BE1024228B1 - Nouvelles formulations d'adjuvants - Google Patents

Abstract

L’invention concerne une composition comprenant des nanoparticules lipidiques solides (NLS), dans laquelle les NLS comprennent un aminoalkyle glucosaminide phosphate (AGP).

Description

NOUVELLES FORMULATIONS D’ADJUVANTS Domaine de l’invention

La présente invention concerne des nouvelles formulations d’adjuvants et des procédés pour leur préparation, ainsi que leurs utilisations. En particulier, l’invention concerne de nouvelles formulations d’aminoalkyle glucosaminide phosphates (AGP). Déclaration concernant la recherche subventionnée par le gouvernement fédéral

Des aspects de cette invention ont été réalisés avec le support du gouvernement des Etats-Unis conformément au contrat #HHSNHHSN272200900008C des National Institutes of Health ; le gouvernement des Etats-Unis peut avoir certains droits dans l’invention.

Contexte de l’invention

Les récepteurs de type Toll (TLR) sont liés à la réponse immunitaire innée et reconnaissent des composants structuraux distincts qui sont uniques aux pathogènes. Des agonistes des TLR sont actuellement utilisés en médecine, par exemple en tant qu’adjuvants dans des vaccins afin de potentialiser les réponses immunitaires. Le premier produit microbien découvert comme étant un agoniste des récepteurs de type Toll a été le LPS, un composant de la membrane bactérienne spécifique des bactéries Gram négatif, qui active le TLR4. Bien que le LPS soit un agent immunomodulateur puissant, son utilisation médicinale est limitée à cause de son extrême toxicité.

Les AGP constituent une classe différente de composés qui interagissent avec le TLR4, en tant qu’agonistes ou antagonistes. Les AGP comprennent des composés à la fois acycliques et cycliques et ils ont été décrits, par exemple, dans les documents US 6 113 918, US 6 303 347, WO 98/50399, WO 01134617, WO 01190129, WO 02112258 et WO 2004062599. Il a été démontré que ces composés conservent des caractéristiques significatives d’adjuvants lorsqu’ils sont formulés avec des antigènes dans des compositions vaccinales. Les AGP démontrent également une activité d’adjuvant mucosal et ils sont efficaces en l’absence d’antigène, les rendant attrayants pour une utilisation prophylactique et/ou thérapeutique.

Alors que les AGP présentent des profils améliorés de toxicité lorsqu’ils sont comparés au LPS ou à ses dérivés, leur utilisation dans des configurations pharmaceutiques bénéficiera d’une autre amélioration du profil de toxicité, y compris des formulations moins pyrogènes. Résumé de l’invention

Dans un premier aspect, l’invention concerne une composition comprenant des nanoparticules lipidiques solides (NLS), dans laquelle les NLS comprennent un aminoalkyle glucosaminide phosphate (AGP).

Dans un deuxième aspect, l’invention concerne une composition immunogène comprenant une composition de NLS telle que décrite ici et un antigène.

Dans un autre aspect, l’invention concerne une composition telle que décrite ici, ou une composition immunogène telle que décrite ici, pour une utilisation en médecine, comme pour une utilisation dans l’immunisation d’un sujet humain.

Dans un autre aspect également, l’invention concerne un procédé de préparation d’une composition comprenant des NLS telle que décrite ici, ledit procédé comprenant : a. La dissolution et le mélange de l’AGP et d’un lipide dans un solvant organique b. L’élimination du solvant organique à partir du mélange c. Le chauffage du mélange résultant et le mélange avec une solution aqueuse contenant un tensioactif pour produire un mélange huile dans l’eau, et d. La réalisation d’une étape de réduction de taille, par exemple, en utilisant la microfluidisation ou la sonication, et e. L’étape permettant à la composition de refroidir, le procédé comprenant éventuellement une étape de filtration.

Figures

Figure 1 : lipides/tensioactifs cationiques utilisés dans la préparation des NLS cationiques.

Figure 2 : titres sériques en IgG post-secondaires (en haut), titres sériques en IgG post-tertiaires (au milieu), et titres en IgA dans les liquides de lavage trachéal/vaginal post-tertiaires (en bas ; liquide de lavage vaginal - barres noires, liquide de lavage trachéal - barres grises) issus de l'étude 1 de la formulation de NLS CRX-601. NLS CAT : NLS cationiques, NLS-1,5 % : NLS préparées à 1,5 % p/v du lipide de support ; NLS-5 % : NLS préparées à 5 % p/v du lipide de support. Les valeurs de 1 pg ou de 5 pg se rapportent au dosage/animal/vaccination de CRX-601.

Figure 3 : titres IHA sériques post-tertiaires issus de l’évaluation sublinguale de l’étude 1 des formulations de NLS/chitosane CRX-601. Toutes les formulations testées ont été capables de produire des anticorps fonctionnels. Les groupes NLS-5 %/CRX-601 et NLS/CRX-601 + chitosane ont été capables de produire des anticorps à des taux similaires au groupe témoin IM. Analyse statistique : analyse ANOVA unilatérale de la variance et test post-hoc de Tukey.

Figure 4 : titres sériques en IgG post-secondaires (en haut), titres sériques en IgG post-tertiaires (au milieu) , et titres en IgA dans les liquides de lavage trachéal/vaginal post-tertiaires (en bas ; liquide de lavage vaginal - barres noires, liquide de lavage trachéal - barres grises) issus de l’étude 2 de la formulation de NLS CRX-601. NLS CAT : NLS cationiques, NLS-1,5 % : NLS préparées à 1,5 % p/v du lipide de support ; NLS-5 % : NLS préparées à 5 % p/v du lipide de support. La dose de CRX-601 est de 5 pg/animal/vaccination dans tous les groupes de traitement SL et de 1 pg/animal/vaccination dans le groupe IM témoin.

Figure 5 : titres IHA sériques post-tertiaires issus de l’évaluation sublinguale de l’étude 2 des formulations de NLS/chitosane CRX-601. Toutes les formulations testées ont été capables de produire des anticorps fonctionnels à des taux similaires aux groupes IM témoins (à l’exception du BLC NLS CAT (SA - 0,5 %) ancien et du BLC NLS CAT (SA - 1 %). Analyse statistique : analyse ANOVA unilatérale de la variance et test post-hoc de Tukey.

Description détaillée de l’invention Définitions

Le terme « nanoparticule lipidique solide » (NLS) lorsqu’il est utilisé ici se rapporte à un support dans la plage des tailles submicroniques comprenant des lipides et des tensioactifs et comportant un noyau lipidique solidifié. Les lipides sont généralement biocompatibles et biodégradables et solides à la température ambiante et corporelle.

