BE1018792A5 - Procede de production d'un hybridome et d'un anticorps monoclonal capable de reconnaitre des metabolites de la vitamine d. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé pour la production d'un hybridome, et d'un anticorpe monoclonal ou de fragments llants de celui-ci, capable de reconnaitre la 25-hydroxyvltamine D2 et la25-hydroxyvitamine D3.

Description

dt^ 9bb^MtfldbM3^(^^^bbb d^b S(b Cb {0001] L’mventran concerne un procédé pour la production d'un hybridome et d’un anticorps monoclonal obtenu à partir de celui-ci, capable de reconnaîtra un épitope présent sur plus d’un antigène. Plus particulièrement, (Invention se rapporte à un procédé pour la production d’un hybridome et d'un anticorps monoclonal ou de fragments üante de ceux-ci, capable de reconnaître plus d’un métabolite de ta vitamine O tels que la 25-hydioxyvâamine 1½ et la 25-hydroxyvHamine O3.

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éePBBq^w» * ^pb^bb b^bp β^β B^^tevtiè*®sBBB^B

{0002] La vitamine O est le terme générique pour désigner ta vitamine D2 ou ergocatcKéro) et la vitamine Os ou chotécalciféiol. L’homme produit naturellement de la vitamine Da sous faction des rayons ultra-violets du soteü sur la peau. La vitamine Os est transférée dans le foie où elle est métabolisée en 25-hydroxyvüamine Os, qui est la forme majeure de ta vitamine O circulant dans l'organisme. Députe le dix-neuvième siècle, la vitamine O2 est fournie par vole orale sous forme sHmentaire afin de suppléer un manque de vitamine Os par exempte chez les personnes qui sont peu exposées eu soteü. La prise de vitamine Os par voie orale a prte une importance aocme au coure dee derniers rtlXal— * a"*— *JÈÈ**b am t\ m SS Jk m«XabaI Sa «ΑΙα jÉa Ia e«lèA*ÂÎÂÂ

Men·, tneneî, on sen « present Que m toto oo ta vwnwne u oane ι ofgcuttsfTie est «ne** en matière de fixation de calcium, et de minéralisation des os. Elle joue un grand rôle dans déférentes voies métaboliques. La 25-bydroxyvitamine D, et plus particutièrement la 25-hydroxyvttamine O2 et la 25-hydroxyvttamine Os sont tes formes de vitamine O stockées ds manière 1a plue abondante dans l'organisme. Ces doux précurseurs peuvent être convertis par tes reins pour tonner la 10,25-dihydroxyvitamine D, qui est la forma biologiquement active. {OOOél il est important de pouvoir doser la teneur en vitamine D dans l’organteme. Toutefois, la mesure du niveau de vitamine O proprement dite est de peu d’intérêt, car tes concentrations en vitamine D fluctuent fortement en fonction de la prise orale de vitamine O2. Ceci est également vrai pour ce qui concerne tes formes physiologiquement actives de la vitamine O (1a,25- dihyóroxyviiamine O), qui tont aussi pfétentet dar» l’organisme dans des quantités relativement faibles et hautement fluctuantes par rapport à la 25· hydroxyvitamine D. Pour ces raisons, la quantification de la 25-hydroxyvitamine D (la 25-hydroxyvitamine 02 et la 25-hydroxyvitamine O3) est un outil apprécié pour analyser globalement la vitamine 0 chez un individu. Plusieurs méthodes existent, certaines d’entre elles imotouent des teohnkiues Immunoiookmes œ j ætrasscsss^^Fss sp vir§rw eessswF rvvinsw· 1¾ espace es ex®ees*æesaFeægpsxgæ«Fse oour déterminer la mésencs de 25-hvdroxwitamin D.

[0004] Habituellement, ta méthodes immunologiques impliquent l’utilisation d'anticorps polyclonaux, ou d’anticorps monodonaux. Les anticorps polyclonaux sont connus depuis longtemps. Pour obtenir de tels anticorps poiyoonaux, osa animaux (te» que oee taptns par exempte; eom immunises avec une préparation hautement purifiée d’un antigène. l'immunisation doit •ire repeio· &voc Cwiie ιιι·νΐιβ pnpäfeöön» νβρνκκυηι βββ β·«Γβιπβ ιβ production d’un méianœ rfmticofDS. ceux-ci ee tient de manière aléatoire à hfs s^xiæpxFSw^ps s æ e·*· wFSFBiMxa^^F ee siesssxs^eFseFXFr sfv ^bpxf s^iw®se xbxf ™f9SFw8*xf®^f ·™xf plus d’un antigène, menant ainsi à une mesure non spécifique. Un premier lakAAaht jkjhft tjt t Jjk j|a tijk^Lahlkl CfiJLjM ftJMMUMJlUAâ J|A MJUMlMMiltf inconvemem est ia ranse os vie oo rantmar. rrequemmem, oe nomoreux animaux doivent être immunisée à cause de la variabilité biologique. Les animaux à l’origine de rantisérum te plus spécifique doivent être sélectionnés et leur mort entrata ta tin de la production des anticorps désirés Jusqu'à fa prochaine immunisation d'animaux. Deuxièmement, la réactivité de l'antisérum aet ««a un inconvénient ιμΑμμμι i’inticome désiré ea unkiuement une eei ese^sr^w ms» wSun^sswnsuFise rtsiTpagwïr e soes%ra^e»sppe* xfsps weiexges“* *exF“r· sw^f fraction de la totalité des anticorps du sérum qui est Hri-méme un mélange trop hétérogène. De plus, la technique souffre de la variabilité de chaque lot. Cependant, la production d’anticorps polyclonaux est une technique rapide et bon marché.

[0008} Dans le domaine de ta reconnaissance des métabolites de la vitamine D. de nombreux documenta décrivant Putitisation d’anticoros ▼ iwM * n» fw ePs xf^f ws%osraFS^p%s^a xPx^s^wseeæxwe^F wv* * s» e sfs·*·eemn* •••w* j··· PQqfCiOfIlUff VOVn νΟΠΠΙΐν« ri» vXvtV^MOf HOIw w |vHniCW W tlvl J UIAII jfi rW9| 3», 629-633), EP 0092004, Kobayashl «t al. (8twold», 1994.69,401-411), al Clamer» al al. (Starokle, 1983,42,603-S09) décrivant la production (fantteoips ootvdonaux et leur utitiaation dans dea rtnaaonfi rediobvnunolodQUM de la

Wirivref ^^fsp· xFxs"S^^^xF»xF*e e^^pee e^Psmrass^FXF e^exFWFeee»»?eiFssxF*x^gj^^qxFXFxp *χ· vitamine D, 10008} On connaît différentes méthodes faisant ou non appel à l'immunologie pour déterminer de manière pius ou moins fiable la 25-hydroxyvitamine O. Dana la document WO 2007/039193, Roche Diagnostics GmbH et F. HOFFMANN-LA ROCHE AG décrivent également reverses méthodes de l’état de Tait. Eux-mêmes divulguent un procédé pour produire des anticorps polyclonaux contre la 25-hydroxyvitamine D qui comprend les étapes d'immuniser un animal avec un conjugué qui contient de la 25-hydroxyvitamine D3 ou bien de 1a 25-hydroxyvitamine D2 en tant qu'haptène, d'isoler du sérum ou du plasma de cet anima! et de purifier tes anticorps contenus dans le sérum ou le plasma par Immunosorption sur une matrice complémentaire, qui comprend de la 25-hydroxyvitamine D* lorsque l’haptène est de te 25-hydroxyvitamine Ds ou qui comprend de ta 25-hydroxyvitamine Da lorsque l’haptène est de te 25-hydroxyvitamine D2. La EAH-Sepharoee a été utilisé comme matière préférée pour te matrice dlmmunosorption. Un premier inconvénient qui se pose avec cette méthode est que tes anticorps sont polyclonaux, c'est-à-dire qu’il est nécessaire de réaliser de nouvelles immunisations d’un animal pour an produire. Un autre inconvénient est que si te méthode permet bien de déterminer à ta fois te 25-hydroxyvitamine Da et te 25-hydroxyvitamine Da, H est en feit nécessaire de réaliser deux batteries de test pour obtenir te dosage du total dea deux composants de la 25-hydroxyvitamine D, c'est è dire un test pour déterminer te quantité de 25-hydroxyvitamine Da dans féchantiDon et un autre pour déterminer la quantité de 25-hydroxyvitamine Da dana ce même échantillon.

{0007] Pour te quantification d'une molécule dans un échantillon biologique, par exemple dans des kits ou dispositifs de diagnostic, des anticorps monodonaux peuvent aussi être utilisés. L’invention de Kohier et Milstein datant de 1975 a ouvert un nouveau domaine de l'immunologie à partir d'une technique de fusion, en présence de poiyéthyiène glycol, d’une celluie de myélome rendu senstete aux composés par une mutation du gène HGPRT avec des ceftutes B de rate d’un animai héte immunisé avec l'antigène d’intérêt. Les cettutes d’hybridomes survivent et peuvent être cultivées dans un milieu approprié (HAT) et rendues immortelles. Chaque hybridome descendant d’une cefiute 8, il fait donc une copte d’un seul anticorps monoclonal. L’hybridome qui produit f anticorps d’intérêt est reproduit en culture pour produire des quantités plus importantes d'anticorps mooockmal qui sont ensuite isolées pour une utilisation ultérieurs. il est important de noter que l'anticorps monoclonal est connu pour être hautement spécifique envers un épitope.

(0008] Dans te domaine de ta reconnaissance de métabolites ds te vitamine O, tes anticorps monodonaux sont également utüisés. Par exempte» Perry et al. (Btechemicaf and biophysfcai research communications. 1983.112. 431-436). US 4S65741 et KobayasN et al. (Biol. Pharm. Bu»., 1997,20(9), 948-953) décrivent Mteation d’anticorps monoclonaux contre te 1,25 dihydroxychotecalciterol. Il est importent de noter que te schéma de production normal d’un anticorps monoclonal dirigé contre un antigène spécifique inclut l’utilisation d’un haptène, l'immunisation d’un animal (généralement une souris), qu'après fusion entre une cellule ds rate et une cédule de myélome, un hybridome est produit, et ce dernier peut être cultivé et immortalisé pour produire un anticorps monodonai spécifiquement dirigé contre un seul épitope <f un seul antigène.

