AT414171B - Verfahren zur diagnose des down-syndroms - Google Patents

Description

3

AT 414 171 B

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostizierung von Down-Syndrom in einer Körperflüssigkeits- oder Gewebeprobe.

Down-Syndrom (DS) ist der häufigste, mit einer geistigen Behinderung verbundene Geburtsfeh-5 ler und tritt mit einer Häufigkeit von 1 bei 700-800 Lebendgeburten auf. Es resultiert aus einer Trisomie von Chromosom 21, wovon 95% freie Trisomien und der Rest Mosaike sind oder eine Translokation-Trisomie 21 aufweisen (Antonarakis, 1998; Epstein, 2001). DS ist mit einer Entwicklungsstörung verbunden, gefolgt von Neurodegenerationsprozessen, von welchen man weiß, dass sie sich in späteren Altersstufen plötzlich einstellen. Diese neurodegenerativen io Veränderungen sind durch eine progressive Akkumulation von senilen Plaques und Neurofibrillengewirr gekennzeichnet und treten mit einer ähnlichen regionalen Verteilung wie bei Morbus Alzheimer auf (Wisniewski et al., 1985; Mann, 1988; Cork, 1990).

Die den pathologischen Veränderungen bei DS zu Grunde liegenden molekularen Mechanis-15 men sind nicht bekannt, und man weiß auch nicht, ob sie die Entwicklungsstörung reflektieren oder degenerative Prozesse sind. Außerdem wurden, während bestimmte Aspekte der morphologischen Entwicklung der Großhirnrinde bei DS während der Schwangerschaft normal zu sein scheinen, Anomalien in der postnatalen Periode entdeckt (Takashima et al., 1981; Becker et al., 1991). Dies weist darauf hin, dass Abnormitäten höchstwahrscheinlich im letzten Trimester 20 auftreten oder Abnormitäten auch im zweiten Trimester existieren, jedoch in einem unterschwelligen Bereich liegen, um irgendwelche signifikante morphologische Veränderungen zu bewirken.

Zusätzlich zur geistigen Behinderung weisen Individuen mit DS eine Reihe neuropathologischer 25 Merkmale auf, einschließlich einer Verringerung der Gehirngröße, einer abnormen neuronalen Migration, Differenzierung und abnormen Dendriten-Verzweigung. Es ist jedoch noch immer unbekannt, wie drei Kopien normaler Gene am Chromosom-21-Segment zu einer komplexen Stoffwechsel- und Entwicklungsstörung führen können. 30 DS wird gewöhnlich pränatal durch eine Chromosomen-Analyse der Fötal-Flüssigkeits-Punktierung oder durch (Ultraschall)-morphologische Analyse diagnostiziert. Diese Tests sind jedoch nicht für den Nachweis von Mosaik-Formen des DS geeignet (etwa 2 bis 4%). Gewöhnlich sind alle Zellen des Körpers für Chromosom 21 trisomal. Bei Mosaik-Formen des DS gibt es zwei Zell-Populationen, eine diploide, eine mit Trisomie. 35

Dieser Mosaik-Zustand kann sich entweder aus einer meiotischen oder einer mitotishen Nondis-junction ergeben. Bei meiotischer Nondisjunction findet die Nondisjunction während der frühen Embryogenese statt, um sowohl 47.+21 und 45.-21 Zell-Populationen zu erzeugen, wobei die monosomen Zellen vermutlich während des embryonalen und fötalen Lebens verloren gehen. 40 Auf Grund einer Analyse des Alters der Mütter zum Zeitpunkt der Geburt wurde geschätzt, das etwa 20% der phänotypisch erkannten Mosaik-Formen mitotischen Ursprungs sind. Es wurde auch vorgeschlagen, dass es mit zunehmendem Alter einen gesteigerten Verlust an Chromosom 21 gibt, was zum vermehrten Auftreten eines geringgradigen Mosaik-Zustands führt. Es kann auch ein Mosaik-Zustand für die anderen Arten von Chromosom-Abnormitäten vorliegen, 45 die zum Vorhandensein eines extra-Chromosoms 21 q führen.

Der Nachweis und die Quantifizierung eines Mosaik-Zustands birgt ernste methodologische Probleme, insbesondere wenn der Anteil trisomaler Zellen niedrig ist. so Andere Arten von Veränderungen des Chromosoms 21 (Translokationen, somatische Trisomie 21 in Gehirnzellen, andere Fälle mit Isochromosom 21,...) stellen auch große Probleme für eine richtige Diagnose dar.

Bemert et al. (Bernert et al., 2002) verglichen das Proteinexpressionsmuster von DS Patienten 55 und von gesunden Individuen. Dabei stellten die Autoren fest, dass das Kern-Matrix-Protein 4

AT 414 171 B

Matrin 3, das Zellskelett-Motor-Protein HMP, das zirkadische Uhr-Protein hlark und das C80RF2-Protein in DS Patienten im Vergleich zu gesunden Individuen eine reduzierte Expressionsrate aufwiesen. 5 Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, geeignete Mittel für die Diagnose des Down-Syndroms vorzusehen. Diese Mittel sollten vorzugsweise für eine frühe pränatale Diagnose geeignet sein.

Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren von Down-Syndrom io vor, welches die folgenden Schritte umfasst: - Vorsehen einer Amnionflüssigkeitsprobe, einer Blut- oder Serumprobe einer schwangeren Frau oder einer Gehirn-Gewebeprobe, - Bestimmen der Menge mindestens eines der Proteine ausgewählt aus der Gruppe bestehend 15 aus Hämatopoietin-Adapter enthaltend die Src-Homologie 3-Domäne und sterile a-Motive (HACS1) (hematopoietic adapter containing Src homology 3 domain and sterile α motifs), Dop-pelstrang-Bruch-Reparatur-Protein rad 21-Homolog (double-strand break repair protein rad 21 homologue), eukaryontischer Translationsfaktor 3-Untereinheit 5 (eukaryotic translation factor 3 subunit 5), mixed-lineage-Leukämie-Septin-artiges Fusions-Protein B (mixed-lineage leukemia 20 septin-like fusion protein-B), Hitzeschock-Protein 75 (heat shock protein 75), ß-Amyloid-Vorläufer-artiges Protein 1 (ß-amyloid precursor-like protein 1), Tropomyosin-4-anaplastisches Lymphom-Kinase-Fusions-Onkoprotein Typ 2 (tropomyosin 4-anaplastic lymphoma kinase fusion oncoprotein type 2), Nck-Adaptor-Protein 2 (Nck adaptor protein 2), Src-Homologie-Domänen-Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenes 2-artiges Endophilin B2 (Src homology 25 domain growth factor receptor bound 2-like endophilin B2), Septin 7 und hämatopoietische Stamm/Progenitor-Zellen 140 (HSP 140) (hematopoietic stem/progenitor cells 140), - Vergleichen der nachgewiesenen Menge mit einer Standard-Menge des (der) entsprechenden Proteins (Proteine) in einer nicht-Down-Syndrom-Probe, die der Amnionflüssigkeitsprobe, der Blut- oder Serumprobe einer schwangeren Frau oder der Gehirn-Gewebeprobe entspricht, und 30 - Diagnostizieren von Down-Syndrom, wenn die nachgewiesene Menge unter der Standard-

Menge liegt, wenn die Menge des Hämatopoietin-Adapters enthaltend die Src-Homologie 3-Domäne und sterile α-Motive (HACS1) (hematopoietic adapter containing Src homology 3 domain and sterile α motifs), ß-Amyloid-Vorläufer-artigen Proteins 1 m (ß-amyloid precursor-like protein 1), Tropomyosin-4-anaplastischen Lymphom-Kinase-Fusions-Onkoproteins Typ 2 (tro-35 pomyosin 4 anaplastic lymphoma kinase fusion oncoprotein type 2), Nck-Adaptor-Proteins 2 (Nck adaptor protein 2), Src-Homologie-Domänen-Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenen 2- artigen Endophilins B2 (Src homology domain growth factor receptor bound 2-like endophilin B2), Septins 7 oder der hämatopoietischen Stamm/Progenitor-Zellen 140 (HSP 140) (hematopoietic stem/progenitor cells 140) bestimmt wird, oder 40 - Diagnostizieren von Down-Syndrom, wenn die nachgewiesene Menge über der Standard-

Menge liegt, wenn die Menge des Doppelstrang-Bruch-Reparatur-Protein rad 21-Homologs (double-strand break repair protein rad 21 homologue), eukaryontischen Translationsfaktors 3- Untereinheit 5 (eukaryotic translation factor 3 subunit 5), mixed-lineage-Leukämie-Septin-artigen Fusions-Proteins B (mixed lineage leukemia septin-like fusion protein-B) oder des Hitze- 45 schock-Proteins 75 (heat shock protein 75) bestimmt wird.

Alle diese Proteine erwiesen sich als geeignete Marker-Moleküle für DS. Diese Marker-Funktion wurde auch durch medizinische Statistiken für alle obigen Proteine bestätigt. so Diese Proteine und die Gene dazu sind bereits im Stand der Technik geoffenbart, z.B. als Gen-Bank-Eintragungen oder als von Fachleuten überprüfte Veröffentlichung oder beides. Hinweis auf diese Proteine oder Gene wird immer als Hinweis auf diese Eintragungen oder Veröffentlichungen angesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre Aminosäure/Nukleinsäure-Sequenzen (auch im Fall von mehr als einer Sequenz-Variation). Es ist klar, dass für den Nachweis oder die 55 Bestimmung jedes dieser Proteine/Gene nicht nur die Proteine oder Gene (mRNA, cDNA) als 5

AT 414 171 B

Ganzes für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sondern auch charakteristische Fragmente dieser Proteine oder Gene, solange eine spezifische Bestimmung/ein spezifischer Nachweis möglich ist. 5 Die Standard-Menge eines Proteins in einer nicht-DS-Probe kann jeder geeignete Standard sein, z.B. eine gepoolte Proben-Stammlösung von gesunden Individuen, ein Standard-Wert, der vorzugsweise mittels derselben Techniken bestimmt wurde wie die Nachweismethode für den vorliegenden Test, eine von einem, zwei, drei oder fünf bis zehn nicht-DS-lndividuen genommene Probe. Bei der Evaluierung, ob eine nachgewiesene Menge über oder unter einer Stan-io dard-Menge liegt, können übliche Durchschnittsbereiche sowie vernünftige Ausschluss-Werte in Betracht gezogen werden. Beispielsweise kann die DS-Diagnose erstellt werden, wenn die bestimmte Menge mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 50%, insbesondere 70% unter oder über dem Standard-Wert oder dem Standard-Wert-Bereich liegt. Standard-Werte, Stan-dard-Wert-Bereiche und geeignete Ausschluss-Werte zur Diagnostizierung des „darüber“ und 15 „darunter“ können auch bestimmt und infolge zukünftiger Standardisierungs-Komitees verändert werden.

Da fötale Zellen im Blut der Mutter vorhanden sind, können geeignete Proben auch vom Blut oder Serum einer schwangeren Frau entnommen werden. 20

Natürlich ist das vorliegende Verfahren auch zum Analysieren von mittels Amniozentese entnommenen Proben geeignet. Fötal-Flüssigkeit, die Fötus-Zellen umfasst, sind daher auch bevorzugte gemäß der vorliegenden Erfindung zu untersuchende Proben. 25 Das Mittel zum Bestimmen der Menge des Proteins (der Proteine) ist nicht von wesentlicher Bedeutung. Vorzugsweise wird die Menge des Proteins (der Proteine) durch ein Verfahren, bestimmt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Protein-Massenspektroskopie, Antikörper-Bindung, zweidimensionele Gel-Elektrophorese oder Kombinationen davon. 30 Anderseits kann die Menge der Proteine auch durch Bestimmen der Menge an mRNA des jeweiligen Proteins bestimmt werden. Dies kann vorzugsweise durch Hybridisierungs-Technologie, insbesondere unter Verwendung von DNA-Chips, oder Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden, insbesondere kompetitive PCR, erreicht werden. Für die vorliegende Erfindung ist auch die cDNA als mRNA anzusehen, die mit dem vorliegenden Verfahren zu bestimmen ist. 35

Das vorliegende Verfahren ist besonders zur Bestimmung einer Vielzahl von Proteinen gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet. Daher ist es bevorzugt, gleichzeitig die Menge von drei oder mehr, vorzugsweise acht oder mehr, insbesondere zehn oder mehr dieser Proteine in der Probe zu bestimmen. Das vorliegende Verfahren kann auch mit anderen Tests kombiniert 40 werden, insbesondere anderen Tests, die zur pränatalen Diagnose verwendet werden, z.B. Tests auf Stoffwechsel-Enzyme oder andere Marker für potentielle genetische Schäden.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Bestimmung der Menge des Proteins unter Verwendung eines Chips, vorzugsweise eines mRNA-Chips oder 45 eines Antikörper-Chips.

