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Verfahren zur Reinigung von Moenomycin
Aus der deutschen Patentschrift Nr. 1113791 ist bekannt, dass man aus Kulturen des Streptomyces bambergiensis, S. ghanaensis, S. ederenses und S. geysiriensis sowie ihrer Varianten oder Mutanten ein neues, als Moenomycin bezeichnetes Antibiotikum gewinnen kann.
Das Antibiotikum ist wirksam gegen grampositive Erreger, insbesondere gegen Staphylokokken, die gegen Tetracyclin, Penicillin, Streptomycin, Novobiocin und Erythromycin resistent sind. So wirkt es beispielsweise schon in einer Konzentration von 0, 125 bis 0, 25 y/ml bakteriostatisch gegen Staphylococcus aureus P 209.
Es wurde nun gefunden, dass man ein hochgereinigtes Produkt mit wesentlich verbesserter antibiotischer Wirksamkeit erhält, wenn man das aus dem Mycelextrakt isolierte Rohprodukt dialysiert, das Innendialysat in schwach saurem Medium mit einem polaren, wasser-unlöslichen oder-schwerlöslichen Lösungsmittel extrahiert, den Extrakt im Vakuum zur Trockne eindampft, in Wasser aufnimmt, die Lösung an Magnesiumsilikat adsorbiert, mit Methanol eluiert, das eluierte Produkt in bekannter Weise isoliert und dieses entweder a) der Adsorptionschromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches von niederen
Alkoholen und Ammoniak als Eluierlösung, oder b) der Chromatographie an vernetzten Dextran-Gelen mit Wasser als Elutionsmittel oder c) der Chromatographie an Ionenaustauschern auf Cellulosebasis mit Salzlösungen als Elutionsmit- teln unterwirft,
aus dem Eluat das reine Moenomycin in bekannter Weise isoliert und gegebenen- falls mit basischen Mitteln in die Salzform überführt.
Als Lösungsmittel für die Extraktion des Innendialysats eignen sich vor allem Alkohole wie beispiels- weisen-ButanolundIsoamylalkohol. ManarbeitetbeieinempH-Wertvon 2 bis 3, vorzugsweise 2,8 bis 3.
Als Magnesiumsilikat kommt vor allem das unter der Bezeichnung Florisil R im Handel erhältliche in Frage.
Das für die Adsorptionschromatographie verwendete Kieselgel hat zweckmässigerweise eine Korngrösse von 75 bis 400 Il, Es empfiehlt sich, es vor der Verwendung durch Behandlung mit halbkonzentrierter Salzsäure, Waschen mit Wasser bis zur neutralen Reaktion und anschliessendes dreistündiges Erhitzen auf zirka 1300C zu aktivieren.
Als Elutionsmittel kommen bei diesem Verfahren verschieden zusammengesetzte Gemische von niederen Alkoholen, insbesondere n-Propanol und Isopropanol, mit niederen wässerigen Aminen, vorzugsweise Ammoniak, in Betracht. Bisweilen kann ein Zusatz von Puffersubstanzen, beispielsweise Boratoder Phosphatpuffer, angebracht sein. Die Mengenverhältnisse von Propanol und Ammoniak können in
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weiten Grenzen variieren. In der Regel enthält das Elutionsmittel 50 -90%, vorzugsweise 65 - 85% Propanol. Der verwendete Ammoniak ist vorzugsweise 2-normal, doch können auch Konzentrationen bis zu etwa 14 n verwendet werden.
Als Dextran-Gele haben sich die Handelsprodukte Sephadex G 25, G 50 und G 100 besonders bewährt. Geeignete Ionenaustauscher auf Cellulosebasis sind beispielsweise Ecteola$-Cellulose ( Epichlorhydrin-Triäthanolamin-Kondensationsprodukt derCellulose) oder DEAE-Cellulose (mit Diäthylaminoätha- nol verätherte Cellulose). Die zur Elution verwendeten Salzlösungen sind vorzugsweise l-lOig ; be- sonders vorteilhaft sind Bicarbonatlösungen, doch können auch Lösungen beliebiger anderer anorganischer Salze verwendet werden.
Die unter b) und c) beschriebenen Reinigungsmethoden können auch in beliebiger Reihenfolge kombiniert und/oder dem Verfahren gemäss a) vorangestellt werden. Reinigungseffekte können ferner mit folgenden Methoden erzielt werden :
1. Aussalzen aus konzentrierter wässeriger Lösung, beispielsweise durch Sättigen mit Ammonium- sulfat ;
2. Gegenstromverteilung, z. B. im System n-Butanol/Mc Ilvaine-Puffer beim PH-Wert 3-5 ;
3. Verteilungschromatographie an geeigneten Adsorbentien, z. B. Kieselgur unter Verwendung des unter 2. genannten Systems ;
4. präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel, beispielsweise mit dem System n-Pro- panol/2 n NH, 70 : 30 ;
5.
Fällung mit Metallsalzen, insbesondere Salzen des Zink, Quecksilber, Aluminium, Kupfer,
Eisen, Kobalt, Nickel, Mangan. und Chrom, aus schwach alkalischem Medium.
Diese Methoden können vor oder nach der Dialyse oder der Adsorptionschromatographie an Magnesiumsilikat eingeschaltet werden.