{0009] Si un homme de fart souhaiterait utiliser des anticorps monodonaux pour 1a détection ds plus d’uns motecute, 8 doit produire en deux procédés paraflètes un antteorpe monodonai pour chaque molécule à détecter. Par exemple, WO 03/104620 décrit la quantification de te vitamines A et Ds dans des échantiRons fluides. Un anticorps monodonai contre la vitamine A est produit en utilisant tes procédures standards à partir d’un conjugué vitamine A-KLH (l’haptène est la Vitamins A). Un anticorps monodonai contre te vitamine Os est produit à partir d’un conjugué vitamine D3-KLH (rhaptène est la vitamine Os). Ainsi deux tests doivent être effectués pour obtenir te quantité des deux vitamines dans tes échantillons fluktee.

Résumé ds rinvention (0010] il a été trouvé que te procédé selon rinvention permet d’obtenir un anticorps monodonai produit par un seul hybridome et capable de reconnaître un épitope présent sur plus d’un antigène, os qui est contraire à toutes tes attentes de rail En particulier, les inventeurs ont trouvé que ta 25-hydroxyvitamine Os et te 25-hydroxyvitamine Os se lie à un anticorps issu d’un seul hybridome.

(0011] Pour des raisons de darté, bien qu’tt doit être compris que dans te cadre de finvention, un hybridome donné produit un type donné d’anticorps monodonai, c'est-à-dire en pratique plusieurs molécules de ta même structure, dans le présent texte, lorsque Pon parte de rinvention, on utilisera « anticorps monodonai » pour désigner te production d’anticorps monocional à partir d’un seul hybridome, et « anticorps monocfonaux » pour désigner ta production d'anticorps monodonai issu d'hybridome différente.

(0012) A moins qu'il en soit spécifié autrement, te terme « vitamine 0 » doit être compris dans te cadre du présent texte comme induant tes formes de ia vitamine D* et la vitamine 0$ de formulée (A) et (8) suivantes.

Formule (A)

Formule (B)

(00191 Dans tee formules (A) et (B), les positions de la vitamine D sont •ΑΑμΙαΑΑ ααΙαΑ Ια a Ai rt A »|(·|| a ΜΛ AÉjk4· t 4k AS fcw l^Mk I· gtâ A gBtlk ft f\ lakAÉi^kB ft^k reprises séton a nornsicaïuie on ηβτοηβο· ls cSTtyoïwxyviwmne u inoiqu© des métabolites de la vitamine D oui sont hvdroxvtôs à la position 25 des ▼ ▼ ter «WiWkpws^ptV kSM· ms w ™·βλβ * m im if sesaw imw ▼% pvwvvvns*w k· ^sa wW»··»»" kw formules (A) et (B), c'est-à-dire la 25-hydroxyvitamine D2 ainsi que la 25-hydroxyvitamine 0^. Comme évoqué ci-dessus, la 25-hydroxyvitamine 0a et la ^nyoroxyvnamme us sont cm τοπηοι panicmoiBfneni pBninwws οβ n vitamine 0 pour pouvoir établir un diagnostic.

[0014] Les métabolites de la vitamine 0 ne sont pas en tant que tels des immunogènes. L'activation chimique des composés issus du métabolisme de !s vitamine 0 ainsi que leur couplage à des protéines carrier ou des groupes AAA ASflk^kl AA· SM |α^|Αι *kktik4k4£4^lk kyk4#4kMk4k Η Jk4kè wflWponOBNiB Π ΘΜ pflS ulWH* AhBI pOUv ΙΙΠ9 ιπβιιΜΠΒΒΙΙΟΠ ινυΗΙΒι R ™ essentiel de préparer un conjugué qui peut contenir un métabolite de la vitamine 0 ou un dérivé de celui-ci comme haptène. U terme «haptène »doit être compris par une personne de rail comme une substance qui en sol n’est pas immunogénique mais, par couplage avec une protéine carrier» est présente dans une terme contre a» antfoons peuvent être oénérés. Des protéines carder pour la production de conjugués d’haptènes, tfest-à-dirô des immunogènes, sont connues de l’homme du métier, La sérum albumine bovine (BSA), la ß-galactosidase ou rhémocyanine de patelle (Keyhole Brnpet hemocyanine - KLM) sont couramment utilisées en tant que protéines carder. Le terme « protéine carder » se réfère è une protéine qui transporte une substance spécifique ou un groupe de substances è travers la membrane cellulaire, dans des saub exhaceButetfrss ou dans un comoartiment

Vwl*V*Mi*V MP f %MM IW VMiM •SWB^kESP^P kff^kkkVM%^W«kCWnWkpB9 ki^· wB*» Μ** 'ΠΜ’ΜΛΒΙΒΜΙΠΡτ IB

intraceHuiaire.

[0015] Seuls la posftion 3 des structures telles que représentées dans les formules (A) et (B) convient en principe pour l'activation et te couplage des proiemas carner en βιιβι» tes nweDOines ob b vnenwiB u ww ropuwe 99 coupler via la position 3 (cf WO 2007/035194 ; Kobayashi et ai. "Production and epedhcityof animera rassed against 25-hydroxyvitamin D3-|C-3H>ovme serum aibumin conjugates”, Steroids 1992,57(10), 488-493).

[0018] Selon un premier aspect, la présente invention se rapporte è un procédé de production d’un hybridome, et d’un anticorps monodonal. ou de fragments Bants de celui-ci, capable de reconnaître la 25-hydroxyvitamine De et la 25-hydroxyvitamine Da comprenant les étapes suivantes : a) immunisation d’un anima) avec un haptène de formule (I), ou un se) de celui*cif ou un dérivé de celui-ci dans laque) ia fonction acide cartxrxyftque est protégée pour former un ester, un amide ou une oxazoüne,

dans laquelle n est un nombre entier compris entra 0 et 3 ; R2, R3, R4, R®, R®, R7, R®, R®, R10, R11, R14. R,e sont indépendamment un hydrogène ou un Cm afcyle ; R12 et R13 sont un Cm alkyle ; R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi te groupe consistant en un groupement acyte, benzyte, aflcyte, aryte, éther cfalkyle, cüméthoxytrity), méthoxytrityf, tétrahydropyranyie, triphénylméthyle, ou un dérivé süyüque; ledit haptène étant rendu immunogène ; b) prélèvement de cellules B produites par fanimal et fusion de ceOee-ci avec des coûtées de myélome pour former fbybridome; c) production, à partir de l'hybridome obtenu, d’un anticorps monoclonal, ou de fragmente liants de ceM-ci, capable de reconnaître ia 25-hydroxyvHamine O2 et la 25-hydroxyvitamine Da.

iown te présent procédé permet de produire un anticorps monoclonal capable de Her ou de reconnaître ta 25-hydroxyvttamine O2 et la 25- hydroxyvHamine O3 {deux molécules différentes) à partir d’un hybridome obtenu par immunisation avec un seul haptène rendu immunogénique, c'est-à-dire avee un seul conjugué. Ceci est un résultat totalement inattendu qui ne pouvait pas être suggéré par l'art antérieur. En effet, comme mentionné précédemment, 9 est connu do rart qu’un anticorps monodonal es lie spécifiquement à un antigène qui est similaire à Phaptène utâisé. De manière surprenant, la présente invention décrit un anticorps monodonal liant deux antigènes différents, ledit anticorps monodonal étant produit par un hybridome fourni par rimmunieatiQn avec un seul haptène de formule générale (I).

(0010] L’haptène de formule (I) peut être sous la forme d’un sel de carboxyiate. Des sels organiques ou inorganiques peuvent convenir. Ainsi les sels peuvent être par exemple des sels de sodium, de potassium ou d’ammonium. Alternativement, l’haptène de formule (I) peut être un dérivé dans lequel la fonction adde catboxytique peut être protégée pour former un ester, un amide ou une oxazoüne. L’ester peut être un ester d’aflcyle, un ester benzytique, un ester cParyte, un ester süytique, un tNoester, un séiénoester ou un orthoeeter.

(0010] Dans la présents Invention, le terme « Ci^aikyle » se réfère à un radical hydrocarboné de formule CmHam+i dans laquelle m est un nombre entier compris entre 1 et 4. Par exemple le terme « Ci^atkyle » se réfère à un radical méthyle, éthyle, n-propyfe, f-propryie, n-butyte, Lbutyle, s*butyte, t-butyle.

Le terme « acyle » se réfère à un radical de formule T'C(0)· dans laquelle T1 est un substituant alkyie ou aryfe.

Le terme « benzyle » se réfère à un radical de formule T2CH2* dans laquelle T2 est un groupement aryle.

Le terme « éther cfafcyle » se réfère à un radical de formule T^OT4- dans laquelle T3 est un alkyie, un aryle ou un benzyle et T* une chaîne hydrocarboné de formula *{CM2)p· dans laquelle p est un nombre entier compris entre 1 et 10. Le terme «diméthoxytrityl » se réfère au radical bis-(4-methoxypttenyQphénytméthyte.

La terme « méthoxytrftyl » se réfère au radical 4-metittxyphenyQdiphenyfméthyl.

i* · - ; U terme « aryle » selon la présente invention se réfère à un groupement hydrocarboné aromatique, polyinsaturé, ayant un ou plusieurs cycles fusionnés (par exempie le napfctyie) ou Hé de manière covalente, contenant généralement entre 6 et 10 atomes de carbone, dans lequel au moins un cycle est aromatique, tes cycles peuvent être substituée. Oes exemptes non limitatifs peuvent être le groupement phényie, naphtyte, anthracyle, ttiphenyi.

