DE946254C

DE946254C - Process for the production of breakdown products of vitamin B factor III

Info

Publication number: DE946254C
Application number: DEA20954A
Authority: DE
Inventors: Dr Konrad Bernhauer; Dr Wilhelm Friedrich
Original assignee: Aschaffenburger Zellstoffwerke AG
Current assignee: Aschaffenburger Zellstoffwerke AG
Priority date: 1954-08-14
Filing date: 1954-08-14
Publication date: 1956-07-26

Description

Verfahren zur Herstellung von Abbauprodukten des Vitamin B12-Faktors III Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Abbauprodukten des Vitamin-Bl2-Faktors III durch hydrolytische Prozesse, wobei neue, bisher noch nicht beschriebene chemische Produkte erhalten werden, die niedermolekular sind und im ultravioletten Spektralbereich stark absorbieren.Process for the production of breakdown products of the vitamin B12 factor III The invention relates to a process for the production of degradation products of the vitamin Bl2 factor III through hydrolytic processes, with new ones so far chemical products which are not described and which are low molecular weight are obtained and absorb strongly in the ultraviolet spectral range.

Unter den verschiedenen natürlichen Vitaminen der Bl2-Gruppe besitzen nur das Vitamin B12 selbst und der von der Anmelderin aufgefundene Vitamin-Bl2-Faktor III antiperniciöse Wirksamkeit. Außerdem konnte die Anmelderin auf biosynthetischem Weg zu neuen Vitamin-Bl2-Arten gelangen, die antiperniciös wirksam sind und in der Natur noch nicht aufgefunden wurden. Die Herstellung neuer biosynthetischer Cobalamine ist insofern bedeutungsvoll, als solche Produkte eventuell zusätzliche besonders wertyolle therapeutische Eigenschaften besitze-l können. Possess among the various natural vitamins of the Bl2 group only the vitamin B12 itself and the vitamin B12 factor found by the applicant III antipernicious activity. In addition, the applicant was able to use biosynthetic Way to get to new types of vitamin Bl2, which are effective in antipernicious diseases and in the Nature have not yet been found. The manufacture of new biosynthetic cobalamins is significant in that such products may be additional special valuable therapeutic properties.

Die Biosynthese von Cobalaminen besteht darin, daß unter der Einwirkung von Fermenten, die z. B. in E. coli vorhanden sind, an Ätiocobalamin ein Nucleotid angelagert- wird. Die Synthese des betreffenden Nucleotids wird von E. coli bewerkstelligt, wenn man ihm die entsprechende Base anbietet. Auf diese Weise gelangte die Anmelderin zu verschiedenen Benzimidazol-cobalaminen, wodurch manche Benzimidazole als »precursors« von besonderer Bedeutung für die Herstellung. neuer Cobalamine wurden. The biosynthesis of cobalamines consists in that under the action of ferments z. B. are present in E. coli, a nucleotide at Ätiocobalamin is attached. The synthesis of the nucleotide in question is accomplished by E. coli, if you offer him the appropriate base. This is how the applicant arrived to various benzimidazole cobalamines, whereby some benzimidazoles are used as precursors of particular importance for manufacture. new cobalamins were.

Diese Ausführungen machen es verständlich, daß der Herstellung von Abbauprodukten des Vitamin-Bl2-Faktors III, die die betreffende Base enthalten, die Base selbst vorstellen oder Abbauprodukte der Base sind, eine beträchtliche Bedeutung beizumessen ist. Die Kenntnis und Gewinnung solcher Abbauprodukte, für die ein starkes Absorptionsvermögen im ultravioletten Bereich charakteristisch ist, bietet die Möglichkeit zur Biosynthese nicht nur des Vitamin-Bl2-Faktors III, sondern eventuell noch anderer neuartiger und wertvoller Cobalamine. These explanations make it understandable that the production of Breakdown products of vitamin Bl2 factor III, which contain the base in question, the Introducing the base itself or being degradation products of the base, have considerable significance is to be measured. The knowledge and extraction of such breakdown products for which a strong Absorbency in the ultraviolet range is characteristic, offers the possibility for the biosynthesis not only of the vitamin B12 factor III, but possibly others as well new and valuable cobalamins.

Es-wurde nun die überraschende Beobachtung gemacht, daß aus dem Vitamin-B12-Faktor III durch Einwirkung konzentrierter Salzsäure bzw. konzentrierter wäßfiger Lösungen von Perchlorsäure (z. B. The surprising observation has now been made that the vitamin B12 factor III by the action of concentrated hydrochloric acid or concentrated aqueous solutions of perchloric acid (e.g.

