BE1022346B1 - Compositions liposomales pour une administration mucosale - Google Patents

Abstract

Une composition liposomale comprenant des lipides qui forment une bicouche lipidique liposomale avec des conjugués phospholipide-PEG incorporés dans la bicouche lipidique liposomale, et un chitosane ou un dérivé du chitosane, est décrite et revendiquée.

Description

COMPOSITIONS LIPOSOMALES POUR UNE ADMINISTRATION MUCOSALE Déclaration concernant la recherche financée par le gouvernement

Des aspects de cette invention ont été réalisés avec le support du gouvernement des Etats-Unis et en vertu du contrat du NIH NO. HHSN272200900008C, le gouvernement des Etats-Unis peut avoir certains droits dans l'invention.

Contexte

Il a été récemment rapporté le transport rapide de nanoparticules à travers la muqueuse humaine pour des nanoparticules suffisamment enrobées de polyéthylène glycol à chaîne courte (PEG, généralement moins de 5000 unités) ou de certains polymères Pluronic [Cu Y, Saltzman WM. Mol Pharm. 2009; 6(1): 173-181 ; Hanes J, et al. Nanomedicine. 2011; 6(2): 365-375]. On pense que cette approche, appelée pénétration mucosale par les auteurs, repose sur une diminution de la muco-adhérence (plutôt qu'une augmentation de la muco-adhérence), permettant une pénétration rapide des nanoparticules à travers le mucus.

Les modulateurs du récepteur de type Toll-4 (TLR4) sont des composés immunogènes utilisés dans des compositions pharmaceutiques et en particulier en tant qu'adjuvants dans les vaccins humains. Des agonistes du TLR-4 ont été formulés dans des liposomes pour une administration par injection pour les vaccins. Les aminoalkyle glucosaminide phosphates (AGP) sont des modulateurs du TLR4, dont certains sont particulièrement puissants et potentiellement réactogènes. De manière générale, il existe un besoin de compositions liposomales améliorées et en particulier de compositions liposomales améliorées pour des modulateurs du TLR4 pour une administration de compositions pharmaceutiques. Résumé de 1'invention

Il est proposé des procédés et des compositions pour des formulations liposomales pour une administration mucosale.

Dans un mode de réalisation, l'invention propose une composition liposomale comprenant des lipides qui forment une bicouche lipidique liposomale et qui comprend en outre des conjugués phospholipide-PEG incorporés dans la bicouche lipidique liposomale. En outre, la composition liposomale comprend un agoniste du TLR4 (par exemple, un AGP) et elle comprend de façon appropriée du tampon HEPES.

Dans un mode de réalisation, les lipides du liposome sont la DOPC en présence de cholestérol.

Dans un mode de réalisation, l'invention propose une composition liposomale comprenant des lipides qui forment une bicouche lipidique liposomale et qui comprend en outre des copolymères de PEG/tensioactifs comme des poloxamères qui sont incorporés dans la bicouche lipidique liposomale. En outre, la composition liposomale comprend un agoniste du TLR4 (par exemple, un AGP) et elle comprend de façon appropriée du tampon HEPES. Dans un mode de réalisation, les lipides du liposome sont la DOPC en l'absence de cholestérol.

Dans un mode de réalisation approprié, la composition liposomale comprend du chitosane ou un dérivé du chitosane.

Dans un mode de réalisation approprié, invention propose une formulation liposomale comprenant un liposome de DOPC en l'absence de stérol, des poloxamères, où les poloxamères sont incorporés dans la bicouche des liposomes de DOPC, un AGP dans du tampon HEPES, et éventuellement du chitosane ou un dérivé du chitosane.

Dans un mode de réalisation approprié, l'invention propose une formulation liposomale comprenant un liposome de DOPC en présence de stérol, de façon appropriée du cholestérol, un conjugué phospholipide-PEG où le conjugué phospholipide-PEG est incorporé dans la bicouche du liposome de DOPC-stérol, un agoniste du TLR4 (par exemple, un AGP) dans du tampon HEPES, et éventuellement du chitosane ou un dérivé du chitosane.

Dans un mode de réalisation, la présente invention propose une composition liposomale comprenant un phospholipide, un conjugué phospholipide-PEG ou un poloxamère et un tampon aminoalcanesulfonique comme HEPES, HEPPS/EPPS, MOPS, MOBS et PIPES.

Dans un mode de réalisation, la présente invention propose une composition liposomale comprenant un phospholipide, un conjugué phospholipide-PEG ou un poloxamère et un aminoalkyle glucosaminide phosphate (AGP), de façon appropriée CRX-601, CRX 6Q2, CRX 527, CRX 547, CRX 526, CRX 529 ou CRX 524.

Dans un mode de réalisation, la présente invention propose une composition liposomale comprenant un phospholipide, un conjugué phospholipide-PEG ou un poloxamère, un AGP, un tampon aminoalcanesulfonique et un chitosane ou un dérivé du chitosane, de façon appropriée chitosane oligosaccharide lactate, glycol chitosane, triméthyl-chitosane ou méthylglycol chitosane.

Dans un autre mode de réalisation, la présente invention propose un procédé d'amélioration de la production d'une composition liposomale pour une administration sublinguale comprenant les étapes suivantes : la dissolution d'un lipide, comme la dioléoyl-phosphatidylcholine (« DOPC ») , d'un conjugué phospholipide-PEG (ou un poloxamère en l'absence de cholestérol), et d'un AGP dans un solvant organique, l'élimination du solvant pour produire un film phospholipidique, l'addition du film à du tampon HEPES ou du tampon HEPES dans du sérum physiologique, la dispersion du film dans la solution, et l'extrusion de la solution successivement à travers des filtres de polycarbonate pour former des liposomes unilamellaires. La composition liposomale peut être en outre filtrée de façon aseptique.

Dans un mode de réalisation approprié, une composition liposomale présente une incorporation élevée d'un agoniste du TLR4 (par exemple, un AGP) lorsque le liposome est formé avec du cholestérol.

Dans un autre mode de réalisation, une composition liposomale présente une incorporation élevée d'un AGP particulier, CRX 601, lorsque le liposome est formé sans stérol comme le cholestérol, fournissant des avantages pour la production et la formulation de telles compositions liposomales, y compris des compositions liposomales comprenant un poloxamère.

Les liposomes de la présente invention sont bénéfiques dans à la fois la production et l'utilisation d'une composition pharmaceutique. D'autres modes de réalisation sont divulgués dans les descriptions, les figures et les revendications fournies ici.

Brève description des dessins

La figure 1 représente la stabilité des liposomes-adjuvants en présence de méthylglycol chitosane (MGC). Les valeurs de taille/IPD et de potentiel □ avec une concentration croissante de MGC pour les liposomes chargés d'adjuvant non modifiés, modifiés par PE-PEG2K et PE-PEG5K (A) et (C) ; et les liposomes modifiés par Pluronic L64, F68 et F127 (B) et (D). Pour (A) et (B), les tailles sont représentées sous forme de barres et les valeurs d'IPD sous forme de points. Les données sont exprimées en moyenne + ET, (n = 3). Les particules dans la plage de tailles de l'ordre du Qn ont eu tendance à précipiter dans le temps.

La figure 2 représente la caractérisation de liposomes de phospholipide-PEG chargés d'adjuvant en présence de méthylglycol chitosane (MGC). Les valeurs de taille/IPD et de potentiel □ avec une concentration croissante de MGC pour les liposomes chargés d'adjuvant modifiés par PE-PEG2K et PE-PEG5K à 1 % (rangée du haut) et 25 % (rangée du bas) . Les tailles sont représentées sous forme de barres et les valeurs d'IPD sous forme de points. Les données sont exprimées en moyenne ± ET, (n = 2) pour la modification à 1 % en mole (rangée du haut) et n = 1 pour la modification à 25 % en mole (rangée du bas) . Les particules dans la plage de tailles de 1'ordre du Qn ont eu tendance à précipiter dans le temps.

La figure 3 représente la caractérisation de liposomes de Pluronic chargés d'adjuvant en présence de méthylglycol chitosane (MGC). Les valeurs de taille/IPD et de potentiel □ avec une concentration croissante de MGC pour les liposomes chargés d'adjuvant modifiés par Pluronic L64, F68 et F127 à 15 % (rangée du haut) et 25 % (rangée du bas) . Les tailles sont représentées sous forme de barres et les valeurs d'IPD sous forme de points. Les données sont exprimées en moyenne ± ET, (n = 2) pour la modification à 1 % en mole (rangée du haut) et n = 1 pour la modification à 25 % en mole (rangée du bas) . Les particules dans la plage de tailles de 1'ordre du Qn ont eu tendance à précipiter dans le temps.

