BE1024148B1 - Compositions et utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des compositions immunogènes et des procédés de production associés, et notamment des compositions immunogènes comprenant un antigène protéique réticulé à un adjuvant oxoadénine.

Description

COMPOSITIONS ET UTILISATIONS

DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION

La présente invention concerne des compositions immunogènes et des procédés de création de vaccins auto-adjuvants et d'immunothérapies auto-adjuvantes comprenant des conjugués antigène-adjuvant et des procédés de production associés. Plus particulièrement, 1'invention concerne une composition immunogène comprenant un antigène protéique réticulé à un adjuvant oxoadénine.

CLAUSE DE SOUTIEN GOUVERNEMENTAL

Des aspects de la présente invention ont été réalisés avec le gouvernement des États-Unis en vertu du contrat #HHSN272200900036C avec le NIH ; le gouvernement peut avoir certains droits sur l'invention.

CONTEXTE

Des adjuvants efficaces et inoffensifs sont utilisés pour fabriquer des vaccins sous-unitaires et des immunothérapies suffisamment immunogènes. Le simple mélange d'un adjuvant avec des vaccins sous-unitaires ou avec des immunothérapies nécessite souvent l'ajout de quantités d'adjuvant qui peuvent conduire à des effets secondaires indésirables. Un tel mélange peut nécessiter la mise au point d'un processus très exigeant et coûteux et la caractérisation du produit, peut conduire à une faible durée de conservation, ou peut résulter en une incapacité à congeler ou lyophiliser le produit final. En outre, les exigences de dosage de l'adjuvant peuvent conduire à un rétablissement des effets secondaires indésirables. En conséquence, il est nécessaire d'améliorer l'efficacité des immunothérapies et vaccins sous-unitaires avec adj uvants.

Pour une présentation optimale des antigènes aux lymphocytes T, les antigènes et les adjuvants doivent non seulement être absorbés par la même cellule présentatrice d'antigène, mais aussi être absorbés par le même phagosome (Medzhitoy, Nature 2006, Vol. 440). Les mélanges antigène/adjuvant classiques nécessitent souvent de grandes quantités d'adjuvant pour assurer que les deux sont phagocytés simultanément. Un excès d'adjuvant conduit à une réactogénicité ouverte qui limite l'utilité de ces systèmes d'adjuvant.

RESUME DE L’INVENTION

Dans un premier aspect, l'invention concerne une composition immunogène comprenant un composé oxoadénine lié à un antigène. Le composé oxoadénine est, de manière adaptée, une 1-méthyl-butoxy-oxoadénine ayant un substituant pipéridinyle. Les composés oxoadénine de la présente invention et les procédés pour la synthèse de composés oxoadénine sont décrits dans le document WO2010/018134.

Dans un aspect, le composé oxoadénine comprend la formule (1) :

dans laquelle ; R1 est un groupe alcoxy en C1-6 ramifié ou saturé ; R2 est un groupe ayant la structure :

n est un nombre entier ayant une valeur de 1 à 6 ; et

Het est un hétérocycle saturé à 6 chaînons contenant un atome d'azote, dans lequel Het est attaché à la fraction -(CH2)n- au niveau de tout atome de carbone de l'hétérocycle ; ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celle- ci .

Dans un autre mode de réalisation, R1 est un groupe n-butyloxy.

Dans un autre mode de réalisation, R1 est un groupe (1S)-1-méthylbutoxy

Dans un autre mode de réalisation, n vaut 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. 4)

Dans un aspect de l'invention, la molécule d'oxoadénine est le composé A.

Dans un aspect de l'invention, la molécule d'oxoadénine est le composé B.

Dans un aspect, l'invention concerne une composition immunogène comprenant un composé oxoadénine lié à un antigène dans lequel le composé oxoadénine est lié à l'antigène via un agent de réticulation. Dans un aspect de l'invention, l'agent de réticulation lié à 1'oxoadénine est un composé hydrophile.

Dans un autre aspect de l'invention, l'ajout de l'agent de réticulation à 1'oxoadénine augmente la solubilité aqueuse de l'oxoadénine comparé à la solubilité en l'absence de l'agent de réticulation.

Dans un autre aspect de l'invention, l'oxoadénine active est davantage soluble dans l'eau que l'oxoadénine inactive.

Dans un autre aspect de l'invention, la solubilité aqueuse accrue de l'oxoadénine active fournie par l'agent de réticulation diminue la quantité d'agrégat non souhaité dans la composition de conjugué antigène-adjuvant, comparé à l'oxoadénine active ne présentant pas de solubilité accrue.

Dans un aspect, l'agent de réticulation lié à l'oxoadénine est un composé chargé.

Dans un aspect, l'agent de réticulation est un agent de réticulation amine-à-sulfhydryle.

Dans un aspect, l'agent de réticulation contient un ester de N-hydroxysuccinimide (ester de NHS) et des groupes réactifs maléimide aux extrémités opposées de l'agent de réticulation.

Dans un aspect, l'agent de réticulation lié à l'oxoadénine est le GMBS, (ester de N-gamma-maléimidobutyryl-oxysuccinimide)

Agent de réticulation hétéro-bifonctionnel, GMBS

Dans un aspect, l'agent de réticulation GMBS est initialement mis à réagir avec l’oxoadénine et l’active.

Dans un aspect, l'agent de réticulation GMBS est initialement mis à réagir avec l'antigène et l’active.

Dans un autre aspect, l’agent de réticulation comprend le réactif de Traut (2-iminothiolane). Réactif de réticulation de Traut (2-iminothiolane HCl)

Dans un aspect, l'agent de réticulation GMBS est lié à l'oxoadénine via le réactif de Traut.

Dans un aspect particulier, l'agent de réticulation a la structure suivante :

Dans un aspect, l'antigène est directement conjugué au GMBS et l'adjuvant est directement conjugué au réactif de Traut (ce à quoi il est fait référence, dans le présent document, comme à la « chimie T »)

Composé B + 2-iminothiolane

Dans un autre aspect, l'adjuvant est directement conjugué au GMBS alors que l'antigène est directement conjugué au réactif de Traut (ce à quoi il est fait référence, dans le présent document, comme à la « chimie G »)

Lorsqu'il est réticulé pour former le conjugué antigène-adjuvant, le conjugué peut être décrit comme ayant les chimies G ou T suivantes :

Chimie G Chimie T

Dans un aspect de l'invention, l'antigène est conjugué à l'oxoadénine via l'agent de réticulation. Dans le contexte de la présente invention, l'antigène conjugué à l'adjuvant par l'agent de réticulation induit une réponse spécifique de l'antigène lorsqu'il est administré à un sujet, et dans un aspect particulièrement approprié de l'invention, la composition immunogène induit une réponse immunitaire spécifique en l'absence d'autre adjuvant supplémentaire (par exemple, d'alun), dans un aspect, une réponse immunitaire spécifique cliniquement significative

Dans un aspect de l'invention, l'antigène est un antigène de la toxine diphtérique, et dans un aspect particulier de l'invention, il est « CRM » 197 (Cross Reactive Material 197).

Dans un autre aspect de l'invention, l'antigène est un antigène du cytomégalovirus (« CMV ») , et dans un aspect particulier de l'invention, un antigène gB du CMV.

Dans un autre aspect de l'invention, l'antigène est un antigène du cytomégalovirus (« CMV ») , et dans un aspect particulier de l'invention, un antigène gB du CMV LVL759.

Dans un autre aspect de l'invention, l'antigène est un antigène de l'hépatite B, et dans un aspect particulier de 1'invention un antigène de surface de l'hépatite B (« HBsAg »).

Dans un autre aspect de l'invention, l'antigène est un antigène de la varicelle ou de la varicelle et du zona (« VZV ») , et dans un aspect particulier de l’invention, un antigène gE du VZV.

Dans un autre aspect de l'invention, l'antigène est un antigène tumoral, et dans un aspect particulier de l’invention, un antigène MAGE ou un antigène BRAME.

Dans un autre aspect de l'invention, l'antigène est un antigène du virus influenza, et dans un aspect particulier de l'invention, un antigène HA.

Dans un autre aspect de l'invention, l'antigène est un antigène du VIH, et dans un aspect particulier de l'invention, un antigène gag du VIH ou un antigène env du VIH.

Dans un autre aspect de l'invention, la molécule d'oxoadénine est liée à l'antigène via un agent de réticulation et dans lequel l'agent de réticulation est un composé hydrophile et de préférence permet ainsi d'augmenter la solubilité aqueuse de l'oxoadénine comparé à la solubilité en l'absence de l'agent de réticulation.

Dans un autre aspect, l'invention comprend une oxoadénine active pour des fins de réticulation dans lequel l'oxoadénine active est plus soluble dans l'eau que l'oxoadénine inactive.

Dans un autre aspect de l’invention, une oxoadénine active ayant une solubilité aqueuse accrue fournie par l'agent de réticulation réduit ainsi la quantité d'agrégat non souhaité dans la composition immunogène, comparé à l'oxoadénine active ne présentant pas de solubilité accrue.

Dans un autre aspect de l'invention, le nombre de molécules adjuvantes conjuguées à un antigène (le « nombre de copies ») pour la population de conjugués antigène-adjuvant dans la composition immunogène se trouve dans une plage souhaitée, en particulier entre 3 et 6 molécules adjuvantes conjuguées à un antigène, où le nombre de copies représente la « moyenne approximative » du véritable nombre d'immunoeffecteurs par molécule d'antigène d'une formulation.

Dans un autre aspect de l'invention, une première composition immunogène comprenant le conjugué antigène-adjuvant induit une réponse immunitaire accrue comparée à une seconde composition immunogène ayant des quantités égales d'antigène et d'adjuvant par rapport à la première composition immunogène, mais dans laquelle l'adjuvant et l'adjuvant ne sont pas conjugués l'un à l'autre (par exemple, l'adjuvant et l'antigène sont mélangés).

Les termes « aspects » de l'invention et « modes de réalisation » de l'invention ont la même signification, sont utilisés de manière interchangeable dans le présent document et sont destinés à signifier une description supplémentaire mais non restrictive de 1'invention.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

Figure 1. Diagramme de flux de processus de la chimie T, un antigène activé avec du GMBS conjugué à un adj uvant.

Figure 2. SM MALDI-TOF d'un antigène (1), de l'antigène conjugué au GMBS (2) et de l'antigène conjugué à un adjuvant (3). Les décalages de masse moléculaire indiquent une moyenne de 11 copies de GMBS par antigène et une moyenne de 3 copies d'adjuvant par antigène.

Figure 3. SDS-PAGE d'un antigène et d'un conjugué antigène-adjuvant en utilisant un gène Bis-Tris à 10 %. Le gel présente une augmentation de la masse moléculaire du conjugué antigène-adjuvant dans la voie 3 comparé à l'antigène non conjugué dans la voie 2.

Figure 4. Chromatogramme RP-HPLC présentant l'antigène témoin (haut), le conjugué antigène-adjuvant avant la purification par échange d'anions (milieu) et le conjugué antigène-adjuvant final après la purification (bas). Des petites quantités d'adjuvant non conjugué libre ont été observées avec un temps de rétention de 10,2 minutes dans l'échantillon avant l'échange d'anions (milieu) qui ont été éliminées après l'échange d'anions (bas).

Figure 5. Chromatogramme SEC-HPLC d'un antigène (haut) et d'un conjugué antigène-adjuvant (bas) présentant une petite quantité de dimère dans le conjugué (< 5 %).

Figure 6 : données présentant une RP-HPLC de fractions collectées durant la chromatographie par échange d'ions d'un conjugué du composé B.

Figure 7 : activation de TLR7 à de très faibles doses par les conjugués CRM-composé A à faible nombre de copies et CRM-composé A à nombre de copies élevé en utilisant la lignée de cellules rapporteuses stables TLR7/NF-kB/SEAP par Imgenex. Les conjugués CRM-composés A (nombre de copies plus faible ou nombre de copies plus élevé) activent la voie du TLR7 humain aussi efficacement que le composé A seul.

Figure 8 : étude de détermination de doses du composé A-CRM mettant en évidence qu'une dose-réponse en termes d’IgG spécifique du CRM est observée avec les conjugués CRM-composé A chez des souris BALB/c de 2 origines différentes en utilisant la chimie T et la chimie G.

Figure 9 : étude de preuve de concept chez des souris mettant en évidence que les conjugués antigène-adjuvant induisent une réponse humorale significative basée sur un anticorps spécifique de CRM197.

Figure 10a : étude de preuve de concept chez des souris mettant en évidence que les conjugués fusionnés CRM-composé B sont plus efficaces même avec 10 x moins d'adjuvant pour monter une réponse humorale significative basée sur l’anticorps spécifique de CRM197.

Figure 10b : l'évaluation de l'activation des lymphocytes T de splénocytes de souris immunisées met en évidence que le conjugué fusionné CRM-composé B déclenche une plus grande activation des lymphocytes T spécifiques de CRM197 comparé au mélange CRM + composé B à une concentration 1 X ou 10 X.

Figure lia et 11b : niveaux d'anticorps spécifiques du CRM 7 jours après la 2ème et la 3ème injection ; l'immunogénicité met en évidence que le CRM-oxoadénine est un conjugué antigène-adjuvant puissant.

Figure 12a : analyse des IgG spécifiques de gB (réponse humorale) à partir de conjugué de gB vs un témoin gB sans adjuvant chez des souris.

Figure 12b : analyse de l'immunité à médiation cellulaire (CMI) pour évaluer la réponse CD4-IFNy chez les souris.

Figure 13 : détermination de dose chez des porcs d'élevage pour tester deux types de conjugués CRM-composé A (G) vs CRM-composé A (T).

