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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Reinigung von Neothramycin-A und/ oder Neothramycin-B der Formel I:
EMI1.1
in welcher Rl eine Hydroxylgruppe und R2 ein Wasserstoffatom für Neothramycin-A bedeutet, während R' ein Wasserstoffatom und R2 eine Hydroxylgruppe für Neothramycin-B bedeutet, wobei das Neothramycin in Lösung ausschliesslich in Wasser behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass man (a) eine rohe wässerige Lösung, welche Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, mit einem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harz behandelt, um das Neothramycin durch das macroreticulare Harz zu adsorbieren, (b) das macroreticulare Harz, an welches das Neothramycin adsorbiert ist, mit Wasser, welches einen Anteil an Aceton enthält, oder mit verdünntem wässerigem Ammoniumhydroxid eluiert,
um eine teilweise gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B als eine Fraktion oder einige Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (c) die derart erhaltene teilweise gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin mit einem stark basischen Ionenaustauscherharz, welches quaternäre Ammoniumgruppen als funktionelle Anionenaustauschergruppen enthält, behandelt, um die Antibiotika durch diesen Anionenaustauscher zu adsorbieren, (c) den Anionenaustauscher, an welchen das Neothramycin adsorbiert ist, mit einer wässerigen Lösung eines neutraler Salzes eluiert, um eine gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin zusammen mit den neutralen Salz enthält, als eine Fraktion oder mehrere Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (d) die derart erhaltene gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin und dem neutralen Salz wiederum mit einer frischen Portion des macroreticularen,
nicht Ionen austauschenden Harzes behandelt, um Neothramycin durch das macroreticulare Harz zu adsorbieren, (f) das letztere macroreticulare Harz, welches Neothramycin adsorbiert enthält, mit Wasser, welches einen Anteil Aceton enthält, oder mit verdünntem wässerigem Ammoniumhydroxid eluiert, um eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin aber kein neutrales Salz enthält, als eine Fraktion oder mehrere Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (g) die derart erhaltene Lösung entsalzt und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin in einer Serie aufeinanderfolgender Stufen behandelt, welche eine adsorptive Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher in derselben Weise wie oben erwähnt, eine Eluierung dieses Anionenaustauschers mit einer wässerigen Lösung eines neutra len Salzes auf dieselbe Weise wie oben erwähnt,
eine adsorp tive Behandlung des erhaltenen Eluates, welches Neothramy cin als neutrales Salz enthält, mit einer frischen Portion eines macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harzes auf dieselbe Weise wie oben und eine Eluierung des letztgenann ten adsorbiertes Neothramycin enthaltenden macroreticula ren Harzes mit Wasser, welches Aceton enthält, oder mit ver dünntem wässerigem Ammoniumhydroxid in um eine ent salzte und weiter gereinigte wässerige Lösung zu gewinnen, welche Neothramycin aber kein neutrales Salz enthält, in solcher Weise, dass die gewonnene entsalzte und weiter gereinigte Lösung von Neothramycin der oben genannten Serie aufeinanderfolgender Stufen ein oder mehrmals unterworfen wird, um eine wässerige Lösung, welche Neothramycin in gewünschter Reinheit enthält, zu erhalten.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete stark basische Anionenaustauscher ein Polystyrolharz ist, welches quaternäre Ammoniumgruppen als funktionelle Anionenaustauschergruppen enthält.
3. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Eluierung des Anionenaustauschers, welcher Neothramycin adsorbiert enthält, verwendete wässerige Lösung eines neutralen Salzes eine wässerige Lösung von Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat ist;
4. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete macroreticulare nicht Ionen austauschende Harz ein macroreticulares Divinylbenzol-Styrol-Copolymer ist.
5. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Eluierung des macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harzes, welches Neothramycin adsorbiert enthält, verwendete acetonhaltige Wasser mit einem Acetongehalt von 5 bis 50 Volumprozent ist.
6. Verfahren zur Reinigung von Neothramycin-A und/ oder Neothramycin-B der Formel I gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässerige Lösung, welche Neothramycin enthält, nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 reinigt, das Aceton oder das Ammoniumhydroxid durch Destillation unter vermindertem Druck aus der erhaltenen gereinigten wässerigen Lösung von Neothramycins entfernt und die Lösung dann gefriertrocknet.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von Neothramycin-A und/oder Neothramy cin-B, wobei das Neothramycin in Lösung ausschliesslich mit Wasser behandelt wird. Das Verfahren ist in Patentanspruch
1 definiert. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Reinigung der Antibiotika Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B in der Form einer wässerigen Lösung, mit erhöhter Ausbeute durch ein chromatographisches Verfahren, welches das Adsorbieren von Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B auf einem stark basischen Anionenaustauscher, insbesondere einem stark basischen Anionenaustauscher, welcher quaternäre Ammoniumgruppen als funktionelle Anionenaustauschergruppen enthält, aus einer wässerigen Lösung, welche die Antibiotika enthält, gefolgt von der Eluierung des Anionenaustauschers, welcher die Antibiotika adsorbiert enthält,
mit einer wässeri gen Lösung eines neutralen Salzes umfasst.
Die nach der vorliegenden Erfindung zu reinigenden Neothramycin-A und Neothramycin-B sind neue Antibiotika, welche zuvor von denselben-Erfindern entdeckt wurden und welche durch Züchtung-eines Mikroorganismus, nämlich des Stammes Streptomyces MC916-C4 erzeugt wurden, welcher Stamm im Fermentation Research Institute in Japan unter der No. FERM-P 2352 und ebenfalls im American
Type Culture Collection unter der No. ATCC 31123 hinter legt. ist. Die Neuthramycine-A und -B weisen nur eine schwa che antibakterielle Aktivität auf besitzen jedoch eine hohe hemmende Wirkung auf das Wachstum von experimentellen Tumoren, die in Tiere transplantiert wurden, auf, so dass sie in Kliniken als Antitumormittel untersucht werden (siehe japanische Patent Nor. 1 009 206 und 1 019 568; Journal of
Antibiotics , Band 29, Seite 93 (1976) und Band 30, Seite 340 (1977); sowie die US-Patente No. 049 497 und 4 105 658).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bestätigt, dass Neothramycin-A und -B die folgende Struktur aufweist:
EMI2.1
in welcher Rl eine Hydroxylgruppe und R2 ein Wasserstoffatom für Neothramycin-A bedeutet, während R' ein Wasserstoffatom und R2 eine Hydroxylgruppe für Neothramycin-B bedeutet. Unter wasserfreien Bedingungen können die Neothramycine-A und -B als solche voneinander isoliert werden.
In wässerigen Lösungen jedoch können die Neothramycine-A und -B spontan ineinander übergehen, wobei ein Gleichgewichtsgemisch der Neothramycine-A und -B entsteht. Da die Neothramycine-A und -B in ihren wässerigen Lösungen gemäss der vorliegenden Erfindung gehandhabt werden, wird im folgenden das Gleichgewichtsgemisch der Neothramycine-A und -B einfach als Neothramycin bezeichnet.
Wie im einzelnen in den japanischen Patenten No.
1 009 206 und No. 1 019 568 sowie den US-Patenten No.
4 049 497 und No. 4 105 658 beschrieben, erfolgte die Ge winkung von Neothramycin, wie es durch die fermentative Methode erzeugt wurde, üblicherweise entweder durch Extrahieren mit Butanol aus einer wässerigen Lösung von Neothramycin, z.B. der Fermentationsbrühe des Neothramycin erzeugenden Mikroorganismus, oder durch Behandlung einer wässerigen Lösung von Neothramycin mit Aktivkohle zwecks Adsorption der Antibiotika. Gemäss der Adsorptionsmethode unter Verwendung von Aktivkohle, ist es im allgemeinen möglich, das Neothramycin, welches an der Aktivkohle adsorbiert wurde, aus der Kohle mit Hilfe eines gemischten Lösungsmittels aus Methanol-Wasser, Propanol Wasser oder Aceton-Wasser und dergleichen zu extrahieren.
Es war am zweckmässigsten, eine Gewinnungsmethode zu verwenden, welches Extrahieren der Aktivkohle, welche das Neothramycin adsorbiert enthielt, mit 50%igem Aceton Wasser, d.h. Wasser, welches 50 Volumprozent Aceton enthielt, das Konzentrieren des erhaltenen Aceton-Wasser-Extraktes unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht höher als 40 "C, das Gefriertrocknen der konzentrierten Lösung, um ein erstes rohes Pulver zu erhalten, welches Neothramycin-A und -B als erste Portion enthielt, umfasste.
Zur Reinigung wurde das obige erste rohe Pulver mit 80%igem Äthanol-Wasser, d.h. Wasser, welches 80 Volumprozent Äthanol enthielt, extrahiert, der erhaltene Extrakt unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht über 40 "C konzentriert und die konzentrierte Lösung gefriergetrocknet, um ein zweites rohes Pulver zu ergeben. Dieses zweite rohe Pulver wurde sodann in Methanol gelöst und die methanolische Lösung durch eine Säule eines Gelfiltrationsmittels, Sephadex LH-20 (ein Produkt von Pharmacia Fine Chemical Co., Schweden) geleitet, gefolgt von der Entwicklung der Säule mit Methanol, so dass Neothramycin von den coexistierenden anderen Antibiotika, wie z.B. Cycloheximid, getrennt wurde.
Jene Fraktionen des Eluates, welche Neothramycin-A und -B enthielten, wurde sodann unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft, wobei ein drittes rohes Pulver erhalten wurde.
Dieses dritte rohe Pulver wurde in Methanol aufgenommen und die methanolische Lösung wurde über eine Säule aus einem neutralen Silicagel chromatographiert und mit Chloroform-Äthanol entwickelt, so dass jene Fraktionen des Eluates, welche Neothramycin-A allein enthielten, getrennt von jenen Fraktionen des Eluates erhalten werden konnten, welche Neothramycin-B allein enthielten. Für die weitere Reinigung von Neothramycin-A und -B wurden die Fraktionen mit Neothramycin-A bzw. die Fraktionen mit Neothramycin-B einer chromatographischen Methode unterworfen, indem sie über eine Säule aus neutralem Silicagel geleitet wurden und anschliessend die Säule mit Chloroform-Äthanol entwickelt wurde.
Das derart erhaltene Eluat wurde sodann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur und nicht über 40 "C konzentriert, um ein teilweise gereinigtes Pulver aus Neothramycin-A oder -B zu ergeben. Wenn die oben erwähnten Verfahren verwendet werden für die Gewinnung und Reinigung der Neothramycine, so sind einige zusätzliche Schritte notwendig, nämlich das Auflösen des oben genannten teilweise gereinigten Pulvers aus Neothramaycin-A oder -B in Chloroform, das Vermischen der Chloroformlösung mit Äthyläther, um das Neothramycin auszufällen, das Auflösen des letzteren in Äthanol, das Chromatographieren über eine Säule aus neutralem Silicagel, die mit wässerigem Äthylacetat entwikkelt wird,
und das Konzentrieren des erhaltenen Eluates unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht über 40 "C um ein vollständig reines Pulver aus Neothramycin-A oder -B zu erhalten.
Wie oben beschrieben, kann die Fraktion, welche das Neothramycin-A allein enthält und die Fraktion, welche das Neothramycin-B allein enthält, welche Fraktionen getrennt erhalten wurden, weiter gereinigt werden über voneinander getrennten Wegen. Wenn jedoch sowohl die Fraktion von Neothramycin-A wie die Fraktion von Neothramycin-B miteinander vermischt sind und das Gemisch sodann einer Reinigungsmethode unterworfen wird, welche die oben erwähnten aufeinanderfolgenden chromatographischen Methoden umfasst, ist es möglich, ein Gemisch von reinem Neothramycin A und reinem Neothramycin-B zu erhalten.
