AT502145A1 - Glycosidase-hemmendes iminoalditol - Google Patents

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Description

« ·· ·♦ · · • ·· • · · • · · ··· ·♦ 1
GLYCOSIDASE-HEMMENDES IMINQALDITOL
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Glycosidase-hemmende hninoalditolderivate.
Iminozucker einschließlich Iminoalditolen und verwandte bicyclische Alkaloide sind wohlbekannte, üblicherweise konkurrierende Glycosidasehemmer (Curr. Top. Med. Chem. 2003, 3,471-591; Angew. Chem. Int. Ed Engl. 1999, 38, 750; Acc. Chem. Res. 1998, 31; Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1990,48, 319). Etliche Vertreter dieser Klasse von Verbindungen fanden wichtige Funktionen als diagnostische Verbindungen, wie z.B. bei der Untersuchung von Glycoprotein-schneidenden Glycosidasen, oder als pharmazeutische Substanzen, wie z.B. bei der Behandlung von Symptomen des Diabetes vom Typ Π. Andere, mit deren Glycosidase-hemmenden Eigenschaften zusammenhängende biologische Aktivitäten bestehen in antiviralen, krebshemmenden und metastasenhemmenden, antiinfektiösen sowie insektenfraßverhindemden und pflanzenwachstumsregulierenden Wirkungen.
Vor kurzem fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung heraus, dass einige fluoreszenz-markierte Derivate des Glucosidasehemmers 2,5-Didesoxy-2,5-imino-D-mannit (oder DMDP) starke Hemmstoffe sind, welche die Wirksamkeit der Ausgangsverbindung um zwei Größenordnungen übertreffen (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001,11,1339).
Die vorliegende Erfindung stellt sich die Aufgabe, starke Glycosidasehemmer bereitzustellen, die als diagnostische Verbindungen zu verwenden sind.
Der neuartige Glycosidasehemmer ist ein Iminoalditolderivat und weist die allgemeine Formel I
auf, wobei R1 = H, OH oder NHAc, wobei Ac Acetyl ist; R2 = H oder OH; R3 = H oder OH; R4 = H oder OH und R5 = H oder CH2OH, dadurch gekennzeichnet, dass
NACHGEREICHT 2 ♦♦ ♦··· R ein fluoreszierender Rest oder eine Gruppe YX ist, wobei Y eine Spacergruppe und X ein fluoreszierender Rest ist, mit der Maßgabe, dass R nicht CH2(CH2OCH2)pX ist, wobei p>l.
Eine Derivatisierung am Ringstickstoff wurde üblicherweise mit einem Verlust an hemmender Aktivität von etwa einer Größenordnung in Verbindung gebracht. Im Gegensatz dazu erwiesen sich die erfindungsgemäßen Derivate überraschenderweise als weitaus aktiver. Die erfindungsgemäßen Iminoalditole sind reversible Hemmstoffe und können bei einer Glycosidase-Isolierung und in Reinigungsprotokollen wirksam als Affinitätsliganden eingesetzt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Iminoalditolderivats ist dadurch gekennzeichnet, dass die Spacergruppe Y -(CH2)n- ist, wobei n 0<n<13 ist, oder eine Gruppe -CCH2)mCONH(CH2)o- ist, wobei m 4<m<6 und o l<o<3 ist.
Die ganze Zahl “n” ist vorzugsweise 8>n>4, insbesondere 5 oder 6.
Noch mehr bevorzugte Iminoalditolderivate haben das folgende Substitutionsmuster:
Muster Nr. 1: R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH;
Muster Nr. 2: R1 = H, R2 = OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH;
Muster Nr. 3: R1 = OH, R2 = H, R3 = H, R4 = OH, R5 = CH2OH;
Muster Nr. 4: R1 = NHAc, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH; und Muster Nr. 5: R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = H.
Die Erfindung ist weiters auf diagnostische Mittel gerichtet, welche zumindest ein erfindungsgemäßes Iminoalditolderivat umfassen.