Das derart gereinigte Moenomycin zeichnet sich durch folgende Charakteristika aus :
Die Verbindung ist eine schwach saure, amorphe Substanz, die mit organischen und anorganischen Basen Salze bildet. Sie ist stabil in neutraler, wässeriger und methanolischer Lösung, zersetzt sich jedoch langsam im sauren und alkalischen Medium. Das Natriumsalz von Moenomycin ist in trockener fester Form selbst nach 48stündigem Erhitzen auf 800C noch stabil. Die Elementaranalyse zeigt folgende werte :
C 48, 5%, H 7, 3%, N 5, 10/0, P 1, 80/0, der Rest besteht aus Sauerstoff. Die Substanz hat keinen de-
EMI2.1
Elektrophorese zeigt das Moenomycin in Pufferlösungen von PR 1, 9 bis 7, 8 keine Wanderung, dagegen eine starke Anodenwanderung bei PH 9, 8.
Die Papierchromatographie gibt folgende RF-Werte :
EMI2.2
<tb>
<tb> System <SEP> RF
<tb> n-Butanol/Triäthylamin/
<tb> Methyl-isobutyl-keton/
<tb> Wasser <SEP> 14 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Benzol/Eisessig/Wasser <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> n-Butanol/Eisessig/Wasser <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 88 <SEP>
<tb> tert. <SEP> Butanol/Eisessig/
<tb> Wasser <SEP> 60 <SEP> : <SEP> 6 <SEP> : <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP>
<tb> Butanol, <SEP> wassergesättigt <SEP> 0
<tb> sec. <SEP> Butanol/Eisessig/Wasser <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb>
Folgende Reaktionen sind negativ :
Ninhydrin, Binret, Fehling, Ehrlich, Sakaguchi, Anilinphthalat, Eisenchlorid.
Dagegen gibt Moenomycin mit Antimontrichlorid und Chlorsulfonsäure (als Sprühreagenzien) rotviolette Farbreaktionen und reagiert mit Kaliumpermanganat und Perjodsäure/Schiffsreagenz. Potentiometrische Titration ergibt ein Äquivalentgewicht von etwa 800 und einen PK-Wert von 4, 1. Die Molgewichtsbestimmung mittels Ultrazentrifuge und Lichtstreuungsmessung führt zu Werten von 68 000 bis
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70000. Moenomycin ist nicht dialysierbar und kann mit Neutralsalzen, z. B. Ammoniumsulfat, aus neutraler wässeriger Lösung ausgesalzen werden.
Gegenüber dem in der deutschen Patentschrift Nr. 1113791 beschriebenen Moenomycin besitzt das nach den vorstehenden verfahren gereinigte Produkt eine erheblich stärkere antibiotische Wirksamkeit.
Das Wirkungsspektrum und die therapeutische Aktivität sind aus nachstehenden Tabellen ersichtlich.
Tabelle I
EMI3.1
<tb>
<tb> Antibiotisches <SEP> Wirkungsspektrum
<tb> Testorganismus <SEP> Hemmung <SEP> (Bakteriostase)
<tb> beiy/ml
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> P <SEP> 209 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> tetracycline <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> streptomycin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> penicillin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> novobiocin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> erythromycin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 16
<tb> Corynebact.
<SEP> diphtheria <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> mesentericus <SEP> 0, <SEP> 24. <SEP>
<tb>
Bacillus <SEP> mycoides <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> anthracis <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP>
<tb> Enterococcus <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 188
<tb> Klebs. <SEP> thinoskleromatis <SEP> 94
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 23
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 94
<tb> Salm. <SEP> paratyph. <SEP> A <SEP> 188
<tb> Salm. <SEP> paratyph. <SEP> B <SEP> 188
<tb> Salm. <SEP> pullorum <SEP> 77
<tb> Shigella <SEP> flexneri <SEP> 47
<tb> Pasteurellaseptica <SEP> 35, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Brucella <SEP> abortus <SEP> Bang <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Brucella <SEP> melitensis <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP>
<tb>
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Tabelle II
EMI4.1
<tb>
<tb> Therapeutische <SEP> Aktivität <SEP> von <SEP> Moenomycin <SEP> bei <SEP> mit <SEP> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> infizierten <SEP> Mäusen <SEP>
<tb> Infektion <SEP> :
<SEP> intraperitoneal
<tb> Behandlung <SEP> : <SEP> 3 <SEP> Dosen <SEP> Moenomycin <SEP> sofort,
<tb> 4 <SEP> und <SEP> 20 <SEP> h <SEP> nach <SEP> der <SEP> Infektion
<tb> Gesamtdosis <SEP> mg/kg <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> Versuchstiere <SEP> Überlebende <SEP> Tiere <SEP> nach
<tb> 2 <SEP> Tagen <SEP> 10 <SEP> Tagen
<tb> 75 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 37, <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP>
<tb> 0 <SEP> (Kontrolle) <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
(Die Herstellung des Impfmaterials erfolgte wie in der deutschen.
Patentschrift Nr. 11137 91 ange- geben.)
Bei Anwendung der oben unter a) beschriebenen Methode erzielt man gleichzeitig eine Trennung in drei antibiotisch aktive Komponenten, die im folgenden Moenomycin A, B und C genannt werden und gewünschtenfalls getrennt aufgefangen werden können. Sie sind einander chemisch sehr ähnlich und verhalten sich in bezug auf Löslichkeit, Säureeigenschaften, Molekulargewicht, papierchromatographisches Verhalten, Papierelektrophorese, Farbreaktionen und Stabilität wie der Moenomycin-Komplex.