La figure 4 représente les titres des IgG sériques postsecondaires (en haut), les titres des IgG sériques posttertiaires (au milieu) et les titres IH et les titres d'IGA des liquides de lavage trachéal/vaginal post-tertiaires (en bas) d'après une étude de liposomes modifiés par phospholipide-PEG. Les liposomes avec 1, 5 et 25 % en mole de substitution MPEG-2000-DSPE ou MPEG-5000-DPPE ont été évalués à une dose de 5 Dg de CRX-601/animal/vaccination. La dose de CRX-601 dans le témoin IM est de 1 Dg/animal/vaccination.

La figure 5 représente les titres IH post-tertiaires (A) et les titres des IGA des liquides de lavage trachéal/vaginal post-tertiaires (B) d'après une étude de liposomes modifiés par phospholipide-PEG.

Figure 6. Titres des IgG sériques post-secondaires (en haut), titres des IgG sériques post-tertiaires (au milieu) et titres des IGA des liquides de lavage trachéal/vaginal posttertiaires (en bas) d'après une étude de liposomes modifiés par le poloxamère 407. Les liposomes avec 5, 10 et 15 % en mole de substitutions poloxamère 407 ont été évalués à une dose de 1 ou 5 Dg de CRX-601/animal/dose de vaccination.

Figure 7. Titres des IgG sériques post-secondaires (en haut), titres des IgG sériques post-tertiaires (au milieu) et titres des IGA des liquides de lavage trachéal/vaginal posttertiaires (en bas) d'après une étude de liposomes modifiés par les poloxamères 407, 188, et 184. Les liposomes avec 15 et 25 % en mole de substitutions poloxamères 407, 188 ou 184 ont été évalués à une dose de 5 Dg de CRX-601/animal/dose de vaccination.

La figure 8 représente les titres IH post-tertiaires (A) et les titres des IGA des liquides de lavage trachéal/vaginal (B) d'après une étude de liposomes modifiés par les poloxamères 407, 188, et 184. Sur les panneaux, les étiquettes de la figure représentent le poloxamère 407 (F127), le poloxamère 188 (F68) et le poloxamère 184 (L64).

Figure 9. Titres des IgG sériques post-secondaires (en haut), titres des IgG sériques post-tertiaires (au milieu) et titres des IGA des liquides de lavage trachéal/vaginal posttertiaires (en bas) d'après une étude de liposomes modifiés + méthylglycol chitosane. Les liposomes en combinaison avec du méthylglycol chitosane ont été évalués à une dose de 5 üg de CRX-601/animal/vaccination. La dose de CRX-601 dans le témoin IM est de 1,5 Dg/animal/vaccination.

Figure 10. Titres des IgG sériques post-secondaires (A), titres des IgG sériques post-tertiaires (B) et titres IH posttertiaires (C) et titres des IGA des liquides de lavage trachéal/vaginal (D) d'après une étude de liposomes modifiés par phospholipide-PEG + méthylglycol chitosane ou chitosane oligosaccharide lactate. Les liposomes avec 5 % en mole de substitution MPEG-2000-DSPE ou MPEG-5000-DPPE en combinaison avec du méthylglycol chitosane ou du chitosane oligosaccharide lactate ont été évalués à une dose de 5 Dg de CRX-601/animal/ vaccination. La dose de CRX-601 dans le témoin IM est de 1,5 Dg/animal/vaccination.

Figure 11. Titres des IgG sériques post-secondaires (en haut), titres des IgG sériques post-tertiaires (au milieu) et titres des IGA des liquides de lavage trachéal/vaginal posttertiaires (en bas) d'après une étude de liposomes modifiés par le poloxamère 407 (sur les légendes de la figure, indiqué par F127) + méthylglycol chitosane. Les liposomes avec 5, 15 ou 15 % en mole d'addition de poloxamère 407 en combinaison avec du méthylglycol chitosane ont été évalués à une dose de 5 Dg de CRX-601/animal/vaccination. La dose de CRX-601 dans le témoin IM est de 1,5 Dg/animal/vaccination.

Figure 12. Titres des IgG sériques post-secondaires (A), titres des IgG sériques post-tertiaires (B), titres IH posttertiaires (C) et titres des IGA des liquides de lavage trachéal/vaginal d'après une étude de liposomes modifiés + méthylglycol chitosane. Les liposomes en combinaison avec du méthylglycol chitosane ont été évalués à une dose de 5 Dg de CRX-601/animal/vaccination. La dose de CRX-601 dans le témoin IM est de 1,5 Dg/animal/vaccination.

Description détaillée de l'invention Liposomes

Le terme « liposome(s) » se rapporte généralement à des structures lipidiques uni- ou multilamellaires (en particulier 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 lamellaires selon le nombre de membranes lipidiques formées) renfermant un intérieur aqueux. Les liposomes et les formulations liposomales sont bien connus de l'état de l'art. Les lipides qui sont capables de former des liposomes comprennent toutes les substances dotées de propriétés graisseuses ou de type graisseux. Les lipides qui peuvent constituer les lipides dans les· liposomes peuvent être choisis dans le groupe comprenant des glycérides, des glycérophospholipides, des glycérophosphinolipides, des glycérophosphonolipides, des sulfolipides, des sphingolipides, des phospholipides, des isoprénolides, des stéroïdes, des stéarines, des stérols, des archéolipides, des lipides cationiques de synthèse et des lipides contenant des glucides.

Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les liposomes comprennent un phospholipide. Les phospholipides appropriés comprennent (mais n’y sont pas limités) : la phosphocholine (PC) qui est un intermédiaire dans la synthèse de la phosphatidylcholine ; des dérivés de phospholipides naturels : la phosphocholine d’œuf, , la phosphocholine de soja, la phosphocholine hydrogénée de soja, la sphingomyéline comme phospholipides naturels ; et des dérivés de phospholipides de synthèse : la phosphocholine (didécanoyl-L-a-phosphatidylcholine [DDPC] , dilauroylphosphatidylcholine [DLPC], dimyristoyl-phosphatidylcholine [DMPC], dipalmitoyl-phosphatidylcholine [DPPC] , distéaroyl-phosphatidylcholine [DSPC], dioléoyl-phosphatidylcholine [DOPC], 1-palmitoyl,2-oléoyl-phosphatidylcholine [POPC], diélaïdoyl-phosphatidylcholine [DEPC]), le phosphoglycérol (1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol [DMPG], 1/2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol [DPPG], 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol [DSPG], l-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol [POPG]), l'acide phosphatidique (acide 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphatidique [DMPA], acide dipalmitoyl-phosphatidique [DPPA], acide distéaroyl-phosphatidique [DSPA]), la phosphoéthanolamine (1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine [DMPE], 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine [DPPE], 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine [DSPE], 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine [DOPE]), la phosphosérine, le polyéthylène glycol [PEG]-phospholipide (mPEG-phospholipide, polyglycérine-phospholipide, phospholipide fonctionnalisé, phospholipide activé terminal), le 1,2-dioléoyl-3-(triméthylammonium)propane (DOTAP) et la sphingomyéline (SPNG) . Dans un mode de réalisation, les liposomes comprennent la l-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphoéthanolamine. Dans un mode de réalisation, de la phosphatidylcholine hautement purifiée est utilisée et peut être choisie dans le groupe comprenant la phosphatidylcholine (d'œuf), la phosphatidylcholine hydrogénée (d'œuf), la phosphatidylcholine (de soja), et la phosphatidylcholine hydrogénée (de soja). Dans un autre mode de réalisation, les liposomes comprennent de la phosphatidyléthanolamine [POPE] ou l'un de ses dérivés.

La taille du liposome peut varier de 30 nm à 5 Qn selon la composition phospholipidique et le procédé utilisé pour leur préparation. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, la taille du liposome se situera dans la plage de 30 nm à 500 nm et dans d'autres modes de réalisation de 50 nm à 200 nm, de façon appropriée inférieure à 200 nm. La diffusion dynamique de la lumière laser est un procédé utilisé pour mesurer la taille des liposomes bien connu de l'homme du métier.

Dans une formulation liposomale appropriée, le lipide comprend la dioléoyl-phosphatidylcholine [DOPC] (2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) et un stérol, en particulier du cholestérol, et éventuellement en l'absence de stérol.

