DEA0020954MA

DEA0020954MA -

Info

Publication number: DEA0020954MA
Authority: DE

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

Tag der Anmeldung: 13. August 1954 Bekanntgemacht am 2. Februar 1956Registration date: August 13, 1954. Advertised on February 2, 1956

DEUTSCHES PATENTAMTGERMAN PATENT OFFICE

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Abbauprodukten des Vitamin-B₁₂-Faktors III durch hydrolytische Prozesse, wobei neue, bisher noch nicht beschriebene chemische Produkte erhalten werden, die niedermolekular sind und im ultravioletten Spektralbereich stark absorbieren.The invention relates to a process for the production of degradation products of vitamin B ₁₂ factor III by hydrolytic processes, new chemical products not yet described which are obtained which are low molecular weight and strongly absorb in the ultraviolet spectral range.

Unter den verschiedenen natürlichen Vitaminen der B₁₂-Gruppe besitzen nur das Vitamin B₁₂ selbst und der von der Anmelderin aufgefundene Vitamin-B₁₂-Faktor III antiperniciöse Wirksamkeit. Außerdem konnte die Anmelderin auf biosynthetischem Weg zu neuen Vitamin-B₁₂-Arten gelangen, die antiperniciös wirksam sind und in der Natur noch nicht aufgefunden wurden. Die Herstellung neuer biosynthetischer Cobalamine ist insofern bedeutungsvoll, als solche Produkte eventuell zusätzliche besonders wertvolle therapeutische Eigenschaften besitzen können.Among the various natural vitamins of the B ₁₂ group, only vitamin B ₁₂ itself and the vitamin B ₁₂ factor III discovered by the applicant have antipernicious activity. In addition, the applicant was able to use a biosynthetic route to obtain new _{types of vitamin B 12} which have an antipernicious effect and have not yet been found in nature. The production of new biosynthetic cobalamins is important in that such products may have additional particularly valuable therapeutic properties.

Die Biosynthese von Cobalaminen besteht darin, daß unter der Einwirkung von Fermenten, die z. B. in E. coli vorhanden sind, an Ätiocobalamin ein Nucleotid angelagert wird. Die Synthese des betreffenden Nucleotids wird von E. coli bewerkstelligt, wenn man ihm die entsprechende Base anbietet. Auf diese Weise gelangte die Anmelderin zu verschiedenen Benzimidazol-cobalaminen, wodurch manche Benzimidazole als »precursors« von besonderer Bedeutung für die Herstellung neuer Cobalamine wurden.The biosynthesis of cobalamines consists in that under the action of ferments that z. B. are present in E. coli, a nucleotide is attached to etiocobalamin. The synthesis of the subject E. coli can produce nucleotides if the appropriate base is offered to it. To this In a way, the applicant obtained various benzimidazole-cobalamines, whereby some benzimidazoles as "precursors" were of particular importance for the production of new cobalamins.

Diese Ausführungen machen es verständlich, daß der Herstellung von Abbauprodukten des Vitamin-B₁₂-Faktors III, die die betreffende Base enthalten,These statements make it understandable that the production of degradation products of vitamin B ₁₂ factor III, which contain the base in question,

509 656,172509 656.172

A 20954 IVa/30hA 20954 IVa / 30h

die Base selbst vorstellen oder Abbauprodukte der Base sind, eine beträchtliche Bedeutung beizumessen ist. Die Kenntnis und Gewinnung solcher Abbauprodukte; für die ein starkes Absorptionsvermögen im ultravioletten Bereich charakteristisch ist, bietet die Möglichkeit zur Biosynthese nicht nur des Vitamin-B₁₂-Faktors III, sondern eventuell noch anderer neuartiger und wertvoller Cobalamine.represent the base itself or are degradation products of the base, considerable importance is to be attached. The knowledge and extraction of such breakdown products; for which a strong absorption capacity in the ultraviolet range is characteristic, offers the possibility of biosynthesis not only of the vitamin B ₁₂ factor III, but also possibly other new and valuable cobalamins.

Es wurde nun die überraschende BeobachtungIt now became the surprising observation

to gemacht, daß aus dem Vitamin-B₁₂-Faktor III durch Einwirkung konzentrierter Salzsäure bzw. konzentrierter wäßriger Lösungen von Perchlorsäure (z. B. 70°/_Oiger) im Temperaturbereich von ο bis 37° im Laufe von einigen Stunden in praktisch quantitativer Ausbeute Ätiocobalamin gebildet wird unter gleichzeitiger Freisetzung eines Nucleotids, das nächfolgend als »Nucleotid des Vitamin-B₁₂-Faktors III« bezeichnet wird. Bei längerer Einwirkung der genannten Agenzien auf den Vitamin-B₁₂-Faktor III bleibt die Ausbeute an Nucleotid des Vitamin-B_}2-Faktors III praktisch konstant; die Ausbeute an Ätiocobalamin sinkt jedoch unter gleichzeitiger Bildung eines neuen kobalthaltigen Abbauproduktes, das die Anmelderin »Faktor la« nennt. Der Faktor Ia läßt sich durch sein Absorptionsspektrum sowie durch sein elektrophoretisches Verhalten vom Ätiocobalamin nicht unterscheiden, wphl aber sind die R-Werte und die CoIi-Aktivität der beiden Faktoren verschieden (vgl. Tabelle I).to made that from the vitamin B ₁₂ factor III by the action of concentrated hydrochloric acid or concentrated aqueous solutions of perchloric acid (z. B. 70 ° / _O iger) in the temperature range from ο to 37 ° in the course of a few hours in practically quantitative Yield Etiocobalamin is formed with the simultaneous release of a nucleotide which is hereinafter referred to as the "nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III". With prolonged action of the agents mentioned on the vitamin B ₁₂ factor III, the yield of nucleotide of the vitamin B _{} 2} factor III remains practically constant; however, the yield of etiocobalamin decreases with the simultaneous formation of a new cobalt-containing degradation product which the applicant calls "factor la". The factor Ia cannot be distinguished from the etiocobalamin by its absorption spectrum or by its electrophoretic behavior, but the R values and the CoIi activity of the two factors are different (see Table I).