Figure 14 : test de la réponse humorale (des anticorps) spécifique de CRM de trois différents conjugués TLR7/8-ligands chez des porcs d'élevage Yorkshire-Landrace-Duroc en utilisant la voie intramusculaire pour l'immunisation.

Figure 15 : réponse des anticorps déclenchée par des conjugués fusionnés vs des témoins sans adjuvant après immunisation intradermique chez des porcs d'élevage (Yorkshire-Landrace).

Figure 16 : évaluation de l'immunogénicité de HBsAg conjugué au composé B vs un mélange en utilisant la voie d'immunisation intradermique chez le modèle intradermique de porcs d'élevage Yorkshire-Landrace Duroc. Une comparaison est également réalisée avec la voie intramusculaire (HBsAg + alun).

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

La présente invention est décrite en termes connus et appréciés par les hommes du métier. Pour la facilité de référence, certains termes seront ci-après définis. Toutefois, le fait que certains soient définis ne sera pas considéré comme indiquant que les termes définis sont utilisés de manière incohérente avec leur signification ordinaire ni, en variante, que les termes non définis sont indéfinis ou pas utilisés dans leur signification ordinaire et acceptée. En revanche, tous les termes utilisés dans le présent document sont supposés décrire l'invention de telle sorte que l'homme du métier pourra apprécier la portée de la présente invention. Les définitions suivantes sont destinées à clarifier, de manière non restrictive, les termes définis.

Les références à un groupe « alkyle » comprennent des références à des isomères aliphatiques à chaîne linéaire et à chaîne ramifiée du groupe alkyle correspondant, contenant jusqu'à 8 atomes de carbone, par exemple jusqu'à 6 atomes de carbone, ou jusqu'à quatre atomes de carbone, ou jusqu'à deux atomes de carbone, ou un atome de carbone. Ces références au groupe « alkyle » sont également applicables lorsqu'un groupe alkyle fait partie d'un autre groupe, par exemple un groupe alkylamino ou un groupe alcoxy. Des exemples de ces groupes alkyle et groupes contenant des groupes alkyle sont des groupes alkyle en Ci-s, alkyle en Ci-6, (alkyl en Ci-e) amino, et alcoxy en Ci-6.

Les références à un « hétérocycle » ou un groupe « hétérocyclyle » font référence à un cycle aliphatique hétérocyclique saturé, monocyclique, contenant des atomes de carbone et un hétéroatome, ledit hétéroatome étant un atome d'azote. Un tel cycle hétérocyclique est un groupe pipéridine ou pipéridinyle.

Dans un premier aspect, l'invention concerne une composition immunogène comprenant un composé oxoadénine lié à un antigène, dans lequel 1'oxoadénine est substituée au niveau de la position C9 avec une fraction pipéridinylalkyle.

Les composés oxoadénine de la présente invention et les procédés pour leur synthèse sont décrits dans le document W02010/018134.

Un composé de formule 1

dans lequel ; R1 est un groupe alcoxy en Ci-ç, ramifié ou saturé ; R2 est un groupe ayant la structure :

n est un nombre entier ayant une valeur de 1 à 6 ; et

Het est un hétérocycle saturé à 6 chaînons contenant un atome d'azote, dans lequel Het est attaché à la fraction -(CH2)n- au niveau de tout atome de de l'hétérocycle ; ou des sels pharmaceutiquement acceptables de celui-ci. 4)

Des exemples de composés oxoadénine comprennent :

Dans un mode de réalisation particulier, le composé oxoadénine est le composé A

Dans un autre mode de réalisation particulier, le composé oxoadénine est le composé B.

Conjugaison

Les composés oxoadénine sont connus pour agir comme des immunopotentialisateurs et/ou des adjuvants. Ces composés oxoadénine sont couplés de façon covalente aux antigènes comme, par exemple, CRM197 (inactivé par la mutation 197 dans la toxine diphtérique) ou gB recombinant (du cytomégalovirus humain). De nombreuses réactions chimiques sont disponibles pour réticuler les amines et les molécules contenant des groupes thiol (voir Hermanson 2nd Edition). Plusieurs autres classes d'agents de réticulation hétérobifonctionnels peuvent être utilisées pour contrôler la position des agonistes de TLR sur l'antigène en se basant sur le site de réticulation et la longueur/composition du lieur. L'utilisation de différentes stratégies de conjugaison peut produire des réponses plus ou moins efficaces ; la stratégie de conjugaison doit être rigoureusement sélectionnée pour fournir l'activité souhaitée.

Des variantes de stratégie sont décrites dans le présent document. Dans une stratégie, à laquelle on fait référence comme au processus de chimie G, le fragment de protéine antigénique est mis en réaction avec un nucléophile de réticulation (par exemple un lieur, par exemple, le réactif de Traut). Le composé oxoadénine est activé avec un électrophile de réticulation complémentaire (par exemple, le GMBS) et ensuite ajouté à l'antigène actif pour terminer la conj ugaison.

Dans une variante de stratégie, le processus de chimie T, l'agoniste du TLR (par exemple, le COMPOSÉ A) est mis à réagir avec un réactif de réticulation ou un lieur (par exemple, le réactif de Traut) . Ensuite, le TLR et le matériau de réticulation fixé sont mis à réagir avec l'antigène actif avec le GMBS.

Plus spécifiquement, dans le processus de chimie T, représentant un mode de réalisation de la présente invention,

Dans un aspect, le GMBS se lie à l'antigène via une liaison amide et le conjugué antigène-GMBS est alors purifié pour éliminer tout GMBS non conjugué. Le nombre de copies du GMBS par antigène est alors déterminé en utilisant des techniques de spectrométrie de masse. Ensuite, l'antigène activé par le GMBS est conjugué à l'adjuvant via le groupe thiol libre sur l'adjuvant. Le groupe thiol libre peut faire partie de 1'oxoadénine ou de la structure oxoadénine modifiée. En variante, le groupe thiol libre peut aussi être ajouté au noyau oxoadénine, par exemple par l'utilisation d'un réactif de réticulation (par exemple, le réactif de Traut). Le nombre de copies de molécules d'adjuvant réticulées à l'antigène est déterminé et la composition est purifiée et caractérisée. Figure 1 (schéma).

Plus particulièrement, la chimie T peut impliquer : (i) l'ajustement du pH du fragment de protéine antigènique avec un tampon tel qu'un tampon de Good (par exemple, la bicine) à un pH supérieur à 7, (ii) l'activation du fragment de protéine antigénique tamponné ayant un pH supérieur à 7 avec un agent de réticulation (par exemple, le GMBS) ; (iii) le retrait de l'agent de réticulation en excès (GMBS) au moyen d'une ultrafiltration centrifuge de purification ; (iv) la conjugaison avec un excès d'adjuvant-matériau de réticulation (par exemple, composé A-Traut) ; (v) le retrait de l'excès de TLR-matériau de réticulation par ultrafiltration centrifuge de purification et/ou chromatographie par échange d'ions ; (vi) la filtration avec un filtre seringue en PVDF pour produire une protéine conjuguée stérile de 1'invention.

En outre, des groupes protecteurs peuvent être requis pour prévenir la dimérisation du peptide activé, par exemple, coiffer les groupes thiol libres sur l'antigène lorsque le processus utilise la conjugaison via une liaison thiol.

Purification par chromatographie par échange d'ions : dans les cas où la solubilité limitée de l'adjuvant ou de 1'adjuvant-lieur (Traut) empêche la purification complète de l'adjuvant non conjugué par ultrafiltration, il peut être nécessaire d'utiliser la chromatographie échangeuse d'ions pour éliminer 1'adj uvant.

Dans encore un autre aspect, un antigène protéique est conjugué à une oxoadénine (par exemple, COMPOSÉ A) conformément à la « chimie T » en réalisant les étapes suivantes : Étape 1 : ajustement du pH de la protéine à 7,4

Étape 2 : pré-dissolution du GMBS dans du DMSO à ~ 1 mg/mL

Étape 3 : équilibrage de la protéine à 25°C Étape 4 : ajout des équivalents nécessaires de GMBS à la protéine Étape 5 : soumission à un vortex pendant 10 secondes pour mélanger

Étape 6 : permettre à l'activation d'avoir lieu pendant 0,5 h à 25°C

Étape 7 : transfert de la protéine dans un tube de centrifugation Amicon de 15 mL avec un MWCO 30 kD

Étape 8 : lavage de la protéine 3 X avec 15 mL chaque fois en utilisant de la bicine 20 mM, pH = 7,4, tampon NaCl 0,15 M Étape 9 : reconstitution de la protéine à 0,5 mg/mL dans un tampon de lavage et prélèvement d'une aliquote pour SM MALDI-TOF. Étape 10 : préparation du composé A-réactif de Traut par dissolution du composé A dans du DMF/H2O (9/1) à 25 mg/mL et ajout de 1 équivalent de 2-imminothiolane dissous dans du DMF/H2O (9/1) à 25 mg/mL et 2,5 équivalents de diisopropyléthylamine. On a laissé la réaction sous incubation à 25°C pendant 45 minutes et on l'a testée par CLSM pour surveiller la réaction. Étape 11 : ajout d'équivalents de composé A-Traut à la protéine activée et soumission à vortex pendant 10 secondes pour mélanger Étape 12 : on laisse la conjugaison avoir lieu à température ambiante. Étape 13 : à t = 2 h, prélèvement d'une aliquote et vérification de celle-ci par SM MALDI-TOF pour déterminer combien de copies du composé A devaient être ajoutées à la protéine.

Étape 14 : le nombre de copies du composé A étant suffisant, transfert de la solution de réaction à un tube de centrifugation Amicon de 15 mL avec un MWCO 30 kD

Étape 15 : lavage de la protéine 5 X avec 15 mL chaque fois en utilisant de la bicine 20 mM, pH = 7,4, un tampon NaCl 0,15 M Étape 16 : reconstitution de la protéine à

0,5 mg/mL dans un tampon de lavage et une aliquote prélevée par SM MALDI-TOF et analyse par CLHP Étape 17 : stérilisation du conjugué par filtration en utilisant un filtre en PVDF de 0,22 micron

Étape 18 : stockage du conjugué à 2 à 8°C

Dans le procédé, les groupes thiol libres peuvent provoquer la formation de dimère et de trimère. Pour contrôler la survenue de thiols libres et ainsi minimiser la formation de dimères et de trimères, les groupes thiol libres sont coiffés avec l'IAA ou le NHM de la manière suivante : 1. Coiffage des groupes thiol libres dans l'antigène (par exemple, gB) par traitement pendant 10 minutes avec 1' IAA, ou le NHM puis purification par ultrafiltration pour éliminer l'excès. 2. Activation avec 20 à 40 équivalents de GMBS,

mise en réaction pendant 30 min à TA 3. Purification de l'excès de GMBS par

ultrafiltration centrifuge avec un MWCO fr 30 kD 4. Conjugaison avec 20 excès molaires de 668-Traut pendant 2 à 12 heures 5. Purification par ultrafiltration centrifuge avec un MWCO de 30 kD pour éliminer l'excès de composé A-Traut 6. Stérilisation par filtration avec un filtre seringue en PVDF de 0,22 pm

7. Caractérisation de conjugués par MALDI-TOF, RP et SEC-CLHP, LAL, et BCA

Les conditions de réaction (temps, stœchiométrie, base) peuvent varier en fonction de l'adjuvant conjugué et de la réactivité de l'amine primaire/secondaire, du sel HCl vs base libre, de la solubilité, etc. Les conditions de réaction et les procédés de purification peuvent également varier en fonction des propriétés de l'antigène y compris de la séquence, de la stabilité, de la taille, de la solubilité, etc.

Nombre de copies

Dans un mode de réalisation, un composé oxoadénine est lié de façon covalente à la molécule CRM197 avec trois molécules d'oxoadénine par molécule d'antigène CRM. Le nombre de copies d'oxoadénine conjuguée peut être contrôlé par de multiples variables. Par exemple, dans le cas de la réticulation par le GMBS, certaines des variables qui permettent de contrôler le nombre de copies sont : 1'excès de GMBS utilisé pour réagir avec l'antigène, la température de réaction, le type de tampon, la concentration de réaction, le pH de réaction et finalement, l'excès d'oxoadénine activée durant l'étape d'ajout final. La relation stœchiométrique des molécules d'adjuvant avec l'antigène est déterminée en utilisant des techniques connues dans l'art et dans un aspect de l'invention, par spectrométrie de masse. Le nombre de molécules d'adjuvant conjuguées à un antigène variera typiquement pour tout nombre de molécules donné. Dans un aspect de l'invention, le nombre de molécules d'adjuvant conjuguées à l'antigène sera présent sous la forme d'une distribution gaussienne. Dans un autre aspect de l'invention, dans une majorité des conjugués antigène-adjuvant dans une composition, le rapport de l'antigène sur les molécules d'adjuvant est le nombre de copies. Par conséquent, le terme « nombre de copies » et la relation stœchiométrique des composés immunostimulateurs/immunopotentialisateurs avec l'antigène telle que mesurée par spectrométrie de masse ou d'autres procédés représente une moyenne du véritable nombre d'immunoeffecteurs par molécule d'antigène d'une formulation.

Dans un aspect de l'invention, le nombre moyen de copies est de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou compris entre 1 et 6, 2 et 5, et 3 et 4 molécules d'oxoadénine par molécule d'antigène.

