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Das Gebiet der Erfindung betrifft lonentransporter, insbesondere Natriumphosphat-Co- Transporter.
Phosphor spielt eine wichtige Rolle bei der Membranstruktur, dem Transport und der Energie- speicherung. Bei dem normalen physiologischen pH (z. B. pH von 7,4) besteht das anorganische Phosphat (Pi) im Plasma aus einer 4:1-Mischung von HPO42 und H2P04-. Von den im Körper vorhandenen 700 g Phosphor sind 0,1% in der extrazellulären Flüssigkeit in frei diffundierbarer Form vorhanden. Der Plasmagehalt an Pi wird durch die Kontrolle der Pi-Absorption im Dünndarm, unter dem Einfluss von Vitamin D, und die Pi-Ausscheidung in der Niere, unter dem Einfluss des Hormons der Nebenschilddrüse, aufrechterhalten.
Die Absorption von Pi erfordert einen transepithelialen Transport. Eine kritische Stufe des tran- sepithelialen Transports von Pi ist die Aufnahme von Pi in Epithelzellen. Die Pi-Aufnahme wird durch Natriumphosphat-Co-Transporter erreicht, die auf der apikalen Oberfläche der geeigneten Epithelzellen, z. B. Epithelzellen des Darms und der Niere, vorhanden sind. Eine Mehrzahl von Natriumphosphat-Co-Transportern wurde bis heute gefunden, einschliesslich : (Kaninchen); NPT1 (Mensch); Npt1 (Maus) ; NaPi-2 (Ratte) ; NaPi-3 (Mensch) ; NaPi-4 (Opossum) ; NaPi-5 (Flun- der); NaPi-6 (Kaninchen) ; NaPi-7 (Maus) und NaPi von NBL-1-Zellen (Rind).
Mehrere Krankheitszustände werden mit Störungen des Pi-Metabolismus in Verbindung ge- bracht, wobei diese Krankheitszustände solche einschliessen, die durch das Vorliegen einer Hypophosphatämie gekennzeichnet sind, z.B. Osteomalazie, Hypokalziurie und Rachitis, und solche, die durch das Vorliegen einer Hyperphosphatämie gekennzeichnet sind, z. B. Hyperpa- rathyreoidismus, Hypokalzämie, Vitamin-D-Mangel, Verkalkung von Weichgewebe oder metastati- sche Verkalkung und dgl. Insbesondere ist Hyperphosphatämie ein Kennzeichen für Nierenkrank- heit und Nierenversagen und ist eine sehr vielen schädlichen Symptomen, die bei solchen Nieren- komplikationen beobachtet werden, zugrundeliegende Ursache.
Es gibt verschiedene Methoden, um Anomalien im Pi-Metabolismus zu behandeln. Z. B. schlie- #en für Krankheitszustände, die mit dem Vorliegen einer Hypophosphatämie verbunden sind, Behandlungsmethoden ein : der Nahrung, indem phosphorreiche Nahrungsmittel zugefügt werden, Ergänzung durch Phosphorsalze, Verwendung von therapeutischen Mitteln, z. B.
Dipyridamol und dgl. Für solche Krankheitszustände, die mit Hyperphosphatämie verbunden sind, kann die Behandlung, falls keine Niereninsuffizienz vorliegt, eine Hydratisierung und/oder die Verwendung von Antacida auf Aluminiumbasis, die Phosphor im Darmlumen binden, einschliessen.
Wenn eine Niereninsuffizienz vorliegt, sind Phosphatbindemittel und/oder Nahrungsmodifikationen, um die Phosphoraufnahme zu beschränken, möglicherweise nützlich, aber typischerweise wird eine Dialyse angewendet.
Wegen der grossen Vielzahl von Krankheitszuständen, die durch das Vorliegen eines anorma- len Pi-Metabolismus gekennzeichnet sind, besteht ein fortgesetztes Interesse an dem Auffinden von Molekülkomponenten, die für den Pi-Metabolismus verantwortlich sind. Von besonderem Interesse ist das Auffinden der intestinalen Transporter, die für die Absorption und Aufnahme von Pi im Darm verantwortlich sind.