Lorsqu’il est utilisé ici, le terme « AGP » se rapporte aux aminoalkyle glucosaminide phosphates. Cette demande divulgue un certain nombre d’exemples d’AGP et comprend des références à d’autres documents décrivant des AGP. Encore d’autres AGP et informations sur la synthèse des AGP peuvent être trouvés, par exemple, dans Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9: 2273.

Les AGP utilisés dans la présente invention sont de préférence des agonistes du TLR4, c’est-à-dire des composés qui activent un récepteur du TLR4 pour produire une réponse biologique.

Le terme « mucoadhésif », lorsqu’il est utilisé ici, se rapporte à une tendance à une adhérence au mucus ou aux membranes muqueuses. « Administration transmucosale » se rapporte à l’administration d’une substance à travers le mucus ou les membranes muqueuses.

Autres aspects et modes de réalisation de l’invention

Comme il a été expliqué ci-dessus, dans un aspect, l’invention concerne une composition comprenant des nanoparticules lipidiques solides (NLS), dans laquelle les NLS comprennent un aminoalkyle glucosaminide phosphates (AGP). AGP pour une utilisation dans l’invention

Dans des modes de réalisation préférés, l’AGP utilisé dans l’invention est un agoniste du TLR4.

Des AGP appropriés pour une utilisation dans l’invention sont divulgués, par exemple, dans les documents WO 9850399, WO 0134617, WO 0212258, WO 03065806, WO 04062599, WO 06016997, WO 0612425, WO 03066065, WO 0190129 et WO 2012055981, US 2003/0199460 et US 2005/0227943, dont la divulgation est incorporée ici en référence. De telles molécules ont été également décrites dans la littérature scientifique et des brevets en tant que mimétiques du lipide A.

Dans un aspect, l’AGP est un AGP dans lequel un groupe aminoalkyle (aglycone) est lié par des liaisons glycosidiques à un 2-désoxy-2-amino-a-D-glucopyranose (glucosaminide). Les composés sont phosphorylés au niveau du carbone 4 ou 6 sur le cycle glucosaminide. En outre, les composés possèdent trois résidus 3-alcanoyl-oxyalcanoyle comprenant une chaîne d’acyle gras primaire et secondaire, chaque chaîne carbonée constituée de 2 à 24 atomes de carbone, et de préférence de 7 à 16 atomes de carbone. Dans un mode de réalisation préféré, chaque chaîne primaire contient 14 atomes de carbone et chaque chaîne secondaire comporte entre 10 et 14 atomes de carbone.

Dans un mode de réalisation, les composés AGP sont décrits par la formule générale :

De tels composés comprennent un 2-désoxy-2-amino-a-D-glucopyranose (glucosamine) en liaison glycosidique avec un groupe aminoalkyle (aglycone). Les composés sont phosphorylés au niveau du carbone 4 ou 6 sur le cycle glucosamine et comportent trois résidus alcanoyl-oxyalcanoyle. Les composés sont décrits de façon générale par la formule I, dans laquelle X représente un atome d’oxygène ou de soufre, Y représente un atome d’oxygène ou un groupe NH, « n », « m », « p » et « q » représentent des nombres entiers de 0 à 6, R1, R2, et R3 représentent des résidus d’acyle gras normaux comportant 7 à 16 atomes de carbone, R4 et R5 représentent un atome d’hydrogène ou un groupe méthyle, R6 et R7 représentent un atome d’hydrogène, un groupe hydroxy, alcoxy, phosphono, phosphono-oxy, sulfo, sulfo-oxy, amino, mercapto, cyano, nitro, formyle ou carboxy et leurs esters et amides ; R8 et R9 représentent un groupe phosphono ou un atome d’hydrogène. La configuration des centres stéréogéniques en 3’ auxquels les résidus d’acyle gras normaux sont fixés est R ou S, mais de préférence R. La stéréochimie des atomes de carbone auxquels R4 ou R5 sont fixés peut être R ou S.

Dans un mode de réalisation préféré, X représente un atome d’oxygène. Le nombre d’atomes de carbone entre l’hétéroatome X et l’atome d’azote de l’aglycone est déterminé par les variables « n » et « m ». Les variables « n » et « m » peuvent être des nombres entiers de 0 à 6. Dans un mode de réalisation préféré, le nombre total d’atomes de carbone entre l’hétéroatome X est l’atome d’azote de l’aglycone est d’environ 2 à environ 6 et de façon préférée entre toutes d’environ 2 à environ 4. Dans un autre mode de réalisation préféré, R8 représente un groupe phosphono et R9 représente un atome d’hydrogène.

Les composés sont hexa-acylés, c’est-à-dire, qu’ils contiennent un total de six résidus d’acide gras. Le radical aminoalkyle glucosamine est acylé au niveau des groupes 2-amino et 3-hydroxyle de l'unité de glucosamine et au niveau du groupe amino de l'unité aglycone avec des résidus 3-hydroxyalcanoyle. Dans la formule I, ces trois positions sont acylées avec des radicaux 3-hydroxytétradécanoyle. Les résidus 3-hydroxytétradécanoyle sont, à leur tour, substitués par des acides gras normaux (R1 à R3), fournissant trois résidus 3-n-alcanoyloxytétradécanoyle ou six groupes d'acide gras au total.

La longueur de la chaîne des acides gras normaux R1 à R3 peut être d'environ 7 à environ 16 carbones. De préférence, R1 à R3 sont d'environ 9 à environ 14 carbones. Les longueurs des chaînes de ces acides gras normaux peuvent être identiques ou différentes. Bien que seuls des acides gras normaux soient décrits, on s'attend à ce que des acides gras insaturés (c'est-à-dire, des radicaux d'acides gras comportant des liaisons doubles ou triples) substitués au niveau de R1 à R3 sur les composés produisent des molécules biologiquement actives.

Des exemples spécifiques d'AGP appropriés pour une utilisation dans l'invention comprennent CRX-527 qui est divulgué dans Stöver et al, (2004) J Biol Chem 279, 6, page 4440. Les documents WO 0212258 et WO 03065806 divulguent d'autres modes de réalisation appropriés d'AGP comportant un groupe aminoalkyle cyclique (aglycone) lié à un 2-désoxy-2-amino-a-D-glucopyranose (glucosaminide), couramment appelés « AGP cycliques ». La référence de façon générale aux AGP ici comprend des AGP à la fois cycliques et non cycliques.