Zur Gewinnung dieser beiden Produkte aus dem Vitamin-B₁₂-Faktor III wird das in der oben erwähnten Weise hergestellte Hydrolysat nach Entfernen der Salzsäure im Vakuum bzw. nach Abneutralisieren mit Kalilauge in Form eines TrockenpräparatesTo obtain these two products from vitamin B ₁₂ factor III, the hydrolyzate prepared in the above-mentioned manner is used in the form of a dry preparation after the hydrochloric acid has been removed in vacuo or after neutralization with potassium hydroxide solution

(z. B. nach dem Aufnehmen in Kieselgur und Trocknen im Vakuum) auf die Zellulosepulversäule gebracht; anschließend wird mit cyanidhaltigem wassergesättigtem n-Butanol entwickelt. Wie die Tabelle I zeigt, führt die Salzsäurehydrolyse unter anderem zur(e.g. after being taken up in kieselguhr and drying in vacuo) placed on the cellulose powder column; then it is developed with cyanide-containing water-saturated n-butanol. Like Table I. shows, the hydrochloric acid hydrolysis leads to, among other things

Bildung geringer Mengen an Ätiocobalamincarbonsäuren, die beim Perchlorsäureabbau nicht entstehen. Die Unterschiede in den R-Werten der in der Tabelle I angeführten Cobalamine sind der bremsenden Wirkung des Kaliumperchlorates zuzuschreiben.Formation of small amounts of etiocobalaminocarboxylic acids, which do not arise during perchloric acid degradation. The differences in the R values of the cobalamins listed in Table I are the retarding effect of potassium perchlorate.

Die Spaltung des Vitamin-B₁₂-Faktors III unter den oben angeführten Bedingungen geht z. B. bei 23⁰ sehr rasch vor sich und ist bereits nach 2 Stunden völlig beendet. Die Ausbeute an Ätiocobalamin erreicht bereits nach I¹Z₂ Stunden das Maximum, um dann allmählich abzusinken. Die Ausbeute an Faktor I a ist in den ersten 2 Stunden gering, steigt aber im Laufe von einigen Stunden beträchtlich an. Der. Faktor I a entsteht offenbar aus dem Ätiocobalamin, wie der ganze Reaktionsverlauf zeigt. -The cleavage of the vitamin B ₁₂ factor III under the conditions listed above goes, for. B. at 23 ⁰ very quickly and is already completely over after 2 hours. The yield of etiocobalamin already reaches ^{its maximum after I 1} Z ₂ hours and then gradually decreases. The yield of factor I a is low in the first 2 hours, but increases considerably over the course of a few hours. The. Factor I a evidently arises from the etiocobalamin, as the entire course of the reaction shows. -

Die Trennung des Nucleotids des Vitamin-B₁₂-Faktors III von den farbigen Komponenten der Hydrolysate gelingt erfindungsgemäß, durch die neuartige und sehr wichtige Beobachtung, daß gewisse stark basische Anionenaustauscher, wie z. B. Dowex-i, Dowex-2 und Amberlite JRA-400 (alle drei sind Polystyrolharze, enthalten quaternäre Ammoniumgruppen) in der Chlorid- bzw. Formiatform das Nucleotid des Vitamin-B₁₂-Faktors III aus neutralen bzw. schwach alkalischen wäßrigen Lösungen gut adsorbieren, wobei gleichzeitig die kobalthaltigen Anteile sich leicht mit Wasser auswaschen lassen. Nach Waschen der Säule mit Wasser, wobei außer den Cobalaminen auch Salze entfernt werden, läßt sich das Nucleotid des Vitamin-B₁₂-Faktors III bereits mit 0,002 n-HCl leicht eluieren. Es ist jedoch zweckmäßiger, etwas stärkere, z. B: 0,01 η-Salzsäure zu verwenden, um das Volumen des Eluates klein zu halten. Die hierbei erhältliche Elutionskurve ist symmetrisch,, woraus zu entnehmen ist, daß das Nucleotid des Vitamin-B₁₂-Faktors III einheitlich ist.The separation of the nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III from the colored components of the hydrolysates succeeds according to the invention, through the novel and very important observation that certain strongly basic anion exchangers, such as. B. Dowex-i, Dowex-2 and Amberlite JRA-400 (all three are polystyrene resins, contain quaternary ammonium groups) in the chloride or formate form, the nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III from neutral or weakly alkaline aqueous solutions adsorb, while at the same time the cobalt-containing components can easily be washed out with water. After washing the column with water, removing salts as well as the cobalamines, the nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III can be easily eluted with 0.002 n-HCl. However, it is more appropriate to use somewhat stronger, e.g. B: Use 0.01 η-hydrochloric acid in order to keep the volume of the eluate small. The elution curve obtained here is symmetrical, from which it can be seen that the nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III is uniform.

