WO2022162131A1

WO2022162131A1 - Compositions liposomales orales

Info

Publication number: WO2022162131A1
Application number: PCT/EP2022/052020
Authority: WO
Inventors: Jean-Yves RENAULT
Original assignee: Jean-Yves RENAULT
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2022-08-04
Also published as: CA3204844A1; US20240108685A1; CN116981441A; AU2022212571A1; EP4284332A1; JP2024504814A; FR3119325B1; FR3119325A1

Abstract

La présente invention concerne une composition liposomale administrable par voie orale, nasale ou pulmonaire comprenant un phospholipide chargé négativement, optionnellement un phospholipide zwitterionique, un stérol, et une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile utile pour traiter et / ou prévenir toute pathologie mettant en œuvre l'activation des monocytes et/ou des macrophages.

Description

DESCRIPTION

COMPOSITIONS LIPOSOMALES ORALES

DOMAINE DE L’INVENTION

L’invention concerne de nouvelles compositions liposomales orales et leurs utilisations.

CONTEXTE DE L’INVENTION

L'effet thérapeutique d'une substance administrée est habituellement directement lié à la quantité et à la vitesse à laquelle la substance atteint la circulation sanguine.

De nombreux facteurs affectent la capacité de la substance à atteindre la circulation systémique, notamment: le site d'entrée dans l'organisme, la forme physique de la substance, la conception de la formulation du produit, les propriétés physico-chimiques de la substance active et des excipients, et une absorption appropriée de ladite substance active.

L'administration orale d'une substance thérapeutique est la forme d'administration la plus courante aujourd'hui en raison de la commodité et de la facilité d'administration. Les facteurs qui influencent l'absorption, et donc la capacité de la substance à atteindre la circulation sanguine d'une substance administrée par voie orale sont liés aux propriétés physico-chimiques de la substance, aux facteurs physiologiques du tractus gastro-intestinal et aux caractéristiques de la forme posologique. Les formes posologiques orales conventionnelles se composent de solutions, suspensions, poudres, capsules de gélatine en deux parties, capsules de gélatine molle, comprimés avec ou sans enrobage.

La présente invention concerne une composition liposomale administrable par voie orale, nasale ou pulmonaire comprenant un phospholipide chargé négativement, un phospholipide zwitterionique, un stérol, et une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile utile pour traiter et / ou prévenir toute pathologie mettant en œuvre l’activation des monocytes et/ou des macrophages (système immunitaire inné).

Il existe des médicaments anticancéreux sous la forme de liposomes qui stimulent le système immunitaire des patients. Cependant ces médicaments sont le plus souvent administrés sous formes parentérales, notamment par la voie intraveineuse. L’un de ces médicaments est le mifamurtide liposomal, également connu sous le nom de MTP-PE (muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine) liposomal et commercialisé sous le nom de Mepact®. Le mode d’administration de ce médicament est très contraignant pour le patient puisqu’il est administré une à deux fois par semaine, sous forme d’une perfusion intraveineuse pendant 1 heure. De plus, le traitement doit être administré sous surveillance médicale, donc préférentiellement dans un hôpital. Ce médicament est indiqué pour le traitement de l’ostéosarcome non-métastatique.

Le terme "liposomes" se réfère généralement à des structures lipidiques uni- ou multilamellaires qui peuvent être chargés d'agents thérapeutiques, par exemple l'agent thérapeutique est encapsulé à l'intérieur du liposome, et / ou l'agent thérapeutique peut être attachés au liposome ou incorporés dans la ou les bicouche(s) lipidique(s). Ces formulations liposomales se sont avérées avoir une efficacité accrue par rapport au médicament libre. Par exemple, il a été démontré qu'une formulation liposomale comprenant la vinca alcaloïde vincristine a une plus grande efficacité contre les cellules leucémiques, par rapport à la vincristine libre et qu'elle présente une toxicité globale réduite.

Outre leur capacité à améliorer l'efficacité thérapeutique des composés biologiquement actifs encapsulés, les liposomes présentent des avantages importants tels que la réduction de la dose efficace de substances biologiquement actives formulées par rapport à l'utilisation des mêmes composés libres.

Les problèmes pharmaceutiques associés à l'administration orale de liposomes sont: 1) le pH de l'estomac, 2) les sels biliaires et 3) les enzymes digestives, principalement les lipases. Le pH non tamponné de l'estomac peut varier de 1,5 à 2,5 et peut provoquer une instabilité chimique de la surface de la membrane liposomale.

Les sels biliaires agissent comme des détergents et provoquent une instabilité de la bicouche liposomique par émulsification. Lors d'une exposition à des lipases et à d'autres enzymes, les groupes de tête polaire ou les chaînes acyle des phospholipides peuvent être clivés et ainsi rompre la vésicule liposomique.

La dégradation des liposomes doit être évitée car les médicaments formulés sous forme de liposomes et administrés par voie orale doivent être absorbés sous la forme de liposomes intacts et non dégradés dans la circulation sanguine générale afin de conserver leurs propriétés pharmacologiques . La dégradation des liposomes entraine également une variabilité de l’absorption du principe actif contenu dans les liposomes. Cette variabilité de l’absorption du principe actif est un problème puisque la proportion de principe actif absorbé après une administration orale doit être contrôlée et raisonnablement prédictible.

L’état de la technique a déjà proposé plusieurs types de liposomes renfermant différentes combinaisons de lipides avec ou sans immunostimulant lipophile.

Cependant, l’état de la technique n’a pas divulgué de formulations liposomales suffisamment stables en présence de sels biliaires et optionnellement dans un milieu acide et enzymatique simulant l’environnement gastro-intestinal, pour assurer un traitement efficace lorsqu’une formulation liposomale renfermant une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile est administrée par voie orale.

Par exemple, le document W02007014754 décrit une composition constituée d'une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, préférentiellement un immunostimulant lipophile et une combinaison de phospholipides, en présence de cholestérol, utile pour l'activation in vivo du système immunitaire. Ce document décrit spécifiquement une composition renfermant du MTP-PE (muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine), et comprenant 62,5% de palmitoyl-oléoyl-phosphatidylcholine (POPC), 26,8% de di-oléoyl- phosphatidylsérine (DOPS) et 10,7% de cholesterol. Ce document décrit la préparation de comprimés constitué d'Avicel, de polyvinylpyrollidone et de lyophilisât d’une composition liposomale comprenant un lipopeptide synthétique, 70% de POPC et 30% de DOPS.

Un autre document décrit l'activité biologique in vivo du muramyl tripeptide synthétique, CGP 19835A, lorsqu'il est encapsulé dans des liposomes de phosphatidylcholine (POPC-19835A) et administré par voie orale comme immunomodulateur à des souris. Les liposomes ont été rapidement absorbés dans l'intestin et ont atteint la circulation systémique en 4 h. Les macrophages alvéolaires récoltés dans les poumons de souris 24 h après une alimentation unique de POPC-19835A étaient tumoricides vis-à-vis des cellules cibles du carcinome rénal murin (S. Tanguay et al., Cancer Res. 1994 Nov. 15;54(22):5882-8)

Ainsi, malgré l’existence de plusieurs compositions liposomales pouvant être administrées par voie orale, il existe toujours un besoin de nouvelles compositions liposomales administrables par voie orale, renfermant une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, dont la stabilité est améliorée en présence de sels biliaires.

BREF APERÇU DE L’INVENTION

Dans ce contexte d’une recherche de nouvelles compositions thérapeutiques améliorées, un premier but de l’invention est de proposer une nouvelle composition liposomale. Un second but de l’invention est de proposer un procédé permettant de produire ladite composition liposomale. Enfin, un autre but de l’invention est de proposer des compositions pharmaceutiques et leurs utilisations.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Le demandeur de la présente invention a donc montré qu'un liposome comprenant un phospholipide chargé négativement, un phospholipide zwitterionique, un stérol dans certaines gammes en % en poids ou en mole et une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile utile pour l'activation du système immunitaire, en particulier l’activation des cellules de types monocytes ou macrophages présente une stabilité à pH acide et/ou en présence de sels biliaires améliorée.

La présente invention concerne ainsi plus particulièrement une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC). Selon la présente invention, le au moins un phospholipide zwitterionique est un phospholipide zwitterionique dont la ou les chaines carbonées est (sont) saturée(s).

Selon la présente invention, les % molaires des constituants i) à iii) concernent uniquement les lipides du liposome, considérés comme des excipients, et ne tiennent pas compte de la partie lipidique d’une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, par exemple de 1’ immunostimulant lipophile.

La gamme de 25% à 35% d'au moins un phospholipide chargé négativement signifie que le au moins un phospholipide chargé négativement est présent dans le liposome à une concentration en poids ou en mole de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%.

La gamme de 30% à 50% d'au moins un phospholipide zwitterionique signifie que le au moins un phospholipide zwitterionique est présent dans le liposome à une concentration en poids ou en mole de 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%.

La gamme de 20% à 30% d'au moins un stérol signifie que le au moins un stérol est présent dans le liposome à une concentration en poids ou en mole de 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%.

Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, de préférence de 26% à 32%, plus préférentiellement 30%, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, de préférence de 30% à 40%, plus préférentiellement 40%, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, de préférence de 22% à 28%, plus préférentiellement 25%, ou 30%, caractérisée en ce que ladite composition liposomale est stable en présence de sels biliaires, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC).

Selon l’invention, un phospholipide chargé négativement doit être compris comme un phospholipide possédant une charge négative à pH physiologique. Par exemple, la phosphatidylsérine (PS) contient un groupement sérine estérifié à l’acide phosphatidique. Du fait d’une charge unique sur le groupement phosphate, la PS est chargée négativement à pH physiologique. Le phosphatidylinositol (PI) et le phosphatidylglycérol (PG) ont, respectivement un groupement glycérol estérifié à l’acide phosphorique ou un sucre estérifié à l’acide phosphorique ; le PI et PG sont chargés négativement à pH physiologique.