Die erfindungsgemäßen Iminoalditolderivate können gemäß dem folgenden allgemeinen Schema hergestellt werden: Für R = fluoreszierender Rest:
Das jeweilige aktivierte Fluorophor (beispielsweise als Säurehalogenid, Mischanhydrid, aktivierter Ester oder dergleichen oder als die jeweilige Säure/Sulfonsäure zusammen mit einem geeigneten Wirkstoff wie z.B. DCC oder dessen verschiedenen funktionellen Derivaten, oder andere herkömmliche reaktionsfähige Formen, um den jeweiligen
NACHGEREICHT 3
gewünschten Baustein zu liefern) wird zu einer Lösung des jeweiligen Hemmstoffs in einem geeigneten Lösungsmittelsystem hinzugefügt, und die Mischung wird bei einer geeigneten Temperatur gehalten, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist. Das fluoreszierende Produkt wird durch standardmäßige organische Trenn- und Reinigungstechniken isoliert. Für R = YX (Spacergruppe Y, angebracht am fluoreszierenden Rest X):
Der jeweilige aktivierte Spacerarm mit zwei terminalen Funktionalitäten wird zu einer Lösung des jeweiligen Hemmstoffs in einem geeigneten Lösungsmittelsystem hinzugefügt, und die Mischung wird unter geeigneten Bedingungen gehalten, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist. Eine Reinigung durch Standardmittel der analytischen organischen Chemie liefert ein Inhibitor-Y-Addukt.
Die zweite funktionelle Endgruppe im Spacerarm ist nunmehr befreit/aktiviert/bereit zum Verbinden unter geeigneten Reaktionsbedingungen mittels einer synthetischen Methodik nach dem Stand der Technik. Eine standardmäßige Reinigung in dieser Stufe kann sein, ist aber nicht immer notwendig.
Das Hinzufügen des jeweiligen chemisch reaktionsfähigen Fluorophorreagens unter den obenstehend erwähnten Bedingungen oder andere herkömmliche Mittel zum Verbinden unter geeigneten Reaktionsbedingungen liefert bzw. liefern das jeweilige gewünschte Inhibitor-Y-X-System, das mittels einer Standardmethodik gereinigt oder, falls gewünscht, im Rohzustand verwendet werden kann.
Bevorzugte Ausfuhrungsformen werden wie folgt veranschaulicht:
OH OH
HO HO
OH
HO
C
OH HC
HO
NACHGEREICHT 4 • · • · · « · · • · · • · · ·· ···· • ft· • • • ·· • • • ··· • ·· • • · • # • • • • · • • • ·
Ausgehend vom jeweiligen freien Hemmstoff kann der Ringstickstoff z.B. mit 5-Brom-hexannitril alkyliert werden, gefolgt von einer Reduktion des Nitrils zum entsprechenden primären Amin, das wiederum mit den Dansyl- oder Dapoxyl-Fluorophoren umgesetzt wurde, um das jeweilige erfindungsgemäße Iminoalditol zu ergeben.
Allgemeine Verfahrensweisen:
Schritt a: Eine 3%ige Lösung des jeweiligen Iminoalditols in trockenem DMF wurde in
Gegenwart von Na2C03 (1,3 Äquiv.)bei 40 °C 72 h lang mit co-Bromhexannitril (2 Äquiv.) gerührt. Die Entfernung des Lösungsmittels und eine chromatographische Reinigung (CHCb/MeOH 1:1) ergaben die jeweiligen Reaktionsprodukte in Ausbeuten im Bereich zwischen 45 und 90%.
Schritt b: Eine 24-stündige standardmäßige Hydrierung einer 5%igen Lösung des jeweiligen Hexannitrils unter einer H2-Atmosphäre (50 bar) in MeOH und in Gegenwart von Raney-Ni im Überschuss, gefolgt von einer Chromatographie (CHCU/MeOH, konz. NH4OH, 50:50:1), ergab die jeweiligen primären Amine in Ausbeuten zwischen 20 und 60%.
