WO2011050833A1 - Procédé de production d'hybridomes et d'anticorps monoclonaux susceptibles de reconnaître des métabolites de la vitamine d - Google Patents

Procédé de production d'hybridomes et d'anticorps monoclonaux susceptibles de reconnaître des métabolites de la vitamine d Download PDF

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WO2011050833A1
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WO
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hydroxyvitamin
hapten
monoclonal antibodies
alkyl
lmbp
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PCT/EP2009/064148
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Michel Anciaux
Fabienne Mathieu
Frédéric Lin
Martin Poncelet
Original Assignee
Diasource Immunoassays S.A.
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Publication date
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Priority to EP10189130.7A priority patent/EP2316854B1/fr
Priority to PCT/EP2010/066271 priority patent/WO2011051348A1/fr
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Priority to JP2010240510A priority patent/JP2011136978A/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors

Definitions

  • the invention relates to a method for the production of hybridomas and monoclonal antibodies. More particularly, the invention relates to a method for producing hybridomas and monoclonal antibodies, or binding fragments thereof, capable of recognizing vitamin D metabolites such as 25-hydroxyvitamin D 2 and with 25-hydroxyvitamin D 3 . Description of the state of the art
  • Vitamin D is the generic term for vitamin D 2 or ergocalciferol and vita mine D 3 or cholecalciferol. Man naturally produces vitamin D 3 under the action of ultraviolet rays of the sun on the skin. Vitamin D 3 is transferred to the liver where it is metabolized to 25-hydroxyvitamin D 3 , which is the major form of vitamin D circulating in the body. Since the nineteenth century, vitamin D 2 has been supplied orally in food form (eg in cod liver oil) to supplement a lack of vitamin D 3 for example in people who have low exposure to vitamin D2. Sun. Oral vitamin D 2 has become more important in recent centuries. Indeed, it is now known that the role of vitamin D in the body is crucial in terms of calcium fixation and bone mineralization.
  • 25-hydroxyvitamin D and more particularly 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 are the vitamin D forms stored in the most abundant form in the body. These two precursors can be converted by the kidneys to form 1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin D, which is the biologically active form.
  • a method for producing polydonal antibodies against 25-hydroxyvitamin D which comprises the steps of immunizing an animal with a conjugate that contains 25-hydroxyvitamin D 3 or 25-hydroxyvitamin D 2 as a hapten, isolate serum or plasma from this animal and purify the antibodies contained in the serum or plasma by immunosorption on a complementary matrix, which comprises 25-hydroxyvitamin D 2 when the hapten is 25 -hydroxyvitamin D 3 or which comprises 25-hydroxyvitamin D 3 when the hapten is 25-hydroxyvitamin D 2 .
  • EAH-Sepharose was used as the preferred material for the immunosorption matrix.
  • a first disadvantage with this method is that the antibodies are polydonal, i.e., it is necessary to perform new immunizations of an animal to produce them.
  • Another disadvantage is that, although the method makes it possible to determine both 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 , it is in fact necessary to make two test batteries in order to obtain the dosage of the total d they components of 25-hydroxyvitamin D
  • the present invention overcomes all or part of the obstacles of the conventional technique.
  • vitamin D should be understood in the context of the present text as including the forms of vitamin D 2 and vitamin D 3 of formulas (A) and (B). ) following.
  • 25-hydroxyvitamin D indicates vitamin D metabolites which are hydroxylated at the position of formulas (A) and (B), that is, 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 .
  • 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 are particularly relevant forms of vitamin D for diagnosis.
  • 1,25-Dihydroxyvitamin D refers to the active forms of vitamin D (also called D-hormones) which have a hydroxyl group at positions 1 and 25 of formulas (A) and (B).
  • vitamin D More than fifty different metabolites of vitamin D are known to date. Among these are 24,25-dihydroxyvitamin D and 25,26-dihydroxyvitamin D.
  • the metabolites of vitamin D are not as such immunogens.
  • the chemical activation of compounds derived from vitamin D metabolism and their coupling to carrier proteins or corresponding groups is not trivial.
  • it is essential to prepare a conjugate that may contain a vitamin D metabolite or a derivative thereof as a hapten.
  • the metabolite may be 25-hydroxyvitamin D or a derivative thereof.
  • hapten should be understood by one skilled in the art as a substance which in itself is not immunogenic but, by coupling with a carrier protein, is present in a form against which antibodies can be generated.
  • Carrier proteins for the production of hapten conjugates are known to those skilled in the art.
  • Bovine serum albumin BSA
  • ⁇ -galactosidase ⁇ -galactosidase
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • protein carrier refers to a protein that transports a specific substance or group of substances across the cell membrane, into extracellular fluids or into an intracellular compartment.
  • the present invention relates to a process for producing hybridomas, monoclonal antibodies, or binding fragments thereof, capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 comprising the following steps:
  • n is an integer from 0 to 3;
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 14 , R 15 are independently hydrogen or C 1-4 alkyl;
  • R 12 and R 13 are C 1-4 alkyl
  • R is hydrogen or a substituent selected from the group consisting of acyl, benzyl, alkyl, aryl, alkyl ether, dimethoxytrityl, methoxytrityl, tetrahydropyranyl, triphenylmethyl, or a silyl derivative;
  • said hapten being rendered immunogenic
  • hybridomas can not recognize 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 but that it is only the monoclonal antibodies, or the binding fragments thereof, produced by them. hybridomas which are capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 .
  • the hapten of formula (I) may be in the form of a carboxylate salt.
  • Organic or inorganic salts may be suitable. So the salts may be, for example, sodium, potassium or ammonium salts.
  • the hapten of formula (I) may be a derivative in which the carboxylic acid function may be protected to form an ester, an amide or an oxazoline.
  • the ester may be an alkyl ester, a benzyl ester, a silyl ester or an orthoester.
  • C 1-4 alkyl refers to a hydrocarbon radical of formula C m H 2m + i wherein m is an integer between 1 and 4.
  • Ci - 4 alkyl refers to methyl, ethyl, n-propyl, i-propryle, n-butyl, i-butyl, s-butyl, t-butyl.
  • acyl refers to a radical of the formula T 1 C (O) - wherein T 1 is an alkyl or aryl substituent.
  • benzyl refers to a radical of formula T 2 CH 2 - wherein T 2 is an aryl group.
  • alkyl ether refers to a radical of formula T 3 OT 4 - wherein T 3 is alkyl, aryl or benzyl and T 4 is a hydrocarbon chain of formula - (CH 2 ) P - in which p is an integer from 1 to 10.
  • the "dimethoxytrityl” serecaraffaric acid bis- (4-methoxyphenyl) phenyl methyl ether.
  • methoxytrityl refers to the 4-methoxyphenyl) diphenylmethyl radical.
  • aryl refers to a polyunsaturated, aromatic hydrocarbon group having one or more fused rings (eg, naphthyl) or covalently bound rings, generally containing from 6 to 10 carbon atoms, wherein least one cycle is aromatic.
  • the cycles can be substituted.
  • Non-limiting examples may be the phenyl, naphthyl, anthracyl, biphenyl group.
  • substituted indicates that one or more hydrogens of the atom indicated in the "substituted” use is replaced with a selection of the indicated group, provided that the valence of the or specified atoms does not exceed the normal valence thereof or thereof, and the substitution results in a chemically stable compound, i.e., a compound strong enough to survive its identification to an acceptable degree of purity from a reaction mixture.
  • Substituents can be selected, in a non of the group consisting of alkyl, aryl, cycloalkyl, halide, hydroxyl, nitro, amido, carboxy, amino, cyano.
  • the term "nitro” refers to the group -NO 2 .
  • the term "cyano" refers to the group -CN.
  • the term “hydroxyl” refers to the -OH group.
  • the term “amido” refers to the group -C (O) -NH-.
  • the term “carboxy” refers to the group -C (O) O-.
  • the term “halide” refers to the radicals chloride, fluoride, bromide, iodide.
  • amino refers to the radical of a substituted or unsubstituted trivalent nitrogen atom.
  • cycloalkyl refers to a cyclic alkyl group comprising all hydrocarbon groups containing one or two rings, including monocyclic or bicyclic groups.
  • the cycloalkyls comprise at least three carbon atoms in the ring, preferably between 3 and 10 carbon atoms and may be optionally substituted.
  • alkyl refers to a hydrocarbon radical of the formula CmH 2m + i wherein m is an integer greater than 1.
  • the alkyl groups of the present invention comprise from 1 to 10 carbon atoms.
  • C 1-10 alkyl refers but is not limited to methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, s-butyl, t-butyl, 1-butyl, pentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, i-pentyl, neo-pentyl, t-pentyl, 1-hexyl, 2-hexyl, 3-hexyl, 1-methyl-1-ethyl-n-pentyl, 1, 1, 2-tri-methyl-n-propyl, 1, 2,2-trimethyl-n-propyl, 3,3-dimethyl-n-butyl, 1-heptyl,
  • tetrahydropyranyl refers to a radical of 2-tetrahydropyran.
  • triphenylmethyl refers to a methyl radical substituted with three aryl groups, preferably phenyl.
  • sil derivative refers to a radical of formula T 5 T 6 T 7 Si- in wherein T 5 , T 6 , T 7 are independently alkyl, aryl, alkoxy or aryloxy.
  • alkoxy refers to a radical of formula -OT 8 wherein T 8 is substituted or unsubstituted alkyl.
  • aryloxy refers to a radical of formula -OT 9 wherein T 9 is substituted or unsubstituted aryl.
  • Said hapten can be rendered immunogenic by covalent coupling with an immunogenic carrier protein, by encapsulation in liposomes, by anchoring in liposomes, by coupling said hapten with a polymer, by induction with a biopolymer, or by coupling with a peptide.
  • immunogenic carrier protein e.g., human serum
  • hapten is a derivative that can be recognized by the immune system (eg antibodies) but does not induce an immune response.
  • said carrier protein may be BSA (bovine serum albumin), ovalbumin, HSA (human serum albumin), THY (thyroglobulin), KLH (keyhole limpet hemocyanin), cBSA (cationic bovine albumin), ⁇ -galactosidase or CCH (Concholepas hemocyanin).
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • THY thyroglobulin
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • cBSA cationic bovine albumin
  • ⁇ -galactosidase or CCH Concholepas hemocyanin
  • said polymer When said hapten is coupled to a polymer, said polymer may be a synthetic polymer, natural or modified natural.
  • the synthetic polymer may be, without limitation, for example poly-L-lysine or agarose.
  • the natural polymer may be, without limitation, dextran.
  • the modified natural polymer may be, without limitation, carboxymethyl cellulose.
  • said hapten can be rendered immunogenic by induction with a biopolymer.
  • the procedure is described in the publication Basai p et al. "Immunogenic Cu 2+ -induced Biopolymer Systems comprising a steroid hormone, protein antigen, and synthetic polyelectrolytes" Hybridoma and Hybridomics, 2002, 21 (1), 45-51, incorporated herein by reference.
  • said hapten may be coupled to a multiple antigenic peptide.
  • Said multiple antigenic peptide may be a polylysine nucleus where are coupled from 2 to 16 copies of a synthetic peptide.
  • said hapten is rendered immunogenic by coupling. covalent with a carrier protein.
  • KLH and BSA may be particularly effective carrier proteins for the method and use of the present invention.
  • the coupling between the hapten and the carrier protein can be carried out via the carboxylic acid function of the hapten.
  • the hapten may be a derivative of formula (I) in which n is equal to 0. More particularly, said hapten may be the derivative of formula (I) in which n is equal to 0 and in which R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 1 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the name of such a hapten according to the IU PAC standard is (2S) -2 - ((7aR, E) -4 - ((Z) -2 - ((S) -5-hydroxy-2) acid.
  • This compound can also be identified as 23,24,25,26,27-pentanor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -trien-3-ol-22-oic acid whose CAS number is 99518-38-4.
  • the hapten may be a derivative of formula (I) in which n is equal to 1. More particularly, said hapten may be the derivative of formula (I) in which n is 1 and in which R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 1 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the name of such a hapten according to the IUPAC standard is the acid (R) -3 - ((1 R, 3aS, 7aR, E) -4 - ((Z) -2 - ((S) -5 hydroxy-2-methylenecyclohexylidene) ethylidene) -7a-methyloctahydro-1H-inden-1-yl) butanoic acid.