Plus particulièrement selon l’invention, le au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant le phosphatidylinositol (PI), la phosphatidylsérine (PS), le phosphatidylglycérol (PG), l'acide phosphaphatique (PA), le diphosphatidylglycérol (DPG) ou cardiolipin (CL), leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, et leurs mélanges.

Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide chargé négativement est la phosphatidyl sérine (PS) ou un dérivé de la phosphatidyl sérine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyloléoyl-phosphatidylsérine (POPS), palmitoyl-linoeoyl phosphatidylsérine (PLPS), palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylsérine (PAPS), palmitoyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (PDPS) , stéaroyl-oleoyl-phosphatidylsérine (OSPS), stéaroyl-linoléoyl-phosphatidylsérine (GPPS), stéaroyl- arachidonoyl-phosphatidylsérine (SAPS), stéaroyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (SDPS), di-capryl-phosphatidylsérine (C10PS), di-lauroyl-phosphatidylsérine (DLPS), di-myristoyl-phosphatidylsérine (DMPS), di- phytanoyl-phosphatidylsérine (DPhPS), di-heptadecanoyl phosphatidylsérine (PS 17:0/17:0), di-oléoyl-phosphatidylsérine (DOPS), di-palmitoyl-phosphatidylsérine (DPPS), di-stéaroyl phosphatidylsérine (DSPS), di-linoleoyl phosphatidylsérine (dil8:3 PS) di-erucoyl phosphatidylsérine, di-docosahexaenoyl- phosphatidylsérine, et leurs mélanges, de préférence la dioleoyl- phosphatidylsérine (DOPS).

Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide chargé négativement est le phosphatidylglycérol ou un dérivé de phosphatidylglycérol choisi dans le groupe comprenant le palmitoyloléoyl-phosphatidylglycérol, palmitoyl-linoleoyl phosphatidylglycérol, palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylglycérol, palmitoyl- docosahexaenoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl-oléoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl- linoleoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl-arachidonoyl-phosphatidylglycérol, stéaroyl- docosahexaenoyl-phosphatidylglycérol, di-capryl phosphatidylglycérol di-lauroyl phosphatidylglycérol, di-heptadecanoyl-phosphatidylglycérol, di-phytanoyl- phosphatidylglycérol, di-myristoyl phosphatidylglycérol , di-palmitoyl-phosphatidylglycérol (DPPG), di-élaidoyl-phosphatidylglycérol (DEPG), di-stéaroyl-phosphatidylglycérol, di- oléoyl-phosphatidylglycérol, di-linoéoyl-phosphatidylglycérol, di-arachidonoyl- phosphatidylglycérol, et leurs mélanges, en particulier le di-oléoyl-phosphatidylglycérol.

Selon l’invention, un phospholipide zwitterionique doit être compris comme un phospholipide neutre à pH physiologique. Par exemple, la phosphatidylcholine (PC) contient un groupement choline estérifié à l’acide phosphatidique. Au pH physiologique, La PC possède à la fois une charge négative portée par le groupement phosphate et une charge positive portée par le groupement choline. La phosphatidyléthanolamine (PE) contient un groupement éthanolamine estérifié à l’acide phosphatidique. La PE ayant une structure similaire à la PC, c’est également un phospholipide neutre à pH physiologique.

Plus particulièrement selon l’invention, le au moins un phospholipide zwitterionique est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, la lécithine, la lysolécithine, la lysophatidyl-éthanolamine, les phosphoglycérides, et leurs mélanges.

Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide zwitterionique est la phosphatidylcholine ou un dérivé de la phosphatidylcholine choisi dans le groupe comprenant la di-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (DAPC), la di-élaidoyl-phosphatidyl- choline (DEPC), la dilauroyl-phosphatidyl-choline (DLaPC), la di-linoléoyl-phosphatidyl- choline (DLPC), la di-linolénoyl-phosphatidyl-choline (DLnPC), la di-myristoyl-phosphatidyl- choline (DMPC), la di-myristoleoyl phosphatidylcholine (DMoPC), la dioléoyl phosphatidylcholine (DOPC), la di-palmitoyl-phosphatidyl-choline (DPPC), la dipentadécanoyl phosphatidyl-choline (DPePC), la dipalmitoléoyl-phosphatidyl-choline (DPoPC), la diphytanoyl phosphatidyl-choline (DPhPC), la di-petrosélénoyl-phosphatidyl-choline (DPsPC), la di-tridécanoyl phosphatidyl-choline (DTPC), la l-hexadécyl-2-arachidonoyl phosphatidylcholine (HAPC), la palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (P APC), la 1 ,2- dihexadécanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), et la l,2-distéaroyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DSPC) et leurs mélanges, de préférence la l,2-distéaroyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DSPC) et encore plus de préférence la di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC). Selon un mode de réalisation préféré, le au moins un phospholipide zwitterionique est la phosphatidyl-éthanolamine ou un dérivé de la phosphatidyl-éthanolamine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyl-oléoyl- phosphatidyl-éthanolamine, palmitoyllinoleoyl- phosphatidyl-éthanolamine, palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidyl-éthanolamine, palmitoyl- docosahexaenoyl phosphatidyl-éthanolamine, stéaroyl-oleoyl phosphatidyl-éthanolamine, stéaroyl-linoleoyl-phosphatidyl-éthanolamine, stéaroyl-arachidonoyl phosphatidyl- éthanolamine, stéaroyl-docosahexaenoyl-phosphatidyl-éthanolamine, di-lauroyl phosphatidyl- éthanolamine, di-myristoyl-phosphatidyl-éthanolamine, di-phytanoyl phosphatidyl- éthanolamine, dipalmitoyl phosphatidyl-éthanolamine, diheptadecanoyl phosphatidyl- éthanolamine, distéaroyl phosphatidyl-éthanolamine, di-élaidoyl phosphatidyl-éthanolamine, diarachidonoyl phosphatidyl-éthanolamine, docosa-hexaenoyl phosphatidyl-éthanolamine, et leurs mélanges.

Selon l’invention, le au moins un stérol est choisi dans le groupe constitué par le cholestérol, les dérivés du cholestérol tels que le cholestérol-phosphocholine, le cholestérolpolyéthylèneglycol et le cholestérol-S04, les esters de cholestéryle, la vitamine D, les phytostérols, tels que le sitostérol, le campestérol et le stigmastérol et leurs mélanges, de préférence le cholestérol.

Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% de DOPS, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, ii) de 30% à 50% de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, iii) de 20% à 30% de cholestérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30% par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome.

Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant:

1. i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ledit au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylsérine (PS), ou un dérivé de la phosphatidyl sérine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyloléoyl-phosphatidylsérine (POPS), palmitoyl-linoléoyl phosphatidylsérine (PLPS), palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylsérine (PAPS), palmitoyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (PDPS), stéaroyl-oléoyl- phosphatidylsérine (OSPS), stéaroyl-linoléoyl-phosphatidylsérine (GPPS), stéaroyl- arachidonoyl-phosphatidylsérine (SAPS), stéaroyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (SDPS), di-capryl- phosphatidylsérine (C10PS), di-lauroyl- phosphatidylsérine (DLPS), di-myristoyl-phosphatidylsérine (DMPS), di-phytanoyl- phosphatidylsérine (DPhPS), di-heptadecanoyl phosphatidylsérine (PS 17:0/17:0), di- oléoyl-phosphatidylsérine (DOPS), di-palmitoyl-phosphatidylsérine (DPPS), di- stéaroyl phosphatidylsérine (DSPS), di-linoléoyl phosphatidylsérine (dil8:3 PS) di- erucoyl phosphatidylsérine, di-docosahexaenoyl- phosphatidylsérine, et leurs mélanges, de préférence la di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS), ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC).

Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS), de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC).

Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS), de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole de cholestérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC). Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS), de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome.

Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS), de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole de cholestérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome.

Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de DOPS, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole de cholestérol.

Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale dont le liposome est constitué ou comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) 30% de DOPS, ii) 40% de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, iii) 30% de cholestérol.

Selon un mode de réalisation préféré, les liposomes de la composition liposomale sont stables en présence de sels biliaires, c’est-à-dire la bicouche lipidique des liposomes n’est pas déstructurée.

Selon un mode de réalisation préféré, les liposomes de la présente composition liposomale sont stables en présence de sels biliaires pendant au moins 1 heure, de préférence 2 heures ou 3 heures.

Selon un mode de réalisation préféré, les liposomes de la présente composition liposomale sont stables en présence de sels biliaires et sont absorbés et transférés vers la circulation sanguine.

L’homme du métier comprend que l’efficacité thérapeutique des compositions liposomales de la présente invention, administrées par voie orale est conditionnée par la stabilité des dites compositions liposomales dans un milieu comprenant des sels biliaires. Selon un mode de réalisation préféré, l'agent thérapeutique est un immunostimulant lipophile utile pour l'activation du système immunitaire, pour soigner et / ou prévenir un cancer, en particulier l’ostéosarcome.

Cette activation du système immunitaire est obtenue par absorption de la suspension liposomale par des cellules immunocompétentes qui sont ensuite activées après la liaison de la substance amphiphile immunostimulante à des récepteurs spécifiques. Cette activation peut également être obtenue via une étape initiale d'activation ex vivo dans des conditions de culture de cellules immunocompétentes spécifiques telles que des monocytes, des macrophages ou des cellules dendritiques.

Selon un mode de réalisation préféré l'agent thérapeutique est un immunostimulant lipophile appartenant au sous-groupe thérapeutique ATC L03 de la Classification Anatomique, Thérapeutique et Chimique de l'OMS, par exemple l’interféron ou un dérivé de l’interféron.

Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, une substance amphiphile d’intérêt biologique ou au moins une des substances amphiphiles d’intérêt biologique selon l’invention est un immunostimulant amphiphile sélectionné. Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, 1’ immunostimulant amphiphile est associé à des peptides amphiphiles ou à des antigènes lipopeptides. L’association d’un immunostimulant amphiphile et d’un ou plusieurs peptides amphiphiles ou antigènes lipopeptides est conçue pour induire également des réponses immunitaires spécifiques aux peptides amphiphiles ou aux antigènes lipopeptides.

L’expression « immunostimulant amphiphile » désigne toutes les substances capables de déclencher des réponses immunitaires innées via des récepteurs tels que les récepteurs TOLL et NOD des monocytes, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK ou cellules polynucléaires, in vitro ou in vivo, et capables de s’ancrer, par sa partie lipidique, dans les bicouches lipidiques d’un liposome. Des exemples d’ immunostimulants amphiphiles sont le muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine (MTP-PE), la bis-(taurine)-L-glutaminyl-N- palmitoyl-S-[2-(R)-3-dilauroyloxypropyl]-L-cystine (JBT 3002), le sitostérol, le lipide A ou d’autres dérivés du LPS ou les nucléotides riches en motif CpG amphiphiles. La présente invention ne se limite pas aux immunostimulants amphiphiles décrits ci-dessus.

Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, 1’ immunostimulant amphiphile est le muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine (MTP-PE).

Le muramyl tripeptide phosphatidyl ethanolamine a été décrit comme un adjuvant pour les études de protection contre les antigènes tumoraux ou les antigènes du virus (virus de l’herpès simplex ou VIH-1). MTP-PE a un effet stimulant sur la prolifération cellulaire et est capable d’activer les capacités cytotoxiques des monocytes.

Dans un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, 1’ immunostimulant amphiphile est la bis-(taurine)-L-glutaminyl-N-palmitoyl-S-[2-(R)-3- dilauroyloxypropyl]-L-cystine (JBT3002), un lipopeptide bactérien synthétique capable d’activer les macrophages et d’induire la production de cytokines inflammatoires (TNF-[alpha], IL-I, IL-6).

Dans un autre mode de réalisation particulier de la présente invention, 1’ immunostimulant amphiphile est le sitostérol. Par sitostérol, on entend le sitostérol, ainsi que 1' [omicron] eta-sitostérol, l'[omicron]eta-sitostérol glucoside. La capacité immunostimulante du 6eta-sitostérol (un phytostérol) a été démontrée in vitro et in vivo. L'[epsilon]éta-sitostérol est capable d’améliorer la prolifération des lymphocytes T en présence de phytohémagglutinine, de stimuler l’activité des cellules NK et d’induire une sécrétion accrue d’IL-2 et d’interféron gamma par les lymphocytes.

Les immunostimulants amphiphiles décrits ci-dessus peuvent être associés à des peptides amphiphiles ou à des antigènes lipopeptides. Lesdits peptides amphiphiles ou antigènes lipopeptides sont de préférence formés par des chaînes peptidiques de 8 à 16 acides aminés (considérés comme des peptides immunogènes), liées via le groupe terminal NH2 à une chaîne aliphatique et lipidique de 5 à 30 carbones, plus préférentiellement de 8 à 18 carbones. Les peptides immunogènes typiques utilisés sont choisis parmi des antigènes peptidiques sauvages ou modifiés ayant une affinité élevée pour les molécules du CMH de classe I et du CMH de classe IL Lesdits peptides peuvent être sélectionnés dans le groupe constitué de peptides induisant le CTL, de peptides d’antigène des cellules tumorales ou de peptides de l’antigène de l’hépatite. Plus préférentiellement, les peptides sont choisis dans le groupe constitué par les antigènes des cellules tumorales solides du carcinome (WO 0142270, US 6.602.510, WO 0145728 et US 07.976.301), les antigènes du mélanome (US 5.662.907 et US 5.750.395), les antigènes de l’hépatite B ou C ou d’autres antigènes tumoraux tels que les antigènes du cancer du sein 5T4 (WO 03068816), les antigènes Her2/neu (US 2004/157780) ou les antigènes p53 (WO 00141787).

Selon un mode de réalisation préféré l'agent thérapeutique est un immunostimulant lipophile dérivé de lipopolysaccharide (LPS).

Selon un mode de réalisation préféré l'agent thérapeutique est une combinaison de plusieurs immunostimulants lipophiles. Selon un mode de réalisation préféré l'agent thérapeutique est un dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP).

Dans un autre mode de réalisation préféré le dérivé lipophile du MTP correspond à la formule (I) ou (II)

dans laquelle R représente un groupe -NH2, ou un groupe -NH-CO-Ri où Ri représente un résidu d’acide gras en C8-C24 ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié, en C1-C30, comportant optionnellement une ou plusieurs double liaison carbone-carbone, de préférence un groupe alkyle en Cs-Cis, comportant optionnellement une ou plusieurs double liaison carbone-carbone.

Dans un autre mode de réalisation préféré, Ri est choisi parmi un résidu d’acide caprylique (8:0), d’acide caprique(10:0), d’acide laurique(12:0), d’acide myristique(14:0) d’acide palmitique (16:0), d’acide stéarique (18:0), d’acide arachidique (20:0), d’acide béhénique (22:0), d’acide lignocérique (24:0), d’acide cérotique (26:0), d’acide myristoléique (14:1), d’acide palmitoléique(16:l), d’acide sapiénique(16:l), d’acide oléique(18:l), d’acide élaïdique (18:1), d’acide trans-vaccénique (18:1), d’acide linoléique (18:2), d’acide linolélaïdique (18:2), d’acide a-linolénique (18:3), d’acide y-linolénique(18:3), d’acide dihomo-y-linolénique(20:3), d’acide arachidonique (20:4), d’acide eicosapentaénoïque (20:5), d’acide clupanodonique (22:5), ou d’acide docosahexaénoïque (22:6); ou

Dans un mode de réalisation préféré l’immunostimulant lipophile est le MTP-PE (mifamurtide). Ce tripeptide muramyl comprend des résidus phospholipidiques qui permettent l'association de la partie hydrophobe de la molécule avec un environnement lipidique tandis que la partie muramyl peptide s'associe à l'environnement aqueux.

Le muramyl tripeptide phosphatidyl éthanolamine a été décrit comme un adjuvant pour les études de protection contre les antigènes tumoraux ou les antigènes viraux (virus Herpes simplex ou VIH-1). MTP-PE a un effet stimulant sur la prolifération cellulaire et est capable d'activer les capacités cytotoxiques des monocytes.

Le mifamurtide est commercialisé sous la dénomination Mepact® et est indiqué chez des patients âgés de deux à 30 ans pour le traitement de l’ostéosarcome non métastatique de haut grade (un type de cancer des os). Mepact® est utilisé en association avec d’autres médicaments anticancéreux après élimination chirurgicale du cancer.

Selon le résumé du rapport européen public d'évaluation (EPAR) relatif à Mepact®, l’utilisation du mifamurtide en association avec d’autres médicaments anticancéreux, augmente la durée de survie des patients sans récidive de la maladie: 68% des patients sous Mepact® (231 sur 338) ont survécu sans récidive de la maladie, par comparaison à 61% des patients (207 sur 340) qui ne l’ont pas reçu. Le risque de décès était également réduit de 28% chez les patients sous Mepact®. Ce traitement est injecté par perfusion. La dose de mifamurtide recommandée pour l’ensemble des patients est de 2 mg/m² de surface corporelle. Elle doit être administrée deux fois par semaine à 3 jours d’intervalle minimum pendant 12 semaines, puis une fois par semaine pendant 24 semaines supplémentaires, soit un total de 48 perfusions en 36 semaines.

Après perfusion intraveineuse de Mepact®, les liposomes sont sélectivement pris en charge par les macrophages, phagocytés et progressivement dégradés dans les cellules. Les effets indésirables observés sous Mepact® (chez plus d’un patient sur 10) sont les suivants: anémie (faible numération de globules rouges), perte d’appétit, maux de tête, vertiges, tachycardie (rythme cardiaque rapide), hypertension (tension artérielle élevée), hypotension (tension artérielle basse), dyspnée (difficultés à respirer), tachypnée (respiration rapide), toux, vomissements, diarrhées, constipation, douleurs abdominales (maux d’estomac), nausées, hyperhydrose (transpiration excessive), myalgies (douleurs musculaires), arthralgies (douleurs dans les articulations), douleurs dans le dos, douleurs dans les extrémités (les bras et les jambes), fièvre, frissons, fatigue, hypothermie (faible température corporelle), douleurs générales, malaises, asthénie (faiblesse) et douleurs dans la poitrine.

Les propriétés anti-métastatiques du Mepact® ont également été montré dans des études cliniques (Kleinerman et al. American Journal of Clinical Oncology 1995, 18(2) : 93-9. Anderson et al. Pediatric Blood & Cancer 2014, 61(2) : 238-44 ).

La composition liposomale Mepact® contient 0,4% (4 mg de mifamurtide). Le liposome est constitué de l-Palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3 -phosphocholine (POPC) et de 1,2- dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho-L-sérine (DOPS) selon le ratio molaire 7:3.

Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale, dont 1’ immunostimulant lipophile est constitué ou comprend une concentration de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), de préférence 0,4% ou moins en poids de MTP-PE.

Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale, constituée ou comprenant : a) de 0,1 à 1 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), de préférence 0,4% ou moins en poids de MTP-PE, b) un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% d’une phosphatidylsérine, de préférence DOPS, de préférence de 26% à 32%, plus préférentiellement 30%, ii) de 30% à 50% d’une phosphatidylcholine, de préférence DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence de 30% à 40%, plus préférentiellement 40%, iii) de 20% à 30% d'au moins un stérol, de préférence le cholestérol, de préférence de 22% à 28%, plus préférentiellement 25%, ou 30%. Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale, constituée ou comprenant: a) de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), de préférence 0,4% ou moins en poids de MTP-PE, b) un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome : i) 30% de DOPS, ii) 40% de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence le DSPC et encore plus de préférence le DMPC, iii) 30% de cholestérol.

Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour la préparation d’une composition pharmaceutique destinée à une administration par voie orale.

L'administration orale désigne une administration par ingestion de comprimés, pilules ou capsules contenant la poudre selon l’invention. L'administration orale désigne également une administration d’une suspension de la poudre dans un solvant aqueux pharmaceutiquement acceptable, par exemple sous la forme d’un sirop ou d’une suspension buvable.

Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour la préparation d’une composition pharmaceutique administrée par voie nasale.

Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour la préparation d’une composition pharmaceutique administrée par voie pulmonaire.

Selon un autre mode de réalisation préféré, la présente invention concerne une composition liposomale pour son utilisation dans une méthode d’activation du système immunitaire inné, en particulier l’activation des cellules de types monocytes ou macrophages. L’homme du métier comprend que l’activation du système immunitaire, en particulier l’activation de cellules de types monocytes ou macrophages permet de traiter les cancers et notamment les métastases cancéreuses. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la présente composition liposomale est utilisée pour le traitement de patients atteints de cancer, de préférence l’ostéosarcome, du cancer du rein ou du cancer de la glande mammaire.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la présente composition liposomale est utilisée pour le traitement et/ou la prévention de métastases cancéreuses en particulier de métastases pulmonaires.

La présente invention concerne également une méthode de traitement des cancers ou de prévention des récidives cancéreuses, en particulier les cancers des os, du rein ou de la glande mammaire et de leurs métastases, en particulier pulmonaires, en utilisant une composition liposomale décrite ci-dessus.

Préparation des liposomes

Les liposomes de la présente invention sont préparés selon des techniques connues de l’Homme du métier. Par exemple, cette méthode de préparation est basée sur deux étapes séparées de solubilisation, dans lesquelles les lipides sont solubilisés dans un solvant polaire miscible à l'eau (butanol tertiaire ci-après également nommé t-butanol) ou bien un mélange de chloroforme et de méthanol (dans les proportions 5:1) (solution A) et l'agent biologiquement actif est dispersé dans un milieu aqueux physiologiquement compatible contenant éventuellement un cryoprotecteur (solution B). La solution A et la solution B sont ensuite mélangées. Par conséquent, selon cette méthode, la substance amphiphile d'intérêt biologique n'est initialement pas présente dans la phase t-butanol mais uniquement dans le milieu aqueux.

Alternativement, les lipides et l'agent biologiquement actif sont directement mélangés dans un solvant polaire miscible à l'eau.

Le document W02007014754 décrit un autre procédé qui est particulièrement adapté à la préparation des liposomes selon la présente invention.

Ce procédé, qui comprend une étape de dispersion (suivie d'une étape de lyophilisation ou d’atomisation/séchage) de phospholipides, et de cholestérol, et d'une ou plusieurs substances amphiphiles d'intérêt biologique dans un mélange approprié de solvants, permet la production d'une suspension liposomale.

Plus particulièrement le procédé de préparation de la suspension liposomale comprend: a) une étape de préparation d'un mélange d’un immunostimulant lipophile et d’un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome : i) de 25% à 35% d’au moins un phospholipide chargé négativement, ii) de 30% à 50% d'au moins un phospholipide zwitterionique, iii) de 20% à 30% d'au moins un stérol, b) une étape de dispersion dudit mélange dans un solvant polaire miscible à l'eau.

Selon un mode de réalisation particulier, le solvant polaire est constitué de t-butanol dihydraté et de t-butanol ou d’un mélange de chloroforme/méthanol en particulier dans un ratio 5:1. Le solvant polaire peut aussi être constitué d'un mélange de 60 à 100% de t-butanol dihydraté et de 0 à 40% de t-butanol, de préférence dans un mélange de 75% à 100% (p / p) de t-butanol dihydraté et de 0 à 25% (p / p) de t-butanol.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'une poudre selon l'invention, comprenant une étape c) d’atomisation/séchage de la suspension liposomale obtenue à l’étape b).

Selon un mode de réalisation particulier, la suspension liposomale contient un excipient hydrophile, de préférence du mannitol ajouté avant l’étape d’atomisation/séchage.

Selon un autre aspect de l’invention la suspension liposomale est extradée à travers un dispositif poreux et ensuite passée à travers une buse. L'utilisation d'une buse de diamètre suffisamment petit limite l'écoulement de la suspension après avoir été extradée à travers le dispositif poreux.

Des buses utiles pour réaliser cette étape du procédé de l'invention sont également généralement connues de l'homme du métier. Ils comprennent, par exemple, des buses à disque rotatif, des buses à jet d'impact, des buses capillaires, des buses à un seul orifice, des buses à ultrasons de type vibrant ou pulsé, des buses à deux fluides telles que des buses coaxiales à deux fluides, etc. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la buse est une buse à orifice. Dans la présente invention, la taille de pore préférée de la buse est comprise entre environ 0,05 mm et environ 1 mm, plus préférablement entre environ 0,1 mm et environ 0,2 mm. Dans l'appareil de l'invention, la buse peut être comprise dans un récipient adapté à la déshydratation du liposome obtenu, en particulier adapté à la déshydratation par atomisation ou par atomisation.

Le débit de la suspension peut être compris entre environ 1 ml / min et environ 1000 ml / min. Plus typiquement, les liposomes ont été préparés par le procédé de l'invention en appliquant un débit de 10 ml / min à 200 ml / min, et plus préférablement d'environ 20 ml / min à environ 100 ml / min.

Selon un autre mode de réalisation, la pression utilisée pour l'extrusion de la suspension liposomale à travers le dispositif poreux et la pression de passage de la suspension liposomale à travers la buse peuvent être sensiblement identiques, en particulier être comprises entre 0,5 bar et 1200 bars. Plus typiquement, les liposomes peuvent être préparés par le procédé de l'invention avec 5 bars à 600 bars, de préférence d'environ 10 bars à environ 500 bars et plus préférablement d'environ 20 bars à environ 150 bars.

Le séchage des liposomes après la formation de gouttelettes peut être réalisé en mettant en contact les gouttelettes avec un courant gazeux, de préférence un courant gazeux chauffé, pour obtenir des particules solides. De préférence, le flux gazeux utilisé est un gaz inerte. Le gaz de séchage peut être de préférence un gaz à faible teneur en oxygène contenant moins de 0,1 vol. %, de préférence moins de 0,05 vol. % en oxygène. Les gaz inertes augmentent la sécurité d'un système de séchage chauffé. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'azote est utilisé comme gaz inerte. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le gaz inerte protège les ingrédients actifs et les excipients contenus dans la formulation. De préférence, le séchage par atomisation est effectué dans un dispositif approprié pour le séchage par atomisation.

Le séchage par atomisation peut par exemple être réalisé dans une tour de séchage. Les liposomes déshydratés sont séparés du courant gazeux et collectés.

Dans un mode de réalisation préféré, la suspension liposomale comprend éventuellement un excipient hydrophile. Les excipients hydrophiles utiles peuvent être monomères, oligomères ou polymères et peuvent être trouvés parmi plusieurs classes chimiques de composés. Selon l'un des modes de réalisation préférés de l'invention, l'excipient hydrophile est un saccharide, par ex. un mono-, di-, oligo- ou polysaccharides, un alcool de sucre, un acide aminé, un peptide, une protéine, un polymère hydrosoluble ou une combinaison de ceux-ci. Un saccharide, ou hydrate de carbone, est défini comme un composé principalement composé de carbone, d'hydrogène et d'oxygène. Les saccharides utiles comprennent les sucres et les alcools de sucre, les oligosaccharides, les polysaccharides hydrosolubles et leurs dérivés. Les saccharides préférés selon l'invention comprennent, mais sans s'y limiter, le glucose, le fructose, le lactose, le saccharose, le tréhalose, le maltose, le cellobiose, le galactose, le maltotriose, le maltopentose, le raffinose, la dextrine, le dextran, l'inuline, le mannitol, le sorbitol, le xylitol, le chitosane; les dérivés de cellulose hydrosolubles tels que la méthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose et fhypromellose; les alginates, les amidons solubles ou les fractions d'amidon, la gomme xanthane, la gomme de guar, la pectine, la carraghénine, le galactomannane, la gomme gellane, la gomme adragante, y compris tout dérivé de ceux-ci. Les saccharides particulièrement préférés sont le glucose et le tréhalose.

D'autres excipients hydrophiles utiles peuvent être choisis parmi d'autres classes chimiques, telles que des acides aminés, des peptides ou des protéines solubles dans l'eau. Par exemple, la glycine ou d'autres acides aminés naturels peuvent être utilisés. Les protéines utiles comprennent, mais sans s'y limiter, la gélatine, l'albumine, la protéine de lactosérum, la protéine de soja ou d'autres protéines alimentaires ou végétales.

D'autres exemples d'excipients hydrophiles utiles sont des polymères tels que des polymères solubles dans l'eau tels que des polyéthylèneglycols solides, de l'alcool polyvinylique, des polyacrylates ou de la polyvinylpyrrolidone.

Selon l'invention, des mélanges de plus d'un excipient hydrophile peuvent être utilisés. Par exemple, il peut être nécessaire d'ajuster indépendamment plusieurs paramètres tels que le pH, la solubilité et la mouillabilité. Dans ce cas, un premier excipient hydrophile peut être choisi comme matériau support basique pour les systèmes colloïdaux, tandis qu'un ou plusieurs excipients hydrophiles supplémentaires peuvent être incorporés pour obtenir un certain pH et / ou mouillabilité.

