JP2023107419A - 定量方法、定量装置および定量プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】生体物質を標識する標識物質に由来する光の強度がノイズに埋もれた場合でも適切に生体物質を定量できる。
【解決手段】定量方法は、複数の生体物質を標識物質で標識した生体標本画像を入力する工程と、生体標本画像からの光の第１強度分布を得る工程と、第１強度分布から複数のピーク値および複数の第１ベース値を求める工程と、ピーク値と対応する第１ベース値との差分値である複数の差分値を求める工程と、検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して複数の差分値を補正した複数の第１検出値を求める工程と、複数の第１検出値と対応する第１ベース値との合計値である複数の第１合計値を求める工程と、複数の第１合計値に基づいて複数の生体物質を定量する工程と、を有する。
【選択図】図２

Description

本発明は、定量方法、定量装置および定量プログラムに関する。

病理診断において、組織切片などを用いて被観察物質の発現量を定量することは、予後の予測やその後の治療計画を決めるうえで非常に重要な情報となり得る。よって、組織切片などにおいて被観察物質を正確に定量することは非常に重要である。被観察物質の定量方法として、被観察物質を蛍光物質で標識して高感度で検出する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。

特許文献１には、免疫染色後の組織切片における生体物質の発現量を定量的に評価する方法が記載されている。特許文献１に記載の方法では、まず、生体物質を蛍光標識した組織切片の蛍光強度分布を検出する。次いで、自家蛍光を除去するために、得られた蛍光強度の分布のうち、所定の閾値以上の強度を示す領域を抽出する。最後に、蛍光物質由来の輝点数を計測することで、被観察物質を定量している。

国際公開第２０１９／０８７８５３号

ここで、自家蛍光が生じる組織切片において、検出される蛍光強度は、被観察物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光の強度および自家蛍光の強度の合計値である場合と、被観察物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光の強度が自家蛍光の強度に埋もれてしまう場合とが考えられる。蛍光物質を自家蛍光が透過する場合には、前述したように、検出される蛍光強度は、被観察物質を標識する蛍光物質に由来の蛍光の強度および自家蛍光の強度の合計値となる。一方、蛍光物質を自家蛍光が透過しない場合、被観察物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光の強度が自家蛍光の強度に埋もれてしまう。このように、使用する蛍光物質により検出される蛍光強度が異なることが考えられる。

特許文献１の定量方法では、検出される蛍光強度が、被観察物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光の強度および自家蛍光の強度の合計値である場合には、被検出物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光の強度を適切に検出できる。一方、検出される蛍光強度が、被観察物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光の強度が自家蛍光の強度に埋もれてしまう場合には、被検出物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光の強度を適切に検出できない。

また、被観察物質を標識する蛍光物質の大きさが検出部の光学分解能より小さい場合、被観察物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光の強度分布をシャープに検出できないことがある。特に、被観察物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光の強度と、自家蛍光の強度との差が大きい場合には、蛍光物質由来の蛍光強度が、周囲の蛍光強度によりならされてしまうため、正確な蛍光強度を検出できないことがある。

本発明の目的は、生体物質を標識する標識物質に由来する光の強度がノイズに埋もれた場合でも適切に生体物質を定量できる定量方法、定量装置および定量プログラムを提供することである。

本発明の一実施の形態に係る定量方法は、複数の生体物質を標識物質で標識した生体標本画像を入力する工程と、検出部で検出された前記生体標本画像からの光の第１強度分布を得る工程と、前記第１強度分布から、各前記標識物質にそれぞれ対応する複数のピーク値と、各前記標識物質の周辺領域にそれぞれ対応する複数の第１ベース値とを求める工程と、前記複数のピーク値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との差分値である複数の差分値を求める工程と、前記検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して、前記複数の差分値をそれぞれ補正した複数の第１検出値を求める工程と、前記複数の第１検出値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との合計値である複数の第１合計値を求める工程と、前記複数の第１合計値に基づいて、前記複数の生体物質を定量する工程と、を有する。

本発明の一実施の形態に係る定量装置は、複数の生体物質を標識物質で標識した生体標本画像からの光の第１強度分布を検出するための検出部と、前記第１強度分布を解析するための解析部と、を有し、前記解析部は、前記検出部で検出された前記生体標本画像からの光の前記第１強度分布を得て、前記第１強度分布から、各前記標識物質にそれぞれ対応する複数のピーク値と、各前記標識物質の周辺領域にそれぞれ対応する複数の第１ベース値とを求め、前記複数のピーク値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との差分値である複数の差分値を求め、前記検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して、前記複数の差分値をそれぞれ補正した複数の第１検出値を求め、前記複数の第１検出値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との合計値である複数の第１合計値を求め、前記複数の第１合計値に基づいて、前記複数の生体物質を定量する。

