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Verfahren zur Herstellung von Derivaten der 7 -Aminocephalosporansäure u. ähnl. Verbindungen
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von antibiotisch wirksamen Verbindungen, nämlich von Derivaten der 7-Aminocephalosporansäure und ähnlichen Verbindungen.
Es wurde festgestellt, dass durch Behandlung von Cephalosporin C mit Säure das Molekül unter bestimmten Bedingungen in zwei Teile gespalten werden kann, nämlich in ein komplexes Ringsystem sowie eine Seitenkette, die als a-Aminoadipinsäure identifiziert wurde. Die Seitenkette haftet an der Aminogruppe eines komplexen Ringsystems in 7-Stellung. Diese als 7-Aminocephalosporansäure (Cephalosporin C-Kern) bezeichnete Verbindung entspricht der Formel
EMI1.1
Durch weitere Verseifung der Acetylestergruppe kann ein Lakton (Cephalosporin Cc-Kern) der folgenden Formel erhalten werden
EMI1.2
Durch Substitution des Acetylrestes der 7 -Aminocephalosporansäure mit einer tertiären Aminogruppe kann eine Verbindung mit einer schwach basischen quaternären Aminogruppe erhalten werden.
Die Verbindung mit Betaincharakter entspricht der allgemeinen Formel
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enthaltenden Acylierungsmittel, wobei R und R die oben angeführte Bedeutung haben, behandelt wird.
Als Acylierungsmittel können geeignete funktionelle Derivate der Säure RCH. COOH, z. B. ein Säurehalogenid, verwendet werden. Die Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze der Derivate können aus den Acylierungsprodukten durch Behandlung mit Natrium-, Kalium-bzw. Ammoniumhydroxyd hergestellt werden.
Wenn X den Rest des Kerns einer Cephalosporin CA-Verbindung darstellt, so ist der bevorzugte Rest der des Cephalosporin CA (Pyridin).
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pen sein, wobei Gruppen mit 1-10 Kohlenstoffatomen und insbesondere solche mit 1 - 6 Kohlenstoffatomen vorgezogen werden. Wenn eines der Symbole R oder R eine substituierte Phenylgruppe darstellt, werden Gruppen mit Nitro-, Chlor-, Alkyl- und Alkoxy-Substituenten bevorzugt. Von den Alkoxygruppen wären insbesondere die Methoxy- und Äthoxygruppen hervorzuheben.
Zu Verbindungen obiger Formel, denen eine besondere Bedeutung zukommt, zählen : die Phenylacetyl-, Phenoxyacetyl-, n-Propionyl-, cc-Phenoxypropionyl-und Isobutyryl-Derivate des Kerns von Cephalosporin C, Cephalosporin Cc und Cephalosporin CA (Pyridin). Von Interesse sind ferner die Hexanoyl-, p-Nitrophenylacetyl-und p-Nitrophenoxyacetyl-Derivate des Kerns von Cephalosporin C, Cephalosporin c. und Cephalosporin CA (Pyridin).
Der zu acylierende Kern kann gewünschtenfalls in dem Reaktionsgemisch durch Säurebehandlung der Cephalosporin C-, Cephalosporin Cc- oder einer Cephalosporin CA-Verbindung in situ hergestellt werden. Nach der Säurebehandlung und vor der Acylierung wird die Lösung vorzugsweise auf einen pH-Wert von ungefähr 6 bis 7 gepuffert. Zum Konzentrieren des Kerns kann bei einem solchen Verfahren zweckmässig die den Kern enthaltende Lösung mit einem stark basischen Anionen-Austauscherharz in Acetatform in Kontakt gebracht werden, wonach nach Eluierung mit Essigsäure die den Kern enthaltenden Fraktionen gesammelt werden. Ein hiefür hervorragend geeignetes Harz ist Dowex-1 X8 in Acetatform, ein geeignetes Eluierungsmittel ungefähr 0, 5 n-n Essigsäure.
Wie schon zuvor erwähnt, können, wenn R, und R, für Alkylgruppen stehen, diese Gruppen ziemlich gross sein. Wenn R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe und R eine Alkylgruppe bedeuten, soll die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome in den Gruppen R und R vorzugsweise 4 betragen und erwünschterweise nicht grösser als 4 sein. Wenn rot eine Phenyl-, eine Phenoxy-, eine substituierte Phenyl- oder eine substituierte Phenoxygruppe und R eine Alkylgruppe bedeutet, enthält R vorzugsweise 1 Kohlenstoffatom und erwünschterweise nicht mehr als 3-4 Kohlenstoffatome.
