AT305177B - Verfahren zur biotechnischen herstellung von alkalischen und neutralen proteinasen - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von alkalischen und neutralen Proteinasen aus Bakterien. Die Proteinasen finden in der Lebensmittelindustrie, der Landwirtschaft, der Waschmittel-, Leder-, Filmindustrie und andern volkswirtschaftlichen Bereichen Anwendung. 



   Es ist bekannt, dass Bakterien aus der Gattung Bacillus Proteinasen mit verschiedenen PH-Optima (sauer bis alkalisch) bilden. Dabei werden als organische Stickstoffquellen für die Produktionsmedien teure Produkte tierischer, pflanzlicher und mikrobieller Herkunft wie   Casein,   Peptone, Tryptone, Sojamehl, Hefeextrakt u. a. benutzt. Bei den bekannten Verfahren zur biotechnischen Herstellung von alkalischen Proteinasen ist es notwendig, eine PH-Wert-Einstellung während des Fermentationsprozesses mit Pufferlösungen vorzunehmen. Weiterhin müssen den Nährböden Spurenelemente zugesetzt werden. 



   Zweck der Erfindung ist es, in Anbetracht des steigenden Bedarfs an alkalischen und neutralen Proteinasen das Verfahren zu deren Herstellung zu vereinfachen und preisgünstiger zu gestalten sowie die biologischen Ausbeuten zu erhöhen. 



   Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch das Angebot geeigneter Stickstoffquellen zu dem gewünschten Ziel zu kommen. 



   Erfindungsgemäss wird das dadurch erreicht, dass Zusätze von Tierkörpermehlen, insbesondere Fischmehl, zu den Produktionsmedien für die Proteinaseproduktion in hervorragender Weise, bei Verwendung von Bakterien der Gattung Bacillus, geeignet sind. Die Tierkörpermehle enthalten etwa 60 bis 75% Rohprotein, etwa 8 bis 12% Rohfett und erhebliche Rohaschebestandteile. 



   Durch die Verwendung von Tierkörpermehlen in Produktionsmedien können die herkömmlich benutzten Nährstoffe wie Milch, Peptone, Tryptone, Casein, Hefeextrakt, ja selbst Sojaschrote bei der biotechnischen Herstellung von Proteinasen nicht nur vollwertig ersetzt werden, sondern darüber hinaus wird eine Wachstumsstimulierung und eine erhöhte Enzymbildung bei den Bakterien induziert. Die Tierkörpermehle haben bei der biotechnischen Herstellung von alkalischen Proteinasen besondere Bedeutung für die Verschiebung der H-Ionenkonzentration in alkalische Bereiche. Eine nach bisher üblichem Verfahren notwendige pH-Wert-Einstellung bei der Herstellung alkalischer Proteinase erübrigt sich, wodurch der Produktionsprozess vereinfacht wird.

   Darüber hinaus besitzen Tierkörpermehle einen hohen Anteil an Wirkstoffen und Spurenelementen, wovon letztere bei den bisherigen Verfahren den Nährböden zugesetzt werden mussten, was erfindungsgemass durch die Verwendung von Tierkörpermehlen nicht mehr erforderlich ist. Darüber hinaus werden die biologischen Ausbeuten beachtlich erhöht. 



   Für die Herstellung alkalischer Proteinase wurde ein Bacillus spec. Stamm 41p und für die Herstellung der neutralen Proteinase wurde ein Bacillus subtilis Stamm 155 verwendet. 



   Dieser Stamm ist im Forschungsinstitut für die Gärungsindustrie, Enzymologie und Technische   1fikrobio-   logie in Berlin, Alt-Stralau 62, hinterlegt und registriert. 



    Das PH-Optimum der alkalischen Proteinase lag bei PH 10 und das der neutralen Proteinase bei pH 7, 3. 



  Ausgehend von den jeweiligen Inocula, die etwa 10-Keime/ml enthielten, wurden Produktionsmedien be-     impft.   Die Fermentationsversuche wurden entweder im   Labor- oder Technikumsmassstab   durchgeführt. 



   Die Erfindung soll an Hand von Beispielen näher erläutert werden :   Beispiel l :   Gewinnung von alkalischer Proteinase im Labormassstab bei Verwendung von Tierkörpermehlen. 



