, de conférer un nouveau phénotype.

Plusieurs variants ou sous-populations polymorphiques peuvent également coexister chez un seul individu. Par exemple, certaines bactéries résistantes aux antibiotiques coexistent avec des bactéries sensibles. La détection de ces différentes sous-populations peut avoir des conséquences sur la gravité de la maladie ou encore sur le choix du traitement à administrer au patient.

Dans le cas de polymorphismes nucléotidiques dans une séquence codante, l'une des difficultés majeures est de pouvoir non seulement identifier la région ou la position dans le génome de la base nucléique mutée, mais également, dans le cas de régions codantes, de déterminer spécifiquement l'acide aminé modifié par la mutation ponctuelle. En effet, une seule et même position du génome peut présenter différents polymorphismes nucléotidiques, engendrant le cas échéant la synthèse d'acides aminés différents.

Dans certains cas, la réponse à la gravité de la pathologie ou la sensibilité ou la résistance à l'agent anti-infectieux est dépendante de l'acide-aminé synthétisé. Il est donc

BE2018/5469 primordial de pouvoir identifier la base nucléotidique modifiée par rapport à la séquence codante sauvage.

A l'heure actuelle, il existe plusieurs technologies pouvant être utilisées pour la détection et la caractérisation d'une mutation ponctuelle. Par exemple, on peut notamment citer :

- Les techniques de PCR « molecular beacons » ou « Taqman » permettant d'identifier les polymorphismes nucléotidiques par l'hybridation de sondes « beacons » ou « Taqman » spécifiques à la région d'intérêt après amplification de la séquence cible par PCR. Cependant, certaines sondes peuvent couvrir plusieurs positions mutationnelles ce qui ne permet pas d'identifier spécifiquement la base nucléotidique mutée et par conséquent le nouvel acide aminé formé (dans le cas d'un gène codant). L'autre limitation de cette technique est le recours à des fluorophores différents pour le marquage des sondes spécifiques. Les appareils de PCR en temps réel permettant la quantification des fluorophores sont limités à 4, voire 5, canaux de fluorescence, ce qui limite le nombre de mutations détectées par réaction PCR.

- La PCR avec agent intercalant suivie d'une analyse par High Resolution Melting (HRM). L'amplification de la cible est réalisée en présence d'un intercalant de l'ADN, puis une courbe de dissociation des doubles brins d'ADN est réalisée sous l'effet de températures croissantes. Les liaisons entre les bases G-C étant plus fortes que pour une liaison A-T, cette technique peut permettre de discriminer des acides nucléiques sauvages, d'acides nucléiques hétérozygotes (mutation sur un seul des deux brins d'ADN), d'acides nucléiques homozygotes (mutation sur les deux brins d'ADN), mais ne permet de détecter qu'une seule mutation par réaction PCR et doit être préférentiellement comparée au signal obtenu pour une séquence sauvage.

- Les techniques de digital PCR permettent d'augmenter significativement la sensibilité de détection de mutants au sein d'une large population sauvage. Elles permettent ainsi d'affiner le diagnostic, voire même de faire du pronostic. Comme décrit pour les techniques de PCR, les instruments de lecture de la fluorescence sont limités à la détection de 4 ou 5 variants par échantillon ce qui nécessite soit la multiplication des essais pour un même échantillon soit la limitation en terme de mutations détectées.

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- Le séquençage de Sanger et le séquençage à haut débit. Toutefois, ces méthodes nécessitent des équipements couteux ainsi que des temps de préparation et d'analyses relativement longs pouvant aller d'une dizaine d'heures à une dizaine de jours.

Il demeure ainsi nécessaire de mettre au point une technique d'identification de mutations ponctuelles qui soit sensible, rapide et qui permette d'identifier un plus grand nombre de mutations ponctuelles simultanément; c'est ce à quoi sont parvenus les Inventeurs en mettant au point une méthode permettant une détection rapide et efficace de séquences nucléotidiques spécifiques, susceptibles de porter une mutation ponctuelle et permettant une corrélation de cette détection à des formes mutées de microorganismes, telles que des bactéries résistantes à des agents anti-infectieux comme des antibiotiques.

Cette méthode permet à la fois l'amplification multiplexe de cibles et la détection spécifique de mutations ponctuelles au sein d'au moins neuf positions mutationnelles sur chaque séquence nucléotidique cible amplifiée (aussi appelé amplicon) à partir d'un seul et même échantillon d'acides nucléiques.

La présente méthode permet en particulier :

- de détecter la position mutée par la présence de sondes nucléotidiques complémentaires aux séquences nucléotidiques cibles mutées (sondes de capture immobilisées sur un support d'oligochromatographie) ;

- d'identifier spécifiquement la base nucléotidique mutée, et par conséquent l'acide aminé introduit par le codon muté dans le cas d'une mutation présente dans une séquence codante ;

- de détecter simultanément au moins neuf positions mutationnelles sur une seule séquence d'ADN;

- de présenter, pour chaque position mutationnelle, une sonde de capture correspondant au type sauvage et des sondes de capture correspondant aux mutations possibles (jusqu'à au moins 5 sondes mutées par position mutationnelle) ;

- de distinguer, dans un même échantillon, des populations microbiennes sauvages et mutées.

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Un autre avantage de la méthode de l'invention est sa rapidité, car elle peut être exécutée rapidement, en moins de 90 minutes, de préférence en moins de 60 minutes, voire dans des conditions préférées en moins de 30 minutes.