本発明の一実施の形態に係る定量プログラムは、コンピュータに、検出部で検出された複数の生体物質を標識物質で標識した生体標本画像からの光の第１強度分布を得る工程と、前記第１強度分布から、各前記標識物質にそれぞれ対応する複数のピーク値と、各前記標識物質の周辺領域にそれぞれ対応する複数の第１ベース値とを求める工程と、前記複数のピーク値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値とのそれぞれの差分値である複数の差分値を求める工程と、前記検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して、前記複数の差分値をそれぞれ補正した複数の第１検出値を求める工程と、前記複数の第１検出値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との合計値である複数の第１合計値をそれぞれ求める工程と、前記複数の第１合計値に基づいて、前記複数の生体物質を定量する工程と、を実行させる。

本発明によれば、生体物質を標識する標識物質に由来する光の強度がノイズに埋もれた場合でも適切に生体物質を定量できる。

図１は、本発明の実施の形態１に係る定量方法のフローチャートである。 図２は、本発明の実施の形態１に係る定量方法を説明するための図である。 図３Ａ～Ｄは、第１補正値を説明するための図である。 図４は、本発明の実施の形態１に係る定量装置の構成を示すブロック図である。 図５は、シミュレーション結果を示すグラフである。 図６は、本発明の実施の形態２に係る定量方法のフローチャートである。

以下、本発明の一実施の形態に係る定量方法、定量装置および定量プログラムについて説明する。

一般に、組織切片などに発現した生体物質の発現量の定量は、生体物質を標識物質で標識し、当該標識物質から発せられた光を検出することで行われる。ここで、光の検出に使用される定量装置では、光学系の開口数（ＮＡ）や、撮像系の画素ピッチなどの影響により、光の強度分布（ピーク形状）を想定される強度分布（ピーク形状）よりもシャープに検出できない場合がある。また、自家蛍光の強弱により、検出結果が変化してしまうことがある。本実施の形態は、想定される本来の検出結果が得られるように、上記のような検出結果を補正する定量方法、定量装置および定量プログラムでる。

［実施の形態１］
図１は、本発明の実施の形態１に係る定量方法のフローチャートである。図２は、定量方法を説明するための図である。

本発明の実施の形態１に係る定量方法は、複数の生体物質を標識物質で標識した生体標本画像を入力する工程と、検出部で検出された生体標本画像からの光の第１強度分布を得る工程と、第１強度分布から、各標識物質にそれぞれ対応する複数のピーク値と、各標識物質の周辺領域にそれぞれ対応する複数の第１ベース値とを求める工程と、複数のピーク値のそれぞれと、複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との差分値である複数の差分値を求める工程と、検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して、複数の差分値をそれぞれ補正した複数の第１検出値を求める工程と、複数の第１検出値のそれぞれと、複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との合計値である複数の第１合計値を求める工程と、複数の第１合計値に基づいて、複数の生体物質を定量する工程と、を有する。

生体標本画像を入力する工程では、定量に使用する生体標本画像を準備し、後述の定量装置に入力する（Ｓ１１０）。生体標本画像の数は、限定されない。生体標本画像の数は、１つでもよいし、複数でもよい。複数の生体標本画像を準備することで、複数の生体標本画像間における生体物質の量的関係、生体物質の局在などを観察できる。ここで、生体標本画像に使用される生体標本の種類は、生体物質を検出できれば特に限定されない。生体標本の例には、病理組織、ＣＤＸ（Ｃｅｌｌ ｌｏｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、ＰＤＸ（Ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）などの組織切片、培養細胞から作製された標本が含まれる。