  • This compound may also be identified as 24,25,26,27-tetranor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -trien-3 -ol-23-oic acid with CAS number is 76794-34-8.
  • the hapten may be a derivative of formula (I) in which n is equal to 2. More particularly, said hapten may be the derivative of formula (I) in which n is equal to 2 and in which R R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 1 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the name of such a hapten according to the IUPAC standard is the acid (R) -4 - ((1 R, 3aS, 7aR, E) -4 - ((Z) -2 - ((S) -5 hydroxy-2-methylenecyclohexylidene) ethylidene) -7a-methyloctahydro-1H-inden-1-yl) pentanoic acid.
  • This compound can also be identified as 25,26,27-trinor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -trien-3-ol-24-oic acid.
  • the hapten may be a derivative of formula (I) in which n is equal to 3.
  • said hapten may be the derivative of formula (I) in which n is equal to 3 and in which R R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 1 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the name of such a hapten according to the IUPAC standard is the acid (R) -5 - ((1 R, 3aS, 7aR, E) -4 - ((Z) -2 - ((S) -5 hydroxy-2-methylenecyclohexylidene) ethylidene) -7a-methyloctahydro-1H-inden-1-yl) hexanoic acid.
  • This compound can also be identified as 26,27-bisnor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -trien-3 ⁇ -ol-25-oic acid.
  • the hybridomas produced following the fusion of the myelomas with the animal's B cells may be chosen from the group consisting of hybridomas deposited with the BCCM / LMBP BCCM / LMBP® (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - Department of Biomedical Molecular Biology - Ghent, Belgium) on September 21, 2009 and having filed for registration the LMBP 701 1 CB, LMBP 7012CB and LMBP 7013CB.
  • the animal used for the experiments may be a rabbit, a mouse, a hamster, a rat, although other animals may be used.
  • the monoclonal antibodies produced by the present process may show recognition for 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 .
  • the recognition for 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 can be simultaneous.
  • the percentage of recognition towards 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 can be between 70 and 1 10%.
  • the percentage of recognition is the ratio, multiplied by 100, between the total amount of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 recognized by the antibodies according to the invention and the total effective amount of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 present in the sample to be tested.
  • the percentage may be greater than 100%. This is due to the uncertainty of the method for measuring the total amounts of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 . This is a phenomenon well known to those skilled in the art for this type of assay.
  • hybridomas capable of allowing the production of monoclonal antibodies or binding fragments thereof capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 are provided.
  • Hybridomas can be selected from group consisting of hybridomas deposited at BCCM / LMBP (Belgium, Belgium) on September 21st, 2009 and having the following deposit numbers: LMBP 701 1 CB, LMBP 7012CB and LMBP 7013CB.
  • These hybridomas are capable of producing monoclonal antibodies, or binding fragments thereof, capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 .
  • the recognition of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 by said monoclonal antibodies produced by the hybridomas according to the invention may be simultaneous.
  • the monoclonal antibodies, or the binding fragments thereof, produced by the hybridomas according to the invention may have a percentage of recognition towards 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 which may be between 70 and 10%. .
  • monoclonal antibodies or binding fragments thereof are provided. Such monoclonal antibodies or binding fragments thereof are capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 .
  • said monoclonal antibodies or binding fragments thereof can be produced from a hybridoma selected from the group consisting of hybridomas deposited at BCCM / LMBP and having LMBP accession numbers 701 1 CB, LMBP 7012CB and LMBP 7013CB. These hybridomas are capable of producing monoclonal antibodies, or binding fragments thereof, capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 .
  • the recognition by said monoclonal antibodies of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 can be simultaneous.
  • the recognition percentage for 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 can be between 70 and 1 10%.
  • the invention relates to the use of a hapten consisting of a compound of formula (I), or a salt thereof, or a derivative thereof in which the carboxylic acid function is protected to form an ester, an amide or an oxazoline,
  • n is an integer from 0 to 3;
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 14 , R 15 are independently hydrogen or C 1-4 alkyl;
  • R 12 and R 13 are C 1-4 alkyl
  • R is hydrogen or a substituent selected from the group consisting of acyl, benzyl, alkyl, aryl, alkyl ether, dimethoxytrityl, methoxytrityl, tetrahydropyranyl, triphenylmethyl, or a silyl derivative; said hapten being rendered immunogenic;
  • Said hapten may be rendered immunogenic by covalent coupling with an immunogenic carrier protein, by encapsulation in liposomes, by anchoring in liposomes, by coupling said hapten with a polymer, by induction with a biopolymer, or by coupling with a multiple antigenic peptide.
  • said carrier protein may be BSA (bovine serum albumin), ovalbumin, HSA (human serum albumin), THY (thyroglobulin), KLH (keyhole limpet hemocyanin), cBSA (cationic bovine serum albumin), ⁇ -galactosidase or CC H (h emocya ninede) Concholepas).
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • THY thyroglobulin
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • cBSA cationic bovine serum albumin
  • CC H h emocya ninede
  • said polymer When said hapten is coupled to a polymer, said polymer may be a synthetic polymer, natural or modified natural.
  • the synthetic polymer may be, without limitation, for example poly-L-lysine or agarose.
  • the natural polymer may be, without limitation, dextran.
  • the modified natural polymer may be, without limitation, carboxymethyl cellulose.
  • said hapten can be rendered immunogenic by induction with a biopolymer.
  • the procedure is described in the publication Basai p et al. "Immunogenic Cu 2+ -induced Biopolymer Systems comprising a steroid hormone, protein antigen, and synthetic polyelectrolytes" Hybridoma and Hybridomics, 2002, 21 (1), 45-51, incorporated herein by reference.
  • said hapten may be coupled to a multiple antigenic peptide.
  • Said multiple antigenic peptide may be a polylysine nucleus where are coupled from 2 to 16 copies of a synthetic peptide.
  • said hapten is made immunogenic by covalent coupling with a carrier protein.
  • KLH and BSA may be particularly effective carrier proteins for the method and use of the present invention.
  • the coupling between the hapten and the carrier protein can be carried out via the carboxylic acid function of the hapten.
  • the hapten used for the production of monoclonal antibodies capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 may be a compound of formula (I) in which n is 0. More particularly said hapten may be (2S) -2 - ((7aR, E) - 4 - ((Z) -2 - ((S) -5-hydroxy-2-methylenecyclohexylidene) ethylidene) -7a-methyloctahydro- 1H-inden-1-yl) propanoic acid, that is to say the compound of formula (I) wherein n is 0; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the hapten used for the production of monoclonal antibodies capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 may be the compound of formula (I) in which n is equal to 1. More particularly, the hapten may be (R) -3 - ((1 R, 3aS, 7aR, E) -4 - ((Z) -2 - ((S) -5-hydroxy-2-methylenecyclohexylidene ) ethylidene) -7a-methyloctahydro-1H-inden-1 - yl) butanoic acid, that is to say the compound of formula (I) in which n is equal to 1; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 1 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the hapten used for the production of monoclonal antibodies capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 can be the compound of formula (I) in which n is equal to 2. More particularly, the hapten may be (R) -4 - ((1 R, 3aS, 7aR, E) -4 - ((Z) -2- ((S) -5-hydroxy-2-methylenecyclohexylidene) ethylidene) -7a- methyloctahydro-1H-inden-1-yl) pentanoic acid, that is to say the compound of formula (I) in which n is equal to 2; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 1 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the hapten used for the production of monoclonal antibodies capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 may be the compound of formula (I) in which n is equal to 3.
  • the hapten may be (R) -5- ((1 R, 3aS, 7aR, E) -4 - ((Z) -2 - ((S) -5-hydroxy-2-methylenecyclohexylidene) ethylidene) - 7 ⁇ -methyloctahydro-1H-inden-1-yl) hexanoic acid, i.e., the compound of formula (I) wherein n is 3; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 1 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • recognition of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 by said monoclonal antibodies, or binding fragments thereof may be simultaneous.
  • the percent recognition of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 , by said monoclonal antibodies or binding moieties thereof may be between 70 and 10%.
  • Said monoclonal antibodies, or the binding fragments thereof, produced are the monoclonal antibodies, or the binding fragments thereof according to the invention.
  • the hapten and the monoclonal antibodies, or the binding fragments thereof, according to the invention can be used in the manufacture of a diagnostic device capable of enabling the recognition and / or measurement of the amount of 25-hydroxyvitamin. D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 in a test sample.
  • the hapten consisting of a compound of general formula (I) as defined above, may be used in the manufacture of a device for diagnostic capable of allowing recognition and / or measurement of the amount of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 in a test sample.
  • recognition of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 can be simultaneous.
  • the percentage of recognition for 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 can be between 70 and 1 10%.
  • a diagnostic device capable of recognizing and / or measuring the amount of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 in a sample to be tested.
  • Said diagnostic device comprises monoclonal antibodies or binding fragments thereof capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 .
  • the monoclonal antibodies or binding fragments thereof of said diagnostic device can be produced according to the present invention from a hybridoma selected from the group consisting of hybridomas deposited at the BCCM / LMBP and having deposit numbers LMBP 701 1 CB, LMBP 7012CB and LMBP 7013CB.
  • the recognition of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 by said monoclonal antibodies or binding fragments thereof can be simultaneous.
  • the recognition percentage for 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 , by the said monoclonal antibodies or binding fragments thereof can be between 70 and 1 10%.
  • Said sample to be tested may be a biological sample.
  • the diagnostic device may also comprise a sample of the compound of formula (I), or a salt thereof, or a derivative thereof in which the carboxylic acid function is protected to form an ester, an amide or an oxazoline,
  • n is an integer between
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 14 , R 15 are independently hydrogen or C 1-4 alkyl;
  • R 12 and R 13 are C 1-4 alkyl
  • R is hydrogen or a substituent selected from the group consisting of acyl, benzyl, alkyl, aryl, alkyl ether, dimethoxytrityl, methoxytrityl, tetrahydropyranyl, triphenylmethyl, or a silyl derivative.
  • the diagnostic device may comprise a sample of the vitamin D derivative of formula (I) in which n is an integer equal to 0; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the diagnostic device may comprise a sample of the vitamin D derivative of formula (I) wherein n is an integer of 1; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the diagnostic device may comprise a sample of the vitamin D derivative of formula (I) wherein n is an integer equal to 2; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 1 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the diagnostic device may comprise a sample of the vitamin D derivative of formula (I) wherein n is an integer equal to 3; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 1 , R 14 , R 15 are independently hydrogen; R 12 and R 13 are independently a methyl group.
  • the diagnostic device may also comprise a means for expressing a signal representative of the presence of 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 in a sample to be tested.
  • Said means of expression of a signal may be the tracer of formula (II),
  • n is an integer from 0 to 3;
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 1 1 , R 14 , R 15 are independently hydrogen or C 1-4 alkyl;
  • R 12 and R 13 are C 1-4 alkyl
  • R is hydrogen or a substituent selected from the group consisting of acyl, benzyl, alkyl, aryl, alkyl ether, dimethoxytrityl, methoxytrityl, tetrahydropyranyl, triphenylmethyl, or silyl derivative;
  • R 16 is the HRP protein (horseradish peroxidase), the alkaline phosphatase protein, the POD protein (peroxidase) or a group of formula (III) or (IV), .
  • HRP protein horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase protein alkaline phosphatase protein
  • POD protein peroxidase
  • R 16 is the HRP protein (horseradish peroxidase), the alkaline phosphatase protein, the POD protein (peroxidase) or a group of formula (III) or (IV), .
  • I 125 refers to a radioisotope of the iodine atom.
  • the group (III) is bonded to the compound of formula (II) by its "amino" NH function.
  • the group (IV) is bonded to the compound (II) by its "amido” function C (O) NH-.
  • said tracer may be of formula (II),
  • n is an integer from 0 to 3;
  • R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 14 , R 15 are hydrogen;
  • R 12 and R 13 are a methyl group;
  • R 16 is a group of formula (III).
  • the diagnostic device may contain a sample of a tracer of formula (II) in which n is equal to 0; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 14 , R 15 are hydrogen; R 12 and R 13 are a methyl group; R 16 is a group of formula (III).
  • said means of expression of a signal is a biosensor coupled to monoclonal antibodies capable of recognizing Ia 2 5-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3.
  • biosensor refers to a physicochemical device capable of detecting a biological sample in a physicochemical, optical, piezoelectric, electrochemical, or electromagnetic manner.
