AT521124A1

AT521124A1 - Verfahren und Zusammensetzung zur Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae

Info

Publication number: AT521124A1
Application number: ATA50244/2018A
Authority: AT
Original assignee: Bcsk Biocid Gmbh
Priority date: 2018-03-23
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2019-10-15
Also published as: WO2019178633A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae mit einer flüssigen Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin sowie die Verwendung einer flüssigen Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin zur Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae. Die Erfindung betrifft weiters eine flüssige Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin zur Verwendung bei der Prophylaxe und der Behandlung von durch Viren der Familie der Picornaviridae hervorgerufenen Erkrankungen.

Description

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19472/5/5

Verfahren und Zusammensetzung zur Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae

Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae mit einer flüssigen Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer flüssigen Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin zur Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae. In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine flüssige Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin zur Verwendung bei der Prophylaxe und der Behandlung von durch Viren der Familie der Picornaviridae hervorgerufenen Erkrankungen.

Viren sind infektiöse Partikel, die für ihre Replikation eine Wirtszelle benötigen. Dazu bindet das Virus an eine Wirtszelle und gibt sein Erbgut an die Wirtszelle ab. Die Zelle vervielfältigt das Erbgut des Virus und setzt anschließend neue Viren frei. Dabei geht die Wirtszelle häufig zu Grunde.

Für die systematische Einordnung von Viren können verschiedene Systeme herangezogen werden. Viren können nach unterschiedlichen Gesichtspunkten unterschieden werden. So kann beispielsweise eine Einteilung nach Art des Erbguts in einzelsträngige und doppelsträngige Viren, sowie in RNA und DNA Viren erfolgen. Ebenso kommt eine Einteilung nach dem äußeren Aufbau in unbehüllte und behüllte Viren zur Anwendung.

Die Familie der Picornaviridae umfasst unbehüllte Viren mit einer einzelsträngigen linearen RNA mit positiver Polarität. Picornaviridae sind sehr stabil gegenüber alkoholischen Desinfektionsmitteln, wie Ethanol oder Isopropylalkohol. Auch / 37 gegen milde Detergenzien, wie Seife, haben sie eine hohe Widerstandskraft. Innerhalb der Familie der Picornavidae weist beispielsweise die Gattung Enterovirus zudem eine hohe Säurestabilität auf. Die Bekämpfung der Viren der Familie der Picornaviridae ist daher mit gängigen Desinfektionsmitteln oft schwierig.

Viele Viren dieser Familie lösen jedoch bei Wirbeltieren, u.a. beim Menschen, häufige Erkrankungen aus. Beispielhaft sei die Gattung Enterovirus angeführt.

Zunächst soll auf das Humane Enterovirus 71 (EV71) eingegangen werden. Dieses Virus ist weltweit verbreitet und der Mensch ist der einzige bekannte Reservoirwirt. Eine Übertragung des Erregers erfolgt direkt von Mensch zu Mensch durch Kontakt mit Körperflüssigkeiten wie Speichel, Tröpfchen, dem Sekret aus Bläschen oder fäkal-oral, wobei die Erreger über die Mundschleimhaut oder den Dünndarm eindringen. Über die regionalen Lymphknoten gelangen sie nach drei Tagen in die Blutbahn (Virämie). Weiters ist auch eine Übertragung über mit Speichel oder Stuhl kontaminierte Oberflächen möglich. Das EV71 wird nach der Nukleotidsequenz des variablen Strukturproteins VP1 in vier genetische Linien aufgeteilt (A,B,C und D), mit jeweils weiteren Unteraufteilungen. Dabei treten immer wieder neue Linien auf, die oft bis zu fünf Jahre zirkulieren, bevor sie größere Epidemien auslösen.

Zumeist verläuft eine Infektion asymptomatisch. EV71 kann jedoch auch die Hand-Fuß-Mund-Krankheit auslösen. Diese Erkrankung beginnt mit grippeähnlichen Symptomen, bevor es zu Bläschenbildung im Mundbereich, an Händen und Füßen kommt.

Neurologische Komplikationen sind selten. Es kann jedoch vor allem bei Kindern unter zwei Jahren zu einer akuten schlaffen Lähmung kommen, die auch mit bleibenden Lähmungen einhergehen kann. Gelegentlich kommt es zu Komplikationen wie einer / 37

Hirnstamm-Enzephalitis, die mit einem neurogenen Lungenödem einhergehen kann. Eine hohe Letalität besteht besonders bei Kindern unter zwei Jahren.

EV71 wurde erstmals 1969 als Erreger einer aseptischen Meningitis und Enzephalitis in Kalifornien entdeckt. Später wurden erste Epidemien mit schweren neurologischen Erkrankungen 1975 in Bulgarien und 1978 in Ungarn beschrieben. Die erste große Epidemie wurde 1997 aus Malaysia berichtet, bei der 41 Kinder starben. Im Folgejahr kam es zu einer Epidemie mit 1,5 Millionen Betroffenen in Taiwan, mit 78 Toten.

