BE1025903A1 - Overspraakcorrectie bij multiplexing-analyse van biologisch monster - Google Patents

Overspraakcorrectie bij multiplexing-analyse van biologisch monster Download PDF

Info

Publication number
BE1025903A1
BE1025903A1 BE20155687A BE201505687A BE1025903A1 BE 1025903 A1 BE1025903 A1 BE 1025903A1 BE 20155687 A BE20155687 A BE 20155687A BE 201505687 A BE201505687 A BE 201505687A BE 1025903 A1 BE1025903 A1 BE 1025903A1
Authority
BE
Belgium
Prior art keywords
fluorescent
fluorescence
microparticles
microparticle
series
Prior art date
Application number
BE20155687A
Other languages
English (en)
Other versions
BE1025903B1 (nl
Inventor
David Rebetez
David Bernasconi
Didier Falconnet
Matthieu Gaillard
José Gil
Original Assignee
Mycartis Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mycartis Nv filed Critical Mycartis Nv
Publication of BE1025903A1 publication Critical patent/BE1025903A1/nl
Application granted granted Critical
Publication of BE1025903B1 publication Critical patent/BE1025903B1/nl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/44—Raman spectrometry; Scattering spectrometry ; Fluorescence spectrometry
    • G01J3/4406—Fluorescence spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/05—Flow-through cuvettes
    • G01N2021/058—Flat flow cell
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Methode ter bepaling van fluorescentiewaarden {ϕispe} iE (1,2,…,1) van een reeks I van fluorescerende microdeeltjes {μPi} iE (1,2,…,1) van een gemultiplexeerde analyse, waarbij genoemde microdeeltjes in een monolaagopstelling zijn, welke methode omvat: - verkrijgen van een digitaal fluorescentiebeeld van de reeks fluorescerende microdeeltjes {μPi} iE (1,2,…,1) ; en - per fluorescerend microdeeltje μPi in de reeks fluorescerende microdeeltjes {μPi} iE (1,2,…,1) berekenen van een fluorescentiewaarde ϕimeas, uitsluitend op basis van pixels van het met genoemd fluorescerend microdeeltje μPi corresponderende, verkregen beeld. De methode omvat het berekenen van de fluorescentiewaarde ϕispe van genoemd fluorescerend microdeeltje μPi door het corrigeren van de eerste fluorescentie ϕimeas daarvan door middel van een overspraakfluorescentiebijdrage ϕicross in genoemde eerste fluorescentie ϕimeas vanuit andere fluorescerende microdeeltjes {μPj} j‡ i in de reeks fluorescerende microdeeltjes {μPi} iE (1,2,…,1).