Auch die biologischen Eigenschaften der Teilkomponenten unterscheiden sich nur unwesentlich von denen des Komplexes. Darüber hinaus sind die Komponenten durch folgende Daten charakterisiert :
Moenomycin A
EMI4.2
H po N 5, 3% P 1, 80/0 0 Rest.
EMI4.3
EMI4.4
EMI4.5
EMI4.6
184-1850C.Dünnschichtchromatographie : s. Tabelle m.
Moenomycin B Elementaranalyse (freie Säure) : C 47, 81o
H 7, 21o
EMI4.7
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EMI5.1
EMI5.2
EMI5.3
ff1/oMoenomycin C Elementaranalyse (frei Säure) : C 49,1%
H 7, 4%
N 5, 31a
P 1, 7%
0 Rest
EMI5.4
EMI5.5
EMI5.6
EMI5.7
: 178 - 179OC.Dünnschichtchromatographie : s. Tabelle III.
Tabelle III
EMI5.8
<tb>
<tb> Dünnschichtchromatographisches <SEP> Verhalten <SEP> von <SEP> Moenomycin <SEP> A, <SEP> B <SEP> und <SEP> C <SEP> an <SEP> Kieselgel <SEP> G
<tb> R-Werte
<tb> Lösungsmittelsystem <SEP> Moenomycin <SEP> A <SEP> Moenomycin <SEP> B <SEP> Moenomycin <SEP> C
<tb> Isopropanol/2n <SEP> NHs <SEP> 70 <SEP> : <SEP> 30 <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 0, <SEP> 36 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP>
<tb> Isopropanol/Wasser/Boratpuffer <SEP> PH <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> 70 <SEP> : <SEP> 25 <SEP> : <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP>
<tb> Äthanol/Wasser <SEP> 4 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 0, <SEP> 77 <SEP>
<tb>
Beispiel 1 :
a) Isolierung
Nach dem Abernten wird das nach dem Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1113791 gewonnene Mycel von der Fermentationslösung durch Zentrifugieren abgetrennt und unter Rühren mit 10 l Methanol extrahiert. Das Methanol wird abfiltriert und der Rückstand nochmals mit 10 l Methanol extrahiert. Die vereinigten Methanolextrakte werden unter vermindertem Druck bis zur Entfernung des Methanols eingedampft und die erhaltene wässerige Phase (zirka 500 ml) mit Salzsäure auf PH 3 eingestellt und zweimal mit je 500 ml n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird im Vakuum auf 100 ml eingedampft.
Beim Stehen im Kühlschrank fällt das rohe Moenomycin aus. Das Produkt wird abgesaugt, mit Äthylacetat gewaschen und getrocknet. Ausbeute 18 g. Das Rohprodukt kann aus der konzentrierten Butanollösung auch durch Ausfällung mit Äther oder Äthylacetat gewonnen werden. Das Produkt enthält etwa 20% Moenomycin (mikrobiologischer Test). b) Reinigung durch Dialyse und Chromatographie an Magnesiumsilicat
20 g Rohprodukt aus a) werden in 200 ml Wasser aufgeschlämmt, die Lösung mit 1 n NaOH auf pH 7 eingestellt, von ungelöstem Material abfiltriert und 3 Tage lang gegen fliessendes Leitungswasser dialysiert. Die im Dialysiergefäss verbliebene Lösung wird mit HCI auf PH 3 gestellt und zweimal mit je 250 ml n-Butanol extrahiert. Nach Einengen des Butanols im Vakuum wird das angereicherte Moenomyein wie bei a) durch Ausfrierung oder Fällung mit Äther gewonnen.
Ausbeute 8, 5 g. Das braune Produkt enthält 481o Moenomycin.
Zur Entfernung der Hauptmenge des noch anwesenden braunen Farbstoffes wird das Rohprodukt in 100 ml Methanol gelöst, von unlöslichem Material abfiltriert und die Lösung auf eine Chromatographiesäule mit 80 g Magnesium-Trisilicat (Florisil R), das in Methanol suspendiert ist, aufgebracht. Die Elution erfolgt mit l l Methanol (Fraktion 1) und 500 ml 80%obigem wässerigem Methanol (Fraktion 2).
Aus Fraktion 1 werden beiAbdampfen des Lösungsmittels 5, 4 g Moenomycin als helles amorphes Pulver,
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aus Fraktion 2 noch 1, 3 g Moenomycin etwas geringerer Aktivität gewonnen. c) Reinigung durch Säulenchromatographie an Kieselgel
EMI6.1
6gelöst und 100 g gereinigtes Kieselgel in dieser Lösung suspendiert. Nach Abdampfen des Wassers im Vakuum gibt man das trockene, aus Moenomycin und Kieselgel bestehende Pulver auf den Kopf der
Säule.
Die Elution erfolgt nun mit folgenden Lösungsmitteln : I) Isopropanol/2 n NHg 100 : 20 (7 1)
II) Isopropanol/2 n NH, 90 : 20 (5, 5 1)
HI) Isopropanol/2 n NH, 80 : 20 (5, 0 1)
IV) Isopropanol/2 n NHs 80 : 30 (15, 0 1)
Mit den Lösungsmittelsystemen I - III werden Verunreinigungen und Farbstoffe herausgewaschen, während mit System IV das Moenomycin eluiert wird. Man fängt Fraktionen von 500 ml auf und weist in ihnen das Vorhandensein von Moenomycin durch dünnschichtchromatographische Analyse nach.