Hilfiker et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA (1998) 95 :14564-14569 die Nucleinsäurese- quenz von Npt2B der Maus. Von Interesse ist auch: Feild et al., "Cloning and Characterization of a Sodium Dependent Phosphate Transporter Isoform Expressed in Human Small Intestine and Lung", veröffentlicht am 24. Dezember 1998 unter der GenBank-Zugangsnummer 4071357 und vorgelegt von Smithkline Beecham Pharmaceuticals, 709 Swedeland Road, King of Prussia, PA 19406 am 7. Dezember 1998). Literaturstellen, die Natriumphosphat-Co-Transporter offenba- ren, schliessen ein : et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA (1991) 88 : 9608-9612 ; Chong et al., Genomics (1993) 18 :355-359; et al., Am. J. Physiol. (1995) 268: F1038-F1045; Magagnin et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA (1993) 90 :5979-5983; et al., J. Biol. Chem. (1994) 269 :6615-6621; Werner et al., Am. J.
Physiol. (1995) 267:F311-F317; Verri et al., Am. J. Physiol.
(1995) 268:F626-F633; Collins et al., FASEB J. (1994) 8 :862-868 undHelps et al., Eur. J. Bio- chem. (1995) 228:927-930.
Von Interesse ist auch WO 98/37198 A1.
Die Literaturstellen, die Hintergrundinformationen zur Rolle von Natriumphosphat-Co- Transportern beim Phosphormetabolismus liefern, schliessen ein : J. Bone Min. Res.
(1997) 12 :159 Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Ausgabe (1998) Seiten
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2259-2263.
Fig. 1 liefert die Aminosäuresequenz von menschlichem Npt2B.
Fig. 2 liefert die Sequenz einer Nucleinsäure, die menschliches Npt2B codiert.
Bevor die vorliegende Erfindung weiter beschrieben wird, wird darauf verwiesen, dass die Erfin- dung nicht durch die speziellen Ausführungsformen der Erfindung, die unten beschrieben werden, beschränkt wird, da Variationen der speziellen Ausführungsformen gemacht werden können und noch im Schutzbereich der beigefügten Ansprüche liegen. Es ist auch selbstverständlich, dass die angewendete Terminologie dem Zweck dient, spezielle Ausführungsformen zu beschreiben und nicht als Beschränkung anzusehen ist. Der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ergibt sich aus den beigefügten Ansprüchen.
In dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen schliessen die Singuiarformen "ein" und "der, die, das" die Pluralformen ein, wenn der Zusammenhang nicht eindeutig dagegen spricht.
Wenn nicht anders angegeben, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie der Fachmann auf diesem Gebiet, auf dem die Erfindung liegt, allgemein versteht.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird, ein Verfahren zum Screenen, um Npt2B-modulierte Mittel aufzufinden, bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Zelle, die funktionel- les Npt2B an ihrer Oberfläche exprimiert, mit einem in Betracht kommenden Mittel in Gegenwart von Phosphoranionen in Kontakt bringt und die Menge der Phosphoranionenaufnahme durch die Zelle bestimmt. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem das Phosphoranion mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist und insbesondere, wenn die Markierung ein Isotop ist.
Ausserdem ist gemäss der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Proteins oder Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, die identisch ist mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 und Natriumphosphat-Co-Transporter-Aktivität aufweist, um Npt2B-modulierende Mittel zu screenen, bereitgestellt.
Das Npt2B-Protein der vorliegenden Erfindung ist ein Membranprotein mit einer Anzahl von Transmembranregionen, wobei die Anzahl der angenommenen Transmembranregionen auf Basis der Aminosäuresequenz 10 ist (vorhergesagt unter Verwendung von TMpred (www. Ch.embnet.org) auf Basis von TMbase (TMbase-A database of membrane spanning protein segments. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347, 166)). Npt2B ist ein Natriumphosphat-Co-Transporter vom Typ ll In seiner nativen Umgebung ist Npt2B ein Co-Transporter für Natriumkationen und Phosphatanionen. Npt2B wird unter anderem auch an der Oberfläche von Darmepithelzellen exprimiert, d. h. auf der apikalen oder intestinalen Luminalseite der Epithelzellen und ist daher für den Transport von Natrium- und Phosphationen aus dem Darmlumen in die Darmepithelzellen verantwortlich.