Description

TERREIN VAN DE UITVINDING
De uitvinding heeft betrekking op biologische multiplexing-analyse op basis van detectie van meerdere biomarkers in een biologisch monster, in het bijzonder bij de diagnose van complexe ziekten.
ACHTERGROND
De diagnose van complexe ziekten en de reactie op behandelingen hangen vaak samen met meerdere biomoleculen in plaats van met één identificeerbare biomarker. In tegenstelling tot conventionele technieken die één analyt tegelijk meten, kunnen multiplexing-technologieën met gebruikmaking van identieke omstandigheden binnen één assay tientallen tot duizenden verschillende biomoleculen, bijvoorbeeld eiwitten of nucleïnezuren, uit één biologisch monster meten. In principe worden verschillende typen afvangmoleculen, bijvoorbeeld antilichamen, doeleiwitten, peptiden of nucleïnezuren, in een met het monster gevuld assay-toestel gedaan, waarbij elk type afvangmolecule is ontworpen om met de in het monster te zoeken biomarker een bepaald fluorescerend gelabeld complex te vormen (gewoonlijk “de fluorescerend gelabelde doelbiomarker” genoemd). Eén belangrijke kwestie bij multiplexing-technieken is om tijdens de enkelvoudige assay de fluorescentie te bepalen die afkomstig is van één type fluorescerend gelabelde, aan hun complementaire afvangmoleculen gebonden biomarkers (hierna “individuele fluorescentie”).
Er zijn uiteenlopende multiplexing-technologieën, die elk gewoonlijk worden geclassificeerd volgens hun specifieke coderingsstrategie voor deze kwestie. De meest populaire, in de handel verkrijgbare multiplexing-technologieën zijn op array-basis en op bead-basis. Bij technologieën op array-basis worden afvangmoleculen op een paneel in een bekende opstelling gebonden onder vorming van een 2D-array van “capture spots”, die elk speciaal zijn bestemd voor het afvangen van een bepaalde biomarker. Dergelijke vlakke arrays zijn dus aangewezen op x-ycoördinaten van de capture spots om de fluorescentie van elke biomarker te bepalen. Technologieën op bead-basis berusten op spectrumcodering, waarbij kleur en intensiteit onderscheid van elke bead-populatie mogelijk maken. Zij hebben zich als zeer flexibel en schaalbaar bewezen. De thans verkrijgbare systemen op bead-basis zijn echter ontworpen voor kosteneffectief ladingsgewijs gebruik, waarbij het op voldoende monsters moeten wachten om de plaat te vullen de doorlooptijd bij routinematige klinische proeven kan verlengen. Voorts hebben beide technologieën te lijden van trage bindingskinetiek aangezien zij voornamelijk diffusiegedreven zijn. Dit levert gewoonlijk lange monsterincubatietijden op, zelfs wanneer
2015/5687 agitatie wordt gebruikt om het proces te versnellen. Bovendien kan een , . , BE2015/5687 door diffusie beperkt bindingsregime tevens bijdragen aan gerapporteerde sterke variaties binnen en tussen assays.
Om iets aan bovenstaande beperkingen te doen, is een multiplexing-technologie op basis van gecodeerde microdeeltjes en microfluïdumkanalen ontworpen. Deze technologie wordt bijvoorbeeld beschreven in Rapid, Sensitive and Real-Time Multiplexing Platform for the Analysis of Protein and Nucleic-Acid Biomarkers, Didier Falconnet et al., Anal. Chem. 2015, 87, 1582-1589 en de onderbouwingsinformatie daarbij, die van de website http://pubs.acs.org kan worden gedownload. Eén toestel dat deze technologie belichaamt, wordt onder de referentienaam EvaluationTM verkocht door MyCartis, Gent, BE. De belangrijkste componenten van deze technologie (microdeeltjes die van een code zijn voorzien, microfluïdumkanaalpatroon en instrumentatie) worden thans kort beschreven aan de hand van figuren 1.
Onder verwijzing naar figuur 1A zijn de gecodeerde microdeeltjes 10, of dragers, schijfvormig, 40 μm in diameter en 10 μm hoog en geproduceerd uit siliciumschijven, bijvoorbeeld met gebruikmaking van MEMS-fabricagetechnologie. De rand van elk microdeeltje 10 is ondubbelzinnig gecodeerd met behulp van een 10-cijferige binaire code Idm 12, of identificatiecode, die wordt gevormd door de aanwezigheid of het ontbreken van gaatjes 14. Afvangmoleculen worden aan weerszijden van de microdeeltjes 10 gebonden, waarbij laatstgenoemde aldus als vaste drager fungeren voor een veelheid van mogelijke afvangmoleculen, waaronder antilichamen, doeleiwitten, peptiden, nucleïnezuren of andere biomoleculen. Meer bepaald, wordt één type afvangmoleculen (dat wil zeggen, afvangmoleculen die speciaal zijn bestemd voor het afvangen van een bepaalde biomarker) vastgemaakt aan microdeeltjes met dezelfde code Idm.
Onder verwijzing naar figuur 1B heeft de patroon 20, of assay-plaat, een veelheid van microschaalkanalen 22 die mengsels gecodeerde microdeeltjes kunnen herbergen en die het aldus mogelijk maken om meerdere monsters tegelijk of na elkaar (dat wil zeggen, op verschillende datums) te verwerken. Elk kanaal 22 is gemaakt van transparante wanden en verbindt een inlaatputje 24 met een uitlaatputje 26, die drukverhoging van het kanaal 22 boven atmosferische druk mogelijk maken, wat microfluïdumbediening van het kanaal mogelijk maakt. De kanalen 22 zijn ten minste 5 maal, bijvoorbeeld 10 maal, breder dan de diameter van de microdeeltjes en omvatten elk onder meer een filterstructuur om de microdeeltjes in een detectiezone van het kanaal in te sluiten. De hoogte van de kanalen is geoptimaliseerd voor efficiënt laden en tegelen van microdeeltjes. De ondiepe kanaalhoogte voorkomt dat microdeeltjes elkaar overlappen, zodat microdeeltjes in monolaagopstelling in het kanaal worden opgesteld met één van hun zijden volledig beschikbaar voor beeldvormingsdoeleinden.
2015/5687
BE Deze monolaagopstelling van microdeeltjes in het kanaal maakt aldus het gebruik mogelijk van hoge-resolutieafbeelding voor zowel decodering als fluorescentiekwantificering. Elk kanaal kan met tot wel duizenden microdeeltjes worden geladen, waarbij een volledig geladen kanaal multiplexing van meer dan honderd verschillende biomarkers met tientallen microdeeltjes voor elke te zoeken biomarker mogelijk maakt. Ten behoeve van multiplexing-analyse omvat een in een kanaal geladen microdeeltjesmengsel meerdere microdeeltjes die een identieke code gemeen hebben, waardoor een populatie wordt gevormd die meetredundantie voor statistische betrouwbaarheid verschaft.
De instrumentatie heeft ten doel het verkrijgen van beelden van het kanaal, het regelen van de fluïdumactuatie en de temperatuur in de kanalen en het analyseren van verkregen beelden. Meer bepaald omvat de instrumentatie:
- een optisch systeem 28, met bijvoorbeeld een objectief met lange werkafstand en een zeer gevoelige CMOS-camera om helderveld- en epifluorescentiebeelden (bijvoorbeeld excitatie bij 640 nm, bijvoorbeeld met gebruikmaking van een laser) van de detectiezone van de patroon te krijgen. Het objectief is gemonteerd op een geautomatiseerde XYZplatform voor het scannen van elk kanaal tijdens de assay voor uitlezing in real-time of aan het eind;
- verlichtingssysteem (niet afgebeeld) voor uniforme belichting van de detectiezone teneinde voor decoderingsdoeleinden een hoog-contrastbeeld van de microdeeltjes tegen een heldere achtergrond te krijgen;
- een regeleenheid (niet afgebeeld) voor het regelen van de microfluïdumbediening van de patroon (in-/uitlaatputjes, drukverhoging, temperatuur...), alsmede de bediening van het optische systeem;