Hiefür werden mit Kieselgel beschichtete Glasplatten verwendet, als Laufmittel dient das System Isopro- panol-2 nNHs 70 : 30, und die Sichtbarmachung der Substanzflecken erfolgt auf Grund der Fluoreszenzlöschung unter der UV-Lampe bei 260 mu oder durch Besprühen mitChlorsulfonsäure/Eisessig 2 : 1 und anschliessendes Erhitzen auf 1050, wobei rotviolette Flecken sichtbar werden. Die Fraktionen 7 - 21 enthalten Moenomycin, die höheren Fraktionen stärker polare Verunreinigungen.
Zur Isolierung des gereinigten Moenomycins werden die vereinigten Fraktionen 7 - 21 im Vakuum bei 400 zur Trockne eingedampft ; den Rückstand löst man in Methanol und fällt nach Filtration das Antibiotikum durch Zusatz von überschüssigem Äther aus. Die Fällung wird abzentrifugiert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Auf diesem Wege gewinnt man gereinigtes Moenomycin als Ammoniumsalz. d) Reinigung durch Gelfiltration an Sephadex R
1 g Moenomycin aus b) wird in 10 ml H20 gelöst und auf eine Chromatographiesäule (80 x 5 cm), die gequollenes Sephadex enthält, aufgetragen. Bei der Entwicklung mit Wasser werden 16 Fraktionen zu je 100 ml aufgefangen und analysiert.
Laut UV-Messung bei 258 mu und Bestimmung der mikrobio- logischen Aktivität befindet sich Moenomycin in den Fraktionen 5 - 10 (Maximum Fraktion 8), während die Farbstoffe in Fraktion 4 und Fraktion 11 bis 16 erscheinen. Aus der Hauptfraktion wird durch Gefriertrocknen ein farbloses amorphes Produkt (0, 55 g) mit einem Moenomycingehalt von 80 bis 85% erhalten. e) Reinigung durch Chromatographie an Ionenaustauscher-Cellulose
400 mg des durch Gelfiltration nach d) gereinigten Moenomycins werden in 8 ml Wasser gelöst und auf eine Chromatographiesäule (100 x 3 cm) mit Ecteola-Anionenaustauscher-Cellulose aufgetragen.
Das Ecteolapulver wurde vorher mit einer 5%igenNHHCO-Lösung in die Bicarbonatform überführt und wird in 0,4%iger NH4HCO3-Lösung in die Säule eingeschlämmt. Die Entwicklung der Säule geschieht mit Wasser (100 ml) und dann durch eine Gradientenelution (linearer Gradient) mit je 11 0, 4% figer und lomiger NH4HCO3-Lösung.Mittels Fraktionensammler werden Fraktionen von je 10 ml aufgefangen und durch UV-Messung (258 mu) und mikrobiologischen Test analysiert. Moenomycin befindet sich in Fraktion 81 - 110. Die Fraktionen werden vereint, die Lösung mit einem Überschuss von Amberlite R IRC-50 (Acrylsäure-Divinylbenzol-Polymerisat der Fa.
Röhm & Haas) gerührt und auf diese Weise entsalzt.
Durch Gefriertrocknung der Lösung werden 180 mg reines farbloses Moenomycin (Säureform) gewonnen. f) Reinigung über das Zinksalz
EMI6.2
1 n-Natronlauge auf pH 8 gestellt. Die Fällung der Zinksalze, die das Moenomycin enthält, wird abzentrifugiert, mit 100 ml Wasser ausgewaschen und in 100 ml Wasser suspendiert. Nach Ansäuern auf PH 2 mit 1 N H2 SO. wird die klare Lösung zweimal mit je 100 ml n-Butanol extrahiert, die ButanolExtrakte vereinigt, eingeengt und das Moenomycin durch Fällung mit Äthylacetat isoliert. Ausbeute 1, 9 g, Gehalt 45% Moenomycin.
Beispiel 2 :
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K-Salz des Moenomycins
0, 5 g reines Moenomycin (Säureform) (erhalten nach 1 e) werden in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 0, 51 nKOH auf PH 7 eingestellt. Durch Gefriertrocknung werden O, 52g K-Salz des Moenomycins erhalten.
Beispiel 3 :
Na-Salz des Moenomycins
300 mg reines Moenomycin (Säureform) (erhalten aus 1 e) werden in 1 ml Methanol gelöst, die Lösung mit Zloiger methanolischer NaOH auf I1I 7 gestellt und das Na-Salz durch Zusatz von 1 Vol Äther ausgefällt, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 240 mg.
Beispiel 4 :
Diäthylaminsalz des Moenomycins
250 mg reines Moenomycin (Säureform) (erhalten nach 1 e) werden in 3 ml Wasser gelöst und dazu 2 ml einer 501eigen wässerigen Diäthylaminlösung gegeben. Das gebildete Diäthylaminsalz des Moenomycins wird durch Eindampfen der Lösung im Vakuum isoliert.
Beispiel 5 :
Cyclohexylaminsalz des Moenomycins
Zu einer Lösung von 450 mg reinem Moenomycin in 10 ml Methanol werden 300 mg Cyclohexylamin gegeben und das gebildete Salz durch Eindampfen der Lösung im Vakuum isoliert.
Beispiel 6 :
Chromatographische Trennung von Moenomycin-Komplex und Herstellung von Moenomycin A,
B und C
400 g gesiebtes Kieselgel, Korngrösse 75-150 u, das durch Behandeln mit halbkonzentrierter Salzsäure, nachfolgendem Neutralwaschen und Aktivieren bei 1300 gereinigt wurde, werden in eine Chromatographiesäule gefüllt. Dann werden 4 g durchchromatographie an FlorisilgereinigtesMoenomycin in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung auf 20 g gereinigtes Kieselgel aufgebracht und nach Trocknen auf den Kopf der Säule gegeben.