Gemäß einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung auch ein Set zum Bestimmen der Menge von mindestens zwei Proteinen in einer Probe vor, wobei die mindestens zwei Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hämatopoietin-Adapter enthaltend die so Src-Homologie 3-Domäne und sterile α-Motive (HACS1) (hematopoietic adapter containing Src homology 3 domain and sterile α motifs), Doppelstrang-Bruch-Reparatur-Protein rad 21-Homolog (double-strand break repair protein rad 21 homologue), eukaryontischem Translationsfaktor 3-Untereinheit 5 (eukaryotic translation factor 3 subunit 5), mixed-lineage-Leukämie-Septin-artigem Fusions-Protein B (mixed lineage leukemia septin-like fusion protein-B), Hitze-55 schock-Protein 75 (heat shock protein 75), ß-Amyloid-Vorläufer-artigem Protein 1 (ß-amyloid 6

AT 414 171 B precursor-like protein 1), Tropomyosin-4-anaplastischem Lymphom-Kinase-Fusions-Onko-protein Typ 2 (tropomyosin 4-anaplastic lymphoma kinase fusion oncoprotein type 2), Nck-Adaptor-Protein 2 (Nck adaptor protein 2), Src-Homologie-Domänen-Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenem 2-artigen Endophilin B2 (Src homology domain growth factor receptor 5 bound 2-like endophilin B2), Septin 7 und hämatopoietischen Stamm/Progenitor-Zellen 140 (HSP 140) (hematopoietic stem/progenitor cells 140), wobei das Set - einen Probenbehälter, - Mittel zum Nachweisen der mindestens zwei Proteine, insbesondere Antikörper, die die Prote-io ine spezifisch erkennen, und - Mittel zum Bestimmen der Menge der nachgewiesenen Proteine aufweist.

Das vorliegende Set enthält vorzugsweise als Mittel zum Nachweisen der mindestens zwei Proteine, und als Mittel zum Bestimmen der Menge der nachgewiesenen Proteine konjugierte, 15 vorzugsweise markierte Antikörper, insbesondere radioaktiv oder mit Fluoreszenz markierte Antikörper.

Vorzugsweise sind die Mittel zum Nachweisen der mindestens zwei Proteine an einer festen Oberfläche immobilisiert. 20

Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Set zum Bestimmen der Menge der mRNAs von mindestens zwei Proteinen in einer Probe, wobei die mindestens zwei Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hämatopoietin-Adapter enthaltend die Src-Homologie 3-Domäne und sterile α-Motive (HACS1) (hematopoietic adapter containing Src homology 3 25 domain and sterile α motifs), Doppelstrang-Bruch-Reparatur-Protein rad 21-Homolog (doublestrand break repair protein rad 21 homologue), eukaryontischem Translationsfaktor 3-üntereinheit 5 (eukaryotic translation factor 3 subunit 5), mixed-lineage-Leukämie-Septin-artigem Fusions-Protein B (mixed lineage leukemia septin-like fusion protein-B), Hitzeschock-Protein 75 (heat shock protein 75), ß-Amyloid-Vorläufer-artigem Protein 1 (ß-amyloid precursor-30 like protein 1), Tropomyosin-4-anaplastischem Lymphom-Kinase-Fusions-Onkoprotein Typ 2 (tropomyosin 4-anaplastic lymphoma kinase fusion oncoprotein type 2), Nck-Adaptor-Protein 2 (Nck adaptor protein 2), Src-Homologie-Domänen-Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenem 2-artigen Endophilin B2 (Src homology domain growth factor receptor bound 2-like endophilin B2), Septin 7 und hämatopoietische Stamm/Progenitor-Zellen 140 (HSP 140) (hematopoietic 35 stem/progenitor cells 140) wobei das Set - einen Probenbehälter, - Mittel zum Nachweisen der mRNAs der mindestens zwei Proteine, insbesondere komplementäre Nukleinsäuren oder Primer, die die mRNAs amplifizieren, und 40 - Mittel zum Bestimmen der Menge der nachgewiesenen mRNAs aufweist.

Vorzugsweise enthält das Set gemäß der vorliegenden Erfindung als Mittel zum Nachweisen der mRNAs der mindestens zwei Proteine und als Mittel zum Bestimmen der Menge der nachgewiesenen mRNAs konjugierte, vorzugsweise markierte Nukleinsäuren, insbesondere radioak-45 tiv oder mit Fluoreszenz markierte Nukleinsäuren.

Vorzugsweise sind die Mittel zum Nachweisen der mRNAs der mindestens zwei Proteine an einer festen Oberfläche immobilisiert. so Die Sets gemäß der vorliegenden Erfindung können gemäß Standard-Protokollen erzeugt und entworfen sein, die an die neuen DS-Marker, die durch die vorliegende Erfindung vorgesehen sind, angepasst sind.

Die vorliegende Erfindung ist weiters durch die folgenden Beispiele und Figuren veranschau-55 licht, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein. 7

AT 414 171 B

Fig. 1: Giemsa-Banden-Darstellung (G-Banden) des humanen Chromosoms 21. Die Pfeile zeigen sechs Proteine, Produkte von Genen, die auf Chromosom 21 codiert sind, an, welche in dieser Studie verwendet wurden. 5 Fig. 2: Western-Blot-Analyse für sechs Proteine, deren Proteine am Chromosom 21 in der Großhirnrinde von fötalem Gehirn mit DS und Kontrollen codiert sind. Denaturierte Proteine (10 mg) wurden beladen, auf einem homogenen Gel getrennt, und auf PVDF-Membran transferiert. Wie in 'Materialien und Methoden' beschrieben, wurden die Membranen mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert, und immunreaktive Banden (HACS1, 49,5 kDa; DYRK1A, io 200 und 80 kDa; αλ-Crystallin, 25 kDa; FTCD, 50 kDa; GARS-AIRS-GART, 110 und 50 kDa; CBS, 60 kDa und 45 kDa; NSE, 45 kDa; GFAP, 48 kDa, Actin, 42 kDa) wurden unter Verwendung von Chemilumineszens-Reagenzien nachgewiesen. Die Dichte der detektierten Banden wurde gemessen und mit dem nicht-parametrischen Mann-Whitney U-Test berechnet, und die Bedeutungshöhe wurde als P <0,05 angesehen. 15

Fig. 3: Expressionsmengen von sechs Proteinen, die mit jenen von Actin normalisiert waren. Die Dichte der immunreaktiven Bande für jedes Protein wurde mit jener von Actin normalisiert, welches als Referenz-Protein verwendet wurde. 20 Fig. 4: Zweidimensionale Karte von humanen Fötal-Gehirn-Proteinen. Humane fötale Gehirn-Proteine wurden extrahiert und auf einem immobilisierten pH 3-10 nicht-linearen Gradientenstreifen aufgetrennt, gefolgt von einem 9-16% linearen Gradienten-Polyacrylamid-Gel, wie unter Material und Methoden beschrieben. Die Gele wurden mit Coomassie Blue gefärbt, und die Spots wurden mittels MALDI-MS analysiert. Die Pfeile zeigen einen Bereich identifizierter 25 und quantifizierter Proteine an.

Fig. 5: Zweidimensionales Teil-Bild von Proteinen mit apparenten Veränderungen. Der Bereich, an dem man interessiert war, wurde aus dem gesamten Gel-Bild für Proteine, die im fötalen Down-Syndrom-Gehirn einer Fehlsteuerung unterlagen, herausgeschnitten. Die Bezeichnung 30 des Proteins ist oben in der Figur angegeben, und der Pfeil zeigt die entsprechenden Spots in beiden Gruppen an. BEISPIEL: Protein-Mengen von HACS1, DYRK1A, aA-Crystallin, alpha-Crystallin-Untereinheit A, FTCD; GARS-AIRS-GART und CBS in fötaler Großhirnrinde. 35

Hier wurden die Expressionsmengen von sechs Proteinen, die auf dem Chromosom 21 codiert sind - haematopoietischer Adapter, enthaltend Src-Homologie-3-Domäne und sterile a-Motive (HACS1, 21q11.2), Doppel-Spezifität-Tyrosin-phosphorylierte und regulierte Kinase (DYRK1A; 21q22.13), alpha-Crystallin-Untereinheit A (αΑ-Crystallin; 21q22.3) Formiminotransferase-40 Cyclodeaminase (FTCD; 21q22.3), Glycinamid-Ribonucleotid-Synthetase-Aminoimidazol-Ribonukleotid-Synthetase-Glycinamid-Ribonukleotid-Formyltransferase (GARS-AIRS-GART; 21 q22.11) und Cystathionin-ß-Synthase (CBS; 21q22.3 (Fig. 1) - im fötalen Gehirn von DS und Kontrollen im frühen zweiten Trimester evaluiert. 45 Materialien und Methoden Fötale Gehirn-Proben Fötale Gehirngewebe (Großhirnrinde) von DS (4 weibliche im Alter von 18-19 Schwanger-50 Schaftswochen) und Kontrollen (4 weibliche im Alter von 18-19 Schwangerschaftswochen) wurden für diese Studie verwendet. Gehirnproben wurden von Dr. Mara Dierssen (Medical and Molecular Genetics Center-IRO, Hospital Duran i Reynals, Barcelona, Spanien) und Dr. Joan Carles Ferneres (Department of Pathology UDIAT-CD, Corporacis Sanit'ria Parc Tauli, Sabadell, Barcelona, Spanien) erhalten. Alle Proben hatten eine Autopsie-Zeit von weniger als 6 h, wur-55 den bei -70°C gelagert, und die Gefrierkette wurde bis zur Verwendung niemals unterbrochen. 8

AT 414 171 B

Antikörper

Die Details der Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern wurden schon früher beschrieben: HACS1 (Claudio et al., 2001); GARS-AIRS-GART (Brodsky et al., 1997); CBS (Chen 5 et al., 1999). Polyklonaler Kaninchen-Antikörper wurde aus C-terminalen Peptiden von αΑ-Crystallin (VSREEKPSSAPSS) entwickelt, und es wurde keine Kreuzreaktion mit αΒ-Crystallin beobachtet. Fünf Antikörper für DYRK1A (Santa Cruz, USA), FTCD (Sigma, USA), Neuronen-spezifischer Enolase (NSE; Chemicon, UK), Glia-fibrillärem saurem Protein (GFAP; Chemicon, UK) und Actin (Sigma, USA) wurden käuflich erworben. 10

Western-blotting

Unter flüssigem Stickstoff gemahlene fötale Gehirngewebe wurden in Lyse-Puffer, der eine Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette (Rache, Deutschland) enthielt, wurden bei 4eC homogeni-15 siert und bei 8.000xg 10 min lang zentrifugiert. Das BCA-Protein-Test-Set (Pierce, USA) wurde angewendet, um die Protein-Konzentration im Überstand zu bestimmen. Die Proben (10 mg) wurden mit dem Proben-Puffer (100 mM Tris-HCI, 2% SDS, 1% 2-Mercaptoethanol, 2% Glycerin, 0,01% Bromphenol-Blau, pH 7,6) gemischt, bei 95°C 15 min lang inkubiert, und auf ein homogenes ExcelGel-SDS-Gel (Amersham Pharmacia Biotech, Schweden) geladen. Die 20 Elektrophorese wurde mit dem Multiphor Il-Elektrophorese-System (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt. Auf dem Gel getrennte Proteine wurden auf eine PVDF-Membran (Millipore, USA) transferiert, und die Membranen wurden in einem Blockierungs-Puffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 0,1% Tween 20 und 2% Trocken-Magermilch) inkubiert. Die Membranen wurden 2 h lang bei Raumtemperatur mit verdünnten primären Antikörpern (1:200 für 25 DYRK1A (G-19); 1:500 für HACS1 und FTCD; 1:1.000 für αΑ-Crystallin und Actin; 1:3.000 für NSE; 1:5.000 für GARS-AI RS-GART, CBS und GFAP) inkubiert. Nach dreimaligem, 15-minütigem Waschen mit Blockierungs-Puffer wurden die Membranen mit sekundären Antikörpern, gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase (Southern Biotechnology Associates, Inc., USA) 1 h lang als Sonden untersucht. Die Membranen wurden 3 mal 15 Minuten lang gewaschen und 30 mit Western Lightning-Chemilumineszenz-Reagenzien (PerkinElmer Life Sciences, Inc., USA) entwickelt.