- een rekeneenheid 30 (bijvoorbeeld een personal computer, een server of meer in het algemeen berekeningshardware die is geconfigureerd voor het ontvangen van data uit de camera en het verwerken van de data volgens instructies die in een geheugen zijn opgeslagen .), mogelijk als onderdeel van de regeleenheid of onafhankelijk daarvan, gekoppeld aan de camera om daaruit beelden te ontvangen en een multiplexinganalyseberekeningsprogramma uit te voeren om de biomarkers in het onderzochte monster automatisch op basis van de door het optische systeem verkregen fluorescerende en helderlicht-beelden te kwantificeren.
Onder verwijzing naar figuren 2 bestaat een in vorengenoemde multiplexing-technologie vervatte multiplex-analyse aldus uit:
- produceren van een suspensiemengsel 32 van microdeeltjes, waarbij de microdeeltjes 10 worden gekozen op basis van de in een onderzocht monster te zoeken biomarkers, en laden van het vloeibare mengsel 32 van microdeeltjes in de patroon 20 teneinde één of meer
2015/5687
BE kanalen 22 zodanig te vullen dat voor optimale uitlezing een vlakke opstelling van de microdeeltjes wordt verschaft (figuur 2A);
- in de kanalen 22 laden van het beproefde vloeibare monster samen met, indien nodig, reagentia (bijvoorbeeld voor sandwich-reacties), waardoor incubatie en/of bindingsreactie in microfluïdummilieu tussen de biomarkers 34 in het onderzochte monster en de aan de microdeeltjes 10 gebonden afvangmoleculen 36 in gang wordt gezet (figuur 2B);
- het verkrijgen van beelden van de detectiezone van de kanalen 22 (bijvoorbeeld in realtime of één maal aan het eind van het procédé). Terwijl de microdeeltjes 10 dankzij drukverhoging en filterelementen in de kanalen 22 zijn geïmmobiliseerd, bestaat een beeldopnamecyclus bij voorkeur uit het achtereenvolgens verkrijgen van een helderveldbeeld 38 en een fluorescentiebeeld 40 of omgekeerd, zodat de positie van elk microdeeltje in beide beelden dezelfde is (figuur 2C);
- per kanaal 22 en per paar van helderveld- en fluorescentiebeeld 38, 40 van het kanaal:
o analyseren van het helderveld-beeld 38 om locatie X, van elk microdeeltje 10 in de kanalen 22 te identificeren en de code ldm 12 van elk microdeeltje 10 te lezen;
o analyseren van het fluorescentiebeeld 40 om de fluorescentie cpmeas van elk microdeeltje 10 in het fluorescerende beeld te bepalen (bijvoorbeeld corresponderend met het maximum van een kerneldichtheid gepast op de pixels van het beelddeel dat met het centrale deel van het microdeeltje correspondeert);
- per kanaal 22 en per microdeeltjespopulatie 10 die dezelfde code Idm in het kanaal gemeen heeft:
o berekenen van een samengetelde waarde van fluorescentie φρορ voor de populatie, bijvoorbeeld: toepassen van een Tukey’s boxplot-filter op fluorescenties cpmeas om abnormale fluorescentiewaarden cpmeas eruit te filteren en daarna berekenen van de samengetelde waarde als het rekenkundige gemiddelde van de resterende fluorescenties cpmeas (figuur 2D);
o bepalen van de biomarkerconcentratie [h] in het onderzochte monster (of “titrering”) op basis van de samengetelde waarde φρορ met gebruikmaking van een opgeslagen relatie fluorescentie versus concentratie (bijvoorbeeld tabel, analytisch wiskundig model, ...) die vooraf voor de biomarker is bepaald en die in een digitaal geheugen van de rekeneenheid 30 is opgeslagen (figuur 2E).
De berekende concentraties worden vervolgens voor de gebruiker afgebeeld en/of opgeslagen in een digitaal geheugen (bijvoorbeeld dat van de rekeneenheid).
Deze multiplexing-technologie maakt (i) korte assay-tijden en hoge reproduceerbaarheid mogelijk dankzij een door de reactie begrensd bindingsregime, (ii) dynamische beheersing van assay-omstandigheden en real-time bindingsbewaking die optimalisering van meerdere
2015/5687 parameters binnen één assay-ronde mogelijk maakt, (iii) verenigbaarheid met verschillenBdEe2015/5687 immunoassay-formats, zoals gelijktijdige co-flowing van de monsters en detectie van antilichamen en daarmee vereenvoudiging van werkstromen, (iv) analytkwantificering op basis van initiële bindingssnelheden die leidt tot verhoogd dynamisch bereik van het systeem en (v) hoge gevoeligheid via versterkte fluorescentieverzameling, (vi) desgewenst de mogelijkheid om een monoplex-assay te doen (dat wil zeggen, verschaffen van slechts één type afvangmoleculen voor kwantitatieve meting van een bepaalde biomarker).
In sommige gevallen ziet men echter divergentie tussen een biomarkerconcentratie [b] die uit multiplex-assay-gegevens is berekend en de uit monoplex-assay-gegevens berekende biomarkerconcentratie [b],
SAMENVATTING VAN DE UITVINDING
Eén doel van de uitvinding is om het berekenen voor te stellen van fluorescenties van microdeeltjes bij een multiplexing-analyse die het verschil tussen multiplex- en monoplexassays corrigeert,
Hiertoe is één doel van de uitvinding een methode ter bepaling van fluorescenties { <p-pe} ie{i,2,van een reeks I van fluorescerende microdeeltjes {pPj ie(i,2,...,/} van een multiplexing-analyse, waarbij genoemde microdeeltjes in monolaagopstelling zijn, welke methode omvat:
- verkrijgen van een digitaal fluorescentiebeeld van de reeks fluorescerende microdeeltjes ίμ^) ie{i,2.....n; en
- per fluorescerend microdeeltje μΡι in de reeks fluorescerende microdeeltjes {μΡι} ie(i,2,...,/} berekenen van een eerste fluorescentie φ''’''’, uitsluitend op basis van pixels van het met genoemd fluorescerend microdeeltje μΙ} corresponderende, verkregen beeld,
Volgens de uitvinding omvat de methode het berekenen van de fluorescentie (p^pe van genoemd fluorescerend microdeeltje μΡ[ door het corrigeren van de eerste fluorescentie daarvan door middel van een overspraakfluorescentiebijdrage (pfoss in genoemde eerste fluorescentie ^meas vanuit andere fluorescerende microdeeltjes {pPj} j^i in de reeks fluorescerende microdeeltjes {^PJ ie{1,2...../},
Met andere woorden, het deel van het met een microdeeltje μΡ] corresponderende, verkregen beeld correspondeert niet strikt met het door genoemd microdeeltje geproduceerde licht, Elk microdeeltje produceert licht dat zich verstrooit en aldus op het licht van andere microdeeltjes wordt gesuperponeerd, Een parallel trekkend met beeldvorming, is tussen de microdeeltjes
2015/5687 sprake van een “overspraakeffect”. Het overspraakeffect kan in het bijzonder worden' waargenomen wanneer ten minste twee populaties microdeeltjes met verschillende fluorescenties (bijvoorbeeld een donkere en een heldere populatie) met elkaar worden gemengd. Bijvoorbeeld, als het fluorescentieverschil tussen de twee populaties groot genoeg is, wordt een fluorescentietoename waargenomen op sommige microdeeltjes van de donkerder populaties die zich in de buurt van microdeeltjes van de helderder populatie bevinden. Overspraak kan ook in een monoplex-assay optreden.
Volgens één uitvoeringsvorm omvat de berekening van de fluorescentiewaarde <pt spe:
- per fluorescerend microdeeltje μΡι in de reeks fluorescerende microdeeltjes {μΡι} mi,2, berekenen van een positie X, in het digitale fluorescentiebeeld;
- modelleren van de eerste fluorescentiewaarde als functie van de posities {XïJml en de fluorescentiewaarden van alle fluorescerende microdeeltjes {pPi} mi,2.....η, en
- berekenen van de inverse van genoemde functie teneinde de fluorescentiewaarde φ·ρβ te verkrijgen.
Volgens één uitvoeringsvorm wordt de berekening van fluorescentie <pfpe uitgevoerd op basis van de volgende vergelijking:
waarbij (pjPe de fluorescentie van het jde fluorescerende microdeeltje μΡ] is en a^- een unitaire overspraakfluorescentiebijdrage in de eerste fluorescentie (p'.1,eas van het jde fluorescerende microdeeltje μΡ] is, waarbij de unitaire overspraakfluorescentiebijdrage uitsluitend afhangt van de afstand tussen de fluorescerende microdeeltjes μ/’, en μ/3·.