Nun wird mit folgenden Lösungsmitteln eluiert :
I) n-Propanol/2 n NH, 100 20 (2, 0 I)
II) n-Propanol/2 n NH, 80 : 20 (2, 01)
III) n-Propanol/2 n NH 80 : 30 (2, 51)
Mit den Elutionsmitteln I und II werden die restlichen Verunreinigungen und Farbstoffe eluiert, während mit System III die Fraktionierung von Moenomycin beginnt.
Mittels Fraktionenteiler werden Fraktionen von 15 ml aufgefangen und in diesen das Vorhandensein von Moenomycin-Komponenten durch dünnschichtchromatographische Analyse (System wie in der Tabelle, Sichtbarmachung durch Fluoreszenzlöschung mitUV-Lampe260mm f oder durch Besprühen mitChlorsulfonsäure/Elsessig 2 : 1 mit anschliessendem Erhitzen auf 1050, 15 min, rotviolette Flecken) überpüft.
Hiebei erscheinen die Moenomycin-Komponenten in folgenden Fraktionen :
EMI7.1
<tb>
<tb> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Moenomycin-Komponente <SEP> Ausbeute <SEP> nach <SEP> Isolierung <SEP> mg
<tb> 55 <SEP> - <SEP> 95 <SEP> C <SEP> 440
<tb> 96 <SEP> - <SEP> 105 <SEP> C <SEP> + <SEP> A <SEP> (Gemisch) <SEP> 470
<tb> 106 <SEP> - <SEP> 140 <SEP> A <SEP> 585
<tb> 141 <SEP> - <SEP> 155 <SEP> A <SEP> + <SEP> B <SEP> (Gemisch) <SEP> 610
<tb> 156 <SEP> - <SEP> 170 <SEP> B <SEP> 275 <SEP>
<tb>
Zur Isolierung der reinen Komponenten werden die vereinigten Fraktionen im Vakuum zur Trockne eingedampft, die Rückstände in Methanol gelöst und nach Filtration die Moenomycin-Komponenten durch Zusatz von überschüssigem Äther ausgefällt. Die Fällungen werden abzentrifugiert, mit Äther gewaschen und getrocknet.
Es werden farblose, amorphe Substanzen mit den in der Beschreibung angegebenen Eigenschaften erhalten.
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Method for purifying moenomycin
It is known from German patent specification no. 1113791 that a new antibiotic called moenomycin can be obtained from cultures of Streptomyces bambergiensis, S. ghanaensis, S. ederenses and S. geysiriensis and their variants or mutants.
The antibiotic is effective against gram-positive pathogens, especially staphylococci, which are resistant to tetracycline, penicillin, streptomycin, novobiocin and erythromycin. For example, it has a bacteriostatic effect against Staphylococcus aureus P 209 at a concentration of 0.125 to 0.25 μg / ml.
It has now been found that a highly purified product with significantly improved antibiotic effectiveness is obtained if the crude product isolated from the mycelium extract is dialyzed, the internal dialysate is extracted in a weakly acidic medium with a polar, water-insoluble or sparingly soluble solvent, and the extract is extracted in vacuo evaporated to dryness, taken up in water, the solution adsorbed on magnesium silicate, eluted with methanol, the eluted product isolated in a known manner and this either a) adsorption chromatography on silica gel using a mixture of lower
Alcohols and ammonia as eluting solution, or b) chromatography on crosslinked dextran gels with water as eluant or c) chromatography on cellulose-based ion exchangers with salt solutions as eluents,
The pure moenomycin is isolated from the eluate in a known manner and, if necessary, converted into the salt form with basic agents.
Particularly suitable solvents for the extraction of the internal dialysate are alcohols such as butanol and isoamyl alcohol. Operate at an pH of 2 to 3, preferably 2.8 to 3.
The magnesium silicate that is commercially available under the name Florisil R is particularly suitable.
The silica gel used for adsorption chromatography expediently has a particle size of 75 to 400 μl. Before use, it is advisable to activate it by treating it with half-concentrated hydrochloric acid, washing with water until it reacts neutral and then heating it for three hours to around 1300C.
Mixtures of different compositions of lower alcohols, in particular n-propanol and isopropanol, with lower aqueous amines, preferably ammonia, come into consideration as eluants in this process. Occasionally, an addition of buffer substances, for example borate or phosphate buffer, may be appropriate. The proportions of propanol and ammonia can be in
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vary widely. As a rule, the eluent contains 50-90%, preferably 65-85% propanol. The ammonia used is preferably 2 normal, but concentrations up to about 14N can also be used.
The commercial products Sephadex G 25, G 50 and G 100 have particularly proven themselves as dextran gels. Suitable cellulose-based ion exchangers are, for example, ecteola cellulose (epichlorohydrin-triethanolamine condensation product of cellulose) or DEAE cellulose (cellulose etherified with diethylaminoethanol). The salt solutions used for the elution are preferably 10%; Bicarbonate solutions are particularly advantageous, but solutions of any other inorganic salts can also be used.