70%iger) im Temperaturbereich von o bis 37° im Laufe von einigen Stunden in praktisch quantitativer Ausbeute Ätiocobalamin gebildet wird unter gleichzeitiger Freisetzung eines Nucleotids, das nachfolgend als »Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III« bezeichnet wird. Bei längerer Einwirkung der genannten Agenzien auf den Vitariin-B12-Faktor III bleibt die Ausbeute an Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III praktisch konstant; die Ausbeute an Ätiocobalamin sinkt jedoch unter gleichzeitiger Bildung eines neuen kobalthaltigen Abbauproduktes, das die Anmelderin »Faktor 1 a« nennt. Der Faktor 1 a läßt sich durch sein Absorptionsspektrum sowie durch sein elektrophoretisches Verhalten vom Ätiocobalamin nicht unterscheiden, wohl aber sind die R-Werte und die Coli-Aktivität der beiden Faktoren verschieden (vgl.70%) in the temperature range from 0 to 37 ° over the course of a few hours Etiocobalamin is formed in practically quantitative yield with simultaneous Release of a nucleotide, hereinafter referred to as the »nucleotide of the vitamin Bl2 factor III «is designated. With prolonged exposure to the mentioned agents on the vitariin-B12-factor III, the yield of nucleotide of vitamin Bl2 factor III remains practically constant; however, the yield of etiocobalamin decreases with the simultaneous formation of a new one cobalt-containing degradation product, which the applicant calls "Factor 1 a". The factor 1 a can be identified by its absorption spectrum as well as by its electrophoretic Behavior cannot be distinguished from etiocobalamin, but the R values and are the coli activity of the two factors is different (cf.

Tabelle I).Table I).

Zur Gewinnung dieser beiden Produkte aus dem Vitamin-B12-Faktor III wird das in der oben erwähnten Weise hergestellte Hydrolysat-nach Entfernen der Salzsäure im Vakuum bzw. nach Abneutralisieren mit Kalilauge in Form eines Trockenpräparates (z. B. nach dem Aufnehmen in Kieselgur und Trocknen im Vakuum) auf die Zellulosepulversäule gebracht; anschließend wird mit cyanidhaltigem wassergesättigtem n-Butanol entwickelt. Wie die Tabelle 1 zeigt, führt die Salzsäurehydrolyse unter anderem zur Bildung geringer Mengen an Ätiocobalamincarbonsäuren, die beim Perchlorsäureabbau nicht entstehen. To obtain these two products from the vitamin B12 factor III is the hydrolyzate prepared in the manner mentioned above - after removing the Hydrochloric acid in a vacuum or after neutralizing with potassium hydroxide in the form of a dry preparation (e.g. after being taken up in kieselguhr and drying in vacuo) onto the cellulose powder column brought; then it is developed with cyanide-containing water-saturated n-butanol. As Table 1 shows, hydrochloric acid hydrolysis leads to formation, among other things small amounts of etiocobalaminocarboxylic acids, which do not occur during perchloric acid degradation develop.

Die Unterschiede in den R-Werten der in der Tabelle I angeführten Cobalamine sind der bremsenden Wirkung des Kaliumperchlorates zuzuschreiben.The differences in R values from those listed in Table I. Cobalamins can be attributed to the braking effect of potassium perchlorate.

Die Spaltung des Vitamin-Bl2-Faktors III unter den oben angeführten Bedingungen geht z. B. bei 23° sehr rasch vor sich und ist bereits nach 2 Stunden völlig beendet. Die Ausbeute an Ätiocobalamin erreicht bereits nach 1112 Stunden das Maximum, um dann allmählich abzusinken. Die Ausbeute an Faktor Ia ist in den ersten 2 Stunden gering, steigt aber im Laufe von einigen Stunden beträchtlich an. Der Faktor 1 a entsteht offenbar aus dem Ätiocobalamin, wie der ganze Reaktionsverlauf zeigt. The cleavage of vitamin Bl2 factor III among those listed above Conditions go z. B. at 23 ° very quickly and is already after 2 hours completely ended. The yield of etiocobalamin reaches already after 1112 hours the maximum, only to gradually decrease. The yield of factor Ia is in the The first 2 hours it is slight, but it increases considerably over the course of a few hours. The factor 1 a evidently arises from the etiocobalamin, like the entire course of the reaction shows.

Die Trennung des Nucleotids des Vitamin-Bl2-Faktors III von den farbigen Komponenten der Hydrolysate gelingt erfindungsgemäß durch die neuartige und sehr wichtige Beobachtung, daß gewisse stark basische Anionenaustauscher, wie z. B. Dowex-I, Dowex-2 ud Amberlite JRA-400 (alle drei sind Polystyrolharze, enthalten quaternäre Ammoniumgruppen) in der Chlorid- bzw. Formiatform das Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III aus neutralen bzw. schwach alkalischen wäßrigen Lösungen gut adsorbieren, wobei gleichzeitig die kobalthaltigen Anteile sich leicht mit Wasser auswaschen lassen. The separation of the nucleotide of vitamin Bl2 factor III from the colored ones Components of the hydrolyzate succeed according to the invention by the novel and very important observation that certain strongly basic anion exchangers, such as. B. Dowex-I, Dowex-2 ad Amberlite JRA-400 (all three are polystyrene resins, contain quaternary Ammonium groups) in the chloride or formate form, the nucleotide of the vitamin Bl2 factor III adsorb well from neutral or weakly alkaline aqueous solutions, whereby at the same time the cobalt-containing parts can be easily washed out with water.