Met andere woorden, voor een gegeven microdeeltje vermindert het door andere microdeeltjes geproduceerde licht niet tot een uniforme achtergrondruis die men kan meten (bijvoorbeeld door het gemiddelde van de helderheid van het beeld te berekenen) en van de fluorescentie van het microdeeltje kan aftrekken. De uitvinders hebben voorts opgemerkt dat verstoring vanuit andere microdeeltjes variabel is, afhankelijk van de specifieke opstelling van de microdeeltjes. Om het overspraakeffect op een microdeeltje te corrigeren, berekent de uitvinding aldus de bijdrage van elk ander microdeeltje. Elke genoemde bijdrage in aanmerking nemend, resulteert dit in multiplex-meting die vergelijkbaar is met monoplex-meting, zelfs bij hoogcontrastomstandigheden onder microdeeltjes.
2015/5687
De uitvinders hebben bovendien opgemerkt dat het overspraakeffect door de som van isotroBpEe2015/5687 vervalprofielen kan worden gemodelleerd. Dit houdt in dat men een microdeeltje onafhankelijk van het andere kan beschouwen om de bijdrage ervan te berekenen en dat de door een microdeeltje verstrooide fluorescentie uitsluitend afhangt van de afstand van het microdeeltje en de fluorescentie op het microdeeltje. De unitaire overspraakfluorescentiebijdrage a^· correspondeert bijvoorbeeld met de genormaliseerde fluorescentie die een microdeeltje genereert en wordt berekend op basis van bijvoorbeeld door de fabrikant van een multiplex analysetoestel tevoren bepaalde en in het geheugen van het analysetoestel opgeslagen, constante parameters.
In het bijzonder omvat de methode:
- berekenen van een afstand dtj tussen het ide en het jde fluorescerende microdeeltje in het digitale fluorescentiebeeld;
- per paar microdeeltjes (μ/’,, μΡ^ in de reeks I van fluorescerende microdeeltjes berekenen van de unitaire overspraakfluorescentiebijdrage a^ van genoemd paar (μΡ,,μΡ,·) op basis van de afstand
- berekenen van de fluorescenties {<pt spe} ie{i,2,...,1} van de reeks fluorescerende microdeeltjes {μΡί} ie{i,2,op basis van de volgende vergelijking:
spe^ 11 \ spe ( 1 «21 a12 «11 \ 1 «2/ ,nmeas\
Ψ1 \ ,nmeas
Ψ2 spe
W*/ a(l-V)1 \ an «(/ — 1)2 ’ «/2 · /nmeas
ΨΙ-1 \(p™easJ
Met andere woorden, de berekening is op basis van een twee specifieke reducties, zoals later wordt besproken, wat een simpele maar toch zeer nauwkeurige correctie van het overspraakeffect mogelijk maakt.
In het bijzonder wordt de unitaire overspraakfluorescentie van het jde microdeeltje in de eerste fluorescentie φ}βα'; van het ide fluorescerende microdeeltje berekend op basis van de volgende vergelijking:
N atj = ^(j)n.e~kn(diJ~ßn^ n=l waarbij N een geheel getal groter dan of gelijk aan 2 is en θη, kn en ßn tevoren bepaalde parameters zijn.
2015/5687
BE Sommeren van exponentiële functies is een doeltreffende manier om de unitaire overspraakfluorescentiebijdrage te modelleren, die tegelijkertijd flexibiliteit van convexe optimalisering voor het berekenen van parameters θη, kn en βη biedt. In het bijzonder zijn drie exponentiële functies voldoende om α^· te berekenen.
In één uitvoeringsvorm omvat elk fluorescerend microdeeltje μ Ij van de reeks fluorescerende microdeeltjes {flj} (£{1,2,...,/} een identificatiecode van een reeksMverschillende unieke identificatiecodes {idm} me^2,...,M], waarbij genoemde identificatiecode /dM(i) leesbaar is door verwerking van een digitaal beeld van genoemd fluorescerend microdeeltje μ/j, waarbij de methode voorts omvat:
- verkrijgen van een digitaal beeld van de reeks fluorescerende microdeeltjes {μΡί} ie{i,2,...,1·μ
- uitlezen van de identificatiecode ldm(i) van elk microdeeltje μ Ij in het digitale beeld; en
- per identificatiecode Idm uit de reeks M verschillende unieke identificatiecodes {idm} berekenen van een samengetelde fluorescentie op basis van de fluorescenties (p-pe van de fluorescerende microdeeltjes die genoemde identificatiecode omvatten.
In het bijzonder omvat elk fluorescerend microdeeltje μ/j uit de reeks fluorescerende microdeeltjes {μ/j} ie{i,2,..,/} een oppervlak dat is bedekt met fluorescerende complexen die op unieke wijze bij de identificatiecode ldm(i) van genoemd fluorescerend microdeeltje μ/j horen, waarbij genoemde complexen eerste, aan de microdeeltjes vastgemaakte nietfluorescerende moleculen en tweede, aan de eerste niet-fluorescerende moleculen gebonden fluorescerende moleculen omvatten.
Meer bepaald hebben de microdeeltjes gelijke afmetingen.
In een variatie omvat de methode:
- voorafgaand aan het verkrijgen van het digitale fluorescentiebeeld van de reeks fluorescerende microdeeltjes {μΡί} o de microdeeltjes zonder aan de eerste niet-fluorescerende moleculen gebonden tweede fluorescerende moleculen in een kanaal plaatsen teneinde de microdeeltjes in een monolaag op te stellen; en o het kanaal met een vloeibaar monster vullen,
- berekenen van concentratie tweede fluorescerende moleculen in het monster op basis van de samengetelde fluorescenties φ1^.
2015/5687
Een ander doel van de uitvinding is een systeem ter belichaming van vorengenoemde methodBeE,2015/5687 in het bijzonder een systeem ter bepaling van fluorescenties { <p-pe} ie{i,2,...,i] van een reeks I van fluorescerende microdeeltjes {μ Ij} ie{i,2,dat omvat:
- ten minste één kanaal om de reeks I van fluorescerende microdeeltjes {μΡι} ie{i,2,..,/} in een monolaagopstelling te ontvangen;
- een verkrijgingseenheid voor het verkrijgen van een digitaal fluorescerend beeld van de monolaagopstelling van de reeks fluorescerende microdeeltjes {μ/j} ie{i,2,in het kanaal;
- een rekeneenheid voor het berekenen van de fluorescenties { cpfpe} op basis van het verkregen digitale fluorescerende beeld, waarbij de rekeneenheid uitsluitend op basis van pixels van verkregen digitaal fluorescerend beeld dat met genoemd fluorescerend microdeeltje μ/j correspondeert, een eerste fluorescentie qjl.tieas berekent, met het kenmerk dat de rekeneenheid per fluorescerend microdeeltje μΡι in de reeks fluorescerende microdeeltjes {μΡι} berekent:
- een overspraakfluorescentiebijdrage (piross in de eerste fluorescentie (p™eas van genoemd fluorescerend microdeeltje μΡ, vanuit andere fluorescerende microdeeltjes {μΡ7·} in de reeks fluorescerende microdeeltjes {μ/j} ie{i,2,waarbij genoemde berekening op basis is van eerste fluorescenties [ Ιψ. van genoemde andere microdeeltjes; en
- de fluorescentie <pspe van genoemd fluorescerend microdeeltje μ/j door de eerste fluorescentie (p™eas daarvan met de overspraakfluorescentiebijdrage (piross te corrigeren.
KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN
De onderhavige uitvinding zal beter worden begrepen bij lezing van de volgende beschrijving, die uitsluitend als voorbeeld in verband met de bijgaande tekeningen wordt verschaft, waarbij dezelfde verwijzingscijfers dezelfde of soortgelijke elementen aanduiden, waarvan:
- figuur 1 een schematisch aanzicht is van een gecodeerd microdeeltje en een multiplexanalysetoestel dat van een dergelijk microdeeltje gebruik maakt, volgens de huidige stand der techniek;
- figuur 2 een multiplex-analyse illustreert van een monster met gebruikmaking van het microdeeltje en het analysetoestel van figuur 1;
- figuur 3 fluorescentieverschillen uit een monoplex- en een multiplex-assay illustreert;
- figuur 4 een microdeeltjesopstelling ter bepaling van een fluorescentievervalprofiel volgens de uitvinding illustreert;