ANTIGÈNES

Les formulations immunogènes de la présente invention comprennent un ou plusieurs antigènes. Dans certains aspects de 1'invention, une composition immunogène peut comprendre plus d'un type d'antigène, dans laquelle tous les antigènes sont conjugués à un adjuvant alors que dans un autre aspect, une composition immunogène peut comprendre plus d'un type d'antigène dans laquelle au moins un type d'antigènes est conjugué à un adjuvant, mais un autre type d'antigènes peut n'être pas conjugué. Dans un aspect de l'invention, ces antigènes peuvent être sélectionnés dans le groupe constitué de : la diphtérie, l'antigène de surface de l'hépatite B, la glycoprotéine b (gB) du cytomégalovirus (CMVj et la glycoprotéine E (gE) du virus de la varicelle et du zona (VZV). Lorsqu'ils sont administrés, les antigènes seront typiquement présents en une concentration finale d'au moins 1 pg/mL chacun, par exemple 1 pg/mL ou dans les plages de 1 à 20 pg/mL, de 2 à 15 pg/mL, de 2,5 à 10 pg/mL, de 3 à 8 pg/mL, ou de 4 à 6 pg/mL ou de 5 pg/mL. En outre, dans un autre aspect de l'invention, les antigènes peuvent être présents dans une plus vaste plage de concentrations finales, par exemple de 1 à 200 pg/mL et de 1 à 50 pg/mL. En général, la concentration de tout antigène sera suffisante pour éliciter une réponse immunitaire contre cet antigène. On préfère que l'efficacité de protection des antigènes individuels ne soit pas supprimée en les combinant, bien que l'immunogénicité elle-même (par exemple, les titres ELISA) puisse être réduite.

Alors qu'au moins l'un des antigènes dans la composition immunogène est conjugué à un adjuvant selon la présente invention, dans un autre mode de réalisation de l'invention d'autres antigènes supplémentaires ne sont pas ainsi conjugués. Par exemple, dans une composition immunogène de la présente invention, un premier antigène est conjugué à un adjuvant oxoadénine, alors qu'un second antigène différent dans la composition immunogène n'est pas conjugué à un adjuvant oxoadénine. Dans ces modes de réalisation, l'antigène supplémentaire peut être libre ou, à titre d'exemple, peut être adsorbé à une particule ou un vecteur, par exemple être adsorbé à un sel d'aluminium, tel que 1'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium ou à un mélange d'hydroxyde d'aluminium et de phosphate d'aluminium.

Les antigènes de la présente invention seront typiquement des antigènes protéiques. Les antigènes dans les compositions immunogènes de l'invention seront présents en « quantités immunologiquement efficaces », en d'autres termes, l'administration de cette quantité à un individu, en une dose unique ou comme une partie d'une série de doses, est efficace pour le traitement ou la prévention d'une maladie. La posologie peut être un régime à dose unique ou un régime à doses multiples (par exemple, comprenant des doses de rappel) .

Fragment(s) de l'antigène. Les fragments de l'antigène (abrégé par « Ag » dans le présent document) utilisés dans la présente invention ont typiquement certaines propriétés utiles dans la conjugaison. Dans un aspect, les fragments de l'antigène sont des protéines qui sont stables en solution et pas susceptibles à l'agrégation substantielle. Dans un autre aspect, le fragment de l'antigène contient un minimum de trois amines disponibles au niveau desquelles la conjugaison peut se produire et présentant une taille inférieure à 500 kD. Dans un autre aspect, les caractéristiques ou propriétés préférées comprennent : une solubilité du fragment de l'antigène supérieure à 1 mg/mL, un monomère ou un oligomère (de préférence un monomère), et une taille inférieure à 150 kD.

Ces fragments sont facilement disponibles dans le commerce et/ou peuvent être facilement préparés par les hommes du métier. Les fragments de l'antigène qui peuvent être utilisés dans l'invention comprennent, par exemple, ceux exposés dans le tableau 1, ci-dessous.

Tableau 1

* avant détox : stocker à 20°C dans du glycérol ; après détox : un mois à 4°C.

Dans certains aspects de l'invention, les candidats antigènes peuvent comprendre des antigènes de la coqueluche, des antigènes du tétanos, des antigènes de rhinovirus, des antigènes TB, des antigènes allergiques, et des antigènes du paludisme. CRM197

La présente invention peut comprendre un antigène diphtérique, par exemple une anatoxine diphtérique. La préparation des anatoxines diphtériques (DT) est bien documentée. Toute anatoxine diphtérique appropriée peut être utilisée. Par exemple, la DT peut être produite par purification de la toxine d'une culture de Corynebacterium diphtheriae suivie par la détoxification chimique, mais est en variante réalisée par purification d'un analogue recombinant, ou génétiquement détoxifié de la toxine (par exemple, CRM197, ou d'autres mutants tels que décrits dans les documents US 4 709 017, US 5 843 711, US 5 601 827, et US 5 917 017).

Dans un aspect de l'invention, CRM197 est une forme non toxique de la toxine diphtérique mais n'est pas dif f érenciable, sur le plan immunologique, de la toxine diphtérique. CRM197 est produit par C. diphtheriae infecté par le phage bêta non toxigène 197tox- créé par la mutagenèse par la nitrosoguanidine du corynephage b toxigène (Uchida et al. Nature New Biology 233 ; 8-11). La protéine CRM197 a la même masse moléculaire que la toxine diphtérique mais diffère de celle-ci par une simple modification de bases dans le gène structural. Ceci conduit à une modification d'acides aminés glycine à glutamine en position 52 qui rend le fragment A incapable de se lier au NAD et par conséquent non toxique (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46 ; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept 1983 p560-564).

gB du CMV

Dans un aspect de la présente invention, l'antigène est dérivé d'un cytomégalovirus (CMV). Dans un mode de réalisation particulier, l'antigène est un polypeptide gB qui comprend, de manière adaptée, au moins une partie d'un domaine extracellulaire de la protéine gB. Le domaine extracellulaire peut en outre comprendre un domaine de boucle de fusion 1 (FLl) et un domaine de boucle de fusion 2 (FL2), dans lequel au moins l'un des domaines FLl et FL2 comprend au moins une délétion ou substitution d'acides aminés. Dans un autre mode de réalisation, l'antigène est la protéine gB recombinante tronquée, délétée d'une partie du domaine transmembranaire, du domaine cytoplasmique, ainsi que d'une partie de la séquence de tête, facultativement sous une forme tronquée ayant des mutations supplémentaires dans les boucles de fusion FL1 et FL2 de gB.

On a observé que les polypeptides gB de l’art antérieur, tels que le polypeptide gB du CMV ne possédant pas de domaine transmembranaire, présentaient une hétérogénéité dans la partie N-terminale du polypeptide. Une population homologue doit être comprise comme une population principalement constituée d’un polypeptide mature unique, le polypeptide commençant invariablement par un acide aminé donné identique au niveau de l'extrémité N-terminale. Dans la présente invention, un polypeptide « mature » fait référence à un polypeptide dans lequel la séquence signal a été supprimée par clivage. Dans la présente invention, dans une population homogène N-terminale, plus de 30 %, de manière appropriée au moins 80 %, de manière davantage appropriée de 80 % à 90 %, de manière davantage appropriée au moins 99 % des polypeptides matures produits après le clivage de la séquence signal commencent avec le même acide aminé au niveau de l'extrémité N-terminale. En conséquence, dans un mode de réalisation, l'invention concerne une préparation comprenant une population de polypeptides gB du CMV matures produits après le clivage de la séquence signal, dans laquelle au moins 30 %, au moins 80 %, de 80 % à 90 % des polypeptides gB matures comprennent le même acide aminé au niveau de l'extrémité N-terminale. En particulier, les polypeptides matures de l'invention commencent de manière appropriée avec une sérine ou une histidine au niveau de la position N-terminale. HBsAg L'enveloppe du virus de l'hépatite B est constituée d'une protéine connue comme l'antigène de surface de l'hépatite B, et contient deux autres antigènes connus comme les antigènes pré-Sl et pré-S2.

Le cœur du virus contient deux autres protéines qui agissent comme des antigènes - l'antigène « e » et l'antigène de capside. Dans un mode de réalisation particulier, l'antigène est un antigène de l'hépatite B, de préférence l'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg). La préparation de l'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) est bien documentée. Voir, par exemple, Harford et al. in Develop. Biol. Standard 54, page 125 (1983), Gregg et al. in Biotechnology, 5, page 479 ¢1987), le document EP-A-0226846, le document EP-A-0299108 et les références y étant citées.

Telle qu’elle est utilisée dans le présent document, l'expression « antigène de surface de l'hépatite B » ou « HBsAg » comprend tout antigène de surface de l'hépatite B ou fragment de celui-ci présentant l'antigénicité de l'antigène de surface du HBV. On comprendra qu'outre la séquence de 226 acides aminés de l'antigène S HBsAg (voir Tiollais et al., Nature, 317, 489 (1985) et les références y étant citées), le HBsAg tel qu’il est décrit dans le présent document peut, si souhaité, contenir tout ou partie d'une séquence pré-S telle que décrite dans les références ci-dessus et dans le document EP-A-0278940. Le HBsAg tel qu'il est décrit dans le présent document peut aussi faire référence à des variantes, par exemple le « mutant d'échappement » décrit dans le document WO 91/14703. Dans un autre aspect, le HBsAg peut comprendre une protéine décrite comme SL* dans la demande de brevet européen numéro 0 414 374, en d'autres termes une protéine dont la séquence d'acides aminés est constituée de parties de la séquence d'acides aminés de la grande protéine (L) du virus de l'hépatite B (sous-type ad ou ay) , caractérisé en ce que la séquence d'acides aminés de la protéine est constituée : (a) des résidus 12 à 52, suivis par les résidus 133 à 145, suivis par les résidus 175 à 400 de ladite protéine L ; ou (b) du résidu 12, suivi par les résidus 14 à 52, suivis par les résidus 133 à 145, suivis par les résidus 175 à 400 de ladite protéine L.

Le HBsAg peut également faire référence aux polypeptides décrits dans le document EP0198474 ou dans le document EP0304578.

En particulier, le HBsAg peut comprendre un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés comprenant les résidus 133 à 145 suivis par les résidus 175 à 400 de la protéine L du HBsAg relativement au cadre de lecture ouvert sur un virus de l'hépatite B du sérotype Ad (on fait référence à ce polypeptide comme à L* ; voir le document EP 0414374) . Le HBsAg dans la portée de l'invention peut également comprendre le polypeptide préSl-préS2-S décrit dans le document EP0198474 (Endotronics ) ou des analogues de celui-ci tels que décrits dans le document EP0304578 (McCormick and Jones) . Le HBsAg tel qu' il est décrit dans le présent document peut aussi faire référence à des mutants, par exemple le « mutant d'échappement » décrit dans le document WO 91/14703 ou EP0511855A1, notamment le HBsAg dans lequel la substitution d'acide aminé à la position 145 est une substitution glycine à arginine.

La préparation de l'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) est bien documentée. Voir, par exemple, Hartford et al., 1983, Develop. Biol. Standard 54 : 125, Gregg et al., 1987, Biotechnology 5 : 479, EP0226846, EP0299108. Il peut être préparé de la manière suivante. Un procédé implique la purification de l'antigène sous forme particulaire du plasma de porteurs de l'hépatite B chronique, étant donné que de grandes quantités de HBsAg sont synthétisées dans le foie et libérées dans la circulation sanguine au cours d'une infection par le HBV. Un autre procédé implique l'expression de la protéine par des procédés utilisant l'ADN recombinant. Le HBsAg peut être préparé par expression dans la levure Saccharomyces cerevisiae, Pichia, des cellules d'insecte (par exemple, H15) ou des cellules mammaliennes. Le HBsAg peut être inséré dans un plasmide, et son expression du plasmide peut être contrôlée par un promoteur tel que le promoteur « GAPDH » (du gène de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase) . La levure peut être cultivée dans un milieu synthétique. Le HBsAg peut alors être purifié par un processus impliquant des étapes telles que la précipitation, la chromatographie par échange d'ions, et l'ultrafiltration. Après la purification, le HBsAg peut être soumis à une dialyse (par exemple, avec la cystéine) . Le HBsAg peut être utilisé sous une forme particulaire.

Le HBsAg peut être sous la forme de particules. Les particules peuvent comprendre, par exemple, la protéine S seule ou peuvent être des particules composites, par exemple L*, S) où L* est telle que définie ci-dessus et S représente la protéine S du HBsAg. Ladite particule est avantageusement sous la forme sous laquelle elle est exprimée dans la levure.

Dans un mode de réalisation, le HBsAg est présent en une quantité de 1 à 20 pg, de 5 à 20 pg, de 8 à 15 pg ou d ' approximativement ou d'exactement 10 pg par dose de 0,5 mL.

Dans un mode de réalisation, le HBsAg est l'antigène utilisé dans EngerixB™ (GlaxoSmithKline Biologicals S.A.), qui est en outre décrit dans le document WO 93/24148.

gE du VZV L'antigène du VZV est la glycoprotéine gE du VZV (également connue comme la gpl) ou son dérivé immunogène. La protéine gE de type sauvage ou de pleine longueur est constituée de 623 acides aminés comprenant un peptide signal, de la principale partie de la protéine, d'une région d'ancrage hydrophobe (résidus 546 à 558) et d'une queue C-terminale. Dans un aspect, une troncature C-terminale de gE (à laquelle on fait référence comme à gE tronquée ou à une troncature de gE) est utilisée moyennant laquelle la troncature supprime 4 à 20 % des résidus acides aminés totaux au niveau de l'extrémité carboxy. Dans un autre aspect, gE tronqué ne possède pas la région d'ancrage carboxy terminale (de manière appropriée approximativement les acides aminés 547 à 623 de la séquence de type sauvage). Dans un aspect supplémentaire gE est un gE tronqué ayant la séquence de SEQ ID NO : 1. L'antigène gE, les dérivés sans ancrage de celui-ci (qui sont également des dérivés immunogènes) et leur production sont décrits dans le document EP0405867 et dans les références y étant citées [voir également Vafai A. Antibody binding sites on truncated forms of varicella-zoster virus gpl(gE) glycoprotein Vaccine 1994 12 : 1265-9]. Le document EP192902 décrit également gE et sa production. gE tronqué ayant la séquence de SEQ ID NO : 1, est également décrit par Haumont et al. Virus Research (1996) vol 40, pl99-204, totalement intégré au présent document à titre de référence.