Es wurde weiterhin gefunden, daß gewisse carboxylhaltige Kationenaustauscher, wie z. B. Amberlite JRC-So-H⁺ , (carboxylhaltiges Acrylsäureharz) das Nucleotid des Vitamin-B₁₂-Faktors III nicht adsorbieren, sehr stark aber die Cobalamine. Durch aufeinanderfolgende Chromatographie des Nucleotids des Faktors III, z. B. an Dowex-2-HCl, Amberlite TRC-50-H+ und wieder Dowex-2-HCl läßt sich das Nucleotid in sehr reiner Form darstellen. Die Elution kann mittels eines Spektrophotometers verfolgt werden, da das Nucleotid des Faktors III im UV-Bereich stark absorbiert. Nach Einengen der Eluate zur Trockne, Aufnehmen des Rückstandes in sehr wenig Wasser und Zusatz von Aceton fällt das Nucleotid des VjtaminrB₁₂-Faktors III gummiartig aus und wird nach Entfernen der Lösungsmittel und Trocknen im Vakuum bald fest. Es besitzt im UV charakteristische Absorptionsmaxima, und zwar in 0,01 n-HCl und 289,5 πιμ E l°^A _m 139,5, bei p_H etwa 8,2 in Wasser und 291,5 m/i E₁ ¹*, 107,2, bei 248,5 ταμ E *„* i66,2.It has also been found that certain carboxyl-containing cation exchangers, such as. B. Amberlite JRC-So-H ⁺ , (carboxyl-containing acrylic acid _{resin) do not adsorb the nucleotide of vitamin B 12} factor III, but the cobalamins very strongly. By sequential chromatography of the factor III nucleotide, e.g. B. on Dowex-2-HCl, Amberlite TRC-50-H + and again Dowex-2-HCl, the nucleotide can be represented in a very pure form. The elution can be followed by means of a spectrophotometer, since the nucleotide of factor III absorbs strongly in the UV range. After concentrating the eluates to dryness, taking up the residue in very little water and adding acetone, the nucleotide of VjtaminrB ₁₂ -factor III precipitates like a rubber and soon solidifies after removal of the solvent and drying in vacuo. It has characteristic absorption maxima in the UV, namely in 0.01 n-HCl and 289.5 πιμ E l ° ^A _m 139.5, at p _H about 8.2 in water and 291.5 m / i E ₁ ¹ * , 107.2, at 248.5 ταμ E * "* i66.2.

Es enthält Phosphat und gibt eine stark positive Reaktion auf Zucker. Aus dem prozentuellen Phosphatgehalt des Nucleotids läßt sich ein Molekulargewicht von etwa 1490 für den Vitamin-B₁₂-Faktor III berechnen.It contains phosphate and gives a strong positive reaction to sugar. A molecular weight of about 1490 for vitamin B ₁₂ factor III can be calculated from the percentage phosphate content of the nucleotide.

Der Abbau des Nucleotids. des Vitamin-B₁₂-Faktors III mit 6 n-HCl bei ioo° geht sehr langsam vor sich, und es werden in 24 Stunden erst etwa 65 °/₀ der Phosphorsäure freigesetzt. Es entsteht dabei ein basisches Produkt, das folgende Absorptionsmerkmale besitzt: in 0,01 n-HCl Maxima bei 289 und 252 m/i, Minima bei 268 und 238 αιμ, bei p_H 8,2 in Wasser Maxima bei 291 und 249 ταμ, Minima bei 270 und 233 ταμ. The breakdown of the nucleotide. Vitamin B ₁₂ -factor III with 6N-HCl at ioo ° is very slow, and there are only approximately ° released within 24 hours _65/0 of phosphoric acid. The result is a basic product that has the following absorption characteristics: in 0.01 n-HCl maxima at 289 and 252 m / i, minima at 268 and 238 αιμ, at p _H 8.2 in water maxima at 291 and 249 ταμ, Minima at 270 and 233 ταμ.

Diese basische Substanz, die vorläufig als »Abbauprodukt IIcc bezeichnet wird, wird in folgender Weise in reinem Zustand erhalten: Einengen des Hydrolysate im Vakuum, Entfernen der HCl über Ätznatron, Aufnehmen des Rückstandes in Wasser, Alkalisieren auf Ph 7,5 bis 8,2, Durchlassen dieser Lösung durch eine Säule aus Dowex-2-HCl und Eluieren mit Wasser, wobei das Produkt im Eluat erscheint.This basic substance, which is provisionally referred to as "breakdown product IIcc", is in the following way Preserved in the pure state: Concentration of the hydrolyzate in vacuo, removing the HCl using caustic soda, taking up the residue in water, alkalizing to Ph 7.5 to 8.2, passing this solution through a column of Dowex-2-HCl and eluting with water, the product appearing in the eluate.