Ainsi, cette méthode représente un outil de diagnostic des polymorphismes (mono)nucléotidiques dans le domaine médical et plus particulièrement dans celui des maladies infectieuses et de la résistance aux antibiotiques.

Plus spécifiquement, la présente invention se rapporte à une méthode de détection et de différenciation par oligochromatographie d'au moins une mutation ponctuelle du génome d'un microorganisme, de préférence d'une bactérie, présent dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :

a- l'amplification d'au moins une séquence nucléotidique cible, ladite séquence nucléotidique cible étant susceptible de porter une mutation ponctuelle, c'est-à-dire de présenter, à une position donnée, la délétion d'un nucléotide, la substitution de ce nucléotide par un autre nucléotide ou encore l'insertion d'un nucléotide juste avant ou juste après ladite position ;

b- la détection parmi les séquences nucléotidiques cibles amplifiées obtenues à l'étape a) de séquences nucléotidiques sauvages ou porteuses d'une mutation ponctuelle par la mise en contact desdites séquences nucléotidiques cibles amplifiées avec plusieurs sondes de capture immobilisées sur un support, l'une de ces sondes de capture étant complémentaire et spécifique d'une partie de la séquence nucléotidique sauvage, chacune des autres étant complémentaires et spécifiques d'une partie de séquence nucléotidique comprenant au moins une mutation ponctuelle, et la détection des séquences nucléotidiques cibles amplifiées hybridées sur les sondes de capture.

L'échantillon biologique consiste en des acides nucléiques extraits d'échantillons biologiques (humains, animaux, plantes...) ; il peut notamment consister en un échantillon extrait d'un animal ou d'un individu tel qu'un mammifère, plus particulièrement d'un humain, ou d'une composition alimentaire.

L'échantillon biologique est préférentiellement lysé dans un tampon de lyse chimique ou par lyse thermique ou par lyse mécanique avant d'être extrait par des

BE2018/5469 méthodes d'extractions manuelles ou automatisées combinant en général deux à trois des étapes suivantes telles que la rétention ou séparation par affinité sur colonne chromatographique ou de billes magnétiques, de précipitation chimiques, de centrifugations ...

Les séquences nucléotidiques cibles peuvent être des séquences d'ADN, en particulier des séquences d'ADN simple brin ou double brin ou partiellement double brin, ainsi que des séquences d'ADNc obtenues par transcription inverse de séquences d'ARN. Ainsi, la méthode selon l'invention peut comprendre une étape optionnelle, préalable à l'étape a), correspondant à la transcription inverse de l'ARN contenu dans l'échantillon.

Dans un mode de réalisation, les séquences cibles amplifiées ont une taille comprise entre 50 et 200 bases, en particulier de 70 à 150 bases.

L'étape a) d'amplification peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier ; plus particulièrement, elle peut être réalisée par PCR ou par amplification isotherme, notamment par la méthode LAMP (Loop-Mediated Amplification) (Notomi et al., Nucleic acid Res., 2000, 28, e63) ou RPA (Recombinase Polymerase Amplification) (Piepenburg et al., PLOS Biol., 2006, 4(7), e204) ou NASBA (Nucleic Acid sequencebased amplification) (Guatelli et al., PNAS, 1990, 87(5), 1874-1878). Il est également possible d'utiliser la technique de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) (Schouten et al., Nucleic Acid Res., 2002, 30, e57). La MLPA est une variante de la PCR multiplexe et permet d'amplifier de multiples séquences nucléotidiques cibles avec une paire d'amorces universelles.

De préférence, l'étape d'amplification est réalisée par PCR.

Le mélange réactionnel pour l'amplification peut contenir plusieurs réactifs comme un tampon, des enzymes, des désoxynucléotides triphosphates (dNTPs), des additifs, et notamment plusieurs couples d'amorces pour l'amplification simultanée de séquences multiples dans un seul échantillon.

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Les deux étapes de transcription inverse et d’amplification par PCR peuvent être réalisées soit dans des tubes réactionnels fermés, insérés dans un instrument programmable qui chauffe et refroidit une chambre de réaction stationnaire (tel qu’un thermocycleur), soit dans un dispositif microfluidique à usage unique dans lequel le mélange réactionnel circule sur des zones statiques ayant chacune une température définie. En général, la transcription inverse est réalisée à une température unique avant que des cycles successifs de chauffe et de refroidissement permettent la multiplication (amplification) des cibles par réaction de PCR. Selon un mode de réalisation préféré, ces étapes sont réalisées en flux continu dans un système microfluidique tel que décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260 ou dans la demande de brevet EP 3 075 451.

Le choix des séquences nucléotidiques utilisées comme amorces pour l'amplification, de préférence par PCR, est fait en fonction de la ou des séquence(s) nucléotidique(s) cibles à amplifier et à détecter. La sélection de ces amorces est à la portée de l'homme de l'art, ainsi que leur marquage éventuel par des éléments comme des particules métalliques, de préférence des particules d'or, des colloïdes, des particules de polystyrène, des particules colorées, des particules (para)-magnétiques ou des éléments fluorescents ou tout autre marqueur permettant la détection.