Seither werden regelmäßig große Epidemien aus Südostasien und dem Pazifikraum gemeldet, so aus Singapur, Brunei, Japan, Vietnam, Hongkong, Südkorea, Thailand, Kambodscha, den Philippinen und jährlich aus China. Aber auch in Frankreich wurden große Fallzahlen berichtet. Es wird geschätzt, dass im ersten Jahrzehnt des neuen Jahrtausends weltweit sechs Millionen Menschen an einer EV71-Infektion erkrankten und über 2000 Menschen daran starben.

Ein weiteres Beispiel für die Pathogenität der Picornaviridae ist die Gruppe der Rhinoviren. Rhinoviren findet man auf jedem Kontinent. Sie werden durch Tröpfcheninfektion oder Schmierinfektion von Mensch zu Mensch übertragen, wobei jedes Individuum ca. viermal pro Jahre infiziert wird. Infektionen treten vor allem im Frühjahr und im Spätsommer auf. Die Inkubationszeit beträgt maximal vier Tage. Die Infektion manifestiert sich durch eine Rhinitis mit Schnupfen.

Durch die zytolytischen Eigenschaften der Rhinoviren treten innerhalb von 48h nach Infektion lokale Zerstörungen des Epithels im Nasen- und Rachenbereiche auf, wobei es in der Regel nicht zu ausgeprägteren Nekrosen kommt. Bei immungeschwächten Patienten kann das Virus in die tieferen Atemwege deszendieren und zu einer Bronchitis oder / 37

Bronchopneumonie führen. Bakterielle Superinfektionen treten häufig auf. Die sich ausbildende Immunität hält nur für kurze Zeit an und ist typenspezifisch. Bei über 100 Serotypen ist aus diesem Grund kein ausreichender Schutz vor einer erneuten Infektion gegeben. Eine Impfung ist nicht möglich, so dass nur allgemeinhygienische Maßnahmen vor einer Infektion schützen können.

Erkrankungen durch Picornaviridae sind daher weit verbreitet. Aufgrund der eingangs erwähnten Eigenschaften der Picornaviridae ist eine Bekämpfung mit vielen gängigen Desinfektionsmitteln nicht ausreichend um eine Übertragung effektiv zu vermeiden.

Die Aufgabe der Erfindung ist es daher ein Verfahren zur Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae bereitzustellen.

Gelöst wird die Erfindung durch die Bereitstellung eines Verfahrens gemäß Patentanspruch 1 oder eine Verwendung gemäß Anspruch 2. Eine erfindungsgemäße Verwendung bzw. ein erfindungsgemäßes Verfahren ermöglicht die Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae mit einer flüssigen Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin.

Es hat sich überraschend gezeigt, dass sich durch eine erfindungsgemäße Verwendung, bzw. durch ein erfindungsgemäßes Verfahren Viren der Familie Picornaviridae effektiv bekämpfen lassen.

Polymere Guanidine sind im Fachgebiet der Desinfektionsmittel bekannt für ihre anti-mikrobielle Wirkung. Für die Zusammensetzung können unterschiedliche polymere Guanidine verwendet werden. Die Herstellung polymerer Guanidine ist beispielsweise in der WO 01/85676 A1 und in den Patenten AT 408302 B und AT 411060 B beschrieben. Polymere Guanidine umfassen beispielsweise auch oder werden als Akacid, oder X5 / 37

Cid, bezeichnet und sind z.B. in Kratzer et al., Antibiotika Monitor 1/2/2006; Buxbaum et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2006) 58, 193-197; US 2,325,586; GB 1095902 A; WO 1999/054291 A1; WO 01/85676 A1; WO 2002/030877 A1; WO 2006/047800 A1; WO 2008/080184 A2; WO 2009/092123 A2; EP 2520605 A1; WO 2013/064161 A1; WO 2014/113835 A1; WO 2016/015081 A1 beschrieben (alle durch Bezugnahme hierin aufgenommen). Die WO 2006/047800 beschreibt beispielsweise eine fungizide Wirkung. Die WO 2008/080184 beschreibt die Verwendung von polymeren Guanidinen zur Bekämpfung von Mikroorganismen bei nichttherapeutischen Anwendungen, z.B. durch Vernebelung zur Raumdesinfektion. Eine darin genannte Zusammensetzung hierzu ist Akacid, Poly-[2-(2-ethoxy)-ethoxyethyl-guanidinium-chlorid und Akacid Plus, eine 3:1-Mischung aus Poly(hexamethylenguanidiniumchlorid) und Poly[2-(2ethoxy)ethoxyethyl)-guanidiniumchlorid] .

Hierin wird der Begriff „polymere Guanidine“ insbesondere für „polymere Guanidinderivate auf Basis eines Alkylendiamins und/oder eines Oxyalkylendiamins“ (WO 2009/009815 A1) , speziell für „polymere Guanidinderivate auf der Basis von Diaminen, welche Alkylketten und/oder Oxyalkylenketten zwischen zwei Aminogruppen enthalten, wobei die Guanidinderivate ein Produkt der Polykondensation eines Guanidin-Säureadditionssalzes mit Diaminen, welche

Polyalkylenketten und/oder Polyoxyalkylenketten zwischen zwei Aminogruppen enthalten, darstellen“ (EP 1 280 766

Anspruch 1), verwendet. Besonders

Poly(hexamethylenguanidinium) Salz ethoxy)ethoxyethyl)-guanidinium Salz.

sind bevorzugte polymere Guanidine gemäß der vorliegenden Erfindung.