Der Abbau des Nucleotides des- Vitamin-B₁₂-Faktors III mit 6 n-HCl bei 150° geht rasch vor sich, wobei die Phosphorsäure in etwa 3 Stunden quantitativ freigesetzt wird. Es entsteht dabei ein basisches Produkt, das folgende Merkmale besitzt: Schmelzpunkt 219 bis 220° (unter Zersetzen, Kofier-Mikroskop); Summenformel C₇H₆N₂O; Absorptionsdaten: in 0,01 NHCl Maximum bei 286 m/i, ■ Minimum bei 260 ταμ, bei p_H etwa 8,2 in Wasser Maxima bei 286The breakdown of the nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III with 6 n-HCl at 150 ° proceeds rapidly, with the phosphoric acid being released quantitatively in about 3 hours. The result is a basic product which has the following characteristics: melting point 219 to 220 ° (with decomposition, Kofier microscope); Molecular Formula C ₇ H ₆ N ₂ O; Absorption data: ταμ ■ minimum at 260 in 0.01 N HCl maximum at 286 m / i, wherein p _H about 8.2 in water maxima at 286

656/172656/172

A 20954 IVa /30 hA 20954 IVa / 30 h

und 246 ταμ, Minima bei 263 und 232 ταμ, in 0,1 n-KOH Maximum bei 306 ταμ, Minimum bei 271 ταμ. and 246 ταμ, minima at 263 and 232 ταμ, in 0.1 n-KOH maximum at 306 ταμ, minimum at 271 ταμ.

Die Base gibt mit Millons Phenol-Reagens einen roten Niederschlag und entfärbt in wäßriger Lösung sofort Permanganat unter praktisch völliger Zerstörung des chromophoren Systems (Verschwinden der charakteristischen Absorption im UV).The base gives a red precipitate with Millon's phenol reagent and decolorizes in aqueous solution Immediately permanganate with practically complete destruction of the chromophoric system (disappearance the characteristic absorption in the UV).

Diese Substanz ist mit dem Abbauprodukt II nicht identisch. Sie wird vorläufig »Abbauprodukt III« genannt. Wohl aber ist sie identisch mit der »Komponente a«, die man durch direkten Abbau des Vitamin-B₁₂-Faktors III erhalten kann, wie weiter unten beschrieben wird. Die Reinigung des Abbauproduktes III erfolgt in der gleichen Weise wie die des Abbauproduktes II. .This substance is not identical to the degradation product II. It is provisionally called "degradation product III". It is, however, identical to "component a", which can be obtained by direct degradation of vitamin B ₁₂ factor III, as will be described below. The degradation product III is purified in the same way as that of the degradation product II.

Die Gewinnung des Nucleosids des Faktors III gelang überraschenderweise unter der katalytischen Wirkung von Salzen seltener Erden. Diese Methode wurde bereits zur Abspaltung esterartig gebundener Phosphorsäure aus gewissen Naturprodukten verwendet; es war aber keinesfalls vorauszusehen, daß sie im vorliegenden Fall zum Ziel führen würde. Sie wurde bisher auch noch nicht in der Vitamin-B₁₂-Forschung benutzt. Es wurde gefunden, daß in verdünnten, z. B. 2 · io-⁶-molaren Lösungen des Nucleotide des Faktors III bei Verwendung eines 5- bis 2ofachen Überschusses an Salzen der seltenen Erden, wie z. B. an Ce(NO₃)₈ 6 H₂O bei p_H 7,5 bis 9 und Temperaturen von über 20° unter rascher Abspaltung von Phosphorsäure das Nuqleosid des Faktors III entsteht.The extraction of the nucleoside of factor III surprisingly succeeded under the catalytic effect of salts of rare earths. This method has already been used to split off ester-like bonded phosphoric acid from certain natural products; but it was by no means foreseeable that it would lead to the goal in the present case. It has also not yet been used in vitamin B ₁₂ research. It has been found that in dilute, e.g. B. 2 · io- ⁶ molar solutions of the nucleotides of factor III when using a 5- to 2-fold excess of rare earth salts, such as. B. of Ce (NO ₃₎ ₈ 6 H ₂ O at _pH 7.5 over 20 ° arises to 9 and temperatures with rapid elimination of phosphoric acid, the Nuqleosid of factor III.

Zur präparativen Gewinnung dieses Nucleosids wird nach beendeter Reaktion (nach völliger Abspaltung des Phosphats) die trübe (Cer-hydroxyd enthaltende) Lösung klar zentrifugiert, durch eine Säule aus z. B. Dowex-2-HCl langsam durchgelassen. Dabei wird das Nucleosid festgehalten und dann mit Wasser eluiert. Nach wiederholter Chromatographie erhält man das Nucleosid in reiner Form. Das Absorptionsspektrum des Nucleosids gleicht dem des Nucleotids. For the preparative production of this nucleoside, after the reaction has ended (after complete cleavage of the phosphate) the cloudy (cerium hydroxide containing) solution is centrifuged clear, through a Column from z. B. Dowex-2-HCl let through slowly. The nucleoside is held and then with Water elutes. After repeated chromatography, the nucleoside is obtained in pure form. The absorption spectrum of the nucleoside is similar to that of the nucleotide.