Nach Waschen der Säule mit Wasser, wobei außer den Cobalaminen auch Salze-entfernt werden, läßt sich das Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III bereits mit 0,002 n-HCl leicht eluieren. Es ist jedoch zweckmäßiger, etwas stärkere, z. B. 0, OI n-Salzsäure zu verwenden, um das Volumen des Eluates klein zu halten. Die hierbei erhältliche Elutionskurve ist symmetrisch, woraus zu entnehmen ist, daß das Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III einheitlich ist.After washing the column with water, besides the cobalamines also Salts are removed, the nucleotide of vitamin Bl2 factor III can already Elute gently with 0.002 N HCl. However, it is more appropriate to use somewhat stronger, e.g. B. 0, OI to use n-hydrochloric acid in order to keep the volume of the eluate small. the The elution curve obtained here is symmetrical, from which it can be seen that the nucleotide of vitamin Bl2 factor III is uniform.

Es wurde weiterhin gefunden, daß gewisse carboxylhaltige Kationenaustauscher, wie z. B. Amberlite JRG-5o-H+ (carboxylhaltiges Acrylsäureharz) das Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III nicht adsorbieren, sehr stark aber die Cobalamine. Durch aufeinanderfolgende Chromatographie des Nucleotids des Faktors III, z. B. an Dowex-2-HCl, Amberlite JRC-50-H+ und wieder Dowex-2-HCl läßt sich das Nucleotid in sehr reiner Form darstellen. Die Elution kann mittels eines Spektrophotometers -verfolgt werden, da das Nucleotid des Faktors III im UV-Bereich stark absorbiert. Nach Einengen der Eluate zur Trockne, Aufnehmen des Rückstandes in sehr wenig Wasser und Zusatz von Aceton fällt das Nucleotid des Yitanim-B12-Faktors III gummiartig aus und wird nach Entfernen der Lösungsmittel und Trocknen im Vakuum bald fest. Es besitzt im UV charakteristische Absorptionsmaxima, und zwar in 0, OI n-HCl und 289,5 mµ e1 cm1% 139,5, bei PH etwa 8,2 in Wasser und 291,5 mµ E1 cm 1% 107,2 bei 248,5 m,z E 11,9, 166,2. It was also found that certain carboxyl-containing cation exchangers, such as B. Amberlite JRG-5o-H + (carboxyl-containing acrylic acid resin) the nucleotide des Do not adsorb vitamin B12 factor III, but the cobalamins very strongly. By sequential chromatography of the factor III nucleotide, e.g. B. Dowex-2-HCl, Amberlite JRC-50-H + and again Dowex-2-HCl can be the nucleotide in very pure Represent shape. The elution can be followed using a spectrophotometer, because the nucleotide of factor III absorbs strongly in the UV range. After narrowing the Eluate to dryness, take up the residue in very little water and add Acetone precipitates the nucleotide of the Yitanim B12 factor III rubbery and becomes after Removing the solvent and drying in vacuo soon solid. It has characteristic in the UV Absorption maxima, namely in 0. OI n-HCl and 289.5 mµ e1 cm1% 139.5, at pH approx 8.2 in water and 291.5 mµ E1 cm 1% 107.2 at 248.5 m, z E 11.9, 166.2.

Es enthält Phosphat und gibt eine stark positive Reaktion auf Zucker. Aus dem prozentuellen Phosphatgehalt des Nucleotids läßt sich ein Molekulargewicht von etwa I490 für den Vitamin-Bl2-Faktor III berechnen. It contains phosphate and gives a strong positive reaction to sugar. A molecular weight can be determined from the percentage phosphate content of the nucleotide of about 1490 for the vitamin B12 factor III.

Der Abbau des Nucleotids des Vitamin-Bl2-Faktors III mit 6 n-HCl bei 100° geht sehr langsam vor sich, und es werden in 24 Stunden erst etwa 65 01o der Phosphorsäure freigesetzt. Es entsteht dabei ein basisches Produkt, das folgende Absorptionsmerkmale besitzt: in 0, OI n-HCl Maxima bei 289 und 252 mµ, Minima bei 268 und 238 my, bei PE 8,2 in Wasser Maxima bei 29I und 249 my, Minima bei 270 und 233 ms. The degradation of the nucleotide of vitamin Bl2 factor III with 6 n-HCl at 100 ° goes very slowly, and it only gets about 65 01o in 24 hours the phosphoric acid released. The result is a basic product, the following one It has absorption characteristics: in 0. OI n-HCl maxima at 289 and 252 mμ, minima at 268 and 238 my, at PE 8.2 in water maxima at 29I and 249 my, minima at 270 and 233 ms.

Diese basische Substanz, die vorläufig als »Abbauprodukt II« bezeichnet wird, wird in folgender Weise in reinem Zustand erhalten: Einengen des Hydrolysats im Vakuum, Entfernen der HC1 über Ätznatron, Aufnehmen des Rückstandes in Wasser, Alkalisieren auf PH 7,5 bis 8,2, Durchlassen dieser Lösung durch eine Säule aus Dowex-2-HCl und Eluieren mit Wasser, wobei das Produkt im Eluat erscheint. This basic substance, provisionally referred to as "degradation product II" is obtained in the pure state in the following manner: Concentration of the hydrolyzate in a vacuum, removing the HC1 via caustic soda, taking up the residue in water, Alkalize to pH 7.5 to 8.2, pass this solution through a column Dowex-2-HCl and eluting with water, the product appearing in the eluate.