  • the biosensor includes an associated electronic element, or signal processor for processing or displaying the data, and a sensor element detecting physicochemical changes in the form of signals.
  • the hapten used for the immunization of the animal, is a derivative of formula (I) wherein n is an integer equal to 0; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 14 , R 15 are hydrogen; R 12 and R 13 are a methyl group.
  • This hapten will be noted (H) for the rest of the description. It should be understood that the invention is not limited to this embodiment.
  • the hapten may be a derivative of formula (I) wherein n is 1, 2 or 3 with unchanged substituents.
  • monoclonal antibodies can be carried out according to the conventional procedure as described, for example, in Kohler and Milstein, Nature 1975 (256), 495-497 or Eur. J. Immunol. 1976 (6), 51-1-519.
  • myeloid cells are fused with B lymphocyte cells of an immunized animal to obtain hybrid cells, called hybridomas, that produce large amounts of a monoclonal antibody.
  • hybridomas hybrid cells
  • a hapten is coupled to a carrier protein to form an immunogen that will be able to create immunogenicity.
  • the carrier protein thus allows the hapten to obtain an ability to induce an immune reaction.
  • the hapten (H) whose synthesis is known to those skilled in the art, is first coupled with bovine serum albumin (BSA) according to the following protocol.
  • BSA bovine serum albumin
  • an amount of hapten (H) is activated for four hours at room temperature by means of O- (N-Succinimidyl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU-Fluka 85972) solubilized in anhydrous dimethylformamide.
  • the hapten (H) can also be coupled with KLH (Keyhole limpet hemocyanin, Sigma H2133).
  • KLH Keyhole limpet hemocyanin, Sigma H2133.
  • 20,000 to 500,000 equivalents of hapten in solution are added to one equivalent of KLH diluted in carbonate buffer (0.1 M, pH 9.4).
  • the solution is then stirred at room temperature for 18 hours in the dark.
  • the reaction mixture is then dialyzed in NaCl saline (9g / l) for 48h at 4 ° C to obtain the desired immunogen.
  • a fresh saline solution is reintroduced after 24 hours.
  • the female mice (6 weeks) used are provided by the company CREAL.
  • the immunogen (20 g saline) is injected subcutaneously into a mouse in the presence of an adjuvant (50% saline / 50% adjuvant (vol / vol)) which may be Freund's complete adjuvant. (CFA, Difco Laboratories and Ref: 263810) or incomplete Freund's adjuvant (IFA, Difco Laboratories and Ref. 263910).
  • CFA is an oil comprising killed mycobacteria.
  • IFA is the same adjuvant as CFA without mycobacteria.
  • the adjuvant stimulates an immune response of the organism of the year.
  • mice After a few injections of the immunogen (from 3 to 10), the serum of each immunized mouse is tested to monitor the serum level of antibodies specific for the injected antigen. As soon as mice is considered positive (that is, the percentage of binding of the labeled antigen with a radioactive or enzymatic label reaches at least 10% when incubated with mouse serum), it is selected for the cell fusion performed in the month following the serum test.
  • the animal is euthanized (with CO 2 ), its spleen is taken and the immunocompetent cells present in the spleen of the animal are recovered by massaging the spleen with a flat-tipped forceps while slowly infusing it with 10 ml of W / O medium kept at 37 ° C., that is to say DMEM medium Dulbecco mod ified Eagle's Medium (G IBCO 21969) without protein and supplemented with 2% (vol / vol) of the mixture 100x penicillin and streptomycin.
  • the cells thus removed are transferred to a petri dish and then to a sterile 15 ml conical tube which is then centrifuged. The cell pellet will be recovered for fusion with the myeloid cells.
  • the myelomas used for fusions of mouse splenocytes are myelomas NSO (Sigma ref: 851 10503), SP2 / 0-Ag14 (ATCC ref: CRL-1581) or P3X63Ag8.653 (ATCC ref: 1580) .
  • the myeloma is cultured in a medium comprising a base mixture DMEM without protein supplemented with 2% (vol / vol) mixture of 100x penicillin and streptomycin, 2 to 5% (vol / vol) glutamine, 2% (vol / vol) of non-essential amino acids (100x), 2% (vol / vol) sodium pyruvate (100x), 1% (vol / vol) gentamicin.
  • the medium also comprises 10% (vol / vol) fetal calf serum.
  • the culture is centrifuged in sterile 50 ml conical tubes (at 1000 rpm, 10 minutes). The pellets are pooled and centrifuged in a 15 ml tube. In general, 1 ml of myeloma represents between 1 10 6 and 2 10 8 cells.
  • the spleen cells are mixed with myeloma cells to form a hybridoma with a ratio of about 5 to 10 spleen cells per 1 myeloma cell.
  • 4.7 ml of NSO myeloma at 3.4 ⁇ 10 6 cells / ml are mixed with 8 ⁇ 10 7 spleen cells.
  • the mixture of spleen cells with the myeloma cells is centrifuged and the supernatants discarded.
  • the cell pellet thus obtained is slowly (1 minute) suspended in 1 ml of a solution of polyethylene glycol 50%, the temperature is maintained at 37 ° C for this operation.
  • the polyethylene glycol solution is obtained by dissolving 5 g of polyethylene glycol (Merck, ref: 1 .09727.0100) in 5 ml of 0.1 M phosphate buffer at pH 7.4, then adding 5% (vol / vol) of dimethylsulfoxide (Sigma D2650) and sterilizing it by filtration (0.2 ⁇ ).
  • the cell pellet thus resuspended in the PEG solution is diluted at least 10 times, by adding a W / O medium (DMEM without protein supplemented with 2% (vol / vol) of the 100x mixture of penicillin and streptomycin).
  • the tube is centrifuged and the cell pellet is resuspended in HAT medium comprising a base mixture DMEM without protein supplemented with 2% (vol / vol) mixture of 100x penicillin and streptomycin, 2-5% (vol / vol) glutamine, 2% (vol / vol) non-essential amino acids (100x), 2% (vol / vol) sodium pyruvate (100x), 1% (vol / vol) gentamicin, 10% (vol / vol) fetal calf serum, 2% (vol / vol) hypoxanthine thymidine (50x), 2% (vol / vol) aminopterin (50x), and optionally 2% (vol / vol) Nutridoma CS ( Roche ref: 1363 743).
  • the volume of HAT medium added to the cell pellet is such that the spread on the 96-well plates is 5 10 4 to 10 5 cells per well, at a rate of 150 to 200 ⁇ of medium per well.
  • the plates are incubated for 8 to 10 days at 37 ° C and 5% CO2.
  • the identification of the wells of multiwell plates containing hybridoma clones producing antibodies capable of recognizing 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 is carried out by a method RIA (Radio Immuno Assay) in a homogeneous phase, followed by immunoprecipitation.
  • RIA Radio Immuno Assay
  • This method consists in incubating a volume (between 50 and 100 ⁇ ) of the culture medium resulting from the multiwell plates of the fusion, with a tracer of formula (II) in which n is equal to 0; R, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 , R 11 , R 14 , R 15 are hydrogen; R 12 and R 13 are a methyl group; R 16 is a group of formula (III). After an incubation time between 4 and 18 h, the reaction is stopped by add ition of SAC CEL (suspension of cellulose containing anti-mouse antibodies: IDS reference: AASAC4) in the middle.
  • SAC CEL suspension of cellulose containing anti-mouse antibodies
  • the radioactivity of the pellets is measured in a gamma counter.
  • Positive wells i.e., fixing more than 10% of the total radioactivity added are those that contain mouse antibodies specific for the hapten (H), therefore those which contain the specific hybridoma clones.
  • hybridomas positive ie producing monoclonal antibodies which recognize the tracer
  • those recognizing both 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 are selected by an inhibition test. fixing said tracer.
  • This test consists in incubating the culture supernatant (for example 100 ⁇ l) of the hybridoma (in a petri dish) with the tracer (labeled with iodine 125) and in the presence of 25-hydroxyvitamin D2 or 25-hydroxyvitamin D3 . The mixture is incubated at room temperature for 18 hours.
  • the 25-hydroxyvitamin D2 used is provided by Sigma under the reference H17937, while 25-hydroxyvitamin D3 is provided by Sigma under the reference H4014.
  • the recognition assays are performed with solutions of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 having concentrations of 1000 ng / ml.
  • the tracer is in solution in a volume / volume mixture: 25% water / 25% ethanol / 50% 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 CP (casein peptone: Organotechnie reference: 19516) 10 g / l.
  • the reaction is stopped by immunoprecipitation by adding SAC CEL (suspension of cellulose containing anti-mouse antibodies: IDS reference: AASAC4) to the incubation medium.
  • Table 1 shows the recognition results of 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 for selected clones following preselection tests of hybridomas producing monoclonal antibodies specific for the hapten (H).
  • the first column represents the numbers of the clones tested, which correspond to the hybridomas deposited as described above.
  • the second column corresponds to the percentage of attachment of said tracer to the antibodies produced by the corresponding clone, in the absence of 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3.
  • the third column corresponds to the percentage of attachment of said tracer to the antibodies produced by the corresponding clone in the presence of 25-hydroxyvitamin D2 at a solution concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • the fourth column corresponds to the percent inhibition of the corresponding antibodies in the presence of 25-hydroxyvitamin D2 at a concentration of 1 g / ml.
  • This percentage is calculated by deducting from 100% the ratio, multiplied by 100, between the percentage of fixation in the presence of 25-hydroxyvitamin D2 at 1000 ng / ml and the percentage of fixation without 25-hydroxyvitamin D2.
  • the fifth column corresponds to the percentage of attachment of said tracer to the antibodies produced by the corresponding clone in the presence of 25-hydroxyvitamin D3 at a solution concentration of 1 g / ml.
  • the sixth column corresponds to the percentage inhibition of the corresponding antibodies in the presence of 25-hydroxyvitamin D3 at a concentration of 1 g / ml. This percentage is calculated by deducting from 100% the ratio, multiplied by 100, between the percentage of fixation in the presence of 25-hydroxyvitamin D3 at 1 g / ml and the percentage of fixation without 25-hydroxyvitamin D3.
  • the percentage inhibition of monodonal antibodies produced by clone LMBP7012CB can be greater than 80% 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 .
  • a simultaneous recognition test of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 was performed in coated tubes.
  • the antibodies were anchored on dry tubes (direct coating) at a concentration of 0.5 g / ml.
  • the antibodies used were produced by the hybridoma LMBP 7013CB.
  • 300 ⁇ l of incubation buffer 50mM phosphate pH7.4 casein peptone 2g / l sodium azide 0.5g / l
  • 100 ⁇ l of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 were added to the tubes.
  • the solutions are analyzed after two hours at room temperature D3 D2 Total Quantity Percentage of
  • the columns denoted "D3" and “D2" in Table 2 respectively correspond to the concentrations, expressed in ng / ml, of 2-hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D2 used for the recognition test.
  • concentrations of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 were each 50 ng / ml, more than 99 ng / ml of 25-hydroxyvitamin D 2 and 25-hydroxyvitamin D 3 were detected, which constitutes a particularly remarkable result.
  • the cells are frozen in liquid nitrogen for long-term preservation.
  • the antibody is produced by an in vitro hybridoma cell culture system, for example: spinner flask (Wheaton Magna-Flex® Microcarrier Spinner Flasks), or CELLIN (Integra Bioscience) or any other in vitro culture method. vitro adapted to hybridoma cells.
  • antibodies can be produced by an in vivo method, such as the ascites method, where legislation permits.
  • the culture supernatant from the in vitro culture system of the hybridoma cells is purified by conventional column affinity chromatography of Protein A and / or Protein G (GE Heathcare), on a support STREAMLINE Protein A (GE Healthcare).
  • the diagnostic devices according to the invention can treungeber "enzyme immunoassays” (EIA) or an "enzyme-linked immunosorbent assays” (ELISA) device, an immunofluorescence device (FIA) , a radiometric device or “radioimmunoassays” (RIA), a device “magnetic separation assays” (MSA), a device “lateral flow assays”, a device “diffusion immunoassays", an immunoprecipitation device, a device “immunosorbent Or “antigen-down assays", an immunoagglutination device, an immunoassay immunoassay (CLIA), or a device using a biosensor.
  • EIA enzyme immunoassays
  • ELISA immunofluorescence device
  • RIA radiometric device or “radioimmunoassays”
  • MSA magnetic separation assays
  • lateral flow assays a device “diffusion immunoassays”
  • Monoclonal antibodies or binding fragments thereof may be biotinylated to increase binding or sensitivity on different carriers.