Bei der Hydrolyse des Vitamin-B₁₂-Faktors III mit 6n-HCl bei 150⁰ während 20 Stunden erhält man zwei im UV-Bereich absorbierende Abbauprodukte. Die Trennung und Reinigung dieser Abbauprodukte wurde erfindungsgemäß durch die wichtige Beobachtung ' ermöglicht, daß nach dem Einengen der Hydrolysate im Vakuum und Trocknen des Rück-When the vitamin B ₁₂ factor III is hydrolyzed with 6n HCl at 150 ^° for 20 hours, two degradation products absorbing in the UV range are obtained. The separation and purification of these degradation products was made possible according to the invention by the important observation that after concentrating the hydrolyzates in vacuo and drying the back

Standes, z. B. über Ätznatron und Calziumchlorid, bei der anschließenden Extraktion mit Wasser oder verdünnter Salzsäure fast sämtliche Farbstoffe zurückbleiben und nur die im UV absorbierenden Abbauprodukte des Vitamin-B₁₂-Faktors III in Lösung gehen. Die so gewonnenen, leicht rotbraungefärbten Extrakte werden im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, mit etwas Kieselgur vermengt und getrocknet. Durch systematische Versuche wurde gefunden, daß durch Chromatographie dieser so gewonnenen Trockenpräparate an einer Säule aus Zellulosepulver unter Verwendung von Aceton + Wasser bzw. Aceton + verdünnte Salzsäure als Entwickler zwei im UV absorbierende Komponenten erhältlich sind. Es ist notwendig, zunächst mit fast reinem Aceton zu entwickeln und die Menge an Wasser bzw. verdünnter Salzsäure allmählich zu steigern. Beim Entwickeln mit z. B. Aceton + 5% 0,1 n-HCl läßt sich die schnellere Komponente, (von der Anmelderin als »Komponente a.« bezeichnet) eluieren.Standes, z. B. caustic soda and calcium chloride, in the subsequent extraction with water or dilute hydrochloric acid, almost all of the dyes remain and only the UV-absorbing degradation products of vitamin B ₁₂ factor III go into solution. The slightly reddish-brown extracts obtained in this way are concentrated to a small volume in vacuo, mixed with a little kieselguhr and dried. Systematic tests have found that chromatography of these dry preparations obtained in this way on a column made of cellulose powder using acetone + water or acetone + diluted hydrochloric acid as developer makes it possible to obtain two UV-absorbing components. It is necessary to first develop with almost pure acetone and gradually increase the amount of water or dilute hydrochloric acid. When developing with e.g. B. acetone + 5% 0.1 n-HCl, the faster component (designated by the applicant as "component a." ) Can be eluted.

Sie ist nach ihrem Absorptionsspektrum und ihrem papierchromatographischen Verhalten identisch mit dem Abbauprodukt III. Bei weiterer Steigerung des Wassergehaltes läßt sich z.B. mit Aceton + 15% 0,1 n-HCl das langsamer wandernde Abbauprodukt (von der Anmelderin »Komponente h« genannt) in reiner Form gewinnen. Die Komponente b konnte nach mehrmaliger Chromatographie, Einengen und Zusatz von Aceton in kristallisierter Form erhalten werden. Ihr Absorptionsspektrum besitzt folgende Merkmale: in 0,01 n-HCl Maxima bei 290 und 255 ταμ, Minima bei 270 und 248 ταμ; bei p_H 8,2 in Wasser Maxima bei 289 und 252 ταμ, Minima bei 273 und 244 ταμ. According to its absorption spectrum and its paper chromatographic behavior, it is identical to the degradation product III. With a further increase in the water content, for example with acetone + 15% 0.1 n-HCl, the more slowly migrating degradation product ( called "component h" by the applicant) can be obtained in pure form. Component b could be obtained in crystallized form after repeated chromatography, concentration and addition of acetone. Their absorption spectrum has the following characteristics: in 0.01 n-HCl maxima at 290 and 255 ταμ, minima at 270 and 248 ταμ; ταμ minima at _pH 8.2 in water maxima at 289 and 252, at 273 and 244 ταμ.

example 1

1,5 mg des Vitamin-B₁₂-Faktors LII werden mit 0,1 ecm 70%iger Perchlorsäure versetzt und 12 Stunden bei 23⁰ stehengelassen. Anschließend wird das Hydrolysat mit etwas Wasser verdünnt, mit 1 Tropfen io°/₀iger Blausäure versetzt und mit 0,5 n-KOH bis zum Farbumschlag in Violett titriert (Verbrauch etwa 2,4ecm 0,5 n-KOH). Das auf p_H 6 bis 7 abneutralisierte Hydrolysat wird im Vakuum auf 0,1 bis 0,5 ecm eingeengt, in etwas Kieselgur aufgenommen, im Vakuum getrocknet und auf einer■ Zellulosesäule chromatographiert. Säulendurchmesser 1,15 cm, Höhe 10 cm. Entwickler: CN'-haltiges wassergesättigtes n-Butanol. Während der Entwicklung des Chromatogramms werden an der Säule sehr bald zwei violette Zonen sichtbar, von denen die untere (vom R-Wert 0,4) das Ätiocobalamin, die obere (vom R-Wert 0,2) der Faktor Ia ist. Nach dem Eluieren, Extrahieren mit Wasser und Entfernen des Butanols werden die beiden Faktoren in reiner Form erhalten.1.5 Vitamin B mg ₁₂ -factor LII are mixed with 0.1 cc of 70% perchloric acid are added and allowed to stand for 12 hours at 23 ^0th Subsequently, the hydrolyzate is diluted with a little water, with 1 drop of io ° / ₀ was added sodium cyanide and 0.5 with KOH-n until the color turns to violet titrated (consumption 2,4ecm about 0.5N KOH). The hydrolyzate abneutralisierte to p _H 6 to 7 is concentrated in vacuum to 0.1 to 0.5 cc, was added to some kieselguhr, dried and chromatographed in a vacuum on a ■ cellulose column. Column diameter 1.15 cm, height 10 cm. Developer: CN'-containing water-saturated n-butanol. During the development of the chromatogram, two violet zones very soon become visible on the column, of which the lower (with an R value of 0.4) is etiocobalamin, the upper (with an R value of 0.2) is factor Ia. After eluting, extracting with water and removing the butanol, the two factors are obtained in pure form.