Statistik 35 Die Dichte der immunreaktiven Banden wurde mit dem RFLPscan Version 2.1-Software-Programm (Scanalytics, USA) gemessen. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem nicht-parametrischen Mann-Whitney U-Test unter Verwendung des GraphPad-lnstat2-Programms berechnet, und die Bedeutungshöhe wurde als P <0,05 angesehen. 40 Ergebnisse

Die Expressionsmenge von sechs Proteinen, die auf dem Chromosom 21 codiert sind (HACS1, DYRK1A, αΑ-Crystallin, FTCD, GARS-AI RS-GART, und CBS, Fig. 1) wurden in Fötal-Gehirnen mit DS im Vergleich zu Kontrollen mittels Western blot-Analyse evaluiert (Fig. 2). Drei Proteine, 45 NSE, GFAP und Aktin, wurden als Referenz-Proteine für Neuronen, Astrocyten bzw. Gesamtzellen verwendet, und keines davon zeigte die verschiedenen Expressionsmengen bei DS im Vergleich zu Kontrollen. Der anti-DYRK1A-Antikörper erkannte eine Haupt-Bande und eine kleinere Bande, deren Molekularmassen etwa 200 kDa bzw. 80 kDa betrugen. Zwei Banden von 110 kDa und 50 kDa mit anti-GARS-AIRS-GART-Antikörper wurden nachgewiesen. Zwei so Banden von 60 kDa und 45 kDa wurden ebenfalls mit anti-CBS-Antikörper beobachtet. Interessanterweise war HACS1 bei fötalem DS signifikant verringert, und diese Verringerung war noch stärker, wenn man sie zur Actin-Menge in Bezug setzte (Fig. 3). Die Dichte immunreaktiver Banden von fünf Proteinen mit Ausnahme von HACS1 war jedoch vergleichbar zwischen DS und den Kontrollen. Wenn die Mengen von fünf Proteinen mit jenen von Actin normalisiert wur-55 den, wurde kein Unterschied zwischen zwei Gruppen beobachtet, wie in Fig. 3 gezeigt ist. g

ΑΤ 414 171 B

Diskussion HACS1 codiert für ein Protein, das zwei Domänen, SH3 und SAM, enthält, die Protein-Wechselwirkungs-Motive sind und vorherrschend bei Signal-Molekülen, Adaptoren und Gerüst-5 Proteinen zu finden sind. Das Vorhandensein von SH3 und SAM in HACS1 und seine vor allem cytosolische Lokalisierung lassen vermuten, dass es als ein zytoplasmatischer Adapter zur Vermittlung einer Signalisierungsbahn dienen könnte (Claudio et al., 2001). Kürzlich wurde auch ein vorausgesagtes Protein (Nashl benannt) mit einem Kern-Lokalisations-Signal, SAM und SH3, ebenfalls auf Chromosom 21q11.1 kartiert (Uchida et al., 2001), doch muss die Funk-io tion und die Expressionsmenge im DS-Gehirn für Nashl noch getestet werden. Auf Grund der beträchtlichen Verringerung der HACS1-Protein-Expression im fötalen DS-Gehim könnte HACS1 eine kritische Rolle bei der Entwicklung des fötalen DS-Gehims spielen. DYRK1A, das humane Homolog des Drosophila minibrain (mnb)-Gens, kartiert auf der soge-15 nannten DS-kritischen Region des humanen Chromosoms 21. DYRK1A codiert für eine Serin-Threonin-Kinase, die während der Neuroblasten-Proliferation bei Drosophila exprimiert wird. Berichten zufolge ist DYRK1A vor allem im Kern lokalisiert (Becker et al., 1998). Es ist daher wahrscheinlich, dass DYRK1A Kernsubstrate, wie den Transkriptionsfaktor Forkhead bei Rhabdomyosarkom phosphoryliert, der sowohl bei der Steuerung der Genexpression durch Insulin 20 als auch bei der Regulierung der Apoptose durch Überlebensfaktoren impliziert ist. Mehrere Studien wurden durchgeführt, um die biologische Funktion von DYRK1A zu identifizieren. Mutierte mnb-Fliegen haben verringerte optische Lappen und ein verringertes Zentralgehirn und weisen Lerndefizite und Hypoaktivität auf (Heisenberg et al., 1985). Transgene Mäuse mit einem künstlichen Hefe-Chromosom, das DYRK1A-Gen enthält, wiesen einige Veränderungen 25 auf, die analog zu jenen waren, die man bei der DS-Pathologie feststellte, wie Gedächtnis-Defizite (Reeves et al., 1995). Außerdem zeigten transgene Mäuse, die DYRK1A überexprimie-ren, eine Verzögerung in der Nervenentwicklung, motorische Abnormitäten und kognitive Defizite, was eine kausative Rolle von DYRK1A bei der geistigen Behinderung und bei motorischen Anomalien von DS vermuten lässt (Altafaj et al., 2001). Interessantenweise wurde eine 30 DYRK1A-mRNA-Überexpression im fötalen DS-Gehirn und bei Ts65Dn-Mäusen berichtet (Guimera et al., 1999). In dieser Untersuchung erkannte der anti-DYRK1A-Antikörper eine Hauptbande und eine kleine Bande, deren Molekularmassen etwa 200 kDa bzw. 80 kDa betrugen. Humanes DYRK1A ist ein Protein mit 763 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 84,552 kDa. Andere Gruppen berichteten auch von einer Größen-Inkonsistenz und 35 von mehrfachen Banden bei DYRK1A in Maus- und Ratten-Geweben (Rahmani et al., 1998; Okui et al., 1999). Die Inkonsistenz in Größe und Vorhandensein von zwei Banden kann durch die vorliegenden Ergebnisse nicht erklärt werden, jedoch wurde dasselbe Migrationsmuster der 200 kDa- und 80 kDa-Proteine beobachtet, wenn Kernextrakte von HeLa-Zellen als Referenz verwendet wurden, und die Statistik zeigte keinen Unterschied zwischen DS und Kontrollen, 40 weder für die Haupt-Bande noch für die kleinere Bande. Wenn man bedenkt, dass sein nächster Verwandter, die Protein-Kinase MNB von Drosophila, vermutlich an der postembryonalen Neurogenese beteiligt ist, könnte ein durch das Gehirn-DYRKIA-Protein regulierter Signalgebungsweg vor der Geburt von Individuen mit DS normal funktionieren. 45 Alpha-Crystallin ist ein Haupt-Protein der Linse und gehört zur kleinen Hitze-Schock-Protein-Familie der molekularen Chaperones. Es ist ein polymerer Komplex aus zwei ~20 kDa Untereinheiten (aA und aB). Die Expression von a-Crystallin in einer Vielfalt von Geweben außerhalb der Linse und seine Fähigkeit, eine thermische Aggregation von Protein auf ähnliche Weise wie molekulare Chaperones zu verhindern, lässt vermuten, dass es allgemeine Zellfunktionen hat, so die über seine Rolle bei der Lichtbrechung hinausgehen (Horwitz, 2000). Mehrere Studien weisen darauf hin, dass die Expression von aA- oder aB-Crystallin die Widerstandsfähigkeit von Zellen gegen eine Vielfalt von Stressbedingungen stärkt, und beide Crystallin-Untereinheiten haben die Fähigkeit, Zellen vor durch Cytokine, Protein-Kinase-C-Inhibitor Staurosporin und UVA-Strahlung induzierter Apoptose zu schützen (Andley et al., 2000). Die Fähigkeit von 55 α-Crystallin, eine Apoptose zu verhindern, könnte mit einer Inhibierung der Caspase-Aktivität 10

AT 414 171 B verbunden sein (Kamradt et al., 2001). Die unveränderten Mengen der Caspase-3-Expression mit unveränderten Mengen von Apopotose-verwandten Proteinen wurde im fötalen Gehirn beobachtet, was darauf schließen lässt, dass eine verstärkte Apopotose in der Gehirnentwicklung von DS nicht apparent sein könnte (Engidawork et al., 2001b). Interessanterweise schien 5 im Nervensystem von αΑ-Crystallin-transgenen Mäusen die αΑ-Crystallin-Protein-Expression in spezifischen Zellen (Astrocyten und Schwann-Zellen) auf, und αΑ-Crystallin-transgene Mäuse entwickeln eine periphere und zentrale Neuropathie, die sich vor allem auf die Rückenmarksbereiche auf der dorsalen Seite, die dorsale Rückenmarkswurzel und den Ischiasnerv auswirkt (De Rijk et al., 2000). Insgesamt könnten die unveränderten Expressionsmengen von Chapero-io ne-Proteinen einschließlich αΒ-Crystallin im fötalen DS-Gehirn (Yoo et al., 2001), die vergleichbare Expression von αΑ-Crystallin im fötalen DS-Gehirn darauf hindeuten, dass der polymere Komplex, α-Crystallin, während der Entwicklung des fötalen DS-Gehirns normal funktionieren könnte. 15 FTCD hat vor allem eine Stoffwechselfunktion, wobei es zwei sequentielle Reaktionen im Histi-din-Abbau-Reaktionsweg katalysiert. Die FT-Domäne dieses bifunktionellen intermediären Stoffwechsel-Enzyms transferiert zuerst die Formimino-Gruppe von Formiminoglutamat zu Tetrahydrofolat (THF), um Formimino-THF und Glutamat zu erzeugen, und danach katalysiert die CD-Domäne die Zyklisierung des Folat-Zwischenprodukts, um Methenyl-THF zu erzeugen 20 und Ammoniak freizusetzen (für einen Überblick vgl. Shane und Stokstad, 1984). Außerdem zeigte es sich, dass FTCD mit dem 58K Golgi-Protein identisch ist, von welchem ursprünglich vorgeschlagen worden war, dass es die Golgi-Membranen mit dem Mikrotubuli-Zellskelett verbindet. Jüngst durchgeführte Untersuchungen weisen darauf hin, dass FTCD an polyglutamierte Reste bindet, die man vorzugsweise im Gehirn-Tubulin findet, und nicht mit Tubulin aus ande-25 ren Quellen interagiert (Bashour und Bloom, 1998). Auf Grund von Berichten, dass der am Abbau von Histidin involvierte Stoffwechsel nur in einigen wenigen Geweben, wie Leber und Niere, stattfindet (Fowler, 2001), und dass es sich zeigte, dass das Gehirn sehr geringe Mengen an FTCD enthält (was mit den vorliegenden Ergebnissen übereinstimmt, Bashour und Bloom, 1998), könnte FTCD zusätzlich zu seiner Enzym-Aktivität eine zweite physiologische Funktion 30 haben, indem es die Wechselwirkung von von Golgi stammenden Membranen mit Mikrotubuli vermittelt. FTCD nimmt auch an der Wechselwirkung des Golgi-Komplexes mit dem Vimentin-intermediären Filament-Zellskelett teil, was darauf hindeutet, dass es ein Anwärter-Protein sein könnte, das das Golgi-Kompartiment mit dem intermediären Filament-Zellskelett integriert (Gao und Sztul, 2001). Hier wurden vergleichbare Protein-Expressionsmengen von FTCD zwischen 35 fötalem DS und Kontrollen beobachtet, was andeutet, dass FTCD während der Entwicklung des fötalen DS-Gehirns im Histidin-Abbau-Reaktionsweg und der Golgi-Dynamik normal funktionieren könnte. Weiters kann Methenyl-THF, das funktionelle Produkt von FTCD, sowohl bei der Purin-Synthese als auch beim Homocystein-Stoffwechsel erzeugt und verwendet werden, die von anderen Chromosom 21-codierten Proteinen, GARS-AIRS-GART bzw. CBS, reguliert 40 werden (siehe unten).