Die Erfindung soll an Hand folgender Beispiele erläutert werden : Beispiel l : Überführung von 7-Aminocephalosporansäure (hergestellt in situ in Lösung durch Säurebehandlung von Cephalosporin C) in das Phenylacetylderivat dieser Säure (Benzylcephalosporin).
300 cm3 Aceton, die 3 cm3 Phenylacetylchlorid enthielten, wurden einer abgekühlten wässerigen Lösung von 7-Aminocephalosporansäure zugesetzt und der pH-Wert auf 7 eingestellt. Es wurde sodann 1 h stehen und die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen gelassen, wonach das Aceton durch Destillation im Vakuum entfernt wurde. Das Volumen des wässerigen Rückstandes betrug jetzt 325 cm\ der PHWert 5, 9. Zwecks Entfernung von nicht abdestilliertem Aceton wurde mit 2 x 150 cms Benzol extrahiert, dann der p-Wert mit sirupöser Phosphorsäure auf 3, 3 eingestellt und die Lösung noch zweimal mit
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X 150 cmTiBenzylcephalosporin hingegen nicht.
Zur Vervollständigung dieser Extraktion wurde der pH-Wert der Lösung, der auf 3, 8 angestiegen war, auf 3, 3 rückgebracht und die Extraktion mit 3 x 150 cms Benzol fortgesetzt. Der pH-Wert wurde dann mit Phosphorsäure auf 2, 5 gesenkt und die Lösung mit 3 x 150 CM3 Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 2 x 30 cm3 Wasser gewaschen und nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat im Vakuum auf 2 - 3 cm3 eingeengt. Ein Zusatz von 10 bis 15 Vol. Petroläther (Sp. 60-80 C) bewirkte die Ausfällung einer gelben Substanz (97 mg), welche abzentrifugiert, mehrmals mit bei 40 - 600C siedendem Petroläther gewaschen und dann im Vakuumexsikkator getrocknet wurde. Hierauf wurde wieder in Äthylacetat (2 cm3) aufgelöst ; sodann wurden 10 bis 15 Vol. Äther zugesetzt.
Dieser Zusatz bewirkte eine Ausfällung eines kleinen Anteils einer Substanz, die nicht verwertet wurde.
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n/10 Natriumhydroxydlösung bis zu einem PH = 6 titriert ; während der Titration ist ein stärkeres Rühren erforderlich. Ein kleiner Anteil an unlöslichem Material wurde filtriert und die wässerige Lösung der Gefriertrocknung unterworfen, wobei eine etwas klebrige Substanz zurückblieb. Diese wurde in einem Minimum einer Mischung von Aceton : Wasser 9:1 (# 1 cm3) gelöst und durch Zusatz von wasserfreiem Aceton ausgefällt. Es bildete sich ein flockiger Niederschlag von feinen, farblosen Nadeln (31, 2 mg). Eine weitere Reinigung wurde vorgenommen, indem in wässerigem Aceton wieder gelöst und nochmals mit wasserfreiem Aceton ausgefällt wurde.
Physikalische Eigenschaften des kristallinen Natriumsalzes des Benzylcephalosporin :
Bei Erhitzung wurde das Natriumsalz dunkler und zersetzte sich bei 1600C.
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28 + 1220U. V. Spektrum in Wasser : X 259 m E1% 190. max 1cm # 234 m E1% 138,5. mm 1 cm
I. R.-Spektrum :
Das Infrarotspektrum in Nujol mull. ist in Fig. 1 gezeigt.
Papier-Chromatographie :
Das verwendete Fliessmittelsystem war Butanol : Äthanol : Wasser (4 : 1 : 5). Die obere Phase aus dieser Mischung wurde auf Whatman Nr.1-Papier, gepuffert auf PH = 6, fliessen gelassen. RF = 0, 65 bis 0, 67.
Elektrophorese :
Die Wanderungen zu der Anode gingen ungefähr mit derselben Geschwindigkeit vor sich wie bei Penicillin G in Kollidinacetat-Puffer bei PH = 7, 0.