Les AGP cycliques possèdent trois résidus 3-alcanoyloxyalcanoyle comprenant une chaîne d’acyle gras primaire et secondaire, chaque chaîne carbonée constituée de 2 à 24 atomes de carbone, et de préférence de 7 à 16 atomes de carbone. Dans un aspect préféré, chaque chaîne primaire contient 14 atomes de carbone et chaque chaîne carbonée secondaire comporte entre 10 et 14 atomes de carbone par chaîne.

Les AGP cycliques sont décrits par la formule générale II :

Ces composés comprennent un 2-désoxy-2-amino-p-D-glucopyranose (glucosamine) lié par des liaisons glycosidiques à un groupe aminoalkyle cyclique (aglycone). Les composés sont phosphorylés au niveau de la position 4 ou 6 du cycle glucosamine et acylés avec des résidus alcanoyloxytétradécanoyle sur l’azote de l’aglycone et les positions 2 et 3 du cycle glucosamine. Les composés sont décrits de façon générale par la formule (II) : et leurs sels pharmaceutiquement acceptables, dans laquelle X représente -O- ou NH- et Y représente -O- ou -S- ; R1, R2, et R3 représentent chacun indépendamment un groupe acyle en C2 à C24, y compris des groupes acyle saturés, insaturés et ramifiés ; R4 représente -H ou -PO3R7R8, où R7 et R8 représentent chacun indépendamment H ou un groupe alkyle en C1 à C4 ; R5 représente -H, -CH3 ou -PO3R9R10, où R9 et Rl0 sont choisis chacun indépendamment parmi -H et un groupe alkyle en Ci à C4 ; R6 est choisi indépendamment parmi H, les groupes OH, alcoxy en C1 à C4, -PO3R11R12, -OPO3R11R12, -SO3R11, -OSO3R11, - NR11R12, -SR11, -CN, -NO2, -CHO, -CO2R11, et -CONR11R12, où R11 et R12 sont choisis chacun indépendamment parmi H et un groupe alkyle en C1 à C4, dans laquelle « *1 à 3 » et « ** » représentent des centres chiraux ; dans laquelle les indices n, m, p et q représentent chacun indépendamment un nombre entier de 0 à 6, à condition que la somme de p et m soit de 0 à 6.

Dans certains modes de réalisation, le composé d’AGP cyclique contient un -O- en X et Y, R4 représente PO3R7R8, R5 et R6 représentent H, et les indices n, m, p, et q représentent des nombres entiers de 0 à 3. Dans un mode de réalisation davantage préféré, R7 et R8 représentent -H. Dans un mode de réalisation même davantage préféré, l’indice n vaut 1, l’indice m vaut 2, et les indices p et q valent 0. Dans un mode de réalisation encore même davantage préféré, R1, R2, et R3 représentent des résidus tétradécanoyle. Dans un mode de réalisation encore davantage préféré, *1 à 3 sont dans la configuration R, Y est dans la position équatoriale, et ** est dans la configuration S (N-[(R)-3-tétradécanoyloxytétradécanoyl]-(S)-2-pyrrolidinométhyl-2-désoxy-4-0-phosphono-2-[(R)-3-tétradécanoyloxytétradécanoylamino]-3-0-[(R)-3-tétradécanoyloxytétradécanoyl]-p-D-glucopyranoside et ses sels pharmaceutiquement acceptables).

Les structures cycliques préférées comprennent : [Ill]

[IV-a]

M

La formule V représente CRX 590.

Dans d’autres modes de réalisation, l’AGP comporte un ou plusieurs groupes lipidiques primaires et/ou secondaires liés à un éther plutôt qu’à un ester. Dans de tels modes de réalisation, R1 à R3 représentent des groupes alkyle à chaîne linéaire et non pas des groupes acyle, faisant de RIO-, R2O- et R3O- des groupes alcoxy plutôt qu’alcanoyloxy et la fixation de la chaîne acyle primaire une liaison éther plutôt qu’ester. Dans le cas d’un groupe lipidique primaire lié à un éther, le résidu 3-alcanoyloxyalcanoyle fixé au groupe 3-hydroxy de l’unité glucosamine est remplacé par soit un radical 3-alcanoyloxyalkyle soit un radical 3-alcoxyalkyle, faisant de la fixation du groupe lipidique primaire à la position 3 de la glucosamine une liaison éther plutôt qu’ester. Une formule générale pour les éthers est celle de la formule IV du document WO 2006016997.

Un exemple d’un composé préféré est CRX-601 (formule VI). Dans des modes de réalisation préférés, la composition comprend entre 0,1 et 1,5 % (p/v) de CRX-601, de façon davantage préférée entre 0,1 et 1 %, de façon même davantage préférée entre 0,2 et 0,5 %, comme entre 0,2 et 0,25 %, ou entre 0,5 et 1 %.

[VI]

Dans d’autres modes de réalisation, la molécule d’AGP peut avoir un nombre différent de carbones dans les chaînes primaires et/ou les chaînes secondaires de la molécule. De tels composés sont divulgués dans les documents WO 04062599 et WO 06016997. Comme avec les autres AGP, chaque chaîne carbonée peut être constituée de 2 à 24 atomes de carbone, et de préférence de 7 à 16 atomes de carbone. Dans un mode de réalisation préféré, chaque chaîne primaire contient 14 atomes de carbone et chaque chaîne carbonée secondaire comporte entre 10 et 14 atomes de carbone par chaîne.

De tels composés sont représentés par les structures VII, VIII, IX et X suivantes : dans laquelle X est choisi dans le groupe constitué de O et S au niveau de la position axiale ou équatoriale ; Y est choisi dans le groupe constitué de O et NH ; n, m, p et q représentent des nombres entiers de 0 à 6 ; R1, R2 et R3 sont identiques ou différents et représentent des résidus d'acyle gras comportant de 1 à 20 atomes de carbone et où l'un de R1, R2 ou R3 représente éventuellement un atome d’hydrogène ; R4 et R5 sont identiques ou différents et sont choisis dans le groupe constitué de H et d’un groupe méthyle ; R6 et R7 sont identiques ou différents et sont choisis dans le groupe constitué de H, les groupes hydroxy, alcoxy, phosphono, phosphono-oxy, sulfo, sulfo-oxy, amino, mercapto, cyano, nitro, formyle et carboxy et leurs esters et amides ; R8 et R9 sont identiques ou différents et sont choisis dans le groupe constitué du groupe phosphono et de H, et au moins l’un de R8 et R9 représente un groupe phosphono ; R10, R11 et R12 sont choisis indépendamment parmi des groupes aliphatiques saturés non substitués à chaîne linéaire comportant de 1 à 10 atomes de carbone ; ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