Npt2B wird auch in den Alveolen der Lunge vom Typ ll exprimiert, wo es am Trans- port von Phosphat in die Zellen beteiligt ist, um den erhöhten Bedarf für die Mucin-Glycoprotein- Synthese zu erfüllen. Die Aminosäuresequenz von Npt2B hat eine 23%ige Identität mit menschli- chen NPT1, wie in Chong et al., "Molecular cloning of the cDNA encoding a human renal sodium phosphate transport protein and its assignment to chromosome 6p21. 3-p23", Genomics (1993), 18 :355-359 beschrieben, und eine 52,5%ige Identität mit menschlichem Npt2a, wie in Maganin et al., "Expression Cloning of Human and Rat Renal Cortex Na/Pi cotransport", Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1993), 90 :5979-5983 (gemessen mit MegAlign, DNAstar (1998) unter Verwendung eines Cluster-Algorithmus, wie in D. G. Higgins und P.M.Sharp : and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer (1989) CABIOS, 5 :151-153 beschrieben. Die verwende- ten Parameter sind ktuple 1, gpa penalty 3, window 5 und diagonals saved 5). Andere Npt2B- Eigenschaften schliessen ein : Potentielle Glycosylierungsstellen an extrazellulären Schlingen.
Npt2B hat die in Fig. 1 gezeigte und mit SEQ ID Nr. 01 bezeichnete Aminosäuresequenz.
Npt2B hat ein Molekulargewicht auf Basis der Aminosäuresequenz von etwa 75 kDa und genauer 75598,52 Dalton (bestimmt mit Protean/DNAstar (1997) gemäss H. Nakashima et al., The Folding Type of a pProetin ist Related to the Amino Acid Composition. J. Biochem (Tokio) 99:153-162).
Das genaue Molekulargewicht von Npt2B kann variieren aufgrund der Glycosylierung und/oder anderer posttranslationaler Modifikationen. Das tatsächliche Molekulargewicht von Npt2B liegt wahrscheinlich im Bereich von etwa 70 bis 130 kDa.
Nucleinsäuren, die das Npt2B-Protein und Npt2B-Polypeptide der vorliegenden Erfindung co- dieren, können cDNA oder genomische DNA oder ein Fragment davon sein. Der Ausdruck
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"Npt2B-Gen" soll sowohl den offenen Leserahmen, der spezifische Npt2B-Proteine und Polypepti- de und Npt2B-lntrons codiert, ebenso wie 5'- und 3'-benachbarte nicht codierenden Nucleotid- sequenzen, die an der Regulation der Expression beteiligt sind, bis zu etwa 20 kb nach der codie- renden Region, und möglicherweise noch weiter in jeder Richtung, einschliessen. Das Gen kann in einen geeigneten Vektor eingebaut werden für die extrachromosomale Erhaltung oder für die Integration in ein Wirtsgenom.
Zusätzlich zu der Vielzahl von Anwendungen, die genauer in den folgenden Abschnitten be- schrieben werden, finden die vorliegenden Nucleinsäurezusammensetzungen Anwendung zur Herstellung der vollständigen Npt2B-Polypeptide oder eines Teils davon, wie oben beschrieben.
Zur Expression kann eine Expressionskassette angewendet werden. Der Expressionsvektor liefert eine Startregion für Transkription und Translation, die induzierbar oder konstitutiv sein kann, wobei die codierende Region operativ verbunden ist unter der Transkriptionskontrolle der Transkriptions- startregion und einer Transkriptions- und Translationsendregion. Diese Kontrollregionen können nativ zu dem Npt2B-Gen gehören oder können aus exogenen Quellen stammen.
Expressionsvektoren haben im allgemeinen übliche Restriktionsstellen, die in der Nähe der Promotorsequenz angeordnet sind, zum Einsetzen der Nucleinsäuresequenzen, die heterologe Proteine codieren. Ein selektierbarer Marker, der in dem Expressionswirt wirksam ist, kann vorhan- den sein. Expressionsvektoren können zur Herstellung von Fusionsproteinen verwendet werden, wobei das exogene Fusionspeptid weitere Funktionalität liefern kann, z. B. erhöhte Proteinsynthe- se, Stabilität, Reaktivität mit definierten Antiserien, einen Enzymmarker, z.B. #-Galactosidase etc.