Bien entendu, le milieu aqueux comprenant la suspension liposomale peut comprendre d'autres excipients ou substances auxiliaires, hydrophiles ou hydrosolubles. Ces substances sont solubles et extraites par le milieu d'extraction ou non, ces substances peuvent être incluses dans les particules sèches ou éliminées avec l'eau et le solvant organique. Les substances, qui sont comprises dans les particules sèches, doivent être pharmaceutiquement acceptables.

D'autres excipients préférés comprennent des stabilisants, des tensioactifs, des agents mouillants, des agents gonflants, des auxiliaires de lyophilisation, des antioxydants, des agents chélatants, des conservateurs, des agents osmotiques, des excipients acides ou alcalins pour ajuster le pH, etc.

Parmi les excipients préférés selon l'invention figurent les stabilisants et les antioxydants. Les antioxydants peuvent empêcher l'oxydation d'un composé actif incorporé, mais aussi celle des composants du colloïdal en particulier si l'on utilise des lipides sensibles à l'oxydation. Des composés utiles comprennent, par exemple, des antioxydants liposolubles tels que l'alpha, bêta et gamma-tocophérol, l'ubiquinol, le lycopène, l'alpha et le bêta-carotène, l'acide nordihydroguaiarétique, le butyl hydroxyanisole, le butyl hydroxytoluène, l'acide éthylènediamine tétraacétique, l’acide dienta-étriamine pentaacétique, etc. L'alpha-tocophérol et l'acide éthylènediamine tétraacétique sont particulièrement préférés, y compris leurs dérivés pharmaceutiquement acceptables. D'autre part, si des lipides saturés chimiquement purs, semi- synthétiques ou synthétiques sont utilisés pour la composition des systèmes colloïdaux, aucun antioxydant ne peut être nécessaire.

L'invention concerne également une poudre décrite ci-dessus telle que celle préparée par un procédé comprenant les étapes a-c), ladite poudre étant constituée ou comprend un liposome constitué ou qui comprend par rapport à la composition lipidique en poids ou en mole totale du liposome: i) de 25% à 35% d'au moins un phospholipide chargé négativement, ii) de 30% à 50% d'au moins un phospholipide zwitterionique, iii) de 20% à 30% d'au moins un stérol, v) de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP).

L'invention concerne également un procédé pour la préparation de liposomes avec une taille et une distribution de taille appropriées pour une administration par voie orale.

De préférence, les liposomes de la composition de la présente invention peuvent avoir un diamètre compris de 100 nm à 10 pm, de préférence de 1 à 10 pm et plus préférentiellement de 2 à 5 pm. Le diamètre des liposomes peut être contrôlé, par exemple, par l'extrusion de la composition liposomale à travers un filtre en polycarbonate ayant une taille de pore connue. Les procédés de contrôle de la taille des liposomes sont bien connus dans l'art et sont décrits, par exemple, dans Mayhew et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta.

Il est possible de déterminer la granulométrie moyenne des liposomes. En effet, une distribution granulométrique est caractérisée par les valeurs moyennes (valeurs moyennes): nombre de diamètre moyen (NMD), volume moyen diamètre (VMD) et la polydispersité en taille est généralement caractérisée par le rapport VMD / NMD (poly dispersity index, PI ).

Une valeur de 1,00 ou proche de 1,00 signifie que toutes les particules ont la même taille, plus l'écart par rapport à 1,00 est élevé, plus la polydispersité de taille est élevée.

La distribution granulométrique peut être déterminée par la technique NANOTRAC basée sur l'analyse du mouvement brownien des particules dispersées dans un liquide par acquisition du spectre d'énergie correspondant au décalage de Doppier.

L'appareil MTUPA 250 - NANOTRAC 250, équipé d'un laser à 780 nm, fonctionne par diffusion laser pour des particules de taille de 0,8 à 6500 nm.

Les liposomes obtenus selon la présente invention sont caractérisés par une polydispersité de 1 ,00 à 1 , 20.

Les liposomes, les particules sèches ou une poudre les comprenant, tels qu'obtenus par le procédé de l'invention, peuvent être utilisés dans la fabrication d'un médicament. Si les particules satisfont à toutes les exigences d'une forme galénique pharmaceutique, elles peuvent être utilisées telles quelles et introduites directement dans des récipients appropriés.

La poudre contenant les liposomes peut contenir de l'eau résiduelle (0,1 à moins de 5%), étroitement liée aux lipides, résultant du procédé de préparation de ladite poudre.

En variante, la poudre contenant les liposomes peut être mélangée avec d'autres ingrédients actifs et / ou inactifs comme par exemple des supports pharmaceutiquement acceptables.

Selon un mode de réalisation particulier, la poudre est micronisée à une taille moyenne comprise entre 1 et 5 micromètres, adaptée à une administration par inhalation.

Pour une application par inhalation, la poudre selon l'invention est chargée dans un dispositif de pulvérisation à sec pour délivrer ladite poudre sous la forme d'un aérosol.

Ledit dispositif de pulvérisation à sec permet de déposer ladite poudre par exemple dans la gorge, sur les amygdales, ou avantageusement directement dans les alvéoles pulmonaires où les macrophages résidents peuvent être directement activés par la suspension liposomale formée in situ. L'invention concerne également une suspension liposomale, de préférence multi- lamellaire obtenue par mise en contact d'une poudre selon l'invention avec un milieu aqueux. Le milieu aqueux peut être de l’eau stérile, éventuellement tamponnée à pH 7,0 - 7,5 et contient éventuellement des conservateurs ou anti-oxydants.

L'invention concerne également l'utilisation d'une poudre ou d'une suspension liposomale multi-lamellaire selon l'invention pour l'activation in vivo du système immunitaire. Cette activation du système immunitaire est obtenue par absorption de la suspension liposomale par des cellules immunocompétentes qui sont ensuite activées après la liaison de la substance amphiphile immunostimulante à des récepteurs spécifiques. Cette activation peut également être obtenue via une étape initiale d'activation ex vivo dans des conditions de culture de cellules immunocompétentes spécifiques telles que des monocytes, des macrophages ou des cellules dendritiques.

Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique selon l'invention contient la poudre présente dans une gamme de 50 mg à 2 g en une seule application ou unité.

Les liposomes de la présente invention sont stables en présence de sels biliaires. Selon la présente invention, on entend par «liposome stable en présence de sels biliaires », un liposome, dispersé dans un milieu aqueux, dont la bicouche lipidique n’est pas déstructurée par un traitement par les sels biliaires, de préférence en présence de taurocholate de sodium, déoxycholate de sodium et cholate hydrate de sodium ou leurs mélanges, de préférence un mélange contenant les trois sels biliaires.

Le test de stabilité des liposomes est réalisé en présence de sels biliaires à une concentration comprise de 2 à 10 mM chacun, de préférence 4 mM. Le test est effectué à une température ambiante de 20°C ou de 37°C. Les liposomes sont mis en contact avec les sels biliaires pendant au moins 1 heure, de préférence 2 heures ou 3 heures.

La stabilité des liposomes après traitement en présence de sels biliaires est mise en évidence par un test visuel. En effet, la suspension de liposomes avant traitement apparait légèrement opaque d’une couleur blanchâtre ; lorsque les liposomes sont dénaturés par les sels biliaires, la suspension de liposomes dénaturés est transparente. Une observation au microscope optique montre des débris de liposomes (voir Figure 6). La présente invention est par ailleurs illustrée, sans toutefois s’y limiter, par les figures et exemples suivants.

LISTE DES FIGURES

La figure 1 montre un flacon contenant une suspension de liposome avant traitement par des sels biliaires.

La figure 2 montre des images de microscopie optique de liposomes avant filtration (image A) et après filtration à 5 pm (image B). Le grossissement est de xl030.

La figure 3 montre la distribution de tailles des liposomes obtenue par une méthode d’analyse d’image automatisée.

La figure 4 montre une image de microscopie optique de liposomes formant des agrégats d’une taille supérieure à 20 pm.

La figure 5 montre un flacon contenant une suspension de liposome après traitement par des sels biliaires. L’observation du flacon montre que les liposomes sont dénaturés et la suspension devient transparente (Image A)

La figure 6 montre une image de microscope optique d’une suspension de liposomes dénaturés.

PARTIE EXPERIMENTALE :

Exemple 1: Fabrication et analyses des suspensions de MTP-PE liposomal

Les réactifs suivants ont été utilisés (les fournisseurs sont indiqués entre parenthèses) : MTP- PE (ou mifamurtide, Sigma-Aldrich), méthanol (VWR Chemicals), éthanol (Sigma- Aldrich), chloroforme (Sigma-Aldrich), dichlorométhane (Carlo Erba), acétonitrile (VWR Chemicals), acétone (Sigma-Aldrich), acétate d’éthyle (Carlo Erba), tétrahydrofurane (VWR Chemicals), dimethylsulfoxide (Honey Well), acide trifluoroacétique (VWR Chemicals), formate d’ammonium formate (Fluka), 2-oleoyl-l-palmitoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine ou POPC (Lipoid), l,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine ou DOPS, sous forme de sel de sodium (Avanti Polar Lipids), cholesterol (Sigma-Aldrich), l,2-didecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine ou DDPC (Lipoid), l,2-dilauroyl-sn-glycero-3 -phosphocholine ou DLPC (Lipoid), l,2-dimyristoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine ou DMPC (Lipoid), 1 ,2-dipalmitoyl- sn-glycero-3-phosphocholine ou DPPC (Lipoid) et l,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ou DSPC (Lipoid). Méthode: Les lipides et le mifamurtide ont été dissouts dans un mélange de chloroforme et de méthanol (5: 1), à la concentration de 30 mg/mL approximativement, puis concentré par séchage dans un évaporateur rotatif (2 heures à 40°C) pour former un film lipidique. Le film lipidique a ensuite été réhydraté dans une solution aqueuse saline (0.9% NaCl, 5 mL) à température ambiante et sous agitation magnétique. La suspension obtenue a ensuite été filtrée 10 fois au travers d’une membrane polycarbonate de 5 pm avec l’aide d’un Mini-Extruder Avanti Polar afin d’obtenir une suspension liposomale.