[VIII]

dans laquelle X est choisi dans le groupe constitué de O et S au niveau de la position axiale ou équatoriale ; Y est choisi dans le groupe constitué de O et NH ; n et m valent 0 ; R1, R2 et R3 sont identiques ou différents et représentent des résidus d’acyle gras comportant de 1 à 2 0 atomes de carbone et où l’un de R1, R2 ou R3 représente éventuellement un atome d’hydrogène ; R4 est choisi dans le groupe constitué de H et d’un groupe méthyle ; p vaut 1 et R6 représentent un groupe COOH ou p vaut 2 et R6 représentent un groupe OPO3H2 ; R8 et R9 sont identiques ou différents et sont choisis dans le groupe constitué du groupe phosphono et de H, et au moins l’un de R8 et R9 représente un groupe phosphono ; et R10, R11 et R12 sont choisis indépendamment parmi des groupes aliphatiques saturés non substitués à chaîne linéaire comportant de 1 à 10 atomes de carbone ; ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

[IX]

dans laquelle X est choisi dans le groupe constitué de O et S au niveau de la position axiale ou équatoriale ; Y est choisi dans le groupe constitué de O et NH ; n, m, p et q représentent des nombres entiers de 0 à 6 ; R1, R2 et R3 sont identiques ou différents et représentent des groupes aliphatiques saturés à chaîne linéaire (c'est-à-dire, des groupes alkyle à chaîne linéaire) comportant de 1 à 20 atomes de carbone et où l'un de R1, R2 ou R3 représente éventuellement un atome d'hydrogène ; R4 et R5 sont identiques ou différents et sont choisis dans le groupe constitué de H et d'un groupe méthyle ; R6 et R7 sont identiques ou différents et sont choisis dans le groupe constitué de H, les groupes hydroxy, alcoxy, phosphono, phosphono-oxy, sulfo, sulfo-oxy, amino, mercapto, cyano, nitro, formyle et carboxy et leurs esters et amides ; R8 et R9 sont identiques ou différents et sont choisis dans le groupe constitué du groupe phosphono et de H, et au moins l’un de R8 et R9 représente un groupe phosphono ; R10, R11 et R12 sont choisis indépendamment parmi des groupes aliphatiques saturés non substitués à chaîne linéaire comportant de 1 à 11 atomes de carbone ; ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables.

La formule générale peut également comprendre un groupe R5, au niveau de la même position que celle représentée sur la formule VII ci-dessus, où R5 est choisi dans le groupe constitué de H et d’un groupe méthyle.

(IV)

Encore un autre type de composé de cette invention a la formule (IV) ci-dessus : dans laquelle Y est à présent fixé sous la forme d’oxygène ; X est choisi dans le groupe constitué de O et S au niveau de la position axiale ou équatoriale ; n et m valent 0 ; R1, R2 et R3 sont identiques ou différents et représentent des résidus d’acides gras comportant de 1 à environ 20 atomes de carbone et où l’un de R1, R2 ou R3 représente éventuellement un atome d’hydrogène ; R4 est choisi dans le groupe constitué de H et d’un groupe méthyle ; p vaut 0 ou 1 et R6 représente un groupe COOH, ou p vaut 1 ou 2 et R6 représente un groupe OPO3H2 ; R8 et R9 sont identiques ou différents et sont choisis dans le groupe constitué d’un groupe phosphono et de H, et au moins l’un de R8 et R9 représente un groupe phosphono ; et R10, R11 et R12 sont choisis indépendamment parmi des groupes aliphatiques saturés non substitués à chaîne linéaire comportant de 1 à 10 atomes de carbone ; ou l’un de ses sels pharmaceutiquement acceptables. Ces composés comportent ainsi deux chaînes acylées et une chaîne éther non acylée. D’autres structures appropriées d’AGP comme CRX-524 sont divulguées dans Cluff et al. (2005) Infection and Immunity 73: 3044.

Des procédés de fabrication d’AGP sont également divulgués, par exemple, dans le document WO 0612425.

Lipides et tensioactifs appropriés pour une utilisation dans l’invention

Comme il a été expliqué ci-dessus, les NLS sont des supports dans la plage des tailles submicroniques comprenant des lipides et des tensioactifs et comportant un noyau lipidique solidifié. Les lipides utilisés sont généralement biocompatibles et biodégradables et solides à la température ambiante et corporelle.

De nombreux lipides peuvent être utilisés pour la préparation de NLS, et des exemples de lipides appropriés sont donnés, par exemple, dans le tableau 8.1 de Svilenov and Tzachev (2014) Nanomedicine chapitre 8, page 187 (ISBN (eBook): 978-1-910086-018: Publisher: One Central Press (OCP)) (incorporé ici en référence).

Les lipides préférés pour une utilisation dans la présente invention sont des béhénates de glycérol, c’est-à-dire, le monobéhénate de glycérol, le dibéhénate de glycérol et le tribéhénate de glycérol. Sont également préférés, des mélanges de ces trois types de béhénates. Les concentrations préférées sont de 1 à 5 % (p/v), comme de 1 à 4 %, par exemple, 1,5 % à 3 %. Un lipide préféré est Compritol 888 ATO (dibéhénate de glycéryle, Pharmacopée Européenne [EP], béhénate de glycéryle, National Formulary [NF]), qui est un mélange hydrophobe de mono- (12 à 18 % p/p) , di- (45 à 54 % p/p) et tri-(28 à 32 % p/p) béhénate de glycérol avec un point de fusion situé dans la plage de 69 à 74 °C et avec une balance hydrophile lipophile (BHL) » 2.

En outre, de nombreux tensioactifs peuvent être utilisés pour la préparation des NLS, et des exemples de tensioactifs appropriés sont donnés, par exemple, dans le tableau 8.2 de Svilenov and Tzachev (2014)

Nanomedicine chapitre 8, page 187 (ISBN (eBook): 978-1910086-01-8: Publisher: One Central Press (OCP)) (incorporé ici en référence). Un tensioactif préféré est le polysorbate 80 (également connu sous le nom de Tween 80) . De préférence, la composition comprend de 0,5 à 3 % (v/v) de polysorbate 80.

Mucoadhérence

Dans des modes de réalisation préférés, les compositions de l’invention sont mucoadhésives. Les NLS peuvent être rendues plus mucoadhésives par combinaison avec ou incorporation de composés mucoadhésifs.