La séquence nucléotidique cible amplifiée (amplicon) peut être marquée, directement ou indirectement, par différents marqueurs de détection, de préférence des fluorophores (ou éléments fluorescents) ou des nanoparticules comme l’or colloïdal. Le marquage de l’amplicon peut se faire (i) soit dès l’étape d’amplification par l’utilisation d’une amorce d’amplification marquée par un fluorophore (Figure 1A), (ii) soit après resuspension d’une sonde fluorescente ou d’une sonde couplée à un conjugué à l’or colloïdal (Figure 1B) déposée au niveau de la région d’application du support d’oligochromatographie, dont la séquence est différente de la séquence de la sonde de capture immobilisée et complémentaire d’une partie de la séquence nucléotidique cible amplifiée, (iii) soit par l'incorporation d'une amorce marquée par un haptène (par exemple DIG, DNP ou FAM) et la resuspension du récepteur de cet haptène, récepteur lui-même couplé à un marqueur de détection (Figure 1C).

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De préférence, le marqueur est un marqueur fluorescent, de préférence constitué de cyanine (Cy5) ou d'un marqueur ayant des propriétés fluorescentes similaires.

Des marqueurs présentant différents types de coloration ou différentes longueurs d'ondes de fluorescence peuvent être utilisés pour le marquage des séquences nucléotidiques cibles amplifiées de manière à faciliter leur détection simultanée ou consécutive sur le support, chaque couleur étant spécifique d'une séquence ou d'un groupe de séquences nucléotidiques cibles amplifiées et présentes initialement dans l'échantillon testé, leur détection colorimétrique peut ainsi être obtenue par des moyens connus de l'homme de l'art.

Le nombre de séquences nucléotidiques différentes pouvant être détectées par la méthode selon l'invention peut être adapté selon les besoins de l'application. La méthode de l'invention est modulable et permet d'adapter le nombre de sondes de capture présentes sur le support oligochromatographique selon le nombre de séquences nucléotidiques cibles à détecter.

Dans un mode de réalisation préféré, entre environ 2 séquences et environ 50 séquences nucléotidiques cibles, de préférence entre environ 4 séquences et environ 40 séquences nucléotidiques cibles sont amplifiées et détectées dans le même échantillon.

En particulier, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 séquences cibles sont amplifiées et détectées dans un même échantillon.

Pour la mise en œuvre de l'étape b) de détection, les sondes de capture, utilisées pour détecter par hybridation les séquences nucléotidiques cibles amplifiées à l'étape a), ont de préférence une longueur comprise entre 18 et 35 bases. Leur séquence est définie en fonction de la région dans laquelle la mutation ponctuelle est recherchée.

En particulier, les sondes de capture selon l'invention ont une taille de 18, 19, 20, 21,

22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 bases.

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Les sondes de capture peuvent être formées de bases nucléotidiques puriques, pyrimidiques, dégénérées, universelles, ou de type LNA (lock nucleic acid), ANA (altritol nucleic acid), HNA (hexitol nucleic acid), ... ou des sondes non-nucléiques de type PNA (peptide nucleic acid) mais pouvant s'apparier à des séquences nucléotidiques ou encore des combinaisons de ces différents types de bases.

Les sondes de capture peuvent être entièrement spécifiques d'une séquence cible ou bien contenir en plus de la séquence définie en fonction de la région dans laquelle la mutation ponctuelle est recherchée (par exemple en plus de leurs 18 à 35 bases) des espaceurs (« spacers ») de nature nucléotidiques ou chimiques. Selon un mode de réalisation particulier, l'espaceur de type nucléotidique est une séquence d'au moins 2 T (thymine), de préférence entre 5T et 8T, et l'espaceur de type chimique est une chaîne de type carbonée de minimum 3 carbones et de maximum 12 carbones.

Les sondes de capture, avec ou sans espaceur, sont immobilisées sur un support, de préférence sur une membrane d'oligochromatographie, permettant la capture ou l'hybridation des séquences nucléotidiques cibles amplifiées.

Dans l'invention, le terme oligochromatographie désigne une méthode de détection par écoulement d'acides nucléiques sur un support pour permettre leur hybridation à des sondes de capture spécifiques.

Les sondes de capture spécifiques à chaque mutation ponctuelle, débutant ou non par un espaceur, sont immobilisées sur le support, de préférence sur une membrane d'oligochromatographie sous forme de points (spottées) (Figure 2), notamment via des liaisons covalentes ou via une molécule porteuse pour faciliter l'accrochage sur le support et l'accessibilité de la sonde. La molécule porteuse s'ajoute à la séquence nucléotidique de la sonde, indépendamment de la présence de l'espaceur. Cette fixation peut être directe ou indirecte ; dans ce dernier cas, la sonde de capture est couplée à une première molécule, telle que la biotine, elle-même fixée sur la membrane par une seconde molécule protéique complémentaire, telle que l'avidine, la streptavidine ou des molécules dérivées.

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Le support peut être de différentes natures ; il peut d'agir d'une membrane, par exemple une membrane de nitrocellulose, de cellulose, d'acétate de cellulose, de nylon, de copolymère acrylique et nylon, ....

En particulier, le support peut être sous la forme d'une tigette. Une tigette selon l'invention peut être trempée dans un tube réactionnel ou disposée dans système microfluidique.

En particulier, une tigette selon l'invention a une longueur de 40 à 60 mm et une largueur de 4 à 10 mm. Plus particulièrement, une tigette selon l'invention a une longueur de 57 mm et une largeur de 5 mm.