Der Abbau des Nucleotides des Vitamin-Bl2-Faktprs III mit 6 n-HCl bei 150° geht rasch vor sich, wobei die Phosphorsäure in etwa 3 Stunden quantitativ freigesetzt wird. Es entsteht dabei ein basisches Produkt, das folgende Merkmale besitzt: Schmelzpunkt 2I9 bis 2200 (unter Zersetzen, Koffer-Mikroskop); Summenformel C7H6N2O; Absorptionsdeaten: in 0, OI NHC1 Maximum bei 286 my, Minimum bei 260 mµ, bie PH etwa 82, in Wsser Msxima bei 286 und 246 mµ, Minima bei 263 und 232 mµ, i 0,1 n-KOH Maximum bei 306mµ, Minimum bei 27I mµ Die Base gibt mit Millons Phenol-Reagens einen roten Niederschlag und entfärbt in wäßriger Lösung sofort Permanganat unter praktisch völliger Zerstörung des chromophoren Systems (Verschwinden der charakteristischen Absorption im UV). -Diese Substanz ist mit dem Abbauprodukt II nicht identisch. Sie wird vorläufig »Abbauprodukt III« genannt. Wohl aber ist sie identisch mit der »Komponente avr, die man durch direkten Abbau des Vitamin-B12-Faltors III erhalten kann, wie weiter unten beschrieben wird.. Die Reinigung des Abbauproduktes III erfolgt in der gleichen Weise wie die des Abbauproduktes II. The degradation of the nucleotide of the vitamin Bl2 fact III with 6 n-HCl at 150 ° goes quickly, with the phosphoric acid quantitatively in about 3 hours is released. The result is a basic product with the following characteristics possesses: melting point 219 to 2200 (with decomposition, suitcase microscope); Molecular formula C7H6N2O; Absorption data: in 0, OI NHC1 maximum at 286 my, minimum at 260 mµ, at PH about 82, in Wsser Msxima at 286 and 246 mµ, minima at 263 and 232 mµ, i 0.1 n-KOH maximum at 306mµ, minimum at 27I mµ, the base gives with Millon's phenol reagent forms a red precipitate and decolorizes in aqueous solution immediately permanganate with practically complete destruction of the chromophoric system (Disappearance of the characteristic absorption in the UV). -This substance is with not identical to degradation product II. It is provisionally called "degradation product III". It is, however, identical to the component avr, which can be obtained through direct dismantling of the vitamin B12 folder III, as will be described below .. The Purification of the degradation product III takes place in the same way as that of the degradation product II.

Die Gewinnung des Nucleosids des Faktors III gelang überraschenderweise unter der katalytischen Wirkung von Salzen seltener Erden. Diese Methode wurde bereits zur Abspaltung esterartig gebundener Phosphorsäure aus gewissen Naturprodukten verwendet; es war aber keinesfalls vorauszusehen, daß sie im vorliegenden Fall zum Ziel führen würde. Sie wurde bisher auch noch nicht in der Vitamin-Bl2-Forschung benutzt. Es wurde gefunden, daß in verdünnten, z. B. 2 Io-6-molaren Lösungen des Nucleotids des Faktors III bei Verwendung eines 5- bis 20fachen Überschusses an Salzen der seltenen Erden, wie z. B. an Ce(NO3)3 6H2O bei PH 7,6 bis 9 und Temperaturen von über 200 unter rascher Abspaltung von Phosphorsäure das Nucleosid des Faktors III entsteht. The nucleoside of factor III was obtained surprisingly under the catalytic action of rare earth salts. This method has already been used used to split off ester-like bonded phosphoric acid from certain natural products; but it was by no means foreseeable that they would lead to the goal in the present case would. It has also not yet been used in vitamin B1 research. It it has been found that in dilute, e.g. B. 2 Io-6 molar solutions of the nucleotide of factor III when using a 5- to 20-fold excess of salts of the rare earths such as B. Ce (NO3) 3 6H2O at pH 7.6 to 9 and temperatures of over 200, with rapid cleavage of phosphoric acid, the nucleoside of factor III arises.

Zur präparativen Gewinnung dieses Nucleosids wird nach beendeter Reaktion (nach völliger Abspaltung des Phosphats) die trübe (Cer-hydroxyd enthaltende) Lösung klar zentrifugiert, durch eine Säule aus z. B. Dowex-2-HCl langsam durchgelassen. For the preparative production of this nucleoside is finished after Reaction (after complete elimination of the phosphate) the cloudy (cerium hydroxide containing) Solution centrifuged clear, passed through a column of e.g. B. Dowex-2-HCl let through slowly.

Dabei wird das Nucleosid festgehalten und dann mit Wasser eluiert. Nach wiederholter Chromatographie erhält man das Nucleosid in reiner Form. Das Absorptionsspektrum des Nucleosids gleicht dem des Nucleotids.The nucleoside is captured and then eluted with water. After repeated chromatography, the nucleoside is obtained in pure form. The absorption spectrum of the nucleoside is similar to that of the nucleotide.