Dans certains modes de réalisation, les NLS sont cationiques. Les NLS cationiques peuvent, par exemple, potentiellement permettre la mucoadhérence par leur interaction électrostatique avec un enrobage de mucine polyanionique sur la muqueuse sublinguale. De préférence, le potentiel zêta, par exemple, tel que mesuré par la diffusion dynamique de la lumière, est de 20 mV ou supérieur, par exemple 20 à 30 mV, ou supérieur. Les NLS peuvent être rendues plus cationiques par combinaison avec ou incorporation de lipides cationiques et/ou de tensioactifs cationiques. Ainsi, dans certains modes de réalisation, les NLS dans la composition de l’invention comprennent un lipide cationique et/ou un tensioactif cationique. Dans un mode de réalisation, les NLS comprennent un composé choisi dans le groupe constitué de la stéarylamine (octadécylamine) (SA), le bromure de diméthyl-dioctadécylammonium (DDAB), ou le bromure de cétyl-triméthylammonium (CTAB) . Dans un autre mode de réalisation, la composition comprend 0,25 à 1,5 % de SA, de DDAB ou de CTAB, comme 0,25 à 0,55 %, par exemple, 0,5 % de SA, de DDAB ou de CTAB.

Dans certains modes de réalisation, les NLS sont rendues mucoadhésives par addition d’un agent mucoadhésif. Les agents mucoadhésifs préférés sont des dérivés de chitosane, tels que des chitosanes alkylés. Un agent mucoadhésif particulièrement préféré est le méthylglycol chitosane, qui est utilisé de préférence dans une concentration de 0,2 à 20 mg/ml, de façon davantage préférée de 2 à 10, comme de 2 à 5 mg/ml.

Autres propriétés préférées des compositions de l’invention

Dans des modes de réalisation préférés, la composition de l’invention présente une distribution des tailles inférieure à la limite de la filtrabilité pour la stérilisation, afin d’éviter la perte de matériau durant la stérilisation par filtration. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la taille moyenne des NLS dans la composition se situe entre 30 et 200 nm, comme entre 30 et 150 nm, comme entre 30 et 100 nm. En outre, dans un mode de réalisation préféré, l’indice de polydispersité est inférieur à 0,75, comme inférieur à 0,5, comme inférieur à 0,4. L’indice de polydispersité et la taille peuvent être mesurés, par exemple, en utilisant un Malvern Zetasizer.

Dans un autre mode de réalisation préféré, la composition demeure une composition homogène stable et ne devient pas un gel semi-solide pendant au moins 24 h à la suite de sa préparation.

Procédés de préparation des compositions de l’invention

Des procédés de préparation des NLS sont décrits dans l’art. De tels procédés ont été décrits, par exemple, dans Svilenov and Tzachev (2014) Nanomedicine chapitre 8, page 187 (ISBN (eBook): 978-1-910086-01-8: Publisher: One Central Press (OCP)) (incorporé ici en référence) .

Comme il a été expliqué ci-dessus, dans encore un autre aspect, l’invention concerne un procédé de préparation d’une composition comprenant des NLS telle que décrite ici, ledit procédé comprenant : a. La dissolution et le mélange de l’AGP et d’un lipide dans un solvant organique b. L’élimination du solvant organique à partir du mélange c. Le chauffage du mélange résultant et le mélange avec une solution aqueuse contenant un tensioactif pour produire un mélange huile dans l’eau, et d. La réalisation d’une étape de réduction de taille, par exemple, en utilisant la microfluidisation ou la sonication, et e. L’étape permettant à la composition de refroidir.

Le procédé peut comprendre une étape de filtration.

Utilisations des compositions de l’invention

Les compositions de l’invention peuvent être utilisées en médecine. Les compositions peuvent être utilisées par elles-mêmes ou dans des combinaisons avec d’autres substances, par exemple, en combinaison avec un antigène pour une utilisation dans une immunisation.

Des procédés de prévention et de traitement de maladies, par exemple, des maladies infectieuses, des maladies auto-immunes ou des allergies, par administration d’AGP en l’absence d’antigène exogène sont divulgués dans les documents WO 03066065 et WO 0190129. Les compositions de l’invention peuvent être utilisées dans de tels procédés.

Comme il a été susmentionné, les compositions de l’invention peuvent être également utilisées en tant qu’adjuvants dans une vaccination. Ainsi, dans un autre aspect, l’invention concerne une composition immunogène comprenant une composition de NLS telle que décrite ici et un antigène. La préparation de vaccins est décrite de façon générale dans Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M.J.) (1995)

Plenum Press New York). Les compositions de l’invention sont appropriées pour une combinaison avec de nombreux antigènes différents, y compris, par exemple, des protéines, des acides nucléiques et des polysaccharides d’origines diverses. Dans un mode de réalisation, l’antigène est un antigène du virus de la grippe, tel que l’hémagglutinine.

Les compositions ou les compositions immunogènes de l’invention peuvent être utilisées pour protéger ou traiter un mammifère au moyen d’une administration par la voie systémique ou transmucosale. Ces administrations peuvent comprendre une injection par les voies intramusculaire, intrapéritonéale, intradermique ou sous-cutanée ; ou par une administration transmucosale aux systèmes oro-alimentaire, respiratoire, urogénital. L’administration par une voie transmucosale, comme une administration sublinguale est préférée. La composition de l’invention peut être administrée sous la forme d’une dose unique, ou de doses multiples.

Les doses sujettes de la composition décrite ici se situent généralement dans la plage d’environ 0,1 pg à 10 mg d’AGP par administration. Les doses mucosales ou locales préférées se situent dans la plage de 1 pg à 10 mg d’AGP par administration, et le plus généralement 10 pg à 1 mg d’AGP.

La divulgation va être en outre décrite en référence aux exemples non limitatifs suivants.

Exemples

Exemple 1 - Préparation des NLS avec CRX-601

Des solutions mères de CRX-601 (2 % p/v) et de

Compritol 888 ATO (béhénate de glycéryle : un mélange de mono-, di-, et tri-béhénate de glycérol ; 5 % p/v) ont été préparées dans du tétrahydrofurane (THF). Des quantités variables de ces solutions mères ont été ajoutées à un flacon en verre afin d'obtenir les concentrations souhaitées de CRX-601 et de Compritol 888 ATO dans la préparation aqueuse finale (présentée dans le tableau 1). Le solvant organique a été éliminé par évaporation sur un évaporateur rotatif et en outre sous vide à pression élevée pendant 12 h. Le mélange lipidique de CRX-601 ainsi obtenu a été chauffé à >80 °C, et il lui a été ajouté une solution aqueuse contenant du Tween 80 (0,25 à 2 % v/v) à la même température sous mélange à vitesse élevée (8000 à 12000 tr/min). L’émulsion huile dans l’eau résultante a été en outre soniquée (15 à 25 min) en utilisant un sonicateur avec une sonde sur une plaque chaude maintenue à une température > 80 °C. La composition des NLS a été ensuite laissée se solidifier à température ambiante et elle a été filtrée de façon aseptique en utilisant un filtre de 0,22 pm dans un récipient dépyrogéné stérile. Les tailles des particules moyennes représentatives et les valeurs des potentiels zêta des formulations résultantes mesurées par diffusion dynamique de la lumière sont présentées dans le tableau 1. L’aminoalkyle glucosaminide 4-phosphate (AGP) CRX-601 utilisé dans ces travaux a été synthétisé comme il a été décrit auparavant (Bazin et al. (2008) Bioorg & Med Chem Lett 18: 5350 (CRX-601 est l’analogue éther de CRX-527)) et purifié par chromatographie (à une pureté > 95 %). CRX-601, soit dans le matériau de départ soit dans le produit final a été quantifié par un procédé analytique de CLHP en phase inverse classique.