B1, bevorzugt sind ein und/oder Poly[2-(2Akacid und Akacid Plus

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, dass ein polymeres Guanidin vorgesehen ist, welches ein Alkylendiamin und das Oxyalkylendiamin im Molverhältnis zwischen 4:1 und / 37

1:4 enthält. Die Aminogruppen des Alkylendiamins und/oder des Oxyalkylendiamins sind bevorzugt endständig, wobei zur Herstellung des polymeren Guanidins als Alkylendiamin in erster Linie eine Verbindung der allgemeinen Formel NH₂(CH₂)_nNH₂ vorgesehen ist, in welcher eine ganze Zahl zwischen 2 und 10, insbesondere 6, ist. Zur Herstellung des polymeren Guanidins kann als Oxyalkylendiamin eine Verbindung der allgemeinen Formel NH2[(CH2)2O)]m(CH2)2NH2 vorgesehen werden, in welcher eine ganze Zahl zwischen 2 und 5, insbesondere 2, ist.

Bevorzugte polymere Guanidine können ausgewählt sein aus Polyhexamethylenguanidin; Poly[2-(2-ethoxy)-ethoxyethyl)guanidin (Akacid, [374572-91-5]); Polytriethylenglykolguanidin; Polyethylenglykolguanidin; Polyoxypropylenguanidin; Polyoxyethylenguanidin oder Mischung aus Poly(hexamethylenguanidiniumchlorid) und Poly[2-(2ethoxy)ethoxyethyl)-guanidiniumchlorid] (Akacid Plus), insbesondere einer 3:1-Mischung.

Insbesondere bevorzugt ist das polymere Guanidin ein Polyalkylenguanidin, insbesondere ein Polyoxyalkylenguanidin. „Alkylen“ kann ein C1-C8 Alkyl, bevorzugst ein C2-C6 Alkyl wie Ethyl, Propyl, Butyl, Methylpropyl, Pentyl sein, verzweigt oder unverzweigt. Dies ist in allen Verwendungen des Begriffs „Alkylen“ oder „Alkyl“ hierin bevorzugt.

Weitere bevorzugte polymeren Guanidine, die sich ausgezeichnet für die vorliegende Erfindung eignen, sind in WO 2014/113835 A1 und WO 2016/015081 A1 beschrieben. Derartige polymere Guanidine (auch „Polyguanidin“ bezeichnet) können der Formel (I), (II) oder (III) entsprechen / 37

NH h₂n—

IN¹—

H

H π

ch₂-r_vch/ (I)

HN

H_;N

H

H₂N—-N

HN

ΜΗ h₂n^j

-CHa-RvCH/ αι) 'NH

I .ΝNH

HN^^NH

-H (III) worin Ri entweder für ein aromatisches Ringsystem mit zumindest einem aromatischen Ring, das gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus 0, N und S enthält und das gegebenenfalls mit einer oder zwei Vinylgruppen substituiert ist, oder für Ethylen steht, oder das eine durch Ringschluss unter Eliminierung eines Guanidins erhaltene zyklische Struktur aufweist. Beispiele für RI sind Benzene (vorzugsweise para- oder meta-stellig eingebunden), Pyridin

8/37 (vorzugsweise and den beiden C-Atomen benachbart zum N eingebunden), Divenylbenzol, Biphenyl (vorzugsweise jeweils beide Benzene para-stellig eingebunden), 1,3-Bis((E)-2 vinyl)benzol, Furan, Pyrrol, Thiophen, Fluoren, Ethylen (vorzugsweise cis-stellig eingebunden). Derartige polymere Guanidine sind in WO 2016/015081 Al beschrieben.

Polymere Guanidine können auch die Verbindung der Formel (IV) enthalten

x-	’h’ -N-	a	N ί	Hl kl
N^	— IM	b
			H	H	n

(IV) worin

X aus -NH₂, Aminoguanidino und 1 ,3-Diaminoguanidino ausgewählt ist;

Y aus -H und -Ri-NH₂ ausgewählt ist; oder X und Y zusammen für eine chemische Bindung stehen, um eine zyklische Struktur zu ergeben;

Ri aus zweiwertigen organischen Resten mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, in denen gegebenenfalls ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch 0 oder N ersetzt sind; a und b jeweils 0 oder 1 sind, wobei a+b ungleich 2 ist, wenn keine 1,3-DiaminoguanidinEinheiten enthalten sind;

R₂ aus -H und -NH₂ ausgewählt ist, wobei R₂ -NH₂ ist, wenn a+b=0 ist,

R₂ -H oder -NH₂ ist, wenn a+b=l ist und

R₂ -H ist, wenn a+b=2 ist; und n größer gleich 2 ist;

oder ein Salz davon.