Example 2

70 mg Vitamin-B₁₂-Faktor III werden in 5 ecm 70%iger Perchlorsäure gelöst und 2 Stunden lang bei 23⁰ stehengelassen. Dann wird das Hydrolysat mit etwas Wasser verdünnt, mit einigen Tropfen io°/₀iger Blausäure versetzt und mit 2 n-KÖH bis zum Farbumschlag in Violett titriert (Verbrauch etwa 30 ecm). Nach dem Stehenlassen im Kühlraum über Nacht wird das auskristallisierte Kaliumperchlorat abgetrennt, das Filtrat auf etwa p_H 8 eingestellt und durch eine Säule aus Dowex-2-HCl (Durchmesser 1,15 cm, Höhe 25 cm) durchgelassen, wobei die gefärbten Abbauprodukte des Vitamin-B₁₂-Faktors III die Säule passieren, während das Nucleotid des Vitamin-B₁₂-Faktors III in der Säule festgehalten wird. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird das Nucleotid mit · 0,01 n-HCl eluiert, das Eluat im Vakuum bis zur Trockne eingeengt, der Rückstand in 20 ecm Wasser aufgenommen, auf p_H etwa 8 eingestellt, die rosagefärbte Lösung durch eine Säule aus Amberlite JRC-50-H+ (Durchmesser 1,15 cm, Höhe 40 cm)70 mg Vitamin _B-12 factor III are dissolved in 5 cc of 70% perchloric acid and allowed to stand for 2 hours at 23 ^0th Then the hydrolyzate is diluted with a little water, a few drops of io ° / ₀ was added sodium cyanide and 2-n KOEH until the color turns to violet titrated (consumption about 30 cc). After standing in the refrigerator overnight, the crystallized potassium perchlorate is separated, the filtrate is adjusted to about p _H 8 and through a column of Dowex-2-HCl (diameter 1.15 cm, height 25 cm) transmitted, wherein the colored degradation products of vitamin -B ₁₂ -factor III pass through the column while the nucleotide of vitamin-B ₁₂ -factor III is captured in the column. After washing the column with water, the nucleotide with · 0.01 N HCl is eluted, the eluate in vacuo to dryness, the residue taken up in 20 cc of water, adjusted to p _H about 8, the pink-colored solution through a column made of Amberlite JRC-50-H + (diameter 1.15 cm, height 40 cm)

509 656/172509 656/172

A 20954 IVa/30 hA 20954 IVa / 30 h

langsam durchgelassen und die Säule anschließend mit Wasser nachgewaschen, wobei die Farbstoffe an der Säule festgehalten werden, während das Nucleotid des Vitamin-B₁₂-Faktors III in Form einer farblosen Lösung im Durchlauf erscheint. Nach dem Einengen der bei 290 τημ absorbierenden Fraktionen im Vakuum auf etwa 10 ecm und anschließender Chromatographie an einer Säule (Durchmesser 0,6 cm, Höhe 7 cm) aus Dowex-2-HCl, Einengen der Eluate bis zur Trockne, Aufnehmen des Rückstandes in 1 bis 2 Tropfen Wasser und Zusatz von etwas Aceton fällt das Nucleotid in gümmiartiger Form aus. Nach Abtrennen der Lösungsmittel erstarrt das Nucleotid und läßt sich zu einem Pulver zerreiben.slowly let through and the column then washed with water, the dyes being retained on the column, while the nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III appears in the form of a colorless solution in the flow. After concentrating the fractions absorbing at 290 τημ in vacuo to about 10 ecm and subsequent chromatography on a column (diameter 0.6 cm, height 7 cm) made of Dowex-2-HCl, concentrating the eluates to dryness, taking up the residue in 1 to 2 drops of water and the addition of a little acetone precipitate the nucleotide in a rubber-like form. After the solvents have been separated off, the nucleotide solidifies and can be ground to a powder.