Les formulations avec plus de 5 % p/v de Compritol et > 1 % p/v de CRX-601 produisent des nanoparticules avec une distribution des tailles approchant la limite de la filtrabilité pour la stérilisation, et sont associées à une perte de matériau durant la stérilisation par filtration.

Paramètres représentatifs des formulations pour les NLS de CRX-601

Exemple comparatif - L'acide stéarique a été exploré pour la préparation des NLS (au lieu du béhénate de glycéryle). Des concentrations d’acide stéarique de 1,5 %, 3,0 % et 6,0 % ont été utilisées. CRX-601 a été ciblé à 1, 2 et 3 mg/ml. Des formulations homogènes limpides ont été observées initialement juste après la préparation, mais après stockage pendant une nuit elles se sont transformées en gels semi-solides.

Exemple 2 - Préparation des CRX-601/NLS cationiques

Les formulations de NLS à base de béhénate de glycéryle sont anioniques en potentiel zêta. Les NLS cationiques ont été préparées par incorporation de lipides/tensioactifs cationiques (représentés sur la figure 1) dans les NLS de béhénate de glycéryle. Les NLS cationiques pourront potentiellement permettre une mucoadhérence par leur interaction électrostatique avec le revêtement de mucine polyanionique sur la muqueuse sublinguale. Les formulations ont été préparées comme dans l’exemple 1, mais avec l’addition de 0,1 à 1 % p/v de stéarylamine (octadécylamine) (SA), de bromure de diméthyldioctadécylammonium (DDAB), ou de bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB). Les tailles des particules moyennes représentatives et les valeurs des potentiels zêta des formulations résultantes mesurées par diffusion dynamique de la lumière sont présentées dans le tableau 2.

Résumé des paramètres des formulations pour les NLS cationiques

NT : non testé

Seule la concentration de lipide cationique la plus élevée testée de 0,5 % a donné des NLS cationiques, et pas les concentrations inférieures, probablement à cause de l'excès de charge anionique à laquelle a contribué CRX-601 comparativement aux préparations de blanc de NLS. Des % en poids supérieurs de DDAB de 0,6, 0,8 et 1 % ont été en outre testés mais dans tous les cas, il a été obtenu un IPD >0,4 avec une distribution multimodale des tailles. Par conséquent, les NLS cationiques à base de SA avec 1,5 % de béhénate de glycéryle ont été choisies pour une analyse initiale dans une étude sublinguale chez la souris.

Exemple 3 Préparation de CRX-601/NLS enrobées de méthylglycol chitosane

Du méthylglycol chitosane (iodure de triméthyl-ammonium glycol chitosane) a été dissous dans 10 mM de HEPES ou 10 mM de tampon HEPES-sérum physiologique pH 7,2 pour produire des concentrations de 2 et 10 mg/ml. Les solutions ont été filtrées de façon aseptique en utilisant un filtre de 0,22 μη dans un récipient dépyrogéné stérile. Les formulations des exemples 1 et 2 ont été mélangées de façon aseptique avec des volumes variables de solution de méthylglycol chitosane pour produire des concentrations de méthylglycol chitosane situées dans la plage de 1 à 10 mg/ml. Les tailles de particules moyennes représentatives et le potentiel zêta mesurés par diffusion dynamique de la lumière sont présentés dans le tableau 3. Dans certaines combinaisons de formulations, où les valeurs d'IPD dépassent 0,3 (distribution bimodale ou multimodale des tailles), la sonication de la formulation sur un sonicateur de bain-marie pendant 10 min a été utilisée pour réduire les valeurs d'IPD et rendre la distribution des tailles unimodale. Globalement, les données indiquent une certaine augmentation de la taille des particules et une inversion du potentiel zêta (potentiel net positif à partir d'un potentiel net négatif) dépassant approximativement 1 mg/ml de méthylglycol chitosane, cohérent avec le revêtement de la surface avec du méthylglycol chitosane. A des concentrations dépassant un certain seuil, on s’attend à ce que le méthylglycol chitosane sature la surface des NLS, avec un excès libre en solution. Résumé des paramètres des formulations pour les NLS-CRX-601 enrobées de méthylglycol chitosane

NT : non testé, U : unimodale, B : bimodale, M : multimodale

La plupart des combinaisons de formulations étaient unimodales dans la distribution des tailles. Les formulations 1,5 %-NLS étaient inférieures à 100 nm, alors que les formulations 6 %-NLS étaient > 200 nm. Il n'a été observé aucune précipitation/agrégation à l'une quelconque des concentrations de MGC testées indiquant l’incorporation de CRX-601 dans les NLS (une précipitation est généralement observée avec du CRX-601 aqueux libre dans la zone de neutralité).

Exemple comparatif : une variante de procédé de préparation des formulations basée sur l’étude par Sandri et al., [J of Microencapsulation, 2010, 27 (8), 735-746], qui décrit la préparation de NLS directement dans une solution de chitosane (à la place de l’eau utilisée auparavant) a été également tentée. Seuls des blancs de NLS (sans CRX-601) ont été préparés, dont les mesures des tailles des particules moyennes représentatives et des potentiels zêta sont présentées dans le tableau 4.

Tableau 4 Résumé des paramètres des formulations pour des NLS associées à du méthylglycol chitosane préparées en utilisant le procédé de Sandri et al.

U : unimodale, B : bimodale, M : multimodale, NT : non testé

La plupart des formulations avaient des valeurs d’IPD considérablement supérieures avec ce procédé (tableau 4), par conséquent ce procédé n’a pas été considéré comme un procédé approprié pour la préparation de CRX-601/NLS.