Dans un mode de réalisation particulier, le support peut également être une puce de détection microfluidique en polymère de cyclo-oléfine.

La capture des séquences nucléotidiques cibles amplifiées est réalisée par l'hybridation entre les séquences nucléotidiques cibles amplifiées et les sondes nucléotidiques de capture immobilisées sur ledit support, de préférence sur une membrane d'oligochromatographie. Pour cela, est utilisé un tampon de migration ; ce tampon peut consister en une solution tamponnée, de préférence, il s'agit d'un tampon de bases phosphate-Tris supplémenté en sels (KCl et MgCl₂) et de saturants (hydrolysat de caséine et thréalose).

La température d'hybridation est adaptée à la séquence des sondes de capture, elle est généralement comprise entre 45°C et 80°C, de préférence, entre 50°C et 75°C.

Comme indiqué plus tôt, les différentes étapes de la méthode selon l'invention, c'està-dire, la transcription inverse optionnelle, l'amplification et la détection, peuvent être réalisées soit dans un dispositif microfluidique unique, soit dans des tubes réactionnels fermés nécessitant alors une étape de détection, séparée de l'amplification, de préférence sur le support oligochromatographique.

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Selon un mode de réalisation, la méthode est mise en œuvre dans un dispositif microfluidique, tel que décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260 et représenté à la Figure 3 ; ce dispositif microfluidique est inséré dans un équipement dédié permettant de gérer les températures de la transcription inverse, de la PCR et de la détection. Le flux du mélange réactionnel est conditionné par une pompe péristaltique et la lecture de la zone de détection est réalisée à l'aide d'une caméra. Un logiciel d'analyse des signaux observés permet de différencier les polymorphismes (mono)nucléotidiques.

Selon un autre mode de mise en œuvre de la méthode selon l'invention, elle est réalisée à l'aide de tubes réactionnels qui sont insérés dans un thermocycler permettant la réalisation de l'éventuelle RT-PCR et de la PCR. Les séquences nucléotidiques cibles amplifiées (amplicons), sont ensuite détectées après migration sur le support oligochromatographique, sur lequel sont immobilisées les sondes de capture. La lecture de la zone optique et l'analyse des signaux sont ensuite réalisées à l'aide d'un lecteur et d'un logiciel d'analyse.

Après l'étape de capture des séquences nucléiques cibles amplifiées, le support oligochromatographique est lavé par une solution tamponnée visant à éliminer les amorces marquées en excès et les hybridations aspécifiques. La solution tamponnée peut être introduite, soit au niveau du réservoir de tampon dans le dispositif microfluidique tel que décrit dans (Figure 3, référence 12), soit au fond d'un tube dans le cas d'une oligochromatographie verticale. La solution tamponnée de lavage peut consister en une solution tamponnée. De préférence, il s'agit d'un tampon de bases phosphate-Tris supplémenté en sels (KCl et MgCl₂) et de saturants (hydrolysat de caséine et thréalose)... Dans le cas où la solution tamponnée est introduite au niveau du réservoir de tampon du dispositif microfluidique (Figure 3, référence 12), la solution tamponnée est soumise aux températures d'abord de la transcription inverse, de la PCR, puis de l'hybridation au niveau du dispositif oligochromatographique. Dans le cas où la migration est réalisée dans un tube à la verticale, le tube contenant la solution de lavage tamponnée est chauffé à la température permettant l'hybridation entre les sondes nucléotidiques immobilisées sur le dispositif oligochromatographie et les séquences nucléotidiques amplifiées.

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Après lavage du support avec la solution tamponnée, par exemple pendant 5, 10, 15, 20 ou 30 minutes, ou quand l'équipement dédié établit le meilleur rapport signal/bruit de fond au niveau de chaque spot de sondes nucléotidiques, la zone de détection est exposée à la source lumineuse d'un équipement dédié ou d'un microscope afin de détecter et de quantifier le signal soit d'un marqueur fluorescent, soit d'un élément détectable dans les spectres de lumière visible telle que des billes d'or colloïdal. Le temps d'exposition est adapté à la méthode mise en œuvre, à titre d'exemple, il peut être compris entre 1 et 5000 ms, en particulier entre 50 ms et 1500 ms.

Les intensités des signaux sont mesurées au niveau de chaque position (« spot ») où est immobilisée une sonde nucléotidique de capture sur le dispositif oligochromatographique; il s'agit du signal spécifique, et autour de chaque position, il s'agit du bruit de fond.

Dans le cas de l'utilisation d'un équipement spécifique au dispositif microfluidique précité, cet équipement positionne une grille d'analyse permettant la quantification automatique du signal lumineux pour chaque spot et pour le signal de bruit de fond autour de chaque spot.

L'intensité du signal est plus élevé lorsque la sonde reconnaît sa séquence homologue dans l'amplicon. Si l'amplicon est de type sauvage, c'est la sonde sauvage qui sera plus lumineuse. Par exemple, si dans la séquence sauvage le nucléotide en position X est G alors c'est le spot avec la sonde portant un C complémentaire au G en position X qui sera plus lumineuse. Si l'amplicon est de type muté, c'est la sonde mutée qui sera plus lumineuse. Par exemple, si dans la séquence mutée le nucléotide en position X est remplacé par un T (G>T) alors c'est le spot avec la sonde portant un A à la position X qui sera plus lumineux. De préférence, un algorithme d'analyse facilite l'interprétation des résultats.