Composition liposomale

Une « composition liposomale » est une composition préparée comprenant un liposome et le contenu au sein du liposome, particulièrement y compris, mais sans y être limité : a) les lipides qui forment la ou les bicouche(s) du liposome, b) des composés autres que les lipides au sein de la ou des bicouche(s) du liposome, c) des composés au sein et associés à l'intérieur ou à 1' (aux) intérieur(s) aqueux du liposome, et d) des composés liés ou associés à la couche externe du liposome.

Ainsi, en plus des lipides du liposome, une composition liposomale de la présente invention peut comprendre de façon appropriée, mais n'y est pas limitée, des composants pharmaceutiquement actifs, des antigènes vaccinaux et des adjuvants, des excipients, des supports, des agents muco-adhérents, des agents muco-pénétrants et des agents tampons. Dans un mode de réalisation préféré, de tels composés sont complémentaires et/ou ne sont pas significativement préjudiciables pour la stabilité ou l'efficacité d'incorporation des AGP de la composition liposomale. « Formulation liposomale » signifie une composition liposomale, telle que celles décrites ici, formulée de façon appropriée avec d'autres composés pour le stockage et/ou l'administration à un sujet.

Ainsi, une « formulation liposomale » de la présente invention comprend une composition liposomale telle que définie ici, et peut comprendre en outre, mais n'y est pas limitée, des compositions liposomales en dehors de la portée de la présente invention, ainsi que des composés pharmaceutiquement actifs, des antigènes de vaccin et des adjuvants, des excipients, des supports et des agents tampons. Dans un mode de réalisation préféré, de tels composés sont complémentaires et/ou ne sont pas significativement préjudiciables pour la stabilité ou l'efficacité d'incorporation des AGP de la composition liposomale de la présente invention.

Composés aminoalkyle glucosaminide phosphate. Les AGP sont des modulateurs du récepteur de type Toll-4 (TLR4) . Le récepteur de type Toll-4 reconnaît le LPS (lipopolysaccharide) bactérien et lorsqu'il est activé, il initie une réponse immunitaire innée. Les AGP sont des mimétiques monosaccharidiques du lipide A du LPS bactérien et ils ont été développés avec des liaisons éther et ester sur les « chaînes acyle » du composé. Des procédés de fabrication de ces composés sont connus et divulgués, par exemple, dans le document WO 2006/016997, les brevets US No. 7 288 640 et 6 113 918, et le document WO 01/90129, qui sont incorporés ici par référence dans leur intégralité. D'autres AGP et des procédés apparentés sont divulgués dans le brevet US No. 7 129 219, le brevet US No. 6 525 028 et le brevet US No. 6 911 434. Les AGP avec des liaisons éther sur les chaînes acyle employés dans la composition de l'invention sont connus et divulgués dans le document WO 2006/016997 qui est incorporé ici par référence dans son intégralité. Sont d'un intérêt particulier, les composés aminoalkyle glucosaminide phosphate présentés et décrits selon la formule (III) aux paragraphes [0019] à [0021] dans le document WO 2006/016997.

Les composés aminoalkyle glucosaminide phosphate employés dans la présente invention ont la structure représentée par la formule 1 suivante :

(Formule 1) dans laquelle m vaut 0 à 6 n vaut 0 à 4 ; X représente 0 ou S, de préférence 0 ; Y représente 0 ou NH ; Z représente 0 ou H ; chaque Ri, R2, R3 est choisi indépendamment dans le groupe constitué d'un groupe acyle en Ci à C2o et d'un groupe alkyle en Ci à C2o ; R4 représente H ou Me ; R5 est choisi indépendamment dans le groupe constitué des groupes -H, -OH, -alcoxy en Cx à C4, -PO3R8R9, -OPO3R8R9, -SO3R8, -OSO3R8, -NR8R9, —SR8, -CN, -NO2, -CHO, -C02R8, et -CONR8R9, où R8 et R9 sont choisis chacun indépendamment parmi H et un groupe alkyle en Ci à C4 ; et chaque R6 et R7 représente indépendamment H ou PO3H2.

Dans la formule 1, la configuration des 3 centres stéréogènes auxquels les résidus d'acyle gras normaux (c'est-à-dire, les résidus acyloxy ou alcoxy secondaires, par exemple, RiO, R2O, et R3O) sont fixés, est R ou S, de préférence R (comme il est désigné par les règles de priorité de Cahn-Ingold-Prelog). La configuration des centres stéréogènes de l'aglycone auxquels R4 et R5 sont fixés, peut être R ou S. Tous les stéréoisomères, à la fois les énantiomères et les diastéréomères, et leurs mélanges, sont considérés comme se situant au sein de la portée de la présente invention.

Le nombre d'atomes de carbone entre 1'hétéroatome X et l'atome d'azote de l'aglycone est déterminé par la variable « n », qui peut être un nombre entier de 0 à 4, de préférence un nombre entier de 0 à 2.

La longueur de la chaîne des acides gras normaux Ri, R2 et R3 peut être d'environ 6 à environ 16 carbones, de préférence d'environ 9 à environ 14 carbones. Les longueurs des chaînes peuvent être identiques ou différentes. Certains modes de réalisation préférés comprennent des longueurs de chaîne où RI, R2 et R3 sont de 6 ou 10 ou 12 ou 14.

La formule 1 englobe des AGP L/D-séryl-, -thréonyl-, -cystéinyl-éther et ester lipides, à la fois des agonistes et des antagonistes et leurs homologues (n = 1 à 4), ainsi que divers bio-isostères d'acide carboxylique (c'est-à-dire, R5 est un groupe acide capable de former un sel ; le phosphate peut être en position soit 4 soit 6 de l'unité de glucosamine, mais de préférence il est en position 4).

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention employant un composé AGP de formule 1, n vaut 0, R5 représente C02H, R6 représente PO3H2, et R7 représente H. Ce composé AGP préféré est représenté par la structure de formule la suivante :

(Formule la) dans laquelle X représente 0 ou S ; Y représente 0 ou NH ; Z représente 0 ou H ; chaque Ri, R2, R3 est choisi indépendamment dans le groupe constitué d'un groupe acyle en Ci à C20 et d'un groupe alkyle en Ci à C20 / et R4 représente H ou un groupe méthyle.

Dans la formule la, la configuration des 3 centres stéréogènes auxquels les résidus d'acyle gras normaux (c'est-à-dire, les résidus acyloxy ou alcoxy secondaires, par exemple, RiO, R2O, et R3O) sont fixés, est R ou S, de préférence R (comme il est désigné par les règles de priorité de Cahn-Ingold-Prelog) . La configuration des centres stéréogènes de l'aglycone auxquels R4 et CO2H sont fixés, peut être R ou S. Tous les stéréoisomères, à la fois les énantiomères et les diastéréomères, et leurs mélanges, sont considérés comme se situant au sein de la portée de la présente invention.

La formule la englobe des AGP, L/D-séryl-, -thréonyl-, -cystéinyl-éther ou ester lipides, à la fois des agonistes et des antagonistes.

Dans à la fois la formule 1 et la formule la, Z est fixé à 0 par une double liaison ou deux atomes d'hydrogène qui sont chacun fixés par une liaison simple. C'est-à-dire que le composé est lié par un ester lorsque Z = Y = 0 ; lié par un amide lorsque Z = 0 et Y = NH ; et lié par un éther lorsque Z = H/H et Y = 0.

Les composés de formule 1 spécialement préférés sont appelés CRX-601 et CRX-527. Leurs structures sont représentées comme suit :

(CRX-527) (CRX-601)

En outre, un autre mode de réalisation préféré emploie CRX-547 ayant la structure représentée.

(CRX 547)

Encore d'autres modes de réalisation comprennent des AGP comme CRX 602 ou CRX 526 fournissant une stabilité accrue aux AGP comportant des chaînes acyle ou alkyle secondaires plus courtes. (CRX 602)

(CRX-526) D'autres AGP appropriés pour une utilisation dans la présente invention comprennent CRX 524 et CRX 529.

Tampons

Dans un mode de réalisation de la présente invention, une composition liposomale est tamponnée en utilisant un tampon zwittérionique. De façon appropriée, le tampon zwittérionique est un acide d'aminoalcanesulfonique ou un sel approprié. Les exemples de tampons aminoalcanesulfoniques comprennent, mais n'y sont pas limités, HEPES, HEPPS/EPPS, MOPS, MOBS et PIPES. De préférence, le tampon est un tampon pharmaceutiquement acceptable, approprié pour une utilisation chez les êtres humains, comme pour une utilisation dans un produit d'injection commercial. Est préféré entre tous, le tampon HEPES. La composition liposomale peut comprendre de façon appropriée un AGP.