Plusieurs types de liposomes, contenant 0,4 % de MTP-PE (soit 1 mg de mifamurtide pour 250 mg de lipides), ont été préparés en utilisant des proportions de lipides variables (exprimées en %).

Tableau 1

Les suspensions liposomales ainsi préparées ont été analysées de trois façons: 1.) par l’observation visuelle des flacons, 2.) par l'observation visuelle des liposomes au microscope optique et 3.) par la mesure de la distribution de tailles des particules (DTP), par un système d’analyse d’image automatisé. Pour cette analyse, une aliquote de 5 pL est placée entre deux lamelles de microscope, et plusieurs champs sont examinés pour l’évaluation de la distribution granulométrique. L’analyse d’image automatisée mesure la taille d’environ 30 000 particules liposomale pour chaque suspension. Résultats: La méthode de préparation permet d’obtenir des suspensions liposomales translucides et légèrement opaque, par exemple la Figure 1 montre un flacon contenant la suspension N°8.

La Figure 2 montre des images de microscopie optique des liposomes de la suspension N°8, avant filtration (image A) et après filtration à 5 pm (image B). Le grossissement est de xl030.

Dans la Figure 2, l’image A montre une suspension liposomale obtenue sans aucune filtration. Les liposomes sont hétérogènes, sans forme ronde, et ont des tailles qui peuvent dépasser 50 pm. L’image B montre une suspension liposomale après une série de dix filtrations à travers une membrane filtrante de 5 pm. Dans ce cas, les liposomes observées étaient beaucoup plus homogènes en termes de forme et de tailles (inférieures à 10 pm.)

La Figure 3 donne un exemple typique de la distribution de tailles des particules qui est obtenue par la méthode d’analyse d’image automatisée. Les résultats de cette analyse sont caractérisés par les valeurs dlO, d50 et d90 qui indiquent la taille maximale (en pm) atteinte par 10%, 50 et 90% des particules liposomales, respectivement, de chaque suspension analysée.

Le Tableau 2 ci-dessous résume les résultats de ces analyses pour les suspensions de liposomes décrites dans le Tableau 1.

Tableau 2

L’observation des flacons de suspensions liposomales N° 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15 montrent des liquides translucides, légèrement opaques et similaires à la Figure 1. L’observation au microscope de ces suspensions a montré qu’elles étaient similaires à celle qui est illustrée dans la Figure 2-Image B. Ces suspensions ont fait l’objet d’une étude de distribution de tailles des particules par analyse d’image automatisée. Les résultats sont indiqués dans le Tableau 2.

Ces résultats montrent que sans addition de DOPS, les particules liposomales obtenues après extrusion au travers d’un filtre 5 pm sont instables et reforment spontanément de gros agrégats.

Ces résultats montrent également que la proportion de cholesterol ne doit pas dépasser 30% puisqu’une proportion supérieure empêche l’obtention de suspensions liposomales homogènes. Exemple 2 : Analyse de la concentration de MTP-PE

La fraction soluble de MTP-PE (sous forme libre ou encapsulée dans des liposomes) a été quantifiée dans chaque préparation, après dilution d’un aliquote dans un mélange de solvant afin de permettre son injection dans un appareil de chromatographie. La concentration en solution a été mesurée par HPLC. Les conditions d’analyse HPLC sont résumées dans le Tableau 3.

Tableau 3 Dans ces conditions, un pic de rétention est observé à 6,5 minutes. Les analyses des pics des suspensions n° 2, 3, 4, 7 et 8 révèlent des concentrations de 0,08 mg/ml qui sont cohérentes avec leurs préparations.

Exemple 3: Effets des sels biliaires sur la stabilité des suspensions de MTP-PE liposomal Les suspensions liposomales N° 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 et 15 décrites dans l’exemple 1 ont été exposées à un mélange de sels biliaires (taurocholate de sodium, déoxycholate de sodium et cholate hydrate de sodium) à la concentration de 4 mM chacun, à 37° C et pendant 3 heures. La stabilité a été évaluée à l’aide des méthodes indiquées dans l’exemple 1, à T-Oh (immédiatement après exposition aux sels biliaires), puis à T-lh et à T-3h (au bout d’une heure et de trois heures d’exposition aux sels biliaires, respectivement.) Les résultats sont résumés dans le Tableau 4.

Tableau 4 La Figure 5 montre des photographies de flacons contenant une suspension N°2 à gauche (image A) et une suspension N°8 à droite (image B). Ces deux suspensions ont été mélangées avec des sels biliaires. La suspension N°2 est devenue limpide et transparente après quelques minutes d’exposition aux sels biliaires. A l’observation microscopique, il a été impossible de retrouver des liposomes. A l’inverse, la suspension N°8 a résisté à la dégradation par les sels biliaires.

La Figure 6 montre une photographie prise au microscope optique de la suspension N°12 après une heure d’exposition aux sels biliaires. L’image révèle une dégradation presque totale des liposomes puisque seuls quelques débris sont visibles.

Pris collectivement, ces résultats montrent que les formulations liposomales qui incluent la DSPC, la DPPC, la DMPC ou la DLPC à la place de la POPC, ainsi que la DOPS à 25-35% et une proportion de cholestérol comprise entre 20 et 30% permettent de résister à la dégradation par les sels biliaires pendant plusieurs heures.

Exemple 4: Effets du pH acide sur la stabilité des suspensions de MTP-PE liposomal

Les suspensions liposomales N° 2 et N° 8 ont été exposées pendant 1 heure à un pH 1. L’examen visuel des suspensions dans les flacons et au microscope n’a pas révélé d’effet notable de dégradation.

Exemple 5: Inclusion de MTP-PE dans les liposomes

La méthode a été préparée selon la méthode décrite dans l’exemple n° 1 et en utilisant les proportions de lipides de la solution N°8. Différentes proportions de MTP-PE ont été additionnées: 0,4%, 1%, 5% et 10%.

L’observation des flacons et au microscope de ces suspensions a montré des suspensions liposomales similaires aux Figures 1 et 2-B. L’addition de MTP-PE jusqu’à une proportion de 10% n’entraine donc pas de désorganisation de la structure des liposomes.

Exemple 6: Fabrication de MTP-PE liposomal sous forme de poudre sèche

Les particules liposomales séchées ont été préparées en utilisant une méthode d’atomisation séchage connue comme « spray drying .» L’appareil utilisé était un Büchi mini spray dryer 290. Le processus d’atomisation séchage comporte quatre étapes: atomisation du produit dans une buse de pulvérisation, contact air-pulvérisation, séchage des gouttelettes de pulvérisation et collecte du produit solide.

La méthode a été utilisée selon les proportions de la solution N°8. Les lipides et le mifamurtide ont été dissouts dans un mélange de chloroforme et de méthanol (5:1) à la concentration finale de 80 pM.

La solution a été injectée à l'aide d'une buse de pulvérisation de 1 mm de diamètre et un flux de 20 ml/minutes. La température de la chambre de séchage était de 90°C. Les particules séchées par atomisation ont été collectées dans un réservoir attaché à un cyclone et stockées dans un réfrigérateur avant leur caractérisation.

Les particules obtenues ont été mesurées par microscopie et avaient un diamètre moyen compris entre 1 et 5 urn.

La poudre sèche ainsi obtenue a été dissoute dans une solution aqueuse saline (NaCl 0,9%). La suspension a été secouée manuellement pendant quelques minutes. L’observation au microscope a montré une suspension liposomale composée de particules d’une taille moyenne de 2 pm, démontrant ainsi que la poudres sèche ainsi obtenue est hydrodispersible.

Exemple 7: Fabrication de MTP-PE liposomal sous forme de poudre sèche

Deux types de particules liposomales sèches ont été préparées en utilisant la méthode décrite dans l’exemple 5, soit en rajoutant du mannitol (35 mM) dans la solution de départ, soit sans en rajouter.

La cristallinité de ces particules sèches préparées avec et sans mannitol a été déterminée par diffraction des rayons X, avec une source de cuivre (Philips, modèle XPERT). Les mesures ont été effectuées à température ambiante en utilisant quelques milligrammes de chaque échantillon et une vitesse de balayage de 2 degrés par minute.

Les résultats montrent une plus grande cristallinité pour les suspensions préparées sans mannitol.

Exemple 8: Etude de l’administration orale de MTP-PE liposomal chez la souris

Des suspensions de MTP-PE liposomal N° 1 et N°10 ont été préparées selon la méthode indiquée dans l’exemple 1. En outre, ces liposomes ont été préparées en incorporant 0,5% d’un marqueur fluorescent N-4-nitrobenzo-2-oxa-l ,3-diazolephosphatidyléthanolamine.

Un lot de 30 souris BALB/c a été divisé au hasard en deux Groupes A et B de 15 souris. Les souris du Groupe A ont reçu une administration de la suspension N°1 par gavage orale à la dose de 20 Lig de MTP-PE et les souris du Groupe B ont reçu une administration de la suspension N°10 à la même dose de MTP-PE. Des échantillons de sang (environ 100 uL) ont été prélevés à 1, 4 et 24 heures après l’administration orale (5 souris par Groupe et par temps de prélèvement). Des frottis ont été réalisés à partir de chaque prélèvement de sang. Les frottis ont été examinés avec un microscope à fluorescence (Zeiss fluorescence microscope) et le nombre de monocytes fluorescents a été compté pour chaque frottis. Le nombre de monocytes fluorescent est un marqueur du niveau d’absorption des liposomes, c’est-à-dire du transfert des liposomes intacts et non déstructurés de la lumière du tractus intestinal vers la circulation sanguine. Après leur passage dans la circulation sanguine, les liposomes qui ont été absorbés sont rapidement phagocytés par les monocytes circulants. Le nombre moyen de monocytes fluorescents était 3, 7 et 5 fois plus élevé dans le Groupe B par comparaison au Groupe A, aux temps 1 , 4 et 24 heures, respectivement.