Andererseits, wenn die oben genannte Methode zum Extrahieren einer rohen wässerigen Lösung der Neothramycine-A und -B mit Butanollösungsmittel angewandt wurde, war es notwendig, den Butanolextrakt unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht über 40 "C zu konzentrieren, so dass ein bräunliches sirupartiges rohes Material, welches die Neothramycine enthielt, als erste Portion erhalten wurde (siehe z.B. Beispiel 7 aus der US-Patentschrift No. 4 049 497).
Für die weitere Reinigung war es notwendig, das erhaltene sirupartige rohe Material anschliessend über eine Anzahl aufeinanderfolgenden Stufen zu behandeln, welche denjenigen ähnlich sind, welche für die Reinigung des mit der oben erwähnten Methode zur Behandlung der Fermentationsbrühe mit Aktivkohle erhaltenen ersten rohen Pulvers eingeschätzt werden.
Wenn entweder die Adsorptionsmethode mit Aktivkohle oder die Extraktionsmethode mit Butanol zur Gewinnung und Reinigung von Neothramycin verwendet wird, ist es somit erforderlich, dass die Stufen der Entwicklung einer Säule aus neutralem Silicagel, an welchem Neothramycin adsorbiert wurde, mit einem organischen Lösungsmittelsystem, z.B. Chloroform-Methanol oder Chloroform-Äthanol, und die anschliessende Trennung des Antibiotikums aus dem zum Entwickeln verwendeten organischen Lösungsmittel mehrmals im Laufe des Reinigungsverfahrens wiederholt werden sollten und dass ferner die Trennung von Neothramycin vom organischen Lösungsmittel das Konzentrieren der organischen Lösung unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht über 40 "C erfordert, um das organische Lösungsmittel zu entfernen.
Unter diesen Verfahrensschritten, welche in Reinigungsverfahren notwendig sind, bildet die Eluierung von Neothramycin aus der Säule aus neutralem Silicagel, welche mit dem organischen Lösungsmittel entwickelt ist, üblicherweise eine Stufe von sehr geringem Wirkungs- grad, und ausserdem ist die Konzentration der organischen Lösung von Neothramycin unter vermindertem Druck üblicherweise mit einigen Schwierigkeiten verbunden und weist einen geringen Wirkungsgrad auf.
Ferner muss das Neothramycin einer mehr oder weniger erhöhten Temperatur während des Konzentrierens der organischen Neothramycin-Lösung unter vermindertem Druck ausgesetzt werden, so dass eine Zersetzung des Neothramycins umweigerlich bis zu einem gewissen Mass stattfinden kann, abgesehen davon, dass Neothramycin als unstabil und bei einer über Zimmertemperatur erhöhten Temperatur leicht zersetzbar bekannt ist.
Ferner ist es notwendig, um Neothramycin von anderen coexistierenden antibiotischen Nebenprodukten, wie Cycloheximid, zu befreien, die rohen Neothramycine-A und -B in Methanol aufzunehmen und die methanolische Lösung über eine Säule aus eine Sephadex-Gelfiltriermittel zu chromatographieren, welche mit Methanol entwickelt wird. Grundsatz lich wird jedoch nicht bevorzugt, dass Neothramycin-A oder -B mit einem niederen Alkanol, wie Methanol und Äthanol, in Berührung gebracht werden, weil die Neothramycine-A und -B jedes die Natur aufweist, in ihr entsprechendes 3-0-alkyliertes Derivat, wie das 3-O-Methylderivat oder 3-O-Äthyl- derivat umgewandelt zu werden, wenn sie mit einem niederen Alkanol in Berührung kommen.
Aus diesen Gründen sind die Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von fermentativ erzeugten Neothramycinen-A und -B, welche früher durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelt wurden, nicht frei von Nachteilen, indem sie schwierige Operationen umfassen und keinen hohen Wirkungsgrad aufweisen und somit nicht geeignet sind für die Ausführung in technischem Massstab. Solange die bisher bekannten Methoden daher angewandt wurden, war die Gesamtausbeute an reinem Endprodukt aus Neothramycin bei einem Wert von 3% dder weniger, berechnet auf die gesamte Potenz (potency) des Neothramycins, welches ursprünglich im Brühenfiltrat der Neothramycin erzeugenden Mikroorganismen zugegen ist.
Aus diesem Grunde haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung kürzlich eine weitere Methode zur Reinigung von Neothramycin entwickelt, welche das Chromatographieren einer rohen wässerigen Lösung von Neothramycin über eine Säule aus macroreticularem Harz, welches keine lonenaustauschfähigkeit besitzt, umfasst und mit welcher eine konzentrierte Lösung, welche Neothramycin von hoher Reinheit enthält, in günstiger Ausbeute erhalten werden kann, wie in der Beschreibung der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Kokai No. Sho 53-38695 (japanische Patentanmeldung No. 1 L0723/76) ausgeführt wurde.
Gemäss dieser chromatographischen Methode unter Verwendung einer Säule aus macroreticularem, nicht Ionen austauschenden Harz, wird eine rohe wässerige Lösung von Neothramycin über eine Säule aus einem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden, adsorbierenden Harz, wie einem macroreticularen Harz hergestellt aus einem Divinyl-benzo-styrolcopolymer, z.B.
Handelsprodukte bekannt als Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7 und dergleichen (Handelsprodukte von Rohm & BR< Haas Co., USA), sowie Diaison HP-10, HP-20, HP-40 und dergleichen (Handelsprodukte von Mitsubishi Kasei Co., Japan), geleitet, so dass das Neothramycin durch das Harz adsorbiert wird. Das derart adsorbierte Neothramycin wird sodann aus der Harzsäule eluiert durch Entwickeln mit Wasser, welches 5 bis 20 Volumprozent Aceton enthält mit Wasser mit einem Methanolgehalt von 30 bis 50 Volumprozent oder mit Wasser mit einem Gehalt an 0,01 N bis 0,1 N Ammoniumhydroxid. Das erhaltene Eluat wird sodann gefriergetrocknet, um ein rohes Pulver zu ergeben, welches Neothramycin enthält.
Diese chromatographische Methode mit dem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harz weist einen höheren Wirkungsgrad auf im Vergleich zur früheren Adsorptionsmethode mit Aktivkohle und der früheren Extraktionsmethode mit Butanol, da sie in einer einzigen Stufe durchgeführt wird. Mit der chromatographischen Methode unter Verwendung des macroreticularen nicht Ionen austauschenden Harzes kann jedoch ein vollständig reines Produkt aus Neothramycin-A oder -B nicht erhalten werden, selbst wenn die aufeinanderfolgenden Stufen der Adsorption von Neothramycin durch das macroreticulare Harz, die Eluierung des Harzes mit Aceton-Wasser oder dergleichen und die anschliessende Gefriertrocknung des erhaltenen Eluates fünfmal oder mehr wiederholt werden. Ausserdem ist es dann ziemlich schwierig, das Neothramycin-Produkt vollständig frei von einer begleitenden Spur von Cycloheximid zu erhalten.
Unter diesen Umständen bestand ein Bedarf für eine einfachere und wirksamere Methode zur Reinigung von Neothramycin, wie es aus dem fermentativen Verfahren erhalten wird. So wurden ausgedehnte Forschungsarbeiten unternommen, um ein neues Verfahren für die Reinigung von Neothramycin zu erhalten, mit welchem es vollständig überflüssig ist, solche Stufen wie das Konzentrieren einer organischen Lösung von rohem Neothramycin unter vermidertem Druck mit mehr oder weniger Zersetzung von Neothramycin bei einer erhöhten Temperatur durchzuführen, in welchen es weiterhin überflüssig ist, als organisches Lösungsmittel einen Alkanol, wie Methanol und Äthanol, zu verwenden, welcher das Neothramycin in entsprechende 3-O-alkylierte Derivate umwandeln kann, wenn sie miteinander in Berührung gebracht werden, in welchem es ferner nicht erforderlich ist,
eine zusätzliche Stufe für die Entfernung von coexistierendem Cycloheximid-Nebenprodukt einzufügen und in welchem keine Stufe auftritt, in welcher eine wässrige Lösung von Neothramycin unter sauren Bedingungen aufbewahrt werden muss, welche fähig sind, das Neothramycin zu zersetzen. Es sollte nicht ausser Acht gelassen werden, dass seit der Entdeckung von Neothramycin-A und -B die Neothramycine bekannt sind als stabil in Form von wasserfreiem Pulver aber einigermassen unstabil in Form einer Lösung. Insbesondere war es bekannt, dass wenn Neothramycin-A und -B in 50%igem wässerigem Athanol aufgelöst werden, die antibakteriellen Aktivitäten in derartigen Lösungen bei pH 2,5 auf 25 bzw.
22% im Laufvon 16 Stunden bei Zimmertemperatur reduziert werden können, und dass, wenn eine Lösung von Neothramycin-A oder -B in 50%igem wässrigem Äthanol bei pH 6,5 oder pH 8,0 bei Zimmertemperatur gelagert wird, Neothramycin-A in ein Gleichgewichtsgemisch aus Neothramycin-A und -B umgewandelt werden kann, während Neothramycin-B ebenfalls in ein Gleichgewichtsgemisch der Neothramycine-A und -B umgewandelt werden kann.
Zusätzliche Untersuchungen haben ferner ergeben, dass wässerige Lösungen von Neothramycin-A oder -B im allgemeinen unter anderen als neutralen Bedingungen instabil sind, dass die restliche Aktivität einer wässerigen Lösung von Neothramycin-A oder -B bei pH 3, pH 7 und pH 12 auf 51,7%, bzw. 85,7% und 46,4% der ursprünglichen Aktivität reduziert werden kann, wenn die Lösung während 2 Tagen bei 25 "C gehalten wird, und dass die restliche Aktivität einer wässerigen Lösung von Neothramycin-A oder -B bei pH 12 auf nur 9,9% der ursprünglichen Aktivität abfallen kann, wenn die Lösung während 2 Tagen bei 35 "C aufbewahrt wird. Es wurde daher als Notwendig erachtet, dass wässerige Lösungen von Neothramycin unter neutralen Bedingungen während des ganzen Reinigungsprozesses gehalten werden.
Es wurden eine Anzahl Untersuchungen durchgeführt und nun unerwarteterweise gefunden, dass wenn eine wässe rige Lösung, welche Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, in Berührung mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz gebracht wird, welches quaternäre Am moniumgruppen als funktionelle lonenaustauschergruppen enthält, um das Neothramycinan dem stark basichen Anionenaustauscher zu adsorbieren, gefolgt von der Entwicklung des Anionenaustauschers mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes, wie z.B. Natriumchlorid, um Neothramycin aus dem lonenaustauscher zu eluieren, nicht nur das Neothra mycin weitgehend vor Zersetzung geschützt werden kann, sondern das Neothramycin auch mit hoher Reinheit und in einer hohen Konzentration in das Eluat verbracht werden kann.
Ausserdem wurde überraschend gefunden, dass keine Spur an coexistierenden Cycloheximid im Neothramycin enthaltenden Eluat festgestellt werden kann, sehr wahrscheinlich, weil Cycloheximid nach seiner Berührung mit dem stark basischen Anionenaustauscher vollständig zersetzt und entfernt wurde.
