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Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zum Abbau von polyzyklische aromatischen Kohlenwasserstoffen (im folgenden als PAK bezeichnet), bei dem kontaminierte Böden und Hölzer oder deren Extrakte mit erweitert wirksamen Laccasen oxidiert und anschliessend einer Nachbehandlung mit Mikroorganismen unterworfen werden.
PAK sind aus zwei bis sechs Kohlenstoffringen zusammengesetzt, entstehen durch Pyrolyse und unvollständige Verbrennung von organischem Material und finden sich daher in allen Umweltmaterialien wie Boden, Wasser und Luft. Weiters kommen PAKs in unterschiedlicher Art und Konzentration in fossilen Brennstoffen vor. Einige Vertreter der PAK, z. B. Benzo (b) fluoranthen, sind als krebserregend bekannt. Grosse Mengen an PAK finden sich im Steinkohlenteer, der bei der Verkokung von Steinkohle in Kokereien und Gaswerken als Nebenprodukt anfällt.
Steinkohlenteeröle, die man durch Destillation aus Steinkohlenteer gewinnen kann, werden zur Imprägnierung von Holz, hauptsächlich für Bahnschwellen und Telegraphenmasten, verwendet.
Die industrielle Nutzung dieser Flächen als Deponien oder Produktionsstätten für Steinkohlenteer und Steinkohlenteeröle in Kokereien, Gaswerken und insbesondere in Imprägnierwerken führte zur Bildung von Altlastenflächen. Hohe Konzentrationen von PAK treten auch in den Schwellen von Gleiskörpern auf, aus denen sie in das Erdreich einsickern können. Diese Altlasten stellen insofern ein schwerwiegendes Umweltproblem dar, als dass die PAK durch Auswaschung der kontaminierten Böden in das Grundwasser gelangen können.
Aus heutiger Sicht bestehen zur Sanierung von PAK-kontaminierten Böden folgende Möglichkeiten :
Aushebung des Bodens und a) thermische Behandlung, b) Belebung der Bodenorganismen durch Belüftung und Einbringen von Zusatzstoffen in den
Boden, c) Beimpfung mit Mikroorganismen, Bakterien oder Pilzen, und Einbringen von Nährstoffen zur Beschleunigung der Abbauprozesse, und d) Extraktion mit Lösungsmitteln oder Detergenzien, wobei die Extrakte mit Bakterien abgebaut, über Aktivkohle filtriert, oder verbrannt werden.
Das Belüften und Einbringen von Zusatzstoffen in den Boden wird auch an nicht ausgehobenen Böden "in situ" durchgeführt. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens ist die geringe Effizienz und die damit verbundenen langen Reaktionszeiten.
Die Nachteile des thermischen Verfahrens sind die Veränderung der Bodenbeschaffenheit durch die hohen Temperaturen sowie die mit dem hohen Energieaufwand verbundenen Kosten.
Der grösste Nachteil bisheriger biologischer Verfahren ist, dass Bakterien nur PAK mit weniger als fünf Ringen abbauen können. Beispielsweise ist das cancerogene, fünfringige Benzo (b) fluoranthen durch Bakterien nicht abbaubar. Pilze, im besonderen WeissfÅaulepilze, wären zwar imstande, alle PAK abzubauen, können sich aber gegen die im Boden vorhandene Bakterienflora nicht durchsetzen. Ausserdem können beim PAK-Abbau durch Pilze toxische Zwischenprodukte akkumulieren, sodass sich die Toxizität des behandelten Materials durch die Behandlung sogar erhöhen kann.
Eine weitere Möglichkeit zur Behandlung PAK-kontaminierter Böden ist der Einsatz von ligninolytischen Enzymen, im besonderen Ligninperoxidasen, Manganperoxidasen, und Laccasen aus Weissfäulepilzen. Wegen ihrer unspezifischen Wirkungsweise können diese Enzyme auch PAK oxidieren. Werden diese ligninolytischen Enzyme zum Abbau persistenter Umweltschadstoffe eingesetzt, so hat dies den Nachteil, dass Wasserstoffperoxid benötigt wird. Da Wasserstoffperoxid die ligninolytischen Enzyme inaktiviert, muss es kontinuierlich zudosiert werden wodurch sich der technische Aufwand wesentlich erhöht.