Exemple 9: Etude préclinique de preuve de concept - Efficacité thérapeutique du MTP- PE liposomal préparé selon l’invention et administré par voie orale dans un modèle de cancer de rein

L’objectif de cette étude était d’évaluer la capacité d’une suspension de MTP-PE liposomal, préparée selon l’invention et administrée oralement, d’inhiber le développement de métastases pulmonaires à partir d’un cancer de rein.

Le modèle expérimental consistait à utiliser des souris immunocompétentes de souche BALB/c et à leur greffer des cellules RENCA de cancer de rein d’origine murine sous la capsule de l’un des deux reins. Cette greffe orthotopique forme une tumeur rénale syngénique. Dans ce modèle, des cellules tumorales disséminent de façon continue dans l’organisme de l’animal et forment de très nombreuses métastases dans les poumons après 17 jours.

Matériel et méthodes

Des suspensions de liposomes ont été préparées selon la méthode indiquée dans l’exemple 1.

Tableau 5 Des tests de résistance aux sels biliaires ont été réalisés selon la méthode décrite dans l’ Exemple 3 et ont montré que les Lots A et B sont résistants alors quel le lot C est rapidement déstructuré. La lignée cellulaire RENCA est dérivée d'une tumeur qui est apparue spontanément sous la forme d'un adénocarcinome cortical rénal chez des souris BALB/c et a été fourni par l’ American Type Culture Collection (USA). Les cellules tumorales ont été cultivées en monocouche à 37°C dans une atmosphère humidifiée (5 % CO2, 95 % air). Le milieu de culture était du RPMI 1640 contenant 2 mM de L-glutamine additionné de 10 % de sérum bovin fœtal et 0,1 mM d’acides aminés non essentiels et 1 mM de pyruvate de sodium. Les cellules tumorales adhèrent aux flacons en plastique. Pour une utilisation expérimentale, les cellules tumorales sont détachées du flacon de culture par un traitement de 5 minutes à la trypsine-versène, dans du milieu de Hanks sans calcium ni magnésium et neutralisées par ajout de milieu de culture complet. Les cellules sont ensuite comptées et la viabilité est évaluée à l'aide d'un test d'exclusion au bleu trypan à 0,25%.

Quarante souris femelles saines BALB/c, âgées de 6 à 7 semaines à la réception, ont été obtenues auprès de Charles River.

Les tumeurs RENCA ont été induites au jour zéro (J0) par voie orthotopique sur 40 souris femelles BALB/c sous anesthésie. Brièvement, l'abdomen de l'animal a été ouvert par une incision médiane dans des conditions aseptiques. Un total de 500 000 cellules tumorales RENCA dans 25 pL de milieu RPMI ont été injectées lentement dans l'espace sous capsulaire du rein droit.

Les animaux ont été randomisés en fonction de leur poids corporel individuel au Jour -2. Les animaux ont été randomisés en quatre groupes de dix animaux chacun (Groupe 1, Groupe 2, Groupe 3 et Groupe 4.) L'homogénéité de poids corporel entre les groupes a été testée par une analyse de variance (ANOVA).

Les animaux du Groupe 1 n’ont pas été traités. Les animaux des Groupes 2, 3 et 4 ont été traités avec les Lot B, A et C, respectivement. Les traitements ont été administrés aux Jours 0, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 et 17. Le traitement a été administré par gavage oral à l’aide d’un tube de gavage. Le volume d'administration était de 5 ml/kg ajusté au poids corporel individuel le plus récent. Dans les Groupes 3 et 4, la dose de MTP-PE était de 1 mg/kg.

Tous les animaux ont été euthanasiés par une anesthésie profonde au gaz isoflurane au Jour 17, une heure après le traitement.

Un échantillon de sang de 500 LIL a été prélevé par ponction intracardiaque. Le sang a été collecté dans des tubes de prélèvement avec un anticoagulant (héparine de lithium). Les tubes ont été centrifugés (2000 g, 10 minutes, 4°C) pour obtenir le plasma et le culot cellulaire. Le plasma de chaque animal a été aliquoté et conservé dans deux tubes en propylène (environ 125 uL/tube) à -80°C pour évaluer les taux plasmatiques de MTP-PE liposomal selon la méthode décrite dans l’article Venkatakrishnan et al. British Journal of Clinical Pharmacology 77(6): 986-97, 2014.) Le culot cellulaire de chaque animal a été transféré et conservé dans un tube en propylène à -80°C pour une analyse ultérieure.

Les paires de poumons de toutes les souris ont été prélevés et pesés. Le poids des poumons reflète la quantité totale de métastases pulmonaires. En outre, une numération macroscopique des métastases pulmonaires sur chaque poumon a été effectuée chez toutes les souris. Les poumons ont ensuite été fixés dans du formol tamponné neutre à 4 % pendant 24 à 48 h, puis inclus dans de la paraffine (Histowax®, Histolab, Suède). Les échantillons ont été conservés à température ambiante pour une analyse microscopique ultérieure

Résultats Les résultats des comptages des métastases pulmonaires sont résumés dans Tableau 6.

Tableau 6 Ces résultats montrent une réduction importante du nombre de métastases pulmonaires dans le Groupe 3 par comparaison aux Groupes 1 , 2 et 4.

Les résultats concernant le poids des poumons sont résumés dans Tableau 7.

Tableau 7

Ces résultats ont montré une réduction importante du poids de poumons dans le Groupe 3 par comparaison aux Groupes 1, 2 et 4. Cette réduction était statistiquement significative (p<0,05, test T de Student) par comparaison aux Groupes 2 et 4.

Les taux plasmatiques de MTP-PE liposomal étaient également significativement plus élevés dans le Groupe 3 par comparaisons aux Groupes 2 et 4.

Conclusion

Ces résultats démontrent la capacité du MTP-PE d’inhiber la dissémination métastatique d’une tumeur cancéreuse quand il est formulé dans des liposomes préparés selon l’invention et administré par voie orale. Ces résultats démontrent également qu’une suspension de liposomes préparés selon l’invention et sans ajout de MTP-PE n’a pas cette capacité. Ces résultats montrent également que le MTP-PE formulé dans des liposomes qui sont déstructurés en présence de sels biliaires n’a pas cette capacité. Dans une étude publiée avec un modèle murin utilisant également des celleules RENCA (S. Tanguay et al., Cancer Res. 1994 Nov. 15 ;54(22):5882-8), l'activité anticancéreuse in vivo du MTP-PE formulé des liposomes de phosphatidylcholine et administré par voie orale à des souris avait montré une activité anticancéreuse modérée. Les conditions expérimentales utilisées dans notre modèle étaient beaucoup plus sévères. En effet, dans l’étude de Tanguay, une quantité maximum de 25 000 cellules RENCA avait été injectée une seule fois par voie intraveineuse aux souris. Dans notre modèle, une quantité de 500 000 cellules a été greffée dans un rein des animaux et ces cellules ont constitué une tumeur rénale chez chaque animal. Dans l’étude de Tanguay, la quantité maximale de métastases pulmonaires était de 150 alors que cette quantité dépassait 400 dans notre modèle.

Ainsi, dans nos conditions expérimentales qui reflètent une maladie cancéreuse métastatique beaucoup plus sévère, le MTP-PE formulé dans des liposomes dégradés par les sels biliaires (Groupe 4) n’a pas montré d’activité anti-métastatique.

Exemple 10 : Etude préclinique de preuve de concept - Efficacité thérapeutique du MTP- PE liposomal préparé selon l’invention et administré par voie orale dans un modèle d’ostéosarcome (cancer de l’os)

L’objectif de cette étude était d’évaluer la capacité d’une suspension de MTP-PE liposomal, préparée selon l’invention et administrée oralement, d’inhiber le développement de métastases pulmonaires à partir d’un cancer de l’os.

Le modèle expérimental consistait à utiliser des souris immunocompétentes de souche C57BL/6 et à leur greffer des cellules MOS-J d’ostéosarcome d’origine murine par injection intramusculaire paratibiale, reproduisant ainsi la maladie humaine. Cette greffe orthotopique forme une tumeur osseuse ostéolytique. Dans ce modèle syngénique, des cellules tumorales disséminent de façon continue dans l’organisme de l’animal et forment des métastases dans les poumons au bout de 5 semaines.

Des tests de résistance aux sels biliaires ont été réalisés selon la méthode décrite dans l’ Exemple 3 et ont montré que les Lots D2 et E2 sont résistants alors quel le lot F2 est rapidement déstructuré.

La lignée cellulaire MOS-J est dérivée d'une tumeur osseuse de souris et a été fournie par le Jackson Laboratory (USA). Les cellules tumorales ont été cultivées en monocouche à 37°C dans une atmosphère humidifiée (5 % CO2, 95 % air). Le milieu de culture était du RPMI 1640 additionné de 5 % de sérum bovin fœtal.

Cinquante souris C57B1/6, âgées de 5 à 6 semaines à la réception, ont été obtenues auprès de Charles River. Les tumeurs osseuses ont été induites par injection intramusculaire paratibiale de 3 000 000 cellules MOS-J par souris.

Les animaux ont été randomisés deux jours plus tard en fonction de leur poids corporel individuel en 5 groupes de dix animaux chacun (Groupe 1, Groupe 2, Groupe 3, Groupe 4 et Groupe 5.)