- figuur 5 en 6 respectievelijk het fluorescentievervalprofiel en het relatieve fluorescentievervalprofiel volgens de uitvinding illustreren;
- figuur 7 een op het relatieve fluorescentievervalprofiel gepast model illustreert;
- figuur 8 een biplex-assay met heldere en donkere microdeeltjes illustreert;
2015/5687 figuren 9 en 10 het effect van het overspraakeffect in de gemeten biplex-fluorescenBtiEe2015/5687 illustreren; en
- figuren 11 en 12 de fluorescentie van de donkere microdeeltjes vóór, respectievelijk na de overspraakeffectcorrectie volgens de uitvinding illustreren.
GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING
Thans wordt een uitvoeringsvorm van de uitvinding op basis van het eerder uiteengezette EvalutionTM-systeem beschreven. De uitvoeringsvorm verschilt van het EvalutionTM-systeem door aanvullende verwerking volgens de uitvinding. In het bijzonder worden in het geheugen van het “Evalution™”-systeem computerinstructies en parameters opgeslagen om de verkregen digitale fluorescentiebeelden van de kanalen te verwerken teneinde het door het systeem berekende overspraakeffect in de fluorescentie <p'”eils te corrigeren. De gecorrigeerde fluorescenties (pspec worden vervolgens gebruikt om de samengetelde waarden van fluorescentie φρορ voor de populaties en de biomarkerconcentraties [h] in het onderzochte monster te berekenen.
In het bijzonder is de gemeten fluorescentie van een bepaald microdeeltje μΡι in een reeks microdeeltjes {μΡ,} in een kanaal 22 van de patroon 20 gelijk aan:
<p^eas = φζρβ + yCross (1) waarbij de fluorescentie (p^pe van een microdeeltje μΡ, correspondeert met de alleen door het microdeeltje μΡ, geproduceerde fluorescentie en <pCross de fluorescentie is vanuit andere microdeeltjes {ƒ//ƒ} die op de fluorescentie <pt spe wordt gesuperponeerd, dat wil zeggen, de overspraakbijdrage vanuit genoemde andere microdeeltjes {ƒ//ƒ}
Volgens de uitvinding wordt de overspraakbijdrage (piross gemodelleerd als een som van individuele bijdragen, elk met een isotroop vervalprofiel, dat wil zeggen:
cross t
(2) waarbij een unitaire overspraakfluorescentiebijdrage in de eerste fluorescentie (p”'eas van het jde fluorescerende microdeeltje μΡ] is die uitsluitend afhangt van de afstand d^- tussen microdeeltjes μΡ, en μ/’-, bijvoorbeeld de afstand tussen de respectieve centra van de microdeeltjes.
2015/5687
Zijn de fluorescenties <pSjPe niet voor de overspraakeffectcorrectie beschikbaar, dan worden BziEj2015/5687 bij benadering gegeven door <pjPe = <plneas, hetgeen de vergelijking:
meas t
i
mmeas rj
(3) oplevert.
In een eerste variant wordt <pfpe aldus berekend volgens:
i
meas t ^αιι.φρρ j*i (4)
Ofschoon deze variant bij het corrigeren van het overspraakeffect goede resultaten laat zien, levert de volgende berekening een betere correctie op.
In het bijzonder krijgt men door Vi, aü = 1 te stellen en de <zi7 in een matrix A, op te slaan:
(5)
,nmeas
Ψΐ-1 tmeas j
(5)
Alle fluorescenties (pspe worden aldus samen berekend volgens:
,nmeas
Ψΐ-1
meas
(6)
Zoals verderop nader wordt besproken, worden de unitaire overspraakfluorescentiebijdragen oCij volgens de volgende vergelijking berekend:
2015/5687
BE2015/5687
N aiJ = (7) n=l waarbij N een geheel getal groter dan of gelijk aan 2 is en θη, kn en βη tevoren bepaalde, identieke parameters zijn, ongeacht de microdeeltjes, die in het geheugen van de rekeneenheid 30 worden opgeslagen.
In het bijzonder met betrekking tot de microdeeltjes van het Evalution™-systeem vertoont N = goede resultaten bij de benadering van de atj.
Op basis van het bovenstaande berekent de rekeneenheid 30 volgens één uitvoeringsvorm van de uitvinding aldus:
a) de positie van het centrum van elk microdeeltje (bijvoorbeeld het centrum van de schijfvormige microdeeltjes) in het verkregen digitale fluorescerende beeld van het kanaal en berekent daarna per paar microdeeltjes (μΡ,,μΡ^ in genoemd beeld de afstand (μΡί,μΡ^;
b) de unitaire overspraakfluorescentiebijdragen α^· volgens vergelijking (7);
c) de matrix A volgens vergelijking (5) en de inverse A~r daarvan;
d) de fluorescenties (pfpe volgens vergelijking (6).
Thans wordt de bepaling van de unitaire overspraakfluorescentiebijdrage met betrekking tot figuren 4-7 beschreven. Een eerste stap bestaat uit het creëren van ten minste één groot gezichtsveld dat slecht één helder microdeeltje bevat. Om de mogelijke invloed van het multiplexing-milieu en de attributen van microdeeltjes in aanmerking te nemen, wordt een biplex-assay gedaan met een lager aantal heldere microdeeltje (bijvoorbeeld volledig heldere biotine-RPE-microdeeltjes) een groot aantal donkere microdeeltjes (bijvoorbeeld COOHmicrodeeltjes) en wordt een helderveld-beeld en een digitaal fluorescerend beeld van de microdeeltjes verkregen. Zodoende kan het overspraakvervalprofiel op de pixels van het beeld (“de pixels”) worden gemeten dat correspondeert met de COOH-microdeeltjes rondom een geïsoleerd helder microdeeltje. Een helder microdeeltje wordt geïsoleerd geacht als het dichtstbijzijnde heldere microdeeltje ten minste 1000 pixels verwijderd is. Ter verhoging van de nauwkeurigheid van de berekening worden bovendien alleen heldere microdeeltjes vastgehouden die een minimum fluorescentie (pmeas hebben en die een homogene fluorescentieverdeling op hun oppervlak hebben (bijvoorbeeld volgens een variatiecoëfficiënt van de pixels van het heldere microdeeltje). Een fluorescentiebeeld van een door donkere microdeeltjes omgeven, geïsoleerd helder microdeeltje wordt geïllustreerd in figuur 4A. Figuur
2015/5687
13
4B illustreert hetzelfde microdeeltjes te laten zien. beeld met een overbelichting na verwerking om de COOBHE-2015/5687
Om de invloed op pixels op een afstand van het centrum van het heldere microdeeltje te meten, worden in een tweede stap alle pixels die met de donkere microdeeltjes op een afstand tussen d en d+p corresponderen (waarbij p een tevoren omschreven stap is, bijvoorbeeld gelijk aan 1), in een bak samengevoegd en worden hun gemiddelde fluorescentie en gemiddelde afstand tot het centrum van de heldere microdeeltjes berekend. De pixels van de donkere microdeeltjes worden met het helderveld-beeld geselecteerd.
In figuur 5 wordt de berekende gemiddelde fluorescentie over de berekende gemiddelde afstand uitgezet. Elk punt op de grafiek correspondeert met de gemiddelde fluorescentie van pixels op een gegeven afstand van één geïsoleerd, helder microdeeltje. Het plateau rechts van de x-as correspondeert met het heldere microdeeltje waarvan de straal door de zwarte verticale lijn wordt afgebeeld. Aldus correspondeert de fluorescentie na genoemde lijn met een fluorescentiehalo die het heldere microdeeltje omgeeft, welke halo een fluorescentievervalprofiel heeft.
Om de profielen onder de verschillende omstandigheden vergelijkbaar te maken, wordt de relatieve fluorescentie berekend door de gemiddelde fluorescentie van de bak te delen door de fluorescentie van het heldere microdeeltje. Figuur 6 illustreert het relatieve fluorescentievervalprofiel dat correspondeert met dat van figuur 5. De waarden op de Y-as van figuur 6 kunnen worden geïnterpreteerd als het aandeel van de fluorescentie van het heldere microdeeltje dat op een gegeven afstand van de centrum van het heldere microdeeltje voor overspraak zorgt.