Die Purin-Biosynthese spielt bei einer Anzahl verschiedener Zellprozesse eine wesentliche Rolle. Purin-Nukleotide sind Vorläufer für RNA und DNA, Coenzyme, Energietransfer-Moleküle und regulierende Faktoren. Beim Menschen kann ein trifunktionales Protein mit enzymatischen 45 GARS-, AIRS- und GART-Aktivitäten den zweiten, dritten und fünften Schritt der de novo-Purin-Biosynthese katalysieren, die für die Umwandlung von Phosphoribosyl-Pyrophosphat zu Inosin-Monophosphat notwendig ist. Dieses Gen codiert nicht nur das trifunktionale Protein GARS-AIRS-GART mit 110 kDa, sondern auch ein monofunktionales Protein GARS mit 50 kDa. Die Expression von sowohl GARS- als auch GARS-AIRS-GART-Proteinen ist während der Entwick-50 lung des menschlichen Kleinhirns reguliert. Diese Proteine werden während der normalen pränatalen Kleinhirn-Entwicklung in großen Mengen exprimiert, wogegen sie in diesem Gewebe kurz nach der Geburt undetektierbar werden. Dagegen werden die Proteine GARS und GARS-AIRS-GART weiterhin während der postnatalen Entwicklung des Kleinhirns bei DS exprimiert (Brodsky et al., 1997). Bei den vorliegenden Untersuchungen wurden auch beide Proteine, 55 GARS und GARS-AIRS-GART, in der Großhirnrinde des fötalen Gehirns nachgewiesen, und 1 1

AT 414 171 B die Expressionsmengen beider Proteine waren im fötalen DS-Gehirn im Vergleich zu Kontrollen unverändert. Diese Ergebnisse implizieren, dass beide Proteine, GARS und GARS-AIRS-GART, bei der Regulierung der Purin-Biosynthese im pränatalen Stadium des fötalen DS-Gehirns eine normale Rolle spielen könnten. 5

Das erste Enzym des Cystein-Biosynthese-Reaktionswegs, CBS, katalysiert die Kondensation von Homocystein mit Serin, wobei Cystathionin gebildet wird. Ein CBS-Mangel, der eine Plas-ma-Homocystein-Ansammlung bewirkt (was zu Homocystinurie führt), resultiert auch in einer S-Adenosylhomocystein-Ansammlung. S-Adenosylhomocystein ist ein wirksamer Inhibitor io verschiedener Methyltransferasen. Wenn die Methylierung inhibiert wird, werden die Synthese von Creatin, Sarcosin, Lecithin und die Methylierung von Protein und Nukleinsäuren beeinflusst. Es zeigte sich, dass die Homocystein-Verabreichung während der embryonalen Entwicklung von Vögeln Geburtsfehler des Herzens und des Neuralrohres induziert (Rosenquist et al., 1996). Dagegen gibt es bei Fällen von Homocystinurie infolge von CBS-Mangel keinen Beweis 15 für eine Neuralrohr- oder Herz-Dysmorphogenese bei der Geburt (Watanabe et al., 1995). Kürzlich fand man beim Kind mit Trisomie 21 eine fünffache Erhöhung der Cystathionin-Menge im Vergleich zu normalen Kindern (Al-Gazalli et al., 2001), was mit der Überexpression von CBS übereinstimmt. Außerdem führt eine erhöhte CBS-Expression bei DS zu geringem Plasma-Homocystein im Vergleich zu Individuen ohne DS (Pogribna et al., 2001). Humanes CBS-20 Gen codiert für das native Enzym der 63 kDa-Untereinheit für Homotetramer, und dieses Protein wird teilweise gespalten, was den aktiven Kern mit 45 kDa durch sequentielle Trypsin-Proteolyse ergibt (Kery et al., 1998; Dong et al., 1997). Bei der vorliegenden Untersuchung wurden zwei Banden mit 60 kDa und 45 kDa mit anti-CBS-Antikörper nachgewiesen, und die Immunreaktivität für beide Banden zwischen dem fötalen DS-Gehirn und Kontrollen war ver-25 gleichbar. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis wurden beide Bandenmuster beobachtet, als eine Western blot-Analyse mit einem Hefestamm durchgeführt wurde, der humanes CBS-Protein exprimierte (Shan et al., 2001). In Anbetracht der Studie, dass sich neurologische und kardiovaskuläre Abnormitäten mehrere Wochen nach der Geburt bei menschlichen Homocysti-nurie-Patienten entwickeln (Watanabe et al., 1995), könnte die vorliegende Erkenntnis die 30 Hypothese unterstützen, dass die biologischen Konsequenzen einer Homocystein-Ansammlung nach der Geburt aufzuscheinen beginnen.

Die verringerten HACS1-Mengen und die unveränderte Expression von fünf Proteinen des Chromosoms 21 im fötalen DS-Gehirn unterstützen die Gen-Dosis-Effekt-Hypothese nicht. 35 3. Proteine, die in der Großhirnrinde von Föten mit Down Syndrom dereguliert sind: Steigerung des Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein rad 21-Homologs, eukaryontischen Translations-Initiierungsfaktor 3-Untereinheit 5, mixed lineage-Leukämie-Septin-artiges Fusions-Proteins B und Hitze-Schock-Proteins 75; Verringerung des ß-Amyloid-Vorläufer-artigen Proteins 1, Tro-40 pomyosin 4-anaplastisches Lymphom-Kinase-Fusions-Onkoproteins Typ 2, Nck-Adaptor-Pro-teins 2, Src-Homologie-Domänen-Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenen 2-artigen Endophi-lins B2, beta-Tubulins, Septins 7 und der hämatopoietischen Stamm/Progenitor-Zellen 140.

Das Gebiet der Proteomik in der Hirnforschung gewinnt im Zuge der Komplettierung und Anno-45 tierung von Genom-Sequenzen zunehmend an Bedeutung (Dutt und Lee, 2000). Außerdem liefern das Studium der Protein-Expression und das Differential-Screening der Protein-Bibliothek spezifische Informationen, die nicht vorhersagbar oder aus genomischen Analysen erhältlich sind. Somit wurde eine Gehirn-Karte für fötale Proteine erzeugt und das Proteom für differenzierte Protein-Expression gesucht. Diese Recherche (Überblick in Engidawork und so Lubec, 2001) zeigte eine anomale Expression von Proteinen, die an der Signal-Transduktion und Gehirn-Morphogenese sowie als synaptische Marker beteiligt waren. Als Teil der laufenden Bemühungen auf der Suche nach Proteinen, die für die Neuropathologie von DS relevant sind, wurde die erste Protein-Karte des fötalen Gehirns auf den laufenden Stand gebracht, was letztlich die Identifizierung von bisher unidentifizierten Proteinen und die Analyse der neu identifi-55 zierten Proteine ermöglichte. In diesem Beispiel werden die Expressionsprofile einer Reihe von 12

AT 414 171 B

Proteinen, einschließlich Zellskelett-assoziierte Proteine, Signalgebungs-Proteine, Apoptose-verbundene Proteine, Proteine, die an einer Vielfalt von Stoffwechsel-Reaktionswegen beteiligt sind und Onkoproteine, bestimmt. 5 Materialien und Methoden Fötales Hirngewebe

Hirngewebe (Großhirnrinde) abortierter Kontroll-Föten ohne offensichtliche Abnormitäten (n=7; io 1 weiblich und 6 männlich, mit einem mittleren Schwangerschaftsalter von 18,8±2,2 Wochen) und DS (n=9, 2 weiblich und 7 männlich, mit einem mittleren Schwangerschaftsalter von 19,6±2,0 Wochen) wurden für den Versuch verwendet. Die Himproben wurden vom Medical and Molecular Genetics Center-IRO, Hospital Duran i Reynals, Barcelona, Spanien, erhalten. Alle Verfahren wurden mit der Zustimmung des Ethik-Komitees des Spitals durchgeführt, und 15 nach dem Sezieren wurden alle Proben bei -70°C gelagert, und die Gefrierkette wurde niemals unterbrochen.

Zweidimensionale Gel-Elektrophorese (2-DE) 20 Gehirngewebe wurde in 0,5 ml Probenpuffer suspendiert, der aus 40 mM Tris, 5 M Harnstoff (Merck, Darmstadt, Deutschland), 2 M Thioharnstoff (Sigma, St. Louis, MO, USA), 4% CHAPS (Sigma), 10 mM 1,4-Dithioerythritol (Merck), 1 mM EDTA (Merck) und einer Mischung von Proteasehemmern, 1 mM PMSF und je 1 pg Peptstatin A, Chymostatin, Leupeptin und Antipain bestand. Die Suspension wurde etwa 30 sec lang mit Schall behandelt und bei 150.000 g 25 45 min lang zentrifugiert. Der Proteingehalt im Überstand wurde mit der Coomassie-Blue-

Methode bestimmt (Bradford, 1976). 2-DE wurde im Wesentlichen wie berichtet durchgeführt (Langen et al., 1997). Proben von 2 mg Protein wurden auf immobilisierte pH 3-10, nicht-lineare Gradienten-Streifen in Probeschalen an 30 ihren basischen und sauren Enden aufgetragen. Die Fokussierung begann mit 200 V, und die Spannung wurde allmählich mit 3 V/min auf 5000 V erhöht und weitere 24 h lang konstant gehalten (etwa 180.000 Vh insgesamt). Die zwei-dimensionale Trennung erfolgte auf Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelen mit einem Gradienten von 9-16%. Die Gele (180x200x1,5 mm) wurden mit 40 mA pro Gel laufen gelassen. Nach 12-stündiger Protein-35 Fixierung in 40% Methanol, das 5% Phosphorsäure enthielt, wurden die Gele mit kolloidalem Coomassie-Blue (Novex, San Diego, CA, USA) 48 h lang gefärbt. Die molekularen Massen wurden durch Laufenlassen von Standard-Protein-Markem (Gibco, Basel, Schweiz) bestimmt, wobei der Bereich 10-200 kDa abgedeckt wurde. Die pl-Werte wurden verwendet, wie vom Lieferanten der immobilisierten pH-Gradienten-Streifen angegeben. Überschüssige Farbe wur-40 de aus den Gelen mit destilliertem Wasser ausgewaschen, und die Gele wurden in einem Agfa-DUOSCAN-Densitometer (Auflösung 200) gescant. Die elektronischen Bilder der Gele wurden unter Verwendung von Photoshop(Adobe)- und PowerPoint(Microsoft)-Software aufgezeichnet.

Matrix-assoziierte Laser-Desorptions-Ionisierungs-Massenspektroskopie (MALDI-MS) 45

Die MALDI-MS-Analyse wurde, wie anderwärts beschrieben (Fountoulakis und Langen, 1997), mit einigen Modifikationen durchgeführt. Die Spots wurden mit einem Spot-Picker herausgeschnitten und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gegeben. Jeder Spot wurde mit 100 ml 30% Acetonitril in 50 mM Ammoniumbicarbonat entfärbt und in einem Speedvac-Verdampfer so getrocknet. Jedes getrocknete Gel-Stück wurde mit 4 ml 3 mM Tris-HCI, pH 9,0, das 50 ng Trypsin enthielt (Promega, Madison, Wl, USA) rehydratisiert. Nach 16 h bei Raumtemperatur wurden 7 ml destilliertes Wasser zu jedem Gel-Stück zugegeben, und die Proben wurden 10 min lang geschüttelt. 4 ml 50% Acetonitril, das 0,3% Trifluoressigsäure und die Standard-Peptide, des-Arg-Bradykinin (Sigma, 904,4681 Da) und adrenocorticotropes Hormon-Fragment 18-39 (Sigma, 2465,1989 Da) enthielt, wurden zu jedem Gel-Stück zugegeben und 10 min lang 55 1 3

AT 414 171 B geschüttelt. Das Aufträgen der Proben erfolgte unter Verwendung des SymBiot I-Proben-Prozessors (PE Biosystems, Framingham, MA, USA). 1,5 ml der Peptidmischung wurden gleichzeitig auf 1 ml Matrix, bestehend aus einer gesättigten Lösung von a-Cyano-4-hydroxy-Zimtsäure (Sigma) in 50% Acetonitril, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure, aufgetragen. Die 5 Proben wurden in einem time-of-flight-Massenspektrometer (Reflex 3, Bruker Analytics, Bremen, Deutschland) analysiert. Eine beschleunigende Spannung von 20 kV wurde verwendet. Der Peptid-Vergleich und die Protein-Recherchen wurden automatisch durchgeführt. Die Peptidmassen wurden mit den theoretischen Peptidmassen aller verfügbaren Proteine aller Spezies verglichen. Monoisotope Massen wurden verwendet, und eine Massentoleranz von 0,0025% io wurde gestattet. Der für die Bestimmung der Wahrscheinlichkeit einer falsch positiven Übereinstimmung mit einem gegebenen MS-Spektrum verwendete Algorithmus ist anderwärts beschrieben (Berndt et al., 1999).

Quantifizierung der Protein-Spots 15

Die Protein-Spots wurden umrissen (zuerst automatisch und dann manuell) und unter Verwendung der ImageMaster 2D Elite-Software (Amersham Pharmacia Biotechnology) quantifiziert. Der Prozentsatz des Volumens der Spots, die ein bestimmtes Protein darstellen, wurde im Vergleich zu den gesamten Proteinen, die in dem interessierenden Bereich vorhanden waren, 20 bestimmt.