Les animaux du Groupe 1 n’ont pas été traités. Les animaux des Groupes 2, 3 et 4 ont été traités avec les Lot E2, D2 et F2, respectivement. Les animaux du Groupe 5 ont été traités avec une solution aqueuse de MTP-PE. Les traitements ont été administrés par voie orale deux à trois fois par semaine. Dans les Groupes 3, 4 et 5, la dose de MTP-PE était de 1 mg/kg.

Tous les animaux ont été euthanasiés après 5 semaines et le nombre de métastases pulmonaires a été compté à l’aide d’une loupe binoculaire.

Les résultats ont montré qu’il y avait entre 0 et 7 métastases pulmonaires par souris dans le Groupe 2 alors que ce nombre variait entre 6 et 23 dans les autres Groupes. Ces résultats ont donc montré un effet anti-métastatique du MTP-PE quand ce composé est formulé sous forme de liposomes résistants aux sels biliaires et administré par voie orale.

Exemple 11 : Etude préclinique de preuve de concept - Efficacité thérapeutique du MTP- PE liposomal préparé selon l’invention et administré par voie orale dans un modèle de cancer mammaire. L’objectif de cette étude était d’évaluer la capacité d’une suspension de MTP-PE liposomal, préparée selon l’invention et administrée oralement, d’inhiber le développement de métastases pulmonaires à partir d’un cancer de la glande mammaire.

Le modèle expérimental consistait à utiliser des souris immunocompétentes de souche BALB/c et à réaliser une greffe orthotopique de cellules 4T-1 de cancer mammaire d’origine murine. Cette greffe orthotopique forme une tumeur reproduisant le cancer du sein humain qui dissémine et forme des métastases dans les poumons au bout de 3 semaines.

La lignée cellulaire 4T1 est dérivée d'une tumeur mammaire de souris et a été fournie par l’ATCC (USA). Les cellules tumorales ont été cultivées en monocouche à 37°C dans une atmosphère humidifiée (5 % CO2, 95 % air). Le milieu de culture était du RPMI 1640 additionné de 5 % de sérum bovin fœtal.

Les tumeurs 4T1 ont été induites au jour zéro (JO) par voie orthotopique sur 60 souris femelles BALB/c sous anesthésie. Un total de 300 000 cellules tumorales 4T1 ont été injectées lentement dans le tissu mammaire thoracique droit.

Les animaux ont été randomisés en fonction de la taille de leur tumeur au Jour 9 en six groupes de dix animaux chacun (Groupes 1, 2, 3, 4 et 5.) L'homogénéité des tailles de tumeur entre les groupes a été testée par une analyse de variance (ANOVA).

Les animaux des Groupe 1, 2 et 3 ont été traités respectivement avec le Lot H3 (contrôle), le Lot G3 et le Lot G3 deux fois par semaine par voie orale. De plus, les animaux des Groupe 2 et 4 ont été traités avec des injections intraveineuses de doxorubicine à 8 mg/kg une fois par semaine pendant 3 semaines. Les animaux des Groupe 3 et 5 ont été traités avec des injections intrapéritonéales d’un anticorps monoclonal anti-PD-Lldeux fois par semaine pendant 3 semaines. Tous les animaux ont été euthanasiés après 3 semaines. Le nombre de métastases pulmonaires a été compté à l’aide d’une loupe binoculaire. Les résultats ont montré qu’il y avait entre 10 et 30 métastases pulmonaires dans les Groupes 1, 4 et 5 alors que les métastases étaient significativement réduites dans les Groupes 2 et 3. Les traitements par chimiothérapie (doxorubicine) et immunothérapie (anti PD-L1) n’ont pas montré d’efficacité significative dans ce modèle. Par contre, le nombre de métastases étaient très réduit quand les animaux recevaient une combinaison de chimiothérapie ou d’immunothérapie, en combinaison avec le MTP-PE formulé sous forme de liposomes résistants aux sels biliaires et administré par voie orale.

Claims

REVENDICATIONS

1. Composition liposomale utile pour une administration orale constituée ou comprenant : a) une ou plusieurs substance(s) amphiphile(s) d'intérêt biologique, de préférence un immunostimulant lipophile, encore plus de préférence de 0,1 à 10 % en poids du dérivé lipophile du Muramyl di ou tri peptide (MDP ou MTP), par rapport au poids total de la composition liposomale; b) un liposome constitué ou comprenant: i) de 25% à 35% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide chargé négativement, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole d'au moins un phospholipide zwitterionique, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole d'au moins un stérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale des lipides du liposome, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit ni la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC), ni la 1 ,2-didecanoyl 1-sn- glycero-3 -phosphocholine (DDPC).

2. Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant le phosphatidylinositol (PI), la phosphatidylsérine (PS), le phosphatidylglycérol (PG), l'acide phosphaphatique (PA), le diphosphatidylglycérol (DPG) ou la cardiolipine (CL), leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, et leurs mélanges.

3. Composition liposomale selon la revendication 2, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide chargé négativement est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylsérine (PS), ou un dérivé de la phosphatidyl sérine choisi dans le groupe comprenant la palmitoyloléoyl-phosphatidylsérine (POPS), palmitoyl-linoléoyl phosphatidylsérine (PLPS), palmitoyl-arachidonoyl-phosphatidylsérine (PAPS), palmitoyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (PDPS), stéaroyl-oléoyl-phosphatidylsérine (OSPS), stéaroyl-linoléoyl-phosphatidylsérine (GPPS), stéaroyl- arachidonoyl-phosphatidylsérine (SAPS), stéaroyl docosa-hexaénoyl phosphatidylsérine (SDPS), di-capryl- phosphatidylsérine (Cl OPS), di-lauroyl-phosphatidylsérine (DLPS), di-myristoyl-phosphatidylsérine (DMPS), di- phytanoyl-phosphatidylsérine (DPhPS), di-heptadecanoyl phosphatidylsérine (PS 17:0/17:0), di-oléoyl-phosphatidylsérine (DOPS), di-palmitoyl-phosphatidylsérine (DPPS), di-stéaroyl phosphatidylsérine (DSPS), di-linoléoyl phosphatidylsérine (dil8:3 PS) di-erucoyl phosphatidylsérine, di-docosahexaenoyl- phosphatidylsérine, et leurs mélanges, de préférence la di-oleoyl-phosphatidylsérine (DOPS).

4. Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide zwitterionique est choisi dans le groupe comprenant la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine, leurs dérivés comprenant un ou plusieurs résidu(s) d’acide(s) gras, la lécithine, la lysolécithine, la lysophatidyl-éthanolamine, les phosphoglycérides, et leurs mélanges, pourvu que le au moins un phospholipide zwitterionique ne soit pas la palmitoyl-oleoyl- phosphatidyl-choline (POPC).

5. Composition liposomale selon la revendication 4, caractérisée en ce que le au moins un phospholipide zwitterionique est la phosphatidylcholine ou un dérivé de la phosphatidylcholine choisi dans le groupe comprenant la di-arachidonoyl-phosphatidyl-choline (DAPC), la di-élaidoyl-phosphatidyl-choline (DEPC), la dilauroyl-phosphatidyl-choline (DLaPC), la di-linoléoyl-phosphatidyl-choline (DLPC), la di-linolénoyl-phosphatidyl-choline (DLnPC), la di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC), la di-myristoleoyl phosphatidylcholine (DMoPC), la di-oléoyl phosphatidyl-choline (DOPC), la di-palmitoyl- phosphatidyl-choline (DPPC), la di-pentadécanoyl phosphatidyl-choline (DPePC), la di- palmitoléoyl-phosphatidyl-choline (DPoPC), la di-phytanoyl-phosphatidyl-choline (DPhPC), la di-petrosélénoyl-phosphatidyl-choline (DPsPC), la di-tridécanoyl phosphatidyl-choline (DTPC), la l-hexadécyl-2-arachidonoyl phosphatidylcholine (HAPC), la palmitoyl- arachidonoyl-phosphatidyl-choline (PAPC), la l,2-dihexadécanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DPPC), et la l,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et leurs mélanges, de préférence la l,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) et encore plus de préférence la di-myristoyl-phosphatidyl-choline (DMPC).

6. Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que le au moins un stérol est choisi dans le groupe constitué par le cholestérol, les dérivés du cholestérol tels que le cholestérol-phosphocholine, le cholestérolpolyéthylèneglycol et le cholestérol-S04, les esters de cholestéryle, la vitamine D, les phytostérols, tels que le sitostérol, le campestérol et le stigmastérol et leurs mélanges, de préférence le cholestérol.

7. Composition liposomale selon la revendication 1, caractérisée en ce que: a) 1’ immunostimulant lipophile est le MTP-PE (mifamurtide), de préférence à une concentration de 0,1 à 10 % en poids par rapport au poids de la composition liposomale, b) un liposome constitué ou qui comprend: i) de 25% à 35% en poids ou en mole de DOPS, de préférence 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, ou 35%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome, ii) de 30% à 50% en poids ou en mole de DSPC, DPPC, DMPC, ou DLPC, de préférence 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome, iii) de 20% à 30% en poids ou en mole de cholestérol, de préférence 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, ou 30% par rapport au poids total ou à la masse molaire totale du liposome.

8. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d’une composition pharmaceutique destinée à une administration par voie orale.

9. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle se présente sous la forme d’une poudre sèche, comprenant optionnellement un stabilisant, ou un autre excipient pharmaceutiquement acceptable.

10. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, pour son utilisation pour le traitement ou la prévention d’un cancer, notamment l’ostéosarcome, le cancer du rein ou le cancer de la glande mammaire.

11. Composition liposomale selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, pour son utilisation pour le traitement et/ou la prévention de métastases cancéreuses, en particulier de métastases pulmonaires.