  • the monoclonal antibodies, or binding fragments thereof can be attached directly to the support. It is also possible to fix on the support an anti-mouse antibody and then to fix a monoclonal antibody or a binding fragment thereof according to the invention on this first antibody. Monoclonal antibodies or fragments thereof can be advantageously biotinylated.
  • the hapten may be attached to the support.
  • a monoclonal antibody according to the invention is added, followed by a secondary anti-HRP antibody.
  • the monoclonal antibodies or binding fragments thereof can be used by direct coupling to HRP (horse radish peroxidase) to detect the immunogen previously fixed on a carrier.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the monoclonal antibodies, or the binding fragments thereof may be biotinylated.
  • SAv-HRP streptavidin-horse radish peroxidase
  • the tracer can be coupled to a tyramine labeled with iodine 125 for RIA tests. It can also be used after biotinylation or coupling to HRP to perform ELISA or CLIA tests. Luminol or tetramethylbenzidine can be subsequently coupled to HRP.
  • test can be performed in open or closed automata.
  • the recognition of 25-hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D2 is simultaneous with the use of diagnostic devices according to the invention on samples containing 25-hydroxyvitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D2.

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour la production d'hybridomes, d'anticorps monoclonaux ou de fragments liants de ceux-ci susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.

Description

Procédé de production d'hybridomes et d'anticorps monoclonaux susceptibles de reconnaître des métabolites de la vitamine D
Domaine technique
[0001] L'invention concerne un procédé pour la production d'hybridomes et d'anticorps monoclonaux. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un procédé pour la production d'hybridomes et d'anticorps monoclonaux, ou de fragments liants de ceux-ci, susceptibles de reconnaître des métabolites de la vitamine D tels que la 25-hydroxyvitamine D2 et à la 25-hydroxyvitamine D3. Description de l'état de la technique
[0002] La vitamine D est le terme générique pour désigner la vitamine D2 ou ergocalciférol et l a vita m i n e D3 ou cholécalciférol. L'homme produit naturellement de la vitamine D3 sous l'action des rayons ultra-violets du soleil sur la peau. La vitamine D3 est transférée dans le foie où elle est métabolisée en 25-hydroxyvitamine D3, qui est la forme majeure de la vitamine D circulant dans l'organisme. Depuis le dix-neuvième siècle, la vitamine D2 est fournie par voie orale sous forme alimentaire (par exemple dans l'huile de foie de morue) afin de suppléer un manque de vitamine D3 par exemple chez les personnes qui sont peu exposées au soleil. La prise de vitamine D2 par voie orale a pris une importance accrue au cours des derniers siècles. En effet, on sait à présent que le rôle de la vitamine D dans l'organisme est capital en matière de fixation de calcium, et de minéralisation des os. Elle joue un grand rôle dans d ifférentes voies métabol iques. La 25-hydroxyvitamine D, et plus particulièrement la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 sont les formes de vitam i ne D stockées de ma n ière la pl us abonda nte da ns l'organisme. Ces deux précurseurs peuvent être convertis par les reins pour former la 1 a,25-dihydroxyvitamine D, qui est la forme biologiquement active.
[0003] Il est important de pouvoir doser la teneur en vitamine D dans l'organisme. Toutefois, la mesure du niveau de vitamine D proprement dite est de peu d'intérêt, car les concentrations en vitamine D fluctuent fortement en fonction de la prise orale de vitamine D2. Ceci est également vrai pour ce qui concerne les formes physiologiquement actives de la vitam ine D (1 a, 25- dihydroxyvitamine D), qui sont aussi présentes dans l'organisme dans des quantités relativement faibles et hautement fluctuantes par rapport à la 25- hydroxyvitamine D. Pour ces raisons, la quantification de la 25-hydroxyvitamine D (la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3) est un outil apprécié pour analyser globalement la vitamine D chez un individu.
[0004] On connaît différentes méthodes faisant ou non appel à l'immunologie pour déterminer de manière plus ou moins fiable la 25- hydroxyvitamine D. Dans le document WO 2007/039193, Roche Diagnostics GmbH et F . HOFFMAN N-LA ROCHE AG décrivent également diverses méthodes de l'état de l'art. Eux-mêmes divulguent un procédé pour produire des anticorps polydonaux contre la 25-hydroxyvitamine D qui comprend les étapes d'immuniser un animal avec un conjugué qui contient de la 25- hydroxyvitamine D3 ou bien de la 25-hydroxyvitamine D2 en tant qu'haptène, d'isoler du sérum ou du plasma de cet animal et de purifier les anticorps contenus dans le sérum ou le plasma par immunosorption sur une matrice complémentaire, qui comprend de la 25-hydroxyvitamine D2 lorsque l'haptène est de la 25-hydroxyvitamine D3 ou qui comprend de la 25-hydroxyvitamine D3 lorsque l'haptène est de la 25-hydroxyvitamine D2. La EAH-Sepharose a été utilisé comme matière préférée pour la matrice d'immunosorption. Un premier inconvén ient qu i se pose avec cette méthode est que les anticorps sont polydonaux, c'est-à-dire qu'il est nécessa i re d e réal iser de nouvel l es immunisations d'un animal pour en produire. Un autre inconvénient est que si la méthode permet bien de déterminer à la fois la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3, il est en fait nécessaire de réaliser deux batteries de test pou r obten ir le dosage d u total des d eux composants de la 25- hydroxyvitamine D.
Résumé de l'invention
[0005] La présente invention vainc tout ou partie des obstacles de la technique conventionnelle.
[0006] A moins qu'il en soit spécifié autrement, le terme « vitamine D » doit être compris dans le cadre du présent texte comme incluant les formes de la vitamine D2 et la vitamine D3 de formules (A) et (B) suivantes.
Formule (A)
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000004_0002
[0007] Dans les formules (A) et (B), les positions de la vitamine D sont reprises selon la nomenclature des stéroïdes. La 25-hydroxyvitamine D indique des métabolites de la vitamine D qui sont hydroxylés à la position 25 des formules (A) et (B), c'est-à-dire la 25-hydroxyvitamine D2 ainsi que la 25- hydroxyvitamine D3. Comme évoqué ci-dessus, la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 sont des formes particulièrement pertinentes de la vitamine D pour pouvoir établir un diagnostic.
[0008] La 1 ,25-dihydroxyvitamine D se rapporte aux formes actives de la vitamine D (aussi appelées les hormones D) qui ont un groupement hydroxyle aux positions 1 et 25 des formules (A) et (B).
[0009] Plus d'une cinquantaine de métabolites différents de la vitamine D sont à ce jour connus. Parmi ceux-ci figurent la 24,25-dihydroxyvitamine D et la 25,26-dihydroxyvitamine D.
[0010] Les métabolites de la vitamine D ne sont pas en tant que tels des immunogènes. L'activation chimique des composés issus du métabolisme de la vitamine D ainsi que leur couplage à des protéines carrier ou des groupes correspondants n'est pas triviale. Ainsi pour une immunisation réussie, il est essentiel de préparer un conjugué qui peut contenir un métabolite de la vitamine D ou un dérivé de celui-ci comme haptène. Par exemple, le métabolite peut être la 25-hydroxyvitamine D ou un dérivé de celle-ci. Le terme « haptène » doit être compris par une personne de l'art comme une substance qui en soi n'est pas immunogénique mais, par couplage avec une protéine carrier, est présente dans une forme contre laquelle des anticorps peuvent être générés. Des protéines carrier pour la production de conjugués d'haptènes sont connues de l'homme du métier. La sérum albumine bovine (BSA), la β- galactosidase ou l'hémocyanine de patelle (keyhole limpet hemocyanine - KLH) sont couramment utilisés en tant que protéine carrier. Le terme « protéine carrier » se réfère à une protéine qui transporte une substance spécifique ou un groupe de substances à travers la membrane cellulaire, dans des fluides extracellulaires ou dans un compartiment intracellulaire.
[0011] Seule la position 3 des structures telles que représentées dans les formules (A) et (B) convient en principe pour l'activation et le couplage des protéines carrier. En effet, les métabolites de la vitamine D sont réputés se coupler via la position 3 (cf WO 2007/039194 ; Kobayashi et al. "Production and specificity of antisera raised against 25-hydroxyvitamin D3-[C-3]-bovine sérum albumin conjugates", Steroids 1992, 57(10), 488-493).
[0012] Selon un premier aspect, la présente invention se rapporte à un procédé de production d'hybridomes, d'anticorps monoclonaux, o u d e fragments liants de ceux-ci, susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 comprenant les étapes suivantes :
a) immunisation d'un animal avec un haptène de formule (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester, une amide ou une oxazoline,
Figure imgf000006_0001
dans laquelle
n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ;
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Ci-4 alkyle ;
R12 et R13 sont un Ci-4 alkyle ;
R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d'alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique;
ledit haptène étant rendu immunogène ;
b) prélèvement de cellules B produites par l'animal et fusion de celles-ci avec des cellules de myélome pour former des hybridomes;
c) production, à partir des hybridomes obtenus, d'anticorps monoclonaux, ou de fragments liants de ceux-ci, susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.
[0013] L'homme du métier comprendra que les hybridomes ne peuvent pas reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 mais que ce sont uniquement les anticorps monoclonaux, ou les fragments liants de ceux-ci, produits par les hybridomes qui sont susceptibles de reconnaître la 25- hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.
[0014] L'haptène de formule (I) peut être sous la forme d'un sel de carboxylate. Des sels organiques ou inorganiques peuvent convenir. Ainsi les sels peuvent être par exemple des sels de sodium, de potassium ou d'ammonium. Alternativement, l'haptène de formule (I) peut être un dérivé dans lequel la fonction acide carboxylique peut être protégée pour former un ester, une amide ou une oxazoline. L'ester peut être un ester d'alkyle, un ester benzylique, un ester silylique ou un orthoester.
[0015] Dans la présente invention, le terme « Ci-4alkyle » se réfère à un radical hydrocarboné de formule CmH2m+i dans laquelle m est un nombre entier compris entre 1 et 4. Par exemple le terme « Ci-4alkyle » se réfère à un radical méthyle, éthyle, n-propyle, i-propryle, n-butyle, i-butyle, s-butyle, t-butyle.
Le terme « acyle » se réfère à un radical de formule T1C(O)- dans laquelle T1 est un substituant alkyle ou aryle.
Le terme « benzyle » se réfère à un radical de formule T2CH2- dans laquelle T2 est un groupement aryle.
Le terme « éther d'alkyle » se réfère à un radical de formule T3OT4- dans laquelle T3 est un alkyle, un aryle ou un benzyle et T4 une chaîne hydrocarboné de formule -(CH2)P- dans laquelle p est un nombre entier compris entre 1 et 10. L e t e r m e « diméthoxytrityl » s e r é f è r e a u r a d i c a l bis-(4- methoxyphenyl)phényl méthyle.
Le terme « méthoxytrityl » se réfère au radical 4- methoxyphenyl)diphenylmethyl.
Le terme « aryle » selon la présente invention se réfère à un groupement hydrocarboné aromatique, polyinsaturé, ayant un ou plusieurs cycles fusionnés (par exemple le naphtyle) ou lié de manière covalente, contenant généralement entre 6 et 10 atomes de carbone, dans lequel au moins un cycle est aromatique. Les cycles peuvent être substitués. Des exemples non limitatifs peuvent être le groupement phényle, naphtyle, anthracyle, biphenyl.
Le terme « substitué » tel qu'utilisé dans la présente invention indique qu'un ou plusieurs hydrogènes de l'atome ind iqué dans l'expression util isant « substitué » est remplacé avec une sélection du groupe indiqué, à condition que la valence du ou des atomes indiqué(s) n'excède pas la valence normale de celui-ci ou de ceux-ci, et que la substitution résulte en un composé stable chimiquement, c'est-à-dire un composé suffisamment robuste pour survivre à son identification à un degré de pureté acceptable à partir d'un mélange réactionnel . Les substituants peuvent être sélectionnés, de man ière non limitative, parmi le groupe consistant en un groupement alkyle, aryle, cycloalkyle, halogénure, hydroxyl, nitro, amido, carboxy, amino, cyano. Dans la présente invention, le terme « nitro » se réfère au groupe -NO2. Dans la présente invention, le terme « cyano » se réfère au groupe -CN. Dans la présente invention, le terme « hydroxyl » se réfère au groupe -OH. Dans la présente invention, le terme « amido » se réfère au groupe -C(0)-NH-. Dans la présente invention, le terme « carboxy » se réfère au groupe -C(0)0-. Dans la présente invention, le terme « halogénure » se réfère au rad ical chlorure, fluorure, bromure, iodure. Dans la présente invention, le terme « amino » se réfère au radical d'un atome d'azote trivalent substitué ou non. Dans la présente invention, le terme « cycloalkyle » se réfère à un groupement alkyle cyclique comprenant tous les groupements hydrocarbonés contenant un ou deux cycles, y compris des groupements monocycliques ou bicycliques. Les cycloalkyles comprennent au moins trois atomes de carbone dans le cycle, préférentiel lement entre 3 et 1 0 atomes de carbone et peuvent être optionnellement substitués.