Leroux-Roels I. et al. (JID 2012 : 206 1280-1290) ont rapporté un essai clinique de phase I/II évaluant un vaccin sous-unitaire à gE tronqué du VZV ayant comme adjuvant AS0I.

Adj uvants

Tel qu'expliqué dans le présent document, dans un aspect de la présente invention, les conjugués antigène-adjuvant « auto-adjuvants » sont capables d’induire une réponse immunitaire spécifique en l’absence d’antigène ou d’adjuvant supplémentaire.

Cependant, l'utilisation de ces conjugués antigène-adjuvant dans une composition immunogène de la présente invention n'empêche pas l'utilisation d'autres antigènes ou adjuvants dans la composition immunogène. Les compositions immunogènes de la présente invention peuvent en outre comprendre un excipient pharmaceutiquement acceptable, tel qu'un adjuvant approprié. Des adjuvants appropriés comprennent un sel d'aluminium tel que 1'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium, mais peuvent aussi être un sel de calcium, de fer ou de zinc, ou peuvent être une suspension insoluble de tyrosine acylée, ou de sucres acylés, ou peuvent être des saccharides cationiquement ou anioniquement dérivatisés, des polyphosphazènes, des microsphères biodégradables, le monophosphoryl lipide A (MPL), des dérivés du lipide A (par exemple, de toxicité réduite), le MPL 3-0-désacylé, les mimétiques synthétiques du MPL tels que l'aminoalkyl glucosamide, (AGP) le quil A, la saponine, QS21, le tocol (EP 0382271), l'adjuvant de Freund incomplet (Difco Laboratories, Détroit, MI), l'adjuvant 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), AS-2, AS-3, AS-4 (Smith-Kline Beecham, Philadelphia, PA) , MF59 (Novartis), les oligonucléotides CpG, des bioadhésifs et des mucoadhésifs, des microparticules, des liposomes, des formulations à base d'éther de polyoxyéthylène, des formulations à base d'ester de polyoxyéthylène, des muramyl peptides ou des composés imidazoquinolone (par exemple, l'imiquamode et ses homologues) et des oxoadénines. Les immunomodulateurs humains appropriés pour une utilisation en tant qu'adjuvants dans l'invention comprennent les cytokines telles que les interleukines (par exemple, l'IL-l, l'IL-2, l'IL-4, l'IL-5, l'IL-6, l'IL-7, l'IL-12, etc.)/ le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) , le facteur onconécrosant (TNF), le facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages (GM-CSF) peuvent également être utilisés comme adjuvants.

Composants non immunologiques

Les compositions immunogènes de la présente invention comprendront typiquement, outre les composants antigéniques et adjuvants susmentionnés, un ou plusieurs vecteurs ou excipients pharmaceutiquement acceptables, qui comprennent tout excipient qui n'induit pas lui-même la production d'anticorps nuisibles à l'individu recevant la composition. Des excipients appropriés sont typiquement de grandes macromolécules lentement métabolisées telles que des protéines, des saccharides, des acides polylactiques, des acides polyglycoliques, des acides aminés polymères, des copolymères d'acides aminés, le saccharose (Paoletti et al., 2001, Vaccine, 19 : 2118), le tréhalose (WO 00/56365), le lactose et des agrégats lipidiques (tels que des gouttelettes d'huile ou des liposomes). Ces vecteurs sont bien connus des hommes du métier. Les compositions peuvent également contenir des diluants, tels que l'eau, une solution saline, du glycérol, etc. En outre, des substances auxiliaires, telles que des agents mouillants ou émulsifiants, des substances tampons du pH, et équivalents, peuvent être présentes. Une solution saline physiologique, tamponnée au phosphate, apyrogène et stérile est un vecteur typique. Une discussion détaillée relative aux excipients pharmaceutiquement acceptables est disponible dans la référence Gennaro, 2000, Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th édition, ISBN :0683306472.

Les compositions utilisant des conjugués de 1'invention peuvent être plus facilement lyophilisées ou susceptibles de séchage par pulvérisation que leurs homologues mélangés ou peuvent se trouver sous une forme aqueuse, en d'autres termes une forme de solutions ou de suspensions. Dans certains cas, des formulations liquides comprenant un conjugué antigène-adjuvant telles que décrites permettent que les compositions soient administrées directement de leur forme emballée, sans nécessiter de reconstitution dans un milieu aqueux, et sont ainsi idéales pour l'injection. Les compositions peuvent se présenter dans des flacons ou dans des seringues pré-remplies. Les seringues peuvent ou non être dotées d'aiguilles. Une seringue comprendra une dose unique de la composition, alors qu'un flacon peut comprendre une dose unique ou des doses multiples (par exemple, 2 doses) . Dans un mode de réalisation, la dose est destinée aux êtres humains. Dans un autre mode de réalisation, la dose est destinée à un adulte, un adolescent, un jeune enfant, un nourrisson ou un être humain de moins d'un an, et peut être administrée par injection. L'effet adjuvant amélioré des conjugués et des compositions comprenant les conjugués peut permettre la fabrication de compositions immunogènes ayant une teneur en antigène réduite mais donnant un effet immunogène équivalent, comparé à un antigène et un adjuvant similaires qui ne sont pas conjugués. Une formulation utilisant le nouveau conjugué peut ainsi fournir un effet bénéfique de réduction des doses nécessaires.

Un profil de réactogénicité amélioré des conjugués et des compositions comprenant les conjugués peut permettre la fabrication de compositions immunogènes efficaces avec une réactogénicité réduite comparé aux compositions comprenant un antigène et un adjuvant similaires, mais qui ne sont pas conjugués. Par exemple, le profil de réactogénicité du conjugué antigène-adjuvant peut être amélioré par rapport à celui de l'antigène et de l’adjuvant mélangés. De manière similaire, la fabrication de compositions immunogènes ayant une efficacité améliorée avec une réactogénicité sensiblement équivalente comparé aux compositions comprenant un antigène et un adjuvant similaires, mais qui ne sont pas conjuguées. Par exemple, l’efficacité du conjugué antigène-adjuvant peut être améliorée par rapport à celle de l'antigène et de l’adjuvant mélangés. Une formulation utilisant le nouveau conjugué peut ainsi fournir une fenêtre thérapeutique accrue.

Les compositions immunogènes de l’invention peuvent être emballées sous la forme d'une dose unique ou sous la forme de doses multiples (par exemple, 2 doses) . Pour les formes de doses multiples, on préfère les flacons aux seringues pré-remplies. Des volumes de dosage efficaces peuvent être établis en routine, mais une dose humaine typique de la composition pour injection a un volume de 0,5 mL. Dans un mode de réalisation, les compositions immunogènes de l'invention ont un pH compris entre 6,0 et 8,0, dans un autre mode de réalisation, les compositions immunogènes de l'invention ont un pH compris entre 6,3 et 6,9, par exemple, 6,6 ± 0,2. Les compositions peuvent être tamponnées à ce pH. Le pH peut être maintenu par l'utilisation d'un tampon. Si une composition comprend un sel d'hydroxyde d'aluminium, un tampon histidine peut être utilisé (WO 03/009869) . La composition doit être stérile et/ou apyrogène. Les compositions immunogènes de 1' invention peuvent être isotoniques relativement aux humains.

Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre un antimicrobien. Les conservateurs sont de préférence présents à de faibles niveaux. Un conservateur peut être ajouté de manière exogène et/ou peut être un composant des antigènes en vrac qui sont mélangés pour former la composition (par exemple, présent sous la forme d'un conservateur dans les antigènes).

Les compositions immunogènes de la présente invention peuvent comprendre un détergent, par exemple, un Tween (polysorbate), tel que le Tween 80. Les détergents sont généralement présents à de faibles niveaux, par exemple, < 0,01 %. Les compositions immunogènes de l'invention peuvent comprendre des sels de sodium (par exemple, chlorure de sodium) pour conférer la tonicité. La composition peut comprendre du chlorure de sodium. Dans un mode de réalisation, la concentration en chlorure de sodium dans la composition de l'invention se trouve dans la plage de 0,1 à 100 mg/mL (par exemple, 1 à 50 mg/mL, de 2 à 20 mg/mL, 5 à 15 mg/mL) et dans un autre mode de réalisation, la concentration en chlorure de sodium est de 10 ± 2 mg/mL de NaCl, par exemple, d'environ 9 mg/mL. Les compositions immunogènes de l'invention comprendront généralement un tampon. Un tampon phosphate ou histidine est classique. Les compositions immunogènes de la présente invention peuvent comprendre des ions phosphate libres en solution (par exemple, par l'utilisation d'un tampon phosphate) de manière à favoriser une non-adsorption des antigènes.

Dans un mode de réalisation, les compositions immunogènes de l’invention sont formulées pour une administration in vivo à l'hôte, de telle sorte que les composants individuels de la composition sont formulés de manière à ce que l'immunogénicité des composants individuels ne soit pas sensiblement modifiée par les autres composants individuels de la composition. Par pas sensiblement modifiée, on entend que lors de l'immunisation, un titre d'anticorps contre chaque composant est obtenu qui est supérieur à 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, ou 95 à 100 % du titre obtenu lorsque l'antigène est administré isolément. Ainsi, dans des modes de réalisation préférés, aucun effet (significativement) nuisible ne se produit sur les autres composants (en termes d'efficacité protectrice) dans la combinaison comparé à leur administration isolément.

Dans un aspect de l'invention, la composition immunogène comprenant les conjugués antigène-adjuvant est « auto-adjuvante ». Le terme « auto-adjuvante » dans ce contexte signifie que l'administration de la composition immunogène comprenant le conjugué antigène-adjuvant est suffisante pour induire une réponse immunitaire spécifique efficace contre l'antigène, en l'absence d'autres composés pharmacologiquement actifs (par exemple, d'autres antigènes ou adjuvants). Par exemple, dans un aspect, une composition auto-adjuvante comprenant un antigène conjugué à un adjuvant fournit une meilleure réponse des anticorps spécifiques telle que mesurée par les titres sériques et de préférence une réponse des anticorps spécifiques, cliniquement significative contre l'antigène telle que mesurée par les titres d'anticorps fonctionnels et/ou l'immunité à médiation cellulaire telle que mesurée par 1' activation des lymphocytes T.

Des exemples d'états pathologiques dans lesquels les compositions immunogènes de la présente invention ont des effets potentiellement bénéfiques comprennent les maladies allergiques, les affections inflammatoires, les troubles à médiation immunitaire, les maladies infectieuses, et le cancer. Les composés de la présente invention peuvent également être potentiellement utilisés en tant que vaccins comprenant des antigènes conjugués aux adjuvants.

En tant que modulateurs de la réponse immunitaire, les conjugués antigène-adjuvant de la présente invention peuvent être utiles, seuls ou en combinaison avec d’autres compositions, dans le traitement et/ou la prévention de troubles immunitaires, comprenant de manière non restrictive des maladies inflammatoires ou allergiques telles que l'asthme, la rhinite allergique et la rhinoconjonctivite, une allergie alimentaire, des maladies pulmonaires liées à l'hypersensibilité, une pneumonite éosinophile, des troubles d'hypersensibilité retardée, le diabète, la sclérose en plaques, l'athérosclérose, une pancréatite, une gastrite, une colite, l'arthrose, le psoriasis, la sarcoïdose, la fibrose pulmonaire, le syndrome de détresse respiratoire, la bronchiolite, la bronchopneumopathie chronique obstructive, la sinusite, la mucoviscidose, la kératose actinique, une dysplasie cutanée, l'urticaire chronique, l'eczéma et tous les types de dermatite.

Les compositions immunogènes de la présente invention peuvent également être utiles dans le traitement de maladies infectieuses comprenant, de manière non restrictive, celles provoquées par les virus de l'hépatite (par exemple, le virus de l'hépatite B, le virus de l'hépatite C) , le virus de l'immunodéficience humaine, les papillomavirus, les herpesvirus, les virus respiratoires (par exemple, les influenza virus, le virus respiratoire syncytial, un rhinovirus, un métapneumovirus, un parainfluenzavirus, le SARS), et le virus West Nile. Les compositions de la présente invention peuvent également être utiles dans le traitement d'infections microbiennes provoquées, par exemple, par des bactéries, des champignons, ou des protozoaires. Celles-ci comprennent, de manière non restrictive, la tuberculose, une pneumonie bactérienne, une aspergillose, une histoplasmose, une candidose, une pneumocystose, la lèpre, une infection à chlamydia, une maladie cryptococcique, la cryptosporidose, la toxoplasmose, la leishmaniose, le paludisme, Ébola et la trypanosomiase.

Les compositions immunogènes de la présente invention peuvent également être utiles dans le traitement de différents cancers, en particulier le traitement de cancers qui sont connus pour répondre à l'immunothérapie et comprenant, de manière non restrictive, un carcinome des cellules rénales, le cancer du poumon, le cancer du sein, le cancer colorectal, le cancer de la vessie, le mélanome, la leucémie, les lymphomes et le cancer des ovaires.

Les hommes du métier apprécieront que les références dans le présent document à un traitement ou une thérapie peuvent, en fonction de l'affection, s'étendre à la prophylaxie et au traitement des affections établies. Ainsi, les conjugués antigène-adjuvant de la présente invention peuvent être utiles dans des vaccins et utiles en tant qu' agents thérapeutiques.

La composition immunogène de la présente invention peut, par exemple, être formulée pour une administration orale, topique, inhalée, intranasale, buccale, parentérale (par exemple intraveineuse, intradermique, ou intramusculaire) ou rectale. Dans un aspect, les composés de la présente invention sont formulés pour une administration orale. Dans un autre aspect, les composés de la présente invention sont formulés pour une administration topique, par exemple une administration intranasale ou par inhalation.