Dans des modes de réalisation appropriés de la présente invention, les liposomes sont tamponnés en utilisant un tampon choisi dans le groupe constitué de : i) HEPES ayant un pH d'environ 7, ii) citrate (par exemple, citrate de sodium) ayant un pH d'environ 5, et iii) acétate (par exemple, acétate d'ammonium) ayant un pH d'environ 5.

Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, les AGP CRX-601, CRX-527 et CRX-547 sont inclus dans une composition liposomale tamponnée en utilisant du HEPES ayant un pH d'environ 7. Les tampons peuvent être utilisés avec une quantité appropriée de sérum physiologique ou d'un autre excipient pour obtenir l'isotonicité souhaitée. Dans un mode de réalisation préféré, du sérum physiologique à 0,9 % est utilisé.

HEPES : numéro d'enregistrement CAS : 7365-45-9 CsHia^C^S

Acide 1-pipérazineéthanesulfonique, 4-(2-hydroxyéthyl)- HEPES est un tampon zwittérionique conçu pour tamponner la plage de pH physiologiques d'environ 6 à environ 8 (par exemple, 6,15 à 8,35) et plus spécifiquement d'une plage plus utile d'environ 6,8 à environ 8,2 et, comme dans la présente invention, entre environ 7 et environ 8 ou entre 7 et 8, et de préférence entre environ 7 et moins de 8. HEPES est généralement une poudre cristalline blanche et a la formule moléculaire : C8H18N2O4S de structure suivante :

HEPES est bien connu et disponible dans le commerce. (Voir, par exemple, Good et al., Biochemistry 1966).

PEG

Le polyéthylène glycol (PEG), également connu sous le nom d'oxyde de polyéthylène (PEO) ou polyoxyéthylène (POE) est un polymère hydrophile (polyéther) avec de nombreuses applications allant de la fabrication industrielle à la médecine. Ce polymère est peu coûteux, présente une bonne biocompatibilité et a été approuvé pour des applications internes chez les êtres humains par les organismes réglementaires. Les chaînes de PEG de poids moléculaires situés dans la plage de 1 à 15 kDa ont été largement employées comme protecteurs stériques dans divers systèmes colloïdaux. Grâce à sa solubilité aqueuse élevée, sa mobilité élevée et son gros volume d'exclusion, le PEG hydraté forme une brosse dense de chaînes polymères se déployant et couvrant la surface de la particule. Ceci minimise l'énergie libre interfaciale de la surface de la particule, et empêche son interaction avec d'autres particules, fournissant une stabilité colloïdale au système. La capacité d'un enrobage par du PEG à empêcher l'interaction avec des protéines et d'autres biomolécules dans le sang et les cellules a été largement utilisée pour prolonger le temps de circulation de supports de médicaments dans le sang, pour réduire l'opsonisation des particules et les rendre moins reconnaissables par le système réticuloendothélial (SRE) dans le foie et la rate. En particulier, pour une administration par la voie mucosale, il a été montré que le PEG, selon la longueur de ses chaînes, possède des propriétés à la fois muco-adhérentes (chaîne longue) et muco-inertes (chaîne courte).

La modification de la surface de supports de médicaments colloïdaux, en particulier des liposomes, avec du PEG peut être obtenue de plusieurs manières : 1) en utilisant des conjugués de PEG-lipide amphiphile, des copolymères de PEG comme des poloxamères, ou d'autres de ces conjugués PEG hydrophobes, soit en les absorbant physiquement sur la surface des vésicules, soit en les incorporant durant la préparation des liposomes, ou 2) en greffant de façon covalente des chaînes de PEG avec des groupes fonctionnels terminaux à des groupes réactifs sur la surface des liposomes préformés.

Conjugués de phospholipide-PEG

Les conjugués de PEG avec des phospholipides ont été largement employés pour incorporer du PEG sur des liposomes. La partie phospholipide agit comme une ancre par incorporation dans l'intérieur hydrophobe de la bicouche et greffe la chaîne de PEG à la surface aqueuse du liposome. Ces conjugués présentent une excellente biocompatibilité. Plusieurs conjugués différents, selon la longueur de la chaîne du PEG et le type de phospholipide utilisé sont disponibles. Doxil, une formulation liposomale de doxorubicine cliniquement approuvée, et de nombreuses autres formulations liposomales dans des essais cliniques en phase finale (comme Lipoplatine, SPI-77, Lipoxal, etc.) sont basées sur ce concept d'incorporation de PEG-phospholipides.

De nombreux conjugués de phospholipide-PEG sont connus de l'état de l'art et de nombreux conjugués de phospholipide-PEG sont disponibles dans le commerce, comme : MPEG-2000-DSPE : sel sodique de N-(carbonyl-méthoxy- polyéthylène glycol-2000)-1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phospho-éthanolamine, MPEG-5000-DPPE : sel sodique de N-(carbonyl-méthoxy- polyéthylène glycol-5000)-1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3- phospho-éthanolamine. D'autres conjugués de phospholipide-PEG apparentés comprennent, mais n'y sont pas limités : DPPE-mPEG(1000) : 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phospho- éthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-1000] (sel d'ammonium) ; DSPE-mPEG(1000) : 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phospho- éthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-1000] (sel d'ammonium) ; DOPE-mPEG(1000) : 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho- éthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-1000] (sel d'ammonium) ; DPPE-mPEG(2000) : 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phospho- éthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (sel d'ammonium) ; DOPE-mPEG(2000) : 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho- éthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (sel d'ammonium) ; DSPE-mPEG(5000) : 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phospho- éthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-5000] (sel d'ammonium) ; et DOPE-mPEG(5000) : 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho- éthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-5000] (sel d'ammonium).

Poloxamères

Les poloxamères sont des copolymères triséquencés non ioniques amphiphiles composés d'une chaîne hydrophobe centrale de polyoxypropylène (poly(oxyde de propylène)) flanquée de deux chaînes de PEG hydrophiles. Les poloxamères sont également connus sous les noms commerciaux de Synperonics, Pluronics et Kolliphor. Les longueurs des séquences des polymères peuvent être personnalisées, ainsi il existe de nombreux poloxamères différents, différant dans leurs propriétés et ils peuvent exister sous la forme de liquides, de pâtes ou de solides. En raison de leur structure amphiphile, ces polymères sont dotés de propriétés tensioactives qui peuvent être utilisées pour émulsifier des substances insolubles dans l'eau, former des associations supramoléculaires (micelles ou vésicules) dans des solutions aqueuses qui peuvent piéger divers composés, ou ils peuvent être incorporés dans d'autres particules colloïdales comme des liposomes. Un trait caractéristique de ces polymères de synthèse est une toxicité relativement faible et une compatibilité biologique. Pour cette raison, ces polymères sont couramment utilisés dans des applications industrielles, des produits cosmétiques et des produits pharmaceutiques. Ils ont été également utilisés en thérapie pour des brûlures et des plaies, dans des cryoprotecteurs, des émulsifiants de médicaments, des adjuvants de vaccins, en imagerie médicale, dans la prise en charge de maladies vasculaires et il a été montré qu'ils sensibilisent des cancers pharmacorésistants à une chimiothérapie. La séquence hydrophobe centrale est essentielle à l'incorporation des poloxamères dans les bicouches des liposomes et d'autres particules colloïdales d'administration de médicaments.

Les poloxamères pharmaceutiquement acceptables comprennent, mais n'y sont pas limités : poloxamère 407 (Pluronic® F127) ; poloxamère 184 (Pluronic® L64) et poloxamère 188 (Pluronic® L68)

Pluronic est une marque déposée par BASF.

De nombreux autres poloxamères sont disponibles dans le commerce.

Chitosane

Le chitosane est un polysaccharide cationique naturel dérivé de la chitine par une désacétylation partielle de ses groupes acétamido dans des solutions fortement alcalines. Durant les deux dernières décennies, le chitosane a trouvé une utilisation très répandue dans des applications biomédicales et d'administration de médicaments grâce à sa faible toxicité, sa bonne biocompatibilité et ses excellentes propriétés muco-adhérentes (van der Lubben, I. M., Verhoef, J. C., Borchard, G. & Junginger, H. E. Chitosan for mucosal vaccination. Adv. Drug Deliv. Rev. 52, 139-144, 2001). On pense que l'adhérence mucosale du chitosane implique des mécanismes complexes, avec l'interaction électrostatique entre le chitosane cationique et l'enrobage de mucine anionique sur la surface mucosale étant le facteur principal, bien que l'on pense que les liaisons hydrogène et les effets hydrophobes jouent également un rôle significatif.