The cleaning methods described under b) and c) can also be combined in any order and / or preceded the process according to a). Cleaning effects can also be achieved with the following methods:
1. Salting out from concentrated aqueous solution, for example by saturation with ammonium sulfate;
2. Countercurrent distribution, e.g. B. in the system n-butanol / Mc Ilvaine buffer at pH 3-5;
3. Partition chromatography on suitable adsorbents, e.g. B. Kieselguhr using the system mentioned under 2.;
4. Preparative thin layer chromatography on silica gel, for example with the system n-propanol / 2N NH, 70:30;
5.
Precipitation with metal salts, especially salts of zinc, mercury, aluminum, copper,
Iron, cobalt, nickel, manganese. and chromium, from a weakly alkaline medium.
These methods can be switched on before or after dialysis or adsorption chromatography on magnesium silicate.
The moenomycin purified in this way is characterized by the following characteristics:
The compound is a weakly acidic, amorphous substance that forms salts with organic and inorganic bases. It is stable in neutral, aqueous and methanolic solutions, but slowly decomposes in acidic and alkaline media. The sodium salt of moenomycin is still stable in its dry solid form even after 48 hours of heating at 800C. The elemental analysis shows the following values:
C 48.5%, H 7, 3%, N 5, 10/0, P 1, 80/0, the rest consists of oxygen. The substance has no de-
EMI2.1
Electrophoresis shows the moenomycin in buffer solutions of PR 1, 9 to 7, 8 no migration, on the other hand a strong anode migration at PH 9, 8.
Paper chromatography gives the following RF values:
EMI2.2
<tb>
<tb> System <SEP> RF
<tb> n-butanol / triethylamine /
<tb> methyl isobutyl ketone /
<tb> water <SEP> 14 <SEP>: <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Benzene / glacial acetic acid / water <SEP> 2 <SEP>: <SEP> 2 <SEP>: <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> n-butanol / glacial acetic acid / water <SEP> 4 <SEP>: <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 88 <SEP>
<tb> tert. <SEP> butanol / glacial acetic acid /
<tb> Water <SEP> 60 <SEP>: <SEP> 6 <SEP>: <SEP> 34 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP>
<tb> butanol, <SEP> water-saturated <SEP> 0
<tb> sec. <SEP> butanol / glacial acetic acid / water <SEP> 4 <SEP>: <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb>
The following reactions are negative:
Ninhydrin, Binret, Fehling, Ehrlich, Sakaguchi, aniline phthalate, ferric chloride.
In contrast, moenomycin gives red-violet color reactions with antimony trichloride and chlorosulfonic acid (as spray reagents) and reacts with potassium permanganate and periodic acid / Schiff's reagent. Potentiometric titration gives an equivalent weight of about 800 and a PK value of 4.1. The molecular weight determination using an ultracentrifuge and light scattering measurement leads to values from 68,000 to
<Desc / Clms Page number 3>
70000. Moenomycin is not dialyzable and can be treated with neutral salts, e.g. B. ammonium sulfate, are salted out from neutral aqueous solution.
Compared to the moenomycin described in German Patent No. 1113791, the product purified by the above process has a considerably stronger antibiotic activity.
The spectrum of activity and the therapeutic activity can be seen from the tables below.
Table I.
EMI3.1
<tb>
<tb> Antibiotic <SEP> spectrum of activity
<tb> test organism <SEP> inhibition <SEP> (bacteriostasis)
<tb> beiy / ml
<tb> staph. <SEP> aureus <SEP> P <SEP> 209 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> tetracycline <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> streptomycin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> penicillin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> novobiocin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> staph. <SEP> aureus <SEP> resistant <SEP> to <SEP> erythromycin <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 16
<tb> Corynebact.
<SEP> diphtheria <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> mesentericus <SEP> 0, <SEP> 24. <SEP>
<tb>
Bacillus <SEP> mycoides <SEP> 3, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Bacillus <SEP> anthracis <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP>
<tb> Enterococcus <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP>
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 188
<tb> Klebs. <SEP> thinoscleromatis <SEP> 94
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 23
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 94
<tb> Salm. <SEP> paratyph. <SEP> A <SEP> 188
<tb> Salm. <SEP> paratyph. <SEP> B <SEP> 188
<tb> Salm. <SEP> pullorum <SEP> 77
<tb> Shigella <SEP> flexneri <SEP> 47
<tb> Pasteurellaseptica <SEP> 35, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Brucella <SEP> abortus <SEP> Bang <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Brucella <SEP> melitensis <SEP> 4, <SEP> 7 <SEP>
<tb>
<Desc / Clms Page number 4>
Table II
EMI4.1
<tb>
<tb> Therapeutic <SEP> activity <SEP> of <SEP> moenomycin <SEP> in <SEP> <SEP> mice <SEP> infected with <SEP> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP>
<tb> infection <SEP>:
<SEP> intraperitoneally
<tb> Treatment <SEP>: <SEP> 3 <SEP> doses <SEP> Moenomycin <SEP> immediately,
<tb> 4 <SEP> and <SEP> 20 <SEP> h <SEP> after <SEP> the <SEP> infection
<tb> total dose <SEP> mg / kg <SEP> number <SEP> of <SEP> test animals <SEP> survivors <SEP> animals <SEP> after
<tb> 2 <SEP> days <SEP> 10 <SEP> days
<tb> 75 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 37, <SEP> 5 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 20 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP>
<tb> 0 <SEP> (control) <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
(The inoculation material was produced as in the German.
Patent specification No. 11137 91 is given.)
When using the method described above under a), a separation into three antibiotically active components is achieved at the same time, which are called moenomycin A, B and C below and can be collected separately if desired. They are chemically very similar to one another and behave like the moenomycin complex with regard to solubility, acid properties, molecular weight, paper chromatographic behavior, paper electrophoresis, color reactions and stability.