Als Folge wurde nun das neue Verfahren entwickelt, welches die Reinigung von rohem Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B mit hohem Wirkungsgrad ermöglicht, indem die oben genannte chromatographische Methode zur Reinigung von rohem Neothramycin mit einem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harz zusammen mit einen neuen Verfahren angewandt wird, in welchem eine wässerige Lösung, welche das Neotramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, mit einem stark basischen Anionenaustauscher behandelt wird, welcher quaternäre Ammoniumgruppen enthält, zur Adsorption von Neothramycin durch diesen Anionenaustauscher, und in welchem dieser Anionenaustauscher, nachdem das Neothramycin daran adsorbiert ist, mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes, z.B. Natriumchlorid, eluiert wird, wodurch eine gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B erhalten wird.
Gemäss der vorliegenden Erfindung ist daher das Verfahren zur Reinigung von Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B der Formel 1, bei welchem das Neothramycin ausschliesslich in wässeriger Lösung behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass man (a) eine rohe wässerige Lösung, welche Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, insbesondere ein Kulturbrühenfiltrat, welches Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, mit einem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harz behandelt, um Neothramycin durch das macroreticulare Harz zu adsorbieren, (b) das macroreticulare Harz, welches Neothramycin daran adsorbiert enthält, mit Wasser, welches einen Anteil Aceton enthält, oder mit verdünntem wässerigem Ammoniumhydroxid eluiert,
um eine teilweise gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin-A und/oder Neotramycin-B als eine oder mehrere Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (c) die derart erhaltene teilweise gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin mit einem stark basischen Anionenaustauscher, welcher quaternäre Ammoniumgruppen als funktionelle Anionenaustauschergruppen enthält, behandelt, um die Antibiotika an diesen Anionenaustauscher zu adsorbieren.
(d) den Anionenaustauscher, welcher Neothramycin adsorbiert enthält, mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes eluiert, um eine gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin zusammen mit dem neutralen Salz enthält, als eine oder mehrere Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (c) die derart erhaltene gereinigte wässerige Lösung von Neothramyein und dem neutralen Salz wiederum mit einer frischen Portion des macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harzes behandelt, um Neothramycin durch das macroreticulare Harz zu adsorbieren, (f) das letztgenannte macroreticulare Harz, welches Neothramycin adsorbiert enthält, mit Wasser, welches einen Anteil Aceton enthält, oder mit verdünntem, wässerigem Ammoniak eluiert, um eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin enthält,
aber kein neutrales Salz enthält, als eine oder mehrere Fraktionen des Eluates zu gewinnen, (g) die derart erhaltene entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin einer Serie von aufeinanderfolgenden Stufen unterwirft, welche eine adsorptive Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher, ausgeführt in derselben Weise wie oben, eine Eluierung des Anionenaustauschers mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes, ausgeführt wie oben, eine adsorptive Behandlung des erhaltenen, Neothramycin und neutrales Salz enthaltenden Eluates mit einer frischen Portion eines macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harzes, ausgeführt wie oben, und eine Eluierung des adsorbierten Neothramycin enthaltenden macroreticularen Harzes mit acetonhaltigem Wasser oder mit verdünntem wässerigem Ammoniak, ausgeführt wie oben, umfasst,
um eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin aber kein neutrales Salz enthält zu gewinnen, und in solcher Weise, dass die gewonnene entsalzte und weiter gereinigte Lösung von Neothramyein mit der Serie der oben genannten aufeinanderfolgenden Stufen ein oder mehrere Male behandelt wird, um eine wässerige Lösung, welche Neothramycin in der gewünschten Reinheit enthält, zu erhalten.
Nach dem in Patentanspruch 6 definierten Verfahren wird das Aceton oder das Ammoniumhydroxid durch Destillation unter vermindertem Druck aus der gereinigten wässerigen Lösung von Neothramycin von gewünschter Reinheit, welche zuletzt aus der letzten Serie der oben genannten aufeinanderfolgenden Stufen erhalten wird, entfernt und diese Lösung gefriergetrocknet.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird die entsalzte Lösung von Neothramycin, welche als eine oder mehrere Fraktionen des Eluates aus jeder Eluierung des adsorbiertes Neothramycin-haltigen macroreticularen, nichtionogenen Harzes mit dem Wasser-Aceton oder dem verdünnten wässerigen Ammoniumhydroxid gewonnen wurde, als solche der adsorptiven Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher unterworfen, doch kann sie statt dessen vorzugsweise einmal gefriergetrocknet und wieder in Wasser aufgelöst werden, bevor die durch das Wiederauflösen erhaltene wässerige Lösung der adsorptiven Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher unterworfen wird.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird zuerst eine wässerige Lösung, welche Neothramycin-A und/oder Neothramycin-B enthält, insbesondere ein Filtrat der Kulturbrühe eines Neothramycin erzeugenden Mikroorganismus, mit dem macroreticularen, nicht Ionen austauschenden Harz behandelt, so dass Neothramycin durch das Harz adsorbiert wird. Für diese Adsorptionsstufe kann das verwendete macroreticulare nicht-ionogene Harz ein Polystyrolharz umfassen, welches mit Divinylbenzol vernetzt ist.
Zum Beispiel können macroreticulare, nicht-ionogene Harze, welche aus einem Divinylbenzol-Styrol-Copolymer bestehen, wie jene, die im Handel unter der Marke Amberlite XAD-2, XAD-4 und XAD-7 (Produkte von Rohm & Haas Co., USA) oder unter der Marke Diaion HP-l0 und MP-20 (Produkte der Mitsubishi Kasei Co., Japan) erhältlich sind, verwendet werden.
Das Volumen an macroreticularen, nicht-ionogenem Harz, welches verwendet wird, kann mitVorlcil 1/5 bis 1/20 des Gesamtvolumens der rohen wässerigen Lösung von Neothramycin-A und/oder -B, welche der adsorptiven Behandlung mit diesem macroreticularen Harz unterworfen werden soll, betragen. Die Säule aus macroreticularem, nichtionogenem Harz kann derartige Dimensionen aufweisen, dass das Verhältnis vom Durchmesser zur Höhe der Säule im Bereich von 1:5 bis 1:20 liegt und vorzugsweise im Bereich von 1:10 zu 1:15 Die rohe wässerige Lösung von Neothramycin, welche der adsorptiven Behandlung mit dem macroreticularen Harz unterworfen werden soll, kann vorzugsweise ein pH von 5 bis 7 aufweisen, bei welchem Neothramycin-A und -B eine verhältnismässig gute Stabilität aufweisen können.
Das macroreticulare, nicht-ionogene Harz, an welches Neothramycin-A und -B adsorbiert sind, kann mit einem vier- bis zehnfach grösseren Volumen Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, welches 5 bis 20 Volumprozent Aceton enthält oder mit Wasser, welches 0,01 N bis 0,1 N Ammoniumhydroxid enthält, eluiert werden. Diese chromatographische Eluierung des macroreticularen Harzes mit Wasser-Aceton oder verdünnter wässerigem Ammoniumhydroxid kann vorzugsweise bei einer Temperatur von nicht höher als 10 "C durchgeführt werden, unter Berücksichtigung der Instabilität von Neothramycin. Die Säule des macroreticularen Harzes ist mit Vorteil derart, dass 0,5 bis 1 Stunde für eine Volumeinheit des Eluierungsmittels zum Durchfliessen einer gleich grossen Volumeinheit des Harzes der Säule benötigt wird.
Die oben erwähnte Eluierung des macroreticularen, nichtionogenen Harzes mit Wasser-Aceton oder wässerigem Ammoniumhydroxid kann eine teilweise gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin-A und/oder -B als eine oder mehrere Fraktionen des erhaltenen Eluates ergeben. Diese Fraktion bzw. Fraktionen des Eluates können als solche für die anschliessende Stufe der adsorptiven Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich und zu empfehlen, dass diese Fraktion(en) des Eluates einmal auf bekannte Weise gefriergetrocknet werden, worauf das erhaltene gefriergetrocknete Material wiederum in Wasser aufgelöst wird und die erhaltene wässerige Lösung der anschliessenden Stufe der adsorptiven Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher unterworfen wird.
Im erfindungsgemässen Verfahren sind die oben genannten Stufen gefolgt von der Stufe, in welcher die teilweise gereinigte Lösung von Neothramycin der adsorptiven Behandlung mit einem stark basischen Anionenaustauscher unterworfen wird, wie auch der Stufe, in welcher dieser Anionenaustauscher mit der wässerigen Lösung eines neutralen Salzes eluiert wird.
Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass Neothramycin unter alkalischen Bedingungen sehr unstabil ist, war anzunehmen, dass die Reinigung von Neothramycin stark beeinträchtigt würde, wenn Neothramycin in Berührung mit einem stark basischen Anionenaustauscher, welcher quaternäre Ammoniumgruppen (üblicherweise mit einem pKa-Wert von nicht weniger als 13) als funktionelle Anionenaustauschergruppen enthält, in Berührung gebracht wird. Überraschen- derweise wurde jedoch festgestellt, dass die Stufe, in welcher das Neothramycin durch eine Säulenchromatographie mit einem stark basischen Anionenaustauscher, welcher quaternäre Ammoniumgruppen als funktionelle Gruppen enthält, gereinigt wird, sehr erfolgreich durchgeführt werden kann, um eine konzentrierte und hoch gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin in günstiger Ausbeute zu erzielen.
Es wurde ferner gefunden, dass die Adsorption von Neothramycin durch die Säule des stark basischen Anionenaustauschers, welcher gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet wird, und die Eluierung davon äusserst wirksam ist, um die Verunreinigungen zu entfernen, welche üblicherweise das fermentativ erzeugte Neothramycin begleiten. Beispielsweise kann Cycloheximid, welches üblicherweise in der Kulturbrühe, welche das Neothramycin enthält, ebenfalls enthalten ist, vollständig durch Berührung mit dem stark basischen Anionenaustauscher zersetzt werden, infolge der hohen Basizität des Austauschers, so dass das Cycloheximid leicht vom Neothramycin während dessen Durchgang durch die Säule des Anionenaustauschers entfernt werden kann.
Ausserdem können weitere Verunreinigungen unbekannter Struktur, welche eine unerwünschte Verfärbung des Neothramycin Produktes erzeugen würden, durch die adsorptive Behandlung mit dem stark basischen Anionenaustauscher ebenfalls entfernt werden. Wahrscheinlich infolge dieser Tatsache weisen Ncothramycin-Produkte, welche durch das crfindungsge- mässe Reinigungsverfahren erhalten werden, ein wesentlich weisseres Aussehen auf.
Der stark basische Anionenaustauscher, welcher im erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden kann, umfasst ein Polystyrolharz, welches quaternäre Ammoniumgruppen -N(CH3)3+ als Anionenaustauschergruppen enthält, wie z.B.
jene Harze, welche unter der Marke Amberlite IRA-400, IRA-401 und IRA-402 (Produkte von Rohm & Haas Co., USA), unter der Marke Dowex I,21K und 11 (Produkte von Dow Chemical Co., USA) oder unter der Marke Diaion SA-IOA (Produkt von Mitsubishi Kasei Co., Japan) erhältlich sind, und ein Polystyrolharz, welches quaternäre Ammoniumgruppen -N(CH3)2(C2H4OH)+ als Anionenaustauschergruppe enthält, wie jene, die im Handel unter der Marke Amberlite lRA-410 (Produkt von Rohm & Haas Co., USA), unter der Marke Dowex 2 (Produkt von Dow Chemical Co., USA) oder unter der Marke Diaion SA-20A (Produkt von Mitsubishi Kasei Co., Japan) erhältlich sind, sowie eine Anionenaustauscherzellulose,
wie jene die im Handel unter der Bezeichnung ECTEOLA -Zellulose (Epichlorhydrintriäthanolamin-Cellulose) erhältlich ist. Im erfindungsgemässen Verfahren ist es üblicherweise zweckmässig, dass der Anionenaustauscher in seiner Hydroxid-(OH -)-Form verwendet wird. Wenn ein im Handel erhältlicher Anionenaustauscher in seiner Chlorid-(C1-)-Form erhältlich ist, kann er leicht durch Behandlung mit der 1 bis 4 molaren Menge an Alkalimetallhydroxid, z.B. Natriumhydroxid, in Wasser in die Hydroxid-(OH-)-Form umgewandelt werden.