生体物質は、定量対象の物質であり、生体標本に含まれる。生体物質の種類は、特に限定されない。生体物質の例には、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）など、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）；タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド、標的細胞の細胞膜に存在する受容体など）；アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）；糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖など）；脂質；エクソソーム；またはこれらの修飾分子、複合体が含まれる。また、生体物質のより具体的な例には、５Ｔ４、ＡＸＬ、ＢＣＭＡ、Ｃ４．４Ａ、ＣＡ６、Ｃａｄｈｅｒｉｎ３、Ｃａｄｈｅｒｉｎ６、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ１３８、ＣＤ１４２、ＣＤ３５２、ＤＬＬ３、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈｒｉｎＡ４、ＥＴＢＲ、ＦｃγＲIII、ＦＯＬＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＧＣＣ、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩｎｔｅｇｒｉｎαＶ、ＬＡＭＰ１、ＬＩＶ１、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２Ｂ、Ｎｅｃｔｉｎ４、ＮＯＴＣＨ３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＲＯＰ２、Ｋｉ６７、ＨＥＲ４、ＥＲ、ＰＲが含まれる。

生体物質は、標識物質で標識されている。生体物質を標識する方法の例には、抗体や抗体の断片を用いた免疫染色法、抗体に類似の分子認識基を用いた染色法が含まれる。抗体に類似の分子認識基を用いた染色法により生体物質を標識する方法では、例えば分子認識基として、アプタマー、ＳＮＡＰ－ｔａｇを用いる。標識物質の例には、蛍光体集積粒子やその他の蛍光物質が含まれる。

免疫染色法により標識する方法では、生体物質を含む生体標本を免疫染色して、生体物質が蛍光標識により可視化された免疫染色像を得る。

また、免疫染色法の２次反応では、蛍光体集積粒子を含む標識物質を使用できる。例えば、生体物質は、蛍光体集積粒子を含む標識物質で標識される。

蛍光体集積粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光体（例えば蛍光色素や半導体ナノ粒子）がその中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。蛍光体集積粒子を構成する蛍光色素の例には、ローダミン系色素、Ｃｙ系色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、スクアリリウム系色素、シアニン系色素、芳香環系色素、オキサジン系色素、カルボピロニン系色素、ピロメセン系色素が含まれる。蛍光体集積粒子を構成する半導体ナノ粒子の素材の例には、ＩＩ－ＶＩ族半導体、ＩＩＩ－Ｖ族半導体、またはＩＶ族半導体が含まれる。蛍光体集積粒子は、公知の方法（例えば、特開２０１３－５７９３７号公報参照）に従って作製できる。

生体標本画像からの光の第１強度分布を得る工程では、生体標本画像全体からの光の強度分布を得る（Ｓ１２０）。光の第１強度分布を得る方法は、生体物質を標識した標識物質に基づいて適宜選択される。生体物質が標識された生体標本画像から光の第１強度分布は、生体標本を撮像した後、所定の画像処理ソフトウェアで生体標本画像を画像処理することにより求められる。これにより、例えば、標識物質として蛍光体集積粒子を使用した場合には、測定位置と、生体物質を標識する蛍光体集積粒子に由来する蛍光の強度値と関係である第１強度分布を得ることができる。

本実施の形態では、図２の実線に示されるように、生体物質が標識された生体標本から放出された光の第１強度分布を求めることができる。図２に示される例では、ピークＡ１およびピークＡ２が検出され、かつ、ピークＡ１における第１ベースＢ１とピークＡ２における第２ベースＢ２とはそれぞれ強度が異なる。ここで、ピークＡ１は第１ベースＢ１に埋もれており、ピークＡ２は第２ベースＢ２に埋もれている。ここで、第１ベースＢ１は、ピークＡ１の周囲における標識物質に由来しない光（背景光）の強度であり、第１ベースＢ２は、ピークＡ２の周囲における標識物質に由来しない光（背景光）の強度である。生体標本の種類などによっては、このように場所ごとに背景光の強度が異なることもある。

複数のピーク値および複数の第１ベース値を求める工程では、第１強度分布から、各標識物質にそれぞれ対応する複数のピーク値と、各標識物質の周辺領域にそれぞれ対応する複数の第１ベース値とを求める（Ｓ１３０）。

ピーク値は、例えば以下の方法で求めることができる。まず、光の第１強度分布を示す関数を１階微分、および２階微分して、１次微分関数および２次微分関数をそれぞれ得る。そして、１次微分関数において、縦軸が０の点を求める。１次微分関数における縦軸が０の点は、第１強度分布を示す関数における極大点または極小点を示す。そして、２次微分関数において、１次微分関数における傾きが０の点の前後に対応して縦軸がプラスからマイナスに変化する点をピーク値とする。１次微分関数において縦軸が０の点の前後において傾きがプラスからマイナスに変化する点は、第１強度分布を示す関数における極大点を示している。１次微分関数において傾きが０の点の前後において傾きがマイナスからプラスに変化する点は、第１強度分布を示す関数における極小点を示している。