Om de potentiële bronnen van variabiliteit te beoordelen, is de bepaling van de relatieve fluorescentievervalprofielen voor verschillende belichtingstijden, verschillende buffers, instrumenten en microdeeltjes gedaan. Deze studie laat zien dat het vervalprofiel in hoofdzaak onafhankelijk is van de fluorescentie van het heldere microdeeltje, alsook van het gebruikte type buffer en de belichtingsomstandigheden.
In een verdere stap wordt een gekozen model op het relatieve-fluorescentievervalprofiel gepast. Meer bepaald, wordt de som van exponentiële functies van vergelijking (7) als model gekozen, en in het bijzonder een som van drie exponentiële functies. Al is het flexibel, verschaft dit model toch een analytische expressie tussen de relatieve overspraakfluorescentie en de afstand van het centrum van het heldere microdeeltje. Het profiel van relatief fluorescentieverval heeft een gecompliceerde vorm die wellicht moeilijk bij een som van drie exponentiële functies valt te
2015/5687
BE2015/5687 passen (plateau van 0 tot ~50 pixels, daarna een steile helling tot 85). Om goede passing van het model te verhogen, worden de data van de steile helling daarom genegeerd. Dit wordt gerechtvaardigd door het feit dat met de steile helling corresponderende afstand niet door andere microdeeltjes wordt opgevuld. Bijvoorbeeld, in het EvalutionTM-systeem is de straal van microdeeltje ongeveer 56 pixels en daarom verwacht men dat de minimum afstand tussen twee microdeeltjes niet kleiner is dan 85 pixels. Aldus is het voor passing van de data gebruikte model in de EvalutionTM:
atj = e-Mdu-85)) n=l
Figuur 7 toont een detail van het relatieve fluorescentieverval van figuur 6, waarbij de rode lijn met het gepaste model correspondeert. Vanzelfsprekend kan elk geschikt model worden gebruikt.
Een voorbeeld van de overspraakeffectcorrectie wordt geïllustreerd aan de hand van figuren 812. Dit voorbeeld correspondeert met een biplex-assay, en dus twee typen microdeeltjes of populaties, waarbij een eerste microdeeltjespopulatie (biotine-RPE-microdeeltjes) zeer helder is vergeleken met een tweede microdeeltjespopulatie (COOH-microdeeltjes). In figuur 8A wordt een helderveld-beeld geïllustreerd van een kanaal dat de twee populaties ontvangt. Zoals geïllustreerd in figuur 8B, is de populatiefluorescentie van de heldere microdeeltjes voor standaard beeldopnameomstandigheden (bijvoorbeeld excitatievermogen = 10 mW, belichting van de beeldopname = 40 ms) gelijk aan 112 A.U. (Arbitrary Unit). Nauwkeurig kijkend naar figuur 8B, zijn biotine-RPE-microdeeltjes scherp, zonder lichthalo eromheen, zodat het lastig is om uit te maken of een overspraakverschijnsel plaatsvindt. Door echter het contrast van het fluorescentiebeeld 8B tot zijn maximum te verhogen (bijvoorbeeld in overweging nemend dat beelden op 8 bits zijn gecodeerd, elke pixel met een oorspronkelijke fluorescentie groter of gelijk daaraan de instelwaarde 255 krijgt en de oorspronkelijk op 0 gestelde pixels op 0 blijven), wordt het overspraakeffect duidelijk (figuur 8C). Door figuur 8A en figuur 8C op elkaar te leggen (figuur 4D), ziet men dat de halo’s van de biotine-RPE-microdeeltjes de COOHmicrodeeltjes overstromen. Figuur 9 illustreert de samengetelde fluorescentie <Pcooh van de COOH-populatie, berekend op basis van de gemeten fluorescenties <P™Joh van COOHmicrodeeltjes die tot een cirkel met een straal van 250 pixels behoren, zoals geïllustreerd in het linker bovendeel van figuur 9. Samengetelde fluorescentie <Pcooh wordt hier geïllustreerd als functie van het aantal biotine-RPE-microdeeltjes in de cirkel. De fluorescentie <Pcoo«van de COOH-populatie correleert positief met het aantal biotine-RPE-microdeeltjes, hetgeen het overspraakverschijnsel illustreert.
2015/5687
In het bijzonder resulteert overspraakeffect in een verhoging van de -waarde, zoals wordf201^5687 geïllustreerd door de horizontale stippellijn die correspondeert met de populatiefluorescentie van COOH-microdeeltjes in een monoplex-assay onder dezelfde verkrijgingsomstandigheden (0,07 A.U.). Bijvoorbeeld, met één biotine-RPE-microdeeltje is de populatiefluorescentie ‘Pcooh van COOH-populatie gelijk aan 0,44 A.U., dat wil zeggen, een zesvoudige toename van de monoplex-waarde. Deze afhankelijkheid van populatiefluorescentie van de fluorescentie van de andere populaties bij een multiplex is desastreus voor de precisie van de assay en kan met name tot valse positieve resultaten leiden. Bijvoorbeeld, in een cytokine-assay wordt een populatiefluorescentie van 0,07 A.U. voor INF-g geacht niet significant boven de blanco fluorescentie te liggen en wordt daarom negatief genoemd. Een populatiefluorescentie van 0,44 A.U. is echter ruimschoots boven de detectielimiet en correspondeert met een geschatte concentratie van 10,3 pg / ml. Figuur 10 illustreert de extrapolatie van een zesvoudige fluorescentietoename bij een experiment met IFN-g en het effect daarvan op de geschatte concentratie met gebruikmaking van de ijkingskromme die wordt gebruikt om populatiefluorescentie φ^0Η in concentratie INF-g om te zetten.
Na toepassing van de overspraakeffectcorrectie volgens de uitvinding zou de op COOHmicrodeeltjes gemeten fluorescentie niet mogen worden beïnvloed door de fluorescentie van heldere microdeeltjes die zich in hetzelfde gezichtsveld bevinden. Om deze onafhankelijkheid te verifiëren, wordt de populatiefluorescentie van COOH-microdeeltjes in multiplex-assays met een referentiewaarde vergeleken. De referentiewaarde is de corresponderende populatiefluorescentie van COOH, zoals gemeten in een monoplex-assay onder dezelfde proefomstandigheden.
De voor de vergelijking tussen COOH in monoplex- en multiplex-assays gebruikte statistiek is
de verhouding: <Pm (multiplex) ? (simplex)
Als de signaalintensiteit van COOH-microdeeltjes niet door de aanwezigheid van de heldere microdeeltjes wordt beïnvloed, zou de verhouding p gelijk aan één moeten zijn. In het geval van overspraak tussen fluorescerende en COOH-microdeeltjes is de verhouding naar verwachting groter dan. Verhoudingen p moeten vóór en na overspraakverwijdering (“decrosstalk”) worden berekend om de verbetering van signaalrobuustheid tot het door de overspraakeffectcorrectie geïnduceerde plexniveau te beoordelen.
Figuren 11 en 12 illustreren respectievelijk vóór en na de overspraakeffectcorrectie op de COOH-microdeeltjes gemeten fluorescentie. De eerste twee boxplots, links van de figuren, presenteren de fluorescentiewaarden in de monoplex-assay. De volgende boxplots rechts
2015/5687 presenteren de COOH-fluorescentiewaarden in de verschillende biplex-omstandighedBenE2015/5687 (verschillende verhoudingen heldere/COOH-microdeeltjes). De labels op de x-as bevatten de informatie van het benaderingspercentage heldere microdeeltjes in het kanaal en het codetype van heldere microdeeltjes in de biplex (276 voor 100% biotine-RPE gekoppelde microdeeltjes en 436 voor 500% biotine-RPE gekoppelde microdeeltjes).
In figuur 11 ziet men dat de ongecorrigeerde COOH-fluorescentie sterke correlatie vertoont met het percentage heldere microdeeltjes in het kanaal. De COOH-populatiefluorescentie in kanalen waar 80% van de microdeeltjes 100%-biotine-RPE zijn, is meer dan 40 maal hoger dan 10 hun populatiewaarde in monoplex-kanalen. Zoals in figuur 12 valt te zien, wordt de correlatie na toepassing van het decrosstalking-algoritme significant verminderd. Bijvoorbeeld de verhoudingen voor de kanalen met 80% heldere microdeeltjes worden verlaagd tot respectievelijk 0,87 en 1,71. In kwalitatief opzicht vertonen de boxplots voor de andere proefomstandigheden (belichtingsduur, type buffer of uit-focusconfiguraties) hetzelfde gedrag. 15