Die Säule des Anionenaustauschers kann vorzugsweise derartige Dimensionen aufweisen, dass das Verhältnis vom Durchmesser zur Höhe der Säule im allgemeinen im Bereich von 1:2 bis 1:20 liegt. Die wässrige Lösung von Neothramycin, welche in die Säule des Anionenaustauscherharzes zur adsorptiven Behandlung eingeführt werden soll, kann Neothramycin in einer Konzentration in einem weiten Bereich enthalten, z.B. 1 mcg/ml bis 1 g/ml, damit die adsorptive Behandlung durch den Ionenaustauscher wirksam ist für die gewünschten Zwecke. Ferner weist die wässerige Lösung des Neothramycins vorzugsweise ein pH von 5 bis 7 auf bei welchem Neothramycin eine verhältnismässig gute Stabilität aufweist.
Der Ionenaustauscher, welcher Neothramycin adsorbiert enthält, wird mit dem vier- bis zehnfachen grösseren Volumen an Wasser gewaschen und anschliessend mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes, z.B. Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat, eluiert, so dass Neothramycin vom Anionenaustauscher desorbiert und in das Eluat übertragen wird. Das verwendete neutrale Salz kann ein Alkalimetallchlorid oder -sulfat sein, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat und Kaliumsulfat, doch werden Natriumchlorid und Ammoniumsulfat am meisten bevorzugt. Die verwendete wässerige Lösung eines neutralen Salzes kann das neutrale Salz in einer Konzentration von nicht über 1 M enthalten.
Die Eluierung des adsorbiertes Neothramycin enthaltenden Anionenaustauschers mit einer wässerigen Lösung eines neutralen Salzes, wie oben erwähnt, ergibt eine gereinigte wässerige Lösung, welche Neothramycin und das neutrale Salz enthält, als eine oder mehrere Fraktionen des Eluates, welche anschliessend wiederum der chromatographischen Behandlung in einer Säule aus macroreticularem, nicht-ionogenem Harz unterworfen wird, die mit Wasser-Aceton oder verdünntem wässerigem Ammoniumoxid entwickelt wird, um eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin zu erhalten.
Die oben erwähnten chromatographischen Behandlungen können vorzugsweise bei einer niederen Temperatur von nicht über 10 C durchgeführt werden, da Neothramycin bei einer höheren Temperatur ziemlich unstabil ist. Die Durchgangsgeschwindigkeit der wässerigen Lösung von Neothramycin oder dem Eluierungsmittel durch eine Säule des Anionenaustauschers oder des macroreticularen, nichtionogenen Harzes ist zweckmässig derart, dass 0,5 bis 1 Stunde zum Durchlauf eines Harzbettvolumens benötigt werden.
Wenn die entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin, welche derart aus der Säule aus macroreticularen nicht-ionogenem Harz eluiert wurde, nicht die gewünschte Reinheit des Neothramycins aufweist, wird sie wiederum einer weiteren Serie der aufeinanderfolgenden Stufen unterworfen, welche die adsorptive Behandlung mit dem Anionenaustauscher, die Eluierung des Anionenaustauschers mit der wässerigen neutralen Salzlösung, die adsorptive Behandlung des erhaltenen Eluates mit einer frischen Portion macroreticularen nicht-ionogenem Harz und die Eluierung dieses letztgenannten mycroreticularen Harzes mit Wasser-Aceton oder wässerigem Ammoniumhydroxid, ausgeführt wie oben beschrieben, umfasst, um eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung zu ergeben, welche Neothramycin jedoch kein neutrales Salz enthält.
Wenn diese letztgenannte entsalzte Lösung noch immer nicht dem gewünschten Reinheitsgrad des Neothramycins entspricht, wird es nochmals einer dritten Serie der oben genannten aufeinanderfolgenden Stufen unterworfen und dies so oft wiederholt, bis die entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin, welche aus der letzten Stufe erhalten wird, die gewünschte Reinheit des Neothramycins aufweist. Im Laufe des erfindungsgemässen Verfahrens kann der Gehalt an Neothramycin in einer wässerigen Lösung bestimmt werden durch Untersuchung der antibakteriellen Potenz der Lösung nach einer Standard-Platten-Methode (standard cup-plate method) unter Verwendung eines Stammes von Staphylococcus aureus als Testorganismus, wobei angenommen wird, dass eine reine, authentische Probe von Neothramycin-A eine Potenz von 1000 mcg/mg aufweist.
Nach dem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein reines oder annähernd reines Produkt von Neothramycin ausgehend aus einem Kulturbrühenfiltrat (mit einer Potenz von 500 bis 1000 mcg/ml) aus der Züchtung von Streptomyces MC916-C4 und durch Behandlung des Kulturbrühenfiltrates mit macroreticularem, nicht-ionogenem Harz zur Adsoption von Neothramycin, Eluierung des adsorbiertes Neothramycin enthaltenden macroreticularen Harzes mit acetonhaltigem Wasser, Behandlung des erhaltenen Eluates mit stark basischem Anionenaustauscher zur Adsorption von Neothramycin, Eluierung des adsorbiertes Neothramycin enthaltenden Anionenaustauschers mit wässeriger Lösung eines neutralen Salzes, Behandlung des erhaltenen Eluates mit einer frischen Portion macromolecularen,
nicht-ionogenem Harz zur Adsorption von Neothramycin durch dieses Harz und anschliessende Eluierung des letztgenannten macroreticularen Harzes mit acetonhaltigem Wasser in solcher Weise, dass die Serien dieser chromatographischen Stufen als erster Zyklus durchgeführt wird, und dann, falls notwendig, weitere Serien dieser chromatographischen Stufen in ein oder zwei zusätzlichen Zyklen durchgeführt werden, erhalten. Auf diese Weise kann Neothramycin in einer Gesamtausbeute von etwa 20%, berechnet auf die Gesamtpotenz von Neothramycin, die ursprünglich im verwendeten Kulturbrühenfiltrat vorhanden war, erhalten wird.
Im Verfahren der vorliegenden Erfindung wird Neothramycin in Lösung in Wasser während praktisch aller Stufen des Verfahrens verarbeitet, und die im Verfahren erforderlichen Lösungsmittel sind nur Wasser und Aceton, welche billig und leicht erhältlich sind, so dass das erfindungsgemässe Verfahren mit niederen Kosten durchgeführt werden kann.
Die Erfindung wird im folgenden durch einige Ausführungsbeispiele weiter illustriert.
Beispiel 1 (1) Ein Filtrat (10 Liter) der Kulturbrühe von Streptomyces MC916-C4 (FERM-P 2452 oder ATCC 31123), welches Neothramycin in einer Potenz von 796 mcg/ml enthielt (pH 7,13) wurde über eine Säule aus 1 Liter Diaion HP-20 (ein macroreticulares, nicht Ionen austauschendes Harz, welches aus einem Divinylbenzol-Styrol-Copolymer besteht, im Handel erhältlich von Mitsubishi Kasei Co., Japan) geleitet, so dass Neothramycin durch das Harz adsorbiert wurde. Dies Harzsäule wurde mit 7 Liter Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, welches 5 Volumprozent Aceton enthielt, eluiert. Das Eluat wurde in 120 ml-Fraktionen gesammelt und die Fraktionen No. 18 bis 120, welche Neothramycin enthielten, wurden vereint zu 11,7 Liter einer teilweise gereinigten wässerigen Lösung von Neothramycin (Potenz 404 mcg/ml, pH 6, 7). Ausbeute: 59%.
(2) Diese teilweise gereinigte Lösung von Neothramycin (5,85 Liter) wurde über eine Säule (8 mm innerer Durchmesser) aus 100 ml Amberlite IRA-401 (OH--Form) (ein stark basisches Anionenaustauscherharz bestehend aus einem Polystyrol, welches quaternäre Ammoniumgruppen -N(CH3)3 + enthält, im Handel erhältlich von Rohm & Haas Co., USA) geleitet, so dass das Neothramycin durch das Anionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Diese Harzsäule wurde sodann mit 500 ml Wasser gewaschen und mit einer wässerigen Lösung von 0,3M Natriumchlorid eluiert und das Eluat sodann in 20 ml-Fraktionen gesammelt. Diese Fraktionen enthielten keine nachweisbare Menge an Cycloheximid. Jene Fraktionen No. 8 bis 120, welche Neothramycin enthielten, wurden zu 2,16 Liter einer wässerigen Lösung vereint, welche Neothramycin und Natriumchlorid enthielt. (pH 9,6, Potenz 904 mcg/ml).
Ausbeute: 82%.
(3) Diese wässerige Lösung von Neothramycin wurde durch Zusatz von wässeriger 10%aber Schwefelsäure auf pH 6,1 gebracht und anschliessend über eine Säule aus 100 ml Diaion HP-20 geleitet zur Adsorption der Antibiotika durch dieses macroreticulare nicht-ionogene Harz. Die Harzsäule wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, welches 15 Volumprozent Aceton enthielt, zum Entsalzen eluiert. Das Eluat wurde in 20 ml -Fraktionen gesammelt und die Fraktionen No. 6 bis 19 zu einer entsalzten wässerigen Lösung Neothramycin vereint. Diese entsalzte Lösung wurde unter 30 "C unter vermindertem Druck destilliert, um das Aceton zu entfernen, und anschliessend gefriergetrocknet, wobei 2,16 g eines rohen Pulvers von Neothramycin (Potenz 606 mcg/mg) erhalten wurden. Ausbeute: 68%.
(4) 2 g des rohen Pulvers von Neothramycin (Potenz 609 mcg/mg), erhalten wie oben beschrieben, wurden in 20 ml Wasser aufgenommen und die wässerige Lösung über eine Säule (8 mm innerer Durchmesser) auf 100 ml Amberlite IRA-401 (OH--Form) geleitet, so dass Neothramycin von diesem stark basischen Anionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Diese Harzsäule wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit einer wässerigen Lösung von 0,3M Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde in 18 ml-Fraktionen gesammelt.
Von jeder Fraktion wurde eine Probe ent nommen, welche mittels Silicagel-Dünnschichtchromatogra- phie (unter Verwendung von Athylacetat-Wasser (50:1 Volumverhältnis) als Entwicklungslösungsmittel und Feststellung eines Neothramycin-Flecks bei oder nahe bei Rf 0,2 un ter Färbung mit gasförmigem Jod) analysiert, um festzustel len, ob die analysierte Fraktion Neothramycin enthielt. Die Fraktionen No. 13 bis 60, welche Neothramycin und Natriumchlorid enthielten, wurden vereint und die vereinte Lösung wurde durch Zusatz von 2N wässeriger Schwefelsäure auf pH 7,0 eingestellt.