Statistische Analysen

Die Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung des Prozentsatzes des Spot-Volumens in 25 jedem speziellen Gel nach Subtraktion der Hintergrundwerte ausgedrückt. Unterschiede innerhalb der Gruppe wurden unter Verwendung des nicht-parametrischen Mann-Whitney U-Tests analysiert. Das Signifikanz-Niveau wurde mit P<0,05 festgehalten.

Ergebnisse 30

Proteinidentifizierung

Sobald die Spots nach dem Verdau im Gel mittels MALDI-MS analysiert worden waren, erfolgte die Identifizierung durch Vergleichen der Peptidmasse mit der theoretischen Peptidmasse aller 35 Proteine in der SWISS-PROT-Datenbank. Interne Standards wurden verwendet, um die gemessene Peptidmasse zu korrigieren, wodurch die Fenster der Massentoleranz reduziert und das Identifizierungs-Vertrauen erhöht wurde. Hunderte Proteine wurden erfolgreich identifiziert, einschließlich Signalgebungsproteine, Chaperones, Zellskelett-Proteine, Onkoproteine, Proteine, die an verschiedenen Stoffwechsel-Reaktionswegen und Protein-Sortierung beteiligt sind. 40 Ein repräsentatives Gel, das identifizierte und quantifizierte Proteine enthält, aus Kontroll-Gehirn erzeugt, ist in Fig. 4 gezeigt. Die aus der MALDI-MS-Analyse erhaltenen Daten sind in Tabelle 1 präsentiert. Von den 49 neu identifizierten und quantifizierten Proteinen wurden 44 als einzelner Spot aufgelöst, und die restlichen fünf wurden durch mehrfache Spots repräsentiert: zwei Spots für Calrecticulin, Sorcin, Spectrin und Histon 44, und drei für Septin 7 (Fig. 4). 45

Expressionsprofil von Proteinen in Kontrollen und DS

Die Mengen eines Arrays von Proteinen, die im fötalen Gehirn von Kontrollen und DS identifiziert und quantifiziert wurden, sind in Tabelle 1 angegeben. Alle Nukleinsäure-assoziierten so Proteine oder Proteine, die mit Nukleinsäure-Bindungs-Proteinen interagieren, einschließlich der einzelnen Spots von Histon H4, jedoch nicht Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein, zeigten keine signifikante Änderung zwischen Kontrollen und DS (Gruppe I). Das Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein, ein humanes Homolog von rad 21, war im fötalen DS um das Dreifache erhöht (P<0,05) (Fig. 5a). ein ähnlicher Trend wurde auch bei Proteinen der Translationsme-55 chanik (Gruppe II) beobachtet. Während das eukaryontische Translations-Initiierungs- 14

AT 414 171 B

Faktor(elF) 3-Untereinheit 5-(elF3 p47)-Protein bei DS um etwa das Zweifache anstieg (P<0,05) (Fig. 5b), wurde keine apparente Veränderung bei anderen Proteinen der Gruppe nachgewiesen. Weder Enzyme und/oder Cofaktoren, die an verschiedenen Stoffwechsel-Reaktionswegen (Gruppe III) beteiligt waren, noch Apoptose-bezogene Proteine (Apopain-Vorläufer und zy-5 toplasmatische Antiproteinase 2, Gruppe VI) zeigten irgendwelche bemerkbaren Veränderungen bei fötalem DS. CUA002, auch als Nit-Protein 2 bekannt (Gruppe VI) gehört zur Nitrilase-Superfamilie und ist bei Wirbellosen als Fusionspartner für das humane Homolog von Fhit identifiziert, einem Tumor-Suppressor-Protein, das mit dem Zelltod-Reaktionsweg verbunden ist (Pace und Brenner, 2001). Dieses Protein wies ebenso keinen apparenten Unterschied zwi-io sehen den Versuchs-Subjekten auf (Gruppe VI).

In Bezug auf Signalgebungs-Proteine (Gruppe IV) zeigte ein geringer Anteil der Gruppe Störungen bei fötalem DS, wogegen der Großteil der identifizierten Proteine, einschließlich die Calcium-Bindungsproteine unverändert blieben. Weder die Intensität der Summe der Spots (Tabelle 15 1), noch die einzelnen Spots (Daten nicht gezeigt) der Calcium-Bindungsproteine, Calreticulin,

Sorcin und Spectrin, waren zwischen den beiden Gruppen verschieden. Anderseits waren ß-Amyloid-Vorläufer-artiges Protein 1 (APLP-1) (P<0,05) (Fig. 5c) und SH (Src-Homologie) 3-Domänenwachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenes 2-artiges Endophilin B2 (SH3GLB2) (P<0,01) (Fig. 5d) um das etwa Dreifache signifikant verringert. Gleichermaßen waren auch 20 Tropomyosin(TPM)4-anaplastisches Lymphom-Kinase(ALK)(TPM4-ALK)-fusions-Onkoprotein,

Typ 2 (P<0,05) (Fig. 5e) und das Nck-Adaptor-Protein 2 (P<0,01) (Fig. 5f) ebenso um das etwa Zweifache verringert. Interessanterweise zeigte eine ganze Reihe Zellskelett-assoziierter Proteine (Gruppe V) tatsächlich eine Änderung in der einen oder in der anderen Richtung. Während beta-Tubulin (P<0,05) (Fig. 5g) und Spot 2 (Daten nicht gezeigt) sowie die Summe der Spots 25 von Septin-7 (P<0,01) (Fig. 5h, Tabelle 1) um das etwa Zweifache verringert waren, war mixed lineage-Leukämie (MLL)-Septin-artiges Fusions-Protein (MSF)-B (Fig. 5i) um das Dreifache gesteigert (P<0,01). Das Chaperone-Hitzeschock-Protein (HSP) 75 (Fig. 5j) und die hämatopoi-etischen Stamm/Progenitor-Zellen (HSPC) 140 (Fig. 5k) waren die einzigen von den unter Verschiedenes (Gruppe VI) kategorisierten Proteine, die eine zweifache (P<0,05) bzw. dreifa-30 che (P<0,01) Steigerung im fötalen DS aufwiesen.

Diskussion

Proteine spielen bei der Etablierung des biologischen Phänotyps von Organismen im gesunden 35 und Krankheitszustand eine zentrale Rolle. So sind Proteine für die Funktionalität als mRNA-Transkripte repräsentativ, die die genetische Information anzeigen. Die Proteomik ist daher zu einem wichtigen Brennpunkt in den Biowissenschaften geworden. Unter Verwendung von 2-DE/MALDI-MS, einer eleganten und aussagekräftigen Plattform-Methode zur Messung von Protein-Expressionsmustem (Fountoulakis, 2001), wurde eine 2-D-Karte fötaler Gehirn-40 Proteine, erzeugt, und ein Array von Proteinen wurde analysiert, die einen Einblick in die molekulare Neuropathologie von DS geben könnten.

Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein und elF3 p47 45 DNA-Doppelstrangbrüche führen zum Zelltod, wenn der Bruch unrepariert bleibt oder falsch repariert wird. Die DNA-Reparatur wird durch eine Vielfalt von Effektor-Proteinen durch homologe und nicht-homologe Rekombination vermittelt. Das DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein wird vom humanen Homolog von rad21, hHR21-Gen codiert und ist an der Reparatur von Doppelstrangbrüchen und Schwester-Chromatiden-Kohäsion beteiligt (McKay et al., 1996; so Hoque und Ishikawa, 2001). Davor wurde eine gesteigerte Expression von Nukleotid-Exzisions-Reparatur-Proteinen im adulten DS-Gehirn berichtet (Hermon et al., 1998). In Übereinstimmung damit zeigt die vorliegende Studie erhöhte Mengen eines anderen Reparatur-Proteins, des DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Proteins, im fötalen DS-Gehirn. Diese Erkenntnis lässt darauf schließen, dass auch im pränatalen DS-Gehirn eine DNA-Schädigung stattfindet. Der 55 DNA-Schaden könnte vermutlich durch reaktive Sauerstoff-Spezies verursacht werden, weil im 15

AT 414 171 B fötalen DS-Gehirn ein oxidativer Stress nachgewiesen wurde (Busciglio und Yankner, 1995; Gulesserian et al., 2001), und dies könnte für die vorzeitige Alterung der DS-Patienten verantwortlich sein. Die kritische Rolle, die das Doppelstrangbruch-Reparatur-Protein bei der Chroma-tid-Kohäsion spielt (Hoque und Ishikawa, 2001) eröffnet auch eine spekulative, doch faszinie-5 rende Möglichkeit, dass höhere Mengen des Proteins beim fötalen DS in gewissem Grad für das non-disjunction-Phänomen bei DS verantwortlich sein könnten.

Die Initiierung der Proteinsynthese in eukaryontischen Zellen hängt von mehrfachen elFs ab, die die Bindung von mRNA und Methionyl-lnitiator-tRNA an das 40S-Ribosom stimulieren. Das io Größte von diesen ist elF3, ein Multiprotein-Komplex von ~600 kDa, bei Säugern aus etwa 11

Untereinheiten zusammengesetzt, das eine zentrale Rolle beim Initiierungsreaktionsweg spielt durch Stimulieren der Bindung des ternären elF2-GTP-Me-thionyl-lnitiator-tRNA-Komplexes zur Erzeugung des 43S Vor-Initiierungskomplexes (Phan et al., 2001). Es zeigte sich, dass elF3 p47 ein Mitglied einer neuen Mov-34-Familie von Proteinen ist, zu deren Funktionen unter 15 anderem der makromolekulare Zusammenbau gehört (Asano et al., 1997). Erhöhte Mengen von elF3 p47 im fötalen DS-Gehirn können zu einem fehlerhaften Zusammenbau des elF3-Komplexes führen oder einige Untereinheiten austitrieren, wodurch elF3 ein schwaches Gerüst für den Zusammenbau anderer Initiierungsfaktoren auf dem Ribosom wird. Diese Feststellung lässt vermuten, dass eine fehlerhafte Protein-Synthese beim fötalen DS nicht nur auf den Ver-20 lust von Transkriptionsfaktoren und Verlängerungsfaktoren zurückzuführen ist (Freidl et al., 2001), sondern teilweise auch von einer Störung der Initiierungsfaktoren stammen kann.

Signalgebungs-Proteine 25 APLP-1 ist ein Membran-assoziiertes Glykoprotein, dessen Gen mit dem ß-Amyloid-Vorläufer-Gen homolog ist, und hauptsächlich im Zentralnervensystem exprimiert wird, vonwiegend in den postsynaptischen Dichten der Großhirnrinde des menschlichen und Ratten-Gehirns (Wasco et al., 1992; Kim et al., 1995). Man nimmt an, dass APLP-1 bei der synaptischen Reifung während der kortikalen Entwicklung (Kim et al., 1995) und neuronalen Differenzierung (Beckman und 30 Iverfeldt, 1997) eine Rolle spielt. Eine verringerte Expression von APLP-1 bei fötalem DS könnte daher zumindest eine teilweise Erklärung für die im DS-Gehirn gefundene retardierte Synap-togenese und abnorme Differenzierung (Wisniewski, 1990; Kim et al., 2000) sein.