De préférence, la mutation ponctuelle à détecter est susceptible d'être présente dans le génome d'un microorganisme, en particulier d'une bactérie.

Selon un mode de réalisation préféré, la méthode est destinée à détecter une mutation ponctuelle dans le génome bactérien de Mycobacterium tuberculosis.

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Dans le cadre de la présente invention, on entend par génome bactérien, le chromosome bactérien et les plasmides bactériens naturels.

Une mutation ponctuelle représente une délétion, insertion ou substitution d'un nucléotide dans un codon du génome bactérien pouvant conduire à l'expression d'une protéine ayant un acide aminé modifié par rapport à la séquence sauvage de cette protéine. La séquence sauvage d'un gène ou d'une protéine est celle présente majoritairement dans la nature.

Plus spécifiquement, la méthode selon l'invention permet la détection d'une mutation ponctuelle associée à une résistance à un antibiotique. L'antibiotique peut être choisi parmi les familles suivantes : les béta-lactamines, les glycopeptides, les aminosides, les macrolides, les phénicolés, les cyclines, les acides fusidiques, les oxazolidinones, les quinolones, les sulfamides et triméthoprime, les produits nitrés (nitrofuranes et nitroimidazoles), les antituberculeux en particulier, il peut s'agir d'une mutation ponctuelle associée à une résistance chez Mycobacterium tuberculosis à la rifampicine, à l'isoniazide, à la pyrazinamide, à l'ethanbutol et aux fluoroquinolones ...

La résistance aux antibiotiques de première intention peut résulter d'une mutation ponctuelle localisée dans le gène : par exemple dans le gène rpoB pour la résistance à la rifampicine, ou dans le gène katG, inhA ou kasA pour la résistance à l'isoniazide ...

Dans le cas de la résistance à la rifampicine, la mutation ponctuelle est localisée dans le gène rpoB (gène de la sous-unité β de l'ARN polymérase). De manière non limitative, le tableau 1 présente une liste de sondes de capture ciblant différentes positions mutationnelles au sein du gène rpoB chez M. tuberculosis.

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	Position mutationnelle (Numérotation E. coli / M. tuberculosis')	Génotype	Acide aminé correspondant à la position mutationnelle	Séquence de la sonde (5’-3’) base substituée en gras	SEQ ID NO.
Amplicon 1	Position 511/430	sauvage	Leucine	GCACCAGCCAGCTGAGCC AATTCATGG	1
muté	Proline	GGCACCAGCCAGCCGAGC CAATTCATGG	2
Position 512/431	sauvage	Sérine	GCACCAGCCAGCTGAGCCA ATTCATGG	1
muté	Cystéine	GCACCAGCCAGCTGTGCCA ATTCATGG	3
Position 513/432	sauvage	Glutamine	GCACCAGCCAGCTGAGCCA ATTCATGG	1
muté	Leucine	ACCAGCCAGCTGAGCCTAT TCATGGACCA	4
Position 516/435	sauvage	Aspartate	AGCCAATTCATGGACCAGA ACAACCCGCT	5
muté	Tyrosine	CTGAGCCAATTCATGTACC AGAACAACCCGCT	6
muté	Valine	AGCCAATTCATGGTCCAGA ACAACCCGCT	7
muté	Alanine	CCAATTCATGGCCCAGAAC AACCCGCTG	8
Position 522/441	sauvage	Sérine	CCAGAACAACCCGCTGTCG GGGTTGACC	9
muté	Leucine	CCAGAACAACCCGCTGTTG GGGTTGACC	10
Position 526/445	sauvage	Histidine	GCTGTCGGGGTTGACCCAC AAGCGCC	11
muté	Aspartate	GCTGTCGGGGTTGACCGAC AAGCGCC	12
muté	Asparagine	CGCTGTCGGGGTTGACCAA CAAGCGCC	13
muté	Tyrosine	CGCTGTCGGGGTTGACCTA CAAGCGCC	14
muté	Leucine	CGCTGTCGGGGTTGACCCT CAAGCGCC	15
muté	Arginine	GCTGTCGGGGTTGACCCGC AAGCGCC	16
Position 529/448	sauvage	Arginine	GGGGTTGACCCACAAGCGC CGACTGT	17
Arginine	GGGTTGACCCACAAGCGCC GACTGTCGGC	18
muté	Glutamine	GGGGTTGACCCACAAGCGC CAACTGT	19
Glutamine	GGGTTGACCCACAAGCGCC AACTGTCGGC	20
Position 531/450	sauvage	Sérine	GCCGACTGTCGGCGCTGG GGCC	21
muté	Leucine	CGCCGACTGTTGGCGCTGG	22

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				GGC
muté	Tryptophane	CGCCGACTGTGGGCGCTGG GGC	23
muté	Glutamine	CGCCGACTGCAGGCGCTGG GGC	24
muté	Phénylalanine	CGCCGACTGTTCGCGCTGG GGCC	25
Position 533/452	sauvage	Leucine	ACTGTCGGCGCTGGGGCCC GG	26
muté	Proline	ACTGTCGGCGCCGGGGCCC G	27
Amplicon 2	Position 572/491	sauvage	Isoleucine	GGCCCAACATCGGTCTGAT CGGCTCG	28
muté	Phénylalanine	GGCCCAACATCGGTCTGTT CGGCTCG	29

Tableau 1 : Séquences des sondes ciblant les génotypes sauvages et mutés détectés au niveau du gène rpoB. La numérotation en italique est liée à la première numérotation des codons en fonction du génome d'Escherichia coli. La numérotation en gras est liée à la nouvelle nomenclature des codons, basée sur le génome de Mycobacterium tuberculosis.