Diese neutralisierte gereinigte Lösung von Neothramycin wurde sodann über eine Säule aus 30 ml Diaion HP-20 geleitet zur Adsorption der Antibiotika, und diese Säule aus macroreticularem Harz wurde mit 150 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, welches 10 Volumprozent Aceton enthielt, zur Entsalzung eluiert, wobei das Eluat in 16 ml-Fraktionen gesammelt wurde. Die Fraktionen No. 2 bis 11 wurden vereint und ergaben eine entsalzte und weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin.
(5) Diese entsalzte Lösung wurde bei einer Temperatur unterhalb 30 "C unter vermindertem Druck destilliert, um das Aceton zu entfernen, und die erhaltene konzentrierte Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab 0,73 g eines gereinigten Pulvers von praktisch reinem Neothramycin-Produkt (Potenz 910 mcg/mg). Ausbeute: 55%. Die Gesamtausbeute an Neothramycin betrug 18%, berechnet auf die Gesamtmenge an Neothramycin, welche ursprünglich im verwendeten Kulturbrühenfiltrat vorhanden war.
Beispiel 2
Ein rohes Pulver (2 g), welches Neothramycin (Potenz 850 mcg/mg) enthielt und auf ähnliche Weise wie in den Schritten (1) bis (3) von Beispiel 1 beschrieben erhalten worden war, wurde in 20 ml Wasser gelöst und die erhaltene wässerige Lösung über eine Säule (8 mm innerer Durchmesser) auf 100 ml Amberlite IRA-401 (OH--Form) zur Adsorption der Antibiotika durch dieses Anionenaustauscherharz geleitet. Die Harzsäule wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit einer wässerigen Lösung von 0,3M Natriumchlorid eluiert.
Das Eluat wurde in 18 ml -Fraktionen gesammelt, von jeder dieser Fraktionen eine Probe entnommen, welche sodann durch Silicagel-Dünnschichtchromatographie analysiert wurde, unter Verwendung von Äthylacetat-Wasser (50:1 Volumverhältnis) als Entwicklungslösungsmittel und Feststellung eines Neothramycin-Flecks bei oder nahe bei Rf 0,2 unter Färbung mittels gasförmigem Jod, um festzustellen, ob die analysierte Fraktion Neothramycin enthielt. Die Fraktionen No. 13 bis 60 des Eluates, welche Neothramycin enthielten, wurden vereint und ergaben eine weiter gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin, welche sodann durch Zusatz von wässeriger 2N Schwefelsäure auf pH 7,0 eingestellt wurde.
Diese neutrale gereinigte Lösung von Neothramycin wurde der adsorptiven Behandlung mit einer Säule aus 30 ml Diaion HP-20 unterworfen, welche anschliessend mit 150 ml Wasser gewaschen und mit Wasser, welches 10 Volumenprozent Aceton enthielt, zum Entsalzen eluiert. Das Eluat aus der Diaion HP-20 -Säule wurde in 16 ml -Fraktionen gesammelt und die Fraktionen No. 2 bis 11 wurden vereint, um eine entsalzte und weiter gereinigte Lösung von Neothramycin zu ergeben. Diese entsalzte Lösung wurde bei einer Temperatur unterhalb 30 C unter vermindertem Druck destilliert, um das Aceton zu entfernen, und die konzentrierte Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 0,73 g eines reinen Pulvers von Neothramycin (Potenz 1000 mcg/mg) erhalten wurden. Ausbeute: 43%.
Beispiel 3
Ein rohes Pulver (2 g) von Neothramycin (Potenz 580 mcg/mg), welches durch ähnliche Verfahrensschritte wie die Stufen (1) bis (3) aus Beispiel 1 erhalten worden war, wurde in 20 ml Wasser gelöst. Die erhaltene wässerige Lösung wurde über eine Säule (8 mm innerer Durchmesser) aus
100 ml Amberlite IRA-410 (OH--Form) geleitet, so dass Neothramycin durch das Anionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Diese Harzsäule wurde mit 500 ml Wasser gewaschen und dann mit einer wässerigen Lösung von 0,5N Ammoni umsulfat eluiert und das Eluat in 18 ml -Fraktionen gesammelt.
Jede Fraktion wurde mit Hilfe einer Silicagel-Dünnschichtchromatographie wie in Beispiel 2 beschrieben analysiert, und jene Fraktionen No. 9 bis 96 des Eluates, welche Neothramycin enthielten, wurden vereint, um eine weitere gereinigte wässerige Lösung von Neothramycin zu ergeben, welche anschliessend durch Zusatz von wässeriger 2N Schwefelsäure auf pH 7,0 eingestellt wurde. Diese neutralisierte, gereinigte Lösung von Neothramycin wurde der adsorptiven Behandlung mit einer Säule von 30 ml Diaion Hp-20 unterworfen, welche sodann mit 50 ml Wasser gewaschen und mit Wasser, welches 10 Volumprozent Aceton enthielt, zur Entsalzung eluiert wurde.
Diejenigen Fraktionen des Eluates, welches Neothramycin enthielten, wurden vereint, um eine entsalzte und weiter gereinigte Lösung von Neothramycin im Wasser-Aceton zu ergeben, die bei einer Temperatur von unter 30 "C unter vermindertem Druck destilliert wurde, um das Aceton zu entfernen. Die konzentrierte Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab 0,35 g eines gereinigten Pulvers eines praktisch reinen Neothramycin-Produktes (Potenz 945 mcg/mg). Ausbeute: 28%.
Beispiel 4
Ein Filtrat (1 Liter) der Kulturbrühe von Streptomyces MC916-C4, welche Neothramycin in einer Potenz von 950 mcg/ml (pH 7,1) enthielt, wurde auf dieselbe Weise wie in den Stufen (1) bis (3) von Beispiel 1 verarbeitet, um ein rohes Pulver von Neothramycin mit einer Potenz von 850 mcg/mg zu ergeben. Dieses rohe Pulver (500 mg) wurde in 3 ml Wasser gelöst und die erhaltene wässerige Lösung über eine Säule (13 mm innerer Durchmesser) aus 20 ml Dowex 1 -X2 (OH--Form) (ein stark basisches Anionenaustauscherharz bestehend aus einem Polystyrol, welches quaternäre Ammoniumgruppen enthält, im Handel erhältlich von Dow Chemical Co., USA) gleitet, so dass Neothramycin durch das Anionenaustauscherharz adsorbiert wurde.
Diese Harzsäule wurde mit 100 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit einer wässerigen Lösung von 0,125M Natriumchlorid eluiert, wobei das Eluat in 8 ml -Fraktionen gesammelt wurde. Jede dieser Fraktionen wurden durch eine Silicagel-Dünnschichtchromatographie auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 untersucht und jene Fraktionen No. 9 bis 23 des Eluates, welche Neothramycin enthielten, wurden vereint und ergaben eine gereinigte Lösung, welche Neothramycin und Natriumchlorid enthielt. Diese Lösung wurde durch Zusatz einer wässerigen 10%gen Schwefelsäure auf pH 6,0 eingestellt und anschliessend der adsorptiven Behandlung mit einer Säule von 15 ml Diaion HP-20 unterworfen. Dieses macroreticulare Harz wurde mit 100 ml Wasser gewaschen und anschliessend mit Wasser, welches 50 Volumprozent Aceton enthielt, zur Entsalzung eluiert.
Die Fraktionen des Eluates, welche Neothramycin enthielten, wurden vereint und ergaben eine entsalzte und weiter gereinigte Lösung von Neothramycin, welche sodann bei einer Temperatur unterhalb 30 "C unter vermindertem Druck destilliert wurde, um das Aceton zu entfernen. Die konzentrierte Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab 220 mg eines gereinigten Pulvers von praktisch reinem Neothramycin-Produkt (Potenz 900 mcg/mg). Ausbeute: 47%. Die Gesamtausbeute des Neothramycins betrug 21%, berechnet auf die totale Potenz an Neothramycin, welche im verwendeten ursprünglichen Kulturbrühenfiltrat vorhanden war.
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PATENT CLAIMS
1. Process for the purification of neothramycin-A and / or neothramycin-B of the formula I:
EMI1.1
in which Rl represents a hydroxyl group and R2 represents a hydrogen atom for neothramycin-A, while R 'represents a hydrogen atom and R2 represents a hydroxyl group for neothramycin-B, the neothramycin in solution being treated exclusively in water, characterized in that (a) a crude aqueous solution containing neothramycin-A and / or neothramycin-B treated with a macroreticular, non-ion exchange resin to adsorb the neothramycin through the macroreticular resin, (b) the macroreticular resin to which the neothramycin is adsorbed, eluted with water containing acetone or with dilute aqueous ammonium hydroxide,
In order to obtain a partially purified aqueous solution of neothramycin-A and / or neothramycin-B as a fraction or some fractions of the eluate, (c) the partially purified aqueous solution of neothramycin thus obtained with a strongly basic ion exchange resin, which quaternary ammonium groups as functional Anion exchange groups, treated to adsorb the antibiotics through this anion exchanger, (c) eluting the anion exchanger to which the neothramycin is adsorbed with an aqueous solution of a neutral salt to a purified aqueous solution containing neothramycin together with the neutral salt , as a fraction or more fractions of the eluate, (d) the purified aqueous solution of neothramycin and the neutral salt thus obtained in turn with a fresh portion of the macroreticular,
non-ion exchange resin treated to adsorb neothramycin through the macroreticular resin, (f) the latter macroreticular resin containing neothramycin adsorbed, eluted with water containing acetone, or with dilute aqueous ammonium hydroxide to desalted and further purified to obtain an aqueous solution, which contains neothramycin but no neutral salt, as a fraction or more fractions of the eluate, (g) desalted the solution thus obtained and treated further purified aqueous solution of neothramycin in a series of successive stages, which an adsorptive treatment with the strongly basic anion exchanger in the same manner as mentioned above, elution of this anion exchanger with an aqueous solution of a neutral salt in the same way as mentioned above,
an adsorptive treatment of the obtained eluate, which contains neothramycin as a neutral salt, with a fresh portion of a macroreticular, non-ion exchange resin in the same manner as above, and an elution of the latter adsorbed neothramycin-containing macroreticular resin with water, which contains acetone , or with dilute aqueous ammonium hydroxide in order to obtain a desalted and further purified aqueous solution which contains neothramycin but no neutral salt, in such a way that the desalted and further purified solution of neothramycin of the series mentioned above comprises one or more steps is subjected to several times in order to obtain an aqueous solution which contains neothramycin in the desired purity.
2. The method according to claim 1, characterized in that the strongly basic anion exchanger used is a polystyrene resin which contains quaternary ammonium groups as functional anion exchanger groups.
3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the aqueous solution of a neutral salt used for eluting the anion exchanger which contains neothramycin adsorbed is an aqueous solution of sodium chloride or ammonium sulfate;
4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the macroreticular non-ion-exchange resin used is a macroreticular divinylbenzene-styrene copolymer.
5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the acetone-containing water used with an acetone content of 5 to 50 volume percent for the elution of the macroreticular, non-ion-exchanging resin which contains neothramycin adsorbed.
6. A process for the purification of neothramycin-A and / or neothramycin-B of the formula I according to claim 1, characterized in that an aqueous solution which contains neothramycin is purified by the process according to claim 1, the acetone or the ammonium hydroxide by distillation removed under reduced pressure from the purified aqueous solution of neothramycins obtained and the solution then freeze-dried.