Bei der Hydrolyse des Vitamin-Bl2-Faktors III mit 6 n-HC.l bei 150° währen 20 Stunden erhält man zwei im UV-Bereich absorbierende Abbauprodkte, Die Trennung und Reinigung dieser Abbauprodukte wurde erfindungsgemäß durch die wichtige Beobachtung ermöglicht, daß nach dem Einengen der Hydrolysate im Vakuum und Trocknen des Rückstandes, z. B. über Ätznatron und Calziumchlorid, bei der anschließenden Extraktion mit Wasser oder verdünnter Salzsäure fast sämtliche Farbstoffe zurückbleiben und nur die im UV absorbierenden Abbauprodukte des Vitamin-Bl2-Faktors III in Lösung gehen. Die so gewonnenen, leicht rotbraungefärbten Extrakte werden im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, mit etwas Kieselgur vermengt und getrocknet. Durch systematische Versuche wurde gefunden, daß dadurch Chromatographie dieser so gewonnenen Trockenpräparate an einer Säule aus Zellulosepulver unter Verwendung von Aceton + Wasser bzw. Aceton + verdünnte Salzsäure als Entwickler zwei im UV absorbierende Komponenten erhältlich sind. Es ist notwendig, zunächst mit fast reinem Aceton zu entwickeln und die Menge an Wasser bzw. verdünnter Salzsäure allmählich zu steigern. During the hydrolysis of the vitamin Bl2 factor III with 6 n-HC.l at 150 ° Two degradation products absorbing in the UV range are obtained for 20 hours, Die According to the invention, separation and purification of these degradation products was carried out by the important Observation enables that after the hydrolyzates have been concentrated in vacuo and dried of the residue, e.g. B. caustic soda and calcium chloride, in the subsequent Extraction with water or dilute hydrochloric acid leaves almost all of the colorants behind and only the degradation products of vitamin Bl2 factor III that absorb in the UV in solution walk. The slightly reddish-brown extracts obtained in this way are applied in vacuo concentrated a small volume, mixed with a little kieselguhr and dried. By systematic experiments have been found that this chromatography thus obtained Dry preparations on a cellulose powder column using acetone + Water or acetone + diluted hydrochloric acid as developer two in the UV absorbing Components are available. It is necessary to start with almost pure acetone too and gradually increase the amount of water or dilute hydrochloric acid.

Beim Entwickeln mit z. B. Aceton + 5 01o 0,1 n-HCl läßt sich die schnellere Komponente (von der Anmelderin als » Komponente a« bezeichnet) eluieren. When developing with e.g. B. acetone + 5 01o 0.1 n-HCl can be the faster component (designated by the applicant as “component a”) elute.

Sie ist nach ihrem Absorptionsspektrum und ihrem papierchromatographischen Verhalten identisch mit dem Abbauprodukt III. Bei weiterer Steigerung des Wassergehaltes läßt sich z. B. mit Aceton + 15 0Io 0,1 n-HCl das langsamer wandernde Abbauprodukt (von der Anmelderin »Komponente b« genannt) in reiner Form gewinnen. Die Komponente b konnte nach mehrmaliger Chromatographie, Einengen und Zusatz von Aceton in kristallisierter Form erhalten werden. Ihr Absorptionsspektrum besitzt folgende Merkmale: in 0, OI n-HCl Maxima bei 290 und 255 mµ, Minima be 270 und 248 mµ; bie PH 8,2 in Wasser Maxima bei 298 und 252 mµ, Minima bei 273 und 244mM-Beispiel I 1,5 mg des Vitamin-Bl2-Faktors III werden mit 0,1 ccm 70%iger Perchlorsäure versetzt und I2 Stunden bei 23° stehengelassen. Anschließend wird das Hydrolysat mit etwas Wasser verdünnt, mit 1 Tropfen IO °/Oiger Blausäure versetzt und mit 0,5 n-K O H bis zum Farbumschlag in Violett titriert (Verbrauch'etwa 2,4ccm 0,5 n-KOH). Das auf pH 6 bis 7 abneutralisierte Hydrolysat wird im Vakuum auf 0,1 bis 0,5 ccm eingeengt, in etwas Kieselgur aufgenommen, im Vakuum getrocknet und auf einer Zellulosesäule chromatorgrphiert. Säulendruchmesser 1,15 cm, Höhe 10 cm. Entwickler; CN-haltiges wassergesättigtes n-Butanol. Während der Entwicklung des Chrotnatogramms werden an der Säule sehr bald zwei violette Zonen sichtbar, von denen die untere (vom R-Wert 0,4) das Ätiocobalamin, die obere (vom R-Wert 0,2) der Faktor 1a ist. Nach dem Eluieren, Extrahieren mit Wasser und Entfernen des Butanols werden die beiden Faktoren in reiner Form erhalten. It is according to its absorption spectrum and its paper chromatographic Behavior identical to the degradation product III. With a further increase in the water content can z. B. with acetone + 15 0Io 0.1 n-HCl the slower moving degradation product (called "component b" by the applicant) in pure form. The component b could after repeated chromatography, concentration and addition of acetone in crystallized Shape can be obtained. Their absorption spectrum has the following characteristics: in 0, OI n-HCl maxima at 290 and 255 mµ, minima be 270 and 248 mµ; at pH 8.2 in water Maxima at 298 and 252 mμ, minima at 273 and 244mM-Example I 1.5 mg of the vitamin Bl2 factor III are mixed with 0.1 ccm of 70% perchloric acid and left to stand for 12 hours at 23 °. Then the hydrolyzate is diluted with a little water, with 1 drop of IO ° / Oiger Hydrocyanic acid was added and titrated with 0.5 n-K O H until the color changed to violet (Consumption about 2.4ccm of 0.5 n-KOH). The hydrolyzate neutralized to pH 6 to 7 is concentrated in vacuo to 0.1 to 0.5 ccm, taken up in a little kieselguhr, im Vacuum dried and chromator grouped on a cellulose column. Column diameter 1.15 cm, height 10 cm. Developer; CN-containing water-saturated n-butanol. While As the Chrotnatogram develops, two violet ones appear on the column very soon Zones visible, of which the lower (from R-value 0.4) the etiocobalamin, the upper (with an R value of 0.2) is factor 1a. After eluting, extracting with water and Removing the butanol will keep the two factors in pure form.