Claims (18)

  1. CONCLUSIES
    1. Methode ter bepaling van fluorescentiewaarden {<pfpe} van een reeks I van fluorescerende microdeeltjes {/zPj van een gemultiplexeerde analyse, waarbij genoemde microdeeltjes in een monolaagopstelling zijn, welke methode omvat:
    - verkrijgen van een digitaal fluorescentiebeeld van de reeks fluorescerende microdeeltjes {/tPj ie{lj2...../}; en
    - per fluorescerend microdeeltje μΡι in de reeks fluorescerende microdeeltjes {pPi.} ie{i,2,berekenen van een fluorescentiewaarde <ptneas, uitsluitend op basis van pixels van het verkregen beeld die met genoemd fluorescerend microdeeltje μΡι corresponderen, met het kenmerk dat de methode het berekenen omvat van de fluorescentiewaarde <pt spe van genoemd fluorescerend microdeeltje μΡ, door de eerste fluorescentie (p™eas daarvan door middel van een overspraakfluorescentiebijdrage (piross in genoemde eerste fluorescentie vanuit andere fluorescerende microdeeltjes {pPj} j^i in de reeks fluorescerende microdeeltjes {/zPj te corrigeren.
  2. 2. Methode volgens conclusie 1, met het kenmerk dat de berekening van de fluorescentiewaarde <pfpe omvat:
    - per fluorescerend microdeeltje μΡ, in de reeks fluorescerende microdeeltjes {pPi.} ie{i,2,berekenen van een positie X, in het digitale fluorescentiebeeld;
    - modelleren van de eerste fluorescentiewaarde (p™™ als functie van de posities
    PGliefi,en de fluorescentiewaarden van alle fluorescerende microdeeltjes^Pj ie{12.....n; en
    - berekenen van de inverse van genoemde functie teneinde de fluorescentiewaarde (pspe te verkrijgen.
  3. 3. Methode volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk dat de berekening van fluorescentie (pspe wordt uitgevoerd op basis van de volgende vergelijking:
    waarbij <pjPe de fluorescentie van het jde fluorescerende microdeeltje μΡ] is en een unitaire overspraakfluorescentiebijdrage in de eerste fluorescentie y”''“'5 van het jde fluorescerende microdeeltje μΡ7· is, waarbij de unitaire overspraakfluorescentiebijdrage aij uitsluitend afhangt van de afstand di7 tussen de fluorescerende microdeeltjes μΡ, en pPj
    2015/5687
  4. 4. Methode volgens conclusie 3, met het kenmerk dat de methode omvat:
    - berekenen van de afstand d^- tussen het ide en het jde fluorescerende microdeeltje in het digitale fluorescentiebeeld;
    - per paar microdeeltjes (μΡ^μΡ;') in de reeks I van fluorescerende microdeeltjes berekenen van de unitaire overspraakfluorescentiebijdrage atj van genoemd paar (μΡί,μΡΡ) op basis van de afstand
    - berekenen van de fluorescenties {<pfpe^ ie(i,2,...,i] van de reeks fluorescerende microdeeltjes [ƒ//’,} ie{i,2,op basis van de volgende vergelijking:
    ',nmeas
    Ψ1 ,nmeas Ψ2 /nmeas
    Ψΐ-1 ,nmeas
  5. 5. Methode volgens conclusie 3 of 4, met het kenmerk dat de unitaire overspraakfluorescentie van het jde microdeeltje in de eerste fluorescentie van het idefluorescerende microdeeltje wordt berekend op basis van de volgende vergelijking:
    N (tij = ^ {θη. e~kn(di’j-ßn^ n=l waarbij N een geheel getal groter dan of gelijk aan 2 is en θη, kn en βη tevoren bepaalde parameters zijn.
  6. 6. Methode volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk dat elk fluorescerend microdeeltje ƒ(/’, van de reeks fluorescerende microdeeltjes {gl}} ie{i,2,..,/} een identificatiecode Idm(i) van een reeks M verschillende unieke identificatiecodes omvat, waarbij genoemde identificatiecode ldM(ij leesbaar is door middel van verwerking van een digitaal beeld van genoemd fluorescerend microdeeltje μΡί, en dat de methode voorts omvat:
    - verkrijgen van een digitaal beeld van de reeks fluorescerende microdeeltjes {μΡί} ie{l,2,...,/};
    - lezen van de identificatiecode ldm(i) van elk microdeeltje in het digitale beeld; en
    - per identificatiecode Idm van de reeks M verschillende unieke identificatiecodes {idm} me{i,2,...,M} berekenen van een samengetelde fluorescentie φ'’β op basis van de fluorescenties <pt spe van de fluorescerende microdeeltjes die genoemde identificatiecode omvatten.
    2015/5687
    BE2015/5687
  7. 7. Methode volgens conclusie 6, met het kenmerk dat elk fluorescerend microdeeltje μΡί van de reeks fluorescerende microdeeltjes {ƒ//’,) een oppervlak omvat dat is bedekt met fluorescerende complexen die op unieke wijze bij de identificatiecode Idm(i) van genoemd fluorescerend microdeeltje μΡι horen, waarbij genoemde complexen eerste, aan de microdeeltjes vastgemaakte niet-fluorescerende moleculen en tweede, aan de eerste niet-fluorescerende moleculen gebonden fluorescerende moleculen omvatten.
  8. 8. Methode volgens conclusie 7, met het kenmerk dat de microdeeltjes gelijke afmetingen hebben.
  9. 9. Methode volgens conclusie 7 of 8, met het kenmerk dat de methode omvat:
    - voorafgaand aan het verkrijgen van het digitale fluorescentiebeeld van de reeks fluorescerende microdeeltjes {ƒ//’,) 2, o de microdeeltjes zonder aan de eerste niet-fluorescerende moleculen gebonden tweede fluorescerende moleculen in een kanaal te plaatsen teneinde de microdeeltjes in een monolaag op te stellen; en o het kanaal met een vloeibaar monster vullen,
    - berekenen van de concentratie van tweede fluorescerende moleculen in het monster op basis van de samengetelde fluorescenties φ^. 10 * * * * * * * * * * * * * * * *
  10. 10. Systeem ter bepaling van fluorescenties {<PiPe} van een reeks I van fluorescerende microdeeltjes {ƒ///} ïe{i,2,...,/) dat omvat:
    - ten minste één kanaal om de reeks Ivan fluorescerende microdeeltjes {ƒ(//} ïe{i,2,..,/) in een monolaagopstelling te ontvangen;
    - een verkrijgingseenheid voor het verkrijgen van een digitaal fluorescerend beeld van de monolaagopstelling van de reeks fluorescerende microdeeltjes
    Wä ie{1,2...../) in het kanaal;
    - een rekeneenheid voor het berekenen van de fluorescenties {<p-pe} ïe{i,2,...,/} op basis van het verkregen digitale fluorescerende beeld, waarbij de rekeneenheid uitsluitend op basis van pixels van verkregen digitaal fluorescerend beeld dat met genoemd fluorescerend microdeeltje μΙ} correspondeert, een eerste fluorescentie (p'”eils berekent, met het kenmerk dat de rekeneenheid per fluorescerend microdeeltje μΡί in de reeks fluorescerende microdeeltjes {ƒ//’,) ie{i,2,..,/} berekent:
    - een overspraakfluorescentiebijdrage (piross in de eerste fluorescentie (pk160-5 van genoemd fluorescerend microdeeltje μ Ij vanuit andere fluorescerende microdeeltjes [p-Pj] j*i in de reeks fluorescerende microdeeltjes {^/)/6(1,2,..,/),
    2015/5687 waarbij genoemde berekening op basis van eerste fluorescenties [ (p”'eas} ίψ. vBn genoemde andere microdeeltjes is; en
    - de fluorescentie <pt spe van genoemd fluorescerend microdeeltje μΡ, door de eerste fluorescentie (p™eas daarvan door middel van de overspraakfluorescentiebijdrage cpcross te corrigeren.
  11. 11. Systeem volgens conclusie 10, met het kenmerk dat de rekeneenheid de fluorescentiewaarde (p^pe berekent door:
    - per fluorescerend microdeeltje μΡι in de reeks fluorescerende microdeeltjes {μΡι} ie{i,2,...,1} een positie in het digitale fluorescentiebeeld te berekenen;
    - de eerste fluorescentiewaarde (pk160-5 te modelleren als functie van de posities
    PGliefi,en de fluorescentiewaarden van alle fluorescerende microdeeltjes ie{lj2...../}; en
    - de inverse van genoemde functie te berekenen teneinde de fluorescentiewaarde (pspe te verkrijgen.
  12. 12. Systeem volgens conclusie 10 of 11, met het kenmerk dat de rekeneenheid de fluorescentie (p^pe op basis van de volgende vergelijking berekent: waarbij <pjPe de fluorescentie van het jde fluorescerende microdeeltje μΡ] is en een unitaire overspraakfluorescentiebijdrage in de eerste fluorescentie (pi6'13 * 15 van het jde fluorescerende microdeeltje μΡ] is, waarbij de unitaire overspraakfluorescentiebijdrage aij uitsluitend afhangt van de afstand tussen de fluorescerende microdeeltjes μ Ij en pPj
  13. 13. Systeem volgens conclusie 12, met het kenmerk dat de rekeneenheid:
    - de afstand d^- tussen het ide en het jde fluorescerende microdeeltje in het digitale fluorescentiebeeld berekent;
    - per paar microdeeltjes (μΡί, μΡ/) in de reeks I van fluorescerende microdeeltjes de unitaire overspraakfluorescentiebijdrage van genoemd paar (μΡ^μρΡ) op basis van de afstand dtJ berekent;
    - de fluorescenties {<pt spe} van de reeks fluorescerende microdeeltjes {μΡι} ie(i,2,...,i} op basis van de volgende vergelijking berekent:
    2015/5687
    BE2015/5687 ,nmeas
    Ψ1-1 \ ,nmeas \ψΐ
    .„me as
    Ψ1 ,nmeas Ψ2
  14. 14. Systeem volgens conclusie 13, met het kenmerk dat de unitaire overspraakfluorescentie van het jde microdeeltje in de eerste fluorescentie van het ide fluorescerende microdeeltje op basis van de volgende vergelijking wordt berekend:
    N eg] = ^(ön· e~kn(di’j~ßm)^ n=l waarbij N een geheel getal groter dan of gelijk aan 2 is en dn,kn en βη tevoren bepaalde parameters zijn.
  15. 15. Systeem volgens een der conclusies 10-14, met het kenmerk dat elk fluorescerend microdeeltje μΡι van de reeks fluorescerende microdeeltjes {ƒ</’,} iep,2,...,1} een identificatiecode Idm(i) van een reeks M verschillende unieke identificatiecodes omvat, waarbij genoemde identificatiecode ldM(ij leesbaar is door verwerking van een digitaal beeld van genoemd fluorescerend microdeeltje μΡι, en dat de rekeneenheid:
    - een digitaal beeld van de reeks fluorescerende microdeeltjes {μ Ij} ie{1(2,...,1} verkrijgt;
    - de identificatiecode ldm(i) van elk microdeeltje μ Ij in het digitale beeld leest; en
    - per identificatiecode Idm van de reeks M verschillende unieke identificatiecodes (idm] me{i,2,...,M} een samengetelde fluorescentie v‘j,j berekent op basis van de fluorescenties <pt spe van de fluorescerende microdeeltjes die genoemde identificatiecode omvatten.
  16. 16. Systeem volgens conclusie 15, met het kenmerk dat elk fluorescerend microdeeltje μΡι van de reeks fluorescerende microdeeltjes {μΡι} ie{i,2,een oppervlak omvat dat is bedekt met fluorescerende complexen die op unieke wijze bij de identificatiecode ldm(i) van genoemd fluorescerend microdeeltje μ/j horen, waarbij genoemde complexen eerste, aan de microdeeltjes vastgemaakte niet-fluorescerende moleculen en tweede, aan de eerste niet-fluorescerende moleculen gebonden fluorescerende moleculen omvatten.
  17. 17. Systeem volgens conclusie 16, met het kenmerk dat de microdeeltjes gelijke afmetingen hebben.
    2015/5687
    BE2015/5687
  18. 18. Systeem volgens conclusie 16 of 17, met het kenmerk dat het systeem ten minste één kanaal omvat en middelen om, voorafgaand aan het verkrijgen van het digitale fluorescentiebeeld van de reeks fluorescerende microdeeltjes {μ.Ρί} ie{i,2,
    - de microdeeltjes zonder aan de eerste niet-fluorescerende moleculen gebonden tweede fluorescerende moleculen in het kanaal te plaatsen teneinde de microdeeltjes in een monolaag op te stellen; en
    - het kanaal met een vloeibaar monster te vullen, en dat de rekeneenheid de concentratie van tweede fluorescerende moleculen in het monster op basis van de samengetelde fluorescenties φ1^ berekent.
BE2015/5687A 2015-09-22 2015-10-26 Overspraakcorrectie bij multiplexing-analyse van biologisch monster BE1025903B1 (nl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15186210.9A EP3147650A1 (en) 2015-09-22 2015-09-22 Cross-talk correction in multiplexing analysis of biological sample
EP15186210.9 2015-09-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BE1025903A1 true BE1025903A1 (nl) 2019-08-06
BE1025903B1 BE1025903B1 (nl) 2019-08-12