Le terme « substitué » tel qu'utilisé dans la présente invention indique qu'un ou plusieurs hydrogènes de l'atome indiqué dans fexpression utilisant « substitué » est remplacé avec une sélection du groupe indiqué, à condition que la valence du ou des atomes indiquô(s) n’excède pas la valence normale de celui-ci ou de ceux-ci, et que la substitution résulte en un composé stable chimiquement c’est-à-dire un composé suffisamment robuste pour survivre è son identification è un degré de pureté acceptable à partir d’un mélange réactionnel, tes substituants peuvent être sélectionnée, de manière non limitative, parmi la groupe consistant an un groupement alkyle, atyfe, cyctoalkyte, haiogénure, hydroxyt, nitro, amido, carboxy, antino, cyano. Dans la présente invention, le terme « nltio » ee réfère au groupe -NQ* Dans la présente invention, le terme «cyano» se réfère au groupe «CN. Dana la présente invention, le terme « bydroxyl » ee réfère au groupe -OH. Dans la présente invention, le terme « antido » se réfère au groupe -C(0)-NH*. Dans la présente invention, le terme « carboxy » sa réfère au groupe -0(0)0-. Dans la présenta invention, le terme « haiogénure » se réfère au radical cNowre, fluorure, bromure, ioduie. Dans la présente invention, le terme « antino » ee réfère au radical d’un atome d’azote trivalent substitué ou non. Dans la présente invention, le terme « cydoa&yfe » ee réfère è un groupement alkyle cyclique comprenant tous les groupements hydrocarbonés contenant un ou deux cycles, y compris des groupements monocyctiques ou bicydiques. tes cydoaikyies comprennent au moine trois atomes de carbone dans le cycle, préférentiellement entre 3 et 10 atomes de carbone et peuvent être optionnetlement substitués.

U terme « alkyle » ee réfère à un radical hydrocarboné de formule CmHam+i dans laquelle m est un nombre entier supérieur à 1. Généralement, les groupements alkyfee de ta présante Invention comprennent entre 1 et 10 «tomes de carbone. Par exempte, te terme « Ci.to&fcyte * se réfère mais ne se limite pas à un radical méthyle, éthyle, n-propyle, Lpropyte, n-butyte, Lbutyte, s· butyte, t-butyte, 1-pentyte, 2*pentyfe, 3-pentyte, i-pentyie, néo-pentyle, t* pentyle, t-hexyte, 2-hexyte, 3-hexyte, 1 -méthyM -éfoyl-n-peniyte, 1,1,2*tri-méthyl-n-propyte, l^^riméthyl-npropyte, 3,3-diméthyl-rvbutyte, 1-heptyfe, 2* heptyle, 1 -éthyf-t ^-<«môthyl-n-pfopyle. 1-éthyL2,2-diméthyLrt‘propyte, 1*octyte, 3-octyte, 4-méthyL3-n-hepiyle, 6-méthyl-2*n-hepfyte, 2*propyt-1-n-heptyte, 2,4,4*triméthyt*1 -n*pentyJe, 1-nonyte, 2-nonyte, 2,6‘diméthyM'n-heptyte, 3-éthyL2,2-diméthyf«3*n-pentyte, 3,5,5-triméthyl-1 -n-hexyte, 1-decyte, 2-decyte, 4-decyte, 3,7-diméthyM *n-octyle, 3,7-diméthyL3-nOctyte. Le groupement atkyte oeut être substitué.

Le terme « tétrahydropyranyle » se réfère à un radical du 2-tétrahydropyrane.

Le terme « triphényimôthyte » se réfère à un radical méthyle substitué par trois groupements styles, de préférence phényte.

Le terme « dérivé sHylique » se réfère è un radical de formule T*T*T7Si» dans laquelle T5, T6, T7 sont indépendamment un alkyte, un aryle, un alkoxy ou un aryloxy. Dans ta présente invention, le terme « alkoxy » se réfère à un radical de formule -OT® dans laquelle T® est un atkyte substitué ou non. Dans la présente invention, te terme « aryloxy * se réfère à un radical de formule -OT9 dans laquelle T9 est un aryte substitué ou non.

(0010] Ledit haptène peut être rendu immunogène par couplage covalent avec une protéfoe center immunogénique, par encapsulation dans des liposomes, par ancrage dans des liposomes, per couplage dudit haptène avec un polymère, par induction avec un biopolymère, ou per couptogs avec un peptide antigénique multipfo. Le terme « immunogène » se réfère à une subtance susceptible de provoquer une réaction immunitaire. Contrairement à l'immunogène, Pheptène est un dérivé pouvant être reconnu per te système immunitairs (tar exemnle tes anticomsl mais oui n’induit m» de réaction SSSSsSSSp·· teSCSU ^ySbS SUΙιΛΛ»*SSSesS^e %g«SS SS SS SSPSeWS · ifînTHtVnlcUfVi (0001) Lorsque ledit haptène est couplé de manière covalente avec une protéine carrier immunogénique, ladite protéine carrier peut être ta BSA (sérum albumine bovine), lOvatoumine, THSA (sérum ateumine humaine), la THY (thyroglobuline), la KLH (hémocyanine de patette), la cBSA (albumine bovine cationique), la ß-gaiactosktese ou la CCH (hémocyanine de Conchotepas). 19022] lorsque ledit haptène est couplé à un polymère, ledit polymère peut être un polymère synthétique, naturel ou naturel modifié. Ainsi le polymère synthétique peut être, de manière non limitative, per exemple la poly-l-lysine ou l’agarose. Alternativement, le polymère naturel peut être, de manière non limitative, le dextran. Alternativement, (e polymère naturel modifié peut être, de ΠΙΒηΐΒΓβ ΠΟΠ linUlalIVOt 18 CBiDWiJfffWInyï wRIlKMO·

[0023] Aitemativement, ledit haptène peut être rendu immunogène par induction avec un Mopolymère. la proeédure est décrite dans ia publication Basalp et ai. « tmmunogenic Ctf+-irKluced Bhpotymer système comprisktg a swfoto normone, ptotem amgen, ano synmeoc potyetecuOtyies » nyonovum andHybridomics, 2002,21<1), 45-51, incorporée ici en référence.

[0024] Alternativement, ledit haptène peut être couplé à un peptide antigénique multiple, ledit peptide antigènique multiple peut être un noyau de poiytysine où sont couplés de 2 à 16 copies d’un peptide synthétique.

[0025] De préférence, ledit haptène est rendu immunogène par couplage covalent avec une protéine carrier. U KIM et la BSA peuvent être des protéines carrier particutièrement efficaces pour le procédé et l’utilisation de la présente invention. U couplage entre l’haptène et la protéine carrier peut s’effectuer via la fonction acide caiboxytique de fhaptène.

[0023) De préférence, fhaptène peut être un dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0. Plus particulièrement, ledit haptène peut être te dérivé de formule (!) dans taqueite n est égal à 0 et dans laquelle R, R8, R3, R4, R5, R®, R7, R®, R9, R10, R11, R14, R1S sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Ainsi, te nom d’un tel haptène selon te norme HJPAC est l’acide (2S)-2-((7aR,SHH(Z)-2-((S)-54ïydroxy-2-métiiyteneeyclohexyiidene)éthytidene)-7a-méthyioclahydro-1H-inden*1· yl)^rro|rs^totqrj^r. ip^rut ti^prl^w^rwt ^^trs l^l^mtiftè erotr^r te nom d’acide 23,24,25,28,27-pen!anof-9, 10-eecochotesta-5,7,10( 19)-trien-3{J-ol-22-oïque dont le numéro CAS est 90518-38-4.

[9027] Alternativement, rhaptène peut être un dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 1. Plus particulièrement, ledit haptène peut être te dérivé de formule (I) dans tequetie n est égal à 1 et dans tequetie R, R2, R3, R4, R5, R®, fl7, R®. R®, R10, R11, R14, R18 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Ainsi, le nom d'un tel haptène eeion ta norme tUPAC est fadde (R)-3*((1 Rf3*S,7aR,EH-«Z)'2*((S)-5* hydroxy-2*méthyienecyôohexySdene)éthy8dene)*7a«méthyioctahydro-1 H-indeml *yf)tHitsnôïqus. Ce composé peut égaiement être identifié sous le nom d’adde 24^5,26,27-tetranor*9, t O^eecochoiesta-SJ, 10( 19)-trien»3ß*oi*23-o?que dont le numéro CAS est 76794-34*.

(0099) Alternativement, fhaptène peut être un dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal è 2. Plus particulièrement, ledit haptène peut être le dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à Z et dans laquelle R, R2, R3, R4, R8, R8, R7, R8, R*, R,0f R11, R14, R18 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R*3 v. sont indépendamment un groupement méthyle. Ainsi, le nom cfun tel haptène selon la norme IUPAC est fackle (RW(1R,3aS.7aR,EW(ZH^(S)^ hydroxy"2HnéthyterrecyeÈohexyik!efre)éthyl^^ H* indeml-yOpentanoIque. Ce composé peut également être identifié sous te nom d'acide 25,26,274rinor*9,10-aeoocholesta*5,7,10(19Hriem3p*ol*24*oïque.

(M99] Alternativement, fhaptène peut être un dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 3. Plus particulièrement, ledit haptène peut être le dérivé de formule (l) dans laquelle n est égal è 3 at dans laqueüt R, R2, R3, R4, R8, R8, R7, R3, R®, R10, R11, R14, Rw sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Ainsi, le nom d’un roi haptène selon ta norme IUPAC set fackle (R)*5*((1R,3a$,7aR,E)-4-((2)*2-<(8)-5-hydroxy»2-méthylenecyc^ohexylidefte)éthylider»e}«7a<méthyloctahydro-t H* inden-t-yf)hexanoïque. Ce composé peut également être identifié sous le nom (fadde 26,274)is»w-9,l0-secocholesta-5,W^ 10030] De préférence, les hybridomes produits suite è la fusion des myélomes avec Isa oeüules 8 ds ranimai peuvent être choisis dans le groupe consistant dans las hybridomes déposés au BCCM/LM8P (BCCM/LMBPQ Bê^nCoor^tn^Co^eGtfomafMfcroergmtim-O^timnl^BiomwM Motecutar Bioiogy * Ûand, Belgique) le 21 septembre 2009 et ayant pour numéros de dépôt LM8P 7011CB, LMBP 7012CB et IMBP 7013C8 et les hybridomes déposés au BCCM/tMBP le 9 mais 2010 ayant pour numéro ds dépôt LM8P7205CB et LMBP 7204C8. t’animai utilisé pour les expériences peut être un lapin, une souris, un hamster, un rat, bien que d’autres animaux être utffie4Si (0031) Chaque anticorps monodonal produit par un seul hybridome du présent procédé est capable de reconnaître la 25-hydroxyvitamine 1¾ et la 25* hydroxyvitamine Ds. U reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine 02 et la 25-hydroxyvitamine Os peut être simultanée. U terme « simultanée » signifie que fanticorps monodonal produit par le procédé de la présente invention est capable de Per ou de reconnaître la 25-hydroxyvitamine Da et ta 25-hydroxyvitamine Os lorsqu’ils sont présents dans le même échantillon. Ainsi le pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine Oa et la 25-hydroxyvitamine Da peut être compris entre 70 et 110%. U pourcentage de reconnaissance est le rapport, multiplié par 100, antre la quantité totale de 25-hydroxyvitamine Oa et de 25-hydroxyvitamine Os reconnue par tes anticorps selon finvention et la quantité totale effective de 2$*hydroxyvitamine Oa et de 25*hydroxyvitamine O3 présente dans l'échantillon à tester, le pourcentage peut être supérieur à 100%. Ceci est dû à l'incertitude liée à la méthode de mesure des quantités totales de 25-hydroxyvitamine Oa et de 25-hydroxyvitamine Oa. Ceci est un phénomène bien connu de fhomme du métier pour ce type de dosage.