Le terme « alkyle » se réfère à un radical hydrocarboné de formule CmH2m+i dans laquel le m est un nombre entier supérieur à 1 . Généralement, les groupements alkyles de la présente invention comprennent entre 1 et 10 atomes de carbone. Par exemple, le terme « Ci-ioalkyle » se réfère mais ne se limite pas à un radical méthyle, éthyle, n-propyle, i-propyle, n-butyle, i-butyle, s- butyle, t-butyle, 1 -pentyle, 2-pentyle, 3-pentyle, i-pentyle, neo-pentyle, t- pentyle, 1 -hexyle, 2-hexyle, 3-hexyle, 1 -methyl-1 -ethyl-n-pentyle, 1 ,1 ,2-tri- methyl-n-propyle, 1 ,2,2-trimethyl-npropyle, 3,3-dimethyl-n-butyle, 1 -heptyle, 2- heptyle, 1 -ethyl-1 ,2-dimethyl-n-propyle, 1 -ethyl-2,2-dimethyl-n-propyle, 1 -octyle, 3-octyle, 4-methyl-3-n-heptyle, 6-methyl-2-n-heptyle, 2-propyl-1 -n-heptyle, 2,4,4-trimethyl-1 -n-pentyle, 1 -nonyle, 2-nonyle, 2,6-dimethyl-4-n-heptyle, 3- ethyl-2,2-dimethyl-3-n-pentyle, 3,5,5-trimethyl-1 -n-hexyle, 1 -decyle, 2-decyle, 4- decyle, 3,7-dimethyl-1 -n-octyle, 3,7-dimethyl-3-n-octyle. Le groupement alkyle peut être substitué.
Le terme « tétrahydropyranyle » se réfère à un radical du 2-tétrahydropyrane. Le terme « triphénylméthyle » se réfère à un radical méthyle substitué par trois groupements aryles, de préférence phényle.
Le terme « dérivé silylique » se réfère à un radical de formule T5T6T7Si- dans laquelle T5, T6, T7 sont indépendamment un alkyle, un aryle, un alkoxy ou un aryloxy. Dans la présente invention, le terme « alkoxy » se réfère à un radical de formule -OT8 dans laquelle T8 est un alkyle substitué ou non . Dans la présente invention, le terme « aryloxy » se réfère à un radical de formule -OT9 dans laquelle T9 est un aryle substitué ou non.
[0016] Ledit haptène peut être rendu immunogène par couplage covalent avec une protéine carrier immunogénique, par encapsulation dans des liposomes, par ancrage dans des liposomes, par couplage dudit haptène avec un polymère, par induction avec un biopolymère, ou par couplage avec un peptide antigénique multiple. Le terme « immunogène » se réfère à une subtance susceptible de provoquer une réaction immunitaire. Contrairement à l'immunogène, l'haptène est un dérivé pouvant être reconnu par le système immunitaire (par exemple les anticorps) mais qui n'induit pas de réaction immunitaire.
[0017] Lorsque ledit haptène est couplé de manière covalente avec une protéine carrier immunogénique, ladite protéine carrier peut être la BSA (sérum albumine bovine), l'ovalbumine, l'HSA (sérum albumine humaine), la THY (thyroglobuline), la KLH (hémocyanine de patelle), la cBSA (albumine bovine cationique), la β-galactosidase ou la CCH (hémocyanine de Concholepas).
[0018] Lorsque ledit haptène est couplé à un polymère, ledit polymère peut être un polymère synthétique, naturel ou naturel modifié. Ainsi le polymère synthétique peut être, de manière non limitative, par exemple la poly-L-lysine ou l'agarose. Alternativement, le polymère naturel peut être, de manière non limitative, le dextran. Alternativement, le polymère naturel modifié peut être, de manière non limitative, le carboxyméthyl cellulose.
[0019] Alternativement, ledit haptène peut être rendu immunogène par induction avec un biopolymère. La procédure est décrite dans la publication Basai p et al. « Immunogenic Cu2+-induced Biopolymer Systems comprising a steroïd hormone, protein antigen, and synthetic polyelectrolytes » Hybridoma and Hybridomics, 2002, 21 (1 ), 45-51 , incorporée ici en référence.
[0020] Alternativement, ledit haptène peut être couplé à un peptide antigénique multiple. Ledit peptide antigénique multiple peut être un noyau de polylysine où sont couplés de 2 à 16 copies d'un peptide synthétique.
[0021] De préférence, ledit haptène est rendu immunogène par couplage covalent avec une protéine carrier. La KLH et la BSA peuvent être des protéines carrier particulièrement efficaces pour le procédé et l'utilisation de la présente invention. Le couplage entre l'haptène et la protéine carrier peut s'effectuer via la fonction acide carboxylique de l'haptène.
[0022] De préférence, l'haptène peut être un dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0. Plus particulièrement, ledit haptène peut être le dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0 et dans laquelle R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Ainsi, le nom d'un tel haptène selon la norme I U PAC est l'acide (2S)-2-((7aR,E)-4-((Z)-2-((S)-5-hydroxy-2- methylenecyclohexylidene)ethylidene)-7a-methyloctahydro-1 H-inden-1 - yl)propanoïque. Ce composé peut également être identifié sous le nom d'acide 23,24,25,26,27-pentanor-9,10-secocholesta-5,7,10(19)-trien-3 -ol-22-oïque dont le numéro CAS est 99518-38-4.
[0023] Alternativement, l'haptène peut être un dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 1 . Plus particulièrement, ledit haptène peut être le dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 1 et dans laquelle R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Ainsi, le nom d'un tel haptène selon la norme IUPAC est l'acide (R)-3-((1 R,3aS,7aR,E)-4-((Z)-2-((S)-5- hydroxy-2-methylenecyclohexylidene)ethylidene)-7a-methyloctahydro-1 H- inden-1 -yl)butanoïque. Ce composé peut également être identifié sous le nom d'acide 24,25,26,27-tetranor-9,10-secocholesta-5,7,10(19)-trien-3 -ol-23-oïque dont le numéro CAS est 76794-34-8.
[0024] Alternativement, l'haptène peut être un dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 2. Plus particulièrement, ledit haptène peut être le dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 2 et dans laquelle R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Ainsi, le nom d'un tel haptène selon la norme IUPAC est l'acide (R)-4-((1 R,3aS,7aR,E)-4-((Z)-2-((S)-5- hydroxy-2-methylenecyclohexylidene)ethylidene)-7a-methyloctahydro-1 H- inden-1 -yl)pentanoïque. Ce composé peut également être identifié sous le nom d'acide 25,26,27-trinor-9,10-secocholesta-5,7,10(19)-trien-3 -ol-24-oïque. [0025] Alternativement, l'haptène peut être un dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 3. Plus particulièrement, ledit haptène peut être le dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 3 et dans laquelle R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Ainsi, le nom d'un tel haptène selon la norme IUPAC est l'acide (R)-5-((1 R,3aS,7aR,E)-4-((Z)-2-((S)-5- hydroxy-2-methylenecyclohexylidene)ethylidene)-7a-methyloctahydro-1 H- inden-1 -yl)hexanoïque. Ce composé peut également être identifié sous le nom d'acide 26,27-bisnor-9,10-secocholesta-5,7,10(19)-trien-3p-ol-25-oïque.
[0026] De préférence, les hybridomes produ its suite à la fusion des myélomes avec les cellules B de l'animal peuvent être choisis dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP BCCM/LMBP® (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - Department of Biomédical Molecular Biology - Gand, Belgique) le 21 septembre 2009 et ayant pour nu méros de dépôt LMBP 701 1 CB, LMBP 7012CB et LMBP 7013CB. L'animal utilisé pour les expériences peut être un lapin, une souris, un hamster, un rat, bien que d'autres animaux puissent être utilisés.
[0027] Les anticorps monoclonaux produits par le présent procédé peuvent présenter une reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3. La reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 peut être simultanée. Ainsi le pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 peut être compris entre 70 et 1 10%. Le pourcentage de reconnaissance est le rapport, multiplié par 100, entre la quantité totale de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 reconnue par les anticorps selon l'invention et la quantité totale effective de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 présente dans l'échantillon à tester. Le pourcentage peut être supérieur à 100%. Ceci est dû à l'incertitude liée à la méthode de mesure des quantités totale de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3. Ceci est un phénomène bien connu de l'homme du métier pour ce type de dosage.
[0028] Selon un second aspect de l'invention, des hybridomes aptes à permettre la production d'anticorps monoclonaux ou de fragments liants de ceux-ci susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et l a 25- hydroxyvitamine D3 sont fournis. Les hybridomes peuvent être choisis dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - Department of Biomédical Molecular Biology - Gand, Belgique) le 21 septembre 2009 et ayant pour numéros de dépôt LMBP 701 1 CB, LMBP 7012CB et LMBP 7013CB. Ces hybridomes sont susceptibles de produire des anticorps monoclonaux, ou des fragments liants de ceux-ci, susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3. La reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 par lesdits anticorps monoclonaux, produits par les hybridomes selon l'invention, peut être simultanée. Les anticorps monoclonaux, ou les fragments liants de ceux-ci, produits par les hybridomes selon l'invention peuvent présenter un pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 pouvant être compris entre 70 et 1 10%.
[0029] Selon un troisième aspect de l ' invention , des anticorps monoclonaux ou des fragments liants de ceux-ci sont fournis. Lesdits anticorps monoclonaux ou des fragments liants de ceux-ci sont susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3. D e préférence, lesdits anticorps monoclonaux ou des fragments liants de ceux-ci peuvent être produits à partir d'un hybridome choisi dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP et ayant pour numéros de dépôt LMBP 701 1 CB, LMBP 7012CB et LMBP 7013CB. Ces hybridomes sont susceptibles de produire des anticorps monoclonaux, ou des fragments liants de ceux-ci, susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25- hydroxyvitamine D3.
[0030] La reconnaissance, par lesdits anticorps monoclonaux, de la 25- hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 peut être simultanée. De plus, le pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 peut être compris entre 70 et 1 10%.
[0031] Selon un quatrième aspect de l'invention, l'invention concerne l'utilisation d'un haptène consistant en un composé de formule (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester, une amide ou une oxazoline,
Figure imgf000013_0001
dans laquelle
n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ;
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Ci-4 alkyle ;
R12 et R13 sont un Ci-4 alkyle ;
R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d'alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique ; ledit haptène étant rendu immunogène ;
pour la production d'hybridomes, d'anticorps monoclonaux ou de fragments liants de ceux-ci susceptibles de reconnaître la 25- hydroxyvitamine D2 et la 25- hydroxyvitamine D3.
[0032] Ledit haptène peut être rendu immunogène par couplage covalent avec une protéine carrier immunogén ique, par encapsulation dans des liposomes, par ancrage dans des liposomes, par couplage dudit haptène avec un polymère, par induction avec un biopolymère, ou par couplage avec un peptide antigénique multiple.
[0033] Lorsque ledit haptène est couplé de manière covalente avec une protéine carrier immunogénique, ladite protéine carrier peut être la BSA (sérum albumine bovine), l'ovalbumine, l'HSA (sérum albumine humaine), la THY (thyroglobuline), la KLH (hémocyanine de patelle), la cBSA (sérum albumine bovine cationique), la β-galactosidase ou l a CC H (h émocya n i n e d e Concholepas).
[0034] Lorsque ledit haptène est couplé à un polymère, ledit polymère peut être un polymère synthétique, naturel ou naturel modifié. Ainsi le polymère synthétique peut être, de manière non limitative, par exemple la poly-L-lysine ou l'agarose. Alternativement, le polymère naturel peut être, de manière non limitative, le dextran. Alternativement, le polymère naturel modifié peut être, de manière non limitative, le carboxyméthyl cellulose.