Derartige polymere Guanidine sind in WO 2014/113835 Al beschrieben.

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In den Formeln (I) bis (IV) entspricht n einer Vielzahl, z.B. um die oben genannten Molmassen des Polymers zu erreichen. Beispielsweise kann n 3 bis 200 betragen.

Vorzugsweise ist das Guanidin ein Guanidinium Salz, vorzugsweise ausgewählt aus einem Halogenid, vorzugsweise einem Chlorid; Phosphat, vorzugsweise einem Dihydrogenphosphat; Karbonat; Nitrat; Sorbat; Acetat, vorzugsweise Hydroacetat; Gluconat; Zitrat; Silikat; etc. Dies betrifft auch die polymeren Guanidine. Das erfindungsgemäße polymere Guanidin kann ein Polyguanidinsalz sein. Diese Verbindungen mit Salzbildungspartnern (Gegenionen), wie z.B. Halogenid, Phosphat, etc., sind z.B. in AT 411060 B beschrieben.

Vorzugsweise ist das mittlere Molekulargewicht des polymeren Guanidins 200 Da bis 10000 Da, vorzugsweise 500 Da bis 3000 Da. Z.B. kann das polymere Guanidin mit mindestens 3 Guanidinresten vorgesehen sein. Die Polymere mit diesen Größen können durch Nanofiltration durch Membranen erhalten werden. Zur Nanofiltration können Filter mit entsprechenden Porengrößen zur Durchlässigkeit der gewünschten Molmassen verwendet werden.

Filtrate (zur Entfernung größerer Polymere) oder der Rückstand (zur Entfernung der kleineren Polymere) können weiter verwendet werden um das gewünschte Polymer zu erhalten. Die gewünschten vorzugsweisen polymere Guanidine haben eine verbesserte Toxikologie. Insbesondere der Eliminationen von kurzkettigen Oligomeren und Monomeren, sowie der Elimination von den durch die Synthese eingeschleppten Rückständen der Diamine kommt dabei ein Hauptaugenmerk zu. Dementsprechend werden monomere Ausgangsstoffe (Guanidine) und Oligo- oder Polymere des Guanidin mit einem Molekulargewicht von 250 Da oder kleiner, oder auch von 400 Da oder kleiner, vorteilhafterweise entfernt.

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Als Lösungsmittel in der Zusammensetzung kann beispielsweise Wasser verwendet werden. Bei der Verwendung von Wasser, wird ein gesundheitlich unbedenkliches Lösungsmittel eingesetzt, das günstige Lösungseigenschaften für polymere Guanidine aufweist. Wasser verdunstet zudem ohne Rückstände. Zusätzlich ist eine solche Zusammensetzung auch besonders gut mit Wasser abwaschbar.

Es hat sich gezeigt, dass die Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae besonders effektiv ist, wenn verunreinigte Oberflächen mit einer flüssigen Zusammensetzung beaufschlagt werden. Das Aufbringen der Zusammensetzung kann beispielsweise durch Besprühen, Bestreichen oder Vernebeln erfolgen. Das Vernebeln ist besonders geeignet für die Anwendung in größeren Räumlichkeiten, wie beispielsweise Kinderbetreuungseinrichtungen.

Eine weitere Möglichkeit ist, dass kontaminierte Gegenstände für eine vorgegebene Zeit in die Zusammensetzung getaucht bzw. damit gewaschen werden. Die Verwendung der Zusammensetzung enthaltend ein polymeres Guanidin, insbesondere Akacid Plus, ist dabei besonders vorteilhaft, da die Oberfläche selbst durch die Anwendung keinen Schaden nimmt und somit auch empfindliche Oberflächen desinfiziert werden können.

Die Verwendung einer Zusammensetzung enthaltend polymere Guanidine, insbesondere Akacid Plus, gegen Viren der Familie Picornaviridae hat sich als besonders effizient gezeigt für Viren der Gattung Enterovirus.

Dies ist besonders vorteilhaft, da Viren der Gattung Enterovirus neben der für die Viren der Familie Picornaviridae typischen Beständigkeit gegen alkoholische Desinfektionsmittel und milde Laugen, auch teilweise säurestabil sind.

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Dabei hat sich die Verwendung gegen Viren der Art Humanes Enterovirus A als besonders effizient erwiesen. Es hat sich herausgestellt, dass insbesondere eine gute Wirkung gegen EV71 erzielt werden kann.

Auch die Verwendung gegen die Art der Rhinoviren, inklusive der Unterarten A, B und C, hat gute Ergebnisse gezeigt.

Erfindungsgemäß ist gemäß einem weiteren Aspekt auch eine flüssige Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin zur Verwendung bei der Prophylaxe und der Behandlung von durch Viren der Familie der Picornaviridae hervorgerufene Erkrankungen. Besonders effektiv ist die flüssige Zusammensetzung zur Verwendung bei der Prophylaxe und der Behandlung von durch Viren der Gattung Enterovirus, insbesondere der Arten EV71 und Rhinovirus A, B und C, hervorgerufenen Erkrankungen. Darunter fallen insbesondere Erkrankungen, wie durch EV71 ausgelöste Meningitis, oder Hand-Mund-Fuß-Krankheit. Auch fallen wie durch Rhinoviren ausgelöste Rhinitis,

Enzephalitis

Erkrankungen,

Erkältungen oder Schnupfen darunter.