ピーク値は、例えば以下の方法でも求めることができる。まず、光の第一強度分布を示すデータに対して、極大値を検出する。次いで、極大値を検出した座標のうち、その座標の強度値と、その近傍の座標の強度値との差分を計算し、差分の値が所定の値以上となる座標のみをピーク座標として検出する。最後に、検出されたピーク座標における強度値をピーク値とする。

第１ベース値は、例えば以下の方法で求めることができる。第１ベース値は、生体物質の周辺領域に対応する。第１ベース値は、第１強度分布において、ピークから離れた一定の範囲内における光の強度の平均値、中央値または最頻値であることが好ましい。光の第１強度分布を示す関数において、測定位置（距離）に対する強度の変化率により決定する。具体的には、当該変化率が所定の値以下になった場合に第１ベースのベーススタートとし、当該変化率が所定の値以上になった場合に第１ベースのベースエンドとする。そして、ベーススタートからベースエンドまでの光の強度の平均値、中央値または最頻値を第１ベース値とする。

図２に示される例では、ピークＡ１のピーク値ａ１と、ピークＡ２のピーク値ａ２とを求める。また、同様に、第１ベースＢ１の第１ベース値ｂ１と、第１ベースＢ２の第１ベース値ｂ２を求める。

複数の差分値を求める工程では、複数のピーク値のそれぞれと、対応する第１ベース値とのそれぞれの差分値を求める（Ｓ１４０）。よって、ピーク毎に差分値が得られる。

図２に示される例では、ピーク値ａ１から第１ベース値ｂ１を引いて差分値Δ１を求め、ピーク値ａ２から第１ベース値ｂ２を引いて差分値Δ２を求める。

複数の第１検出値を求める工程では、検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して複数の差分値をそれぞれ補正して、第１検出値を求める（Ｓ１５０）。

ここで、第１補正値について説明する。第１補正値は、例えば以下の方法で求めることができる。まずは、検出部で検出された標識物質のみからの光に対応する第２強度分布または点拡がり関数（Ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ；ＰＳＦ）を求める。

第２強度分布は、例えば検出部による標識物質のみからの光の強度分布を実測することにより求めてもよい。

点拡がり関数の求め方は、特に限定されない。点拡がり関数は、例えば、検出部における開口数（ＮＡ）と、画素ピッチとに基づいて算出できる。なお、点拡がり関数は、収差をさらに考慮して算出してもよい。具体的には、点拡がり関数は、例えば、以下の方法で算出できる。

点拡がり関数は、例えば以下の方法で求めることができる。点広がり関数は、光学系が既知である場合は、光学設計ソフトウェアＺｅｍａｘ（登録商標）などの市販の光線追跡ソフトを用いて、物体面に設置した単一の点光源から多くの光線を発射させたときの、それぞれの光線の像面上の強度分布を、各光線の強度と位相を複素振幅として積分演算することで求めてもよい。光学系が未知の場合や、収差が回折限界に対して無視できるほど小さい場合には、光学系のＮＡに対応する円形状を２次元フーリエ変換することで得られるエアリーディスクパターンを点拡がり関数としてもよい。

次いで、第２強度分布に基づいて、第１補正値を求める。例えば、第１補正値は、第２強度分布において、ピーク値の積分値に対する第２強度分布または点拡がり関数の総積分値の比率である。ここで、「ピーク値の積分値」とは、ピーク強度でもよいし、ピーク値を含む任意の範囲における積分値でもよい。

次いで、算出した第１補正値を利用して複数の差分値をそれぞれ補正して複数の第１検出値を求める。

例えば、第１補正値がピーク値の積分値に対する点拡がり関数の総積分値の比率である場合には、第１補正値を差分値に乗じた値を第１検出値とする。

ここで、第１補正値について具体的に説明する。ここでは、第２強度分布および点拡がり関数に基づいて算出する方法について説明する。図３Ａ～Ｄは、第１補正値を説明するための図である。図３Ａは、検出部で検出された標識物質からの光のみの第２強度分布を模式的に示している。図３Ｂは、標識物質のみに対応する理想的な点拡がり関数を模式的に示している。図３Ｃは、第２強度分布と理想的な点拡がり関数とを重ねた図である。図３Ｄは、第１補正値を利用した差分値の補正方法を示している。