(00321 Selon un second aspect de l'invention, plusieurs hybridomes, chacun étant capable de produire un anticorps monodonal, ou des fragments de ceM-d, capable de reconnaître la 25-hydroxyvitamine Da et la 25-hydroxyvitamine O3 sont fournis. Un hybridome peut être obtenu par les étapes a) et b) du présent procédé, les hybridomes peuvent être choisis dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP (Befgian UOOfOmawO gOMCWni OT MGfUOIffmniSmS · ΙΛ|>αΙϋΤΐθΠΙ Of WOfTwOlçai

Molecutar Biotogy - Gand, Belgique) le 21 septembre 2009 et ayant pour numéros de dépôt LMBP 7011CB, LM8P 7012CB et IMBP 7013CB et tes hybridomes déposés au BCCM/LMBP le 9 mars 2010 ayant pour numéro do dépôt IMBP 7205CB et LM8P 7204CB. Comme évoqué d-desaus. chacun de ces hybridomes est capable de produire un anticorps monodonal, ou des fragments Bants de celui-d, capable de reconnaître la 25-hydroxyvitamine Oa et la 25-hydroxyvitamine Os. la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine Ds et de la 25-hydroxyvitemine O3 par ledit anticorps monodonal produit par un des hybridomes séton rinvention, peut être simultanée lorsque l'échantillon testé contient de la 25-hydroxyvitamine Os et la 25-hydroxyvitemine O3, H est particuflèrement remarquable que l’anticorps monodonal. ou les fragmenta liants de cefui-d, produit par un hybridome de l'invention peut présenter un pourcentage de reconnaissance envers la 2S*hydroxyvitamine Os et la 25-hydroxyvitamine Os pouvant être compris entre 70 et 110%. l’hybridome peut être utilisé dans la fabrication d’un dispositif de diagnostic capable de reconnaître et de quantifier la 25-hydroxyviiamme Os et la 25-hydroxyvitamine O3 présent dans un ou plusieurs échantillons à tester ou peut être utilisé pour produire un anticorps monodonal ou un fragments de oefui*ci capable de reconnaître ta 25-hydroxyvitamJne Os et la 25-hydroxyvitamine Os. l’hybridome peut être modifié génétiquement afin d’amélioier ta sécrétion d’un anticorps monodonal produit à partir de celui-ci. c'est-à-dire un plasmide ou une séquence AON peut être introduite à la séquence AON de l’hybridome pour former un hybridome génétiquement modifié qui peut être utilisé pour produireun anticorps monodonal capable de reconnaître la 25-hydroxyvHamine D2 et la 25-hydroxyvitamine 03.

(0033] Selon un troisième aspect de l’invention, un anticorps monodonal ou des fragments liants de celui-ci est fourni, ledit anticorps monodonal ou des fragments liants de oelui-d est capable de reconnaître la 25-hydroxyvtiamirtâ Os et la 25-hydroxyvtiamine O3. Ain», un anticorps monodonal contre la 25-hydroxyvitamine D* et la 25-hydfoxyvhamtea O3 est fourni. De préférence, ledit anticorps monodonal ou des fragments liants de ceUri-d peut être produit à partir d’un hybridome choisi dans le groupe consistant dans tes hybridomes déposés au BCCM/LMBP et ayant pour numéros de dépôtLMBP 7011 CB, LMBP 7012CB et IMBP 7013CB et les hybridomes déposés au 8CCM/IMBP la 9 maie 2010 ayant pour numéro de dépét LMBP 7205CB et IMBP 7204CB. Chacun de ces hybridomes set susceptible de produire un anticorps monodonal, ou des fragments liante de celui-d, capable de reconnaître le 25-hydroxyvitamine O2 et ta 25-hydroxyvitamine D3.

10034) la reconnaissance, par ledit anticorps monodonal, de la 25-hydroxyvitamine Os et de la 25-hydroxyvitamine D$ peut être simultanée. De plus, te pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamlne Da et la 25-hydrojcyvttamine Da peut être compris entre 70 et 110%.

[003$) Sekm un quatrième aspect de l’invention, (Invention concerne l’utilisation d’un haptène consistant en un composé de formule (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide cafooxytique est protégée pour former un ester, un amide ou une oxazoiine,

dan· laquelle n aat un nombre entier compris entre 0 et 3 : R2, R8, R4, R®, R* R7, R®, R®. R10, R". R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Cm aikyte ; R12 et R19 sont un Cm aikyto ; R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi ie groupe consistant en un groupement acyte, benzyte, aikyte, aryie, éther «Talkyfe, diméthoxytrityt, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénytméthyto, ou un dérivé süyQque ; leckt haptène étant rendu immunogène; pour la production d’un hybridome, d'un anticorps monoclonal ou de fragmente Hante de celui-ci capable de reconnaître ta 25-hydmxyvitamine Ot et la 28· hydroxyvâamine Os. Alternativement, l'haptène consistant en un composé de formule générale (!) peut être uüsé pour ta production de fragmente recombinante d’un anticorps monoclonal capable de reconnaître la 25- hydroxyvttamine 02et ta 25-hydroxyvitamine D3. Ledit haptène peut être utilisé pour ta production d'un hybridome aeton tes étapes a) et b) du présent procédé décrit ci-dessus. Ledit haptène peut être utisé pour la production d’un anticorps monoclonal selon le procédé de ta présente invention.

(0036] Ledit haptène peut être rendu immunogène par couplage covalent avec une protéine carrier immunogénique, par encapsulation dans des liposomes, par ancrage dans des liposomes, par couplage dudit haptène avec un polymère, par induction avec un biopotymère, ou par couplage avec un peptide antigénique multiple, (0037] Lorsque ledit haptène est couplé de manière covalente avec une protéine carrier immunogénique, ladite protéine carrier peut être la BSA (sérum albumine bovine), fovalbumirte, fHSA (sérum albumine humaine), la THY (thyroglobuline), la KLH (hémocyanine de patelle), la cBSA (sérum albumine bovine cationique), (a ß-gaiactosidase ou la CCH (hémocyanine de Concholepas).

(0030] Lorsque ledit haptène est couplé è un polymère, ledit polymère peut être un polymère synthétique, naturel ou naturel modifié. Ainsi le poiymère synthétique peut être, de manière non limitative, par exempte la poly-L-lysme ou fagarose. Alternativement, le polymère nature) peut être, de manière non limitative, le dextran. Alternativement, le polymère naturel modifié peut être, de manière non limitative, le carboxymêthyl cellulose.

(0039) Alternativement, ledit haptène peut être rendu immunogène par induction avec un biopotymère. La procédure est décrite dans la publication Basaip et ai. « knmunogenhs Ctf*-mduced Biopofymer Systems compriatog a stefoüd hormone, protem antigen, and aynthetic potyeiectrotytaa » Hybridoma and Hybridomica, 2002,21(1), 45-01, incorporée ici en référence.

(0040) Alternativement, ledit haptène peut être couplé à un peptide antigénique muftipte. Ledit peptide antigénique multiple peut être un noyau de poiylysine où sont couplés de 2 à 16 copies d’un peptide synthétique.

(0041) De préférence, ledit haptène est rendu immunogène par couplage covalent avec une protéine carrier. U KLH et la BSA peuvent être des protéines carrier particulièrement efficaces pour le procédé et l’utilisation de ia présente invention. Le couplage entre l’haptène et ia protéine carrier peut s'effectuer vie te fonction adde carboxylique de l’haptène.

(0042] De préférence, l’haptène utitisé pour ta production d’un hybridome et d’un anticorps monodonal obtenu à partir de celui-ci et capable de reconnaître la 25-hydroxyvttamine Da et la 25-hydroxyvttamine Os peut être un composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0. Plus particulièrement, ledit haptène peut être radde (28)-2-((7aR,EH*((Z)-2-((S)-5-hydioxy-2-méthytenecyclohexylidene)éthylidene)-7a-méthyloctahydrD-lH*inden-1 -yl)propanoïque, c'est-à-dire le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0 ; R, R8, R3, R4, R8. R®, R7, R8, R®, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un nycBogene, h ei h son« tncH^snosiTUnoni un giOupofneni nwinyie. ATOmauvemem, inapisns umim pour m pofluciion (run nyonoorrie si crun anticoms monockmd obtenu à partir de ceUnsi et «mwu* de reconnafee la sa» »ei^s^ee» pee» v v ws eseAPvSæ ^wv wafSw®iw va pnsf II? saw sasesses ar» ses AMa®PAati»*sp sé^sp —sps»»p» —· »se»*»mm 25-hydroxyvttamine Da et la 25-hydroxyvitamine Os peut être le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 1. Plus particulièrement, rhaptène peut être tadde (R)-3-((1R,3aS,7aR^)-4-((Z)-2-«8)-5-hydfOxy-2- memyfenecycfonexysaenejemyNaene^/'a-memyrocianyaro-i n-maen-i -yfybutanûtque, c'est-à-dire le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 1 ; R, R8, R3, R4, R5, R3, R7, R3, R3, Rt0, R11, R14, R,s sont indépendamment un