Schritt c: Eine Behandlung der primären Amine (3%ige Lösungen in trockenem DMF) mit dem jeweiligen Fluorophor (Dansyl- oder Dapoxylchlorid, 1,2 Äquiv.) in Gegenwart von Et3N (2 Äquiv.) ergab die entsprechenden fluoreszenzmarkierten Hemmstoffe in Ausbeuten im Bereich zwischen 30 und 60%.
Spektrometrische NMR-Daten der folgenden hninoalditolverbindvmgen Nr. 1-8: NMR-Spektren wurden bei 200 sowie 500 MHz (!H) und bei 50 und 125 MHz (13C) von Proben in MeOH-d4 erfasst, falls nicht anders angegeben. Die chemischen Verschiebungen sind in δ angegeben, wobei ein nicht deuteriertes Restlösungsmittel als interner Standard verwendet wird. Die Signale aromatischer Gruppen wurden in den erwarteten Bereichen vorgefunden und sind nicht explizit aufgelistet.
Iminoalditol Nr. 1: R = (CH2)6NHDansyl, R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH 13C NMR: δ 78,6, 69,5, 68,5,66,1, 58,3, 56,7 (C-l, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6), 49,1 (C-l'), 44,6 (Me2N-Aryl), 42,5 (C-6'), 29,2,26,2,26,0, 23,5 (C-2’, C-3', C-4', C-5'). Ή NMR: δ 3,91 (bd, 1 H, J6a,6b 12,0 Hz, H-6a), 3,83 (dd, 1 H, J5,6b 2,4 Hz, H-6b), 3,53 (m, 1 Η, H-2), 3,42 (dd, 1 H, J3>4 = As 9 Hz, H-4), 3,20 (dd, 1 H, J2>3 9 Hz, H-3), 3,08 (m, 1 H, H-la), 2,90 (m, 7
NACHGEREICHT 5 5 • ·· · • ·· ·· ·· > · · ) · · · · H, H-l'a, Me2N-Aryl), 2,66 (m, 1 H, H-IT)), 2,38 (m, 2 H, H-le, H-5), 1,42 - 1,05 (m, 8 H, H-2', H-3', H-4', H-5').
Iminoalditol Nr. 2: R = (CH2)6NHDapoxyl, R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 =
CH2OH 13C NMR: δ 79,4, 70,9, 69,6, 66,2, 58,3, 56,2 (C-l, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6), 52,5 (C-l'), 42,8 (C-6'), 39,2 (Me2N-Aryl), 29,5, 26,9,26,3,24,0 (C-21, C-3', C-4', C-5'); *H NMR: δ 3,85 (dd, 1 H, J5,6a 2 Hz, J6a,eb 12,7 Hz, H-6a), 3,81 (dd, 1 H, J5,6b 3 Hz, H-6b), 3,45 (ddd, 1 H, t/ia,2 = Ji,3 9,8 Hz, Jle,2 4,9 Hz, H-2), 3,33 (dd, 1 H, J3)4 8,8 Hz, H-4), 3,20 (dd, 1 Η, H-3), 2,96 (dd, 1 H, Jia,ie 10,8 Hz, H-la), 2,90 (t, 2 Η, H-l'), 2,76 (m, 1 H, H-6'a), 2,50 (m, 1 Η, H-6'b), 2,14 (dd, 1 H, H-le), 2,08 (m, 1 H, H-5), 1,50 - 1,17 (m, 8 H, H-2', H-3', H-4', H-5').