Die Wirksamkeit der 7-Phenylacetamidocephalosporansäure (Benzylcephalosporin) gegenüber verschiedenen Bakterien wurde mittels der Reihenverdünnungsmethode (tube dilution technique) geprüft. Die Organismen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Nährbrühe wachsen gelassen, wobei die 2 cm* Medium enthaltenden Röhrchen mit 0,1 cm3 einer 1/100 Verdünnung einer etwa 12stündigen NährbrüheKultur beimpft und bei 370C 48 h bebrütet wurden. Die Resultate sind als minimale Hemmungskonzentration in g/cm3 angegeben.
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<tb>
<tb>
Organismus <SEP> Stamm <SEP> Medium <SEP> Minimale <SEP> Hemmungskonzentration <SEP> in <SEP> g/cm3
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> 1 <SEP> (Nutrient <SEP> Broth) <SEP> 0,28
<tb> Nährbrühe
<tb> 2 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP>
<tb> 3 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,28
<tb> 4 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,14
<tb> 5 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,38
<tb> 6 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP>
<tb> 7 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 1, <SEP> 14 <SEP>
<tb> 8 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,57
<tb> 9 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP>
<tb> 10 <SEP> Nährbrühe <SEP> 1, <SEP> 14 <SEP>
<tb> 11 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 28
<tb> 12 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 1,14
<tb> 13 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP>
<tb> 14 <SEP> Nährbrühe <SEP> 2, <SEP> 28 <SEP>
<tb> 15 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,28
<tb> 16 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,
<SEP> 56 <SEP>
<tb> 17 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,28
<tb> 18 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 1,14
<tb> 19 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,57
<tb> 20 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP>
<tb> 21 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 3,00
<tb> 22 <SEP> * <SEP> Nährbrühe <SEP> 3,00
<tb> 23 <SEP> Nährbrühe <SEP> 3, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 1 <SEP> Nährbrühe <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> Nährbrühe <SEP> 2, <SEP> 20 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> 2 <SEP> Gehirn-Herz-Infusion <SEP> 0,14
<tb> haemolyticus <SEP> (Brain-heart-infusion)
<tb> + <SEP> 10% <SEP> Serum
<tb>
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<tb>
<tb>
Organismus <SEP> Stamm <SEP> Medium <SEP> Minimale <SEP> hemmungskonzentration <SEP> in <SEP> g/cm3
<tb> Streptococcus <SEP> 3 <SEP> Gehirn-Herz-Infusion <SEP> 0,28
<tb> haemolyticus <SEP> +10% <SEP> Serum <SEP>
<tb> 4 <SEP> Gehirn-Herz-Infusion <SEP> 0,14
<tb> +10% <SEP> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> - <SEP> Gehirn-Herz-Infusion <SEP> 0,14
<tb> agalactiae <SEP> +10% <SEP> Serum
<tb> Streptococcus <SEP> - <SEP> Gehirn-Herz-Infusion <SEP> 0,07
<tb> dysgalactiae <SEP> +10% <SEP> Serum
<tb> Corynebacterium-Nährbrühe <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 0,07
<tb> pyogenes
<tb> Corynebacterium <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 0,14
<tb> coryzae
<tb> Bacillus <SEP> subtilis-Nährbrühe <SEP> 0,07
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> 0,
56
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalis <SEP> 1 <SEP> Nährbrühe <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 0,28
<tb> 2 <SEP> Nährbrühe <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 0,28
<tb> Haemophilus <SEP> pertussis <SEP> 1 <SEP> Bordet-Gengou-Agar <SEP> > <SEP> 15 <SEP>
<tb> + <SEP> 10% <SEP> Schafsblut <SEP>
<tb> 2 <SEP> Bordet-Gengou-Agar <SEP> > 15
<tb> + <SEP> 10% <SEP> Schafsblut <SEP>
<tb> 3 <SEP> Bordet-Gengou-Agar <SEP> > 15 <SEP>
<tb> + <SEP> 10% <SEP> Schafsblut
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1 <SEP> Nährbrühe <SEP> 61
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 2 <SEP> Nährbrühe <SEP> > <SEP> 122 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> 15
<tb> Salmonella <SEP> typhi-Nährbrühe <SEP> 7,
5
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> 61
<tb> Salmonella <SEP> meloagidis <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> 122
<tb> Salmonella <SEP> heidelburg <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> > <SEP> 122
<tb> Shigella <SEP> flexneri <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> > <SEP> 122
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> > <SEP> 122
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> 1,5
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> - <SEP> Nährbrühe <SEP> + <SEP> 2% <SEP> Glucose <SEP> > <SEP> 122
<tb> Leptospira <SEP> pomona <SEP> - <SEP> Korthof's <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 20
<tb> Leptospira <SEP> ictero- <SEP> - <SEP> Korthof's <SEP> ¯ <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 10
<tb> haemorrhagiae
<tb>
Beispiel 2 : Herstellung von 7-Phenylacetamidocephalosporansäure.