The biological properties of the subcomponents also differ only insignificantly from those of the complex. In addition, the components are characterized by the following data:
Moenomycin A
EMI4.2
H po N 5.3% P 1.80 / 0 0 remainder.
EMI4.3
EMI4.4
EMI4.5
EMI4.6
184-1850C. Thin layer chromatography: s. Table m.
Moenomycin B elemental analysis (free acid): C 47, 81o
H 7, 21o
EMI4.7
<Desc / Clms Page number 5>
EMI5.1
EMI5.2
EMI5.3
ff1 / oMoenomycin C elemental analysis (free acid): C 49.1%
H 7.4%
N 5, 31a
P 1, 7%
0 rest
EMI5.4
EMI5.5
EMI5.6
EMI5.7
: 178-179OC. Thin layer chromatography: see p. Table III.
Table III
EMI5.8
<tb>
<tb> Thin-layer chromatographic <SEP> behavior <SEP> of <SEP> Moenomycin <SEP> A, <SEP> B <SEP> and <SEP> C <SEP> on <SEP> silica gel <SEP> G
<tb> R values
<tb> Solvent system <SEP> Moenomycin <SEP> A <SEP> Moenomycin <SEP> B <SEP> Moenomycin <SEP> C
<tb> Isopropanol / 2n <SEP> NHs <SEP> 70 <SEP>: <SEP> 30 <SEP> 0, <SEP> 45 <SEP> 0, <SEP> 36 <SEP> 0, <SEP> 53 < SEP>
<tb> isopropanol / water / borate buffer <SEP> PH <SEP> 9, <SEP> 0 <SEP> 70 <SEP>: <SEP> 25 <SEP>: <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> 0, <SEP> 55 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP>
<tb> Ethanol / water <SEP> 4 <SEP>: <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 0, <SEP> 77 <SEP>
<tb>
Example 1 :
a) Isolation
After harvesting, the mycelium obtained by the method described in German Auslegeschrift 1113791 is separated from the fermentation solution by centrifugation and extracted with 10 l of methanol while stirring. The methanol is filtered off and the residue is extracted again with 10 l of methanol. The combined methanol extracts are evaporated under reduced pressure until the methanol is removed and the aqueous phase obtained (approx. 500 ml) is adjusted to pH 3 with hydrochloric acid and extracted twice with 500 ml of n-butanol each time. The butanol extract is evaporated to 100 ml in vacuo.
When standing in the refrigerator, the raw moenomycin precipitates. The product is filtered off with suction, washed with ethyl acetate and dried. Yield 18g. The crude product can also be obtained from the concentrated butanol solution by precipitation with ether or ethyl acetate. The product contains about 20% moenomycin (microbiological test). b) Purification by dialysis and chromatography on magnesium silicate
20 g of crude product from a) are suspended in 200 ml of water, the solution is adjusted to pH 7 with 1N NaOH, undissolved material is filtered off and dialyzed against running tap water for 3 days. The solution remaining in the dialysis vessel is adjusted to pH 3 with HCl and extracted twice with 250 ml of n-butanol each time. After concentrating the butanol in vacuo, the enriched moenomyein is obtained as in a) by freezing out or precipitation with ether.
Yield 8.5g. The brown product contains 481o moenomycin.
To remove most of the brown dye still present, the crude product is dissolved in 100 ml of methanol, insoluble material is filtered off and the solution is applied to a chromatography column with 80 g of magnesium trisilicate (Florisil R) suspended in methanol. Elution takes place with 1 l of methanol (fraction 1) and 500 ml of 80% aqueous methanol (fraction 2).
From fraction 1, when the solvent evaporates, 5.4 g of moenomycin are produced as a pale amorphous powder,
<Desc / Clms Page number 6>
from fraction 2 still 1.3 g of moenomycin obtained somewhat less activity. c) Purification by column chromatography on silica gel
EMI6.1
6 dissolved and suspended 100 g of purified silica gel in this solution. After the water has evaporated in vacuo, the dry powder consisting of moenomycin and silica gel is applied to the top of the
Pillar.
The elution now takes place with the following solvents: I) Isopropanol / 2N NHg 100: 20 (7 1)
II) isopropanol / 2N NH, 90:20 (5, 5 1)
HI) isopropanol / 2N NH, 80:20 (5, 0 1)
IV) isopropanol / 2N NHs 80:30 (15, 0 1)
With the solvent systems I - III impurities and dyes are washed out, while with system IV the moenomycin is eluted. Fractions of 500 ml are collected and the presence of moenomycin is detected in them by analysis by thin-layer chromatography.
Glass plates coated with silica gel are used for this, the isopropanol-2 nNHs 70:30 system is used as the mobile phase, and the substance spots are made visible due to the fluorescence quenching under the UV lamp at 260 μm or by spraying with chlorosulfonic acid / glacial acetic acid 2: 1 and then heating to 1050, with red-violet spots becoming visible. Fractions 7-21 contain moenomycin, the higher fractions contain more polar impurities.
To isolate the purified moenomycin, the combined fractions 7-21 are evaporated to dryness in vacuo at 400; the residue is dissolved in methanol and, after filtration, the antibiotic is precipitated by adding excess ether. The precipitate is centrifuged off, washed with ether and dried. In this way, purified moenomycin is obtained as the ammonium salt. d) Purification by gel filtration on Sephadex R
1 g of moenomycin from b) is dissolved in 10 ml of H 2 O and applied to a chromatography column (80 × 5 cm) containing swollen Sephadex. When developing with water, 16 fractions of 100 ml each are collected and analyzed.