Beispiel 2 70 mg Vitamin-Bl2-Faktor III werden in 5 ccm 70%iger Perchlorsäure gelöst und 2 Stunden lang bei 23° stehengelassen. Dann wird das Hydrolysat mit etwas Wasser verdünnt, mit einigen Tropfen Io°/Oiger Blausäure versetzt und mit 2 n-KOH bis zum Farbumschlag in Violett titriert (Verbrauch etwa 30 ccm). Example 2 70 mg of vitamin B12 factor III are dissolved in 5 cc of 70% perchloric acid dissolved and left to stand at 23 ° for 2 hours. Then the hydrolyzate with something Diluted water, mixed with a few drops of Io / Oiger hydrocyanic acid and treated with 2N KOH titrated until the color changes to violet (consumption approx. 30 ccm).

Nach dem Stehenlassen im Kühlraum über Nacht wird das auskristallisierte Kaliumperchlorat abgetrennt, das Filtrat auf etwa p g eingestellt und durch eine Säule aus Dowex-2-HCl (Durchmesser 1,15 cm, Höhe 25 cm) durchgelassen, wobei die gefärbten Abbauprodukte des Vitamin-Bl2-Faktors III die Säule passieren, während das Nucleotid des Vitamin-Bl2-Faktors III in der Säule festgehalten wird. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird das Nucleotid mit 0, OI n-HCl eluiert, das Eluat im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, d Rückstand in 20 ccm Wasser aufgenommen, auf pfl etwa 8 eingestellt, die rosagefärbet Lösung durch eine Säule aus amberlite JRC-50-H+ (Durchmesser 1,15cm, Höhe 40 cm) langsam durchgelassen und die Säule anschließend mit Wasser nachgewaschen, wobei die Farbstoffe an der Säule festgehalten werden, während das Nucleotid des Vitamin-B12-Faktors III in Form einer farblosen Lösung im Durchlauf erscheint. Nach dem Einengen der bei 290 mµ absorbierenden Fraktionen im Vakuum auf etwa 10 ccm und anschließender Chromatographie an einer Säule (Durchmesser 0,6 cm, Höhe 7 cm) aus Dowex-2-HCl, Einengen der Eluate bis zur Trockne, Aufnehmen des Rückstandes in I bis 2 Tropfen Wasser und Zusatz von etwas Aceton fällt das Nucleotid in gurnmiartiger Form aus. Nach Abtrennen der Lösungsmittel erstarrt das Nucleotid und läßt sich zu einem Pulver zerreiben. After standing in the refrigerator overnight, the crystallized Separated potassium perchlorate, the filtrate adjusted to about p g and through a Column of Dowex-2-HCl (diameter 1.15 cm, height 25 cm) passed through, whereby the colored degradation products of vitamin Bl2 factor III pass through the column while the nucleotide of vitamin Bl2 factor III is retained in the column. After this Washing the column with water, the nucleotide is eluted with 0. OI n-HCl, the eluate concentrated to dryness in vacuo, the residue taken up in 20 ccm of water Pfl about 8 adjusted, the rose-colored solution through a column of amberlite JRC-50-H + (Diameter 1.15 cm, height 40 cm) slowly let through and the column then washed with water, the dyes being retained on the column while the nucleotide of vitamin B12 factor III is in the form of a colorless Solution appears in the run. After concentrating the fractions absorbing at 290 mµ in a vacuum to about 10 ccm and subsequent chromatography on a column (diameter 0.6 cm, height 7 cm) from Dowex-2-HCl, concentrate the eluates to dryness, take up of the residue in 1 to 2 drops of water and the addition of a little acetone falls Nucleotide in rubber-like form. After the solvents have been separated off, it solidifies Nucleotide and grinds to a powder.