Formulations

Dans un mode de réalisation, les compositions immunogènes de l'invention sont formulées sous la forme d'un vaccin pour l'administration in vivo à l'hôte, de telle sorte qu'elles confèrent un titre d'anticorps supérieur au critère de séroprotection pour chaque composant antigènique pour un pourcentage acceptable de sujets humains. Ceci est un test important dans l'évaluation de l'efficacité d'un vaccin sur une population. Les antigènes avec un titre en anticorps associé au-dessus duquel un hôte est considéré séroconverti contre l'antigène sont bien connus, et ces titres sont publiés par des organisations telles que l'OMS. Dans un mode de réalisation, plus de 80 % d'un échantillon statistiquement significatif des sujets sont séroconvertis, dans un autre mode de réalisation plus de 90 % d'un échantillon statistiquement significatif des sujets sont séroconvertis, dans encore un autre mode de réalisation, plus de 93 % d'un échantillon statistiquement significatif des sujets sont séroconvertis et dans encore un mode de réalisation de 96 à 100 % d'un échantillon statistiquement significatif des sujets sont séroconvertis.

La quantité de l'antigène dans chaque dose de vaccin est sélectionnée comme une quantité qui induit une réponse immunoprotectrice sans effet secondaire indésirable significatif dans les vaccins typiques. Une telle quantité variera en fonction des antigènes spécifiques qui sont utilisés. On s'attend généralement à ce que chaque dose comprenne de 1 à 1 000 pg d'antigène total, ou de 1 à 100 pg, ou de 1 à 40 pg, ou 1 à 5 pg. Une quantité optimale d'un vaccin particulier peut être vérifiée par des études impliquant l'observation des titres d'anticorps et d'autres réponses chez le sujet.

Les vaccins de la présente invention peuvent être emballés dans différents types de récipients, par exemple, dans des flacons, dans des seringues, etc. Un flacon multidose comprendra typiquement un orifice en plastique refermable à travers lequel une aiguille stérile peut être insérée pour retirer une dose de vaccin, ledit orifice se refermant une fois que l'aiguille a été retirée.

Le vaccin peut être fourni dans différents récipients (par exemple, 2 ou 3) . Les contenus des récipients peuvent être mélangés de manière extemporanée avant d'être administrés à un hôte en une seule injection ou peuvent être administrés de manière concomitante à différents sites. La dose du vaccin, ou de chaque vaccin dans le cas d'un kit, qui est administrée de manière concomitante (dans au moins deux récipients) sera typiquement de 0,5 mL.

Administration L'invention concerne un procédé destiné à développer une réponse immunitaire chez un mammifère, comprenant l'étape d'administration d’une quantité efficace d’une composition immunogène de l'invention. Les compositions peuvent être administrées de manière prophylactique (en d'autres termes, pour prévenir l'infection) comme avec un vaccin. La réponse immunitaire est de préférence protectrice et implique de préférence des anticorps. Le procédé peut induire une réponse immunitaire suite au rappel.

Après une administration initiale, les sujets peuvent recevoir une ou plusieurs immunisations (subséquentes) de rappel espacées de manière appropriée. Le schéma posologique peut être un régime posologique à dose unique ou un régime posologique à doses multiples. Les doses multiples peuvent être utilisées dans un régime d'immunisation primaire et/ou un régime d'immunisation de rappel. L'administration de la dose primaire peut être suivie par l'administration d'une dose de rappel. Un intervalle approprié entre les doses de sensibilisation et entre la sensibilisation et le rappel peut être déterminé en routine.

Les compositions immunogènes de la présente invention peuvent être utilisées pour protéger ou traiter un mammifère susceptible à une infection, par l'administration de ladite composition directement à un patient. L'administration directe peut être réalisée par administration parentérale (y compris, de manière non restrictive : par voie intramusculaire, intrapéritonéale, intradermique, intraveineuse, ou dans l'espace interstitiel d'un tissu) ; ou par administration rectale, orale, vaginale, topique, transdermique, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou muqueuse autre. Dans un mode de réalisation, l'administration est réalisée par injection intramusculaire dans la cuisse ou l'avant-bras. L'injection peut être réalisée via une aiguille (par exemple, une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut en variante être utilisée. Dans un mode de réalisation, une dose intramusculaire est 0,5 mL.

Les termes « comprenant », « comprennent » et « comprend » utilisés dans le présent sont entendus par les inventeurs comme facultativement substituables par les termes « consistant en », « consistent en » et « consiste en », respectivement, pour chaque occurrence. Ceci ne modifie pas la signification normale de ces termes, et est uniquement destiné à fournir une base pour la substitution, pas à en faire deux termes de signification équivalente. EXEMPLE 1

Synthèse d'oxoadénines

Les oxoadénines et des procédés de préparation d'oxoadénines telles que les composés A et C sont connus dans l'art et sont en particulier décrits dans le document WO 2010/018134.

La synthèse du composé B oxoadénine est réalisée selon le schéma 1 et tel que décrit ci-dessous. Les composés 1, 2, 40, 41, 42 et 43 exposés dans la synthèse ci-dessous sont en outre décrits dans le document WO 2010/018134 (en utilisant la même numérotation que dans la demande de brevet WO 2010/018134) .

On a séparé le chlorhydrate de 4-bromopyridine A (2,5 g) entre l'hydroxyde de sodium 1 N (20 mL) et l'acétate d'éthyle (3 x 20 mL) . On a séparé la couche organique, on l'a séchée sur du Na;S04 et concentrée sous vide. On a fait se dissoudre l'huile obtenue dans du TEA (2,6 M) et on a dégazé sous azote. On a ajouté du 4-pentyn-l-ol (1,1 éq.) puis du chlorure de bis (triphénylphosphine)palladium (II), (0,01 éq.) et de 1' iodure de cuivre (I) (0,02 éq.) puis on a laissé le mélange réactionnel sous agitation à reflux pendant 20 minutes. Le traitement aqueux (acétate d'éthyle/eau) et la purification par chromatographie sur gel de silice (gradient de 0 à 30 % d'acétate d'éthyle dans l'heptane) ont conduit à B en un rendement de 82 %. On a fait se dissoudre B dans de l'acide acétique (0,05 M) et on a hydrogéné la solution en utilisant un réacteur d'hydrogénation à flux continu H-Cube® (ThalesNano) (cartouche de 20 % Pd(OH)2/C, 100 bars d'H2, 90°C, 1 mL/min).

Après la fin de l'hydrogénation, on a concentré le mélange réactionnel et on l'a séché sous vide. On a fait se dissoudre le produit brut obtenu dans du CH2CI2 (0,4 M) , puis on l'a fait réagir avec de l'EtsN (1,5 éq.) et du bicarbonate de di-t-butyl (1,2 éq.) à température ambiante pendant 30 minutes. Après un traitement aqueux (CH2CI2/H2O) et la purification par chromatographie sur gel de silice (gradient de 0 à 30 % d'acétate d'éthyle dans l'heptane) on a isolé le composé C en un rendement de 80 % : RMN ΧΗ (400 MHz, CDCI3) d 4,06 (s, 2H) , 3,64 (t, 2H) , 2,66 (t, 2H) , 1, 54-1,66 (m, 5H) , 1,45 (s, 9H) , 1,24-1,39 (m, 8H) , 1,08 (m, 2H) , on a lentement ajouté du CBr4 (1,6 éq.) et du PPI13 (1,2 éq.) (réaction exothermique) à une solution de C dans du CH2CI2 (0,45 M) à 0°C.

Après 5 minutes, on a laissé le mélange réactionnel remonter à température ambiante, on l'a laissé sous agitation à température ambiante pendant 45 minutes, on l'a concentré et directement purifié par chromatographie sur gel de silice (gradient 0 à 30 % d'acétate d'éthyle dans l'heptane) pour donner D en un rendement de 92 %. On a ajouté du K2CO3 (325 mesh, 3,0 éq.) à une solution de 43 dans du DMF (0,25 M) et on a soniqué le mélange réactionnel pendant plusieurs secondes pour obtenir une suspension fine que l'on a alors laissée sous agitation à 60°C pendant 1 heure. Après un refroidissement à 50°C, on a ajouté D (1,2 éq.) au mélange réactionnel puis on a laissé sous agitation pendant 1 nuit à 50°C. Après le refroidissement à température ambiante et le traitement aqueux (acétate d'éthyle/eau), on a purifié le produit brut résultant par chromatographie sur gel de silice (gradient de 0 à 10 % de méthanol dans du chloroforme).

On a fait se dissoudre le produit E purifié dans du méthanol (0,1 M) et on l'a fait réagir avec du HCl 4 N dans du dioxane (6,0 éq.) à température ambiante pendant 1 heure. On a concentré le mélange réactionnel et on l'a séché sous vide, on a purifié le résidu par chromatographie sur gel de silice (0 à 100 % CHCI3/CH3OH/H2O 90/10/0,5 dans CHCI3/CH3OH/H2O 85/15/1,0) pour obtenir F en un rendement de 64 % (2 étapes) . RMN 1H (400 MHz, CD3OD) gamma 5,14 (m, 1H) , 3,81 (t, 2H) , 3,36/3,32 (m, 4H), 2,97(d de t, 2H), 1,92 (m, 2H), 1,75 (p, 2H), 1,72 (m, 1H) , 1,57 (m, 2H) 1,5-1,3 (m, 14H) , 0,95 (t, 3H) ; ES TOF-MS positive calculée pour [M+H] 391,28222, trouvée 391,0843. SCHEMA 1

EXEMPLE 2

Exemple : procédé de conjugaison HBsAg-composé B (chimie G) 1) On a activé l’adjuvant avec du GMBS par ajout de 3 équivalents de GMBS et 1,5 de TEA à 1 équivalent d'adjuvant dans du DMF/H2O 80 %/20 %. On a fait incuber la réaction à température ambiante pendant 20 minutes. 2) On a dilué l'échantillon avec de l'acétonitrile et de l'acétate d'ammonium 10 mM pH = 6 et on l'a purifié par RP-CLHP pour éliminer le GMBS n'ayant pas réagi et tout dimer d'adjuvant. 3) On a collecté des fractions contenant l’adjuvant activé avec le GMBS (testé par CLSM) et on les a séchées par Speed Vac. On a stocké l'adjuvant sec activé par le GMBS à -20°C jusqu’à l’utilisation. 4) On a activé l’antigène par ajout de 40 équivalents de 2-iminothiolane (réactif de Traut) à la solution protéique goutte à goutte tout en mélangeant délicatement la solution. On a fait incuber la solution à température ambiante pendant 1,5 heure.

On a purifié la solution par ultrafiltration en utilisant des tubes d'ultrafiltration Amicon de 15 rnL avec un MWCO de 30 kDa puis on a lavé 7 fois avec un tampon phosphate 100 raM. 1) contenant de l'EDTA 10 mM et à pH = 7,2. (On a conservé une aliquote d'échantillon pour un test par MALDI-TOF). 2) On a ajouté 15 équivalents d'adjuvant purifié activé avec du GMBS à l'antigène purifié activé avec le réactif de Traut et on a fait incuber à température ambiante pendant 2 heures. On a déterminé le nombre de copies par MALDI-TOF. 3) On a centrifugé l'échantillon pendant 5 minutes et on a filtré le surnageant avec un filtre de 0,1 pm pour éliminer les particules insolubles. 4) On a purifié le filtrat par ultrafiltration en utilisant un tube d'ultrafiltration Amicon de 15 mL avec un MWCO de 100 kDa. On a lavé l'échantillon avec un tampon phosphate 100 mM pH = 6,8 avec du NaCl 150 mM. 5) on a stérilisé par filtration le conjugué purifié et on l'a caractérisé par RP-CLHP, SEC-CLHP, MALDI-TOF, SDS-PAGE, BOA et LAL.