The present invention relates to a process for the purification of neothramycin-A and / or neothramy cin-B, the neothramycin in solution being treated exclusively with water. The method is in claim
1 defined. In particular, the present invention relates to a method for purifying the antibiotics neothramycin-A and / or neothramycin-B in the form of an aqueous solution, with increased yield, by a chromatographic method which involves adsorbing neothramycin-A and / or neothramycin-B on a strongly basic anion exchanger, in particular a strongly basic anion exchanger which contains quaternary ammonium groups as functional anion exchanger groups, from an aqueous solution which contains the antibiotics, followed by elution of the anion exchanger which contains the antibiotics adsorbed,
with an aqueous solution of a neutral salt.
The neothramycin-A and neothramycin-B to be purified according to the present invention are new antibiotics which were previously discovered by the same inventors and which were produced by culturing a microorganism, namely the strain Streptomyces MC916-C4, which strain in the Fermentation Research Institute in Japan under No. FERM-P 2352 and also in American
Type Culture Collection under the No. ATCC 31123 behind. is. The neuthramycins A and B have only a weak antibacterial activity but have a high inhibitory effect on the growth of experimental tumors that have been transplanted in animals, so that they are investigated in clinics as anti-tumor agents (see Japanese patent Nor 1 009 206 and 1 019 568; Journal of
Antibiotics, volume 29, page 93 (1976) and volume 30, page 340 (1977); and U.S. Patents No. 049 497 and 4 105 658).
The inventors of the present invention confirmed that neothramycin A and B have the following structure:
EMI2.1
in which R1 represents a hydroxyl group and R2 represents a hydrogen atom for neothramycin-A, while R 'represents a hydrogen atom and R2 represents a hydroxyl group for neothramycin-B. As such, neothramycins A and B can be isolated from each other under anhydrous conditions.
In aqueous solutions, however, the neothramycins A and B can spontaneously merge into one another, an equilibrium mixture of the neothramycins A and B being formed. Since the neothramycins A and -B are handled in their aqueous solutions according to the present invention, the equilibrium mixture of the neothramycins A and -B is simply referred to as neothramycin in the following.
As detailed in Japanese Patent No.
1 009 206 and No. 1 019 568 and US Pat.
4 049 497 and No. 4 105 658, neothramycin, as generated by the fermentative method, was usually obtained either by extraction with butanol from an aqueous solution of neothramycin, e.g. the fermentation broth of the neothramycin-producing microorganism, or by treating an aqueous solution of neothramycin with activated carbon to adsorb the antibiotics. According to the adsorption method using activated carbon, it is generally possible to extract the neothramycin adsorbed on the activated carbon from the coal using a mixed solvent of methanol-water, propanol-water or acetone-water and the like.
It was most convenient to use a recovery method which involved extracting the activated carbon containing the neothramycin adsorbed with 50% acetone water, i.e. Water containing 50 volume percent acetone, concentrating the acetone-water extract obtained under reduced pressure at a temperature not higher than 40 ° C, freeze-drying the concentrated solution to obtain a first crude powder which contains neothramycin-A and -B contained as the first serving.
For cleaning, the above first raw powder was washed with 80% ethanol water, i.e. Water containing 80 volume percent ethanol was extracted, the extract obtained was concentrated under reduced pressure at a temperature not exceeding 40 ° C. and the concentrated solution was freeze-dried to give a second raw powder. This second raw powder was then dissolved in methanol and the methanolic solution is passed through a column of a gel filtration agent, Sephadex LH-20 (a product of Pharmacia Fine Chemical Co., Sweden), followed by developing the column with methanol so that neothramycin is separated from the coexisting other antibiotics such as cycloheximide has been.
Those fractions of the eluate containing neothramycin A and B were then evaporated to dryness under reduced pressure to give a third crude powder.
This third crude powder was taken up in methanol and the methanolic solution was chromatographed on a column of neutral silica gel and developed with chloroform-ethanol so that those fractions of the eluate which contained neothramycin-A alone are obtained separately from those fractions of the eluate which contained neothramycin B alone. For the further purification of neothramycin-A and -B, the fractions with neothramycin-A and the fractions with neothramycin-B were subjected to a chromatographic method by passing them over a column of neutral silica gel and then developing the column with chloroform-ethanol has been.
The eluate thus obtained was then concentrated under reduced pressure at a temperature and not above 40 "C to give a partially purified powder of Neothramycin-A or -B. When the above-mentioned methods are used for the recovery and purification of the Neothramycins, some additional steps are required, namely dissolving the above-mentioned partially purified powder of neothramaycin-A or -B in chloroform, mixing the chloroform solution with ethyl ether to precipitate the neothramycin, dissolving the latter in ethanol, chromatographing on a column made of neutral silica gel, which is developed with aqueous ethyl acetate,
and concentrating the obtained eluate under reduced pressure at a temperature not exceeding 40 "C. to obtain a completely pure powder of neothramycin-A or -B.
As described above, the fraction containing the neothramycin-A alone and the fraction containing the neothramycin-B alone, which fractions were obtained separately, can be further purified by separate routes. However, when both the neothramycin-A fraction and the neothramycin-B fraction are mixed together and the mixture is then subjected to a purification method which includes the above-mentioned sequential chromatographic methods, it is possible to use a mixture of pure neothramycin A and pure neothramycin -B get.
On the other hand, when the above-mentioned method for extracting a crude aqueous solution of the neothramycins-A and -B with butanol solvent was used, it was necessary to concentrate the butanol extract under reduced pressure at a temperature not higher than 40 "C so that a brownish one syrup-like raw material containing the neothramycins was obtained as the first portion (see, for example, Example 7 from US Pat. No. 4,049,497).
For further purification, it was necessary to subsequently treat the syrup-like raw material obtained through a number of successive stages similar to those estimated for the purification of the first raw powder obtained by the above-mentioned method of treating the fermentation broth with activated carbon.
Thus, when either the activated carbon adsorption method or the butanol extraction method is used for the recovery and purification of neothramycin, it is necessary that the steps of developing a column of neutral silica gel to which neothramycin has been adsorbed are used with an organic solvent system, e.g. Chloroform-methanol or chloroform-ethanol, and the subsequent separation of the antibiotic from the organic solvent used for development should be repeated several times in the course of the cleaning process, and further that the separation of neothramycin from the organic solvent, the concentration of the organic solution under reduced pressure at a temperature of above 40 "C is required to remove the organic solvent.
Among these process steps, which are necessary in purification processes, the elution of neothramycin from the column of neutral silica gel, which is developed with the organic solvent, usually forms a stage of very low efficiency, and in addition the concentration of the organic solution of neothramycin usually has some difficulties under reduced pressure and is low in efficiency.
Furthermore, the neothramycin must be subjected to a more or less elevated temperature during the concentration of the organic neothramycin solution under reduced pressure, so that decomposition of the neothramycin can inevitably take place to a certain extent, apart from the fact that neothramycin is considered to be unstable and at over Room temperature is known to be easily decomposable.
Furthermore, in order to free neothramycin from other coexisting antibiotic by-products such as cycloheximide, it is necessary to take up the crude neothramycins A and B in methanol and to chromatograph the methanolic solution on a column of a Sephadex gel filter medium which is developed with methanol . In principle, however, it is not preferred that neothramycin-A or -B be contacted with a lower alkanol such as methanol and ethanol because the neothramycins-A and -B each have the nature of their corresponding 3-0-alkylated Derivative such as the 3-O-methyl derivative or 3-O-ethyl derivative to be converted when they come into contact with a lower alkanol.
For these reasons, the methods for obtaining and purifying fermentatively produced neothramycins-A and -B, which were previously developed by the inventors of the present invention, are not free from disadvantages in that they involve difficult operations and are not highly efficient and are therefore unsuitable are for execution on a technical scale. As long as the previously known methods were therefore used, the total yield of pure end product from neothramycin was 3% or less, calculated on the total potency of the neothramycin which is originally present in the broth filtrate of the neothramycin-producing microorganisms.
For this reason, the inventors of the present invention have recently developed another method for purifying neothramycin, which comprises chromatographing a crude aqueous solution of neothramycin over a column of macroreticular resin, which has no ion exchange ability, and with which a concentrated solution, which is neothramycin contains of high purity, can be obtained in favorable yield, as described in the description of published Japanese patent application Kokai No. Sho 53-38695 (Japanese Patent Application No. 1 L0723 / 76).
According to this chromatographic method using a macroreticular, non-ion exchange resin column, a crude aqueous solution of neothramycin is passed over a column of a macroreticular, non-ion exchange, adsorbent resin, such as a macroreticular resin, made from a divinyl-benzo-styrene copolymer. e.g.
Commercial products known as Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7 and the like (commercial products from Rohm & BR <Haas Co. , USA), and Diaison HP-10, HP-20, HP-40 and the like (commercial products from Mitsubishi Kasei Co. , Japan), so that the neothramycin is adsorbed by the resin. The neothramycin so adsorbed is then eluted from the resin column by developing with water containing 5 to 20 volume percent acetone, with water having a methanol content of 30 to 50 volume percent, or with water containing 0.01N to 0.1N ammonium hydroxide. The resulting eluate is then freeze-dried to give a crude powder containing neothramycin.
This chromatographic method with the macroreticular, non-ion exchange resin has a higher efficiency compared to the previous adsorption method with activated carbon and the earlier extraction method with butanol, since it is carried out in a single step. However, a completely pure product of neothramycin-A or -B cannot be obtained by the chromatographic method using the macroreticular non-ion-exchanging resin, even if the successive stages of adsorption of neothramycin by the macroreticular resin, elution of the resin with acetone- Water or the like and the subsequent freeze-drying of the eluate obtained are repeated five or more times. In addition, it is then quite difficult to keep the neothramycin product completely free of an accompanying trace of cycloheximide.
Under these circumstances, there was a need for a simpler and more effective method of purifying neothramycin as obtained from the fermentative process. Extensive research has been done to obtain a new neothramycin purification process that completely eliminates the need for steps such as concentrating an organic solution of crude neothramycin under reduced pressure with more or less decomposition of neothramycin at an elevated temperature in which it is further superfluous to use an alkanol, such as methanol and ethanol, as organic solvent, which can convert the neothramycin into corresponding 3-O-alkylated derivatives when they are brought into contact with one another, in which it is also not is required,
to introduce an additional step for the removal of coexisting cycloheximide by-product and in which there is no step in which an aqueous solution of neothramycin has to be kept under acidic conditions which are capable of decomposing the neothramycin. It should not be overlooked that since the discovery of neothramycin A and B, neothramycins have been known to be stable in the form of anhydrous powder but somewhat unstable in the form of a solution. In particular, it was known that when neothramycin A and B are dissolved in 50% aqueous ethanol, the antibacterial activities in such solutions at pH 2.5 to 25 and
22% can be reduced over 16 hours at room temperature and that if a solution of neothramycin-A or -B in 50% aqueous ethanol is stored at pH 6.5 or pH 8.0 at room temperature, neothramycin-A in an equilibrium mixture of neothramycin-A and -B can be converted, while neothramycin-B can also be converted into an equilibrium mixture of neothramycin-A and -B.
Additional studies have further shown that aqueous solutions of neothramycin-A or -B are generally unstable under conditions other than neutral, that the residual activity of an aqueous solution of neothramycin-A or -B is found at pH 3, pH 7 and pH 12 51.7%, or 85.7% and 46.4% of the original activity can be reduced if the solution is kept at 25 "C for 2 days, and that the remaining activity of an aqueous solution of Neothramycin-A or -B at pH 12 to only 9 , 9% of the original activity may drop if the solution is kept at 35 "C for 2 days. It was therefore considered necessary that aqueous solutions of neothramycin be kept under neutral conditions throughout the cleaning process.