Le chitosane non dérivatisé présente une solubilité limitée (□! mg/ml) et il est soluble uniquement dans des conditions acides (pH < 6,5). Toutefois, les dérivés du chitosane comme le glycol chitosane, le méthylglycol chitosane, et le chitosane oligosaccharide lactate présentent une solubilité significativement améliorée ([10 mg/ml) au pH physiologique.

Les dérivés du chitosane disponibles dans le commerce comprennent, mais n'y sont pas limités : le chitosane oligosaccharide lactate, le glycol chitosane, ou le méthylglycol chitosane (MGC). Ces dérivés présentent des propriétés physiques variables par rapport au chitosane, qui peuvent les rendre plus appropriés pour une utilisation avec des antigènes, des adjuvants, des liposomes et analogues.

Préparation des liposomes

Les procédés classiques pour fabriquer des liposomes comprennent, mais n'y sont pas limités, des procédés rapportés dans Liposomes: A Practical Approach, V. P. Torchilin, Volkmar Weissig Oxford University Press, 2003 et sont bien connus de l'état de l'art.

Dans un procédé approprié de fabrication d'une composition liposomale de la présente invention, un AGP (par exemple, CRX-601 (0,2 % p/p) ) et la DOPC (spécifiquement, la 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine, 3 à 4 % p/v) et éventuellement un stérol (par exemple, le cholestérol (1 % p/v) ) sont dissous dans une phase organique de chloroforme ou de tétrahydrofurane dans un ballon à fond arrondi. Le solvant organique est éliminé par évaporation sur un évaporateur rotatif et en outre avec une pression élevée sous vide pendant 12 h. Au film phospholipidique mixte ainsi obtenu, sont ajoutés 10 ml d'un tampon aminoalcanesulfonique comme 10 mM de HEPES ou un tampon 10 mM de HEPES-sérum physiologique pH 7,2. Le mélange est soniqué sur un bain-marie (20 à 30 °C) et passé au vortex de façon intermittente jusqu'à ce que le film le long des parois du ballon soit dispersé dans la solution (30 min à 1,5 h). La solution est ensuite extrudée successivement à travers des filtres de polycarbonate à l'aide d'un mini-extrudeur de lipides (extrudeur Lipex™ (Northern Lipids Inc., Canada)) pour former des liposomes unilamellaires. La composition liposomale est ensuite filtrée de façon aseptique en utilisant un filtre de 0,22 pm dans un récipient dépyrogéné stérile. La taille moyenne des particules de la formulation résultante mesurée par diffusion dynamique de la lumière est de 80 à 120 nm avec un potentiel zêta négatif net. La formulation représente des concentrations cibles finales de 2 mg/ml de CRX-601, 10 mg/ml de cholestérol, et 40 mg/ml de phospholipide totaux.

De façon appropriée, un PEG-phospholipide (par exemple, MPEG-2000-DSPE (0,1 à 3 % p/v) ou MPEG-5000-DPPE (0,3 à 6 % p/v) ) ou un poloxamère (par exemple, le poloxamère 407 (1 à 16 % p/v) ) est dissous avec les lipides AGP et DOPC au début du procédé. De façon appropriée, la composition liposomale dans les formulations peut être mélangée avec une solution aseptique de chitosane (par exemple, MGC 200 mg) dissous dans du HEPES. L'aminoalkyle glucosaminide 4-phosphate (AGP) CRX-601 utilisé dans ces travaux peut être synthétisé comme il a été décrit précédemment {Bazin, 2008 32447 /id}, et purifié par chromatographie (jusqu'à > 95 % de pureté). CRX-601, soit dans le matériau de départ soit dans le produit final, peut être quantifié par un procédé analytique de CLHP en phase inverse classique.

Dans un mode de réalisation durant la préparation des liposomes, le CRX-601 formulé dans le tampon HEPES (pH = 7,0) obtient la réduction souhaitée de la taille des particules cinq fois plus rapidement, comparativement au tampon d'hydratation des liposomes (« LHB », à base de phosphate, pH = 6,1). La réhydratation des films lipidiques de CRX-601 dans du tampon HEPES nécessite quatre fois moins de pression totale et de temps pour formuler les liposomes comparativement au tampon phosphate LHB. Ceci est une amélioration significative puisque cela libère à la fois de l'énergie et du temps et exerce beaucoup moins de stress sur les AGP durant le traitement des liposomes.

Les plages appropriées (p/v) des composants d'une composition liposomale comprennent un mode de réalisation comprenant un lipide dans une plage d'environ 3 à 4 % p/v, un stérol à 1 % p/v, un composant actif, comme un AGP, dans la plage de 0,1 à 1 % p/v et un tampon aminoalcanesulfonique à 10 mM. Dans un mode de réalisation, le stérol est de façon appropriée présent dans une plage de 0,5 à 4 % p/v. En outre, dans un mode de réalisation, le rapport lipide/stérol/ composant actif est d'environ 3 à 4/1/0,1 à 1.

Exemples

Préparation de liposomes de DOPC modifiés avec du CRX-601

Exemple 1 - Liposomes avec 1 % en mole de substitution MPEG-2000-DSPE

Le % en mole de substitution dans cet exemple se rapporte à la quantité de MPEG-2000-DSPE par rapport à la teneur totale en phospholipides. Le CRX-601 (20 mg) , la 1,2-dioléoyl-sn- glycéro-3-phosphocholine, abrégée en DOPC (396 mg) , le cholestérol (100 mg) et le PEG-phospholipide [sel sodique de N-(carbonyl-méthoxypolyéthylène glycol-2000)-1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine, abrégé en MPEG-2000-DSPE (15 mg) ] ont été dissous dans une phase organique de tétrahydrofurane dans un ballon à fond arrondi. Le solvant organique a été éliminé par évaporation sur un évaporateur rotatif et en outre sous vide à haute pression pendant 12 h. Au film phospholipidique mixte ainsi obtenu, ont été ajoutés 10 ml de tampon 10 mM de HEPES ou 10 mM de sérum physiologique pH 7,2. Le mélange a été soniqué sur un bain-marie (20 à 30 °C) et passé au vortex de façon intermittente jusqu'à ce que le film le long des parois du ballon soit dispersé dans la solution (30 min à 1,5 h) . La solution a été ensuite extrudée successivement à travers des filtres de polycarbonate ayant une taille de pore de 600 nm (1 passage) , 400 nm (1 passage) , et 200 nm (2 à 4 passages) à l'aide d'un mini-extrudeur de lipides (extrudeur Lipex™ (Northern Lipids Inc., Canada)) pour former des liposomes unilamellaires. La composition liposomale a été ensuite filtrée de façon aseptique en utilisant un filtre de 0,22 pm dans un récipient dépyrogéné stérile. La taille moyenne des particules de la formulation résultante mesurée par diffusion dynamique de la lumière a été de 80 à 120 nm avec un potentiel zêta négatif net. La formulation représente des concentrations cibles finales de 2 mg/ml de CRX-601, 10 mg/ml de cholestérol, et 40 mg/ml de phospholipides totaux. L'aminoalkyle glucosaminide 4-phosphate (AGP) CRX-601 utilisé dans ces travaux a été synthétisé comme il a été décrit précédemment {Bazin, 2008 32447 /id}, et purifié par chromatographie (jusqu'à > 95 % de pureté) . Le CRX-601, soit dans le matériau de départ soit dans le produit final a été quantifié par un procédé analytique classique de CLHP en phase inverse.

Exemple 2 - Liposomes avec un % en mole supérieur de substitution MPEG-2000-DSPE

Les formulations liposomales ont été préparées comme dans l'exemple 1 mais avec des quantités variables de DOPC et de MPEG-2000-DSPE pour obtenir le % en mole souhaité de

Substitution. Les formulations avec des substitutions ciblées de 5, 10, 15, et 25 % en mole ont été préparées. Les tailles moyennes de particules et le potentiel zêta représentatifs mesurés par diffusion dynamique de la lumière sont présentés dans le tableau 1. Les formulations avec plus de 25 % en mole de substitutions sont difficiles à préparer, limitées par la dissolution du film lipidique dans le tampon durant la sonication, lorsque la limite de solubilité des composants est approchée. A des substitutions élevées, on s'attend à ce que les PEG-phospholipides saturent la bicouche des liposomes avec un excès en solution sous la forme de micelles ou d'unimères.