Weiters ist die Einsetzbarkeit des Verfahrens für den PAKAbbau dadurch beschränkt, dass ligninolytische Enzyme sowohl in An- als auch in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid nur PAK mit einem Redoxpotential von weniger als 7, 55 eV oxidieren können, was bedeutet, dass einige der toxischen PAK mit fünf oder sechs Ringen nicht erfasst werden.
In der Anmeldung WO 94/2951 OA wird ein Verfahren zum Abbau von Lignin und ligninähnlichen Stoffen beschrieben, bei dem ligninolytische Enzyme in Kombination mit stickstoffhaltigen Verbindungen (Mediatoren) eingesetzt werden. Dieses Verfahren erweitert die Wirksamkeit ligninolytischer Enzyme, hat aber im Hinblick auf den PAK-Abbau den erheblichen Nachteil, dass PAK mit einem Redoxpotential von über 7, 55 eV nicht angegriffen werden.
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Die vorliegende Erfindung hat sich zur Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Behandlung PAKkontaminierter Substrate wie Böden oder Hölzer bereitzustellen, das eine wesentlich bessere Effizienz als bisherige Verfahren aufweist. Das erfindungsgemässe Verfahren zeichnet sich vor allem dadurch aus, dass Laccasen in Kombination mit ungesättigten Fettsäuren oder Derivaten, die ungesättigte Fettsäuren enthalten, eingesetzt werden. Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, dass Laccasen in Anwesenheit von Mediatoren ungesättigte Fettsäuren peroxidieren können, wobei freie Oxyradikale entstehen, die ihrerseits imstande sind, PAK zu oxidieren. Es zeigte sich, dass durch das erfindungsgemässe Verfahren die Oxidation aller PAK, auch derjenigen mit einem Redoxpotential von über 7, 55 eV, erzielt werden kann.
Der Hauptunterschied zur Verfahren der WO 94/29510A ist, dass durch den Zusatz von ungesättigten Fettsäuren bzw.
Derivaten, die ungesättigte Fettsäuren enthalten, die Wirksamkeit von Laccase-Mediator-Systemen wesentlich erweitert wird.
Die Verwendung von Laccasen hat gegenüber anderen ligninolytischen Enzymen den zusätzlichen enormen technischen Vorteil, dass die Laccase das einzige für den Abbau von PAK in Frage kommende Enzym ist, das industriell hergestellt werden kann.
Die Neuheit des erfindungsgemässen Verfahrens aber besteht nicht nur darin, dass damit cancerogene PAK mit fünf oder mehr Ringen oxidiert werden können, sondern auch darin, dass durch die Oxidation der PAK durch das erfindungsgemässe Laccase-Mediator-ungesättigteFettsäeure-System die weitere biologische Abbaubarkeit durch Mikroorganismen gesteigert wird.
Dies äussert sich in einer signifikanten Abnahme der Toxizität des Matenals.
Wie oben erwähnt, besteht der Hauptnachteil biologischer Verfahren darin, dass nur PAK mit zwei bis vier Ringen abgebaut werden. Durch das erfindungsgemässe Verfahren können jedoch alle PAK soweit oxidiert werden, dass sie von den bakteriellen Systemen weiter abgebaut und veratmet werden können. Ein technisches Verfahren kann darin bestehen, dass das erfindungsgemässe Laccase-Mediator-ungesättigte-Fettsäeure-System gemeinsam mit Bakterien oder auch Pilzen in einem Reaktor oder im Boden (z. B. in Form von Mieten), zur Anwendung gebracht wird. Der PAKAbbau in kontaminierten Böden und Hölzern durch das erfindungsgemässe Laccase-Mediatorungesättigte-Fettsäeure-System und der weitere Abbau durch Mikroorganismen kann aber auch in zwei getrennten Schritten erfolgen und so bei jeweils optimalen Bedingungen ablaufen.
In Falle eines zweistufigen Prozesses kann im Anschluss an die enzymatische Behandlung eine Beimpfung mit Mikroorganismen erfolgen, um den weiteren Abbau der enzymatischen Oxidationsprodukte zu beschleunigen. Dabei ist es möglich, durch Verwendung von thermophile Mikroorganismen mit einem Wachstumsoptimum von bis zu 80 C den Abbau noch weiter zu beschleunigen. Eine weitere Variante des Verfahrens ist, das erfindungsgemässe Laccase-Mediator-ungesättigteFettsäeure-System in Verbindung mit "in situ" Verfahren in den Boden zu infiltrieren.