Iminoalditol Nr. 3: R = (CH2)5CONH(CH2)2NHDansyl, R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH 13C NMR: δ 'H NMR: δ 175,3 (C=0), 79,2 (C-3), 70,6 (C-4), 69,3 (C-2), 66,2 (C-5), 57,9 (C-6), 56,3 (C-l), 52,4 (C-l’), 44,7 (Me2N-Aryl), 42,1 (C-5’), 39,1 (C-7’), 35,6 (C-8'), 26,8, 25,4, 23,7 (C-2', C-3’, C-4'). 'H NMR: δ 3,86 (m, 2 H, H-6a, H-6b), 3,49 (ddd, 1 H, H-2), 3,37 (dd, 1 H, JiA 10,3 Hz, H-4), 3,15 (dd, 1 H, J3(2 8,8 Hz, H-3), 3,17 (t, 2 H-6’), 3,02 (dd, 1 H, yia,ie 10,9 Hz, J,e>24,9 Hz, H-le), 2,92 (t, 2 Η, H-7'), 2,88 (s, 6 H, Me2N-Aryl), 2,85 -2,79 (m, 1H, H-l’), 2,63 - 2,58 (m, 1 H, H-l’), 2,23 (dd, 1 H, yw 11,2 Hz, H-la), 2,19 (m, 1 H, H-5), 2,01 (t, 2 H, H-5'), 1,56 -1,45 (m, 4 H, H-3', H-4'), 1,30 - 1,20 (m, 2 H, H-2').
Iminoalditol Nr. 4: R = (CH2)6NHDansyl, R1 = H, R2 = OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH. I3C NMR: δ 74,7, 67,9, 67,8, 66,0, 57,2, 55,0 (C-l, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6), 52,7 (C-l’), 44,7 (Me2N-Aryl), 42,5 (C-6'), 29,2,26,5, 26,0,23,6 (C-2’, C-3', C-4', C-5’). *H NMR: δ 3,91 (m, 2 H, H-2, H-6a), 3,84 (dd, 1 H, J5,6b 2 Hz, J6a,6b 11,7 Hz, H-6b), 3,73 (dd, 1 H, J3>4 8,8 Hz, /4)5 9,3 Hz, H-4), 3,37 (dd, 1 H, J2,3 2,4 Hz, H-3), 3,04 (bs, 1 H, H-la), 2,90 (s, 6 H, Me2N-Aryl), 2,86 (t, 2 Η, Η-Γ), 2,76 (m, 1 H, H-6'a), 2,44 (m, 2 H, H-le, Η-6Τ)), 2,32 (bs, 1 H, H-5), 1,40 - 1,10 (m, 8 H, H-2', H-3', H-4', H-5').
Iminoalditol Nr. 5: R = (CH^NHDapoxyl, R1 = H, R2 = OH, R3 = OH, R4 = H, R5 -CH2OH.
NACHGEREICHT 6 ·· ·· ·· ···· · ·· • · · · · · ···« • · · · ··· ··· · ·· ······ · ··· ······ φ ··« 13C NMR: δ 75,4, 68,5,68,4,65,8, 58,0,55,3 (C-l, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6), 52,5 (C-l’), 42,8 (C-6'), 39,2 (Me2N-Aryl), 29,4,26,9,26,3,24,0 (C-2’, C-3', C-4', C-5'). 'H NMR: δ 3,87 (dd, 1 H, Js,6a 2,4 Hz, J6a,6b 11,7 Hz, H-6a), 3,83 (dd, 1 H, J5,6h 2,4 Hz, H-6b), 3,79 (m, 1 H, H-2), 3,64 (dd, 1 H, JXA 9,3 Hz, J4,s 8,8 Hz, H-4), 3,28 (dd, 1 H, J2,3 3,3 Hz, H-3), 3,01 (s, 6 H, Me2N-Aryl), 2,92 (m, 3 H, H-la, Η-Γ), 2,71 (m, 1 H, H-6'a), 2,51 (m, 1 Η, Η-όΊι), 2,40 (dd, 1 H, J\e,21,5 Hz, Jla,,e 12,2 Hz, H-le), 2,07 (ddd, H-5), 1,50-1,16 (m, 8 H, H-2', H-3', H-4’, H-5’).