   Das Produktionsmedium hatte folgende Zusammensetzung : 
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<tb> 
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Saccharose
<tb> 10 <SEP> % <SEP> geriebene <SEP> rohe <SEP> Kartoffeln <SEP> oder <SEP> 2% <SEP> Kartoffelstärke
<tb> 2,5 <SEP> % <SEP> Gerstenschrot
<tb> 2, <SEP> 0 <SEP> % <SEP> Fischmehl
<tb> 0,22% <SEP> NaHPO
<tb> Der <SEP> PH- <SEP> Wert <SEP> lag <SEP> nach <SEP> dem <SEP> Sterilisieren <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 7,0 <SEP> : <SEP> ! <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 1. <SEP> 
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   Die Fermentationskolben hatten ein Volumen von 500 ml und waren mit 50 ml   Nährlösung   gefüllt. Die Inkubation erfolgte nach dem Beimpfen auf einer Schüttelmaschine mit 220   Aussche gen/min   bei   37 C.   Nach einer Fermentationszeit von zirka 70 h stellte sich ein PH-Wert von PH 7,6 bis 8, 3 ein. Eine Zugabe von Pufferlösung zur Alkalisierung der Nährlösung erübrigte sich. Die proteolytische Aktivität der Kulturlösung betrug am Ende der Fermentationszeit 40 bis 80 Anson-Einheiten   (AE)/1.   



   Die Bestimmung der Anson-Einheiten erfolgte nach ML. Anson [1959] J. Gen. Physiol 22, S. 79-89. 



     Beispiel 2 :   Gewinnung von alkalischer Proteinase im halbtechnischen Massstab bei Verwendung von   Tierkörpermehlen.   



   Das Produktionsmedium hatte folgende Zusammensetzung : 

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<tb> 
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Saccharose
<tb> 2 <SEP> % <SEP> Kartoffelstärke
<tb> 2,5 <SEP> % <SEP> Gerstenschrot
<tb> 1,0 <SEP> % <SEP> Fischmehl
<tb> 0,5 <SEP> % <SEP> Tierkörpermehl
<tb> 0, <SEP> 22% <SEP> Na2HPO4
<tb> Der <SEP> PH-Wert <SEP> lag <SEP> nach <SEP> dem <SEP> Sterilisieren <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 7, <SEP> 00, <SEP> 01.
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   Die verwendeten Fermentationstanks hatten ein Bruttovolumen von 500 1 und wurden mit 300 1 Nährlösung gefüllt. Die Sterilisation erfolgte unter den im technischen Massstab der Fermentationsindustrie üblichen Bedingungen bei   125 C.   Die sterile Nährlösung wurde mit etwa   50/0   Inoculum beimpft. Als Antischaummittel wurde ein Silikonöl benutzt. Das Belüftungsverhältnis betrug 0, 3 : 1, d. h. 0,   3 l   sterile Luft auf 11 Kulturlösung in 1 min. Die Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührers lag bei 250 Umdr/min. Nach einer Fermentationsdauer von 65 h hatte sich   ein PH-Wert   von PH 8,0   fui 0,   3 eingestellt.

   Die proteolytische Aktivität der Kulturlösung betrug am Ende der Fermentation 50   Anson-Einheiten/l     :     15 AE/1.   



    Be ispi el 3 : Gewinnung von neutraler Proteinase bei Verwendung von Tierkörpermehlen im halbtechni-    schen Massstab. 
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<tb> :1 <SEP> % <SEP> Gerstenschrot
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Haferschrot
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Weizenkleie
<tb> l, <SEP> 3 <SEP> % <SEP> geriebene <SEP> rohe <SEP> Kartoffeln
<tb> 0, <SEP> 3 <SEP> % <SEP> Fischmehl
<tb> 0, <SEP> l <SEP> Tierkörpermehl <SEP> 
<tb> Der <SEP> PH-Wert <SEP> lag <SEP> nach <SEP> dem <SEP> Sterilisieren <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 6,7 <SEP> 0, <SEP> 2.
<tb> 
 



   Die verwendeten Fermentationstanks hatten ein Bruttovolumen von 500 1, die mit 280 1 gefüllt wurden. 



  Nach der Sterilisation wurde mit etwa 5% Inoculum beimpft. Als Antischaummittel benutzten wir ein Silikon- öl. Das Belüftungsverhältnis lag bei 0,   3 : l/min.   Die Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührers betrug 300 Umdr/min. Nach einer Fermentationsdauer von 30 h wurden am Ende der Fermentation 40 AE/l 10 AE/1 erreicht. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von alkalischen und neutralen Proteinasen mittels Bakterien der Gattung Bacillus, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung unter aeroben Bedingungen im Submersverfahren unter Verwendung von Tierkörpermehlen in Verbindung mit andern bekannten Nährstoffkomponenten in den Produktionsmedien durchgeführt wird, wobei die Fermentation im Bereich von schwach sauer bis schwach alkalisch erfolgt.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zu Beginn der Fermentation der PH-Wert auf 6,5 bis 7,5 eingestellt wird.