. Beispiel 3. Example 3

10 ecm eines 0,25 n-Ammoniumchlorid-Ammoniak-Puffers vom p_H 8,6, enthaltend etwa 2 · io~^e Mol Nucleotid desVitamin-B₁₂-Faktors III und 4 · io~⁵Mol Ce(NOg)₃-OH₂O werden bei 50⁰ 100 Minuten lang geschüttelt. Sodann wird die trübe Flüssigkeit10 cc of a 0.25 N ammonium chloride-ammonia buffer of p _H 8.6, containing about 2 x io ~ ^e Mol nucleotide desVitamin _12-B-factor III and 4 x io ~ ⁵ moles of Ce (NOG) ₃ -OH ₂ O are ^{shaken at 50 0 for} 100 minutes. Then the liquid becomes cloudy

■ ■ zentrifugiert, das klare Zentrifugat durch eine Säule aus Dowex-2-HCl (Durchmesser 0,6 cm, Höhe 7 cm) durchgelassen, wobei das entstandene Nucleosid an der Säule adsorbiert bleibt. Es wird dann mit Wasser entwickelt, wobei sich das Nucleosid in den bei 290 τημ absorbierenden Fraktionen befindet.■ ■ centrifuged, the clear centrifugate passed through a column of Dowex-2-HCl (diameter 0.6 cm, height 7 cm), the resulting nucleoside remaining adsorbed on the column. It is then developed with water, the nucleoside being in the fractions absorbing at 290 τημ.

Example 4

ι mg des Nucleotids des Vitamin-B₁₂-Faktors III wird in 1 ecm 6 n-H Cl gelöst und im zugeschmolzenen Glasrohr 3,Stunden auf 150⁰ erhitzt. DasHydrolysat wird im Vakuum über Calciumchlorid und Ätznatron getrocknet, der Rückstand an 2 ecm Wasser aufgenommen, auf p_H etwa 8 gebracht und durch eine Säule aus Dowex-2-HCl (Durchmesser 0,6 cm, Höhe 7 cm) durchlaufen gelassen, wonach die Säule mit Wasser gewaschen wird. Die bei 286 τημ absorbierenden Fraktionen enthalten das basische Abbauprodukt des Nucleotids (»Abbauprodukt III«·, »Komponente a«).ι mg of the nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III is dissolved in 1 ecm 6 nH Cl and heated ^{to 150 0 in a sealed glass tube for 3 hours.} DasHydrolysat is dried in vacuo over calcium chloride and caustic soda, the residue taken up in 2 cc of water, brought to p _H about 8 and passed through a column of Dowex-2-HCl (diameter 0.6 cm, height 7 cm) run through, after which the Column is washed with water. The fractions absorbing at 286 τημ contain the basic degradation product of the nucleotide (»degradation product III« ·, »component a«).

Example 5

ι mg des Nucleotids des Vitamin-B₁₂-Faktors III wird in 1 ecm 6 n-H Cl gelöst und im zugeschmolzeneh Glasrohr 30 Stunden auf ioo° erhitzt. Die Weiterverarbeitung des Hydrolysates erfolgt, wie im Beispiel 4 beschrieben. Die bei 290 τημ absorbierenden Fraktionen enthalten das basische Abbauprodukt des Nucleotids (»Abbauprodukt II«).ι mg of the nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III is dissolved in 1 ecm 6 nH Cl and heated to 100 ° in a sealed glass tube for 30 hours. The further processing of the hydrolyzate takes place as described in Example 4. The fractions absorbing at 290 τημ contain the basic degradation product of the nucleotide ("degradation product II").

Example 6

60 mg Vitamin-B₁₂-Faktor III werden in 5 ecm 6 n-HCl 20 Stunden lang auf 150° erhitzt. Das Hydrolysat wird im Vakuum über Calciumchlorid und Ätznatron zur Trockne gebracht, der Rückstand mit 5 ecm 0,1 n-HCl verrührt, durch eine kleine Glassinternutsche G 3 filtriert, das Filtrat im Vakuum auf 0,2 bis 0,5 ecm eingeengt, mit etwas Kieselgur vermengt und im Vakuum getrocknet. Das trockene Kieselgurpräparat wird auf eine Zellulosepulversäule (Durchmesser 1,15 cm, Höhe 20 cm) gebracht. Man entwickelt mit Aceton, das steigende Mengen an 0,1 n-HCl enthält. Mit Aceton + 5 % 0,1 n-HCl wird aus der Säule die basische Komponente a (identisch mit dem Abbauprodukt III) eluiert, die weitere Entwicklung mit Aceton + 15% 0,1 n-H Cl ergibt die saure Komponente b.60 mg of vitamin B ₁₂ factor III are heated to 150 ° for 20 hours in 5 ecm 6 n HCl. The hydrolyzate is brought to dryness in vacuo over calcium chloride and caustic soda, the residue is stirred with 5 ecm 0.1 N HCl, filtered through a small G 3 sintered glass funnel, the filtrate is concentrated in vacuo to 0.2 to 0.5 ecm with mixed some kieselguhr and dried in vacuo. The dry kieselguhr preparation is placed on a cellulose powder column (diameter 1.15 cm, height 20 cm). Develop with acetone containing increasing amounts of 0.1 N HCl. The basic component a (identical to the degradation product III) is eluted from the column with acetone + 5% 0.1 n HCl, the further development with acetone + 15% 0.1 nH Cl results in the acidic component b.

Table I.