[0035] Alternativement, ledit haptène peut être rendu immunogène par induction avec un biopolymère. La procédure est décrite dans la publication Basai p et al. « Immunogenic Cu2+-induced Biopolymer Systems comprising a steroïd hormone, protein antigen, and synthetic polyelectrolytes » Hybridoma and Hybridomics, 2002, 21 (1 ), 45-51 , incorporée ici en référence.
[0036] Alternativement, ledit haptène peut être couplé à un peptide antigénique multiple. Ledit peptide antigénique multiple peut être un noyau de polylysine où sont couplés de 2 à 16 copies d'un peptide synthétique.
[0037] De préférence, ledit haptène est rendu immunogène par couplage covalent avec une protéine carrier. La KLH et la BSA peuvent être des protéines carrier particulièrement efficaces pour le procédé et l'utilisation de la présente invention. Le couplage entre l'haptène et la protéine carrier peut s'effectuer via la fonction acide carboxylique de l'haptène.
[0038] De préférence, l'haptène utilisé pour la production d'anticorps monoclonaux susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25- hydroxyvitamine D3 peut être un composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0. Plus particulièrement, ledit haptène peut être l'acide (2S)-2-((7aR,E)- 4-((Z)-2-((S)-5-hydroxy-2-methylenecyclohexylidene)ethylidene)-7a- methyloctahydro-1 H-inden-1 -yl)propanoïque, c'est-à-dire le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Alternativement, l'haptène utilisé pour la production d'anticorps monoclonaux susceptibles de reconnaître la 25- hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 peut être le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 1 . Plus particulièrement, l'haptène peut être l'acide (R)-3-((1 R,3aS,7aR,E)-4-((Z)-2-((S)-5-hydroxy-2- methylenecyclohexylidene)ethylidene)-7a-methyloctahydro-1 H-inden-1 - yl)butanoïque, c'est-à-dire le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 1 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Alternativement, l'haptène utilisé pour la production d'anticorps monoclonaux susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 peut être le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 2. Plus particulièrement, l'haptène peut être l'acide (R)-4-((1 R,3aS,7aR,E)-4-((Z)-2- ((S)-5-hydroxy-2-methylenecyclohexylidene)ethylidene)-7a-methyloctahydro- 1 H-inden-1 -yl)pentanoïque, c'est-à-dire le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 2 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Alternativement, l'haptène utilisé pour la production d'anticorps monoclonaux susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 peut être le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 3. Pl us particul ièrement, l'haptène peut être l'acide (R)-5- ((1 R,3aS,7aR,E)-4-((Z)-2-((S)-5-hydroxy-2- methylenecyclohexylidene)ethylidene)-7a-methyloctahydro-1 H-inden-1 - yl)hexanoïque, c'est-à-dire le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 3 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle.
[0039] Ainsi la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25- hydroxyvitamine D3 par lesdits anticorps monoclonaux, ou les fragments liants de ceux-ci, peut être simultanée. De plus, le pourcentage de reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3, par lesdits anticorps monoclonaux ou les fragment liants de ceux-ci, peut être compris entre 70 et 1 10%. Lesdits anticorps monoclonaux, ou les fragment liants de ceux-ci, produits sont les anticorps monoclonaux, ou les fragments liants de ceux-ci selon l'invention. L'haptène et les anticorps monoclonaux, ou les fragments liants de ceux-ci, selon l'invention peuvent être utilisés dans la fabrication d'un dispositif de diagnostic susceptible de permettre la reconnaissance et/ou la mesure de la quantité de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 dans un échantillon à tester.
[0040] L'haptène consistant en un composé de formule générale (I) telle que définie ci-dessus, peut être utilisé dans la fabrication d'un dispositif de diagnostic susceptible de permettre la reconnaissance et/ou la mesure de la quantité de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 dans un échantillon à tester. Dans ce cas, la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 peut être simultanée. Le pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 peut être compris entre 70 et 1 10%.
[0041] Selon un autre aspect de l'invention, un dispositif de diagnostic susceptible de permettre la reconnaissance et/ou la mesure de la quantité de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 dans un échantillon à tester est fourni. Ledit dispositif de diagnostic comprend des anticorps monoclonaux ou des fragments liants de ceux-ci susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3. De préférence, les anticorps monoclonaux ou les fragments liants de ceux-ci dudit dispositif de diagnostic peut être produ it, selon la présente invention à partir d 'u n hybridome, choisi dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP et ayant pour numéros de dépôt LMBP 701 1 CB, LMBP 7012CB et LMBP 7013CB. La reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25- hydroxyvitamine D3, par lesdits anticorps monoclonaux ou les fragments liants de ceux-ci, peut être simultanée. De plus, le pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3, par lesd its anticorps monoclonaux ou les fragments liants de ceux-ci, peut être compris entre 70 et 1 10%. Ledit échantillon à tester peut être un échantillon biologique.
[0042] Le dispositif de diagnostic peut également comprendre un échantillon du composé de formule (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester, une amide ou une oxazoline,
Figure imgf000017_0001
dans laquelle
n est un nombre entier compris entre
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Ci-4 alkyle ;
R12 et R13 sont un Ci-4 alkyle ;
R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d'alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique.
[0043] Préférentiellement, le dispositif de diagnostic peut comprendre un échantillon du dérivé de la vitamine D de formule (I) dans laquelle n est un nombre entier égal à 0; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Alternativement, le d ispositif de diagnostic peut comprendre un échantillon du dérivé de la vitamine D de formule (I) dans laquelle n est un nombre entier égal à 1 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Alternativement, le dispositif de diagnostic peut comprendre un échantillon du dérivé de la vitamine D de formule (I) dans laquelle n est un nombre entier égal à 2; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle. Alternativement, le dispostif de diagnostic peut comprendre un échantillon du dérivé de la vitamine D de formule (I) dans laquelle n est un nombre entier égal à 3; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle.
[0044] Le dispositif de diagnostic peut également comprendre un moyen d'expression d'un signal représentatif de la présence de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 dans un échantillon à tester.
[0045] Ledit moyen d'expression d'un signal peut être le traceur de formule (II),
Figure imgf000018_0001
dans laquelle
n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ;
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Ci-4 alkyle ;
R12 et R13 sont un Ci-4 alkyle ;
R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d'alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérive silylique ;
R16 est la protéine HRP (horseradish peroxidase), la protéine phosphatase alkaline, la protéine POD (peroxidase) ou un groupement de formule (III) ou (IV),
Figure imgf000019_0001
. Le terme
« I125 » se réfère à un radio-isotope de l'atome d'iode. Le groupement (III) est lié au composé de formule (II) par sa fonction « amino » NH. Le groupement (IV) est lié au composé (II) par sa fonction « amido » C(O)NH-.
[0046] Préférentiellement, ledit traceur peut être de formule (II),
Figure imgf000019_0002
dans laquelle
n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont un hydrogène; R12 et R13 sont un groupe méthyle ;
R16 est un groupement de formule (III). En particulier, le dispositif de diagnostic peut contenir un échantillon d'un traceur de formule (II) dans laquelle n est égal à 0 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont un hydrogène; R12 et R13 sont un groupe méthyle ; R16 est un groupement de formule (III).
[0047] Alternativement, ledit moyen d'expression d'un signal est un biosenseur couplé à des anticorps monoclonaux susceptibles de reconnaître la I a 2 5-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3. Le terme « biosenseur » se réfère à un dispositif physicochimique susceptible de détecter un échantillon biologique de manière physicochimique, optique, piézoélectrique, électrochimique, ou électromagnétique. Le biosenseur comprend notamment un élément électronique associé, ou processeur de signal permettant le traitement ou l'affichage des données, et un élément capteur détectant des changements physicochimique sous forme de signaux.
[0048] Le fait que les anticorps monoclonaux obtenus soient capables de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 est extrêmement surprenant et vainc un préjugé technique selon lequel une telle propriété ne pouvait être obtenue par des anticorps monoclonaux issus d'un seul hybridome. Un avantage important du procédé de l'invention est qu'il permet la reconnaissance simultanée de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25- hydroxyvitamine D3, dans un procédé simple et facilement reproductible. En outre, ce procédé répond à un besoin qui est resté longtemps non satisfait dans l'industrie bien que la technique relative aux anticorps monoclonaux soit connue depuis plusieurs décennies.
Description détaillée de l'invention
[0049] La présente invention sera décrite selon une forme d'exécution particulière dans laquelle l'haptène, utilisé pour l'immunisation de l'animal, est un dérivé de formule (I) dans laquelle n est un nombre entier égal à 0 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont un hydrogène; R12 et R13 sont un groupe méthyle. Cet haptène sera noté (H) pour la suite de la description. Il doit être compris que l'invention n'est pas limitée à cette forme d'exécution. Par exemple, l'haptène peut être un dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 1 , 2 ou 3 avec des substituants inchangés.
Procédé de production d'anticorps monoclonaux
[0050] La production d'anticorps monoclonaux peut être effectuée suivant la procédure conventionnelle telle que décrite, par exemple, dans Kohler and Milstein, Nature 1975 (256), 495-497 ou Eur. J. Immunol. 1976 (6), 51 1 -519. Selon cette méthode, des cellules myéloïdes sont fusionnées avec des cellules lymphocytaires B d'un animal immunisé pour obtenir des cellules hybrides, appelées hybridomes, qui produisent de grandes quantités d'un anticorps monoclonal. Dans cette procédure, un haptène est couplé à une protéine carrier pour former un immunogène qui sera en mesure de créer une immunogénicité. La protéine carrier permet donc à l'haptène d'obtenir une capacité d'induction d'une réaction immunitaire.
Synthèse de l'haptène et obtention de l'immunoqène [0051] Ainsi, dans la présente invention, l'haptène (H), dont la synthèse est connue de l'homme du métier, est tout d'abord couplé avec la sérum albumine bovine (BSA) selon le protocole suivant. Dans un milieu comprenant du diméthylformamide anhydre (Fluka 1386923-43408231 ), du dioxane anhydre (Aldrich S39136-277) et du diisopropyléthylamine (Fluka 03440), une quantité d'haptène (H) est activée pendant quatre heures à température ambiante par de l'O-(N-Succinimidyl)-1 ,1 ,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU - Fluka 85972) solubilisé dans du diméthylformamide anhydre. Par la suite, 100 à 1000 équivalents d'haptène en solution sont ajoutés à un équivalent de BSA (Calbiochem 12659) dilué dans du tampon carbonate (0,1 M ; pH 9,4). La solution est agitée à température ambiante pendant 18h à l'abri de la lumière. Le mélange réactionnel est ensuite dialysé dans une solution saline NaCI (9g/l) pendant 48h à 4°C. Une solution saline fraîche est réintroduite après 24h.
L'haptène (H) peut également être couplé avec le KLH (Keyhole limpet hemocyanin, Sigma H2133). Dans ce cas, 20000 à 500000 équivalents d'haptène en solution sont ajoutés à un équivalent de KLH dilué dans du tampon carbonate (0,1 M ; pH 9,4). La solution est alors agitée à température ambiante pendant 18h à l'abri de la lumière. Le mélange réactionnel est ensuite dialysé dans une solution saline NaCI (9g/l) pendant 48h à 4°C pour obtenir l'immunogène désiré. Une solution saline fraîche est réintroduite après 24h.