Exemple 4 - Test de pyrogénicité chez le lapin

Le test de pyrogénicité est utilisé ici comme mesure substitutive de l’incorporation de CRX-601 dans les NLS issues des exemples 1 à 3 et comme mesure de leur stabilité en milieu biologique. Le test a été effectué chez Pacific Biolabs (Hercules, CA) selon leur SOP (procédure d’utilisation normalisée) 16E-02, qui suit les procédures présentées dans USP<151>. La formulation 1,5 %-NLS/CRX-601 n’a présenté aucune pyrogénicité à une concentration de 25 ng de CRX-601/kg de poids corporel de l’animal. Ce manque de pyrogénicité jusqu’à 25 ng/kg correspond à une amélioration d’au moins 10 fois par rapport au CRX-601 libre (dose non pyrogène maximale de là 2 ng/kg) , et indique une incorporation > 90 % de CRX-601 dans les NLS. Les augmentations de température individuelle à partir de trois lapins par test sont indiquées dans le tableau 5.

Mesures représentatives du test de pyrogénicité chez le lapin pour certaines des formulations décrites dans les exemples 1, 2, et 3. Les valeurs entre parenthèses représentent la variation de température maximale pour trois animaux durant la période d’analyse.

NT : non testé ; *NP : réponse non pyrogène, P : réponse pyrogène. Le test est considéré comme NP si aucun des lapins ne montre une augmentation de température individuelle de 0,5 °C ou plus au-dessus de sa température de contrôle respective à n’importe quel point.

Exemple 5 - Compatibilité de l'antigène du virus de la grippe avec les formulations de NLS

La compatibilité avec l'antigène du virus de la grippe fractionné (A/Victoria/210/2009 H3N2, lot #AS20APA-051-02) a été testée par mélange avec les formulations de NLS aux concentrations requises pour une administration des doses aux animaux. La combinaison résultante a été testée pour toute précipitation par une observation visuelle et par turbidimétrie (aucune diminution du % de lumière transmise à 600 nm). Il n'a été observé aucune précipitation significative ni variation du % de T avec l'une quelconque des formulations.

Exemple 6 - Vaccination sublinguale de souris et détermination des réponses spécifiques en anticorps

Des souris BALB/c femelles (âgées de 6 à 8 semaines) obtenues chez Charles River Laboratories (Wilmington, MA) ont été utilisées pour ces études. A des souris anesthésiées par une administration intrapéritonéale (i.p) de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg), il a été donné le vaccin par administration sublinguale (5 à 6 gl) . Toutes les souris ont été vaccinées aux jours 0, 21 et 42 avec les 5 gg de CRX-601 dans la formulation des NLS mélangés avec 1 ou 1,5 gg de HA/souris en utilisant l’antigène du virus de la grippe A/Victoria/210/2009 H3N2. Le sérum a été récolté en utilisant une ponction rétro-orbitale au jour 36 (14jp2) sous anesthésie, au jour 56 (14jp3) les souris ont été sacrifiées et une récolte finale des liquides de lavage vaginal, des liquides de lavage trachéal et du sérum a été recueillie. Tous les animaux ont été utilisés conformément aux directives établies par le U.S. Department of Health and Human Services Office of Laboratory Animal Welfare et le Institutional Animal Care and Use Committee à GSK Biologicals, Hamilton, Montana.

Les réponses spécifiques en anticorps ont été mesurées par deux tests immunologiques indépendants, le test ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) et le test d’inhibition de l’hémagglutinine (IH) du virus de la grippe.

Le test ELISA a été effectué en utilisant des plaques de 96 puits sensibilisées avec le virus de la grippe fractionné (Nunc Maxisorp) et en détectant les immunoglobulines liées provenant des échantillons ajoutés de sérum ou de liquide de lavage trachéal ou de liquide de lavage vaginal en utilisant des IgG, IgG1, IgG2a ou IgA de chèvre anti-souris liées à de la peroxydase. Ceci a été suivi de l’addition d’un chromogène spécifique de l’enzyme, ce qui a produit une intensité de couleur directement proportionnelle à la quantité d’IgG/IgA spécifiques anti-virus de la grippe contenue dans le sérum. La densité optique a été lue à 450 nm.

Le test IH a été effectué en évaluant l’inhibition des érythrocytes de poulet ou de coq après exposition au virus de la grippe en présence de sérums de souris. L’inverse de la dernière dilution du virus de la grippe qui a produit une agglutination complète ou partielle des érythrocytes a été utilisé pour calculer le titre IH et exprimé en unités HA/50 pl de sérum.

Exemple 7 - Vaccination sublinguale de souris avec des formulations de NLS (NIH # 157, 165, 170, 171)

En se basant sur les études décrites ci-dessus avec diverses formulations de NLS, les formulations décrites dans le tableau 6 ci-dessous ont été choisies, préparées, caractérisées, stérilisées par filtration, et quantifiées par RP-HPLC pour une étude sublinguale chez la souris (étude 1). Résumé des formulations préparées pour l’étude sublinguale chez la souris (étude 1)

Les souris ont été vaccinées en utilisant la procédure présentée dans l’exemple 6 avec des formulations issues du tableau 6. Les titres sériques en anticorps post-secondaires ont été supérieurs avec les formulations de NLS de CRX-601 comparativement aux témoins de véhicule ou une formulation liposomiale de CRX-601 DOPC (1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) (figure 2, panel du haut), à l’exception des NLS cationiques CRX-601, qui n'ont pas été meilleures que les témoins dans ce test particulier. Des souris vaccinées par une administration intramusculaire de CRX-601 + antigène du virus de la grippe fractionné sont également incluses en tant que témoin positif. Pour la majeure partie des groupes, les titres sériques en anticorps post-tertiaires ont été stimulés comparativement aux titres post-secondaires (figure 2, panel du milieu). Le profil des titres a été quelque peu différent par rapport aux post-secondaires, avec 5 μg de CRX-601 dans les 5 %-NLS et 5 μg de CRX-601 dans les 1,5 %-NLS enrobées de chitosane fournissant les meilleurs titres globaux. De façon surprenante, les blancs des NLS cationiques ont également fourni une forte immunité humorale qui pourrait être due à l'adsorption de l'antigène anionique du virus de la grippe sur la surface de ces nanoparticules, aidant leur transport à travers la muqueuse SL. Les titres en IgA anti-virus de la grippe ont été facilement détectés dans les liquides de lavage mucosal des souris vaccinées par voie SL avec le virus de la grippe fractionné et les formulations de NLS ou les témoins de CRX-601 (figure 2).