Die Rezeptor-Tyrosin-Kinasen spielen eine wichtige Rolle bei der Zellproliferation und 35 -Differenzierung, indem sie sich selbst und auch andere, stromabwärts befindliche Signalgebungsmoleküle als Reaktion auf eine Liganden-Bindung phosphorylieren, was zu einer Veränderung in der Gen-Expression führt. Außerdem kann die Kinase-Domäne von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen konstitutiv durch Punkt-Mutation oder chromosomale Umordnung („rearrangement“) aktivieren, was den Rezeptoren ein onkogenes Potential verleiht. ALK ist eine Rezeptor-40 Tyrosin-Kinase der Insulin-Rezeptor-Familie, deren Expression normalenweise auf neurale Gewebe beschränkt ist (Iwahara et al., 1997). Gen-Umordnungen schaffen ALK-Fusions-Gene, einschließlich NPM (Nukleophosmin)-ALK (Anmerkung: NPM war zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant verändert), TPM3-ALK und TPM4-ALK (Morris et al., 1994; Lawrence et al., 2000). Das von solchen fusionierten Genen codierte trunkierte ALK ist dereguliert und phospho-45 ryliert intrazelluläre Substrate, um eine maligne Transformation auszulösen (Morris et al., 1994). Daraus ergibt sich, dass geringere Mengen des TPM4-ALK-Fusions-Proteins im fötalen DS vermutlich ein Hinweis auf die Möglichkeit sind, dass bei DS ein geringeres Risiko für einen Gehirntumor besteht. In der Literatur wird von etwa 36 DS-Patienten mit Gehirntumoren berichtet (Satge et al., 2001), und es wurde vorgeschlagen, dass die angeborene Missbildung Fakto-50 ren beiträgt, die die Entwicklung bestimmter Malignitäten inhibiert oder verzögert (Nishi et al., 2000). Es ist daher plausibel, dass die Seltenheit von Gehirntumoren bei DS-Patienten mit der verringerten Expression von Proteinen mit neuroonkogenem Potential, wie TPM4-ALK, verbunden sein könnte. 55 SH2/SH3-Domänen-enthaltende Proteine fungieren als zweiter Messenger, der die Protein- 1 6

AT 414 171 B

Tyrosin-Phosphorylierung mit einer Vielfalt von intrazellulären Signalisierungs-Netzen verbindet. Das Nck-Adaptor-Protein besteht aus drei SH3-Domänen und einer SH2-Domäne. Die SH2-Domäne von Nck assoziiert mit den Tyrosin-phosphorylierten Proteinen der Zelloberfläche, und seine SH3-Domänen rekrutieren Prolin-reiche, stromabwärts befindliche Effektor-Moleküle, die 5 Prozesse, wie die Membran-Kräuselung („membrane ruffling“), Vesikel-Motilität und Axon-Leitung („axon guidance“), regulieren (Buday, 1999, Li und She, 2000). Zwei humane Nck-Gene (Ncka und Nckß/2) wurden charakterisiert, und es zeigt sich, dass Nckß sowohl an Rezeptorals auch an non-Rezeptor-Tyrosin-Kinasen um ein Vielfaches besser bindet als Ncka (Chen et al., 1998). Eine Mutation im Dreadlocks (Dock)-Gen von Drosophila, dem Homolog von Säuger-io Nck, unterbrach die Signalgebung von der Oberfläche des Wachstums-Konus zum intrazellulären Aktin-Zellskelett, was zu einer fehlerhaften Photorezeptor-Leitung und Target-Erkennung führte (Garrity et al., 1996). Eine wachsende Anzahl von Studien belegte, dass humanes Nck auch eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Signalgebung an das Aktin-Zellskelett spielt (Chen et al., 2000; Rohatgi et al., 2001). Somit würde man eine abnorme 15 neuronale Migration beim fötalen DS während der Gehirnentwicklung als Folge von verringertem Nck2 Voraussagen, was tatsächlich auch der Fall ist (Wisniewski, 1990). SH3GLB2 ist durch das Vorhandensein einer Dimerisations-Domäne und einer C-terminalen SH3-Domäne charakterisiert und gehört zu den die SH3-Domäne enthaltenden Proteinen der 20 Endophilin-Familie (Pierrat et al., 2001). Die Funktion des Proteins ist nicht bekannt. Jedoch zeigt das Vorhandensein der SH3-Domäne an, dass das Protein am Signalgebungsprozess beteiligt ist. Es wird angemerkt, dass Mitglieder der Endophilin-Familie Proteine modulieren, die bei der synaptischen Vesikel-Endocytose, Zellskelett-Matrix-Organisation und Aufrechterhaltung der Mitochondrien-Morphologie eine Rolle spielen (Micheva et al., 1997; Smrinova et al., 1998). 25 Wenn SH3GLB2 auch solche Rollen übernimmt, könnte seine Verringerung bei fötalem DS zu Abnormitäten des synaptischen Aufbaus, des Zellskeletts und der Mitochondrien bei DS beitragen.

Zellskelett-assoziierte Proteine 30

Mikrotubuli üben wesentliche und unterschiedliche Funktionen in eukaryontischen Zellen aus. Sie sind besonders im Zentralnervensystem vorherrschend, wo sie für die Organisation und Funktion axonaler und dendritischer Prozesse von Neuronen wesentlich zu sein scheinen. Die Mikrotubuli des eukaryontischen Zellskeletts sind aus einem Heterodimer von a- und ß-Tubulin 35 zusammengesetzt, obwohl auch andere Mitglieder der Tubulin-Familien kürzlich identifiziert wurden (Dutcher, 2001). ß-Tubulin wird im Soma und in den Dendriten von Neuronen stark exprimiert (Rosenstein, 1995), und seine Expression in verschiedenen Spezies variiert je nach den Phasen der Synaptogenese (Bhattacharya und Sarkar, 1991). Die höchste Expression wird in der Phasenmitte der Synaptogenese erreicht und nimmt mit dem Ende der Synaptogenese 40 ab. Eine bemerkenswerte Verringerung von ß-Tubulin im zweiten Trimester des fötalen DS-Gehirns, wo man erwartet, dass die aktive Synaptogenese stattfindet, unterstreicht, dass es im DS-Gehirn tatsächlich eine kortikale Dysgenese gibt. Der Verlust von beta-Tubulin könnte teilweise einer verringerten Expression des t-Komplex Polypeptids-1 (TCP-1) beim fötalen DS zugeschrieben werden (Yoo et al., 2001). TCP-1 ist ein selektiver molekularer Chaperone in der 45 Tubulin-Biogenese, wobei naszente Tubulin-Untereinheiten daran binden und in Zusammenbaukompetenten Formen freigesetzt werden. Alternativ könnte die abnorme Migration und synaptische Verbindbarkeit bei DS die DS-Neuronen dazu zwingen, einem neuen Entwicklungsschema zu folgen, da eine solche Situation zu einer relativ geringen Menge an Tubulin bei transplantierten Neuronen führt (Rosenstein, 1995). 50

Die Septine sind eine neue Gruppe der GTPasen, die erstmals in Hefe identifiziert wurden und in jüngerer Zeit in einem breiten Spektrum von Tierzellen gefunden wurden. Obwohl man ursprünglich dachte, dass die Septine bei der Steuerung der Cytokinese eine Funktion innehaben, lässt ihr Vorhandensein an Stellen dynamischer Zellmembran-Ereignisse sehr stark eine aktive 55 Rolle an Prozessen vermuten, bei welchen die Zellmembranen eine Rolle spielen (Field und 1 7

AT 414 171 B

Kellogg, 1999; Trimble, 1999; Karmann und Roth, 2000). Tatsächlich weist ihre reichliche Expression im Gehirn, einem vonwiegend nicht-mitotischen Gewebe, darauf hin, dass zumindest ein Teil der Funktion von Septinen nicht mit der Cytokinese zu tun hat und bei Neuronen erforderlich ist (Trimble, 1999). Es wurde festgestellt, dass Septin 7 mit dem Exocyst-Komplex 5 (einem konservierten Protein-Komplex, von dem man weiß, dass er eine Schlüsselrolle beim Vesikel-Targeting oder „Tethering“ spielt) bei Neuronen assoziiiert ist (Hsu et al., 1998), was anzeigt, dass es eine Rolle beim Hinzufügen von Membran an die sich entwickelnden neuronalen Strukturen spielt. Es wurde auch als Bestandteil der postsynaptischen Dichte-Fraktion identifiziert, wo es ein Gerüst für das Hinzufügen von Proteinen zur sich entwickelnden postsynapti-io sehen Membran bilden könnte und danach als Teil der postsynaptischen Dichte der reifen

Synapse weiter existieren könnte (Walikonis et al., 2000). Die Feststellung eines Septin 7-Mangels passt zum früheren Bericht über eine Verringerung von Septin 6 im fötalen DS (Cheon et al., 2001). Dies zeigt an, dass ein Verlust von Septinen, die mit synaptischen Strukturen assoziiert sind, ein immer wiederkehrendes Thema bei DS ist, und es könnte die Ursache 15 für eine gestörte Synaptogenese und synaptische Funktion sein. Vielleicht der interessanteste, jedoch bisher noch unerklärte Aspekt der Rolle der Septine ist ihre Verbindung mit akuter myeloischer Leukämie. Das Septin-Gen ist ein Fusions-Partner für das MLL-Gen und trägt zur Entwicklung einer de novo-Leukämie bei Kindern (Ono et al., 2002) sowie einer akuten, mit einer Therapie in Verbindung stehenden Leukämie (Osaka et al., 1999) bei. MSF gehört zu den 20 Septin-Genen, die als Target für die MLL-Fusion dienen. MLL ist ein DNA-Bindungs-Protein, und die MLL/Septin-Fusions-Proteine enthalten den N-Terminus von MLL, einschließlich der DNA-Bindungs-Domäne, und fast das gesamte Septin-Protein (Osaka et al., 1999). Obwohl das MLL-MSF-Fusions-Produkt ein Aktivierungs-Potential aufweist, gibt es starke Beweise dafür, dass die Fusionspartner von MLL auch eine wichtige Rolle bei der Entstehung einer akuten 25 Leukämie spielen (Corral et al., 1996). Eine gesteigerte Expression von Hirn-MSF-B könnte einen Hinweis darauf geben, warum bei DS-Kindern eine akute Leukämie gehäuft auftritt. Anderseits ist bei einigen Eierstock- und Brust-Tumoren ein Chromosomen-Bereich, in welchem MSF liegt, deletiert, was andeutet, dass die Region einen bisher noch unidentifizierten Tumor-Suppressor enthält, oder dass MSF selbst ein solcher Tumor-Suppressor sein könnte (Kalikin et 30 al., 2000). Bei dieser Sachlage liefert eine erhöhte Expression von MSF eine zusätzliche Erklärung für das seltene Auftreten von Gehirntumoren bei DS.

Verschiedene Proteine 35 HSP 75 (Chen et al., 1996), das auch als Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)-Rezeptor-assoziiertes Protein 1 (TRAP-1) bekannt ist (Song et al., 1995) ist mit der HSP 90-Protein-Familie verwandt und wird in verschiedenen Säuger-Geweben, einschließlich dem Gehirn, ubiquitär exprimiert. Obwohl früher berichtet wurde, dass die subzelluläre Lokalisierung zytoplasmatisch oder perinuklear wäre (Chen et al., 1996), zeigten spätere Studien, dass sie mitochondrial ist (Felts et 40 al., 2000). Die Art, in welcher HSP 75 kloniert wurde, ließe auch darauf schließen, dass seine zellulären Targets der TNF-Rezeptor, ein Transmembran-Zellenoberflächen-Protein (Song et al., 1995), und Retinoblastom-Protein, ein vorwiegend nukleares Protein (Chen et al., 1996), sind. Somit würde eine erhöhte Expression von HSP 75 im fötalen DS eine weitreichende Wirkung auf die Zell-Proliferation und -differenzierung sowie auf den Zell-Zyklus haben. Die Mög-45 lichkeit, dass eine gesteigerte Expression von HSP 75 nur eine Reaktion anzeigt, die gegen zellulären Stress gerichtet ist, kann auch nicht ausgeschlossen werden. HSPC 140 ist ein Protein, das von einem Gen codiert wird, welches aus haematopoietischen CD34+-Stammzellen kloniert wurde (Zhang et al., 2000). Die in der Literatur zu findenden In-50 formationen über dieses Protein sind spärlich. Beispielsweise sind die chromosomale Lokalisierung, das Struktur-Motiv oder das Gewebe-Expressionsprofil dieses Proteins nicht bekannt. Folglich kann HSPC als neues Protein angesehen werden, dessen Expression im fötalen DS-Gehirn erhöht ist. Die Signifikanz seines gesteigerten Vorkommens im fötalen DS-Gehirn ist eine Herausforderung für zukünftige Nachforschungen. Was bei der vorliegenden Studie inte-55 ressant ist, ist, dass keines der Apoptose-verwandten Proteine irgendeine signifikante Verände- 18

AT 414 171 B rung zeigte, was die Hypothese stärkt, dass die Apoptose bei fötalem DS nicht fehlgesteuert ist (Engidawork et al., 2001). Eine unveränderte Expression des Apopain(Caspase-3)-Vorläufers, einer Effektor-Caspase, die bei der Entwicklungs-Apoptose eine wesentliche Rolle spielt, und cytoplasmatischer Antiproteinase, eines Proteins, das Granzym inhibiert, welches die Aktivie-5 rung von pro-Caspase 8 bei DS katalysieren kann, belegt diese Tatsache. Zusammenfassend sei gesagt, dass die Identifizierung und Bewertung der Protein-Expression ein nützlicher erster Schritt zum Verständnis des molekularen Mechanismus ist, der zur Neuropathologie von DS führt oder diese repräsentiert. Die molekularen Details dahingehend, wie diese Proteine tatsächlich zu diesen Abnormitäten führen, bedarf weiterer Nachforschung. 10