A number of studies have been conducted and it has now been unexpectedly found that when an aqueous solution containing neothramycin-A and / or neothramycin-B is brought into contact with a strongly basic anion exchange resin containing quaternary ammonium groups as functional ion exchange groups adsorb the neothramycin on the strongly basic anion exchanger, followed by the development of the anion exchanger with an aqueous solution of a neutral salt, such as. B. Sodium chloride, in order to elute neothramycin from the ion exchanger, not only can the neothra mycin be largely protected from decomposition, but the neothramycin can also be introduced into the eluate with high purity and in a high concentration.
It was also surprisingly found that no trace of coexisting cycloheximide can be found in the eluate containing neothramycin, very likely because cycloheximide was completely decomposed and removed after contact with the strongly basic anion exchanger.
As a result, the new method has now been developed which enables the purification of crude neothramycin-A and / or neothramycin-B with high efficiency by using the above-mentioned chromatographic method for purifying crude neothramycin with a macroreticular, non-ion exchange resin together with one new method is used in which an aqueous solution containing the neotramycin-A and / or neothramycin-B is treated with a strongly basic anion exchanger, which contains quaternary ammonium groups, for the adsorption of neothramycin by this anion exchanger, and in which of these anion exchangers after the neothramycin is adsorbed thereon with an aqueous solution of a neutral salt, e.g. B. Sodium chloride, eluting to give a purified aqueous solution of neothramycin-A and / or neothramycin-B.
According to the present invention, the process for the purification of neothramycin-A and / or neothramycin-B of formula 1, in which the neothramycin is treated exclusively in aqueous solution, is characterized in that (a) a crude aqueous solution, which is neothramycin -A and / or neothramycin-B, especially a culture broth filtrate containing neothramycin-A and / or neothramycin-B, treated with a macroreticular, non-ion exchange resin to adsorb neothramycin through the macroreticular resin, (b) the macroreticular Resin which contains neothramycin adsorbed thereon, eluted with water which contains a portion of acetone or with dilute aqueous ammonium hydroxide,
in order to obtain a partially purified aqueous solution of neothramycin-A and / or neotramycin-B as one or more fractions of the eluate, (c) the partially purified aqueous solution of neothramycin thus obtained with a strongly basic anion exchanger which uses quaternary ammonium groups as functional anion exchanger groups contains, treated to adsorb the antibiotics on this anion exchanger.
(d) eluting the anion exchanger containing neothramycin adsorbed with an aqueous solution of a neutral salt to obtain a purified aqueous solution containing neothramycin together with the neutral salt as one or more fractions of the eluate, (c) such obtained purified aqueous solution of neothramyein and the neutral salt in turn treated with a fresh portion of the macroreticular, non-ion-exchange resin to adsorb neothramycin through the macroreticular resin, (f) the latter macroreticular resin containing neothramycin adsorbed with water, which contains a portion of acetone, or eluted with dilute aqueous ammonia to give a desalted and further purified aqueous solution containing neothramycin,
but containing no neutral salt as one or more fractions of the eluate, (g) subjecting the thus obtained desalted and further purified aqueous solution of neothramycin to a series of successive stages which carry out an adsorptive treatment with the strongly basic anion exchanger carried out in the same As above, elution of the anion exchanger with an aqueous solution of a neutral salt carried out as above, an adsorptive treatment of the resulting neothramycin and neutral salt-containing eluate with a fresh portion of a macroreticular, non-ion exchange resin, carried out as above, and one Elution of the adsorbed neothramycin-containing macroreticular resin with acetone-containing water or with dilute aqueous ammonia, carried out as above,
to obtain a desalted and further purified aqueous solution containing neothramycin but no neutral salt, and such that the desalted and further purified solution of neothramyein obtained is treated with the series of the above-mentioned successive steps one or more times to obtain an aqueous solution which contains neothramycin in the desired purity.
According to the method defined in claim 6, the acetone or ammonium hydroxide is removed by distillation under reduced pressure from the purified aqueous solution of neothramycin of desired purity, which is last obtained from the last series of the above-mentioned successive steps, and this solution is freeze-dried.
In the process according to the invention, the desalted solution of neothramycin, which was obtained as one or more fractions of the eluate from each elution of the adsorbed neothramycin-containing macroreticular, nonionic resin with the water-acetone or the dilute aqueous ammonium hydroxide, as such the adsorptive treatment with the strongly basic anion exchanger, but instead it may preferably be freeze-dried once and redissolved in water before the aqueous solution obtained by redissolving is subjected to the adsorptive treatment with the strongly basic anion exchanger.
When carrying out the process according to the invention, an aqueous solution which contains neothramycin-A and / or neothramycin-B, in particular a filtrate of the culture broth of a neothramycin-producing microorganism, is first treated with the macroreticular, non-ion-exchanging resin, so that neothramycin is treated by the resin is adsorbed. For this adsorption stage, the macroreticular non-ionogenic resin used can comprise a polystyrene resin which is crosslinked with divinylbenzene.
For example, macroreticular, non-ionic resins consisting of a divinylbenzene-styrene copolymer, such as those commercially available under the trademark Amberlite XAD-2, XAD-4 and XAD-7 (products from Rohm & Haas Co. , USA) or under the trademark Diaion HP-l0 and MP-20 (products of Mitsubishi Kasei Co. , Japan) are available.
The volume of macroreticular non-ionic resin used can be 1/5 to 1/20 of the total volume of the crude aqueous solution of neothramycin-A and / or -B to be subjected to adsorptive treatment with this macroreticular resin , amount. The column of macroreticular, nonionic resin can have dimensions such that the ratio of the diameter to the height of the column is in the range from 1: 5 to 1:20 and preferably in the range from 1:10 to 1:15. The crude aqueous solution of neothramycin , which is to be subjected to the adsorptive treatment with the macroreticular resin, can preferably have a pH of 5 to 7, at which neothramycin-A and -B can have a relatively good stability.
The macroreticular, non-ionic resin to which neothramycin A and -B are adsorbed can be washed with a four to ten times larger volume of water and then with water which contains 5 to 20 percent by volume acetone or with water that contains 0.01 Containing N to 0.1 N ammonium hydroxide can be eluted. This chromatographic elution of the macroreticular resin with water acetone or dilute aqueous ammonium hydroxide can preferably be carried out at a temperature of not higher than 10 ° C., taking into account the instability of neothramycin. The column of the macroreticular resin is advantageously such that 0.5 to 1 hour is needed for one volume unit of the eluent to flow through an equal volume unit of the resin of the column.
Elution of the macroreticular nonionic resin with water acetone or aqueous ammonium hydroxide mentioned above can result in a partially purified aqueous solution of neothramycin-A and / or -B as one or more fractions of the eluate obtained. This fraction or Fractions of the eluate can be used as such for the subsequent stage of the adsorptive treatment with the strongly basic anion exchanger. However, it is also possible and recommended that these fraction (s) of the eluate are once freeze-dried in a known manner, whereupon the freeze-dried material obtained is in turn dissolved in water and the aqueous solution obtained in the subsequent stage of the adsorptive treatment with the strongly basic anion exchanger is subjected.
In the process according to the invention, the above-mentioned steps are followed by the step in which the partially purified solution of neothramycin is subjected to the adsorptive treatment with a strongly basic anion exchanger, and also the step in which this anion exchanger is eluted with the aqueous solution of a neutral salt .
Taking into account the fact that neothramycin is very unstable under alkaline conditions, it could be assumed that the purification of neothramycin would be greatly impaired if neothramycin came into contact with a strongly basic anion exchanger which had quaternary ammonium groups (usually with a pKa value of not less than 13) contains functional anion exchange groups, is brought into contact. Surprisingly, however, it was found that the step in which the neothramycin is purified by column chromatography with a strongly basic anion exchanger which contains quaternary ammonium groups as functional groups can be carried out very successfully in order to obtain a concentrated and highly purified aqueous solution of To achieve neothramycin in favorable yield.
It has also been found that the adsorption of neothramycin by the column of the strongly basic anion exchanger used in accordance with the present invention and the elution thereof is extremely effective in removing the contaminants which usually accompany the fermentatively produced neothramycin. For example, cycloheximide, which is usually also contained in the culture broth containing the neothramycin, can be completely decomposed by contact with the strongly basic anion exchanger, due to the high basicity of the exchanger, so that the cycloheximide is easily released from the neothramycin during its passage through the column of the anion exchanger can be removed.
In addition, further impurities of unknown structure, which would produce an undesirable discoloration of the neothramycin product, can also be removed by the adsorptive treatment with the strongly basic anion exchanger. Probably as a result of this fact, ncothramycin products obtained by the cleaning process according to the invention have a substantially whiter appearance.
The strongly basic anion exchanger which can be used in the process according to the invention comprises a polystyrene resin which contains quaternary ammonium groups -N (CH3) 3+ as anion exchanger groups, such as, for. B.
those resins sold under the trademark Amberlite IRA-400, IRA-401 and IRA-402 (products from Rohm & Haas Co. , USA), under the trademark Dowex I, 21K and 11 (products from Dow Chemical Co. , USA) or under the Diaion SA-IOA brand (product of Mitsubishi Kasei Co. , Japan), and a polystyrene resin containing quaternary ammonium groups -N (CH3) 2 (C2H4OH) + as an anion exchange group, such as those commercially available under the trademark Amberlite IRA-410 (product of Rohm & Haas Co. , USA), under the Dowex 2 brand (product of Dow Chemical Co. , USA) or under the brand Diaion SA-20A (product of Mitsubishi Kasei Co. , Japan) are available, as well as an anion exchange cellulose,
such as that which is commercially available under the name ECTEOLA cellulose (epichlorohydrin triethanolamine cellulose). In the process according to the invention, it is usually expedient for the anion exchanger to be used in its hydroxide (OH -) form. If a commercially available anion exchanger is available in its chloride (C1 -) form, it can easily be treated with the 1 to 4 molar amount of alkali metal hydroxide, e.g. B. Sodium hydroxide, can be converted into the hydroxide (OH -) form in water.
The column of the anion exchanger can preferably have dimensions such that the ratio of the diameter to the height of the column is generally in the range from 1: 2 to 1:20. The aqueous solution of neothramycin to be introduced into the column of the anion exchange resin for adsorptive treatment can contain neothramycin in a concentration in a wide range, e.g. B. 1 mcg / ml to 1 g / ml, so that the adsorptive treatment by the ion exchanger is effective for the desired purposes. Furthermore, the aqueous solution of the neothramycin preferably has a pH of 5 to 7 at which neothramycin has a relatively good stability.
The ion exchanger, which contains neothramycin adsorbed, is washed with four to ten times the larger volume of water and then with an aqueous solution of a neutral salt, e.g. B. Sodium chloride or ammonium sulfate, eluted so that neothramycin is desorbed from the anion exchanger and transferred into the eluate. The neutral salt used can be an alkali metal chloride or sulfate such as sodium chloride, potassium chloride, sodium sulfate and potassium sulfate, but sodium chloride and ammonium sulfate are most preferred. The neutral salt aqueous solution used may contain the neutral salt in a concentration of not more than 1M.
Elution of the adsorbed neothramycin-containing anion exchanger with an aqueous solution of a neutral salt, as mentioned above, gives a purified aqueous solution, which contains neothramycin and the neutral salt, as one or more fractions of the eluate, which in turn are then subjected to chromatographic treatment in a column from macroreticular, non-ionic resin which is developed with water acetone or dilute aqueous ammonium oxide to obtain a desalted and further purified aqueous solution of neothramycin.