According to UV measurements at 258 μm and determination of the microbiological activity, moenomycin is found in fractions 5–10 (maximum fraction 8), while the dyes appear in fraction 4 and fraction 11 to 16. A colorless amorphous product (0.55 g) with a moenomycin content of 80 to 85% is obtained from the main fraction by freeze-drying. e) Purification by chromatography on ion-exchange cellulose
400 mg of the moenomycin purified by gel filtration according to d) are dissolved in 8 ml of water and applied to a chromatography column (100 × 3 cm) with Ecteola anion exchanger cellulose.
The ecteola powder has previously been converted into the bicarbonate form with a 5% NHHCO 3 solution and is slurried into the column in 0.4% NH4HCO3 solution. The column is developed with water (100 ml) and then by a gradient elution (linear gradient) with 11 0, 4% and 1 ohm NH4HCO3 solution. Fractions of 10 ml each are collected by means of a fraction collector and measured by UV (258 mu) and microbiological test analyzed. Moenomycin is in fraction 81-110. The fractions are combined, the solution with an excess of Amberlite R IRC-50 (acrylic acid-divinylbenzene polymer from Fa.
Röhm & Haas) and desalinated in this way.
Freeze-drying the solution gives 180 mg of pure colorless moenomycin (acid form). f) Purification via the zinc salt
EMI6.2
1 N sodium hydroxide solution adjusted to pH 8. The precipitation of the zinc salts, which contains the moenomycin, is centrifuged off, washed out with 100 ml of water and suspended in 100 ml of water. After acidification to PH 2 with 1 N H2 SO. the clear solution is extracted twice with 100 ml of n-butanol each time, the butanol extracts are combined and concentrated, and the moenomycin is isolated by precipitation with ethyl acetate. Yield 1.9 g, content 45% moenomycin.
Example 2:
<Desc / Clms Page number 7>
K salt of moenomycin
0.5 g of pure moenomycin (acid form) (obtained according to 1 e) are dissolved in 5 ml of water and the solution is adjusted to pH 7 with 0.51 nKOH. Freeze-drying gives 0.52 g of the K salt of moenomycin.
Example 3:
Na salt of moenomycin
300 mg of pure moenomycin (acid form) (obtained from 1 e) are dissolved in 1 ml of methanol, the solution is adjusted to 11 with Zloiger methanolic NaOH and the sodium salt is precipitated by adding 1 vol of ether, washed with ether and dried in vacuo . Yield 240 mg.
Example 4:
Diethylamine salt of moenomycin
250 mg of pure moenomycin (acid form) (obtained according to 1 e) are dissolved in 3 ml of water and 2 ml of a 50% aqueous diethylamine solution are added. The resulting diethylamine salt of moenomycin is isolated by evaporating the solution in vacuo.
Example 5:
Cyclohexylamine salt of moenomycin
300 mg of cyclohexylamine are added to a solution of 450 mg of pure moenomycin in 10 ml of methanol and the salt formed is isolated by evaporating the solution in vacuo.
Example 6:
Chromatographic separation of moenomycin complex and production of moenomycin A,
B and C
400 g of sieved silica gel, grain size 75-150 u, which was purified by treatment with half-concentrated hydrochloric acid, subsequent neutral washing and activation at 1300, are placed in a chromatography column. Then 4 g of moenomycin purified by Florisil-purified chromatography is dissolved in 10 ml of water and the solution is applied to 20 g of purified silica gel and, after drying, applied to the top of the column.
Now it is eluted with the following solvents:
I) n-propanol / 2 n NH, 100 20 (2, 0 I)
II) n-propanol / 2 n NH, 80:20 (2.01)
III) n-propanol / 2 n NH 80: 30 (2, 51)
The remaining impurities and dyes are eluted with the eluents I and II, while the fractionation of moenomycin begins with system III.
Fractional dividers are used to collect fractions of 15 ml and in these the presence of moenomycin components by thin-layer chromatographic analysis (system as in the table, visualization by fluorescence quenching with a UV lamp 260 mm f or by spraying with chlorosulfonic acid / alsaceous acid 2: 1 with subsequent heating to 1050, 15 min, red-violet spots) checked.
The moenomycin components appear in the following fractions:
EMI7.1
<tb>
<tb> Fraction <SEP> No. <SEP> Moenomycin component <SEP> Yield <SEP> after <SEP> isolation <SEP> mg
<tb> 55 <SEP> - <SEP> 95 <SEP> C <SEP> 440
<tb> 96 <SEP> - <SEP> 105 <SEP> C <SEP> + <SEP> A <SEP> (mixture) <SEP> 470
<tb> 106 <SEP> - <SEP> 140 <SEP> A <SEP> 585
<tb> 141 <SEP> - <SEP> 155 <SEP> A <SEP> + <SEP> B <SEP> (mixture) <SEP> 610
<tb> 156 <SEP> - <SEP> 170 <SEP> B <SEP> 275 <SEP>
<tb>
To isolate the pure components, the combined fractions are evaporated to dryness in vacuo, the residues are dissolved in methanol and, after filtration, the moenomycin components are precipitated by adding excess ether. The precipitates are centrifuged off, washed with ether and dried.
Colorless, amorphous substances with the properties given in the description are obtained.
** WARNING ** End of DESC field may overlap beginning of CLMS **.