Iminoalditol Nr. 6: R = (CH2)6NHDansyl, R1 = OH, R2 = H, R3 = H, R4 = OH, R5 = CH2OH 13C NMR: δ 74,6, 70,3, 66,4, 64,7, 60,2, 54,9, 52,9 (C-l, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6, C-l’), 44,6 (Me2N-Aryl), 42,4 (C-6'), 29,2,26,3,25,9,23,1 (C-2’, C-3', C-4’, C-5'). 'H NMR: δ 3,97 (dd, 1 H, H-4), 3,78 (ddd, 1 H, H-2), 3,74 (m, 2 H, H-6a, H-6b), 3,20 (dd, 1 H, J2i3 9,3 Hz, J3A 3,4 Hz, H-3), 2,91 (dd, 1 H, Jla,Xe 11,3 Hz, JXa,2 4,9 Hz, H-le), 2,90 (s, 6 H, Me2N-Aryl), 2,85 (t, 2 Η, H-l'), 2,58 (m, 1 H, H-6’a), 2,37 (m, 1 H, H-6'b), 2,52 (m, 1 H, H-5), 2,06 (dd, 1 H, Jie,2 10,3 Hz, H-la), 1,35 - 0,97 (m, 8 H, H-2', H-3', H-4', H-5').
Iminoalditol Nr. 7: R = (CH2)6NHDansyl, R1 = NHAc, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH ,3C NMR: δ 172,4 (CO), 76,5,71,5,66,2, 58,4, 54,4, 52,2 (C-l, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6), 50,7 (C-l’), 44,7 (Me2N-Aryl), 42,6 (C-6’), 29,3,26,7,26,1,24,1 (C-2’, C-3’, C-4', C-5’), 21,6 (COMe). *H NMR: δ 3,86-3,78 (m, 3 H, H-2, H-6a, H-6b), 3,39 (dd, 1 H, J3A = J4y5 9,3 Hz, H-4), 3,21 (dd, 1 H, J2y3 9,8 Hz, H-3), 2,97 (dd, JXa,2 4,4 Hz, Ju,ie 11,2 Hz, H-le), 2,89 (s, 6 H, Me2N-Aryl), 2,84 (t, 2 H, H-l'), 2,68 (m, 1 H, H-6’a), 2,43 (m, 1 Η, Η-6Τ3), 2,12 (m, 1 H, H-5), 2,07 (dd, 1 H, JXe,2 11,2 Hz, H-la), 1,98 (s, 3 H, COMe). 1,34 - 0,65 (m, 8 H, H-2’, H-3’, H-4’, H-5’).
Iminoalditol Nr. 8: R = (CH2)6NHDansyl, R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = H. ,3C NMR: δ 79,2 (C-3), 70,2 (C-2, C-4), 58,3 (C-l, C-5), 57,6 (C-l’), 44,7 (Me2N-Aryl), 42,5 (C-6’), 29,2,26,7,26,3,26,1 (C-21, C-3’, C-4’, C-5’). ‘H NMR: δ 3,23 (ddd, 2 H, J2>3 = J3.4 8,8 Hz, H-2, H-4), 2,84 (dd, 1 H, H-3), 2,68 (m, 2 H, Jua = JAJSe 4,7 Hz, H-le, H-5e), 2,64 (s, 6 H, Me2N-Aryl), 2,60 (dd, 2 H, Jia,2 = J4,5a 10,3 Hz, JXa,Xe = J5a,5e 11,0 Hz, H-la, H-5a), 2,01 (t, 2 H, H-l’), 1,70 - 0,77 (m, 8 H, H-2’, H-3’, H-4’, H-5’).