Exemple : conjugaison gE-composé B (Chimie T) 1) On a activé l'antigène avec du GMBS par ajout goutte à goutte à l'antigène de 42 équivalents de GMBS dissous dans du DMSO, tout en soumettant à un vortex délicat, et on a fait incuber à température ambiante pendant 30 minutes. 2) On a purifié le GMBS n'ayant pas réagi par ultrafiltration en utilisant des tubes d'ultrafiltration Amicon de 15 mL avec un MWCO de 30 kDa puis on a lavé 5 fois avec un tampon phosphate 100 mM, pH = 6,8. On a conservé une aliquote pour un test par MALDI-TOF. 3) On a activé l'adjuvant avec le réactif de Traut par ajout de 0,95 équivalent du réactif de Traut et 2,5 équivalents de base de Hunig (N,N-diisopropyléthylamine) dans du DMF/H2O 90 %/10 % puis on a fait incuber à température ambiante pendant ~ 1 heure. On a conservé une aliquote pour un test par RP-CLHP. 4) On a ajouté goutte à goutte 20 équivalents d'adjuvant activé avec le réactif de Traut à l'antigène purifié activé avec le GMBS tout en soumettant à un vortex délicat et on a fait incuber à température ambiante pendant 2 heures. 5) On a purifié le conjugué par ultrafiltration en utilisant des tubes d'ultrafiltration Amicon de 15 mL avec un MWCO de 30 kDa puis on a lavé 8 X avec un tampon phosphate 10 mM, pH = 6,8. 6) On a éliminé l'adjuvant non conjugué restant du conjugué par échange d'anions. On a chargé le conjugué sur une colonne échangeuse d'anions forts Pierce, prélavée, puis on a lavé avec un tampon phosphate 10 mM, pH 6,8, contenant des concentrations croissantes de

NaCl (jusqu'à 500 mM) . On a collecté les fractions et on les a analysées par RP-CLHP pour déterminer la concentration en protéine et en adjuvant libre. On a combiné les fractions contenant le conjugué sans adjuvant libre et on les a dessalées par ultrafiltration en utilisant un tube d'ultrafiltration

Amicon de 15 mL avec un MWCO de 10 kDa puis on les a lavées avec un tampon phosphate, pH =6,8 7) on a stérilisé par filtration le conjugué et on l'a caractérisé par RP-CLHP, SEC-CLHP, SDS PAGE, MALDI-TOF, BCA et LAL. EXEMPLE 3

Caractérisation analytique des conjugués

On a utilisé la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour caractériser la masse de l’antigène (gB), de l'antigène conjugué au GMBS et de l’antigène conjugué à l’adjuvant (un agoniste de TLR2). On a utilisé la différence de masse moléculaire entre chaque groupe pour calculer le nombre moyen de molécules de GMBS et d'adjuvant fixées à chaque antigène. L'antigène a été protoné avec un volume égal de TFA à 2 % avant l'ajout d'un excès molaire du composé matriciel 2,5-dihydroxy acétophénone. On a alors ajouté le mélange à une plaque d'acier rectifiée permettant la co-cristallisation de l'antigène dans la matrice. On a alors analysé les échantillons par SM MALDI-TOF avec un Microflex de Bruker. (Figure 2)

On a confirmé la taille de l'antigène et des conjugués antigène/adjuvant par SDS-PAGE conjointement à une concentration relative de monomère dans des agrégats de masse moléculaire supérieure. On a utilisé un système de gel pour SDS-PAGE Novex NuPAGE avec des conditions de réduction et on a choisi des gels préfabriqués en se basant sur la taille de l'antigène. (Figure 3) Sur la figure 3, sont présentés les résultats pour l'antigène (1), l'antigène conjugué à un agoniste de TLR-7/8 (2), l'antigène conjugué à un agoniste de TLR-2 (3), l'antigène activé avec le GMBS sans adjuvant (4), l'antigène conjugué à un agoniste de TLR-7/8 (5), l'antigène conjugué à des agonistes de TLR-7/8 et de TLR-2 (6) . L'augmentation de la masse moléculaire des conjugués est présentée par le décalage vers le haut des bandes de gel relativement à l'antigène non conjugué. Le gel met également en évidence que le dimère et le trimère sont stabilisés par la procédure de conjugaison.

La CLHP en phase inverse a été utilisée pour confirmer que la totalité de l'adjuvant non conjugué était supprimée du conjugué par le processus de purification. On a utilisé une CLHP dotée d'un détecteur PDA et d'une colonne C4 Jupiter avec un débit de 1 mL/min et un gradient de 3 % d ' acétonitrile et 97 % d'une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique (acide trif luoroacétique à 0,1 % dans de l'eau pour CLHP) à 90 % d'acétonitrile et 10 % d'acide trifluoroacétique à 0,1 %. On a mesuré l'absorbance pour des longueurs d'onde de 215 à 320 nm. (Figure 4) Le chromatogramme de RP-CLHP du tampon uniquement (1), de l'antigène uniquement (2) et du conjugué antigène/adjuvant (3) présente un léger décalage du temps de rétention pour le conjugué et sans adjuvant non conjugué.

On a également utilisé la chromatographie d'exclusion diffusion-CLHP pour confirmer la conjugaison de l'adjuvant à l'antigène et déterminer le pourcentage de monomère des conjugués. On a utilisé un équipement de CLHP doté d'un détecteur d'UV et d'une colonne de gel TSK (G3000SWXL) avec un débit de 0,8 mL/min de tampon phosphate 10 mM. On a mesuré l'absorbance pour des longueurs d'onde de 215 et 280 nm. (Figure 5) Le chromatogramme de SEC-CLHP du tampon uniquement (1), de l'antigène uniquement (2) et du conjugué antigène/adjuvant (3) présente un décalage du temps de rétention pour le conjugué et sans adjuvant non conjugué.

On a utilisé un kit Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay pour quantifier la concentration de l'antigène après la purification en utilisant comme protéine étalon la BSA.

On a utilisé un kit Lonza Kinetic QCL Assay pour quantifier les niveaux d'endotoxine dans des conjugués purifiés, stérilisés par filtration.

Dans les cas où la solubilité limitée de l'adjuvant ou de 1'adjuvant-lieur (Traut) empêche la purification complète de l'adjuvant non conjugué par ultrafiltration, il peut être nécessaire d'utiliser la chromatographie échangeuse d'ions pour éliminer l'adjuvant restant.

Par exemple, après la conjugaison du composé B-réactif de Traut au CRM-GMBS et la purification par ultrafiltration, approximativement 0,9 pg/mL de composé B-réactif de Traut non conjugués est resté dans l'échantillon et n'a pas pu être purifié par ultrafiltration supplémentaire. Pour la purification par échange d'ions, on a chargé le conjugué sur une colonne échangeuse d’anions lavée où la protéine de charge négative s'est associée à la colonne de charge positive. Le composé B-Traut non conjugué a été éliminé par lavage avec un tampon phosphate 10 mM. On a alors élué le conjugué purifié de la colonne par lavage avec un tampon phosphate 10 mM contenant des quantités croissantes de NaCl. On a collecté les fractions et on les a examinées par RP-CLHP puis on a rassemblé les fractions contenant le conjugué CRM-composé B sans composé B-réactif de Traut non conjugué et on les a dessalées par ultrafiltration. Le conjugué de composé B purifié final avait moins de 0,1 pg/mL de composé B-réactif de Traut non conjugué. (Figure 6). RP-CLHP de fractions collectées durant la chromatographie par échange d'ions d'un conjugué du composé B. On a d'abord lavé la colonne avec du NaCl 1 M pour éliminer les impuretés de la colonne avec un temps de rétention d'environ 3,5 minutes. On a lavé la colonne avec un tampon phosphate 10 mM avant de la charger du conjugué. Avec le chargement et des lavages supplémentaires avec un tampon phosphate 10 mM, on a éliminé le composé B-réactif de Traut non conjugué avec un temps de rétention d'environ 10,2 minutes alors que le conjugué protéique est resté sur la colonne jusqu'à son élution avec du NaCl 400 mM. EXEMPLE 4

On a alors évalué la capacité des conjugués CRM-composé A présentant un nombre de copies inférieur (quatre copies du composé A) et un nombre de copies supérieur (six copies du composé A) à moduler l'activation de TLR7 (figure 7). Pour cette expérience, on a utilisé le composé A en tant que référence et on a dilué les composés conjugués de telle sorte que le nombre de copies du composé A soit le même à chaque dilution (même rapport moléculaire relativement au composé A) . Les résultats obtenus de cette analyse mettent en évidence que les composés conjugués de la présente invention sont efficaces en tant que ligand seul, composé A, pour activer la voie de TLR7 . Ceci suggère aussi que les composés du conjugué, bien qu'ils soient largement plus gros que le ligand lui-même, ne génèrent pas d'encombrement stérique ayant un impact significatif sur leur récepteur. EXEMPLE 5

Des études de détermination de dose ont identifié la dose optimale de conjugués à utiliser dans les expériences subséquentes. On a conjugué l'oxoadénine TLR7/8 (composé A) avec l'antigène modèle CRM197 pour tester son potentiel immunogène dans une étude de détermination de dose. Méthode :

On a quantifié les anticorps anti-CRM197 et anti-gB dans le sérum de souris par ELISA. À un point temporel terminal, on a collecté du sang total de souris et on l'a centrifugé sur un tube de prélèvement de sang Vacutainer contenant du gel pour la séparation du sérum. On a stocké les échantillons de sérum à -80°C. On a d'abord enduit des plaques NUNC Maxisorp avec la protéine CRM197 ou gB à 5 ou 4 pg/mL, en utilisant respectivement un tampon carbonate de sodium 50 mM, pendant une nuit à 4°C. On a alors lavé les plaques ELISA en utilisant du PBS/Tween 20 à 0,05 %.

On a ajouté du Super Block (ScyTek laboratories) aux plaques et on a fait incuber à 37 °C pendant au moins une heure. Les échantillons de sérum et les étalons utilisés ici étaient des mélanges d'antisérums de souris préquantifiés contre CRM197 ou gB. On a étalé les étalons ainsi que les sérums dans chaque plaque et on les a dilués en série 1/2 dans les plaques avant de les faire incuber à 37°C pendant 2 heures. Après un lavage, on a ajouté 1'IgG de chèvre anti-souris AffiniPure, diluée à la peroxydase et spécifique du fragment Fcy (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) pendant 1 heure à 37°C. On a réalisé un dernier lavage avant d'ajouter le réactif de substrat TMB (BD OptEIA™, BD Biosciences) pendant 30 minutes à TA. On a immédiatement stoppé les plaques en utilisant de l'acide sulfurique 2N, puis on les a lues à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaque SpectraMax (Molecular Devices, Inc.) . On a réalisé les formulations le jour des injections. Le volume d'injection était de 50 pL par souris. Une formulation typique contient : 20 pg à 25 pg d'antigène dilué avec de l'H;0 et du PBS pH 7,4 pour l'isotonicité.

On a réalisé des études de détermination de dose pour identifier la dose optimale de conjugués à utiliser dans les expériences subséquentes. Pour des raisons liées à la chimie et à la disponibilité du réactif, nous avons commencé avec le ligand TLR7/8 (composé A) en tant qu’adjuvant au conjugué avec l’antigène modèle CRM197 pour tester leur potentiel immunogène dans une étude de détermination de doses. On a évalué différentes doses log 10 de conjugués CRM-composé A de 0,01 à 10 pg (sur la base de la teneur totale en protéine) . Les résultats (figure 7) ont mis en évidence que 10 pg est une dose optimale pour obtenir une réponse humorale significativement plus élevée spécifique de CRM197. Ceci a été mis en évidence pour les conjugués ayant une chimie G ou T tel qu'expliqué ci-dessus. (Figure 8) EXEMPLE 6

Conjugué antigène-adjuvant comparé à l'adjuvant mélangé

On a réalisé une étude de preuve de concept sur des souris BALB/c. On a injecté aux souris différentes compositions immunogènes (volume de 50 pl dans un tampon PBS par souris) en utilisant la voie intramusculaire aux jours 0-21 et 42 et on a collecté le sérum puis on l'a analysé le jour 49 par un ELLSA spécifique de CRM197 tel que décrit dans l'exemple 5. On a testé les formulations vaccinales suivantes : 1 - CRM seul (protéine purifiée CRM197) à 10 pg par souris 2 - Conjugué : CRM-composé A à une dose totale de 10 pg par souris. La dose du composé A liée au CRM dans cette composition est 0,15 pg

3 - protéine purifiée CRM197 à 10 pg + 0,15 pg du composé A décrit comme mélange 1 X

4 - protéine purifiée CRM197 à 10 pg + 1,5 pg du composé A décrit comme mélange 10 X

5 - protéine purifiée CRM197 à 10 pg + 15 pg du composé A décrit comme mélange 100 X

Tel que ceci est illustré sur la figure 9, le conjugué CRM-composé A est plus immunogène que les simples mélanges de CRM et de composé A, même lorsque la quantité de composé A est 100 X supérieure à celle qui était présente dans le conjugué. La quantité de CRM197 utilisée dans les essais a été maintenue constante (10 pg de CRM197) . Seule la quantité de la molécule composé A a été modifiée dans la formulation Ad-Mix. En particulier, 0,15 pg de l'adjuvant composé A conjugué à 10 pg de CRM197 a déclenché une réponse significative des anticorps contre CRM197. Ceci contraste avec AdMix, qui n'a pas présenté de réponse immunogène significative avec 0,15 pg de composé A. Pris conjointement, ces résultats mettent en évidence que la conjugaison de l'adjuvant à l'antigène augmente l'immunogénicité tout en utilisant moins d'adjuvant par dose comparé au mélange de l'adjuvant et de l'antigène.

Nous avons par conséquent réalisé une autre étude de preuve de concept chez des souris BALB/c en utilisant un conjugué CRM-composé B. On a injecté à des souris différentes compositions de CRM/composé B (volume de 50 pL dans un tampon PBS par souris en utilisant la voie intramusculaire aux jours 0, 21 et 42) . On a prélevé les sérums et on les a analysés le jour 49 par un ELISA spécifique de CRM197 tel que décrit dans l'exemple 5. On a testé les formulations suivantes : 1 - PBS seul 2 - CRM seul (protéine purifiée CRM197) à 10 pg par souris 3 - Conjugué : CRM-composé B à une dose totale de 10 pg par souris. La dose du composé A lié au CRM dans cette composition est 0,2 pg 4 - Protéine purifiée CRM197 à 10 pg + 0,2 pg du composé B décrit comme mélange 1 x 5 - Protéine purifiée CRM197 à 10 pg + 2 pg du composé B décrit comme mélange 10 x 6 - Protéine purifiée CRM197 à 10 pg + 20 pg du composé B décrit comme mélange 100 x 7 - Protéine purifiée CRM197 à 10 pg + adjuvant contenant TLR4 (AS01E) préalablement décrit dans le présent document (2,5 pg de MPL, 2,5 pg de QS21 dans une formulation liposomale).

Tel que ceci est mis en évidence sur la figure 10a, le conjugué CRM-composé B est plus immunogène que les simples mélanges de CRM et de composé B (valeur p inférieure à 0,01), même lorsque la quantité de composé B est 10 X supérieure à la quantité présente dans le conjugué. La quantité de CRM197 utilisée dans les essais a été maintenue constante (10 pg de CRM197).