Besonders einfach und effektiv ist es, wenn die Zusammensetzung in einer für die nasale Applikation geeigneten Darreichungsform, beispielsweise als Nasenspray vorliegt.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der folgenden Beispiele und Figuren ohne Einschränkung des allgemeinen erfinderischen Gedankens beispielhaft erläutert:

Fig. 1 bis 11 zeigen Ergebnisse der Versuche zur Therapiewirkung bei HRV8 mit unterschiedlichen Akacid Plus Konzentrationen

Fig. 12 bis 19 zeigen Ergebnisse der Versuche zur Prophylaxiswirkung bei HRV8 mit unterschiedlichen Akacid / 37

Plus Konzentrationen

Fig. 20 bis 27 zeigen Ergebnisse der Versuche zur Therapiewirkung bei HRV14 mit unterschiedlichen Akacid Plus Konzentrationen

Fig.	28	und	29	zeigen	die
Fig.	30	und	31	zeigen	die
Fig.	32	und	33	zeigen	die
Fig.	34	und	35	zeigen	die

verwendeten Verdünnungsreihen

Versuchsergebnisse für HRV2

Versuchsergebnisse für HRV8

Versuchsergebnisse für HRV16

Beispiel 1: Herstellung eines polymeren Guanidins (z.B. Akacid Plus)

Grundlage der Formulierungen sind Wirkstoffe der Gruppe der Polyguanidine (Akacid, beschrieben in Kratzer et al., Antibiotika Monitor 1/2/2006; Buxbaum et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2006) 58, 193-197; WO 01/85676 A1; WO 2006/047800 A1; WO 2008/080184 A2; WO 2013/064161 A1), Die Herstellung von Akacid Plus wird insbesondere beschrieben in WO 2006/047800 (durch Bezugnahme hierin aufgenommen). Dabei wurden die Ausgangssubstanzen Triethylenglykoldiamin, Hexamethylendiamin und Guanidin Hydrochlorid in einem Verfahren gemeinsam umgesetzt. Vorliegend wurde eine 3:1Mischung aus Polyhexamethylen-guanidinium-chlorid und Poly[2-(-ethoxy)ethoxyethyl)-guanidinium-chlorid verwendet. Diese polymeren Guanidinverbindungen zeigen ein ausgezeichnetes antimikrobielles Profil und sind zudem in der Lage stabile Formulierungen mit schwer mischbaren Substanzen ohne Lösungsvermittler aus der Gruppe der polyethoxylierten nichtionischen Verbindungen zu vermitteln.

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Beispiel 2: Virus Reduktion

Ziel der Forschung war es, die Wirkung von Akacid Plus auf Viren in einem therapeutischen und prophylaktischen Ansatz hinsichtlich der Virusreduktion zu testen. Verwendet wurden hierfür die Zelllinie HeLa-Zellen und getestet wurden Enteroviren, speziell die weitverbreiteten Arten Humaner Rhinovirus 8 (HRV 8) und Humaner Rhinovirus 14 (HRV 14) . Besonders HRV 14 ist ein schwer zu hemmender HRV-Strain.

Im Reduktionstest wurden zwei verschiedene Viren, HRV8 und HRV14, in einem therapeutischen und prophylaktischen Ansatz getestet. Der erste untersuchte Test war die Therapie von HRV8-Infektionen. Nach der Probennahmezeit wurden die Platten gefärbt, um ein Endergebnis zu erhalten.

Fig. 1 zeigt eine vollständige Zerstörung der Zellen bei der höchsten Akacid Plus-Konzentration von 0,125%. Bei kontinuierlicher Abnahme der Konzentration erhöhte sich die Lebensfähigkeit der Testzellen, obwohl die Lebensfähigkeit bei 0,008%, der niedrigsten Konzentration, etwas niedriger war als zuvor. Dennoch zeigte die negative Kontrolle den höchsten gemessenen Wert.

Das erhaltene Ergebnis zeigte, dass die Lebensfähigkeit der Zellen bei der höchsten Konzentration sehr niedrig war und kontinuierlich durch abnehmende Akacid Plus-Konzentration zunahm. Fig. 2 zeigt, dass nach 6 Stunden Inkubation das Muster sehr ähnlich aussah, wie in der ersten Messung. Die Lebensfähigkeit der Zellen nahm mit niedrigerer Akacid PlusKonzentration zu. Die Zellen mit der höchsten Akacid PlusKonzentration überlebten die Testvertiefung, aber bei 0,06% war die gemessene Lebensfähigkeit noch höher. Diese war bei den nächsten zwei Konzentrationen niedriger. Gerade bei der niedrigsten Akacid Plus-Konzentration überlebten mehr Zellen als bei der Konzentration von 0,06%.