WtMêflMhJtoJk«fe4S· Q l2 üA 1*1 IM ak^>rihA tyfe jn|Mk| MUUM aaI MtMA&Éàas^4ak nywogene, si n eom tnoepenownmsfR w poupewHi msmyw·

Altemativement, l’haptène utülsé pour la production d’un hybridome et d’un antioorpe monodonal obtenu à partir de cefcti-d et capable de reconnaître le 25-hydroxyvttamine 0a et la 25-hydroxyvttamine Os peut être le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 2. Plus particulièrement, rhaptène peut être radde (RHH(ia3e8,7aR,EH-((Z)-2-((8)-5-hydfOxy-2- méthylenecydohexySifene)émylidene)-7a-méthy»octahydfO*t H-hxten-1 -vitoentanotaue. c'est-à-dire le comooeé de formule (Il dans laquelle n est éost wiÿg^wwsewisFwegwsFy se ^fws^w^spia^p wS^»fpFSFW easp "AimAP*sp*sp \*j saea* e®p » » ^fw· iriiw» à 2 ; H, R®, R3, R», R*, R*, R7, R*, R», Rw, R1', R’4, R* sont Indépendamment «A a^liA 4M Ju^4 «ma 4ML· jCêÉs* jÉtffc nywogene, h (h h eoni tncKipenQBfvtfneni un yioupeifieni (WHnyie· Alternativement, rhaptène utülsé pour la production d’un hybridome et d’un mtieoiDS monodonal obtenu à partir de celui-ci et ««mw« de reconnaître la ia»»»s—apsp»sp^a »v»app s^epœ——^sa sa s^^a»s^s sa»p s^sp^ea»^ss» ses s^iasp^aap*»p s^^p -w»»·-»æ-Mw 25-hydroxyvitamine Da et la 25-hydroxyvttamine Os peut être le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 3. Plus particulièrement, rhaptène peut être radde (R)-S-<(1R,3aS,7aR,E)-4-<(2)-2-«8)-5-hydroxy-2- méthyterwcyclohexytWene)éthyliderre)-7a-fitethylo<^ydro-1 H-inden-1 * yOhexanoïque, c'est-à-dire le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 3 ; R, R2, R9, R4, R6, R®, R7, R®, R®, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont Indépendamment un groupement méthyle.

(0043) Ainsi la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamlne D2 et la 25-hydroxyvitamine Da par ledit anticorps monoclonal, ou les fragments liants de celui-ci, peut être simultanée lorsque les deux antigènes sont présent dans le môme échantillon. De plus, le pourcentage de reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine Da et la 25-hydroxyvitamine Da, par lesdHs anticorps monoclonaux ou las fragment liante de ceux-ci, peut être compris entre 70 et 110%.

(0044) L'haptène et/ou l'anticorps monoclonal, ou tes fragmente liante de celui-ci, selon l’invention peut être utiiteé dans la fabrication d'un dispositif de diagnostic capable de permettre la reconnaissance et/ou la mesure de la quantité de 25-hydroxyvHamine 1¾ et de 25-hydrexyvitamine Da dans un ou plusieurs échantiHonfs) à tester. L'haptène étant un composé de formule générale (I) telle que définie d-deeaus, peut être utilisé dans la fabrication d’un dispositif de diagnostic capable de permettre la reconnaissance et/ou la mesure de la quantité de 25-hydroxyvitamine Da et de 25-hydroxyvitamine Da dans un échantillon à tester. Dans ce cas, la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine Da et de la 25-hydfoxyvitamine Oa par ledit anticorps monoclonal peut être simultanée lorsque tes deux antigènes sont présente dans le même échantillon. Le pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine 1¾ et la 25-hydroxyvitamine Da par rantteorps monoclonal peut être compris entre 70 et 110%.

(0045) Selon un autre aspect de l'invention, un dispositif de diagnostic capable de permettre la reconnaissance et/ou ta mesure de la quantité de 25-hydroxyvitamine D* et de 25-hydroxyvüamine Da dans un échantillon è tester est fourni. Le terme « dispositif de diagnostic » tel qu'utilisé ici se rapporte è un kit pour la reconnaissance et/ou la quantification de 25-hydroxyvitamine Da et de 25-hydroxyvitamine D» dans un échantillon. L’éehantillon peut être un échantition humain ou animal. Le dispositif de ctiagnoetic englobe te dispositif de test pour te recherche animale. Ledit dispositif de diagnostic comprend un ! anticorps monoclonal ou des fragments Hanta de celui-d capable de reconnaître la 25-hydroxyvitamine Da et la 25-hydroxyvitamine D3. De préférence, l’anticorps monodonal ou les fragments Hante de celui-ci dutfit dispositif de diagnostic peut être produit, selon ta présente invention à partir d’un hybridome, choisi dans le groupe consistant dm les hybridomes déposés au BCCM/LMBP et ayant pour numéros de dépôt LMBP 7011 CB, LMBP 7012CB, LMBP 7013C8, LMBP 7204CB et LMBP 720SCB. U reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine 0? et de ta 25-hydroxyvitamme Ds, par ledit anticorps monodonal ou les fragments liants de cetui-d, peut être simultanée lorsque les deux antigènes sont présents dans un échantillon à tester. De plus, le pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine O3, par ledit anticorps monodonal ou les fragments liants de ceiui-d, peut être compris entre 70 et 110%. Ledit échantillon à tester peut être un échantiHon biologique humain ou animai.

[0046] Le dispositif de diagnostic peut également comprendre un échantillon du composé de formule (I), ou un sel de oduki, ou un dérivé de ceiui-d dans lequel la fonction acide carboxyüque est protégée pour former un ester, un amkte ou une oxazoüne,

dans laquelle n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ; R*. H*, R4. R*. R*. R7. R*. R*, R'0, R'1. R”, R'5 «ont indépendamment un hydrogène ou un Ci-*afcyie; R12 et R'3 sont un C1.4 aikyte ; R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyie, benzyte, elkyte, «ryte, éther d*alkyte, diméthoxytrttyi, méthoxytrityl, tétrahydropyranyfe, triphényiméthyle, ou un dérivé eitytique.

|Q0é7| PréféfentüHement, le dispositif de diagnostic peut comprendre un échantillon du dérivé de la vitamine D de formule (I) dans taquetie n est un nombre entier épalàOiR, R2, R3, R4, R8, fl·, RT, R*, fl·, R”, R”, RM, R1* oont indépendamment un hydrogène; R'· et H’s sont indépendamment un {ρτοΐφφνηβηι fiNnnyie· wwifieiivwTWfiif 99 wepositu 09 ywynosuw jwui comprendre un échantillon du dérivé de la vitamine O de formule <l) dans laquelle n est un nombre entier égal à t; R. R2, R3, R4, R®, R®, R7, R®, R®, R10, R11 Si14 PfclS Adbmil lg^X|^gej||meiMagM|A«bé ΛΛΜΛ |*bl|iflWhMÄflftA» Π y H SOfn MWepWKIaliknsWii M·* nyQlvQWwi H w Π 9001 ioçi^î9ncronni9ra un uroup9fnevo nwnyw. wwnawwnwii* w wpwn» 09 diagnostic peut comprendre un échantillon du dérivé de la vitamine D de formule (I) dent laquelle n est un nombre entier égal à 2; R, R8, R3, R4, R®, R®, R7, R®, R9, R10, R1’, R14, R1® sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle· ASemativement» le cHspostif de diagnostic peut comprendre un échantillon du dérivé de la vitamine D de formule (I) dans laquelle n est un nombre entier égal à 3; R, R2, R3, R\ R®, R®, R7* R®, R®, Rw, R11, R14, R18 sont indépendamment un hydrogène; R,a et Rt3 sont indépendamment un groupement méthyle.

[0046) Le dispositif de diagnostic peut également comprendre un moyen d'expression d’un signal représentatif de la présence de 26-hydroxyvitamine 02 et de 25-hydroxyvitamlne 03 dans un échantillon à tester.

{0040) Ledit moyen d'expression d’un signai peut être le traceur de formule (II),

dans laqueHe n est un nombre entier compris antre 0 et 3 ; R2, R3, R4, R8, R®, R7, R®, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Cm aikyle ; R12 et R13 sont un Cm atkyte ; R est un hydrogène ou un substituant sélectionné pâmé le groupe consistant en un groupement acyte, benzyte, afkyie, aryle, éther rfalkyle, diméthoxytrttyt, môthoxytrityi, tétrahydropyranyte, triphénytméthyte, ou un dérive sityHque ; R18 est la protéine MRP (horserodish peroxidase), la protéine phosphatase alfcaHne, la protéine POD (peroxidase) ou un groupement de fonnuie (ill) ou (IV).

Le terme * \m » se réfère & un radio-isotope de ratome d’iode. Le groupement (lit) est lié au composé de formule (II) par sa fonction « amino » NH. Le groupement (IV) est Bé au composé (II) par sa fonction « anédo » C(0)NH·. De manière alternative, R19 peut être l’histamine marquée 1SSI, l’histidine marquée 125i, la tyrosine marquée 12el, le méthyle tyrosinate marqué 12fii, un groupement fluorescent, un groupement chemiluminescent ou un groupement de formule générale (V)

, dans laquelle Z est un coupleur et W est un groupement fonctionnel capable de lier un groupement carbonyt. Z peut être un alkyfe Ci* substitué ou non. W peut être une entité amino, amido, hydroxyt ou hydrazine. {0080] Préférentiellement, ledit traceur peut être de formule (II),

dans laquelle nest un nombre entier compris entre 0 et 3 ; R, R2, R3, R4. R8, R6, R7, R*, R9, R10, R11, R14, R15 sont un hydrogène; R12 et R19 sont un groupe méthyle ; R1* est un groupement de formule (III). En particulier, te dispositif de diagnostic peut contenir un échantillon d'un traceur de formule (II) dans laquelle n est égal à 0 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R9, R®, R10, R11, R14, R15 sont w» hydrogène; R12 et R13 sont un groupe métfiyte ; R19 est un groupement de formule (III).