Immunisation de l'animal
[0052] Les souris femelles (6 semaines) utilisées sont fournies par la société CREAL. L'immunogène (20 g en solution physiologique saline) est injecté par voie sous-cutanée dans une souris en présence d'un adjuvant (50% solution saline /50 % adjuvant (vol/vol)) pouvant être l'adjuvant complet de Freund (CFA, Difco Laboratories et référence : 263810) ou l'adjuvant incomplet de Freund (IFA, Difco Laboratories et référence : 263910). Le CFA est une huile comprenant des mycobactéries tuées. L'IFA est le même adjuvant que le CFA sans les mycobactéries. L'adjuvant permet de stimuler une réponse immunitaire de l 'organ isme de l 'an imal . Après quelques injections de l'immunogène (de 3 à 10), le sérum de chaque souris immunisée est testé pour suivre le taux sérique en anticorps spécifiques de l'antigène injecté. Dès qu'une souris est considérée comme positive (c'est-à-dire que le pourcentage de fixation de l'antigène marqué avec un marqueur radioactif ou enzymatique atteint au moins 10% quand il est incubé avec le sérum de souris), elle est sélectionnée pour la fusion cellulaire réalisée dans le mois qui suit le test de sérum. Au cours de la fusion, l'animal est euthanasié (au CO2), sa rate est prélevée et les cellules immunocompétentes présentes dans la rate de l'animal sont récupérées en massant la rate avec une pince à bouts plats tout en la perfusant lentement avec 10 ml de milieu W/O gardé à 37°C, c'est-à-dire un milieu DMEM Dulbecco mod ified Eagle's Méd ium (G IBCO 21969) sans protéine et complémenté de 2%(vol/vol) du mélange 100x de pénicilline et de streptomycine. Les cellules ainsi prélevées sont transférées dans une boite de Pétri, puis dans un tube conique stérile de 15 ml qui est ensuite centrifugé. Le culot de cellules sera récupéré pour la fusion avec les cellules myéloïdes.
Cellules mvéloïdes
[0053] Habituellement, les myélomes utilisés pour les fusions des splénocytes de souris sont les myélomes NSO (Sigma réf :851 10503), SP2/0- Ag14 (ATCC réf :CRL-1581 ) ou P3X63Ag8.653 (ATCC réf :1580). Le myélome est cultivé dans un milieu comprenant un mélange de base DMEM sans protéine complémenté de 2%(vol/vol) du mélange 100x de pénicilline et de streptomycine, 2 à 5%(vol/vol) de glutamine, 2%(vol/vol) d'acides aminés non essentiels (100x), 2%(vol/vol) de pyruvate de sodium (100x), 1 %(vol/vol) de gentamicine. Le milieu comprend également 10%(vol/vol) de sérum de veau fœtal. La culture est centrifugée dans des tubes coniques stériles de 50 ml (à 1000 rpm, 10 minutes). Les culots sont rassemblés et centrifugés dans un tube de 15 ml. De manière générale, 1 ml du myélome représente entre 1 106 et 2 108 cellules.
Fusion cellulaire
[0054] Les cellules de rate sont mélangées avec des cel lules de myélome, pour former un hybridome, avec un rapport d'environ 5 à 10 cellules de rate pour 1 cellule de myélome. Dans le cas présent : 4,7 ml de myélome NSO à 3,4.106 cellules/ml sont mélangés 8.107 cellules de rate. Le mélange des cell ules de rate avec les cellules de myélome est centrifugé et les surnageants écartés. Le culot de cellules ainsi obtenu est lentement (1 minute) suspendu dans 1 ml d'une solution de polyéthylène glycol 50%, la température est maintenue à 37°C pour cette opération. La solution de polyéthylène glycol est obtenue en dissolvant 5 g de polyéthylène glycol (Merck, ref : 1 .09727.0100) dans 5 ml de tampon phosphate 0,1 M à pH 7,4, puis en y ajoutant 5%(vol/vol) de diméthylsulfoxyde (Sigma D2650) et en la stérilisant par filtration (0,2 μιτι). Le culot de cellules ainsi resuspendu dans la solution de PEG est dilué au moins 10 fois, par addition d'un milieu W/O (DMEM sans protéine complémenté de 2%(vol/vol) du mélange 100x de pénicilline et de streptomycine). Le tube est centrifugé et le culot de cellules est resuspendu dans du milieu HAT comprenant un mélange de base DMEM sans protéine complémenté de 2%(vol/vol) du mélange 100x de pénicilline et de streptomycine, 2 à 5%(vol/vol) de glutamine, 2%(vol/vol) d'acides aminés non essentiels (100x), 2%(vol/vol) de pyruvate de sodium (100x), 1 %(vol/vol) de gentamicine, 10%(vol/vol) de sérum de veau fœtal, 2%(vol/vol) d'hypoxanthine thymidine (50x), 2 %(vol/vol) d'aminoptérine (50x), et éventuellement 2%(vol/vol) de Nutridoma CS (Roche réf :1363 743). Le volume de milieu HAT ajouté au culot de cellules est tel que l'étalement sur les plaques de 96 puits est de 5 104 à 105 cellules par puits, à raison de 150 à 200 μΙ de milieu par puits. Les plaques sont incubées entre 8 à 10 jours, à 37°C et 5% de CO2.
Présélection des hybridomes produisant des anticorps spécifiques de l'haptène
[0055] L'identification des puits des plaques multipuits contenant des clones d'hybridomes produisant des anticorps susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et 25-hydroxyvitamine D3 est effectuée par une méthode RIA (Radio Immuno Assay) en phase homogène, suivi d'une immuno- précipitation. Cette méthode consiste à incuber un volume (entre 50 et 100 μΙ) du milieu de culture issu des plaques multipuits de la fusion, avec un traceur de formule (II) dans laquelle n est égal à 0 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont un hydrogène; R12 et R13 sont un groupe méthyle ; R16 est un groupement de formule (III). Après un temps d'incubation entre 4 et 18 h, la réaction est arrêtée par add ition de SAC CEL (suspension de cellulose contenant des anticorps anti-souris : IDS référence : AASAC4) au milieu. Après centrifugation, la radioactivité des culots est mesurée dans un compteur gamma. Les puits positifs (c'est-à-dire fixant plus de 10% de la radioactivité totale ajoutée) sont ceux qui contiennent des anticorps de souris spécifiques de l'haptène (H), donc ceux qui contiennent les clones d'hybridomes spécifiques.
Sélection des clones produisant des anticorps monoclonaux reconnaissant la 25-hvdroxyvitamine D2 et la 25-hvdroxyvitamine D3
[0056] Parmi les hybridomes positifs (c'est-à-dire produisant des anticorps monoclonaux qui reconnaissent le traceur) obtenus, ceux reconnaissant à la fois la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 sont sélectionnés par un test d'inhibition de la fixation dudit traceur. Ce test consiste à incuber le surnageant de culture (par exemple 100 μΙ) de l'hybridome (en boîte de Pétri) avec le traceur (marqué à l'iode 125) et en présence de 25-hydroxyvitamine D2 ou de 25-hydroxyvitamine D3. Le mélange est incubé à température ambiante pendant 18h. La 25-hydroxyvitamine D2 utilisée est fournie par Sigma sous la référence H17937, tandis que la 25- hydroxyvitamine D3 est fournie par Sigma sous la référence H4014. Les tests de reconnaissance sont effectués avec des solutions de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 ayant des concentrations de 1 000 ng/ml . Le traceur est en solution dans un mélange volume/volume : 25% eau/25% éthanol/50% tampon phosphate 0.1 M pH 7,4 CP (caséine peptone : Organotechnie référence : 19516) 10g/I . La réaction est arrêtée par immunoprécipitation en ajoutant du SAC CEL (suspension de cellulose contenant des anticorps anti-souris : IDS référence : AASAC4) au milieu d'incubation.
Résultats
[0057] Le tableau 1 représente les résultats de reconnaissance de la 25- hydroxyv ita m i n e D2 et d e l a 25-hydroxyvitamine D3 pour des clones sélectionnés suite aux tests de présélection des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifiques de l'haptène (H).
Figure imgf000024_0001
Tableau 1
[0058] La première colonne représente les numéros des clones testés, qui correspondent aux hybridomes déposés comme décrit ci-dessus. La seconde colonne correspond au pourcentage de fixation dudit traceur aux anticorps produits par le clone correspondant, en absence de 25- hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3. La troisième colonne correspond au pourcentage de fixation dudit traceur aux anticorps produits par le clone correspondant en présence de 25-hydroxyvitamine D2 à une concentration en solution de I pg/ml. La quatrième colonne correspond au pourcentage d'inhibition des anticorps correspondants en présence de 25- hydroxyvitamine D2 à une concentration de 1 g/ml. Ce pourcentage est calculé en déduisant de 100% le rapport, multiplié par 100, entre le pourcentage de fixation en présence de 25-hydroxyvitamine D2 à 1000 ng/ml et le pourcentage de fixation sans 25-hydroxyvitamine D2. La cinquième colonne correspond au pourcentage de fixation dudit traceur aux anticorps produits par le clone correspondant en présence de 25-hydroxyvitamine D3 à une concentration en solution de 1 g/ml. La sixième colonne correspond au pourcentage d'inhibition des anticorps correspondants en présence de 25- hydroxyvitamine D3 à une concentration de 1 g/ml. Ce pourcentage est calculé en déduisant de 100% le rapport, multiplié par 100, entre le pourcentage de fixation en présence de 25-hydroxyvitamine D3 à 1 g/ml et le pourcentage de fixation sans 25-hydroxyvitamine D3.
[0059] Lorsque la concentration en 25-hydroxyvitamine D2 et en 25- hydroxyvitamine D3 est de l'ordre de 1 pg/ml, le pourcentage d'inhibition des anticorps monodonaux produits par le clone LMBP7012CB peut être supérieur à 80% vis-à-vis de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3.
Exemple de reconnaissance simultanée de la 25-hydroxyvitamine D? et de la 25-hydroxyvitamine D
[0060] Un test de reconnaissance simultanée de la 25-hydroxyvitamine D2 et 25-hydroxyvitamine D3 a été effectué en tubes coatés. Les anticorps ont été ancrés sur des tubes secs (coating direct) à une concentration de 0.5 g/ml. Les anticorps utilisés ont été produits par l'hybridome LMBP 7013CB. Par la suite, 300 μΙ de tampon d'incubation (phosphate 50mM pH7.4 Caséine peptone 2g/l d'azoture de sodium 0.5g/l) et 1 00 μΙ de 25-hydroxyvitamine D2 et 25- hydroxyvitamine D3 ont été ajoutés aux tubes. Les solutions sont analysées après deux heures à température ambiante D3 D2 Quantité totale Pourcentage de
(ng/mL) (ng/mL) détectée (ng/mL) reconnaissance
(%)
1 ,5 1 ,5 3,3 1 10
5 5 8, 1 80
15 15 25, 1 84
50 50 99,7 100
50 5 60 1 10
5 50 42 75
Tableau 2
Les colonnes notées « D3 » et « D2 » dans le tableau 2, correspondent respectivement aux concentrations, exprimées e n n g / m L , d e 2 5- hydroxyvitamine D3 et de 25-hydroxyvitamine D2 utilisées pour le test de reconnaissance. Par exemple, lorsque les concentrations en 25- hydroxyvitamine D2 et 25-hydroxyvitamine D3 étaient chacune de 50 ng/ml, plus de 99 ng/ml de 25-hydroxyvitam ine D2 et 25-hydroxyvitamine D3 ont été détectés, ce qui constitue un résultat particulièrement remarquable.
[0061] Des tests identiques ont été effectués avec des anticorps monoclonaux produits par l'hybridome LMBP 7012CB. Ainsi, lorsque les concentrations en 25-hydroxyvitamine D2 et en 25-hydroxyvitamine D3 étaient de 1 ,5 ng/mL chacune, le pourcentage de reconnaissance était de 86%. De même, lorsque les concentrations en 25-hydroxyvitam ine D2 et en 25- hydroxyvitamine D3 étaient de 5 ng/mL chacune, le pourcentage de reconnaissance était de 77%. D'excellents résultats ont été également obtenus pour d'autres concentrations. Les tests effectués avec des anticorps monoclonaux produits par l'hybridome LMBP 701 1 CB donnent également de bons résultats.
Obtention des anticorps monoclonaux
[0062] Après la sélection des clones d'intérêt, les cellules sont congelées dans l'azote liquide pour une conservation à long terme. La production d'anticorps se fait par un système de culture in vitro des cellules d'hybridome par exemple : en spinner flask (Wheaton Magna-Flex® Microcarrier Spinner Flasks), soit en CELLINE (Integra Bioscience) ou toute autre méthode de culture in vitro adaptée aux cellules d'hybridomes. Alternativement, les anticorps peuvent être produits par une méthode in vivo, telle que la méthode des ascites, là où la législation le permet.
Purification des anticorps monoclonaux [0063] Le surnageant de culture issu du système de culture in vitro des cellules d'hybridome est purifié par chromatographie d'affinité sur colonne classique de Protéine A et/ou Protéine G (GE Heathcare), sur un support STREAMLINE Protein A (GE Healthcare).