NACHGEREICHT 7 ·· ·· ·· • · · · · • · · · ··· • · · · · · • · · · · · ···· · ·· • ·· · · ··· · ·· • · · · • · · t
Messung der hemmenden Wirkung von bevorzugten Iminoalditolderivaten
Die hemmende Wirkung wurde gemäß den folgenden Verfahrensweisen bestimmt:
Agrobacterium sp. ß-Glucosidase wurde gereinigt und analysiert so wie beschrieben (Prade, H.; Mackenzie, L.F.; Withers, S.G. Carbohydr. Res. 1998, 305, 371; Kempton, J.B.; Withers, S.G. Biochemistry 1992,31,9961-9969). Kinetische Studien wurden bei 37 °C in pH 7,0-NatriumphosphatpufFer (50 mM), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin, durchgeflihrt, wobei 7,2 x 10'5 mg/ml Enzym verwendet wurden. Ungefähre Kj-Werte winden unter Anwendung einer festgelegten Substratkonzentration bestimmt, schließlich wurden die 4-Nitrophenyl-ß-D-glucopyranosid-Konzentration (0,11 mM = 1,5 x Km) und die Hemmstoffkonzentrationen im Bereich vom 0,2- bis 5-fachen des Kj-Werts bestimmt. Eine durch 1/Vmax gezogene Horizontallinie in einem Dixon-Diagramm dieser Daten (1/V versus [I]) schneidet die Experimentallinie bei einer Hemmstoffkonzentration, die -Kx entspricht. Wo erforderlich, wurden vollständige Kj-Bestimmungen durchgeflihrt, wobei derselbe Bereich von Hemmstoffkonzentrationen verwendet wurde, während die Substrat (4-Nitrophenylglucosid)-Konzentrationen ebenfalls von ungefähr 0,015 mM bis 0,6 mM variiert wurden. Die Daten wurden unter Anwendung des GraFit-Programms durch direkte Anpassung an die Michaelis Menten-Gleichung analysiert, welche die Reaktion in Gegenwart von Hemmstoffen beschreibt (Leatherbarrow, RJ. Grafit 4.0, Erthacus Software, Staines, U.K., 1992). α-Mannosidase von der Jackbohne wurde bei Sigma erworben. Kinetische Studien wurden bei 25 °C in pH 6,8-Natriumphosphatpuffer (50 mM), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin, λ durchgeführt, wobei 3,7 x 10 mg/ml Enzym verwendet wurden. Ungefähre ÄTj-Werte wurden unter Anwendung einer festgelegten Substratkonzentration bestimmt, schließlich wurden die 4-Nitrophenyl-a-D-mannopyranosid-Konzentration (1,3 mM = 1,5 x Km) und die Hemmstoffkonzentrationen im Bereich vom 0,2- bis 5-fachen des Kj-Werts bestimmt. Eine durch 1/Vmax gezogene Horizontallinie in einem Dixon-Diagramm dieser Daten (1/V versus [I]) schneidet die Experimentallinie bei einer Hemmstoffkonzentration, die -K\ entspricht.
Agrobacterium sp. ß-Galactosidase siehe Agrobacterium sp. ß-Glucosidase (Prade, H.; Mackenzie, L.F.; Withers, S.G. Carbohydr. Res. 1998,305, 371; Kempton, J.B.; Withers, S.G. Biochemistry 1992,31,9961-9969), es wurden Bedingungen wie für Glucosesubstrate, einschließlich der Verwendung von pNP-Glucose als Substrat, eingesetzt (K\ ist unabhängig davon, mit welchem Substrat es gemessen wird).