Tabelle 1: Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen im humanen fötalen Gehirn. Proteine aus der Großhirnrinde von 5-7 Kontrollen und 5-9 Föten mit Down-Syndrom wurden getrennt und identifiziert, indem aus MALDI-Analysen erhaltene Daten verwendet wurden. Unter Verwendung von partiellen Gel-Bildern, die ein Gebiet, an dem ein Interesse besteht, darstellen, 15 wurde die relative Intensität der Spots, die das Protein darstellen, an dem man interessiert ist, unter Verwendung der 2D-lmage-Master-Software gemessen. Die Intergruppen-Analyse wurde unter Verwendung des nicht-parametrischen Mann-Whitney U-Tests durchgeführt, und die Signifikanz wurde mit P<0,05 festgelegt. 20 *P<0,05, **P<0,01. 25 30 35 40 45 50 55 1 9

AT 414 171 B 5 10 15

xn Q 20 25 Φ CDIro io LL c Φ c COE 3 /«“N /—X /~\ /^s /—N ΙΛ /~\ fs. /—s /s rs /—s /—. /•"ν /-> v©' V© so r- Os 00 || r- Os 11 m m r- V© vo V© 00 oo r- Ό II II II II II II II II c II II <1 g II II (1 II II II il II II II c c c c c c c c Nw</ G c Sw/ c c G G C c G G c C Sw/ Sw/ s-/ Sw/ Sw/ Sw< Sw-/ #- W Sw/ S»/ Sw/ Sw/ Sw/ S-/ s-/ Sw-/ Sw/ Sw/ »- CS (T. oc \© i-·: «Γ, τ S_/ 00 Os V© 0 * «_ o Os v© l 'S o 1—s q q q q r—t o ob ο. ©^ q q CS o q q. q cs

..5¾¾¾ Tt Ö Λ ^ O (S Ή 00 rH r-Γ ö* θ’ θ’ ο" s?ss? O «O \© \0 ^ <N —‘ q CScT o° θ’ Ο θ’ §?sssss§ q q q ’ cn ο* o ^ 04 rü Wi tJ· ο γλ vo cs

ä I ü JL HL & !U 1 V»/ S»/ Sw-· S»/ W Sw/ Sw/ W Sw/ v—/ »—tsd-^-*-H»OCS—‘VOO—< 000*“'i-'<CS*-«0'©0 3¾$2¾¾¾¾¾¾ pihto<noooo^r>w q.o qq qoo.-« q q —^ θ’ ö" cT ο” θ’ ö” cT o i-Γ cT

vO'C'üh >0 5 oooooooooo ώώωώώώώώ«« OOOOt'tCÄCMJOOO q*-i tOON.Ch oo_ —q q Ow 1-Γ 4-Γ w“4 (θ' N fO Η H OOcOhOiNO\O>0«nO «SOOhOCSmNMt ^η^Ν^·ΟΉ00ΟνΝΝ *rr>T|-co,«t oo h cn ^ οι θ\ «Λ Ό oo «o tf\ «<t ^O^oo^^-oo^in Tf^vq, Tt“ τΓ ^ ^ 'O ^ ^ V) t-* Γ-* Γ-“ f·'*· I! fl II ff II c c c c c 'S*-/ Sw/ Sw/ w Sw/ m vo oo νρ i-c O 1-1 O q.CS S'gSjSS cn t*· oo τί; «-< cs cn —< cs cT θ’ o* ö* o

α 5 c< c·' «o 0 0-100 ώώώώώ ?§88§_ 00 ^ r-H

Tf Λ (Λ vo V*> O Tf —» CS Ό n N r- N MO vo Ό Ol ηόΙσιΌΌ h h· Tf Μ Οι CS O 00 00 q vT vd~ Tj^ vo s© o o o o o o /“S /N /*S /—\ /*\ /*» II II II Η Μ Π II II II G C G C C G GC G Sw/ S«/ s«/ S./ S·/ Sw/ S^c S^ Sw/ oa^ooqhHfj 5¾¾¾¾¾¾¾¾ nhöO>nOwovi OcnosqqcSOqq o’cTo'oo'ofooo"

H(OOMOOOsh»Ö5 ^©OO—<©00© ώώώώώώώώ« —«OOOOOQOOO© —* 00 CS Ο δδ,^^.Ν «Η pN pN ^ Η H CO H OOOC'-’^tOOsOsninrr «O^dO^OMOOVi Tt4t^Nvor-^o\|n CSOOfOOCSCSOt-Os Ov>>to^ininr"H (niocncn^^cv^n _ r- o q qqq os hoho^ vC so* v*j s© v© ocT ό r- 30 35 40 45 C ω c 'φ o Q. c o > O) c 3 w ω 'n jw W-» c (0 3 σ T3 C 3 CD C 3 i_ ω 'n 60 - »n P o _ s© 'O^SvjOiooSoot.Sg&SgSSigS SSuöS < c Φ Ό 50

Φ .Ω CO

Os ÖOooÖfH S cn Os co Os <D t"* ή ►jr VI rt«V)gO\ SaS

Os Os CO CO £2

o\ a\.ooo ^ 00 rn so cs r VI WS V· i W Li. ww» w -st —i cs cn 3 50 o _ . . S3:^f:|g2SS 82£8δδ£ε£

itilΙου §S

55 20 5

ΙΛ Q

. t" II c I

Η II ^ ^ z"' C c θ' Γ' Ό t*' w O i| || (| || * * c c c c * « w w w w ^ ^ rM ιΗ Ο O t-1 o O 00 ΙΛ \0 OO Ό r- c II C II t-* c c Ifl — II — “ * c * * w * on tj- r- o tj- o O »o μ io o

\& /-s II Ό _ c II <S ^ c |1 J. w C

Ό II . y-s /-\ OO r—V Ό 00 V> C- II .. II II II II e II c c c c c ^ c S_, w \_z >s-/ W ^ w «Ο Ό ^ Ol (Ο Ή (Λ — Ο CO Ο C — ΙΛ

3¾¾¾¾¾¾ «ISällS (SHÖN^OOOÖleO^· ^ Ο· ή Τ Ο τ|· 3 ή Ο (N OO ^ « IO p VÖ o o

^ oo r* öl bei ^ *-H 00 p CS ö* cT cT r-Γ O oT CS

(S ^ fS. ^ Οβ Ο Η (Ο H iM OO Tf ν£> U-) Ο Ο. q. cs in cT ö* cn* θ’ Ö* Ο* ^ 10 15 20 25 30 35 40 45 (Λ c o Ll_ y-N /^N Λ, f~~\ /-V /—\ <~s ιηΌΟΌοοΌΌο r-II II II II || II II II II II cccccccccc W W w 'w' 'w' S_^ N«/ S-r«nt>o>ci»ov>rioo 0·ηθΗθΌ^τί·Η 2¾¾¾¾¾¾¾¾ ......^ „ +1 „ p o co.t-^ co o co vo o p O cT^o o' o’ of ο’ h ri -göoobbo9H=, ϊώώώώωώωώ ppδ,ο oo^^qoo *N N r4 Oi N «-* VJä ΐηΌΝΟχηοΌΌΌΌΗ 'ΟΊ’Ο-^Ο'ΦΟΌΟ^'Ο χίΟΟΙΛΜ^ΟΐΟΝΟΌΟ »-'ΝΟ'ίΟχίΓ'ΟΟΟΟ»-«·^ %or-c4Ttrt<ocn^n^ OiOOOOrniooONmvOO rfp wn, cs oo p p «-<_ cs,

ό oo ό Ό φ o ........ Η I II II II c c

II II C G

Xf Ol OO O H 4 *—< S S Sj-g S S Λ h Q\ Ot τ|" *1. ^ ^4 ^ p4 ^4 *>4 •\J· 5 \ß ‘ » © Opp »0 co _ _ _ O »H ώ ώ m ώ ώ ώ ώ ο ο,8 ? §,8 § •Η τΗ f·» *Η »—4

OiOOhOOO V <Ν OO (Ν Ο $ Q (Λ Η «ο h Ό Ο Μ»Γ«<ηΐΛΟΐΟΟ SO V\ CS οο, ^ ^ ρ τ* Tf” 00 '•ο ό” r-* σΓ r^spr^r^voOr-Γ“ η η 11 11 ιι ιι I) η CCCGCCCG >W^ S_/ V_/ \-/ w 'w' Ho^^dNinto Ο « Ο O OfO Ο η, ^2252¾ ίΛΐηό\νρ^3;6Ιοχ pro O p p, w-^ o’oÖ'fOOOO’- 8SS§ ώ ώ ci ώ 'Sßßßßßßß. r4 rn (sTco*^ N xt* Ό m Ό so hio in o\

OmOihCOXtOiOO moiNooooooKO eo^ooOO««n eownori^^o cocscoco^rsr^m V“ vf ό r- m t-^* vo vd“ 50 Φ "05 .Q (0 rf »o Γ-^ SO vO* *xf~ »θ’ IO*

gS5?Spp 5¾ Μ Ι-. Ό Ω co rs <ο ’ . δ^δαδ^αδ es asuffN|st||i

SOfO^ONS-^OsOk pTf^p f-^r^p-pp

AT 414 171 B 55 21

AT 414 171 B

Literaturstellen:

Altafaj X., et al., (2001). Hum Mol Genet 18:1915-1923 Andley UP., et al., (2000). J Biol Chem 275: 36823-36831 5 Antonarakis, S. E., 1998. Genomics 51,1-16,

Bashour AM, et al., (1998). J Biol Chem 273:19612-19617 Becker W„ et al., (1998). J Biol Chem 273: 25893-25902,

Becker, L. E., et al., 1991. In: Epstein, C., J., (Ed.), The morphogenesis of Down syndrome, Wiley-Liss, New York, pp. 133. io Beckman, M., et al., 1997. Neurosci. Lett. 221, 73-76.

Berndt, P., et al., 1999. Electrophoresis 20, 3521-3526.

Bernert, G., et al., 2002. Proteomics 2, 1752-1757.

Bhattacharya, B., et al., 1991. Int. J. Dev. Neurosci. 9, 89-99.

Bradford, M„ 1976. Anal. Biochem. 72, 248-254. 15 Brodsky G., et al., (1997). Hum Mol Genet 6: 2043-2050 Buday, L., 1999. Biochimi. Biophys. Acta 1422, 187-204.

Busciglio, J., et al., 1995. Nature 378, 776-779.

Chen, C. -F., etal., 1996. Mol Cell. Biol. 16, 4691-4699.

Chen, M., et al., 1998. J. Biol. Chem. 273, 25171-25178. 20 Chen, M., et al., 2000. Mol. Cell Biol. 20, 7867-7880.

Chen P., et al., (1999). Adv Enzyme Regul 39: 93-109.

Cheon, M. S., et al., 2001. J. Neural Transm. 61 [Suppl], 311-319.

Claudio JO, et al., (2001). Oncogene 20: 5373-5377.

Cork, L. C., 1990. Am. J. Genetics 7 [Suppl], 282-286. 25 Corral, J., et al., 1996. Cell 85, 853-861.

De Rijk EP, et al., (2000). Int J Exp Pathol 81: 271-282.

Dong A., et al., (1997). Arch Biochem Biophys 344: 125-132.

Dutcher, S. K., 2001. Cell Biol. 13, 49-54.

Dutt, M. J., et al., 2000. Proteomic analysis. Curr. Opin. Biotechnol. 11,176-179. 30 Engidawork, E., et al., 2001. Amino Acids 21, 331-361.

Engidawork E, et al., (2001a). J Neural Transm Suppl 61: 335-346.

Engidawork E, et al., (2001b). J Neural Transm Suppl 61:149-162.

Epstein, J. etal., McGraw Hill, Inc., New York 1995, pp. 749-794.

Epstein, J., 2001. Down syndrome. In: Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S., Valle, D. (Eds), 35 The metabolic and molecular bases of inherited disease, vol 1. McGraw Hill, Inc., New York, pp. 1223-1256.

Felts, S. J., et al., 2000. J. Biol. Chem. 275, 3305-3312.

Field, C. M., etal., 1999. Trends Cell Biol. 9, 387-394.

Fountoulakis, M., etal., 1997. Anal. Biochem. 250, 153-156. 40 Fountoulakis et al., Electrophoresis 1999, 20, 3572-9.

Fountoulakis, M., 2001. Amino Acids 21, 363-381.

Fowler B (2001). Kidney Int 59: S-221-S-229.

Freidl, M., et al., 2001. J. Neural Transm. 61 [Suppl] 47-57.

Gao Y, et al., (2001). J Cell Biol 152: 877-894. 45 Garrity, P. A., et al., 1996. Cell 85, 639-650.

Guimera J., et al., (1999). Genomics 57: 407-418.

Gulesserian, T., et al., 2001. J. Neural Transm. 61 [Suppl] 71-84.

Heisenberg M., et al., (1985). J Neurogenet 2:1-30.