Tableau 1

Paramètres représentatifs des formulations pour des liposomes de DOPC-cholestérol modifiés par MPEG-2000-DSPE

Exemple 3 - Liposomes avec 1 % en mole de substitution MPEG-5000-DPPE

La formulation liposomale a été préparée comme dans l'exemple 1 mais avec le PEG-phospholipide [sel sodique de N-(carbonyl-méthoxypolyéthylène glycol-5000)-1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine, abrégé en MPEG-5000-DPPE (33 mg) ] utilisé à la place du MPEG-2000-DSPE. La taille moyenne des particules de la formulation résultante mesurée par diffusion dynamique de la lumière a été de 80 à 120 nm.

Exemple 4 - Liposomes avec un % en mole supérieur de substitution MPEG-5000-DPPE

Les formulations liposomales ont été préparées comme dans l'exemple 3 mais avec des quantités variables de DOPC et de MPEG-5000-DPPE pour obtenir le % en mole souhaité de substitution. Les formulations avec des substitutions ciblées de 5, 10, 15, et 25 % en mole ont été préparées. Les tailles moyennes de particules et le potentiel zêta représentatifs mesurés par diffusion dynamique de la lumière sont présentés dans le tableau 2. Les formulations avec plus de 25 % en mole de substitutions sont difficiles à préparer, limitées par la dissolution du film lipidique dans le tampon durant la sonication, lorsque la limite de solubilité des composants est approchée. A des substitutions élevées, on s'attend à ce que les PEG-phospholipides saturent la bicouche des liposomes avec un excès en solution sous la forme de micelles ou d'unimères.

Tableau 2

Paramètres représentatifs des formulations pour des liposomes de DOPC-cholestérol modifiés par MPEG-5000-DPPE

Exemple 5 - Préparation de liposomes avec addition de 1 % en mole de poloxamère 407

Le % en mole d'addition dans cet exemple se rapporte à la quantité de poloxamère par rapport au contenu total en phospholipides. Le CRX-601 (20 mg) , la DOPC (400 mg) , et le poloxamère 407 (64 mg) ont été dissous dans une phase organique de tétrahydrofurane dans un ballon à fond arrondi et traités comme il a été discuté dans l'exemple 1. Il n'a été inclus aucun cholestérol dans ces préparations car il a été rapporté qu'il réduit l'incorporation des poloxamères dans la bicouche phospholipidique. La taille moyenne des particules de la formulation résultante mesurée par diffusion dynamique de la lumière a été de 120 à 180 nm. La formulation représente les concentrations cibles finales de 2 mg/ml de CRX-601, 40 mg/ml de DOPC, et 1 % en mole (par rapport à la DOPC) de poloxamère 407.

Exemple 6 - Préparation de liposomes avec un % en mole supérieur d'addition de poloxamère 407

Les formulations liposomales ont été préparées comme dans l'exemple 5 mais en augmentant les quantités de poloxamère 407. Les formulations avec des substitutions ciblées de 5, 10, 15 et 25 % en mole ont été préparées. Les tailles moyennes de particules et le potentiel zêta représentatifs mesurés par diffusion dynamique de la lumière sont présentés dans le tableau 3. Les formulations avec plus de 25 % en mole d'additions sont difficiles à préparer, limitées par la dissolution du film de lipide-poloxamère dans le tampon durant la sonication, lorsque la limite de solubilité des composants est approchée. A des substitutions élevées, on s'attend à ce que le poloxamère 407 sature la bicouche des liposomes avec un excès en solution sous la forme de micelles ou d'unimères.

Tableau 3

Paramètres représentatifs des formulations pour les liposomes de DOPC modifiés par le poloxamère 407

Exemple 7 - Préparation de liposomes avec addition de poloxamère 188

Les formulations liposomales ont été préparées comme dans l'exemple 6 mais avec du poloxamère 188 à la place du poloxamère 407. Les formulations avec des substitutions ciblées de 15 et 25 % en mole ont été préparées. Les tailles moyennes de particules et le potentiel zêta représentatifs mesurés par diffusion dynamique de la lumière sont présentés dans le tableau 4.

Exemple 8 - Préparation de liposomes avec addition de poloxamère 184

Les formulations liposomales ont été préparées comme dans l'exemple 6 mais avec du poloxamère 184 à la place du poloxamère 407. Les formulations avec des substitutions ciblées de 15 et 25 % en mole ont été préparées. Les tailles moyennes de particules et le potentiel zêta représentatifs mesurés par diffusion dynamique de la lumière sont présentés dans le tableau 4.

Tableau 4

Paramètres représentatifs des formulations pour les liposomes de DOPC modifiés par le poloxamère 188 ou le poloxamère 184

Exemple 9 - Préparation de formulation liposomale avec du chitosane

Du méthylglycol chitosane (iodure de chitosane glycol triméthylammonium, 200 mg) a été dissous dans 10 ml de tampon 10 mM de HEPES-sérum physiologique pH 7,2 pour produire une concentration de 20 mg/ml. La solution a été filtrée de façon aseptique en utilisant un filtre de 0,22 pm dans un récipient dépyrogéné stérile. Les formulations des exemples 1 à 4 ont été mélangées de façon aseptique avec des volumes variables de solution de méthylglycol chitosane pour produire des concentrations situées dans la plage de 1 à 10 mg/ml. Alors que les formulations traditionnelles de liposomes de DOPC-cholestérol s'agrègent lors du mélange avec du chitosane ou ses dérivés y compris le méthylglycol chitosane (tableau 5), les liposomes modifiés (exemples 1 à 4) rapportés ici demeurent stables en suspension (tableau 6). Les tailles moyennes des particules et le potentiel zêta représentatifs mesurés par diffusion dynamique de la lumière présentés dans le tableau 6, indiquent une certaine augmentation de la taille des particules et une inversion du potentiel zêta (un potentiel positif net à partir d'un potentiel négatif net) en dépassant approximativement 1 mg/ml de méthylglycol chitosane, cohérent avec l'enrobage de la surface avec du méthylglycol chitosane. A des concentrations dépassant un certain seuil, on s'attend à ce que le méthylglycol chitosane sature la bicouche des liposomes, avec un excès en solution.

Tableau 5

Paramètres représentatifs des formulations indiquant une agrégation de la formulation liposomale de DOPC non modifiée avec des concentrations variables de méthylglycol chitosane (MGC). La concentration de CRX-601 est de 1 mg/ml dans tous les cas.

Tableau 6

Paramètres représentatifs des formulations pour les liposomes de DOPC-cholestérol modifiés par MPEG-2000-DSPE et MPEG-5000-DPPE enrobés de méthylglycol chitosane (MGC) à 1, 5, 15 et 30 % de modification liposomale préparés dans 10 mM de HEPES-sérum physiologique. La concentration de CRX-601 est de 1 mg/ml dans tous les cas.

Chitosane oligosaccharide lactate. Des études ont été réalisées de la même manière qu'avec le méthylglycol chitosane (MGC) ci-dessus à l'exception que du chitosane oligosaccharide lactate a été utilisé à la place du méthylglycol chitosane. Toutes les compositions testées avec des liposomes de l'exemple 1 ont présenté une agrégation. Toutes les autres formulations sont demeurées stables en suspension.

Glycol chitosane. Des études ont été réalisées de la même manière qu'avec le méthylglycol chitosane (MGC) ci-dessus à l'exception que le glycol chitosane a été utilisé à la place du méthylglycol chitosane. Toutes les compositions testées avec des liposomes des exemples 1 et 2 ont présenté une agrégation. Les liposomes des exemples 3 et 4 sont demeurés stables en suspension.