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Fig. 5 zeigt, dass nach 33 Stunden am vierten Probennahmepunkt die Zellen bei 0,125% Akacid Plus die niedrigste Viruslast zeigten, da die Zellen vollständig überlebten und sogar die Lebensfähigkeit der Kontrollzellen überstiegen. Auch bei der zweiten Akacid Plus-Konzentration mit 0,063% war das Überleben der Zellen ziemlich hoch.

Die höchste Konzentration von Akacid Plus zeigte im Allgemeinen eine geringere Lebensfähigkeit der Testzellen, aufgrund einer allgemeinen Zytotoxizität, die konzentrationsabhängig zu sein scheint. Nach 33 Stunden schien das Akacid Plus 0,06% sein antivirales Potential auszuüben. Dies kann der verbesserten Lebensfähigkeit der Zellen entnommen werden.

Fig. 9 zeigt, dass das Überleben der Testzellen bei 0,031% Akacid Plus-Konzentration zu Beginn und am Ende des Tests am höchsten war. Fig. 11 zeigt, dass die niedrigste Polymerkonzentration von 0,0078% keine viruzide Wirkung, und damit keine Wirkung auf das Überleben der Zellen, aufwies.

Das gleiche Experiment wurde für einen prophylaktischen Ansatz durchgeführt. Die Behandlung eines infektiösen Virus wurde durchgeführt, bevor die Suspension den Testzellen zugesetzt wurde. Fig. 12 zeigt die Färbung der Testzellen nach der Inkubationszeit von 48 Stunden. Es zeigte sich eine sehr geringe Lebensfähigkeit bei den ersten drei Konzentrationen; darunter überlebten immer mehr Zellen die Behandlung. Die sechste Vertiefung wurde als Kontrolle verwendet. Die Messung bei 650 nm bestätigte einen kontinuierlichen Anstieg des Überlebens der Zellen.

Fig. 13 zeigt, dass nach 6 Stunden Inkubationszeit nur sehr wenige Zellen die beiden ersten Konzentrationen überlebten. Dies könnte zurückzuführen sein auf das Virus oder eine Zytotoxizität von Akacid Plus. In niedrigeren Konzentrationsbereichen war die Lebensfähigkeit der Zellen gerade um die Negativkontrolle sehr hoch. Die ersten beiden / 37

Akacid Plus - Konzentrationen verursachten ein eher geringes Überleben der Zellen, wohingegen die Zellen bei der Konzentration von 0,03% und in niedrigeren Konzentrationen eine hohe Lebensfähigkeit zeigten.

Fig. 15 zeigt den Vergleich der Konzentration an den verschiedenen Probenahmepunkten, wobei eine geringe Lebensfähigkeit bei 6 Stunden für 0,125% zu entnehmen ist, die im Laufe der Zeit signifikant zunahm und ihr PeakÜberleben nach 33 Stunden erreichte. Dort schien Akacid Plus das Abtöten der Zellen durch das Virus zu inhibieren. Nach 48 Stunden schien die Wirkung von Akacid Plus auf das Virus verschwunden zu sein.

Fig. 16 zeigt, dass bei 0,06% Akacid Plus- Konzentration das Experiment kein reales nachweisbares Überleben der Zellen zeigte, da es den maximalen Wert des Graphen bei 0,007 Extinktion annehmen muss. Andere Graphen wurden bis zu 0,25 Extinktion gemessen.

Fig. 17 zeigt, dass bei 0,031% Akacid Plus- Konzentration die Testzellen nach 9h ein konstant gutes Überleben mit einem Peak zeigten. Die Gesamtkurve zeigte eine eher geringe Virusinfektion, da bei keiner Konzentration ein signifikanter Effekt auftrat.

Fig. 18 und 19 zeigen, dass bei der Hälfte der Akacid PlusKonzentrationen ein ähnlicher Effekt nachgewiesen werden konnte.

Fig. 20 zeigt den Startzeitpunkt der Untersuchungen zu HRV14. Aus Fig. 21 kann entnommen werden, dass nach 6 Stunden die Zellen ein konstant hohes Überleben zeigten und es keinen Hinweis auf eine virale Infektion oder toxische Wirkung des Polymers gab. In Fig. 22 wird deutlich, dass drei Stunden später die Zellen sogar eine höhere Lebensfähigkeit zeigten und somit ein Wachstum der Zellen.

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Fig. 23 ist zu entnehmen, dass die prophylaktische Behandlung der Testzellen mit 0,125% Akacid Plus einen ziemlich eindrucksvollen Erfolg zeigte, da die Lebensfähigkeit während der ersten 24 Stunden ziemlich niedrig war, was auf eine hohe Viruslast mit hoher Infektionsrate hinwies. Nach 33 Stunden schien das Akacid Plus sein antivirales Potential auszuüben, da im Vergleich zu den anderen Entnahmezeitpunkten die Zellen in großer Zahl überlebten.

Die Konzentration von 0,03% Akacid Plus gegen das Virus zeigte keine offensichtliche Wirkung. Die Untersuchung des Graphen zeigte keine infektiöse Wirkung des Virus, da die Viabilitätsmessung im Laufe der Zeit mehr oder weniger gleich blieb.