Seule la quantité de molécule CRX-composé B a été modifiée dans la formulation Ad-Mix. Les résultats mettent en évidence que le conjugué CRM-composé B permet une réduction d'un facteur de 10 de l’adjuvant pour une immunogénicité équivalente. En outre, le CRM-composé B est équivalant à AS01E + CRM pour la réponse des anticorps. Le calcul stœchiométrique avant l'injection met en évidence que 10 pg de protéine CRM contenait 0,2 pg de composé B. Chaque composition contenant le CRM contient une quantité égale d'antigène CRM (10 pg par souris). Par conséquent, pour une comparaison de dose appropriée, le mélange de 1 X de CRM + composé B contient 10 pg de protéine CRM et 0,2 pg de composé B mélangés avant l'injection aux souris. Le mélange 10 X (10 pg de protéine CRM et 2 pg de composé B) , et le mélange 100 X (10 pg de protéine CRM et 20 pg de composé B) ont également été comparés. AS01E, que l'on a utilisé en tant que référence, (2,5 pg de MPL (agoniste de TLR4), 2,5 pg de QS21 dans une formulation liposomale) par injection. Nous avons constaté que le conjugué CRM-composé B présente une réponse des anticorps spécifiques de CRM similaire à la référence CRM + AS01E, suggérant que l'agoniste de TLR7 comme le composé à une très faible dose, par exemple 0,2 pg, lorsqu'il est lié de façon covalente à un antigène pourrait promouvoir une réponse des anticorps similaires à celle promue par les adjuvants de référence contenant TLR, tels que AS01E. Ici encore, la conjugaison de l'adjuvant à un antigène présente un effet bénéfique sur la réponse immunitaire comparé au mélange d'un adjuvant et d'un antigène. En outre, nous avons mis en évidence que le conjugué CRM-composé B déclenche une réponse immunitaire des IgG à CRM197 similaire à celle de l'adjuvant puissant contenant TLR4 dénommé AS01E + CRM197.

On a mesuré la réponse des lymphocytes T dans les splénocytes

On a récolté les rates de souris et on a généré des suspensions monocellulaires dans du RPMI + FBS à 10 % en utilisant des filtres cellulaires de 100 microns. On a étalé les splénocytes en triple (1,5 x 107/mL ; 200 pL/puits) dans une plaque de 96 puits à fond rond. On a ajouté la protéine CRM (1 pg/mL), un CD28 anti-souris (1 pg/mL) et un CD49d anti-souris pour stimuler les cellules spécifiques du CRM. On a utilisé des cellules non stimulées en tant que témoin négatif. On a utilisé un cocktail BD PMA (1 pL/puits) pour le témoin positif. On a fait incuber la plaque à 37° pendant une nuit, puis pendant 6 heures avec de la bréfeldine A (10 pg/mL) . On a coloré les cellules en surface avec des CD3, CD4 &amp; CD8, puis on a réalisé une coloration intracellulaire avec le TNF et 1'IFNy en utilisant un système de tampon BD Fix/Perm. On a acquis les cellules sur un LSRII en utilisant un logiciel FACSDiva. On a réalisé une sélection primaire sur des cellules CD3+/CD4+ pour l'analyse. Les données sont présentées sur la figure 10b.

Les données présentent un plus grand nombre de lymphocytes T CD4 spécifiques du CRM produisant 1'INFy dans les splénocytes de souris immunisées avec le conjugué CRM-composé B comparé à la formulation de mélange 1 X ou 10 X, suggérant que la conjugaison du composé B avec CRM197 conduit à l'activation des lymphocytes T CD4 in vivo.

Les analyses mettent en évidence que les Thl CMI (cellules CD4-IFNg+) étaient plus nombreux dans le cas du CRM-composé B vs le CRM seul (figure 10 b) . Les données ont pu être extraites de l'analyse de CMI sur les Thl CMI (cellules CD4-IFNg+) étaient plus nombreux dans le conjugué vs CRM seul ou composé A + CRM mélangé 1 X ou 10 X. En outre, le CRM-composé B présente une tendance pour 3 souris sur 4 à être meilleur pour les cellules CD4-IFNg+. Ces données suggèrent que le conjugué CRM-composé B peut déclencher l'activation des lymphocytes T et fournir une meilleure efficacité vaccinale, même en utilisant une quantité inférieure d'adj uvants. EXEMPLE 7

On a testé trois différents composés TLR7/8 conjugués au modèle d'antigène CRM197 pour leur immunogénicité chez les souris, deux oxoadénines et une imidazoquinoléine,

Composé C

On a inclus le CRM seul (protéine CRM197 purifiée) en tant que témoin sans adjuvant. On a injecté à des souris (BALB/c CR) différentes compositions (volume de 50 pL dans un tampon PBS par souris) en utilisant la voie intramusculaire aux jours 0, 21 et 42. On a prélevé les sérums et on les a analysés les jours 28 et 49 par une méthode ELISA spécifique de CRM197, tel que décrit dans l'exemple 5. Le niveau d'anticorps spécifique du CRM 7 jours après les deuxième et troisième injections met en évidence que les conjugués CRM-oxoadénine sont de puissants conjugués antigène-adjuvant, (Figures 11 a et 11b) . Le conjugué CRM-Composé B présente une réponse des anticorps spécifiques de CRM197 supérieure parmi les agonistes de TLR7/8 testés dans le présent document. EXEMPLE 8

On a conjugué un antigène recombinant (gB du CMV) d'un système d'expression eucaryote dans des cellules CHO à un adjuvant et on l'a évalué. On a immunisé des souris BALB/c (5 par groupe) par voie intramusculaire (quadriceps) avec gB ou le conjugué gB-composé A (0,001, 0,01, 0,1, 1 ou 10 pg dilués dans une solution saline) les jours 0, 20 et 41. On a prélevé du sang aux souris pour la collecte de sérum les jours 31 (post 2) et 52 (post 3). Les données sont présentées sur la figure 12a.

On a récolté les rates de souris et on a généré des suspensions monocellulaires dans du RPMI + FBS à 10 % en utilisant des filtres cellulaires de 100 microns. On a étalé les splénocytes en triple (1,5 x 107/mL ; 200 pL/puits) dans une plaque de 96 puits à fond rond. On a ajouté gB (4 pg/mL), un CD28 anti-souris (1 pg/mL) et un CD49d anti-souris pour stimuler les cellules spécifiques de gB. On a utilisé les cellules non stimulées en tant que témoin négatif. On a utilisé un cocktail BD PMA (1 pL/puits) en tant que témoin positif. On a fait incuber la plaque à 37° pendant une nuit, puis pendant 6 heures avec de la bréfeldine A (10 pg/mL) . On a coloré les cellules en surface avec des CD3, CD4 &amp; CD8 suivi par la coloration intracellulaire avec de l'IL-2, de l'IL-4, du TNF et de 1'IFNy en utilisant un système de tampon BD Fix/Perm. On a acquis les cellules sur un LSRII en utilisant un logiciel FACS Diva. On a réalisé un gating primaire sur des cellules CD3+/CD4+ pour l'analyse. Les données sont présentées sur la figure 12b.

Les données d'immunogénicité ont mis en évidence qu'un conjugué gB-composé A utilisé à une dose de 0,01 pg promouvait une réponse des anticorps spécifique de gB 100 fois (2 x log 10) supérieure à la réponse des anticorps spécifiques de gB comparé à gB seul, sans adjuvant. Il est intéressant de remarquer que le bénéfice du conjugué gB-composé A par rapport à gB seul n'a pas été clairement mis en évidence à des doses supérieures.

Bien que les données relatives aux IgG ne soient pas dose-dépendantes, les données de l'analyse d'immunité à médiation cellulaire (CMI) suggèrent que les Thl CMI (cellules CD4-IFNg+) étaient plus nombreux pour le gB-composé A vs gB seul (figure 12b) page 46. Les Thl CMI (cellules CD4-IFNg+) étaient plus nombreux pour le gB-composé A vs gB seul. Prises conjointement, les données relatives à l'activation des anticorps et des lymphocytes T suggèrent que de faibles quantités de conjugué gB-composé A déclenchent l'activation des lymphocytes T et fournissent potentiellement une réponse fonctionnelle des anticorps neutralisant à l'antigène de 1'herpesvirus tel que gB du hCMV. EXEMPLE 9

On a réalisé une étude de détermination de doses de vaccins chez les porcs (bagage génétique : croisement Yorkshire-Duroc-Landrace) pour identifier la dose appropriée pour les études subséquentes chez les gros animaux. On a testé les deux types de réactions chimiques chirales décrits ci-dessus, la conjugaison G et T, et trois concentrations de vaccin (1, 10 et 100 pg) .

On a immunisé les porcs avec 1 mL de vaccin les jours 0 et 21 et on a collecté le sérum le jour 31 (10 jours après l'injection secondaire). On a réalisé un ELISA tel que décrit dans l'exemple 5 à l'exception que l'anticorps secondaire conjugué à la HRP était une IgG de chèvre anti-cochon (Bethyl Laboratories). Tel que ceci est décrit sur la figure 13, le CRM-Composé A déclenche une réponse des IgG spécifiques du CRM197 proche d'une manière de détermination de doses. Tous les animaux (5/5) recevant la dose de 100 pg de CRM (= 1,5 pg de composé A) ont répondu au CRM-composé A. Par conséquent, la dose de 100 pg de CRM a été choisie pour d'autres études chez les porcs d'élevage.

On a réalisé une brève évaluation visuelle des effets indésirables au point d'injection sur deux porcs choisis de manière aléatoire par test d'une dose supplémentaire de 150 pg de composé A seul. On n'a pas observé d'effet indésirable visuel au niveau du point d'injection, suggérant que les molécules de composé A présentent un bon profil d'innocuité. EXEMPLE 10

Pour mieux identifier le conjugué du TLR le plus prometteur pour CRM197 en utilisant la dose de 100 pg, on a préparé trois conjugués adjuvant TLR7/8-antigène : CRM-composé A ; CRM-composé C ; et CRM-composé B. En outre, on a testé un conjugué adjuvant TLR2-antigène. (Données non illustrées). On a utilisé CRM197, seul, sans adjuvant en tant que témoin. On a immunisé des porcs d'élevage Yorkshire-Landrace les jours 0, 21 et 42 et on a collecté les sérums finaux le jour 52. On a réalisé l'ELISA spécifique des porcs tel que ceci est décrit dans l'exemple 5. Les résultats mettant en évidence une réponse des IgG anti-CRM dans les prélèvements finaux sont présentés sur la figure 14.

La réponse des IgG anti-CRM197 dans le cas du CRM-composé B suggère que le composé B est actif et immunogène chez les porcs d'élevage. EXEMPLE 11. Immunisation intradermique de porc

Nous avons évalué la voie d'immunisation intradermique en utilisant le conjugué CRM-composé B. On a immunisé des porcs Yorkshire-Landrace-Cambrio de 4 mois dans le derme du flanc aux jours 0 et 23 avec 100 pL de différents vaccins. On a prélevé les sérums le jour 37 et on a réalisé un ELISA spécifique des IgG contre CRM197 tel que ceci est préalablement décrit dans l'exemple 5. Les groupes d'animaux étaient les suivants :

Les mesures spécifiques des IgG anti-CRM197 mettent en évidence que le conjugué CRM-composé B à 100 pg est considérablement plus immunogène que le témoin antigène seul, sans adjuvant en utilisant la voix intradermique. Ces titres d'anticorps dans la plage de 10 000 à de 110 000 ng/mL du conjugué CRM-composé B suggèrent que la voie intradermique d'immunisation est également appropriée pour la vaccination avec les conjugués TLR7/8-antigène. (Figure 15) EXEMPLE 12

On a quantifié les antigènes anti-HB dans le sérum de porcs d'élevage Yorkshire-Landrace en utilisant un ELISA. On a immunisé les porcs le jour 1, le jour 28 et on a collecté les sérums le jour 58 (point temporel terminal) . On a collecté du sang total et on l'a centrifugé sur un tube de prélèvement de sang

Vacutainer contenant du gel pour la séparation du sérum. On a stocké les échantillons de sérum à -80°C. On a enduit les plaques à 96 puits à fond plat Maxisorp (cat. Nunc : 439454) de 100 pL par puits d'antigène de surface de l'hépatite B dilué à 2 pg/mL dans un tampon d'enduction carbonate-bicarbonate à 50 mM, pH 9,6. Pour les courbes d'étalonnage, on a distribué 100 pL par puits d'anticorps de capture IgG de chèvre anti-porc (cat. Béthyl : A100-104A) dilué à 1/100 dans un tampon d'enduction carbonate-bicarbonate. On a fait incuber les plaques pendant 1 heure à température ambiante. On a lavé les plaques (4 x 250 pL) en utilisant un tampon de lavage (TBS contenant du Tween-20 à 0,05 %) puis, on l'a bloqué avec 200 pL par puits de solution de blocage (TBS contenant 0,05 % de Tween-20 et 1 % de BSA (cat. Sigma : A7030)). On a fait incuber les plaques pendant 30 minutes à température ambiante.

On a jeté la solution de blocage et on a distribué 100 pL par puits de solution de blocage dans les plaques. On a ajouté, dans la première rangée des plaques, 100 pL de sérum porcin de référence (cat. Bethyl : RS 10-107) dilué à 1/6 600 ou d'échantillons (préalablement pré-dilué au besoin) suivi par une dilution en série de deux fois pour un volume final dans chaque puits de 100 pL. On a fait incuber les plaques pendant 1 heure à température ambiante. On a lavé les plaques et on a distribué 100 pL par puits d'IgG anti-porcs conjuguée à la HPR (cat. Bethyl : A100-104P) diluée à 1/75 000 dans une solution de blocage. On a alors fait incuber les plaques pendant 30 minutes à température ambiante. On a lavé les plaques et on a ajouté 100 pL par puits de substrat TMB (cat. BD : 555214) dans les plaques, protégées de la lumière, pendant 30 minutes à température ambiante. On a mis un terme à la réaction en utilisant 100 pL par puits de solution d'arrêt (H2SO4 1 M) . On a lu la plaque immédiatement sur un lecteur de microplaque à 450 nm en utilisant un lecteur de plaques de microtitration SpectraMax (Molecular Devices, Inc.). On a analysé les résultats avec une matrice Soft Max Pro selon le critère suivant : % CV inférieur à 30 % entre un minimum de 2 concentrations calculées pour la quantification finale.