Family

ID=54185882

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BE2015/5687A BE1025903B1 (nl) 2015-09-22 2015-10-26 Overspraakcorrectie bij multiplexing-analyse van biologisch monster

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10527549B2 (nl)
EP (2) EP3147650A1 (nl)
JP (1) JP2018529947A (nl)
CN (1) CN108139325A (nl)
AU (1) AU2016328559A1 (nl)
BE (1) BE1025903B1 (nl)
WO (1) WO2017050788A1 (nl)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7235036B2 (ja) * 2018-03-07 2023-03-08 コニカミノルタ株式会社 画像処理方法、画像処理装置及びプログラム
CN109859188B (zh) * 2019-01-31 2021-04-06 领航基因科技（杭州）有限公司 一种基于均值漂移算法的荧光串扰校正方法及其应用
US11676685B2 (en) 2019-03-21 2023-06-13 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based quality scoring
US11210554B2 (en) 2019-03-21 2021-12-28 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
US11593649B2 (en) 2019-05-16 2023-02-28 Illumina, Inc. Base calling using convolutions
US11423306B2 (en) * 2019-05-16 2022-08-23 Illumina, Inc. Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing
GB2619176B (en) * 2019-05-22 2024-03-27 Hitachi High Tech Corp Analysis device and analysis method
BR112022016415A2 (pt) 2020-02-20 2022-10-11 Illumina Inc Múltiplas chamadas de base à base de inteligência artificial

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006015251A2 (en) * 2004-07-29 2006-02-09 The Research Foundation Of State University Of New York System and method for cross-talk cancellation in a multilane fluorescence detector
US20080241843A1 (en) * 2006-12-21 2008-10-02 Stanford University Single-cell analysis systems, methods of counting molecules in a single-cell, cylindrical fluorescence detection systems
JP2011501189A (ja) * 2007-10-25 2011-01-06 ザ・リサーチ・ファウンデーション・オブ・ステイト・ユニバーシティー・オブ・ニューヨーク 単一光子分光計
CN102264474B (zh) * 2008-12-23 2016-01-13 麦卡提斯股份有限公司 用于进行生物学检测的检测设备和方法
RU2434288C1 (ru) * 2010-06-08 2011-11-20 Закрытое Акционерное Общество "Импульс" Способ коррекции цифровых изображений
US20120015825A1 (en) * 2010-07-06 2012-01-19 Pacific Biosciences Of California, Inc. Analytical systems and methods with software mask
EP2484447A1 (en) * 2011-02-07 2012-08-08 Biocartis SA Improved encoded microcarriers, assay system using them and method for performing an assay
WO2012154734A1 (en) * 2011-05-09 2012-11-15 Rotman M Boris System for detecting and enumerating biological particles

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016328559A1 (en) 2018-03-01
US10527549B2 (en) 2020-01-07
BE1025903B1 (nl) 2019-08-12
CN108139325A (zh) 2018-06-08
WO2017050788A1 (en) 2017-03-30
JP2018529947A (ja) 2018-10-11
EP3353532A1 (en) 2018-08-01
US20180275059A1 (en) 2018-09-27
EP3147650A1 (en) 2017-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BE1025903B1 (nl) Overspraakcorrectie bij multiplexing-analyse van biologisch monster
Digman et al. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope
Ellington et al. Antibody-based protein multiplex platforms: technical and operational challenges
US20230258561A1 (en) Digital molecular assays
US20120015825A1 (en) Analytical systems and methods with software mask
KR102652419B1 (ko) 생물학적 샘플에서 분석물 및/또는 단백질을 측정하기 위한 방법
JP4979516B2 (ja) 画像読み取り方法および装置
Rodriques et al. A theoretical analysis of single molecule protein sequencing via weak binding spectra
CN117110270B (zh) 使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备
CN117388227B (zh) 使用检测微球测定样品中目标分子浓度的方法、计算机可读介质和分析设备
Wilkins Stevens et al. Imaging and analysis of immobilized particle arrays
KR102048599B1 (ko) 판정 방법, 판정 장치, 판정 시스템 및 프로그램
CN109073554B (zh) 利用双光子激发荧光的生物亲和性测定方法
KR20190136650A (ko) 바이오센서용 형광 광학 장치 및 시스템
JP2005030950A (ja) 固定化された物質の定量方法
RU200805U1 (ru) Флуоресцентный анализатор биочипов
US20040019433A1 (en) Method for locating areas of interest of a substrate
JP2023107419A (ja) 定量方法、定量装置および定量プログラム
US20230280338A1 (en) Improvements in or relating to an apparatus for detection and analysis of a component
WO2015000720A1 (en) System for determining a quantitative number being indicative of the concentration of target elements in a fluid
Picket et al. Turning photons into results: principles of fluorescent microarray scanning
JP2004029009A (ja) バイオチップ

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Effective date: 20190812

MM Lapsed because of non-payment of the annual fee

Effective date: 20201031