Fig. 23 bis 27 zeigen die Ergebnisse für unterschiedliche Akacid Plus Konzentrationen.

Fig. 26 zeigt, dass es im Fall von 0,016% Akacid Plus eine konstante Abnahme der Lebensfähigkeit der Testzellen innerhalb der ersten 24 Stunden gab. Dies zeigt die Zeit an, die das Virus brauchte, um die Zellen zu infizieren. Nach 33 Stunden Infektion zeigte das Akacid Plus ein antivirales Potential, da das Überleben der Testzellen wieder anstieg. Fig. 27 zeigt ein ähnliches Bild für die niedrigste Konzentration von 0,008% Akacid Plus.

Der Reduktionstest zeigte zu bestimmten Zeitpunkten einen antiviralen Einfluss von Akacid Plus, da die Lebensfähigkeit der Zellen oft schnell abfiel und sie wieder zurückgewann. Dies weist auf eine reduzierte Viruslast zu einem bestimmten Zeitpunkt während der Experimente hin; die Lebensfähigkeit nahm jedoch meistens nach einigen Stunden wieder ab. Akacid Plus hatte somit eine antivirale Wirkung auf beide getesteten Viren.

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Beispiel 3: Virus Therapie und Prophylaxe

Für den therapeutischen Ansatz wurde die Zellplatte 15 Minuten inkubiert, damit das Virus in die Zellen eindringen konnte. Danach wurden 80 pl der noch gefüllten Vertiefungen der Verdünnungsplatte auf die Zellplatte übertragen. Die Platte wurde 48 Stunden inkubiert und danach untersucht. Fig.28 zeigt die Herstellung einer Verdünnungsplatte mit den eingestellten Akacid Plus Konzentrationen.

Für den prophylaktischen Ansatz wurde das Virus zuerst behandelt und mit Akacid Plus inaktiviert. Anschließend wurde die Infektionsfähigkeit des behandelten Virus an vitalen

Zellen getestet. Die inkubiert. Fig. 2 9 Verdünnungsplatte mit Konzentrationen.

Platten werden 48 Stunden lang zeigt die Herstellung einer den eingestellten Akacid Plus

Fig. 30 zeigt, dass die Infektionsrate von HRV2 ziemlich niedrig war, wie in den angefärbten Platten zu sehen ist. Im Therapieansatz waren die ersten vier Konzentrationen von Akacid Plus toxisch. Oberhalb der vierten Konzentration erreichte die Lebensfähigkeit

Kontrolle. Bei der letzten

Lebensfähigkeit wieder ab und zeigt eine Virusinfektion an. Fig. 31 zeigt einen moderaten Effekt auf die prophylaktisch behandelte Platte.

der Zellen die negative Konzentration nahm die

Fig. 32 zeigt, dass im Vergleich zur Negativkontrolle die Zellen nie die vergleichbare Lebensfähigkeit erreicht haben. Dennoch zeigte die Kurve der Therapie eine gute Form, da der therapeutische Effekt zwischen 0,06% und 0,008% Akacid Plus lag. Bei geringerer Dosierung infiziert das Virus die Zellen erneut.

Fig. 33 zeigt für die Prophylaxe einen sehr ähnlichen Effekt mit einer leicht verlängerten Wirkung von Akacid Plus.

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Fig. 34 zeigt die Versuchsergebnisse zu HRV16. Die Färbung zeigte eine toxische Wirkung von Akacid Plus bei den ersten 3 Konzentrationen in der Therapie.

Die Prophylaxe zeigte ein anderes Bild, wie Fig. 35 zu entnehmen ist. Die Therapie schien recht effektiv zu sein, da die Lebensfähigkeit bei der Konzentration von 0,001% eher nahe der Negativkontrolle lag.

Akacid Plus zeigte im therapeutischen Ansatz eine bessere Wirkung. Auch eine prophylaktische Wirkung konnte gezeigt werden. Der beste Effekt wurde gegen HRV 16 erzielt.

Beispiel 4: Verwendung zur Oberflächendesinfektion und zur vorbeugenden Behandlung der Hand-Mund-Fuß-Krankheit

Durch spezielle Maßnahmen und eine spezielle Vorgehensweise wurde in Kindergärten und anderen schulischen Einrichtungen im Raum Peking die Übertragung des Virus durch die Anwendung von Akacid Plus enthaltenden Zusammensetzungen unterbunden. Anders in Einrichtungen, in denen keine Akacid Plus enthaltenden Zusammensetzungen verwendet wurden. Dort kam es zu einer massiven Durchseuchung der Kinder.

Die ergriffenen Maßnahmen waren insbesondere die Verwendung von flüssigen Zusammensetzungen, enthaltend Akacid Plus zur Handwäsche, Desinfektion von Gegenständen, insbesondere von Spielzeug, und die Vernebelung der Räumlichkeiten in Abwesenheit der Kindern und des Personals.