Expressionskassetten können hergestellt werden mit einer Transkriptionsstartregion, dem Gen oder einem Fragment davon und einer Transkriptionsendregion. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Sequenzen, die die Expression funktioneller Epitope oder Domänen zulassen, die gewöhnlich eine Länge von mindestens 8 Aminosäuren, üblicher mindestens etwa 15 Aminosäuren bis etwa 25 Aminosäuren und bis zum vollständigen offenen Leserahmen des Gens haben. Nach Einführung der DNA können Zellen, die das Konstrukt enthalten, mit Hilfe selektierbarer Marker selektiert werden, die Zellen expandiert werden und dann zur Expression verwendet werden.
Npt2B-Proteine und Polypeptide können in Prokaryoten oder Eukaryoten auf konventionelle Weise exprimiert werden, abhängig vom Zweck der Expression. Für eine Produktion des Proteins in grossem Massstab können einzellige Organismen, z. B. E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Insekten- zellen in Kombination mit Baculovirusvektoren oder Zellen höherer Organismen, z.B. Wirbeltiere, insbesondere Säugetiere, z.B. COS-7-Zellen, HEK 293, CHO, Xenopus Oocytes etc. als Wirtszel- len für die Expression verwendet werden. In einigen Situationen ist es wünschenswert, das Npt2B- Gen in eukaryotischen Zellen zu exprimieren, wo das Npt2B-Protein die native Faltung und die posttranslationalen Modifikationen erfährt. Kleine Peptide können auch im Labor synthetisiert werden.
Polypeptide, die Unterabschnitte der vollständigen Npt2B-Sequenz sind, können verwen- det werden, um Teile des Proteins, die wichtig für seine Funktion sind, festzustellen und zu unter- suchen.
Gemäss der vorliegenden Erfindung werden Npt2B-Polypeptide verwendet für verschiedene Screeningassays, die dazu entwickelt wurden, um therapeutische Mittel aufzufinden. So kann man ein Zellmodell, wie eine Wirtszelle, z. B. CHO, HEK293, COS7, Xenopus Oocyten etc. verwenden, die in einer Art und Weise transfiziert wurden, die ausreicht, um Npt2B an der Oberfläche zu expri- mieren. Man kann dann die Zelle mit einem Medium, das Natrium- und Phosphationen enthält, in Kontakt bringen und die Menge an Phosphationen messen, die von der Zelle aufgenommen wird, wobei die Messungen sowohl in einer Kontrollumgebung als auch einer Testumgebung durchge- führt werden, z. B. in Gegenwart einer in Betracht gezogenen Npt2B-Modulatorverbindung, z. B. eines Npt2B-Agonisten oder eines Npt2B-Antagonisten oder-Inhibitors.
Um den Nachweis der Pi- Aufnahme zu erleichtern, ist markierter Phosphor im Medium vorhanden, wobei jede geeignete Markierung angewendet werden kann, z. B. eine isotopische Markierung, z.B. 32P oder 32P Alterna- tiv können Strommessungen unter Verwendung wohlbekannter elektrophysiologischer Methoden (siehe z.B. Elektrophysiology, A practical Approach (IRL Press) (1993)) durchgeführt werden, aus denen die Pi-Aufnahme bestimmt werden kann. Beispiele für Assays zur Messung der Pi- Aufnahme sind enthalten in : Maganin et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA (Juli 1993), 90:5979-5983 und Helps et al., Eur. J. Biochem. (1995), 228:927-930.
Von Interesse für Screeningassays sind auch nicht menschliche transgene Tiere, die funktio-
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nelles Npt2B exprimieren, wobei solche Tiere oben beschrieben wurden. In vielen Ausführungs- formen fehlt den Tieren endogenes Npt2B. Bei Verwendung solcher Tiere für Screeninganwen- dungen wird eine Testverbindung/werden Testverbindungen dem Tier verabreicht und die entste- henden Veränderungen im Phänotyp, z. B. der Serum-Pi-Pegel, falls vorhanden, werden mit einer Kontrolle verglichen.