Die Erfindung wird nachstehend anhand eines nicht einschränkenden Beispiels näher erläutert.
Beispiel : Behandlung eines PAK-kontaminierten Bodens
Der PAK-Gehalt eines Bodens eines ehemaligen Bahndamms wurde mittels Soxhlet-Extraktion (Lösungsmittel c-Hexan) und anschliessender HPLC-Analyse mit 1800 ig/g Trockensubstanz bestimmt. Dieser Boden wurde in einem Suspensionsreaktor wie folgt weiterbehandelt.
5 g (Trockensubstanz) gemahlener und gesiebter Boden (Korngrösse < 1mm) wurden 15 min bei 1200C sterilisiert, anschliessend mit 50 ml Reaktionslösung versetzt und bei 30 C und 130 rpm insgesamt 6 Tage behandelt. Es wurden sechs Parallelversuche A-F angesetzt wobei sich die jeweiligen Reaktionslösungen folgendermassen zusammensetzten :
A : Die Reaktionslösung enthielt 1 U/I Laccase, 1 mmol/l 1-Hydroxybenzotriazol, 4 mmoUI
Monolinoleylglycerinester (ungesättigtes Fettsäurederivat), und 50 mmol/l
Natriumacetatpuffer, pH=5. Zur Solubilisierung der PAK wurden 2, 5%
Polyoxyethylensorbitanmonolaureat zugesetzt.
B : wie A, jedoch ohne Laccase
C : wie A, jedoch mit 0, 9 g/l Monostearoylglycerinester (gesättigtes Fettsäurederivat) anstelle von Monolinoleylglycerinester.
D : Die Reaktionslösung enthielt 1 ml einer Bakterienmischkultur, die ein breites PAK-
Verwertungsspektrum aufwies. Zusätzlich wurde ein Mineralsalzmedium zugefügt.
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E : wie A, unter gleichzeitiger Zugabe von 1 ml Bakterienmischkultur (siehe D) und
Mineralsalzmedium.
F : wie C, jedoch unter gleichzeitiger Zugabe von 1 ml Bakterienmischkultur (siehe D) und
Mineralsalzmedium.
1 U Laccase wird definiert als die Umsetzung von 1 ; imot ABTS pro Minute bei 250C beim für das jeweilige Enzym optimalen pH-Wert.
Nach Beendigung der Behandlung wurde der Restgehalt an PAK in Lösung (Extraktion mit c-Hexan) und im Niederschlag (Soxhietextraktion mit c-Hexan) bestimmt. Der Gesamtgehalt an PAK errechnete sich aus der Summe dieser beiden Werte. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden die Konzentrationen der einzelnen PAK in drei Gruppen, geordnet nach Anzahl der Kohlenstoffringe, zusammengefasst. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt und zeigen, dass die fünf- bis sechsringigen PAK nur im erfindungsgemässen Verfahren (d. h. in Anwesenheit einer ungesättigten Fettsäure oder eines Derivats) vollständig abgebaut wurden.
Gleichzeitig wurde auch eine ökotoxikologische Bewertung der Bodeneluate durch einen Leuchtbakterien-Hemmtest mit Vibrio fischer in Anlehnung an das DIN-Verfahren 38412-L34 durchgeführt. Dabei wird der GL20-Wert bestimmt, der dem Verdünnungsfaktor des Eluats entspricht, bei dem die Lichtemission um 20% gehemmt wird. Werte > 8 werden als toxisch, Werte von 1 und 2 als nicht toxisch angesehen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt und zeigen, dass sich die Toxizität des Eluats durch die erfindungsgemässe Behandlung signifikant reduziert.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Biotechnologisches Verfahren zur Detoxifizierung von mit polyzyklische aromatischen
Kohlenwasserstoffen (PAK) kontaminierten Substraten unter Verwendung des Enzyms
Laccase und eines Mediators, dadurch gekennzeichnet, dass eine ungesättigte Fettsäure oder deren Derivate oder mehrere verschiedene ungesättigte Fettsäuren oder deren
Derivate in einer Konzentration von 0, 1-20 mmol/I direkt oder in Form eines Produktes, welches eine oder mehrere ungesättigte Fettsäuren oder deren Derivate enthält, zugegeben wird, und nach Zugabe der drei Komponenten die Einwirkung dieser auf die
PAK bei an sich bekannten optimalen Reaktionsbedingungen für die Laccase erfolgt.