図３Ａ、Ｂに示されるように、標識物質からの光量は同じであるため、第２強度分布の総積分値Ｓ１と、理想的な点拡がり関数の総積分値Ｓ２とは、同じ値である。

図３Ｃに示されるように、第２強度分布の総積分値Ｓ１は、部分面積ｓ１と、部分面積ｓ２と、部分面積ｓ４との総和である。また、理想的な点拡がり関数の総積分値Ｓ２は、部分面積ｓ３と、部分面積ｓ４との総和である。第２強度分布の総積分値Ｓ１と、理想的な点拡がり関数の総積分値Ｓ２とは、同じ値であるため、部分面積ｓ１と、部分面積ｓ２との和が、部分面積ｓ３と同じ値になる。

ここで、上述した「ピーク値の積分値」は、部分面積ｓ４に対応し、「第２強度分布の総積分値Ｓ１」は、部分面積ｓ１と、部分面積ｓ２と、部分面積ｓ４との総和に相当する。

本実施の形態では、ピーク値の積分値（部分面積ｓ４）に対する第２強度分布の総積分値（部分面積ｓ１と、部分面積ｓ２と、部分面積ｓ４との総和）Ｓ１の比率は、３である。すなわち、本実施の形態では、第１補正値は、３である。

よって、理想的な点拡がり関数の総積分値Ｓ２は、部分面積ｓ４の約３倍になる。また、理想的な点拡がり関数のピーク値（ｃ１－ｂ１）は、第２強度分布におけるピーク値の約３倍になる。

このように、検出部で検出された標識物質からの光のみの第２強度分布と、標識物質のみに対応する理想的な点拡がり関数とに基づいて、第１補正値を求めることができる。

ここで、第１強度分布におけるピークは、第２強度分布におけるピークとほぼ同じ形状であるため、差分値Δ１、Δ２）に第１補正値をそれぞれ乗じることにより、第１検出値Δ３、Δ４に補正できる。

複数の第１合計値を求める工程では、複数の第１検出値のそれぞれと、対応する第１ベース値の合計値である第１合計値を求める（Ｓ１６０）。

本実施の形態では、図２に示されるように、第１検出値Δ３に第１ベース値ｂ１を加えることにより、第１合計値ｃ１を求めることができる。また、第１検出値Δ４に第１ベース値ｂ２を加えることにより、第１合計値ｃ１を求めることができる。

第１合計値に基づいて、生体物質を定量する工程では、例えば、あらかじめ求めておいた検量線に基づいて、生体物質の量を定量できる（Ｓ１７０）。

（定量装置および定量プログラム）
図４は、本実施の形態に係る定量装置１００のブロック図である。図４に示されるように、本実施の形態に係る定量装置１００は、検出部１１０と、解析部１２０とを有する。本実施の形態では、定量装置１００は、検出部１１０および解析部１２０を制御するための制御部１３０をさらに有する。

検出部１１０は、複数の生体物質を標識物質で標識した生体標本からの光の第１強度分布を検出するための装置である。また、検出部１１０は、標識物質のみに対する第２強度分布を検出してもよい。検出部１１０は、撮像することにより、光の強度分布を得てもよいし、外部で取得した画像に基づいて光の強度分布を得てもよい。検出部１１０は、第１強度分布または第２強度分布を検出するための撮像装置（カメラ）でもよいし、外部で取得した画像を入力するためのコンピュータの一部でもよい。

解析部１２０は、第１強度分布と、第２強度分布または点拡がり関数を解析するための装置である。解析部１２０は、上述したように、第１強度分布から、各標識物質にそれぞれ対応する複数のピーク値と、各標識物質の周辺領域にそれぞれ対応する複数の第１ベース値とを得る。また、解析部１２０は、複数のピーク値のそれぞれと、複数の第１ベース値のうち対応する複数の第１ベース値との差分値である複数の差分値を得る。また、解析部１２０は、検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して、複数の差分値をそれぞれ補正した複数の第１検出値を得る。さらに、解析部１２０は、複数の第１検出値のそれぞれと、複数の第１ベース値のうち対応する複数の第１ベース値の合計値である複数の第１合計値をそれぞれ求め、複数の第１合計値に基づいて、複数の生体物質を定量する。