Le résultat de la réponse des anticorps (figure 16) met en évidence que le conjugué HBsAg-composé B utilisant la voie intradermique est considérablement supérieur au vaccin intramusculaire standard HBsAg-alun (test t non apparié P = 0,0034) . Ces résultats suggèrent que les vaccins conjugués à TLR7 sont hautement immunogènes comparés aux formulations de vaccins intramusculaires standard par exemple avec de l'alun. Légende des figures

Figure 1. Diagramme de flux de processus

Figure 2, SM MALDI-TOF d'un antigène (1), de l'antigène conjugué au GMBS(2) et de l'antigène conjugué à un adjuvant (3) . Les décalages de masse moléculaire indiquent une moyenne de 11 copies de GMBS par antigène et une moyenne de 3 copies d'adjuvant par antigène.

Figure 3, SDS-PAGE d'un antigène et de conjugués antigène/adjuvant en utilisant un gel tris-acétate 3 à 8%. Antigène (1), antigène conjugué à un agoniste de TLR-7/8(2), antigène conjugué à un agoniste de TLR-2(3), antigène réticulé avec du GMBS sans adjuvant (4), antigène conjugué à un agoniste de TLR-7/8(5), antigène conjugué à des agonistes de TLR-7/8 et de TLR-2(6). L'augmentation de la masse moléculaire des conjugués est mise en évidence par le décalage des bandes dans le gel relativement à l'antigène non conjugué. Le gel met aussi en évidence que le dimère et le trimère sont stabilisés par la procédure de conjugaison.

Figure 4 Le chromatogramme de RP-CLHP de tampon uniquement (1), d'antigène uniquement (2) et de conjugué antigène/adjuvant (3) présente un petit décalage du temps de rétention pour le conjugué et sans adjuvant non conjugué.

Figure 5. Le chromatogramme de SEC-CLHP de tampon uniquement (1), d'antigène uniquement (2) et de conjugué antigène/adjuvant (3) présente un petit décalage du temps de rétention pour le conjugué et sans adjuvant non conjugué.

Figure 6. Données présentant une RP-CLHP de fractions collectées durant la chromatographie par échange d'ions d'un conjugué CRM-composé B.

Figure 7. Activation de TLR7 à de très faibles doses par les conjugués CRM-composé A à faible nombre de copies et CRM-composé A à nombre de copies élevé en utilisant la lignée de cellules rapporteuses stables TLR7/NF-kB/SEAP (Imgenex corp.) . Les conjugués CRM-composés A (nombre de copies faible ou nombre de copies élevé) activent la voie du TLR7 humain aussi efficacement que le composé A seul.

Figure 8. Etude de détermination de doses du composé A-CRM mettant en évidence qu'une dose-réponse en termes d'IgG spécifique du CRM est observée avec les conjugués CRM-composé A chez des souris BALB/c en utilisant la configuration T vs G.

Figure 9. Etude de preuve de concept chez des souris mettant en évidence que les conjugués antigène-adjuvant CRM-composés A (fusion) induisent une réponse humorale significative basée sur un niveau d'anticorps spécifique de CRM197. Titres d'IgG spécifiques anti-CRM dans le sérum au jour 49 (7 jours post 3).

Figure 10a. Etude de preuve de concept chez des souris mettant en évidence que les conjugués fusionnés CRM-composés B (FUSION) sont plus efficaces même avec 10 x moins d'adjuvant pour monter une réponse humorale significative basée sur l'anticorps spécifique de CRM-197.

Figure 10b. L'évaluation de l'activation des lymphocytes T de splénocytes de souris immunisées met en évidence que le conjugué fusionné CRM-composé B déclenche une plus grande activation des lymphocytes T spécifiques de CRM 197 comparé au mélange CRM + Composé B à une concentration 1 X ou lOx.

Figure lia. Niveau d'anticorps spécifiques de CRM 7 jours après la 2eme injection ; l'immunogénicité met en évidence que le conjugué CRM-composé B est plus immunogène que les constructions CRM-composé A et CRM-composé C chez les souris.

Figure 11b. Niveau d'anticorps spécifiques de CRM 7 jours après la 3eme injection ; l'immunogénicité met en évidence que les conjugués CRM-composé B et CRM-composé A sont des constructions immunogènes chez les souris.

Figure 12a. Analyse des IgG spécifiques de gB (réponse humorale) avec la FUSION vs un témoin gB dans adjuvant chez des souris.

Figure 12b. Analyse de l'immunité à médiation cellulaire (CMI) pour évaluer la réponse CD4-IFNy chez les souris.

Figure 13. Détermination de dose chez des porcs d'élevage pour tester deux types de conjugués; CRM-Composé A(G) vs CRM-Composé A (T).

Figure 14. Test de la réponse humorale (des anticorps) spécifique de CRM de trois différents conjugués TLR7/8-ligands chez des porcs d'élevage Yorshire-Landrace-Duroc en utilisant la voie intramusculaire pour l'immunisation.

Figure 15. Réponse des anticorps déclenchée par des conjugués fusionnés vs des témoins sans adjuvant après immunisation intradermique chez des porcs d'élevage (Yorkshire-Landrace) .

Figure 16. IgG spécifique de HBsAG dans le sérum 28 jours post immunisation secondaire intradermique.

BPGSKL0047BE00 Listage séquences BE

LISTE DES SÉQUENCES

<110> GlaxosmithKline Biologicals SA

<120> COMPOSITIONS ET UTILISATIONS

<130> VR65753 WO <150> US 61/130 812 <151> 03-10-2015 <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 546 <212> PRT <213> vi rus <400> 1

Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly val Leu Met Gly Phe Gly 15 10 15

Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg île Thr Asn Pro Val Arg Ala ser Val 20 25 30

Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn 35 40 45

Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp 50 55 60

Val Asn Arg Gly Glu Ser ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro 65 70 75 80

Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His 85 go 95

Glu His His Gly Val Tyr Asn Gin Gly Arg Gly Ile Asp ser Gly Glu 100 105 110

Arg Leu Met Gin Pro Thr Gin Met ser Ala Gin Glu Asp Leu Gly Asp 115 120 125

Asp Thr Gly île His Val île Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His 130 135 140

Lys île val Asn val Asp Gin Arg Gin Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly 145 150 155 160

Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gin Gly Gin Arg Leu Ile Glu Val Ser Val 165 170 175

Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gin Arg île Tyr 180 185 190 BPGSKL0047BE00 Listage séquences □

Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp ser Phe Leu Pro ser Leu Thr cys 195 200 205

Thr Gly Asp Al a Al a Pro Al a Ile Gin His île cys Leu Lys His Thr 210 215 220

Thr Cys Phe Gin Asp val val Val Asp Val Asp cys Al a Glu Asn Thr 225 230 235 240

Lys Glu Asp Gin Leu Al a Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gin Gly Lys Lys 245 . 250 255

Glu Al a Asp Gin Pro Trp Ile Val val Asn Thr ser Thr Leu Phe Asp 260 265 270

Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu île Glu pro Gly Val Leu Lys Val 275 280 285

Leu Arg Thr Glu Lys Gin Tyr Leu Gly val Tyr Ile Trp Asn Met Arg 290 295 300

Gly ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu val Thr Trp Lys 305 310 315 320

Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala val Thr Pro Gin Pro 325 330 335

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His val Phe Ser 340 345 350

Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gin Tyr Lys Ile His 355 360 365

Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro île Asp 370 375 v 380

Pro Thr Cys Gin Pro Met Arg Leu Tyr ser Thr Cys Leu Tyr His Pro 385 390 395 40o

Asn Ala Pro Gin cys Leu Ser His Met Asn ser Gly cys Thr phe Thr 405 4io 415

Ser Pro His Leu Ala Gin Arg val Ala ser Thr Val Tyr Gin Asn Cys 420 425 430

Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr cys Leu Gly Ile Ser His Met 435 440 445

Glu Pro ser Phe Gly Leu île Leu His asd Gly Gly Thr Thr Leu Lys 450 455 460

BPGSKL0047BE0O Listage Séquences B

Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe val Val 465 470 475 480

Tyr Phe Asn Gly His val Glu Al a Val Al a Tyr Thr val Val Ser Thr 485 490 495 val Asp His Phe val Asn Al a île Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr 500 505 510

Ala Gly Gin Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro val 515 520 525

Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly 530 535 540

Leu Ala 545

Claims (29)

1. REVENDICATIONS

   1. Une composition immunogène comprenant une oxoadénine ayant une structure comprenant la formule 1

   dans laquelle ; R1 est un groupe alcoxy en Ci-6 ramifié ou saturé ; R2 est un groupe ayant la structure :

   n est un nombre entier ayant une valeur de 1 à 6 ; et Het est un hétérocycle saturé à 6 chaînons contenant un atome d'azote, dans lequel Het est attaché à la fraction -(CH2)n- au niveau de tout atome de carbone de 1'hétérocycle ; ou des sels pharmaceutiquement acceptables de celle-ci, ladite oxoadénine étant liée de façon covalente à un antigène.
2. 2. La composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle le nombre de molécules d'oxoadénine par molécule d'antigène est de 2, 3, 4, 5, 6 ou entre 1 et 8, 2 et 5 et 3 et 4.
3. 3. La composition immunogène selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle l'oxoadénine a une structure sélectionnée dans le groupe de
4. 4. La composition immunogène selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle la structure de l'oxoadénine est

   Composé A.
5. 5. La composition immunogène selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle la structure de l'oxoadénine est

   Composé B.
6. 6. Une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle la molécule d'oxoadénine est liée à un antigène via un agent de réticulation et dans laquelle l'agent de réticulation est un composé hydrophile.
7. 7. Une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle l'agent de réticulation à l'oxoadénine augmente la solubilité aqueuse de l'oxoadénine comparé à la solubilité en l'absence de l'agent de réticulation.
8. 8. Une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle l'oxoadénine active est davantage soluble dans l'eau que l'oxoadénine inactive.
9. 9. Une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle la solubilité aqueuse accrue de l'oxoadénine active fournie par l'agent de réticulation diminue la quantité d'agrégats non souhaités dans la composition de conjugué antigène-adjuvant, comparé à l'oxoadénine active ne présentant pas de solubilité accrue.
10. 10. Une composition immunogène selon l'une 1'agent de réticulation lié à 1' oxoadénine est un composé chargé.
11. 11. La composition immunogène selon la revendication 9, dans laquelle l'agent de réticulation lié à 1'oxoadénine est le réactif de Traut ou le GMBS.
12. 12. Une composition immunogène selon la revendication 10, dans laquelle l'agent de réticulation lié à 1'oxoadénine est le réactif de Traut ayant réagi avec le GMBS.
13. 13. Une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle l'agent de réticulation est un agent de réticulation hétéro-bifonctionnel.
14. 14. Une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, comprenant en outre une « protéine vectrice » dans laquelle l'antigène est lié au vecteur et la molécule d'oxoadénine est liée à la protéine vectrice.
15. 15. Une composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle l'antigène est un antigène sélectionné dans le groupe constitué de : CRM-197, l'anatoxine tétanique, HA, gB du CMV, preF, Hash-2, HPV E7, l'anatoxine coquelucheuse (PT), HBs (par exemple l'antigène S), l'ovalbumine, le VIH (par exemple, gag, env), l'antigène PRAME et l'antigène MAGE (par exemple MAGE A3).
16. 16. La composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle l'antigène est conjugué à 1'oxoadénine par l'agent de réticulation et l'antigène facilite une réponse immunitaire spécifique associée à l'antigène en l'absence d'antigènes supplémentaires.
17. 17. La composition immunogène selon la revendication 1, dans laquelle l'antigène est un antigène toxine diphtérique.
18. 18. La composition immunogène selon la revendication 17, dans laquelle la toxine diphtérique est « CRM » 197 (Cross Reactive Material 197).
19. 19. La composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle l'antigène est un antigène de l'hépatite B.
20. 20. La composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle l'antigène est un antigène de surface de l'hépatite B (« HBsAg »).
21. 21. La composition immunogène selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans laquelle l'antigène est un antigène de la varicelle ou de la varicelle et du zona (« VZV »).
22. 22. La composition immunogène selon la revendication 21, dans laquelle l'antigène est un antigène gE du VZV.
23. 23. La composition immunogène selon la revendication 21, dans laquelle l'antigène gE du VZE est tronqué et comprend SEQ ID NO : 1.
24. 24. Une composition immunogène comprenant une population de conjugués antigène-adjuvant, dans laquelle le nombre moyen de molécules de l'adjuvant conjuguées à chaque antigène est compris entre 1 et 5, ou 2 et 4 ou est de 3 ou 4.
25. 25. Un procédé de production d'un conjugué antigène-adjuvant comprenant les étapes de la figure 1.
26. 26. La composition immunogène selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans accrue, en d'autres termes une réponse des anticorps supérieure à une dose égale ou une dose pouvant atteindre jusqu'à 100 fois celle des mêmes antigènes et adjuvants non mélangés de façon covalente.
27. 27. La composition immunogène selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le conjugué provoque une réponse immunitaire accrue, en d'autres termes une réponse des anticorps supérieure à une dose égale ou une dose pouvant atteindre jusqu'à 100 fois celle des mêmes antigènes et adjuvant non mélangés de façon covalente.
28. 28. La composition immunogène selon la revendication 1, pour son utilisation dans un médicament.
29. 29. La composition immunogène selon la revendication 1, pour son utilisation pour provoquer une réponse immunitaire.