The chromatographic treatments mentioned above can preferably be carried out at a lower temperature not higher than 10 C, since neothramycin is quite unstable at a higher temperature. The rate of passage of the aqueous solution of neothramycin or the eluent through a column of the anion exchanger or of the macroreticular, nonionic resin is expediently such that 0.5 to 1 hour is required to pass through a resin bed volume.
If the desalted and further purified aqueous solution of neothramycin, which has been eluted from the column of macroreticular non-ionic resin in this way, does not have the desired purity of the neothramycin, it is again subjected to a further series of successive steps which involve the adsorptive treatment with the Anion exchanger, the elution of the anion exchanger with the aqueous neutral salt solution, the adsorptive treatment of the eluate obtained with a fresh portion of macroreticular non-ionic resin and the elution of this latter mycroreticular resin with water-acetone or aqueous ammonium hydroxide, carried out as described above to give a desalted and further purified aqueous solution, which neothramycin does not contain a neutral salt.
If this latter desalted solution still does not meet the desired degree of purity of the neothramycin, it is subjected to a third series of the successive stages mentioned above and repeated until the desalted and further purified aqueous solution of neothramycin obtained from the last step has the desired purity of the neothramycin. In the course of the method according to the invention, the neothramycin content in an aqueous solution can be determined by examining the antibacterial potency of the solution according to a standard cup-plate method using a strain of Staphylococcus aureus as the test organism, assuming that a pure, authentic sample of neothramycin-A has a potency of 1000 mcg / mg.
According to the method according to the present invention, a pure or approximately pure product of neothramycin is obtained from a culture broth filtrate (with a potency of 500 to 1000 mcg / ml) from the cultivation of Streptomyces MC916-C4 and by treating the culture broth filtrate with macroreticular, non- ionogenic resin for adsorption of neothramycin, elution of the macroreticular resin containing adsorbed neothramycin with acetone-containing water, treatment of the obtained eluate with strongly basic anion exchanger for adsorption of neothramycin, elution of the adsorbed neothramycin-containing anion exchanger with aqueous solution of a neutral salt, treatment of a neutral salt fresh portion of macromolecular,
Non-ionic resin for adsorption of neothramycin by this resin and subsequent elution of the latter macroreticular resin with acetone-containing water in such a way that the series of these chromatographic steps is carried out as a first cycle, and then, if necessary, further series of these chromatographic steps in one or two additional cycles are obtained. In this way, neothramycin can be obtained in a total yield of about 20%, calculated on the total potency of neothramycin, which was originally present in the culture broth filtrate used.
In the process of the present invention, neothramycin is processed in solution in water during virtually all stages of the process, and the solvents required in the process are only water and acetone, which are cheap and readily available, so that the process of the invention can be carried out at low cost.
The invention is further illustrated in the following by a few exemplary embodiments.
Example 1 (1) A filtrate (10 liters) of the culture broth of Streptomyces MC916-C4 (FERM-P 2452 or ATCC 31123), which contained neothramycin in a potency of 796 mcg / ml (pH 7.13), was passed through a column 1 liter of Diaion HP-20 (a macroreticular, non-ion exchange resin consisting of a divinylbenzene-styrene copolymer, commercially available from Mitsubishi Kasei Co. , Japan) so that neothramycin was adsorbed by the resin. This resin column was washed with 7 liters of water and then eluted with water which contained 5% by volume of acetone. The eluate was collected in 120 ml fractions and fractions no. 18 to 120, which contained neothramycin, were combined to 11.7 liters of a partially purified aqueous solution of neothramycin (potency 404 mcg / ml, pH 6, 7). Yield: 59%.
(2) This partially purified solution of neothramycin (5.85 liters) was passed through a column (8 mm inner diameter) of 100 ml Amberlite IRA-401 (OH form) (a strongly basic anion exchange resin consisting of a polystyrene, which is quaternary Contains ammonium groups -N (CH3) 3 +, commercially available from Rohm & Haas Co. , USA) so that the neothramycin was adsorbed by the anion exchange resin. This resin column was then washed with 500 ml of water and eluted with an aqueous solution of 0.3M sodium chloride, and the eluate was then collected in 20 ml fractions. These fractions contained no detectable amount of cycloheximide. Those fractions No. 8 to 120 containing neothramycin were combined into 2.16 liters of an aqueous solution containing neothramycin and sodium chloride. (pH 9.6, potency 904 mcg / ml).
Yield: 82%.
(3) This aqueous solution of neothramycin was brought to pH 6.1 by adding aqueous 10% but sulfuric acid and then passed through a column of 100 ml Diaion HP-20 for the adsorption of the antibiotics by this macroreticular non-ionogenic resin. The resin column was washed with 500 ml of water and then eluted with water containing 15% by volume of acetone for desalting. The eluate was collected in 20 ml fractions and the fractions no. 6 to 19 combined into a desalted aqueous solution neothramycin. This desalted solution was distilled under 30 ° C. under reduced pressure to remove the acetone, and then freeze-dried, whereby 2.16 g of a crude powder of neothramycin (potency 606 mcg / mg) were obtained. Yield: 68%.
(4) 2 g of the raw powder of neothramycin (potency 609 mcg / mg), obtained as described above, was taken up in 20 ml of water and the aqueous solution on a column (8 mm inner diameter) on 100 ml of Amberlite IRA-401 ( OH form) so that neothramycin was adsorbed by this strongly basic anion exchange resin. This resin column was washed with 500 ml of water and then eluted with an aqueous solution of 0.3M sodium chloride. The eluate was collected in 18 ml fractions.
A sample was taken from each fraction, which was performed by silica gel thin layer chromatography (using ethyl acetate-water (50: 1 by volume ratio) as a developing solvent and finding a neothramycin spot at or near Rf 0.2 under gaseous staining Iodine) to determine whether the analyzed fraction contained neothramycin. Fractions No. 13 to 60, which contained neothramycin and sodium chloride, were combined and the combined solution was adjusted to pH 7.0 by adding 2N aqueous sulfuric acid.
This neutralized, purified solution of neothramycin was then passed through a column of 30 ml of Diaion HP-20 to adsorb the antibiotics, and this column of macroreticular resin was washed with 150 ml of water and then eluted with water containing 10% by volume of acetone for desalting , whereby the eluate was collected in 16 ml fractions. Fractions No. 2 to 11 were combined to give a desalted and further purified aqueous solution of neothramycin.
(5) This desalted solution was distilled at a temperature below 30 ° C under reduced pressure to remove the acetone, and the obtained concentrated solution was freeze-dried to give 0.73 g of a purified powder of practically pure neothramycin product (potency 910 mcg / mg). Yield: 55%. The total yield of neothramycin was 18%, calculated on the total amount of neothramycin that was originally present in the culture broth filtrate used.
Example 2
A crude powder (2 g) containing neothramycin (potency 850 mcg / mg) and obtained in a similar manner to that described in steps (1) to (3) of Example 1 was dissolved in 20 ml of water, and the obtained one aqueous solution passed through a column (8 mm inner diameter) on 100 ml Amberlite IRA-401 (OH form) for the adsorption of the antibiotics through this anion exchange resin. The resin column was washed with 500 ml of water and then eluted with an aqueous solution of 0.3M sodium chloride.
The eluate was collected in 18 ml fractions, a sample was taken from each of these fractions, which was then analyzed by silica gel thin layer chromatography using ethyl acetate-water (50: 1 by volume ratio) as the developing solvent and finding a neothramycin stain at or near at Rf 0.2 with gaseous iodine staining to determine if the analyzed fraction contained neothramycin. Fractions No. 13 to 60 of the eluate, which contained neothramycin, were combined and gave a further purified aqueous solution of neothramycin, which was then adjusted to pH 7.0 by adding aqueous 2N sulfuric acid.
This neutral, purified solution of neothramycin was subjected to the adsorptive treatment with a column of 30 ml of Diaion HP-20, which was then washed with 150 ml of water and eluted with water containing 10% by volume of acetone for desalting. The eluate from the Diaion HP-20 column was collected in 16 ml fractions and the fractions No. 2 to 11 were combined to give a desalted and further purified solution of neothramycin. This desalted solution was distilled at a temperature below 30 ° C under reduced pressure to remove the acetone, and the concentrated solution was freeze-dried to obtain 0.73 g of a pure powder of neothramycin (potency 1000 mcg / mg). Yield: 43%.
Example 3
A crude powder (2 g) of neothramycin (potency 580 mcg / mg), which had been obtained by process steps similar to steps (1) to (3) from Example 1, was dissolved in 20 ml of water. The aqueous solution obtained was discharged through a column (8 mm inner diameter)
100 ml of Amberlite IRA-410 (OH form) passed so that neothramycin was adsorbed by the anion exchange resin. This resin column was washed with 500 ml of water and then eluted with an aqueous solution of 0.5N ammonium sulfate, and the eluate was collected in 18 ml fractions.
Each fraction was analyzed using silica gel thin layer chromatography as described in Example 2, and those fractions no. 9 to 96 of the eluate containing neothramycin were combined to give another purified aqueous solution of neothramycin, which was then adjusted to pH 7.0 by adding aqueous 2N sulfuric acid. This neutralized, purified solution of neothramycin was subjected to the adsorptive treatment with a column of 30 ml of Diaion Hp-20, which was then washed with 50 ml of water and eluted with water containing 10% by volume of acetone for desalting.
Those fractions of the eluate containing neothramycin were combined to give a desalted and further purified solution of neothramycin in water-acetone, which was distilled at a temperature below 30 ° C. under reduced pressure to remove the acetone. The concentrated solution was freeze-dried and gave 0.35 g of a purified powder of a practically pure neothramycin product (potency 945 mcg / mg). Yield: 28%.
Example 4
A filtrate (1 liter) of the culture broth of Streptomyces MC916-C4 containing neothramycin in a potency of 950 mcg / ml (pH 7.1) was prepared in the same manner as in steps (1) to (3) of Example 1 processed to give a raw powder of neothramycin with a potency of 850 mcg / mg. This crude powder (500 mg) was dissolved in 3 ml of water and the aqueous solution obtained over a column (13 mm inner diameter) of 20 ml of Dowex 1 -X2 (OH form) (a strongly basic anion exchange resin consisting of a polystyrene, which contains quaternary ammonium groups, commercially available from Dow Chemical Co. , USA) slides so that neothramycin has been adsorbed by the anion exchange resin.
This resin column was washed with 100 ml of water and then eluted with an aqueous solution of 0.125 M sodium chloride, the eluate being collected in 8 ml fractions. Each of these fractions was examined by silica gel thin layer chromatography in the same manner as in Example 2, and those fractions No. 9 to 23 of the eluate containing neothramycin were combined to give a purified solution containing neothramycin and sodium chloride. This solution was adjusted to pH 6.0 by adding an aqueous 10% sulfuric acid and then subjected to the adsorptive treatment with a column of 15 ml of Diaion HP-20. This macroreticular resin was washed with 100 ml of water and then eluted with water containing 50% by volume of acetone for desalination.
The fractions of the eluate containing neothramycin were combined to give a desalted and further purified solution of neothramycin which was then distilled at a temperature below 30 ° C under reduced pressure to remove the acetone. The concentrated solution was freeze-dried and gave 220 mg of a purified powder of practically pure neothramycin product (potency 900 mcg / mg). Yield: 47%. The overall yield of neothramycin was 21%, calculated on the total potency of neothramycin, which was present in the original culture broth filtrate used.