制御部１３０は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）と、プログラム格納されているＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）と、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）とを有する。ＣＰＵは、ＲＯＭから処理内容に応じたプログラムを読み出してＲＡＭに展開し、展開したプログラムと協働して定量装置１００の各ブロックの動作を集中制御する。このとき、記憶部に格納されている各種データが参照される。記憶部は、例えば不揮発性の半導体メモリ（いわゆるフラッシュメモリ）やハードディスクドライブである。制御部１３０は、コンピュータに、検出部で検出された複数の生体物質を標識物質で標識した生体標本画像からの光の強度分布を得る工程と、強度分布から、各標識物質にそれぞれ対応する複数のピーク値と、各標識物質の周辺領域にそれぞれ対応する複数の第１ベース値とを求める工程と、複数のピーク値のそれぞれと、複数の第１ベース値のうち対応する複数の第１ベース値との差分値である複数の差分値を求める工程と、検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して、複数の差分値をそれぞれ補正した複数の第１検出値を求める工程と、複数の第１検出値のそれぞれと、複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値の合計値である複数の第１合計値をそれぞれ求める工程と、複数の第１合計値に基づいて、複数の生体物質を定量する工程と、を実行させる、定量プログラムを実行させる。

制御部１３０は、通信部を介して、ＬＡＮ（Ｌｏｃａｌ Ａｒｅａ Ｎｅｔｗｏｒｋ）、ＷＡＮ（Ｗｉｄｅ Ａｒｅａ Ｎｅｔｗｏｒｋ）などの通信ネットワークに接続された外部の装置（例えばパーソナルコンピューター）との間で各種データの送受信を行う。制御部１３０は、例えば外部の装置から送信された画像データを受信し、この画像データ（入力画像データ）に基づいて画像診断を行う。通信部は、例えばＬＡＮカードなどの通信制御カードである。なお、定量装置１００は、表示部や出力部を有していてもよい。表示部は例えばディスプレイであり、出力部はたとえばプリンターである。

（シミュレーション）
本実施の形態に係る定量方法と、強度分布から自家蛍光を差し引いた状態で定量した方法と、強度分布から自家蛍光を差し引くことなく定量した方法とをシミュレーションした。

ここでは、生体物質を含まない生体標本から得られた自家蛍光画像と、強度積分値が一定の輝点信号が等間隔に配置された画像とを重ねた画像を評価用画像とした。次いで、評価用画像に対して、上記の３つの方法による輝点を定量した。

図５は、シミュレーション結果を示すグラフである。横軸は、輝点１個あたりの強度積分値を示しており、縦軸は、検出された輝点数を示している。実線は、本実施の形態に係る定量方法の結果を示しており、点線は、強度分布から自家蛍光を差し引いた状態で定量した方法の結果を示しており、一点鎖線は、強度分布から自家蛍光を差し引くことなく定量した方法の結果を示している。なお、本来検出されるべき輝点の強度積分値は、１１５０である。

図５の実線に示されるように、本実施の形態に係る定量方法による定量結果は、他の２つの方法と比較して、本来検出されるべき輝点の強度積分値に近く、かつばらつきも小さいことがわかった。強度分布から自家蛍光を差し引いた状態での定量結果は、自家蛍光の分だけ強度積分値が低くなってしまった。また、強度分布から自家蛍光を差し引くことなく定量した方法による定量結果は、自家蛍光の強度も積算しているため、本来検出されるべき輝点の強度積分値よりも高い値になっていまった。

（効果）
以上のように、本実施の形態では、検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して、第１合計値を求め、背景光の値を加えるため、標識物質からの光のピークが自家蛍光に部分的に埋もれる場合でも、本来検出されるべきピーク強度に補正できる。そして、補正したピーク強度に基づいて、生体物質を適切に定量できる。

［実施の形態２］
次に、本発明の実施の形態２に係る定量方法について説明する。

図６は、本発明の実施の形態２に係る定量方法のフローチャートである。実施の形態２に係る定量方法は、標識物質に対する透過率に関係する第２補正値を利用して、複数の第１ベース値をそれぞれ補正した複数の第２ベース値を求める工程をさらに有し、複数の第１合計値を求める工程に代えて、複数の第１検出値のそれぞれと、前記複数の第２ベース値のうち対応する複数の第２ベース値との合計値である複数の第２合計値をそれぞれ求める工程を行い、複数の生体物質を定量する工程では、複数の第１合計値に代えて複数の第２合計値に基づいて、複数の生体物質を定量する。すなわち、本実施の形態に係る定量方法は、生体標本画像を入力する工程と、第１強度分布を得る工程と、ピーク値と、第１ベース値とを求める工程と、差分値を求める工程と、第２ベース値を求める工程と、第２合計値をそれぞれ求める工程と、定量する工程と、を有する。