Cobalamine aus Vitamin-B₁₂-Faktor III und Vitamin B₁₂, gewonnen durch Abbau mit konzentrierter Salzsäure bzw. 7o°/₀iger Perchlorsäure bei 23⁰. Perchlorsäurehydrolysate samt den Salzen (Kaliumperchlorat) chromatographiert.Cobalamins from vitamin B ₁₂ and vitamin B-factor III _12, obtained by digestion with concentrated hydrochloric acid and 7o ° / ₀ perchloric acid at 23 ^0th Perchloric acid hydrolysates together with their salts (potassium perchlorate) are chromatographed.

CobalaminCobalamin

R-Wert a. d. Zellulosesäule
Perchlorsäure-
HydrolyseR-value on cellulose column
Perchloric acid
hydrolysis

Salzsäure-Hydrolyse Hydrochloric acid hydrolysis

ColiaktivitätColi activity

(a)(a)

Farbe a. d.Color a. d.

chromato-chromato-

graphischengraphic

Säulepillar

Stabilitätstability

des
CN-Komplexesof
CN complex

Elektro-Electrical

phoretischesphoretic

Verhaltenbehavior

Ätiocobalamin-carbonsäure χ Etiocobalamin carboxylic acid χ

Ätiocobalamin-carbonsäure y :......Etiocobalamin-carboxylic acid y: ......

Vitamin-B₁₂-Faktor IIIVitamin B ₁₂ factor III

Faktor Ia Factor Ia

ÄtiocobalaminEtiocobalamin

(Faktor -I) : (Factor -I) :

0,010.01

0,040.04

0,10.1

0,30.3

0,50.5

0,05
0,20.05
0.2

o,4-o, 4-

inaktivinactive

aktivactive

sehr geringvery low

aktiv (c)active (c)

(a) Aktivität gegenüber der E. coli-Mutante 313—3.(a) Activity against E. coli mutant 313-3.

(b) Bei pn 4,5 bis 5 und Zimmertemperatur.(b) At pn 4.5 to 5 and room temperature.

(c) Ebenso wie das natrve Produkt aus Faulschlamm.(c) Just like the natural product from digested sludge.

Violettviolet

Rot
BlauviolettRed
Blue violet

Violettviolet

sehr geringvery low

sehr gering
sehr stabil
stabiler als
Faktor I
sehr geringvery low
very stable
more stable than
Factor I.
very low

wie Faktor Ilike factor I.

Claims

PATENT CLAIMS:

i. Process for the production of low molecular weight,

'Substances that are strongly absorbing in the ultraviolet spectral range from the vitamin B ₁₂ factor III, characterized in that the vitamin B ₁₂ factor III or its degradation products are subjected to hydrolytic processes and the hydrolysis products are purified by chromatographic processes.

2. The method according to claim 1, characterized in that the vitamin B ₁₂ factor III is the

656/172

A 20954 IVa/30hA 20954 IVa / 30h

Effect of 4 to 8 η-hydrochloric acid at 130 to 170 ° during ( ¹ Z ₂ to 30 hours) is subjected and that after removal of the hydrochloric acid, the hydrolysis products absorbing in the ultraviolet spectral range separated by chromatography with the aid of a cellulose powder column using aqueous acetone as a developer will.

3. Process according to claims 1 and 2, characterized in that the hydrolysis. Vitamin B ₁₂ -factor III products chromatographically using an Zellülosepulversäule using mixtures of acetone + most 20 ° / ₀ are isolated on p _H 1 to 5 acidified water, wherein a basic substance, the "component a", and another crystallized substance, the "component b", can be obtained.

4. The method according to claim 1, characterized in that the vitamin B ₁₂ factor III in the temperature range from ο to 37 ⁰ subjected to the action of concentrated hydrochloric acid and the resulting nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III after neutralizing or removing the hydrochloric acid with the help of a carboxyl-containing cation exchanger from the other degradation products

separates.

5. The method according to claim 1, characterized in that the vitamin B ₁₂ factor III in the temperature range from 0 to 37 ^{0 is} subjected to the action of concentrated aqueous perchloric acid solutions and after separation of the perchlorate. ons the resulting nucleotide is separated from the other degradation products with the help of a carboxyl-containing cation exchanger.

6. The method according to claim. 1, characterized in that the vitamin B in the temperature range of ο subjected to ₁₂ factor III to 37 ⁰ of the action of concentrated hydrochloric acid or concentrated aqueous perchloric acid and the hydrolyzate to p _H 7 placed to 9 through a column of a strongly basic anion exchanger in Chloride or formate form is allowed through, then the nucleotide retained in the column is washed with water and eluted with dilute hydrochloric acid or dilute formic acid.

7. The method according to claim 1, characterized in that from the according to claims 4, 5 and 6 obtained nucleotide of vitamin B ₁₂ factor III in a weakly alkaline medium, such as. B. at _pH 7.5 to 9, more rarely at temperatures of about 20 ° in the presence of salts earths such. B. Cer +++, with elimination of phosphoric acid, the nucleoside of vitamin B ₁₂ -factor III is formed, which is separated from the hydroxides of the rare earths and passed through a column of a strongly basic anion exchanger for further purification, whereby it is retained on the column and then eluted with water.

8. The method according to claim 1, characterized in that from the nucleotide of the vitamin B ₁₂ factor III obtained according to claims 4, 5 and 6 by the action of 4 to 8 N hydrochloric acid in the temperature range from 130 to 170 ⁰ mainly a basic one Product »degradation product III « is formed.

1 509 656/172 1.56