2 g Natriumsalz von Cephalosporin C wurden in 30 cm3 Wasser gelöst. Hierauf wurde der PH-Wert durch Zusatz von Dowex 50 X 8 (H+) auf 2, 5 eingestellt, das Harz filtriert und mit 10 cm3 Wasser gewaschen, wonach den vereinigten Filtraten und Waschflüssigkeiten 10, 2 cm3 n HCl zugesetzt wurden. Die Lösung wurde 3 Tage bei 200C stehen gelassen und in eine Kolonne von Dowex 1 (Acetatform), 2, 1 cm Durchmesser x 7 cm, eingebracht. Das Perkolat wurde in 5 cm3-Fraktionen (1-12) gesammelt, wonach
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mit Wasser eluiert wurde, bis insgesamt 34 Fraktionen gesammelt waren. Sodann wurde die Eluierung mit
0, 5 n Essigsäure vorgenommen ; es wurden weitere 66 Fraktionen gesammelt. Von jeder Fraktion wurde die optische Dichte bei 260 mll gemessen.
Die Fraktionen 2-16 wurden zusammengegeben. Die erhaltene Lösung, die 7-Aminocephalosporan- säure und andere unter den mässig sauren Bedingungen gebildete Abbauprodukte des Cephalosporin C ent- hielt, wurde neutralisiert und in einer C02 -Atmosphäre mit einer Natriumbicarbonatlösung auf PH = 7, 0 gepuffert. Phenylacetylchlorid (1, 2 Äquiv., bezogen auf die Menge an verwendetem Cephalosporin C) in Aceton wurde langsam der neutralen Lösung zugesetzt, die auf 0 C abgekühlt worden war, und mit so viel Aceton vermischt, dass die Acetonkonzentration, nach Zusatz der Phenylacetylchloridlösung, auf
50% gebracht wurde. Nach 1 h wurde das PH der Mischung auf 5, 0 (Glaselektrode) eingestellt und das
Aceton im Vakuum entfernt.
Der pH-Wert wurde dann auf 2, 0 gesenkt, wonach die 7-Phenylacetamido- cephalosporansäure, zusammen mit N -Phenacetylcephalosporin Cc und N-Phenylacetylcephalosporin C mit Butylacetat extrahiert wurde. Das Butylacetat wurde abgetrennt, wonach wieder mit Wasser extra- hiert wurde, welches durch Zusatz von Alkali, in Gleichgewicht, auf einen pH-Wert von 5, 0 gebracht wurde. Der wässerige Extrakt wurde der Gefriertrocknung unterworfen. Bei Chromatographie eines Teiles des Produktes (150 Mg) auf Papier in n-Butanol-Äthanol-Wasser (4 : 1 : 5 Vol.) wurde festgestellt, dass dieses drei gegenüber Staph. aureus wirksame Komponenten (s. Fig. 1) enthielt. Die vorwiegend vorhan- dene wirksame Komponente war 7-Phenylacetamidocephalosporansäure.
Die andern aktiven Komponen- ten waren N-Phenylacetylcephalosporin Cc und N-Phenylacetylcephalosporin C, wobei letztere zwei
Komponenten durch das Butylacetat nur teilweise extrahiert wurden.
Die 7-Phenylacetamidocephalosporansäure wurde von den andern aktiven Komponenten des rohen
Gemisches (17 Einheiten/mg gegenüber Staph. aureus) mittels Chromatographie auf einer Grycksbo-Paper-Kolonne (paper roll column ; LKB-Produkter-Schweden) und mittels Gegenstromverteilung (counter current distribution) abgetrennt.
Die Eluierung aus der Kolonne wurde mit n-Butanol, das mit Wasser gesättigt war, ausgeführt ; in einem Vor versuch wurde das Natriumsalz der 7-Phenylacetamidocephalosporansäure aus der Kolonne als ein Pulver mit einer Wirksamkeit von 167 Einheiten/mg erhalten. Dieses Material war weit davon entfernt, rein zu sein.