生体標本画像を入力する工程（Ｓ１１０）と、光の第１強度分布を得る工程（Ｓ１２０）と、ピーク値および第１ベース値を求める工程（Ｓ１３０）と、差分値を求める工程（Ｓ１４０）と、第１検出値を求める工程（Ｓ１５０）とは、実施の形態１に係る定量方法と同じであるため、その説明を省略する。

第２ベース値を求める工程では、標識物質に対する透過率に関係する第２補正値を利用して、複数の第１ベース値をそれぞれ補正した複数の第２ベース値を求める（Ｓ２８０）。

ここで、第２補正値は、周辺領域からの光の標識物質に対する透過率である。周辺領域からの光の標識物質に対する透過率が高い場合には、生体物質に対応するピーク値は、周辺領域からの光の強度と、生体物質を標識した標識物質からの光の強度との合計値となる。一方、周辺領域からの光の標識物質に対する透過率が低い場合には、生体物質に対応するピーク値は、周辺領域からの光の強度と、生体物質を標識した標識物質からの光の強度とのうち、高い方の強度となる。

透過率の求め方は特に限定されない。例えば、透過率は、赤色の蛍光を放出する蛍光体集積粒子を配置した生体標本に、緑色の蛍光を放出する蛍光体集積粒子を励起するための波長の光を照射したときの自家蛍光の蛍光体集積粒子が存在する領域における減衰量から求めることができる。

また、生体物質を標識した標識物質が１つの場合（輝点が１つの場合）には、生体物質に対応するピークは、周辺領域からの光の影響を受けにくいが、生体物質を標識した標識物質が検出部１１０の光学分解能以下の距離に接近している場合（複数の輝点が集合している場合）には、周辺領域からの光の影響を受けやすい。よって、複数の輝点が集合している場合には、自家蛍光の遮蔽効果が高くなる（減衰量が多くなる）。

そして、第２補正値を第１ベース値に乗じて第２ベース値を得る。

第２合計値を求める工程では、複数の第１合計値を求める工程に代えて、複数の第１検出値のそれぞれと、複数の第２ベース値のうち対応する第２ベース値との合計値である複数の第２合計値を求める（Ｓ２６０）。

第２合計値に基づいて、生体物質を定量する工程では、例えば、あらかじめ求めておいた検量線に基づいて、生体物質の量を定量できる（Ｓ１７０）。

（定量装置および定量プログラム）
検出部１１０は、実施の形態１と同様であるため、説明を省略する。

解析部１２０は、標識物質に対する透過率に関係する第２補正値を利用して、複数の第１ベース値をそれぞれ補正した複数の第２ベース値をさらに得る。また、解析部１２０は、複数の第１合計値を求める代わりに、複数の第１検出値のそれぞれと、複数の第２ベース値のうち対応する第２ベース値との合計値である複数の第２合計値を求める。最後に複数の生体物質を定量する際には、複数の第１合計値に代えて複数の第２合計値に基づいて、複数の生体物質を定量する。

制御部１３０には、コンピュータに、標識物質に対する透過率に関係する第２補正値を利用して、第１ベース値をそれぞれ補正した複数の第２ベース値を求める工程をさらに実行させ、複数の第１合計値を求める工程に代えて、複数の第１検出値のそれぞれと、複数の第２ベース値のうち対応する第２ベース値との合計値である複数の第２合計値を求める工程を実行させる。複数の生体物質を定量する工程では、制御部１３０には、コンピュータに、複数の第１合計値に代えて複数の第２合計値に基づいて、複数の生体物質を定量させる。

（効果）
以上のように、本実施の形態では、周辺領域からの光の標識物質に対する透過率である第２補正値をさらに考慮してピーク強度を補正するため、実施の形態１よりも、より高精度に補正でき、結果的に、補正したピーク強度に基づいて、生体物質を適切に定量できる。

本発明によれば、例えば、医薬のスクリーニング、医薬の作用機序の証明、医薬の毒性評価に有用である。

１００ 定量装置
１１０ 検出部
１２０ 解析部
１３０ 制御部

Claims (8)