(0081] Alternativement, ledit moyen d'expression d'un signal est un biosenseur. Ce dernier exprime un signal lorsqu'un anticorps monoclonal se Be à un antigène, l'anticorps monoclonal peut être lié sur support du biosenseur. Le terme « biosenseur » se réfère à un dispositif physicochimique susceptible de détecter un échantillon biologique de manière phyeioochimique, optique, piézoélectrique, électrochimique, ou électromagnétique, te biosenseur comprend notamment un élément électronique associé, ou processeur de signal permettant le traitement ou rafffchage des données, et un élément capteur détectant des changements physloochtmiques sous tonne de signaux. {0052] Selon un autre aspect de l'invention, fhaptène de formule générale (I) teile que définie ci-dessus, rendu immunogénique, peut être utHlse pour la production d’un hybridome. Ladite production d’un hybridome peut comprendre les étapes de : a) immunisation d’un animal avec un haptène, rendu immunogénique, de formule générale (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxyüque est protégée pour former un ester, un amide ou oxazoüne, .

' ’ . ' i dans laquelle n est un entier compris entre 0 et 3; R2, R2. R4, R5, R* R2, R*. H*. R'°, R", R14. R” «ont indépendamment un hydrogène ou un Cm afeyte, R12 et R13 sont un Cm alkyl; R est un hydrogène ou un substftuant séiectionné parmi ie groupe consistant en acyie, benzyte, alkyte, aryie, éther (faikyle, dlméthoxytrityf, méthoxytrityl, tétrahydropyranyte, triphénytméthyle, et un dérivé aüySque; et b) prélèvement des ceüutes Θ produites par ranimai et fusion de celles-ci avec des cellules de myélome pour former l'hybridome. A partir de rhybridome obtenu par le présent procédé, a procédé pour ta production (Tun anticorps monodonal, ou un fragment de celui-ci, capable de reconnaître la 25* hydroxyvitamin O2 et 25-hydroxyvitamin O3 peut être fourni.

1005¾ u fea qu'un anticorps monodonal obtenu soit capable de reconnaître la 25-hydmxyvitamine (½ et la 25-hydroxyvitamrne Os est extrêmement surprenant et vainc un préjugé technique selon lequel une teile propriété ne pouvait être obtenue par un anticorps monodonal issu d’un seul hybridome. Un avantage important du procédé de l’invention est qu’il permet la reconnaissance simultanée de la 2S-hydfoxyvitamine O2 et de la 25-hydraxyvüamine Os dans un échantillon, dans un procédé simple et facilement reproductible. En outre, ce procédé répond à un besoin qui est resté longtemps non satisfait dans l'industrie bien que la technique relative aux anticorps monndon1“** soit connue «ewmia oiusteurs décennies, détaiflét fOOMI U présente invention sera décrite selon une «orme d’exécution particuHère dans laquelle rhaptène, utilisé pour l’immunisation de l’animai, est un dérivé de formule (I) dans laquelle n est un nombre entier égal à 0 ; R, R2, R3, R4, R5, R®, R7, R8, R* R10, R11, R14, R1* sont un hydrogène; R12 et R13 sont un groupe méthyle. Cet haptène sera noté (H) pour la suite de la description. Il doit être compris que l’invention n’est pas limitée è cette forme d’exécution. Par exempte, i’haptène peut être un dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal è 1,2 ou 3 avec dea substituants inchangée.

(0055] La production d’anticorps monodonaux peut être effectuée suivant la procédure conventionnelle telle que décrite, par exempte, dans Kohier and Mttstein, Nature 1975 (255), 495-497 ou Eur. J. tmmunot. 1975 (5). 511-519. Selon cette méthode, des ceüutes myéloïdes sont fusionnées avec des ceüutes lymphocytaires B d’un animal immunisé pour obtenir des celkdes hybrides, appelées hybridomes, qui produisent de grandes quantités d’un anticorps monodonal. Dans cette procédure, un haptène est couplé à une protéine carrier pour former un immunogène qui sera en mesure de créer une immunogénicité, U protéine carrier permet donc à l’haptène cfobtenir une capacité cf induction d’une réaction immunitaire.

8vna<è«a d» f haptène al obtention da fimmunooine ΡβββΙ Ainsi, dans ta présente invention, fhaptène (H), dont la synthèse est connue de f homme du métier, est tout d’abord couplé avec ta sérum albumine bovine (BSA) selon le protocole suivant. Oana un miôeu comprenant du diméthytformamide anhydre (Fiufca 1366923*43408231), du dloxane anhydre (Atdrich S39136*277) et du diieopropyiéthytemine (Fluka 03440), une quantité «fhaptène (H) est activée pendant quatre heures A température ambiante par de l’0*(N»SuccWmidyt)*1,1 Æ.^tetraméthyturonium tetraHuoroborate (TSTU - Fluka 65972) sotubtiiaé «Sana du diméthydormamide anhydre. Par la suite, 100 à 1000 équivalents d’haptène en solution sont ajoutés à un équivalent de BSA (Caibiochem 12669) dHué dans du tampon carbonate (0,1 M ; pH 9,4). ta solution est agitée à température ambiante pendant 18h à Pabri de la lumière. Le mélange réactionnel est ensuite dialysé dans une solution satine NaCI (9g4) pendant 48h à 4°C. Une solution saline fraîche est réintroduite après 24h.

{0987| L’haptène (H) peut également être couplé avec ia KLH (Keyhole Hmpet hemoeyanln, Sigma H2133). Dana ce cas, 20000 à 500000 équivalants d’haptène en solution sont ajoutés à un équivalant de KLH dHué dans «Si tampon carbonate (0,1M ; pH 9,4). la solution est alors agitée à température ambiant· pendant iBh à Pabri de la lumière. Le mélange réactionnel est ensuite dialysé dans une solution saline NaCi (9gΛ) pendent 46h à 4°C pour obtenir {Immunogène désiré. Une solution saline fraîche est réintroduite après 24h.

0)089) Les souris fsmeües (8 semaines) utilisées sont fournies par ta société CREAI. L’immunogène (20 pg en solution physiologique safine) est injecté par voie eous*cutanée dans une souris an présence d’un adjuvant (50% solution satine /60 % adjuvant (vol/vot)) pouvant être fa«Jjuvant complet de Freund (CFA, Difoo Laboratories et référence : 283810) ou redjuvant incomplet de Freund (IFA, Difoo Laboratories et référence : 263910). Ls CFA est uns huile comprenant des mycobactéries tuées. L’IFA est la môme adjuvant<$ue te CFA sans les mycobactéries, L’adjuvant permet de etimufer une réponse immunitaire de ^organisme de l’animal. Après quelques infections de l'immunogène (de 3 à 10), ie sérum de chaque souris immunisée est testé pour suivre le taux sériaue en anticoms soédricaies de i'antioène injecté Dós ou'une souris est considérée comme positive (c'est-à-dire que le pourcentage de fixation de l’antigène marqué avec un marqueur radioactif ou enzymatique atteint au moins 10% quand ä est incubé avec le sérum de souris), elle est sélectionnée oour la fusion cetiutaire réalisée dans te mois oui suit ie test de sérum. Au cours de la fusion, ranimai est euthanasié (au CO,), sa rate est prewvM ei m cernera immtmooofnpewnHW preseiws oins ιο raie wivwirii sont récupérées en massant ta rata avec une pince à boute plate tout en la perfusant lentement avec 10 ml de müieu WA) gardé è 37°C, c'est-à-dire un milieu DMEM Dutwcco modified Eagte’s Medtam (GIBCO 21969) sans protéine et compiémenté de 2%(vol/voi) du mélange lOOx de pénicilline et de streptomycine. Lee ceüuies ainsi prélevées sont transférées dans une boite de Pétri, puis dans un tube conique stérile de 15 ml qui est ensuite centrifugé. Le culot de cellules sera récupéré pour ta fusion avec les «Mules myéloïdes.

Cellules myétoMos tyuovj naommiwmeni· we mywomra uinww pour we luwon® ara splénocytes de souris sont les myélomes NSO (Sigma ré1:65110503), 3Ρ2/Ό* Ag14 (ATCC réf .*CRL-1581) ou P3X63Ag8.653 (ATCC réf :1560). Le myélome est cultivé dans un müieu comprenant un mélange de base DMEM sans protéine compiémenté de 2%(votfcof) du mélange tOOx de pénicilline et de streptomycine, 2 à 5%(voVvoi) de glutamine, 2%(voWol) d'acides aminés non essentiels (lOOx), 2%(voi/voi) de pyvuvate de sodium (100x), 1%(νοΙΛ/οΙ) de gentamidne. Le müieu comprend également 10%(vd/vol) de sérum de veau f^s^ilsl· Ls rîirlttrr^r rt^it ^5entriftJij|llit tient des tubes coniques stériles de 50 ml (à lOOOrpm, 10 minutes). Les euiots sont rassemblés et centrifugés dans un tube «Aa éfi Ahâ I^a —— — -X- <6μ*Ι jAéa «αμαΙλαμΙα d éAw a| Ä CW lw ftli· UC iMeiWnl QOnWKIwf lUw Cnl mjfeiOfW fBpfeWllW Cmfv 1 lU W m ιο®«ιωβ$.

fittÎQDLE8ftUÉâ& fooe^l Ira ceüutes de rate sont mélangées avec das ceüuies de myélome, pour fournir tat hytutdoine, avec un rapport d’environ 5 à 10 ceüuies de rate pour 1 ceüute de myélome. Dans le ces présent : 4,7 mt de myélome NSO à 3,4.10e ceüutes/ml sont mélangée 8.107 ceflutes de rate. U mélange des cellule* de rate avec les cellules de myélome est centrifugé et les surnageants écartés. Le culot de ceüutee ainsi obtenu est lentement (1 minute) suspendu dans 1 ml d’une solution de polyéthylène glycol 50%, la température est maintenue à 37°C pour cette opération. U solution de polyéthylène glycol est obtenue en dissolvant S g ds polyéthylène glycol (Merck, ref : 1.09727.0100) dans $ mt de tampon phosphate 0,1 M à pH 7.4. puis en y ajoutant 5%(voVvol) de diméthylsutioxyde (Sigma D2650) et en la etérifisant par filtration (0.2 pm). U culot de celiutes ainsi resuspsndu dans la solution de PEG est dilué au moins 10 fois, par addition d’un milieu W/O (DMEM sans protéine complémenté de 2%(voVvol) du mélange 100* de pénicilline et de streptomycine}. U tube est centrifugé et le culot de cellulee est resuspenAi dans du milieu HAT comprenant un mélange de base DMEM sans protéine complémenté de 2%(voi/vol) du mélange 100* de pénicilline et de streptomycine, 2 è 5%(votfrot) de glutamine, 2%(vot/vol) d’acides emblée non essentiels (100x), 2%(vo9vo») de pyruvate de sodium <100x), 1%(vol/voi) de gentamicine. tû%(vol/Vol) de sérum de veau fartai, 2%(vol/vol) d’hypoxanthine thymidine (SOx). 2 %(voWol) d’aminoptérine (SOx), et éventueüement 2%{voVvol) de Nutridoma CS (Roche réf :1363 743). Le volume de milieu HAT ajouté au culot de ceüutee est tel que fétatement sur les plaques de 96 puits est de 6 104 à 10e cetfutes par puits, à raison de 160 è 200 μ! de milieu par puits. Lee plaques sont incubées entre 8 è 10 Jours» è 37°C et 5% de CQj.