Alternativ können in-vitro-Modelle erstellt und angewendet werden. Z. B. kann die Npt2B- Bindungsaktivität in einer in-vitro-Umgebung gemessen werden, in der Bindungsereignisse zwi- schen Npt2B und vorgesehenen Npt2B-modulierenden Mitteln überwacht werden. In anderen in- vitro-Modellen werden synthetische Lipid-Bilayers, die den vorgesehenen Npt2B-Co-Transporter beinhalten, hergestellt und eine Pi-Passage von einer Seite der Lipid-Bilayer zur anderen gemes-
EMI4.1
mica et Biophysica Acta (1995), 1236:339-344; Wonderlin et al., Biophys. J. (1990), 58:289-297 und Suarez-Isla et al., Biochemistry (1983), 22:2319-2323.
Eine Vielzahl anderer Reagenzien kann in dem Screeningassay enthalten sein Diese schlie- #en Reagenzien wie Salze, neutrale Proteine, z. B. Albumin, Detergenzien etc. ein, die verwendet werden, um eine optimale Protein-Protein-Bindung zu erleichtern und/oder nichtspezifische oder Hintergrundwechselwirkungen zu reduzieren. Reagenzien, die die Wirksamkeit des Assays verbessern, z. B. Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikirobielle Mittel etc., können verwendet werden.
Eine Vielzahl verschiedener vorgesehener therapeutischer Mittel, die entweder als Ntp2B- Agonisten oder-Antagonisten dienen, können mit den obigen Methoden gescreent werden. Vorge- sehene oder in Betracht gezogene Mittel umfassen zahlreiche chemische Klassen, obwohl es typischerweise organische Moleküle, bevorzugt kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger als etwa 2500 Dalton sind. Vorgesehene Mittel umfassen funktionelle Gruppen, die für die strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen notwendig sind, insbesondere Wasserstoffbindung, und enthalten typischerweise mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe, bevorzugt mindestens zwei funktionelle chemische Gruppen.
Die in Betracht gezogenen Mittel umfassen häufig cyclische Kohlenstoff- oder heterocyc- lische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehre- ren der obigen funktionellen Gruppen substituiert sind. In Betracht gezogene Mittel finden sich auch unter den biologischen Molekülen einschliesslich Peptiden, Sacchariden, Fettsäuren, Steroi- den, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, Strukturanalogen oder Kombinationen davon.
Vorgesehene Mittel werden aus einer Vielzahl von Quellen erhalten, einschliesslich Bibliotheken für synthetische oder natürliche Verbindungen. Z. B. sind zahlreiche Mittel verfügbar für eine statis- tische oder gerichtete Synthese einer grossen Vielzahl organischer Verbindungen und biologischer Moleküle, einschliesslich der Expression von randomisierten Oligonucleotiden und Oligopeptiden.
Alternativ sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten verfügbar oder können leicht hergestellt werden. Zusätzlich werden natürliche oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht modifiziert durch übliche che- mische, physikalische und biochemische Mittel und können verwendet werden, um kombinatori- sche Bibliotheken zu erzeugen. Bekannte pharmakologische Mittel können direkten oder zufälligen chemischen Modifikationen unterzogen werden, z.B. Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidifi- zierung etc., um Strukturanaloge zu erzeugen.
Von speziellem Interesse für viele Ausführungsformen sind Screeningmethoden, die Mittel auf- finden, die selektiv das vorliegende Npt2B und nicht andere Natriumphosphat-Co-Transporter, wie Nieren-Natriumphosphat-Co-Transporter, z.B. Npt1, modulieren, d. h. hemmen. Um solche Mittel aufzufinden, kann ein mehrstufiges Screeningprotokoll durchgeführt werden, wobei Mittel, die Npt2B in einem ersten Assay hemmen, dann auf ihre Fähigkeit untersucht werden, Nicht-Npt2B- Transporter zu hemmen. Jeder geeignete Assay kann für diesen Assay der zweiten Stufe ange- wendet werden, z.B. solche, die von Maganin et al. in Proc. Nat'l Acad. Sci USA (Juli 1993), 90 :5979-5983 und Helps et al., Eur. J. Biochem. (1995), 228 :927-930 werden.