Les titres sériques IH ont été les plus élevés chez les souris vaccinées avec les 1,5 %-NLS enrobées de chitosane du groupe de 5 μg de CRX-601 et significativement supérieurs au groupe des liposomes de CRX-601 DOPC (figure 3) . Il n'a été noté aucune différence significative entre les autres groupes de traitement SL. L'étude a été suivie d'une étude 2 SL, avec des formulations décrites dans le tableau 7, avec des souris vaccinées en utilisant la procédure présentée dans l’exemple 6. L’étude de suivi comprend des groupes supplémentaires avec des blancs de NLS cationiques, un rapport supplémentaire de NLS-1,5 %/CRX-601 + MGC, et un groupe supplémentaire avec des compositions de la formulation NLS-5 %/CRX-601 + MGC.

Formulations de NLS préparées pour une étude 2 sublinguale chez des souris. Toutes les formulations ont été préparées à une concentration de CRX-601 > 1 mg/ml et elles ont été en outre diluées à 1 mg/ml avant le transfert en immunologie.

*Bien que la valeur d'IPD soit de beaucoup supérieure à celle observée précédemment, la formule était limpide, n'a indiqué aucune agrégation et, par conséquent, a été jugée acceptable pour une autre utilisation. NT : non testé

Les résultats de l'étude 2 sont résumés sur la figure 4. En général, les réponses sériques en IgG ont été supérieures lorsque du chitosane était présent dans la formulation des NLS, par rapport à la formulation de NLS correspondante sans chitosane (figure 4). Les formulations de CRX-601 1,5 % et 5 %-NLS avec du chitosane ont présenté des réponses en IgG supérieures aux groupes témoins IM. Notamment, les formulations NLS CAT sans CRX-601 ont déclenché des taux significatifs d’IgG (figure 4). Les tendances en anticorps sériques post-secondaires ont été similaires aux post-tertiaires, bien qu’avec des taux inférieurs. Tous les groupes de vaccin sublingual ont démontré des titres en IgA dans les liquides de lavage trachéal et vaginal significativement supérieurs contre les témoins positifs IM, avec des titres dans le liquide de lavage vaginal surpassant les titres dans le liquide de lavage trachéal (figure 4). Les CRX-601 1,5 % NLS avec 5 mg/ml de chitosane ont déclenché la plus grande réponse en IgA, comparativement aux autres formulations de CRX-601. Notamment, les formulations NLS CAT sans CRX-601 (BLC) ont également déclenché des taux significatifs d’IgA.

En se basant sur les résultats de cette étude, les formulations de NLS, particulièrement avec 5 à 10 mg/ml de chitosane, sont des candidats de tête prometteurs pour les formulations de vaccination SL. En outre, les formulations NLS CAT sans CRX-601 ont déclenché des taux significatifs d’IgG et d’IgA.

Les titres IH post-tertiaires correspondaient aux titres en IgG post-tertiaires. Toutes les formulations testées ont été capables de produire des anticorps fonctionnels à des taux généralement similaires aux groupes témoins IM (à l’exception du Blc NLS CAT (SA-0,5 %) ancien et du BLC NLS CAT (SA-1 %) (figure 5).

Claims (25)

1. REVENDICATIONS

   1. Composition comprenant des nanoparticules lipidiques solides (NLS), dans laquelle les NLS comprennent un aminoalkyle glucosaminide phosphate (AGP).
2. 2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle l’AGP est un agoniste du TLR4.
3. 3. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’AGP est CRX-601.
4. 4. Composition selon la revendication 3, la composition comprenant de 0,45 à 2,5 mg/ml de CRX-601.
5. 5. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les NLS comprennent du béhénate de glycéryle.
6. 6. Composition selon la revendication 5, la composition comprenant de 1 à 5 % (p/v) de béhénate de glycéryle, comme 3 % (p/v) de béhénate de glycéryle.
7. 7. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les NLS comprennent du polysorbate 80.
8. 8. Composition selon la revendication 7, la composition comprenant de 0,5 à 3 % (v/v) de polysorbate 80.
9. 9. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les NLS sont cationiques.
10. 10. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les NLS comprennent un lipide cationique et/ou un tensioactif cationique.
11. 11. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les NLS comprennent un composé choisi dans le groupe constitué de SA, DDAB ou CTAB.
12. 12. Composition selon la revendication 11, la composition comprenant 0,25 à 1,5 % de SA, comme 0,25 à 0,55 % de SA, par exemple, 0,5 % de SA ou 0,25 à 1,5 % de DDAB, comme 0,25 à 0,55 % de DDAB, par exemple, 0,5 % de DDAB.
13. 13. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le potentiel zêta est de 20 mV ou supérieur, par exemple, entre 20 et 3 0 mV.
14. 14. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, la composition comprenant en outre un agent mucoadhésif, tel que le méthylglycol chitosane.
15. 15. Composition selon la revendication 14, la composition comprenant de 0,2 à 5 mg/ml de méthylglycol chitosane, de préférence de 2 à 5 mg/ml de méthylglycol chitosane.
16. 16. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la taille moyenne des NLS dans la composition se situe entre 30 et 200 nm, comme entre 30 et 150 nm, comme entre 30 et 100 nm.
17. 17. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l’indice de polydispersité des NLS est inférieur à 0,75, comme inférieur à 0,5, comme inférieur à 0,4.
18. 18. Composition immunogène comprenant une composition de NLS selon l’une quelconque des revendications précédentes et un antigène.
19. 19. Composition immunogène selon la revendication 18, dans laquelle l’antigène est un antigène du virus de la grippe, tel que l’hémagglutinine.
20. 20. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 17, ou composition immunogène selon la revendication 18 ou 19, pour une utilisation en médecine.
21. 21. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 17, ou composition immunogène selon la revendication 18 ou 19, pour une utilisation dans l’immunisation d’un sujet humain.
22. 22. Composition ou composition immunogène selon la revendication 21, la composition étant administrée par une voie transmucosale, telle qu’une administration sublinguale.
23. 23. Procédé de préparation d’une composition comprenant des NLS selon l’une quelconque des revendications précédentes, ledit procédé comprenant : a. La dissolution et le mélange de l’AGP et d’un lipide dans un solvant organique b. L’élimination du solvant organique à partir du mélange c. Le chauffage du mélange résultant et le mélange avec une solution aqueuse contenant un tensioactif pour produire un mélange huile dans l’eau, et d. La réalisation d’une étape de réduction de taille, par exemple, en utilisant la microfluidisation ou la sonication, et e. L’étape permettant à la composition de refroidir.
24. 24. Procédé selon la revendication 23, comprenant l’étape supplémentaire de mélange avec une solution contenant un agent mucoadhésif, telle qu’une solution contenant du méthylglycol chitosane.
25. 25. Procédé selon la revendication 23 ou 24, comprenant l’étape supplémentaire de mélange avec un antigène.