Beispiel 3 10 ccm eines 0,25 n-Ammoniumchlorid-ammoiak-Puffers vom PH 8,6, enthaltend etwa 2 # 01-6 Mol Nucleotid des Vitamin-B12-Faktors III und 4 # 10-5Mol Ce(NO3)5. #6 H,O werden bei 50° 100 Minuten lang geschüttelt. Sodann wird die trübe Flüssigkeit zentrifugiert, das klare Zentrifugat - durch eine Säule aus Dowex-2-HCl (Durchmesser 0,6 cm, Höhe 7 cm) durchgelassen, wobei das entstandene Nucleosid an der Säule adsorbiert bleibt. Es wird dann mit Wasser entwickelt, wobei sich das Nucleosid in den bei 290 m, absorbierenden Fraktionen befindet. Example 3 10 ccm of a 0.25 n-ammonium chloride-ammonia buffer from PH 8.6, containing about 2 # 01-6 moles of nucleotide of vitamin B12 factor III and 4 # 10-5 mol Ce (NO3) 5. # 6 H, O are shaken at 50 ° for 100 minutes. Then will the cloudy liquid centrifuged, the clear centrifugate - through a column Dowex-2-HCl (diameter 0.6 cm, height 7 cm) let through, the resulting Nucleoside remains adsorbed on the column. It is then developed with water, being the nucleoside is in the absorbing fractions at 290 m.

Beispiel 4 1 me ges Nucleotids des Vitamin-B12-Faktors III wird in 6 ccm 6 n-HCl gelöst und im zugeschmolzenen Glasrohr 3 Stunden auf I50° erhitzt. Das Hydrolysat wird im Vakuum über Calciumchlorid und Ätznatron getrocknet, der Rückstand in 2 ccm Wasser aufgenommen, auf pur etwa 8 gebracht und durch eine Säule aus Dowex-2-HCl (Durchmesser 0,6 cm, Höhe 7 cm) durchlaufen gelassen, wonach die Säule mit Wasser gewaschen wird. Die bei 286mµ absorbierenden Fraktionen enthalten das basische Abbauprodukt des Nucleotids- (» Abbauprodukt III «, «"Komponente a »). Example 4 1 me ges nucleotide of vitamin B12 factor III is in 6 cc of 6 n HCl dissolved and heated to 150 ° for 3 hours in a sealed glass tube. The hydrolyzate is dried in vacuo over calcium chloride and caustic soda, the The residue was taken up in 2 cc of water, brought to about 8 neat and passed through a column of Dowex-2-HCl (diameter 0.6 cm, height 7 cm), after which the Column is washed with water. Contain the fractions absorbing at 286mµ the basic breakdown product of the nucleotide ("breakdown product III", "" component a »).

Beispiel 5 1 mg des Nucleotids des Vitariin-B12-Faktors III wird in I ccm 6 n-H C1 gelöst und im zugeschmolzenen Glasrohr 30 Stunden auf 1000 erhitzt. Die Weiterverarbeitung des Hydrolysates erfolgt, wie im Beispiel 4 beschrieben. Die bei 290 mµ absorbierenden Fraktionen enthalten das basische Abbauprodukt des Nucleotids (»Abbauprodukt II«). Example 5 1 mg of vitariin B12 factor III nucleotide becomes dissolved in 1 ccm 6 n-H C1 and heated to 1000 for 30 hours in a sealed glass tube. The further processing of the hydrolyzate takes place as described in Example 4. The fractions absorbing at 290 mµ contain the basic degradation product of Nucleotide ("degradation product II").