Die folgenden Beispiele dienen nur der Erläuterung. Es ist für den Fachmann leicht erkennbar, dass die Präparate, Dosierungen, Verabreichungsmethoden und anderen Parameter der Erfindung weiter modifiziert oder auf verschiedenen Wegen ersetzt werden können, ohne vom Sinn und Zweck der Erfindung abzuweichen.
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A. Identifizierung der Npt2B-Sequenz
Ein Vergleich von Natnumphosphat-Co-Transporterproteinsequenzen vom Typ ll aus verschie- denen Arten, die in öffentlichen Datenbanken erhältlich sind, ergab, dass während die meisten sehr eng verwandt waren, die Sequenzen von Rind und Flunder eine getrennte Unterfamilie zu bilden schienen. Die lncyte LifeSeq Datenbank wurde daher auf Npt2-artige Klone untersucht, die der Rindersequenz näher kamen als der menschlichen. Eine Anzahl von Klonen wurde identifiziert und drei davon wurden erhalten und die DNA-Sequenz der gesamten Inserts bestimmt. Die DNA- Sequenzierung wurde mit einem Sequenzautomaten (PE/Applied Biosystems, Modell 373A, Foster City, CA) durchgeführt unter Verwendung des Farbstoff-Didesoxyabbruch-Sequenzierkits des Anbieters.
Ein Vergleich der Sequenzen zeigte, dass sie die gleiche cDNA wiedergaben und dass die längste nur ein Teilklon war, dem ungefähr 150 Aminosäuren vom N-Ende fehlten, auf Basis der Homologie mit dem Rinderprotein. Die Konsensussequenz wurde verwendet, um die LifeSeq Datenbank weiter zu screenen und eine grosse Anzahl von Klonen wurde aufgefunden, einschliess- lich einem, der die codierende Sequenz voller Länge zu enthalten schien. Letztere wurde von Incyte erhalten und sequenziert. Diese zeigte die Gegenwart eines offenen Leserahmens mit 689 Aminosäuren, der ein menschliches Mitglied der Rinder/Flunder-Typ-II-Co-Transporter-Unterfamilie zu sein schien.
Die Mehrzahl der in der LifeSeq Datenbank identifizierten Klone stammte von Bibliotheken, die von aus der Lunge stammenden Gewebeproben abgeleitet waren, jedoch stamm- ten einige der Klone aus Bibliotheken des Dünndarms und aus dem Eierstock. Dies deutete darauf hin, dass diese cDNA ein Kandidat für den menschlichen Natriumphosphat-Co-Transporter des Darms sein könnte. Versuche unter Verwendung von RT-PCR bestätigten die Expression dieses Gens in cDNA, die aus menschlichen Dünndarmproben stammte (erhalten von Clontech Corpora- tion, Palo Alto, CA). Anschliessend wurde die Zuordnung dieser Sequenz als menschlicher Darm- transporter verstärkt durch einen hohen Grad an Homologie mit veröffentlichten Sequenzen für intestinale Transporter von Xenopus (A. Ishizuya-Oka et al.
(1997), Temporal and Spatial Expres- sion of an lntestinal Na +/PO$3Cotransporter Correlates With Epithelial Transformation During Thyroid Hormone-Dependent Frog Metamorphosis. Development Genetics 20 :53-66) Maus (H. Hilfiker et al., Characterization of a murine type ll sodium-phosphate cotransporter expressed in mammalian small intestine. PNAS 1998,95:14564-14569).
B. Expression in Säugetierzellen und Assayprotokoll für Na/Pi-Transporter
Menschliche Npt2B-cDNA wird in einen geeigneten konstitutiven Säugetierexpressionsvektor, wie pcDNA3. 1 oder pREP9 (beide von Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien) kloniert. Falls erforderlich, wird die cDNA in einen induzierbaren Vektor, wie pLK-neo, einen mit Glucocorticoid induzierbaren Vektor (von Prof. Nicholas Fasel, Institute of Biochemistry, Universität von Lausanne, Schweiz, wie in Gene, 111,199-206 (1992) beschrieben) kloniert. Eine Anzahl von Säugetierzellinien, z. B. HEK 293, CHO, MDCK, BHK und NIH 3T3 werden mit den Expressionskonstrukten transfiziert und auf eine stabile Expression der rekombinanten Transporter gescreent unter Verwendung einer Version des unten beschriebenen Assays.