Hermon, M., etal., 1998. Neurosci. Lett. 251, 45-48. so Hoque, Μ. T„ et al., 2001. J. biol. Chem. 276, 5059-5067.

Horwitz J., (2000). Semin Cell Dev Biol 11: 53-60.

Hsu, S. C., et al., 1998. Neuron 20, 1111-1122.

Iwahara, T., et al., 1997. Oncogene 14, 439-449.

Kalikin, L. M., et al., (2000) Genomics 63, 165-172. 55 Kamradt MC, et al., (2001). J Biol Chem 276:16059-16063.

Claims (11)

1. 22 AT 414 171 B Kery V., et al., (1998). Arch Biochem Biophys 355: 222-232. Kim, T. W., et al., 1995. Mol. Brain Res. 32, 36-44. Kim, S. H., et al., 2000. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276, 329-334. Langen, H. et al., Electrophoresis 1997,18, 2085-2090. 5 Langen et al., Electrophoresis 1999, 20, 907-16. Lawrence, B., et al., 2000. Am. J. Pathol. 175, 377-384. Li, W., et al., 2000. Histol. Histopathol. 15, 947-955. Mann, D. Μ. M., 1988. Mech. Aging Dev. 43, 99-136. McKay, M. J., et al., 1996. Genomics 36, 305-315. io Micheva, K. D., et al., 1997. J. Biol. Chem. 272, 27239-27245. Morris, S. W., etal., 1994. Science 263,1281-1284. Nishi, M., et al., 2000. Med. Pediatr. Oncol. 34, 250-254. Okui M, et al., (1999). Genomics 62:165-171. Ono, R., et al., 2002. Cancer Res. 62, 333-337. 15 Osaka, M„ et al., 1999. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 6428-6433. Pace, H. C., et al., 2001. Genome Biol. 2,0001.1-0001.9. Phan, L., etal., 2001. EMBO J. 20, 2954-2965. Pierrat, B., et al., 2001. Genomics 71,222-234. Pogribna M, et al., (2001). Am J Hum Genet 69: 88-95. 20 Rahmani Z, et al., (1998). Biochem Biophys Res Commun 253: 514-518. Reeves RH, et al., (1995). Nat Genet 11:177-184. Rohatgi, R„ et al., 2001. J. Biol. Chem. 276, 2648-26452. Rosenquist TH, et al., (1996). Proc Natl Acad Sei USA 93:15227-15232. Rosenstein, J. M., 1995. Cell Transplant. 4, 83-91. 25 Satge, D., etal., 2001. Cancer91, 1458-1466. Shan X., et al., (2001). Hum Mol Genet 10: 635-643 Shane B., et al., (1984). New York, vol 1 p 433-455. Smrinova, E., et al., 1998. J. Cell Biol. 143, 351-358. Song, Η. Y„ et al., 1995. J. Biol. Chem. 270, 3574-3581. 30 Takashima, S., etal., 1981. Brain Res. 225,1-21. Trimble, W. S., 1999. J. Membrane Biol. 169, 75-81. Uchida T., et al., (2001). Biochem Biophys Res Commun 288:137-141. Walikonis, R. S., et al., 2000. J. Neurosci. 20, 4069-4080. Wasco, W„ et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89,10758-10762. 35 Watanabe M., et al., (1995). Proc Natl Acad Sei USA 92: 1585-1589. Wisniewski, K. E., et al., 1985. Ann. Neurol. 17, 278-282. Wisniewski, K. E., 1990. Am. J. Med. Genet. 7 [Suppl], 274-281. Yoo, B.J., et al., Nature 2001, 411, 763-764. Yoo BC, et al., (2001). J Neural Transm Suppl 61: 321-334. 40 Zhang, Q. -H., et al., 2000. Genome Res. 10, 1546-1560. Zhang, X., et al., J Neurobiol 2000, 45,14-29. Patentansprüche: 45 1. Verfahren zur Diagnostizierung von Down Syndrom, welches die folgenden Schritte umfasst: - Vorsehen einer Amnionflüssigkeitsprobe, einer Blut- oder Serumprobe einer schwangeren Frau oder einer Gehirn-Gewebeprobe, so - Bestimmen der Menge mindestens eines der Proteine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hämatopoietin-Adapter enthaltend die Src-Homologie 3-Domäne und sterile α-Motive (HACS1) (hematopoietic adapter containing Src homology 3 domain and sterile α motifs), Doppelstrang-Bruch-Reparatur-Protein rad 21-Homolog (double-strand break re-pair protein rad 21 homologue), eukaryontischer Translationsfaktor-3-Untereinheit 5 (euka-55 ryotic translation factor 3 subunit 5), mixed-lineage-Leukämie-Septin-artigem Fusions- 23 AT 414 171 B Protein B (mixed lineage leukemia septin-like fusion protein-B), Hitzeschock-Protein 75 (heat shock protein 75), ß-Amyloid-Vorläufer-artigem Protein 1 (ß-amyloid precursor-like protein 1), Tropomyosin-4-anaplastischem Lymphom-Kinase-Fusions-Onkoprotein Typ 2 (tropomyosin 4-anaplastic lymphoma kinase fusion oncoprotein type 2), Nck-Adaptor-5 Protein 2 (Nck adaptor protein 2), Src-Homologie-Domänen-Wachstumsfaktor-Rezeptor- gebundenem 2-artigen Endophilin B2 (Src homology domain growth factor receptor bound 2-like endophilin B2), Septin 7 und hämatopoietische Stamm/Progenitor-Zellen 140 (HSP 140) (hematopoietic stem/progenitor cells 140), - Vergleichen der nachgewiesenen Menge mit einer Standard-Menge des (der) entspre-io chenden Proteins (Proteine) in einer nicht-Down-Syndrom-Probe, die der Amnionflüssigkeitsprobe, der Blut- oder Serumprobe einer schwangeren Frau oder der Gehirn-Gewebeprobe entspricht, und - Diagnostizieren von Down-Syndrom, wenn die nachgewiesene Menge unter der Standard-Menge liegt, wenn die Menge des Hämatopoietin-Adapters enthaltend die Src- 15 Homologie 3-Domäne und sterile α-Motive (HACS1) (hematopoietic adapter containing Src homology 3 domain and sterile α motifs), ß-Amyloid-Vorläufer-artigen Proteins 1 (ß-amyloid precursor-like protein 1), Tropomyosin-4-anaplastischen Lymphom-Kinase-Fusions-Onkoproteins Typ 2 (tropomyosin 4-anaplastic lymphoma kinase fusion oncoprotein type 2), Nck-Adaptor-Proteins 2 (Nck adaptor protein 2), Src-Homologie-Domänen-20 Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenen 2-artigen Endophilins B2 (Src homology domain growth factor receptor bound 2-like endophilin B2), Septins 7 und der hämatopoietischen Stamm/Progenitor-Zellen 140 (HSP 140) (hematopoietic stem/progenitor cells 140) bestimmt wird, oder - Diagnostizieren von Down-Syndrom, wenn die nachgewiesene Menge über der Standard- 25 Menge liegt, wenn die Menge des Doppelstrang-Bruch-Reparatur-Protein rad 21-Homologs (double-strand break repair protein rad 21 homologue), eukaryontischen Translationsfaktors 3-Untereinheit 5 (eukaryotic translation factor 3 subunit 5), mixed-lineage-Leukämie-Septin-artigen Fusions-Proteins B (mixed lineage leukemia septin-like fusion protein-B) oder des Hitzeschock-Proteins 75 (heat shock protein 75) bestimmt wird. 30
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des Proteins (der Proteine) durch ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein-Massenspektroskopie, Antikörperbindung, zweidimensionaler Gel-Elektrophorese oder Kombinationen davon, bestimmt wird. 35
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge des Proteins (der Proteine) durch die Bestimmung der mRNA, die für das Protein (die Proteine) codiert, bestimmt wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge von drei oder mehr, vorzugsweise von acht oder mehr, insbesondere von zehn oder mehr, der Proteine gleichzeitig in der Probe bestimmt werden.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge 45 des Proteins durch Verwendung eines Chips, vorzugsweise eines mRNA-Chips oder eines Antikörper-Chips, bestimmt wird.
6. 6. Set zum Bestimmen der Menge von mindestens zwei Proteinen in einer Probe, wobei die mindestens zwei Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hämatopoietin- 50 Adapter enthaltend die Src-Homologie 3-Domäne und sterile α-Motive (HACS1) (hematopoietic adapter containing Src homology 3 domain and sterile α motifs), Doppelstrang-Bruch-Reparatur-Protein rad 21-Homolog (double-strand break repair protein rad 21 homologue), eukaryontischem Translationsfaktor 3-Untereinheit 5 (eukaryotic translation factor 3 subunit 5), mixed-lineage-Leukämie-Septin-artigem Fusions-Protein B (mixed lineage leukemia septin-like fusion protein-B), Hitzeschock-Protein 75 (heat shock protein 75), 55 24 AT 414 171 B ß-Amyloid-Vorläufer-artigem Protein 1 (ß-amyloid precursor-like protein 1), Tropomyosin-4-anaplastischem Lymphom-Kinase-Fusions-Onkoprotein Typ 2 (tropomyosin 4-anaplastic lymphoma kinase fusion oncoprotein type 2), Nck-Adaptor-Protein 2 (Nck adaptor protein 2), Src-Homologie-Domänen-Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenem 2-artigem Endophi-5 lin B2 (Src homology domain growth factor receptor bound 2-like endophilin B2), Septin 7 und hämatopoietischen Stamm/Progenitor-Zellen 140 (HSP 140) (hematopoietic stem/progenitor cells 140), wobei das Set - einen Probenbehälter, - Mittel zum Nachweisen der mindestens zwei Proteine, insbesondere Antikörper, die die io Proteine spezifisch erkennen, und - Mittel zum Bestimmen der Menge der nachgewiesenen Proteine aufweist.
7. 7. Set nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Nachweisen der mindestens zwei Proteine und die Mittel zum Bestimmen der Menge der nachgewiesenen Pro- 15 teine konjugierte, vorzugsweise markierte Antikörper, insbesondere radioaktiv oder Fluo reszenz markierte Antikörper sind.
8. 8. Set nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Nachweisen der mindestens zwei Proteine an einer festen Oberfläche immobilisiert sind. 20
9. 9. Set zum Bestimmen der Menge der mRNAs von mindestens zwei Proteinen in einer Probe, wobei die mindestens zwei Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Hä-matopoietin-Adapter enthaltend die Src-Homologie 3-Domäne und sterile a-Motive (HACS1) (hematopoietic adapter containing Src homology 3 domain and sterile α motifs), 25 Doppelstrang-Bruch-Reparatur-Protein rad 21-Homolog (double-strand break repair protein rad 21 homologue), eukaryontischer Translationsfaktor 3-Untereinheit 5 (eukaryotic transla-tion factor 3 subunit 5), mixed-lineage-Leukämie-Septin-artigem Fusions-Protein B (mixed lineage leukemia septin-like fusion protein-B), Hitzeschock-Protein 75 (heat shock protein 75), ß-Amyloid-Vorläufer-artigem Protein 1 (ß-amyloid-like-precursor-like protein 1), Tro-30 pomyosin-4-anaplastichem Lymphom-Kinase-Fusions-Onkoprotein Typ 2 (tropomyosin 4-anaplastic lymphoma kinase fusion oncoprotein type 2), Nck-Adaptor-Protein 2 (Nck adaptor protein 2), Src-Homologie-Domänen-Wachstumsfaktor-Rezeptor-gebundenem 2-artigem Endophilin B2 (Src homology domain growth factor receptor bound 2-like endophilin B2), Septin 7 und hämatopoietischen Stamm/Progenitor-Zellen 140 (HSP 140) 35 (hematopoietic stem/progenitor cells 140), wobei das Set - einen Probenbehälter, - Mittel zum Nachweisen der mRNAs der mindestens zwei Proteine, insbesondere komplementäre Nukleinsäuren oder Primer, die die mRNAs amplifizieren, und - Mittel zum Bestimmen der Menge der nachgewiesenen mRNAs aufweist. 40
10. 10. Set nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Nachweisen der mRNAs der mindestens zwei Proteine und die Mittel zum Bestimmen der Menge der nachgewiesenen mRNAs konjugierte, vorzugsweise markierte Nukleinsäuren, insbesondere radioaktiv oder Fluoreszenz markierte Nukleinsäuren sind. 45
11. 11. Set nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Nachweisen der mRNAs der mindestens zwei Proteine an einer festen Oberfläche immobilisiert sind. so Hiezu 5 Blatt Zeichnungen 55