Présélection des hybridomes «oduiaant un anticotBL JBéâegyg (0081) L'identification des puits des plaques rmdtipuits contenant des clones d’hybridomes produisant chacun un anticorps monoclonal capable de reconnaître la 2S*hydroxyvttamine De et 25-hydroxyvHamine Ds est effectuée par une méthode RIA (Radio Immuno Assey) en phase homogène, suivi d’une immunoprécipitation. Cette méthode consiste è incuber un volume (entre 50 et 100 μβ du milieu de culture laeu des plaques muMpufte de la taston, avec un traceur de formule (!t) dans laquelle n est égal à 0 : R, R2, R8, R4, R5, R®, R7, R8, R8, R10, R11. R14 R,s sont un hydrogène: R12 et R13 sont un groupe méthyle ; R18 est un groupement de formule (III). Après un tempe d’incubation entre 4 et 18 h, la réaction est arrêtée par addition de SAC CEL (suspension de cellulose contenant des anticorps anti-souris : IOS référence : AASAC4) au milieu. Après centrifugation, la radioactivité des culots est mesurée dans un compteur gamma. Les puits positifs (c’est-à-dire fixant plus de 10% de la radioactivité totale ajoutée) sont ceux qui contiennent des anticorps de sourie spécifiques de l'haptène (H), donc ceux qui contiennent tes clones O nyiifiwVim Sp0C9KfU08.

{0062] Parmi les hybridomes positifs (c'est-à-dire produisant des anticorps monodonaux qui reconnaissent le traceur) obtenus, ceux reconnaissant à la fols la 25-hydroxyvitamine Da at ia 25-hydroxyvitamine Ds sont sélectionnés par un test d’inhibition de la fixation dudit traceur. Ce test consiste à incuber te surnageant de culture (par exemple 100 μ!) de l’hybridome (en botte de Pétri) avec le traceur (marqué à l'iode 126) et en présence de 25-hydroxyvitamine 02 ou de 25-hydroxyvitamine Os. la mélange est incubé à température ambiante pendant 18h. U 25-hydroxyvitamine O2 utilisée est fournie par 8igma sous la référance H17937, tandis que la 25-hydroxyvitamine O3 est fournis par Sigma sous la référence H4014. Les tests de reconnaissance sont effectués avec des solutions de 25-hydroxyvitamine O? et de 25-hydroxyvitamine D3 ayant dee concentrations de 1000 ngfati. Le traceur est en solution dans un mélange volume/volume : 25% eau/25% éthanoi/50% tampon phosphate 0.1M pH 7,4 CP (caséine peptone: Organotechnie référence: 19516) 10gfl. La réaction est arrêtée par tinmunopiécîpitation en ajoutant du SAC CEL (suspension de cellulose contenant das anticorps anti-souris: IOS référence: AASAC4) au milieu d’incubation.

^)063} Le tableau 1 représente tes résultats ds reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine O2 et de ta 25-hydroxyvitamine Ds pour des clones sélectionnés suite aux tests ds présélection des hybridomes produisant des anticorps monodonaux spécifiques de fhaptène (H).

Tableau 1 {0064} U première colonne représente tes numéros des dones testés, qui correspondent aux hybridomes déposés comme décrit ci-dessus. La seconde colonne correspond au pourcentage de fixation dudit traceur À l'anticorps produit par le clone correspondant, en absence de 25-hydroxyvitamine (¼ et de 25-hydroxyvitamine O3. La troisième colonne correspond au pourcentage da fixation dutte traceur à l'anticorps produit par le clone correspondant en présence de 25-hydroxyvitamine Ds d une concentration en solution de ipgftnl. La quatrième colonne correspond au pourcentage d'inhibition de l'anticorps correspondant en présence de 25-hydroxyvitamine O2 è une concentration de 1 pg/hé. Ce pourcentage est calculé an déduisant de 100% le rapport, multiplié par 100. entre le pourcentage de fixation en présence de 25-hydroxyvitamine Da è 1000 ngfonl et le pourcentage de fixation sans 25-hydroxyvitamine Oa. U cinquième colonne correspond au pourcentage de fixation dudit traceur à l'anticorps produit par te clone correspondant en présence de 25-hydroxyvitamine D3 è une concentration en solution de 1 pjÿml. La sixième colonne correspond au pourcentage d’inhibition è rantteotps correspondant en présence de 25-hydroxyvitamine Ds à une concentration de 1 pg/mi. Ce pourcentage est calculé en dédièrent de 100% le rapport, multiplié par 100, entre le pourcentage de fixation en présence de 25-hydroxyvitamine O3 è 1 pg/m! et le pourcentage de fixation sans 25-hydroxyvitamine Os.

[0055] Lorsque les concentrations en 25-hydroxyvHarmns Da et en 25* hydroxyvitamine Ds est de Tordre de 1 pg/ml, le pourcentage d’inhâxtîon de f anticorps monoclonal produit par le clone LMBP7012CB peut être supérieur è 80% vis-à-vis de la 25-hydroxyvitamme Ds et de la 25-hydroxyvitamine D3.

Exempte da te gs-hvdroxwitflmina P» a!date 2S4wdfOXwtomlMDa {00β9) Un test «te reconnaiesaftce simultanée de ta 25-hydroxyvitamine Oa et 25-hydroxyvitamine O3 a été effectué en tubes costés. L’antteorpe monoclonal a été ancré sur des tubes secs (coattag direct) à une concentration de O.Sug/rnl. l’amicoipe misé a été produit par rhybridome IMBP 7013CB. Par ta suite, 300 μΙ de tampon d'incubation (phosphate 50mM pK7.4 Caseine peptone 2g/l d'azotuie de sodium 0.69/1) et 100 μΙ de 25-hydroxyvitamine Os et 25-hydroxyvitamine O3 ont été ^utés aux tubes. Us solutions sont analysées après deux heures a température ambiante

Tableau 2 '1 ; > , ;

Us colonnes notées «O3» et «Os» dans ta tableau 2, correspondent respectivement eux ooncentrattana, exprimées en ng/mi., de 25-hydroxyvitamine Os et de 25-hydroxyvitamine Os utëtoéee pour ta test ds reconnaisscmce. Par exempta, lorsque tes concentrations en 25-hydroxyvitamine Osât 25-hydroxyvitamine Os étaient chacune de 50 ng/rmtpius de 99 ng/mi de 25-hydroxyvitamine Os et 25-hydroxyvitamine O3 ont été détectée, oe qui constitue un résultat peritauôèfement lemerquebta, {0057} Des testa identiques ont été effectués avec fantfcorps monoclonal produit par l’hybridome LMBP 7012C8. Ainsi, ioisque tes concentrations en 25-hydroxyvitamine Os eten 25-hydroxyvitamine O3 étaient de 1,5 ng/hil chacune, ta pourcentage de reconnaissance était de 86%. Oe même, lorsque (es concentrations en 25-hydroxyvitamine Os et en 25-hydroxyvitamine Oa étaient de 5 ng/toL. chacune, ta pourcentage de recormaiesence était de 77%. D'exceftente résuitats ont été également obtenue pour d’autres concentrations. Oes tasta ont égatamsnt été effectués avec tas hybridomes IMBP 7204CB et tMBP 7206C8. Pour une concentration en 25-hydroxyvitamine Dz et en 25-hydroxyvitamine Os de 1,5 ng/mi. chacune, ta pourcentage de reconnaissance était do 104% avec l’anticorps monodona! isou do rhybridome LMBP 7204CB. Pour une concentration en 25-hydroxyvitamine 02 do 5 ngtonl et une concentration en 25-hydroxyvitamine O3 de 50 ng/mt, te pourcentage de reconnaieeance était de 100% avec fanticorpe monodona! iseu de fhybridome LMBP 7205CB. Ces deux dones montrent une excellente reconnaissance de ta vitamine O2. Lee testa effectués avec l’anticorps monodona) produit par l’hybridome LMBP 7011 CB donnent également de bons résultats.

(0080] Dans te sérum humain d'un patient al après un prétraitement permettant de libérer ta 25-hydroxyvitamin Cfe et la 25-hydroxyvitamine 03, la reconnaissance simultanée de 25-hydroxyvitamin 02 et ta 25*hydroxyvitamine O3 êta» conduite sur das tubes codés où Tanticorps était ancré sur des tubes secs (ooating indited) à une concentration de 25 ng/ml. Dans ta tableau 3, t’antioorpe monodonat utilisé était produit par l’hybridome LMBP 7013CB. Dana le tableau 4, fanticorpe monodonat utBaé était produit par l’hybridome LMBP 7012CB. Une méthode de référence par LC/MS a été utilisée pour valider les concentrations trouvées dans n serum numarn.

Table 3

Table 4

Du sênim de rat et de sourie a également été utftsé suivant te même protocole, un resuaws stmxatres ont ete omenus.

rihtentinn «ft« artimipa monoclonal (0088] Après la sÄection d’un done d'intérêt, les cellules sont congelées darm l’azote fluide pour une conservation è long terme. U production tfun anticorps monodonal se fait par un système de culture in vfiro des cellules d'hybridome par exemple: en spinner flash (Wheaton Magna-Flex® Microcarrier Spinner Rashs), soit en CELUNE (integra Bioscience) ou toute autre méthode de culture m vitro adaptée aux cetiuies d’hybridomes. Alternativement, les anticorps peuvent être produits par une méthode in vivo, telle que ta méthode des ascites, là où la législation le permet.