Dans le cas de la résistance à l’isoniazide, la mutation ponctuelle est localisée dans le gène katG (heme-containing enzyme catalase-peroxidase), dans le gène kasA (3-oxoacylACP synthase) ou dans la région promotrice du gène inhA (gène de enoyl-acyl carrier protein reductase). De manière non limitative, le tableau 2 présente une liste de sondes de 10 capture ciblant différentes positions mutationnelles au sein des gènes katG et inhA chez M. tuberculosis.

	Position mutationnelle (Numérotation M. tuberculosis)	Génotype	Acide aminé correspondant à la position mutationnelle	Séquence de la sonde (5’-3’) base substituée en gras	Seq ID NO
Amplicon katG	Position 315	sauvage	Sérine	GTAAGGACGCGATCACCAGCGG CATCGAGG	30
muté	Thréonine	GTAAGGACGCGATCACCACCGGC ATCGAGG	31
muté	Thréonine	GTAAGGACGCGATCACCACAGG CATCGAGGT	32
muté	Asparagine	GTAAGGACGCGATCACCAACGG CATCGAGGT	33
muté	Isoleucine	GTAAGGACGCGATCACCATCGGC	34

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				ATCGAGGT
Amplicon inhA	Position -15	sauvage		GCGGCGAGACGATAGGTTGTCG GGGTG	35
muté		GCCGCGGCGAGATGATAGGTTG TCGGG	36
Position -16	sauvage		GCGGCGAGACGATAGGTTGTCG GGGTG	35
muté		CCGCGGCGAGGCGATAGGTTGT CG	37
Position -8	sauvage		GCGGCGAGACGATAGGTTGTCG GGGTG	35
muté		CGGCGAGACGATAGGCTGTCGG GGTG	38
muté		GCGGCGAGACGATAGGATGTCG GGGTG	39

Tableau 2 : Séquences des sondes ciblant les génotypes sauvages et mutés détectés au niveau des gènes katG et inhA.

La présente invention se rapporte également à un support oligochromatographique sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques. Le support oligochromatographique et les sondes de captures sont tels que définis précédemment.

Selon un mode de réalisation, ledit support comprend une sonde de capture complémentaire et spécifique de la séquence sauvage de la région cible et au moins une sonde de capture complémentaire et spécifique de la séquence mutée de la région cible.

La présente invention se rapporte encore à un dispositif microfluidique comprenant le support oligochromatographique selon l'invention. De préférence, le dispositif microfluidique est tel que décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260.

La présente invention se rapporte enfin à une trousse de réactifs comprenant au moins des amorces d'amplification d'une région cible et le support oligochromatographique selon l'invention.

Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, les exemples ne sont présentés qu'à titre illustratif et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention.

BE2018/5469 LEGENDE DES FIGURES

Figure 1 : Représentation schématique de l'hybridation de l'amplicon et des systèmes de marquage de l'amplicon.

Figure 2 : Représentation schématique de sondes de captures immobilisées sur le support oligochromatographique : damier de 40 spots et exemple de 4 sondes de capture dont celle ayant le génotype sauvage ; la sonde 1 a une mutation en position 5 (G > C), la sonde 2 a une mutation en position 5 (G > T) et la sonde 3 a une mutation en position 4 (A > G).

Figure 3 : Dispositif microfluidique décrit dans le Brevet Européen EP 2 870 260.

1. chambre d'amplification, 2. chambre de détection, 3. canal, 4. support oligochromatographique (tigette), 5. partie proximale de la tigette, 6. partie distale de la tigette, 7. région d'application, 8. région de détection, 9. région absorbante, 10. communication fluidique, 11. réservoir de mélange réactionnel, 12. réservoir de tampon, 13. tuyau de contact avec le système de pompage, 14. tuyau de liaison.

Figure 4 : Histogramme illustrant la détection d'une souche de Mycobacterium tuberculosis mutée en position 526 et sauvage pour les positions 511-512-513 ; 516 ; 522 ;

529 ; 531 ; 533 au niveau du gène rpoB.

Figure 5 : Histogramme illustrant la détection d'une souche de Mycobacterium tuberculosis mutée en position 315 au niveau du gène katG.

BE2018/5469 EXEMPLES

Exemple 1 - Détection de souches de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou résistantes à la rifampicine

Il est connu que la résistance à la rifampicine est due à un ou des polymorphismes (mono)nucléotidiques dans le gène rpoB (gène de la sous-unité β de l'ARN polymérase, cible de la rifampicine chez Mycobacterium tuberculosis).

Deux séquences cibles, respectivement de 113 et 119 nucléotides, ont donc été sélectionnées au niveau du gène rpoB (Tableau 3).