Liposomes enrobés de chitosane

Des formulations de liposomes enrobés de chitosane ont été préparées en mélangeant des liposomes de CRX-601 non modifiés, modifiés par phospholipide-PEG ou modifiés par Pluronic avec le dérivé de chitosane et évalués pour les changements de taille et de potentiel □. Lorsqu'ils sont combinés avec du MGC, les liposomes non modifiés ont présenté une agrégation, menant à une précipitation, de 0,4 à 2 mg/ml de MGC, comme il est indiqué sur la figure IA sous la forme de particules présentant une taille située dans la plage de l'ordre du pm. A des concentrations de MGC dépassant 2 mg/ml, les formulations sont apparues colloïdement stables initialement mais ont eu tendance à s'agréger sur 1 à 4 jours. Les liposomes modifiés par PE-PEG2K et PE-PEG5K avec 5 % en mole de modification ont été colloïdement stables en présence de MGC sans aucun changement majeur de la taille à l'une quelconque des concentrations testées (figure 1Ά) . L'inversion du potentiel □ d'un potentiel négatif à positif, est survenue à approximativement 0,5 mg/ml de MGC avec les liposomes non modifiés et 1 mg/ml avec 5 % de modification PE-PEG2K ou PE-PEG5K. Il a été démontré que la modification avec aussi peu que 1 % en mole de PE-PEG2K ou PE-PEG5K fournit une protection suffisante contre l'agrégation induite par le MGC à la plupart des concentrations (figure 2A) . A 1 % de modification, les liposomes avec PE-PEG5K ont été plus résistants à l'agrégation induite par le MGC que les liposomes modifiés par PE-PEG2K. De 0,4 à 0,6 mg/ml de MGC, il n'a été observé aucun changement majeur de la taille des particules ou de l'IPD avec 1 % de modification PE-PEG5K mais il a été observé une augmentation de la taille à la plage de l'ordre du μπι avec 1 % de modification PE-PEG2K. La modification jusqu'à 25 % n'a entraîné aucune déstabilisation/agrégation en présence de MGC (figure 2B).

Parmi les liposomes modifiés par Pluronic, les liposomes modifiés par le F127 ont été les plus stables, ne présentant aucune agrégation visible ni augmentation de la polydispersité sur la plage complète des concentrations de MGC évaluées (figure IB). L'augmentation de la taille des particules a été d'environ 10 à 30 nm, et l'inversion du potentiel □ d'un potentiel négatif net à positif est survenue à des concentrations ^0,4 mg/ml de MGC. Les liposomes modifiés par le F127 à 15 et 25 % de modification ont été de façon similaire stables en présence de MGC (figure 3A) , mais à 1 % de modification, ils ont présenté une agrégation (données non présentées) . Les liposomes avec 5 % en mole de modification par L64 lorsqu'ils sont combinés avec du MGC, ont présenté une augmentation de la taille et de la polydispersité de 0,2 à 0,8 mg/ml de MGC (figure IB) , correspondant à une neutralisation complète de la charge de la surface des liposomes. A ^ 1 mg/ml de MGC, de façon similaire aux liposomes non modifiés, les liposomes modifiés par le L64 sont apparus stables initialement mais ont eu tendance à s'agréger et à précipiter dans le temps (figure IB). Les liposomes modifiés par le F68 ont été les moins stables, et ont provoqué une précipitation instantanée avec le MGC à toutes les concentrations testées. Des tendances similaires ont été observées avec les liposomes avec une modification supérieure par Pluronic de 15 et 25 % (figure 3). Par conséquent, l'ordre de stabilité des liposomes modifiés par Pluronic en présence de MGC a été F127>L64>F68.

Le résumé de l'évaluation de la stabilité pour ces formulations liposomales en présence des dérivés du chitosane, MGC, GC et CO, est présenté dans le tableau 7. Globalement, parmi tous les dérivés du chitosane testés, il a été observé le moins d'agrégation avec le MGC. Les liposomes modifiés par phospholipide-PEG ont été plus stables contre l'agrégation induite par le chitosane que les liposomes modifiés par Pluronic. Seules les formulations qui ont présenté une réduction significative de la cha-rge (liposomes modifiés par phospholipide-PEG ou Pluronic F127) ont été résistantes contre l'agrégation induite par le chitosane. Les liposomes modifiés par PE-PEG5K ont été plus stables que les liposomes modifiés par PE-PEG2K, comme en témoignent le manque de changement quelconque de la taille/IPD en présence de MGC à 1 % de modification et une augmentation de la stabilité en présence de GC et CO.

Tableau 7 Résumé de la stabilité des liposomes non modifiés, modifiés par phospholipide-PEG et Pluronic avec un degré variable de modification contre l'agrégation induite par un dérivé du chitosanea

aLa modification la plus basse testée a été de 1 % en mole.

Agrégation partielle de 0,2 à 0,6 mg/ml bMGC : méthylglycol chitosane, CGC : glycol chitosane, dCO : chitosane oligosaccharide lactate

Exemple 10 - Test pyrogène chez le lapin

Le test pyrogène est utilisé ici comme mesure de substitution de l'incorporation de CRX-601 dans les liposomes modifiés des exemples 1 à 6 et comme mesure de leur stabilité en milieu biologique. Le test a été réalisé à Pacific Biolabs (Hercules, CA) selon leur SOP de 16E-02, lequel suit les procédures présentées dans USP<151>. Toutes les formulations des exemples 1 à 6 ont manqué de pyrogénicité jusqu'à une concentration d'au moins 250 ng de CRX-601/kg du poids corporel de l'animal, à l'exception des formulations de l'exemple 7 (liposomes modifiés par le poloxamère 188) et de l'exemple 8 (liposomes modifiés par le poloxamère 184). Ce manque de pyrogénicité jusqu'à 250 ng/kg correspondant à une amélioration de 100 fois par rapport à sans CRX-601 (dose non pyrogène maximale de 2,5 ng/kg), et indique une incorporation > 99 % de CRX-601 dans la bicouche des liposomes. Les augmentations de température individuelles à partir des trois lapins par test sont indiquées dans le tableau 8.

Tableau 8

Mesures représentatives du test pyrogène chez le lapin pour les formulations décrites dans les exemples 2, 4, 6, et 9. Les valeurs entre parenthèses représentent le changement de température maximal pour trois animaux durant la période d'analyse. Une élévation de la température de 0,5 °C ou plus est considérée comme une réponse pyrogène. Les symboles P et F indiquent une réponse « Réussite » ou « Echec », respectivement.

Abréviations : méthylglycol chitosane (MGC) ; chitosane oligosaccharide lactate (CL)

Exemple 11 - Vaccination sublinguale_de_souris_et détermination des réponses en anticorps spécifiques

Des souris BALB/c femelles (âgées de 6 à 8 semaines) obtenues chez Charles River Laboratories (Wilmington, MA) ont été utilisées pour ces études. A des souris anesthésiées par administration intrapéritonéale (i.p) de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg), il a été donné le vaccin par administration sublinguale (5 à 6 μΐ). Toutes les souris ont été vaccinées aux jours 0, 21 et 42 avec les 5 pg de CRX-601 dans la formulation liposomale mélangée avec 1 ou 1,5 pg de HA/souris en utilisant l'antigène grippal A/Victoria/210/2009 H3N2. Le sérum a été prélevé au jour 36 (14dp2) sous anesthésie, au jour 56 (14dp3) les souris ont été sacrifiées et un prélèvement final de lavage vaginal, de lavage trachéal et de sérum a été recueilli. Tous les animaux ont été utilisés conformément aux directives établies par le U.S. Department of Health and Human Services Office of Laboratory Animal Welfare et 1'Institutional Animal Care and Use Committee à GSK Biologicals, Hamilton, Montana.

Les réponses en anticorps spécifiques ont été mesurées par deux tests immunologiques indépendants, le test ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) et le test d'inhibition de 1'hémagglutinine (IH) grippale.

Le test ELISA a été réalisé en utilisant des plaques de 96 puits sensibilisés par le virus grippal fragmenté (Nunc Maxisorp) et en détectant les immunoglobulines liées provenant des échantillons de sérum ou de liquide de lavage trachéal ou de lavage vaginal en utilisant des IgG, igGl, lgG2a ou IgA de chèvre anti-souris liées à de la peroxydase. Ceci a été suivi de l'addition d'un chromogène spécifique de l'enzyme, ce qui a entraîné une intensité de couleur directement proportionnelle à la quantité d'IgG/IGA antigrippales spécifiques contenues dans le sérum. La densité optique a été lue à 450 nm.

Le test IH a été réalisé par évaluation de l'inhibition des hématies de poulet ou de coq lors d'une exposition au virus grippal en présence de sérum de souris. L'inverse de la dernière dilution de virus grippal qui a entraîné une agglutination complète ou partielle des hématies a été utilisé pour calculer le titre IH et exprimé en unités de HA/50 μΐ de sérum.

Exemple 12 - Vaccination sublinguale de souris avec des liposomes modifiés avec MPEG-2000-DSPE ou MPEG-5000-DPPE (NIH No. 162)

Les souris ont été vaccinées en utilisant la procédure présentée dans l'exemple 11 avec des liposomes modifiés avec 1, 5, et 25 % en mole de MPEG-2000-DSPE ou MPEG-5000-DPPE des exemples 1 à 4. Les titres des IgG sériques 14 jours après les vaccinations secondaires et les vaccinations tertiaires sont présentés sur la figure 4 (et également avec les titres IH sur la figure 5). Parmi les groupes de traitement sublingual, les titres ont été les plus élevés chez les souris recevant du CRX-601 dans le groupe de traitement des liposomes à 25 % de MPEG-5000-DPPE, significativement supérieurs aux groupes de traitement avec des liposomes de CRX-601 aqueux ou des liposomes de CRX-601 non modifiés.