NACHGEREICHT JV-Ac-ß-D-Hexosaminidase von Streptomyces Sp. Hex. wurde kloniert und in E. coli exprimiert so wie zuvor beschrieben (Mark, B. L.; Vocadlo, D. J.; Knapp, S.; Triggs-Raine, B. L.; Withers, S. G.; James, Μ. N. G. J. Biol. Chem. 2001,276,10330-10337). Kinetische Studien wurden bei 37 °C in pH 5,0-Citratphosphatpuffer (50 mM), enthaltend 75 mM Natriumchlorid und 6,5 x 10'5 mg/ml Enzym, durchgefuhrt. Ungefähre Aj-Werte wurden unter Anwendung einer festgelegten Substratkonzentration bestimmt, schließlich wurden die 4-Nitrophenyl-ß-D-TV-acetylglucosamin-Konzentration (0,14 mM = 2 x Am) und die Hemmstoffkonzentrationen im Bereich vom 0,2- bis 5-fachen des Ai-Werts bestimmt. Eine durch 1/Vmax gezogene Horizontallinie in einem Dixon-Diagramm dieser Daten (1/V versus [I]) schneidet die Experimentallinie bei einer Hemmstoffkonzentration, die -Aj entspricht. ß-Xylosidase von Thermoanaerobact. sacch. XynB wurde kloniert und in E. coli exprimiert so wie zuvor beschrieben (Vocadlo, D. J.; Wicki, J.; Rupitz, K.; Withers, S. G. Biochemistry 2002,41,9736-9746). Kinetische Studien wurden bei 37 °C in pH 5,5-Natriumcitratpuffer (50 mM), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin, durchgefuhrt. Ungefähre Ai-Werte wurden unter Anwendung einer festgelegten Substratkonzentration bestimmt, schließlich wurden die 4-Nitrophenyl-ß-D-xylopyranosid-Konzentration (0,1 mM = 2,7 x Am) und die HemmstofF-konzentrationen im Bereich vom 0,2- bis 5-fachen des Aj-Werts bestimmt. Eine durch 1/Vmax gezogene Horizontallinie in einem Dixon-Diagramm dieser Daten (1/V versus [I]) schneidet die Experimentallinie bei einer Hemmstoffkonzentration, die -K\ entspricht.
Das Ergebnis ist in den folgenden Tabellen 1-5 dargelegt. Diese Tabellen zeigen die hemmende Wirkung (Kj-Werte) der erfmdungsgemäßen Iminoalditole im Vergleich zur Ausgangsverbindung (R = H). “a” bezeichnet ß-Glucosidase von Agrobacterium sp., “b” bezeichnet α-Mannosidase von Jackbohnen, “c” bezeichnet ß-Galactosidase von Agrobacterium sp., “d” bezeichnet ß-D-Hexosaminidase von Streptomyces plicatur und “e” bezeichnet ß-Xylosidase von Thermoanaerobact. Sacch.
Tabelle 1
NACHGEREICHT
Verbindung ΚΐΓμΜΙ Ausgangsverbindung: R = H, R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H,R5 = CH2OH 12a Iminoalditol Nr. 1: R = (CH2)6NHDansyl, R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH 0,32a Iminoalditol Nr. 2: R = (CH^NHDapoxyl, R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH 1,0" 9
Iminoalditol Nr. 3: R = (CH2)5CONH(CH2)2NHDansyl, R1 = 0,14a OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH
Tabelle 2 Verbindung ΚΐΓμΜ] Ausgangsverbindung: R = H, R1 = H, R2 = OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH 600b Iminoalditol Nr. 4: R = (CH2)6NHDansyl, R1 = H, R2 = OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH 65b Iminoalditol Nr. 5: R = (CH2)6NHDapoxyl, R1 = H, R2 = OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH 95b
Tabelle 3 Verbindung ΚΐΓμΜΙ Ausgangsverbindung: R = H, R1 = OH, R2 = H, R3 = H, R4 = OH, R5 = CH2OH 12,5C Iminoalditol Nr. 6: R = (CH2)6NHDansyl, R1 = OH, R2 = H, R3 = H, R4 = OH, R5 = CH2OH 0,95c
Tabelle 4 Verbindung _Κΐ[μΜ]_ Ausgangsverbindung: R = H, R1 = NHAc, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH •o O 00 Iminoalditol Nr. 7: R = (CH2)6NHDansyl, R1 = NHAc, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH l,8d