Zellen, die den Transporter exprimieren, werden in 96-Napf-Gewebekulturplatten mit 50 000 bis 100 000 Zellen pro Napf in 200 l geeigneten Medien plattiert und 3 bis 16 Stunden lang anhaf- ten gelassen. Direkt vor dem Test werden die Zellen dreimal mit natrium- und phosphatfreiem Waschpuffer (137 mM N-Methyl-D-glucamin, 5,4 mM KCI, 2,8 mM CaCI2, 1,2 mM MgCI2, 10 mM HEPES, pH eingestellt auf 7,4 mit HCI) gewaschen.
Die folgenden Komponenten werden dann zugegeben : (1) 50 l Reaktionspuffer (137 mM NaCI, 5,4 mM KCI, 2,8 mM CaCI2, 1,2 mM MgCI2, 0,1 mM KH2P04, 10 mM HEPES, pH eingestellt auf 7,4 mit KOH), (2) 40 l Testverbindungen verdünnt in Reaktionspuffer und (3) 10 ml einer 10X Phosphatlösung (Endkonzentration Phosphat ist 100 uM), die entweder 32P (0,25 Ci) oder 33P (0,5 Ci) als Tracer enthält. Die Platten werden bei Raumtemperatur 20 bis 30 Minuten lang inkubiert und die Reaktion gestoppt, indem die Auf- nahmelösung entfernt wird und die Zellen dreimal mit eiskalter Stoplösung (137 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 7,2) gewaschen werden. Die von den Zellen aufgenommene Radioaktivität wird bestimmt, indem nach Zugabe von 150 l Szintillationscocktail gezählt wird.
Kontrollen bestehen aus Zellen, die ohne Testverbindung (Träger allein) inkubiert wurden und Zellen, die mit N-Methyl- D-glucamin in Reaktionspuffer anstelle von Natrium inkubiert wurden. Die hemmende Wirkung wird ausgedrückt als Prozentanteil Hemmung der natriumabhängigen Aufnahme des Tracers. Unter
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Verwendung des obigen Protokolls werden in Betracht gezogene therapeutische Mittel auf ihre Npt2B-modulierende Aktivität gescreent.
Es ist aus den obigen Ergebnissen und der Diskussion offensichtlich, dass ein neuer menschli- cher intestinaler Natriumphosphat-Co-Transporter ebenso wie Polypeptide, die damit verwandt sind und Nucleinsäurezusammensetzungen, die ihn codieren, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden. Diese Polypeptid- und Nucleinsäurezusammensetzung finden Verwendung in einer Vielzahl verschiedener Anwendungen, einschliesslich Forschung, Diagnose, Screening und therapeutische Anwendungen. Es werden auch neue Methoden zur Behandlung von Krankheiten bereitgestellt, die mit Anormalitäten beim Plasmaphosphatpegel verbunden sind, da die Identifika- tion des vorliegenden Natriumphosphat-Co-Transporters ein weiteres Ziel für therapeutische Mittel für solche Krankheiten liefert. Somit liefert die vorliegende Erfindung einen wesentlichen Beitrag auf diesem Gebiet.
Obwohl die vorliegende Erfindung im Detail durch Erläuterung und Beispiele beschrieben wur- de, um das Verständnis zuerleichtern, ist es für den Fachmann auf diesem Gebiet im Lichte der Lehren der Erfindung offensichtlich, dass bestimmte Veränderungen und Modifikationen gemacht werden können, ohne vom Schutzbereich der beigefügten Ansprüche abzuweichen.
PATENTANSPRÜCHE:
1. Verfahren zum Screenen, um Npt2B-modulierende Mittel aufzufinden, wobei das Verfah- ren umfasst, dass man eine Zelle, die funktionelles Npt2B an ihrer Oberfläche exprimiert mit einem in Betracht gezogenen Mittel in Gegenwart von Phosphoranionen in Kontakt bringt und die Menge an Phosphoranionen, die von der Zelle aufgenommen wird, be- stimmt.