Beispiel 6 6o mg Vitamin-B12-Faktor III werden in 5 ccm 6 n-HCl 20 Stunden lang auf 150° erhitzt. Das Hydrolysat wird im Vakuum über Calciumchlorid und Ätznatron zur Trockne gebracht, der Rückstand mit 5 ccm 0,1 n-HCl verrührt, durch eine kleine Glassinternutsche G3 filtriert, das Filtrat im Vakuum auf 0,2 bis 0,5 ccm eingeengt, mit etwas Kieselgur vermengt und im Vakuum getrocknet. Das trockene Kieselgurpräparat wird auf eine Zellulosepulversäule (Durchmesser 1,15 cm, Höhe 20 cm) gebracht. Man entwickelt mit Aceton, das steigende Mengen an 0,1 n-HCl enthält. Mit Aceton + 5 % 0,1 n-HCl wird aus der Säule die basische Komponente a (identisch mit dem Abbauprodukt III) eluiert, die weitere Entwicklung mit Aceton + I5°/o 0,1 n-HCl erigt die saure Komponente b. -Tabelle I Cobalamine aus Vitamin-B12-Fakor III und Vitamin B12, gewonnen durch Abbau mit konzentrierter Salzsäure bzw. 70%iger Perchlorsäure bei 230. Perchlorsäurehydrolysate samt den Salzen (Kaliumperchorat) chromatographiert. R-Wert a. d. Zellulosesäule Farbe a. d. Stabilität Elektro- Cobalamin Salzsäure- Perchlor- Coiiaktivität chromato- des phoreitsches Hydroyse Hydroyse Säure (b) Verhalten Ätiocobalamin-carbon- säure x ................. . 0,01 - inaktiv Violett sehr gering Ätiocobalamin-carbon- säure y ................... 0,04 - inaktiv Violett sehr gering Vitamin-B15-Faktor III 0,1 0,05 aktiv Rot sehr stabil Faktor Ia ............ .0,3 0,2 sehr gering Blauviolett stabiler als wie Faktor I Ätiocobalamin Faktor I (Faktor I) ................ 0,5. 0,4 aktiv (c) Vilett sehr gering (c) (a) Aktivität gegenüber der E. coli-Mutante 313-3.Example 6 60 mg of vitamin B12 factor III are heated to 150 ° for 20 hours in 5 cc of 6 n HCl. The hydrolyzate is brought to dryness in vacuo over calcium chloride and caustic soda, the residue is stirred with 5 cc of 0.1 N HCl, filtered through a small glass funnel G3, the filtrate is concentrated in vacuo to 0.2 to 0.5 cc, with a little Diatomaceous earth mixed and dried in vacuo. The dry kieselguhr preparation is placed on a cellulose powder column (diameter 1.15 cm, height 20 cm). Develop with acetone containing increasing amounts of 0.1 N HCl. The basic component a (identical to the degradation product III) is eluted from the column with acetone + 5% 0.1 n-HCl, the further development with acetone + 15% 0.1 n-HCl erases the acidic component b. -Table I Cobalamine from vitamin B12-factor III and vitamin B12, obtained by degradation with concentrated hydrochloric acid or 70% perchloric acid at 230. Perchloric acid hydrolysates including the salts (potassium perchorate) chromatographed. R-value ad cellulose column color ad stability electrical Cobalamin hydrochloric acid, perchloric acid, chromato- desphoreitic activity Hydroyse Hydroyse acid (b) behavior Etiocobalamin-carbon- acid x .................. 0.01 - inactive violet very low Etiocobalamin-carbon- acid y ................... 0.04 - inactive violet very low Vitamin B15 factor III 0.1 0.05 active red very stable Factor Ia ............ 0.3 0.2 very slightly blue-violet more stable than factor I. Etiocobalamin factor I. (Factor I) ................ 0.5. 0.4 active (c) Vilett very low (c) (a) Activity against E. coli mutant 313-3.

(b) Bei PH 4,5 bis 5 und Zimmertemperatur.(b) At pH 4.5 to 5 and room temperature.

(c) Ebenso wie das native Produkt aus Faulschlamm.(c) Just like the native product from digested sludge.

Claims

PATENT CLAIMS I. Process for the production of low molecular weight, im Ultraviolet spectral range of strongly absorbing substances from the vitamin B12 factor III, characterized in that the vitamin B12 factor III or its breakdown products subjected to hydrolytic processes and the hydrolysis products by chromatographic Processes are cleaned.

2. The method according to claim I, characterized in that the viamin B12 factor III the one Effect of 4 to 8 N hydrochloric acid at 130 to 170 ° during (112 to 30 hours) is subjected and that after removing the hydrochloric acid, the im ultraviolet spectral range absorbing hydrolysis products by chromatography with the aid of a cellulose powder column using aqueous acetone as a developer be separated.

3. The method according to claims 1 and 2, characterized in that that the hydrolysis products of vitamin B12 factor III by chromatography a cellulose powder column using mixtures of acetone + at most to 0 /, to PH I to 5 acidified water can be separated, whereby a basic substance, the "component a" as well as another crystallized substance, the "component b", be won.

4. The method according to claim I, characterized in that the vitamin B15 factor III in the temperature range from o to 37 ° to the action of concentrated hydrochloric acid and the resulting nucleotide of vitamin Bl2 factor III after neutralization or removing the hydrochloric acid with the aid of a carboxyl-containing cation exchanger is separated from the other breakdown products.

5. The method according to claim I, characterized in that the vitamin Bl2 factor III in the temperature range from o to 37 ° to the action of concentrated aqueous Subjected to perchloric acid solutions and the resulting after separation of the perchlorate Nucleotide with the help of a carboxyl-containing cation exchanger from the rest Degradation products is separated.

6. The method according to claim I, characterized in that the vitamin B12 factor III in the temperature range from o to 37 ° to the action of concentrated hydrochloric acid or concentrated aqueous perchloric acid and that brought to p, 7 to 9 Hydrolyzate through a column of a strongly basic anion exchanger in chloride or formate form, then the nucleotide trapped in the column washed with water and eluted with dilute hydrochloric acid or dilute formic acid will.

7. The method according to claim I, characterized in that from the according to claims 4, 5 and 6 obtained nucleotide of the vitamin Bl2 factor III in a weakly alkaline medium, such as. B. at pH 7.5 to 9, at temperatures of over 20 in the presence of rare earth salts such. B. Cer +++, with cleavage of phosphoric acid, the nucleoside of vitamin Bl2 factor III is formed, which is produced by the Rare earth hydroxides separated and for the purpose of further purification by a Column of a strongly basic anion exchanger is passed, with it is held on the column and then eluted with water.

8. The method according to claim I, characterized in that from the according to claims 4, 5 and 6 obtained nucleotide of the vitamin Bl2 factor III mainly due to the action of 4 to 8 N hydrochloric acid in the temperature range from 130 to 170 ° basic product »degradation product III« is formed.