Tabelle 5 Verbindung ΚΐΓμΜΙ Ausgangsverbindung: R = H, R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = h,r5=h 206e
NACHGEREICHT
Iminoalditol Nr. 8: R = (CH2)6NHDansyl, R1 = OH, R2 = H, 7,6e R3 = OH,R4 = H,R5 = H
Literaturhinweise und Anmerkungen 1) Beispielsweise: Iminosugars: Recent Insights into their Bioactivity and Potential as Therapeutic Agents, Martin, O. R.; Compain, P., Hrsg., Curr. Top. Med. Chem. 2003, 3, 471-591; From lianas to glycobiology tools: Twenty-five years of 2,5-dideoxy-2,5-imino-D-mannitol, Wrodnigg, T. M. In Timely Research Perspectives in Carbohydrate Chemistry, Schmid, W.; Stütz, A. E. (Hrsg.), Springer: Wien, New York, 2002, S. 43-76; Heightman, T. D. ; Vasella, A. T. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999, 38,750; Iminosugars as Glycosidase Inhibitors, Stütz, A. E., Hrsg.; Wiley-VCH: Weinheim, 1999; Bois, M. Acc. Chem. Res. 1998, 31,1; Legier, G. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1990, 48, 319. 2) Spiro, R. G. In Carbohydrates in Chemistry andBiology, Emst B.; Hart, G. W.; Sinay, P., Hrsg.; Wiley-VCH, Weinheim, 2000, Part Π: Biology of Saccharides, Band 3, S. 65-79; Elbein, A. D.; Molyneux, R. J. In Iminosugars as Glycosidase Inhibitors, Stütz, A. E. , Hrsg.; Wiley-VCH: Weinheim, 1999; S. 216-251.
3) Miglitol® von BAYER 4) Simmonds, M. S. J.; Kite, G. C.; Porter, E. A. In Iminosugars as Glycosidase Inhibitors, Stütz, A. E., Hrsg.; Wiley-VCH: Weinheim, 1999; S. 8-30. 5) De Raadt, A.; Ekhart, C.; Legier, G.; Stütz, A. E. In Iminosugars as Glycosidase Inhibitors, Stütz, A. E., Hrsg.; Wiley-VCH: Weinheim, 1999; S. 207-215. 6) Hermetter, A.; Scholze, H.; Stütz, A. E.; Withers, S. G.; Wrodnigg, T. M. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001,11,1339.
NACHGEREICHT

Claims (9)

  1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Iminoalditolderivat mit der allgemeinen Formel I
    R wobei R* = H, OH oder NHAc, wobei Ac Acetyl ist; R2 = H oder OH; R3 = H oder OH; R4 = H oder OH und R5 = H oder CH2OH, dadurch gekennzeichnet, dass R ein fluoreszierender Rest oder eine Gruppe YX ist, wobei Y eine Spacergruppe und X ein fluoreszierender Rest ist, mit der Maßgabe, dass R nicht CH2(CH20CH2)pX ist, wobei p>l.
  2. 2. Iminoalditolderivat gemäß Anspruch 1, wobei die Spacergruppe Y -(CH2)n- ist, wobei n 0<n<13 ist, oder eine Gruppe -(CH2)mCONH(CH2)o- ist, wobei m 4<m<6 und o l<o<3 ist.
  3. 3. Iminoalditolderivat gemäß Anspruch 2, wobei 8>n>4, insbesondere 5 oder 6.
  4. 4. Iminoalditolderivat gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei R1 = OH, R2 = H, R3 = OH,R4 = H,R5 = CH2OH.
  5. 5. Iminoalditolderivat gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei R1 = OH, R2 = H, R3 = H, R4 = OH, R5 = CH2OH.
  6. 6. Iminoalditolderivat gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei R1 = NHAc, R2 = H, R3 = OH,R4 = H,R5 = CH2OH. NACHGEREICHT
  7. 7. Iminoalditolderivat gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = H, R5 = H.
  8. 8. Iminoalditolderivat gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei R1 = H, R2 = OH, R3 = OH, R4 = H, R5 = CH2OH.
  9. 9. Diagnostische Mittel, umfassend zumindest ein Iminoalditolderivat gemäß einem der Ansprüche 1-8. NACHGEREICHT
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