1. 複数の生体物質を標識物質で標識した生体標本画像を入力する工程と、
   検出部で検出された前記生体標本画像からの光の第１強度分布を得る工程と、
   前記第１強度分布から、各前記標識物質にそれぞれ対応する複数のピーク値と、各前記標識物質の周辺領域にそれぞれ対応する複数の第１ベース値とを求める工程と、
   前記複数のピーク値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との差分値である複数の差分値を求める工程と、
   前記検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して、前記複数の差分値をそれぞれ補正した複数の第１検出値を求める工程と、
   前記複数の第１検出値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との合計値である複数の第１合計値を求める工程と、
   前記複数の第１合計値に基づいて、前記複数の生体物質を定量する工程と、
   を有する、定量方法。
2. 前記第１補正値は、前記検出部で検出された前記標識物質のみからの光に対応する第２強度分布において、ピーク値の積分値に対する前記第２強度分布または前記検出部で検出された前記標識物質のみからの光に対応する点拡がり関数の総積分値の比率である、請求項１に記載の定量方法。
3. 前記複数の第１ベース値は、前記第１強度分布において、ピークから離れた一定の範囲内における光の強度の平均値、中央値または最頻値である、請求項１または請求項２に記載の定量方法。
4. 前記周辺領域からの光の前記標識物質に対する透過率である第２補正値を利用して、前記複数の第１ベース値をそれぞれ補正した複数の第２ベース値を求める工程をさらに有し、
   前記複数の第１合計値を求める工程に代えて、前記複数の第１検出値のそれぞれと、前記複数の第２ベース値のうち対応する第２ベース値との合計値である複数の第２合計値を求める工程を行い、
   前記複数の生体物質を定量する工程では、前記複数の第１合計値に代えて前記複数の第２合計値に基づいて、前記複数の生体物質を定量する、
   請求項１～３のいずれか一項に記載の定量方法。
5. 複数の生体物質を標識物質で標識した生体標本画像からの光の第１強度分布を検出するための検出部と、
   前記第１強度分布を解析するための解析部と、を有し、
   前記解析部は、
   前記検出部で検出された前記生体標本画像からの光の前記第１強度分布を得て、
   前記第１強度分布から、各前記標識物質にそれぞれ対応する複数のピーク値と、各前記標識物質の周辺領域にそれぞれ対応する複数の第１ベース値とを求め、
   前記複数のピーク値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との差分値である複数の差分値を求め、
   前記検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して、前記複数の差分値をそれぞれ補正した複数の第１検出値を求め、
   前記複数の第１検出値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との合計値である複数の第１合計値を求め、
   前記複数の第１合計値に基づいて、前記複数の生体物質を定量する、
   定量装置。
6. 前記解析部は、前記周辺領域からの光の前記標識物質に対する透過率である第２補正値を利用して、前記第１ベース値をそれぞれ補正した複数の第２ベース値をさらに求め、
   前記解析部は、
   前記複数の第１合計値を求める代わりに、前記複数の第１検出値のそれぞれと、前記複数の第２ベース値のうち対応する第２ベース値との合計値である複数の第２合計値を求め、
   前記複数の生体物質を定量する際には、前記複数の第１合計値に代えて前記複数の第２合計値に基づいて、前記複数の生体物質を定量する、
   請求項５に記載の定量装置。
7. コンピュータに、
   検出部で検出された複数の生体物質を標識物質で標識した生体標本画像からの光の第１強度分布を得る工程と、
   前記第１強度分布から、各前記標識物質にそれぞれ対応する複数のピーク値と、各前記標識物質の周辺領域にそれぞれ対応する複数の第１ベース値とを求める工程と、
   前記複数のピーク値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値とのそれぞれの差分値である複数の差分値を求める工程と、
   前記検出部の光学分解能に関係する第１補正値を利用して、前記複数の差分値をそれぞれ補正した複数の第１検出値を求める工程と、
   前記複数の第１検出値のそれぞれと、前記複数の第１ベース値のうち対応する第１ベース値との合計値である複数の第１合計値をそれぞれ求める工程と、
   前記複数の第１合計値に基づいて、前記複数の生体物質を定量する工程と、
   を実行させる、定量プログラム。
8. 前記コンピュータに、
   前記周辺領域からの光の前記標識物質に対する透過率である第２補正値を利用して、前記第１ベース値をそれぞれ補正した複数の第２ベース値を求める工程をさらに実行させ、
   前記複数の第１合計値を求める工程に代えて、前記複数の第１検出値のそれぞれと、前記複数の第２ベース値のうち対応する第２ベース値との合計値である複数の第２合計値を求める工程を実行させ、
   前記複数の生体物質を定量する工程では、前記複数の第１合計値に代えて前記複数の第２合計値に基づいて、前記複数の生体物質を定量させる、
   請求項７に記載の定量プログラム。