	Séquence nucléotidique (5'-3')	Seq ID NO
Amplicon 1	AGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCA GAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGG CGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACG	40
Amplicon 2	GCACCCGTCGCACTACGGCCGGATGTGCCCGATCGAAACCCCT GAGGGGCCCAACATCGGTCTGATCGGCTCGCTGTCGGTGTACGC GCGGGTCAACCCGTTCGGGTTCATCGAAACGC	41

Tableau 3. Séquences cibles du gène rpoB amplifiées par PCR. Les séquences des amorces sont indiquées en gras.

Sur ces séquences, 10 positions mutationnelles montrant des polymorphismes (mono)nucléotidiques impliqués dans la résistance à la rifampicine ont été ciblées. L'amplicon_1 comporte 9 positions mutationnelles et l'amplicon_2 comporte une seule position mutationnelle. De 2 à 6 variants de séquences sont détectés pour chacune des positions (Tableau 1).

Dans cette application, les régions cibles du gène rpoB de Mycobacterium tuberculosis sont amplifiées par PCR, suivie d'une détection sur support oligochromatographique, dans le dispositif microfluidique tel que décrit dans la demande de brevet EP 3075451.

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Remplissage du dispositif : le réservoir de tampon (12) est rempli par un volume de solution de lavage tamponnée pouvant aller de 50 à 80 μL. Le réservoir de mélange réactionnel (11) est rempli par un volume de 10 à 20 μL de mélange réactionnel contenant l'échantillon et les réactifs d'amplification, et, le cas échéant, de transcription inverse.

Fermeture du dispositif : le dispositif microfluidique est fermé hermétiquement par une tête de pompe (Demande de brevet EP 3075451).

Amplification et détection : le dispositif est inséré dans un équipement dédié approprié permettant la réalisation des étapes de transcription inverse, d'amplification par PCR, d'hybridation des produits d'amplification aux sondes immobilisées sur le dispositif d'oligochromatographie et de lavage de la zone de lecture par la solution de lavage tamponnée.

Le dispositif est géré par un équipement dédié permettant la gestion du flux du liquide dans le canal du dispositif microfluidique via un système de pompage actif et la gestion de la température d'au moins deux, et jusqu'à 5, zones de chauffe sous le réservoir de mélange réactionnel, la chambre d'amplification et le canal PCR et d'une zone de chauffe sous la tigette de détection.

Les résultats sont interprétés par le logiciel d'analyse de l'équipement dédié. L'identification du caractère sauvage ou muté de chaque position d'intérêt est réalisée par l'analyse des valeurs de fluorescence entre sondes s'hybridant aux mêmes positions.

Par exemple, pour la position 526/445 du gène rpoB, 6 acides aminés ont été identifiés dans des variants naturels: l'histidine (H) dans la séquence sauvage, l'aspartate (D), l'asparagine (N), la tyrosine (Y), la leucine (L) ou l'arginine (R) dans des variants mutés.

Chacun de ces changements d'acide aminé est dû à une mutation dans le codon correspondant.

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Six sondes couvrant ce codon ont été immobilisées sur le damier de la tigette oligochromatographique, chaque sonde étant spécifique à un des codons (sauvage ou muté, Tableau 1).

Le produit d'amplification s'hybride à chacune de ces 6 sondes et l'intensité du signal est mesurée. Pour chaque sonde, le signal est rapporté à la moyenne des signaux des 5 autres sondes. Les rapports de signaux ainsi calculés permettent d'identifier le génotype à la position considérée : la sonde pour lequel un rapport de signaux supérieur à la valeur cut-off pré-déterminée (par exemple la valeur 2) est obtenu correspond à la séquence présente dans l'échantillon.

Dans le cas des positions 511-512-513, l'utilisation d'une sonde de type « sauvage » commune pour ces 3 positions permet de pallier au problème de proximité des séquences, alors que les sondes correspondant aux génotypes mutés sont spécifiques de chaque position, respectivement en position 577/430, 572/431, 575/432.

Exemple d'une souche Mycobacterium tuberculosis, portant la mutation H526Y :

Dans cet exemple, le génotype est sauvage pour les positions 511-512-513-522-529531 et 533 (identifié par un ratio supérieur à 2, barres d'histogramme gris foncé) et le génotype est muté H526Y (barre noire) pour la position 526 (nomenclature d'E. coli) (Figure 4).

Les barres gris clair représentent le ratio obtenu pour chacune des sondes qui correspondent au génotype sauvage H526 et aux mutant non détectés. (Figure 4). Le changement d'acide aminé est identifié. L'histidine en position 526 est remplacée par une tyrosine; les acides aminés aux autres positions sont de type sauvage.

Cette méthode permet également de détecter des mélanges de souches ou de variants.

BE2018/5469 Exemple 2 - Détection de souches de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou résistantes à l’isionazide

Chez Mycobacterium tuberculosis, il est connu que les résistances à l'isonazide sont majoritairement dues à un ou des polymorphismes (mono)nucléotidiques dans le gène katG ou dans la région promotrice du gène inhA.

Une séquences cible de 85 nucléotides a donc été sélectionnée au niveau du gène katG et une séquence de 123 nucléotides a été sélectionnée au niveau du gène inhA (Tableau 4).

	Séquence nucléotidique (5'-3')	Seq ID NO
Amplicon katG	GGCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGG ACGCGATCACCAGCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCC	42
Amplicon inhA	GTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAG ACGATAGGTTGTCGGGGTGACTGCCACAGCCACTGAAGGGGCCA AACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCG	43

Tableau 4. Séquences cibles des gènes katG et inhA amplifiées par PCR. Les séquences des amorces sont indiquées en gras.