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Beispiel 5: Anwendung gegen durch Rhinoviren Schnupfen

Eine beispielhafte flüssige Zusammensetzung Applikation enthält folgende Bestandteile:

Akacid Plus 0,004

NaCl 0,9% ad 10

Die flüssige Zusammensetzung wird in einer bereitgestellt.

verursachten zur nasalen ^g ^g

Sprühflasche

Claims

1. Verfahren zur Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae mit einer flüssigen Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin.

2. Verwendung einer flüssigen Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin zur Bekämpfung von Viren der Familie Picornaviridae.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren Viren der Gattung Enterovirus sind.

4. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren Viren der Art Humanes Enterovirus A, insbesondere Humanes Enterovirus 71 (EV71) sind.

5. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Viren Viren der Art Rhinovirus A, B oder C sind.

6. Verfahren oder Verwendung jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein anorganisches Lösungsmittel, insbesondere Wasser, enthalten ist.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, zur Desinfektion von durch Viren der Familie Picornaviridae verunreinigten Oberflächen durch Beaufschlagung der Oberfläche mit einer flüssigen Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin.

8. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, einer flüssigen Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres

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Guanidin zur Desinfektion von durch Viren der Familie Picornaviridae verunreinigten Oberflächen.

9. Verfahren oder Verwendung jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Guanidin ein Polyalkylenguanidin oder ein Polyoxyalkylenguanidin ist.

10. Verfahren oder Verwendung jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Guanidin ein polymeres Kondensationsprodukt ist, erhältlich durch Umsetzen von Guanidin oder einem Salz davon, mit einem Alkylendiamin und/oder einem Oxyalkylendiamin, insbesondere mit einem Alkylendiamin und/oder einem Oxyalkylendiamin mit endständigen Aminogruppen.

11. Verfahren oder Verwendung jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Guanidin erhältlich ist durch eine Umsetzung von Guanidin oder einem Salz davon, mit einem Alkylendiamin und einem Oxyalkylendiamin, bei der das Alkylendiamin und das Oxyalkylendiamin im Molverhältnis zwischen 4:1 und 1:4 eingesetzt werden.

12. Verfahren oder Verwendung jeweils nach einem vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Oxyalkylendiamin Triethylenglykoldiamin

Molekularmasse:

der als (relative (relative

148), Polyoxypropylendiamin 230) und/oder Polyoxyethylendiamin (relative 600) vorgesehen ist.

13. Verfahren oder Verwendung jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Guanidin erhältlich ist durch eine Umsetzung von Guanidinhydrochlorid mit Triethylenglykoldiamin oder erhältlich durch eine Umsetzung von Guanidinhydrochlorid mit Hexamethylendiamin und mit Triethylenglykoldiamin.

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14. Verfahren oder Verwendung jeweils nach einem der das aus vorangehenden Ansprüche, polymere Guanidin

Polyhexamethylenguanidin; guanidin (Akacid

Polytriethylenglykolguanidin;

dadurch gekennzeichnet, dass ausgewählt ist

Poly[2-(2-ethoxy)-ethoxyethyl)Plus, [374572-91-5]);

Polyethylenglykolguanidin;

Polyoxypropylenguanidin; Polyoxyethylenguanidin oder einer 3:1-Mischung aus Poly(hexamethylenguanidiniumchlorid) und Poly[2-(2-ethoxy)ethoxyethyl)-guanidiniumchlorid] (Akacid

Plus).

15. Verfahren oder Verwendung jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Guanidin ein Guanidinium Salz ist, vorzugsweise ausgewählt aus einem Halogenid, vorzugsweise einem Chlorid; Phosphat, vorzugsweise einem Dihydrogenphosphat; Karbonat; Nitrat; Sorbat; Acetat, vorzugsweise hydroacetat; Gluconat; Zitrat; Silikat.

16. Verfahren oder Verwendung jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mittlere Molekulargewicht des polymeren Guanidins 200 Da bis 10000 Da ist, vorzugsweise 500 Da bis 3000 Da.

17. Verfahren oder Verwendung jeweils nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung 0,001 - 1 Gew.% polymeres Guanidin enthält, bezogen auf die Gesamtmenge der Zusammensetzung.

18. Flüssige Zusammensetzung enthaltend zumindest ein polymeres Guanidin zur Verwendung bei der Prophylaxe und der Behandlung von durch Viren der Familie der Picornaviridae hervorgerufenen Erkrankungen, insbesondere zur Verwendung bei der Prophylaxe und der Behandlung von durch Viren der Gattung Enterovirus, insbesondere Humanes Enterovirus 71 (EV71) hervorgerufenen Erkrankungen, insbesondere Meningitis,

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Enzephalitis oder Hand-Fuß-Mund-Krankheit, oder von durch Viren der Art Rhinovirus A, B oder C hervorgerufenen Erkrankungen, insbesondere Rhinitis, Erkältungen oder Schnupfen.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 17 ausgebildet ist und/oder dass ein polymeres Guanidin nach einem der Ansprüche 9 bis 16 enthalten ist.

20. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung in einer für die nasale Applikation geeigneten Darreichungsform vorliegt, insbesondere als Nasenspray.