Æy£LSffî^ç<>rra· anal {0070| Le surnageant de culture issu du système de culture in vitro des cellules d’hybridome est purifié par chromatographie <falfinité sur colonne classique de Protéine A et/ou Protéine G (GE Heethcare), sur un support STREAMUNE Protein A (GE Healthcare).

PfWsafoteflfiflQgste (0071) Les dispositifs de diagnostic selon l’invention, également appelée dispositif (fimmunoaeeaye peuvent être un dispositif « enzyme imtmmoasaays » (ElA) ou un dispositif « enzymeJinked immunosorbent asseye» (EUSA), un dispositif d’immunofluorescence (FIA), un dispositif radométrique ou « radioimmunoassays » (RIA), un dispositif « magnetic séparation asseye » (MBA), un dispositif « latéral flow essaya », un dispositif « diffusion imrminoassays », un dispositif d’immunoprécipitation, un dispositif « immunosorbent » ou «antiQen^kmn essays», un dispositif (ftmmuno-agjputination, un dispositif de « chemtiunescence immuno assay (CUA), ou encore un ctispositif utilisant un bkmenseur.

(0073) Différents types de supports peuvent être utiüsés : tubes, plaques de microtitration ou billes. Lee anticorps monoctonaux ou les fragments liante de ceux-ci peuvent être biotinyfôe afin d’augmenter la fixation ou la sensibilité sur les différante supporte.

(0073) L’anticorps monodonat, ou des fragments liante de celui-ci peut être fixé directement sur ie support. On peut également fixer sur le support un anticorps anti-souris et fixer ensuite un anticorps monoclonal ou un fragment liant de celui-ci selon rinvention sur ce premier anticorps. L’anticorps monodonat ou des fragments de celui-ci peut être avantageusement biotinytô.

(0074) De manière alternative, Phaptène peut être fixé sur le support Far ta $uit8i un anticorps monoteonal selon l'Invention est Ajouté) suivi cfun anticorps anti-HRP secondaire. Le cas échéant, Panticorps monoctonai ou fragmenta Hanta de celui-ci peut être teflteé par couplage direct à PHRP (home radish peroxktese) afin de détecter l'immunogène préalablement fixé sur un support. Alternativement, Panticorps monodonal, ou les fragments Hanta de celui-ci, peut être biotinyié. Par ta suite, ta SAv-HRP (streptavidin- horse radish nemxktnset est rUnute»

[0075] Le traceur être couplé à une tyramine marquée à node 12$ pour les testa RIA. K peut également être utilisé après biotinytation ou couplage à PHRP en vue de réaiiser des testa ELISA ou CUA. Le tuminol ou ta tetraméthyibenzidine peuvent être couplée par ta suite à PHRP. loorsi Enfin, tes testa peuvent être réalisés dans des automates ouverts ou fermés.

(0077) Dans tas testa RIA compétitifs une quantité fixa du traceur de formule (II) dar» laquelle n est égal à 0 ; R, R2, R3, R4, R5, R®, Rr, R®, R9, R10, R11, R14, R16 sont un hydrogène; R12 et R13 sont un groupe méthyle ; R1® est un groupement de formule (lll), entre en compétition avec la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine Da présentes dans tes échangeons, tas contrôles ou tas caiibrateurs extraits pour une quantité fixe cPun anticorps spécifique, immobHtaé sur ta surface d’un support en polystyrène. Après une incubation de 2 à 24h è température ambiante ou à 37°C, une phase d'aspiration met fin à ta réaction de compétition. Les tubes sont alors lavés et ta radioactivité est mesurée dans un comoteur flamme.

(0078) Grâce è ta présenta invention, la reconnaissance de ta 25-hydroxyvitamine Os et ta 2$-hydroxyvitamine 02 est simultanée lors de PubHsation de dispositifs de dtagnostic selon Pinvention sur des échantillons contenant de la 25*hydroxyvttamina Ds et de ta 25-hydroxyvftafvûne Da.

(0079) Lea tannes et descriptions utilisés Ici sont proposés à titre d'illustration seulement et ne constituent pas des HnHtabons. L’homme du métief reconnaîtra que de nombreuses variations sont possibles dans resprit et la portée de Pinvention taüe que décrite dar» las revendications qui stevent et leurs équivalents; dans ceites-ci, tous les tannes doivent être compris dans leur acception ta plus large à moins que cela ne soit indiqué autrement

Claims (21)

1. Procédé pour la production d’un hybridome, d’un anticorps monoclonal ou de fragments liants de celui-ci, capable de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 comprenant les étapes suivantes : a) immunisation d’un animal avec un haptène de formule (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester, un amide ou une oxazoline,

dans laquelle n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ; R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un C1-4 alkyle ; R12 et R13 sont un C-m alkyle ; R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d’alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, et un dérivé silylique ; ledit haptène étant rendu immunogène ; b) prélèvement de cellules B produites par l’animal et fusion de celles-ci avec des cellules de myélome pour former l’hybridome ; c) production, à partir de l’hybridome obtenu, d’un anticorps monoclonal, ou de fragments liants de celui-ci, capable de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la reconnaissance, par ledit anticorps monoclonal, de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 est simultanée lorsque les deux antigènes sont dans le même échantillon.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit anticorps monoclonal a un pourcentage de reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 compris entre 70 et 110%.

4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que l’haptène dérivé de la vitamine D est le dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8. R9, R10. R". R14. R'5 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle.

5. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les hybridomes sont choisis dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP et ayant pour numéros de dépôt LMBP 7011 CB, LMBP 7012CB, LMBP 7013CB, LMBP 7204CB et LMBP 7205CB.

6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce l’haptène est rendu immunogène par couplage entre l’haptène et une protéine carrier, ledit couplage s’effectuant via la fonction acide carboxylique dudit haptène.

7. Hybridome apte à permettre la production d’un anticorps monoclonal ou de fragments liants de celui-ci capable de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.

8. Hybridome selon la revendication 7, caractérisé en ce qu’il est sélectionné dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP et ayant pour numéros de dépôt LMBP 7011CB, LMBP 7012CB, LMBP 7013CB, LMBP 7204CB et LMBP 7205CB.

9. Anticorps monoclonal ou fragments liants de celui-ci capable de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.

10. Anticorps monoclonal selon la revendication 9, caractérisé en ce que la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 est simultanée lorsque les deux antigènes sont dans le même échantillon.

11. Anticorps monoclonal selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu’il présente un pourcentage de reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 compris entre 70 et 110%.

12. Anticorps monoclonal selon l’une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu’il est produit à partir d’un hybridome sélectionné dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP et ayant pour numéros de dépôt LMBP 7011 CB, LMBP 7012CB, LMBP 7013CB, LMBP 7204CB et LMBP 7205CB.

13. Utilisation d’un haptène consistant en un composé de formule (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester, un amide ou une oxazoline,

dans laquelle n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ; R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un C1-4 alkyle ; R12 et R13 sont un C-μ alkyle ; R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d’alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique ; ledit haptène étant rendu immunogène ; pour la production d’un hybridome, et d’un anticorps monoclonal, ou de fragments liants ou recombinants de celui-ci, capable de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.

14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit haptène est rendu immunogène par le couplage entre l’haptène et une protéine carrier, ledit couplage s’effectuant via la fonction acide carboxylique dudit haptène.

15. Utilisation selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce ledit haptène de formule (I) est le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle.

16. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que ledit anticorps monoclonal, ou les fragments liants de celui-ci, produit est un anticorps monoclonal selon les revendications 9 à 12.

17. Utilisation d’un haptène consistant en un composé de formule (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester, un amide ou une oxazoline,

dans laquelle n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ; R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un C-m alkyle ; R12 et R13 sont un C-m alkyle ; R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d’alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique ; ledit haptène étant rendu immunogène ; dans la fabrication d’un dispositif de diagnostic susceptible de permettre la reconnaissance et/ou la mesure de la quantité de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 dans un échantillon à tester, ledit dispositif comprenant en outre un anticorps monoclonal selon l’une quelconque des revendication 9 à 12.

18. Dispositif de diagnostic capable de permettre la reconnaissance et/ou la mesure de la quantité de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 dans un échantillon à tester caractérisé en ce qu’il comprend un anticorps monoclonal selon l’une quelconque des revendications 9 à 12.

19. Dispositif de diagnostic selon la revendication 18 caractérisé en ce qu’il comprend également un échantillon du traceur de formule (II),

dans laquelle n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ; R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un C-m alkyle ; R12 et R13 sont un C1-4 alkyle ; R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d’alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique ; R16 est la protéine HRP (horseradish peroxidase), la protéine phosphatase alkaline, la protéine POD (peroxidase) ou un groupement de formule (III) ou (IV), histamine marquée 1251, histidine marquée 1251, tyrosine marquée 1251, méthyle tyrosinate marquée 1251, un groupement fluorescent, un groupement chemiluminescent ou un groupement de formule (V) dans laquelle Z est un bras coupleur et W est un groupement fonctionnel capable de se lier avec un groupement carbonyl.

20. Dispositif de diagnostic suivant la revendication 18 ou 19, caractérisé en ce qu’il est choisi dans le groupe consistant en « enzyme immunoassays » (EIA), « enzyme-linked immunosorbent assays » (ELISA), un dispositif d’immunofluorescence (FIA), un dispositif « radioimmunoassays » (RIA), un dispositif « magnetic séparation assays » (MSA), un dispositif « lateral flow assays », un dispositif « diffusion immunoassays », un dispositif d’immunoprécipitation, un dispositif « immunosorbent » ou « antigen-down assays», un dispositif d’immuno-agglutination, un dispositif de « chemilunescence immuno assay (CLIA), ou un dispositif utilisant un biosenseur.

21. Utilisation d’un haptène, rendu immunogénique, de formule générale (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester, un amide ou oxazoline,

dans laquelle n est un entier compris entre 0 et 3; R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendament un hydrogène ou un Ci-4alkyle, R12 et R13 sont un C-m alkyle; R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d’alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle group, et un dérivé silylique; pour la production d’un hybridome.