Une position montrant des polymorphismes (mono)nucléotidiques impliqués dans la résistance l'isoniazide a été ciblée dans la séquence cible du gène katG, tandis que 3 positions ont été ciblées dans la séquence promotrice du gène inhA. Entre 2 à 5 variants de séquences sont détectés pour chacune des positions (Tableau 2).

Dans le cas du gène inhA, les différentes positions mutationnelles se retrouvent au niveau de la région promotrice du gène. Une mutation à ce niveau n'induit donc pas la formation d'un nouvel acide aminé mais la surexpression du gène qui va entrainer une résistance à l'isoniazide.

Comme dans l'exemple précédent, les régions cibles du gène katG et de la région promotrice du gène inhA de Mycobacterium tuberculosis sont amplifiées séparément par

BE2018/5469 PCR, suivie d'une détection sur support oligochromatographique dans le dispositif microfluidique, comme décrit dans l'exemple précédent.

Exemple d'une souche Mycobacterium tuberculosis , portant la mutation S315N :

Par exemple, dans le cas du gène katG, la position mutationnelle 315 peut présenter 4 acides aminés différents : la serine (S) qui correspond à la séquence sauvage, la thréonine (T), retrouvée dans deux des séquences mutées, l'asparagine (N) et l'isoleucine (I). Chacun de ces changements d'acide aminé est dû à une mutation dans le codon correspondant. La synthèse de la thréonine peut être induite par deux polymorphismes nucléotidiques différents.

Cinq sondes couvrant ce codon ont été immobilisées sur le damier de la tigette oligochromatographique, chaque sonde étant spécifique à un des codons (sauvage ou muté, Tableau 2).

Le produit d'amplification s'hybride à chacune de ces 5 sondes et l'intensité du signal est mesurée. Pour chaque sonde, le signal est rapporté à la moyenne des signaux des 4 autres sondes. Les rapports de signaux ainsi calculés permettent d'identifier le génotype à la position considérée : la sonde pour lequel un rapport de signaux supérieur à un cut-off prédéterminé est obtenu correspond à la séquence présente dans l'échantillon.

Dans cet exemple, le génotype pour la position 315 est muté S315N (nomenclature d'E. coli). Les barres grises claires représentent le ratio obtenu pour chacune des sondes qui correspondent aux génotypes sauvages et mutant non détectés. (Figure 5). Le changement d'acide aminé est identifié. La sérine est remplacée par une asparagine.

Claims

BE2018/5469 REVENDICATIONS

1. Méthode de détection et de différenciation par oligochromatographie d'au moins une mutation ponctuelle du génome d'un microorganisme, de préférence d'une bactérie, présent dans un échantillon biologique comprenant les étapes suivantes :

a- l'amplification d'au moins une séquence nucléotidique cible ; ladite séquence nucléotidique cible étant susceptible de porter une mutation ponctuelle, c'est-à-dire de présenter, à une position donnée, la délétion d'un nucléotide, la substitution de ce nucléotide par un autre nucléotide ou encore l'insertion d'un nucléotide juste avant ou juste après ladite position ;

b- la détection parmi les séquences nucléotidiques cibles amplifiées obtenues à l'étape a) de séquences nucléotidiques porteuses d'une mutation ponctuelle par la mise en contact desdites séquences nucléotidiques cibles amplifiées avec plusieurs sondes de capture immobilisées sur un support, l'une de ces sondes de capture étant complémentaire et spécifique d'une partie de la séquence nucléotidique sauvage, chacune des autres étant complémentaires et spécifiques d'une partie de séquence nucléotidique comprenant au moins une mutation ponctuelle, et la détection des séquences nucléotidiques cibles amplifiées hybridées sur les sondes de capture.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape préalable de transcription inverse de l'ARN contenu dans l'échantillon.
3. Méthode selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que l'amplification est réalisée par PCR ou par amplification isotherme.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la séquence nucléotidique cible amplifiée est marquée, directement ou indirectement, par un marqueur.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les séquences de capture contiennent de 18 à 35 bases.

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6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les séquences de capture contiennent un espaceur.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la mise en contact des séquences nucléotidiques cibles amplifiées avec les sondes de captures immobilisées sur le support oligochromatographique est réalisée par hybridation desdites sondes nucléotidiques cibles amplifiées suivie d'un lavage à l'aide d'un tampon de migration.
8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'hybridation est réalisée à une température comprise entre 45°C et 80°C, de préférence, entre 50°C et 75°C.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la mutation ponctuelle à détecter est présente dans le génome bactérien de Mycobacterium tuberculosis.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite mutation ponctuelle est associée à :

- une résistance à la rifampicine et est localisée dans le gène rpoB, ou

- à la résistance à l'isoniazide respectivement localisée dans le gène katG et le promoteur du gène inhA.
11. Méthode selon la revendication 10, caractérisée en ce que les sondes de capture sont choisies parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 et 39.
12. Support oligochromatographique sur lequel sont immobilisées des sondes de capture choisies parmi les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 et 39.

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13. Dispositif microfluidique comprenant le support oligochromatographique selon la revendication 12.
14. Trousse de réactifs comprenant au moins des amorces d’amplification d'une

5 région cible d’un génome bactérien et le support oligochromatographique selon la revendication 12.