Exemple 13 - Vaccination sublinguale de souris avec des liposomes modifiés avec le poloxamère 407 (NIH No. 158)

Les souris ont été vaccinées en utilisant la procédure présentée dans l'exemple 11 avec des liposomes modifiés avec 5, 10 et 15 % en mole de poloxamère 407 des exemples 5 et 6. Les titres des IgG sériques 14 jours après les vaccinations secondaires et tertiaires sont présentés sur la figure 6. Parmi les groupes de traitement sublingual, les titres ont été les plus élevés chez les souris recevant du CRX-601 dans le groupe de traitement par les liposomes modifiés avec 15 % de poloxamère 407 (post-secondaires) , significativement supérieurs aux groupes de traitement avec des liposomes de CRX-601 aqueux ou des liposomes de CRX-601 non modifiés.

Exemple 14 - Vaccination sublinguale de souris avec des liposomes modifiés avec les poloxamères 407, 188, et 184 (NIH No. 167)

Les souris ont été vaccinées en utilisant la procédure présentée dans l'exemple 11 avec des liposomes modifiés avec 15 et 25 % en mole du poloxamère 407, ou 188, ou 184 des exemples 5 à 8. Les titres des IgG sériques 14 jours après les vaccinations secondaires et tertiaires sont présentés sur la figure 7 (et avec les titres IH sur la figure 8) . Parmi les groupes de traitement sublingual, les titres ont été les plus élevés chez les souris recevant du CRX-601 dans le groupe de traitement avec des liposomes à 15 % de poloxamère 188. Les titres dans les groupes de traitement avec des liposomes de CRX-601 modifiés avec poloxamère ont été en général meilleurs que les groupes de traitement avec des liposomes de CRX-601 aqueux ou des liposomes de CRX-601 non modifiés.

Exemple 15 - Vaccination sublinguale de souris avec des liposomes modifiés avec du MPEG-2000-DSPE ou du MEPEG-5000-SPPE et du méthylglycol chitosane ou du chitosane oligosaccharide lactate (NIH No. 163)

Les souris ont été vaccinées en utilisant la procédure présentée dans l'exemple 11 avec des liposomes modifiés avec 5 % en mole de MPEG-2000-DSPE ou MPEG-5000-DPPE des exemples 2 et 4 formulés avec du méthylglycol chitosane ou du chitosane

Oligosaccharide lactate comme il est décrit dans l'exemple 9. Les titres des IgG sériques 14 jours après les vaccinations secondaires et tertiaires sont présentés sur la figure 9 (et également avec les titres IH sur la figure 10) . Parmi les groupes de traitement sublingual, les titres dans les groupes de traitement avec des liposomes + méthylglycol chitosane ont été en général meilleurs que dans les groupes de traitement avec des liposomes de CRX-601 non modifiés.

Exemple 16 - Vaccination sublinguale de souris avec des liposomes modifiés avec des poloxamères et du méthylglycol chitosane (NIH No. 164)

Les souris ont été vaccinées en utilisant la procédure présentée dans l'exemple 11 avec des liposomes modifiés avec 5, 15 et 25 % en mole de poloxamère 407 (étiqueté F127 sur les .figures 11 et 12) des exemples 5 à 8 et 15 ou 25 % en mole de poloxamère 407 formulés avec le méthylglycol chitosane comme il est décrit dans l'exemple 9. Les titres des IgG sériques 14 jours après les vaccinations secondaires et tertiaires sont présentés sur la figure 11 (et également avec les titres IH sur la figure 12).

Claims (24)

REVENDICATIONS

1. Composition liposomale comprenant des lipides qui forment une bicouche lipidique liposomale, des conjugués phospholipide-PEG incorporés dans la bicouche lipidique liposomale, et un chitosane ou un dérivé du chitosane.

2. Composition liposomale selon les revendications précédentes comprenant en outre un aminoalkyle glucosaminide phosphate (AGP) et un tampon aminoalcanesulfonique.

3. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les lipides du liposome sont la DOPC.

4. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la composition liposomale comprend en outre du cholestérol.

5. Composition liposomale comprenant des lipides qui forment une bicouche lipidique liposomale, des copolymères de PEG/tensioactifs comme des poloxamères incorporés dans la bicouche lipidique liposomale, un AGP et un tampon aminoalcanesulfonique .

6. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, où les lipides du liposome sont la DOPC en l'absence de cholestérol.

7. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le conjugué phospholipide-PEG est choisi dans le groupe constitué des poloxamère 407 (Pluronic® F127), poloxamère 184 (Pluronic® L64), poloxamère 188 (Pluronic® L68).

8. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le conjugué phospholipide-PEG est le MPEG-2000-DSPE, sel sodique de N-(carbonyl-méthoxypolyéthylène glycol-2000)-1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine, ou le MPEG-5000-DPPE, sel sodique de N-(carbonyl-méthoxypolyéthylène glycol-5000)-1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine.

9. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la composition liposomale comprend en outre du chitosane.

10. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, dans laquelle le tampon aminoalcanesulfonique est choisi dans le groupe constitué de HEPES, HEPPS/EPPS, MOPS, MOBS et PIPES.

11. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, dans laquelle l'AGP est choisi dans le groupe constitué de : CRX-601, CRX 602, CRX 527, CRX 547, CRX 526, CRX 529 ou CRX 524.

12. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant un chitosane, où le chitosane est choisi dans le groupe constitué de chitosane oligosaccharide lactate, triméthyl-chitosane glycol chitosane, et méthylglycol chitosane.

13. Procédé de production améliorée d'une composition liposomale pour une administration mucosale comprenant les étapes suivantes : a. la dissolution d'un lipide, comme la dioléoyl- phosphatidylcholine, du conjugué phospholipide-PEG, et de l'AGP dans un solvant organique, b. l'élimination du solvant pour produire un film phospholipidique, c. l'addition du film à du tampon HEPES ou du tampon HEPES dans du sérum physiologique, d. la dispersion du film dans la solution, et e. l'extrusion de la solution successivement à travers des filtres de polycarbonate pour former des liposomes unilamellaires.

14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel l'AGP est le CRX-601.

15. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications 2 à 14, dans laquelle l'AGP CRX-601 est présent dans une quantité inférieure à 10, inférieure à 9, inférieure à 8, inférieure à 7, inférieure à 6, inférieure à 5, inférieure à 4, inférieure à 3, inférieure à 2 ou inférieure à 1 mg.

16. Composition liposomale selon la revendication 15, dans laquelle l'AGP CRX-601 est présent dans une quantité située entre 30 Dg/ml et 6 mg/ml.

17. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le liposome est multilamellaire.

18. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le liposome est 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 lamellaire.

19. Composition lamellaire selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le liposome est unilamellaire.

20. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la taille du liposome se situera dans la plage de 50 nm à 500 nm et dans d'autres modes de réalisation de 50 nm à 200 nm.

21. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la taille du liposome se situera dans la plage d'environ 80 à 120 nm.

22. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les structures liposomales renferment un intérieur aqueux.

23. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un mimétique du lipide A, un ligand du TLR4, ou un AGP.

24. Composition liposomale selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'AGP est un composé ayant la structure représentée par la formule 1 :

(Formule 1) dans laquelle m vaut 0 à 6 n vaut 0 à 4 ; X représente 0 ou S, de préférence 0 ; Y représente 0 ou NH ; Z représente 0 ou H ; chaque Ri, R2, R3 est choisi indépendamment dans le groupe constitué d'un groupe acyle en Ci à C20 et d'un groupe alkyle en Ci à C20 ; R4 représente H ou Me ; R5 est choisi indépendamment dans le groupe constitué des groupes -H, -OH, -alcoxy en Ci à C4, -PO3R8R9, -OPO3R8R9, -SO3R8, -OSO3R8, -NR8R9, -SR8, -CN, “NO2, -CHO, —CO2R8 , et -CONR8R9, où Re et R9 sont choisis chacun indépendamment parmi H et un groupe alkyle en Ci a C4 } et chaque Rë et R7 représente indépendamment H ou PO3H2.