Dispositifs de diagnostic
[0064] Les dispositifs de diagnostic selon l'invention, également appelés dispositif d'immunoassays peuvent ê t r e u n d i s p o s i t i f « enzyme immunoassays » (EIA) ou un dispositif « enzyme-linked immunosorbent assays » (ELISA), un dispositif d'immunofluorescence (FIA), un dispositif radiométrique ou « radioimmunoassays » (RIA), un dispositif « magnetic séparation assays » (MSA), un dispositif « latéral flow assays », un dispositif « diffusion immunoassays », un dispositif d'immuno-précipitation, un dispositif « immunosorbent » ou « antigen-down assays», un dispositif d'immuno- agglutination, un dispositif de « chemilunescence immuno assay (CLIA), ou encore un dispositif utilisant un biosenseur.
[0065] Différents types de supports peuvent être utilisés : tubes, plaques de microtitration ou billes. Les anticorps monoclonaux ou les fragments liants de ceux-ci peuvent être biotinylés afin d'augmenter la fixation ou la sensibilité sur les différents supports.
[0066] Dans certains tests, les anticorps monoclonaux, ou des fragments liants de ceux-ci peuvent être fixés directement sur le support. On peut également fixer sur le support un anticorps anti-souris et fixer ensuite un anticorps monoclonal ou un fragment liant de celui-ci selon l'invention sur ce premier anticorps. Les anticorps monoclonaux ou fragments de ceux-ci peuvent être avantageusement biotinylés.
[0067] De manière alternative, l'haptène peut être fixé sur le support. Par la suite, un anticorps monoclonal selon l'invention est ajouté, suivi d'un anticorps anti-HRP secondaire. Le cas échéant, les anticorps monoclonaux ou fragments liants de ceux-ci peuvent être utilisés par couplage direct à l'HRP (horse radish peroxidase) afin de détecter l'immunogène préalablement fixé sur un support. Alternativement, les anticorps monoclonaux, ou les fragments liants de ceux-ci, peuvent être biotinylés. Par la suite, la SAv-HRP (streptavidin- horse radish peroxidase) est ajoutée.
[0068] Le traceur être couplé à une tyramine marquée à l'iode 125 pour les tests RIA. Il peut également être utilisé après biotinylation ou couplage à l'HRP en vue de réaliser des tests ELISA ou CLIA. Le luminol ou la tetramethylbenzidine peuvent être couplé par la suite à l'HRP.
[0069] Enfin, les tests peuvent être réalisés dans des automates ouverts ou fermés.
[0070] Dans les tests RIA compétitifs une quantité fixe du traceur de formule (II) dans laquelle n est égal à 0 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont un hydrogène; R12 et R13 sont un groupe méthyle ; R16 est un groupement de formule (III), entre en compétition avec la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 présentes dans les échantillons, les contrôles ou les calibrateurs extraits pour une quantité fixe d'anticorps spécifiques, immobilisés sur la surface d'un support en polystyrène. Après une incubation de 2 à 24h à température ambiante ou à 37°C, une phase d'aspiration met fin à la réaction de compétition. Les tubes sont alors lavés et la radioactivité est mesurée dans un compteur gamma.
[0071] Grâce à la présente invention, la reconnaissance de la 25- hydroxyvitamine D3 et la 25-hydroxyvitamine D2 est simultanée lors de l'utilisation de dispositifs de diagnostic selon l'invention sur des échantillons contenant de la 25-hydroxyvitamine D3 et de la 25-hydroxyvitamine D2.
f0072] Les term es et descriptions util isés ici sont proposés à titre d'illustration seulement et ne constituent pas des limitations. L'homme du métier reconnaîtra que de nombreuses variations sont possibles dans l'esprit et la portée de l'invention telle que décrite dans les revendications qui suivent et leurs équivalents; dans celles-ci, tous les termes doivent être compris dans leur acception la plus large à moins que cela ne soit indiqué autrement.

Claims

Revendications
1. Procédé pour la production d'hybridomes, d'anticorps monoclonaux ou de fragments liants de ceux-ci, susceptibles de reconnaître la 25- hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 comprenant les étapes suivantes :
a) immunisation d'un animal avec un haptène de formule (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester, une amide ou une oxazoline,
Figure imgf000029_0001
dans laquelle
n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ;
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Ci-4 alkyle ;
R12 et R13 sont un Ci-4 alkyle ;
R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d'alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique ;
ledit haptène étant rendu immunogène ;
b) prélèvement de cellules B produites par l'animal et fusion de celles-ci avec des cellules de myélome pour former des hybridomes ;
c) production, à partir des hybridomes obtenus, d'anticorps monoclonaux, ou de fragments liants de ceux-ci, susceptibles de reconnaître la 25- hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la reconnaissance, par lesdits anticorps monoclonaux, de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25- hydroxyvitamine D3 est simultanée.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdits anticorps monoclonaux présentent un pourcentage de reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 compris entre 70 et 1 10%.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'haptène est rendu immunogène par couplage covalent dudit haptène à une protéine carrier immunogénique, par encapsulation dudit haptène dans des liposomes, par ancrage dudit haptène dans des liposomes, par couplage dudit haptène avec un polymère, par induction avec un biopolymère, ou par l'utilisation d'un peptide antigénique multiple.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que l'haptène dérivé de la vitamine D est le dérivé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0 ; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les hybridomes sont choisis dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP et ayant pour numéros de dépôt LMBP 701 1 CB, LMBP 7012CB et LMBP 7013CB.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'haptène est rendu immunogène par le couplage entre l'haptène et une protéine carrier, ledit couplage s'effectuant via la fonction acide carboxylique dudit haptène.
8. Hybridomes aptes à permettre la production d'anticorps monoclonaux ou de fragments liants de ceux-ci susceptibles de reconnaître la 25- hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.
9. Hybridomes selon la revendication 8, caractérisés en ce que la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 est simultanée. l O. Hybndonnes selon la revendication 8 ou 9, caractérisés en ce que lesdits anticorps monoclonaux ou les fragments liants de ceux-ci, présentent un pourcentage de reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25- hydroxyvitamine D3 compris entre 70 et 1 10%.
11. Hybridomes selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP et ayant pour numéros de dépôt LMBP 701 1 CB, LMBP 7012CB et LMBP 7013CB.
12. Anticorps monoclonaux ou fragments liants de ceux-ci susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.
13. Anticorps monoclonaux selon la revendication 12, caractérisés en ce que la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 est simultanée.
14. Anticorps monoclonaux selon la revendication 12 ou 13, caractérisés en ce qu'ils présentent un pourcentage de reconnaissance de la 25- hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 compris entre 70 et 1 10%.
15. Anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisés en ce qu'ils sont produits à partir d'un hybridome sélectionné dans le groupe consistant dans les hybridomes déposés au BCCM/LMBP et ayant pour numéros de dépôt LMBP 701 1 CB, LMBP 7012CB et LMBP 7013CB.
16. Utilisation d'un haptène consistant en un composé de formule (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester, une amide ou une oxazoline,
Figure imgf000032_0001
dans laquelle
n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ;
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Ci-4 alkyle ;
R12 et R13 sont un Ci-4 alkyle ;
R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d'alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique ; ledit haptène étant rendu immunogène ;
pour la production d'hybridomes, d'anticorps monoclonaux, ou de fragments liants de ceux-ci, susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.
17. Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3, par lesdits anticorps monoclonaux, est simultanée.
18. Utilisation selon la revendication 16 ou 17, caractérisée en ce que lesdits anticorps monoclonaux présentent un pourcentage de reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 compris entre 70 et 1 10%.
19. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisée en ce que l'haptène est rendu immunogène par couplage covalent dudit haptène à une protéine carrier immunogenique, par encapsulation dudit haptène dans des liposomes, par ancrage dudit haptène dans des liposomes, par couplage dudit haptène avec un polymère, par induction avec un biopolymère, ou par l'utilisation d'un peptide antigénique multiple.
20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que ledit haptène est rendu immunogène par le couplage entre l'haptène et une protéine carrier, ledit couplage s'effectuant via la fonction acide carboxylique dudit haptène.
21. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 20, caractérisée en ce ledit haptène de formule (I) est le composé de formule (I) dans laquelle n est égal à 0; R, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R1 1, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène; R12 et R13 sont indépendamment un groupement méthyle.
22. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 21 , caractérisée en ce que lesdits anticorps monoclonaux, ou les fragments liants de ceux- ci, produits sont les anticorps monoclonaux selon les revendications 12 à 15.
23. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 22, caractérisée en ce que lesdits anticorps monoclonaux, ou les fragments liants de ceux- ci, sont utilisés dans la fabrication d'un dispositif de diagnostic.
24. Utilisation d'un haptène consistant en un composé de formule (I), ou un sel de celui-ci, ou un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester, une amide ou une oxazoline,
13
dans laquelle
n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ;
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Ci-4 alkyle ;
R12 et R13 sont un Ci-4 alkyle ;
R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d'alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique ; ledit haptène étant rendu immunogène ;
dans la fabrication d'un dispositif de diagnostic susceptible de permettre la reconnaissance et/ou la mesure de la quantité de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 dans un échantillon à tester.
25. Utilisation selon la revendication 24, caractérisée en ce que la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 est simultanée.
26. Utilisation selon la revendication 24 ou 25, caractérisée en ce que le pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25- hydroxyvitamine D3 est compris entre 70 et 1 10%.
27. Dispositif de diagnostic susceptible de permettre la reconnaissance et/ou la mesure de la quantité de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25-hydroxyvitamine D3 dans un échantillon à tester caractérisé en ce qu'il comprend des anticorps monoclonaux selon l'une quelconque des revendications 12 à 15.
28. Dispositif de diagnostic selon la revendication 27, caractérisé en que la reconnaissance de la 25-hydroxyvitamine D2 et de la 25-hydroxyvitamine D3 est simultanée.
29. Dispositif de diagnostic selon la revendication 27 ou 28, caractérisé en ce que le pourcentage de reconnaissance envers la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3 est compris entre 70 et 1 10%.
30. Dispositif de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 27 à 29, caractérisé en ce qu'il comprend également un moyen d'expression d'un signal représentatif de la présence de 25-hydroxyvitamine D2 et de 25- hydroxyvitamine D3 dans un échantillon à tester.
31. Dispositif de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 27 à 30 caractérisé en ce qu'il comprend également un échantillon du composé de formule (I), ou d'un sel de celui-ci, ou d'un dérivé de celui-ci dans lequel la fonction acide carboxylique est protégée pour former un ester ou une oxazoline,
Figure imgf000035_0001
dans laquelle
n est un nombre entier compris entre
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Ci-4 alkyle ;
R12 et R13 sont un Ci-4 alkyle ;
R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d'alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique.
32. Dispositif de diagnostic selon la revendication 30 ou 31 caractérisé en ce que ledit moyen d'expression d'un signal est le traceur de formule (II),
Figure imgf000036_0001
R3 (il) dans laquelle
n est un nombre entier compris entre 0 et 3 ;
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R14, R15 sont indépendamment un hydrogène ou un Ci-4 alkyle ;
R12 et R13 sont un Ci-4 alkyle ;
R est un hydrogène ou un substituant sélectionné parmi le groupe consistant en un groupement acyle, benzyle, alkyle, aryle, éther d'alkyle, diméthoxytrityl, méthoxytrityl, tétrahydropyranyle, triphénylméthyle, ou un dérivé silylique ;
R16 est la protéine HRP (horseradish peroxidase), la protéine phosphatase alkaline, la protéine POD (peroxidase) ou un groupement de formule (III) ou (IV),
Figure imgf000036_0002
33. Dispositif de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 27 à 30, caractérisé en ce que ledit moyen d'expression d'un signal est un biosenseur couplé à des anticorps monoclonaux susceptibles de reconnaître la 25-hydroxyvitamine D2 et la 25-hydroxyvitamine D3.
34. Dispositif de diagnostic suivant l'une quelconque des revendications 18 à 21 , caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe consistant en « enzyme immunoassays » (EIA), « enzyme-linked immunosorbent assays » (ELISA), un dispositif d'immunofluorescence (FIA), un dispositif « radioimmunoassays » (RIA), un dispositif « magnetic séparation assays » (MSA), u n d ispositif « latéral flow assays », un dispositif « diffusion immunoassays », un dispositif d'immuno-précipitation, un dispositif « immunosorbent » ou « antigen-down assays», un dispositif d'immuno- agglutination, un dispositif de « chemilunescence immuno assay (CLIA), ou un dispositif utilisant un biosenseur.
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