Hierauf wurden Gegenstromverteilungen in zwei Lösungsmittelsystemen vorgenommen. Das erste System bestand aus gleichen Teilen von Butylacetat und 10/0 Essigsäure (Lösungsmittel I) und das zweite aus n-Butanol und 0, 05 m Natriumphosphatpuffer, PH = 6, 0 (Lösungsmittel II). Nach acht Übertragungen im Lösungsmittel 1 (10 cm'obere Schicht und 20 cm3 untere Schicht) erreichte die Konzentration der 7-Phe- nylacetamidocesshalosporansäure ein Maximum zwischen den Röhrchen 6 und 7, wogegen die andern aktiven Komponenten in den Röhrchen 0 und 1 gefunden wurden. Ein aus den Röhrchen 5,6 und 7 erhaltenes Produkt zeigte eine Wirksamkeit von zirka 50 Einheiten/mg.
Die Papierchromatographie dieses Materials in n-Butanol-Wasser-Äthanol (4 : 5 : 1 Vol. ) zeigte an, dass die 7-Phenylacetamidocephalosporansäure die einzig wirksame der vorhandenen Substanzen war.
Nach acht Übertragungen im Lösungsmittel II (20 cm3 jede Schicht) zeigte das Natriumphenylacetamidocephalosporanat eine Spitze zwischen den Röhrchen 3 und 4, wobei jedoch die Hauptmenge des Restes an aktivem Material in dem Röhrchen 0 verblieben war.
7-Phenylacetamidocephalosporansäure bewegte sich zu der Anode mit fast der gleichen Geschwindigkeit wie Penicillin G, wenn es der Elektrophorese auf Papier in Kollidinacetat-Puffer, PH = 7, 0, unterworfen wurde. Nach Inkubation mit wässerigem Pyridin bei 370C wurde die Phenylacetamidocephalosporansäure teilweise in ein aktives Derivat der Cephalosporin CA (Pyridin)-Art überführt. Dieses Derivar reagierte als eine neutrale Substanz, wenn es der Elektrophorese bei PH = 7, 0 unterworfen wurde.
7-Phenylacetamidocephalosporansäure (zirka 10 gag) wurde durch eine Lösung von Penicillinase nicht wesentlich inaktiviert, welche das zehnfache der Enzymmenge enthielt, die unter gleichen Bedingungen 50 jig Penicillin G vollständig inaktivierte.
Beispiel 3 : Herstellung des Phenylacetylderivats des Cephalosporin CA (Pyridin)-Kerns aus Cephalosporin'CA (Pyridin).
Cephalosporin CA (Pyridin) wird drei oder mehr Tage lang bei Raumtemperatur in 0, 1 n oder n HC1 gehalten. Bei Analyse der Reaktionsprodukte durch Elektrophorese auf Papier in Pyridinacetat-Puffer (PH = 4, 0) und nachfolgendem Inberührungbringen des Papiers mit Agarplatten, die mit Staph. aureus beimpft waren, wurde bei der verwendeten Konzentration eine einzige aktive Zone, nämlich die dem unveränderten Cephalosporin CA (Pyridin) zukommende, festgestellt. Duplikat-Papierstreifen, die mit m-Pyridin in 50% wässerigem Aceton und 0, 125% Phenylacetylchlorid in trockenem Aceton besprüht worden waren,
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zeigen eine zusätzliche wirksame Zone auf den besäten Platten, die auf das Produkt der Phenylacetylierung des Cephalosporin CA (Pyridin)-Kerns zurückzuführen ist.
Das Phenylacetylderivat des Cephalospo-
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7, in 16 h und nachfolgender Phenylacetylierung gebildet.
Beispiel 4 : Herstellung des Phenylacetylderivates des Cephalosporin Cc-Kerns aus Cephalospo- rin cc. a Cephalosporin C (50 mg) wurde in n oder 0, 5 n Hel (l. 33 cm) 2 oder 3 Tage bei 20 C gehalten.
Unter diesen Bedingungen verschwand die 7-Aminocephalosporansäure, die nach24hindernHCl-Lö-
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Der Cephalosporin Cc-Kern wurde auch gebildet, wenn Cephalosporin C mit einem gleichen Gewicht an nassem Dowex 50 X 8 (-H"1-Ionenaustauscherharz 15 - 48 h bei 200C in Kontakt gehalten wurde.
Streifen von Ionogramme, die mit Pyridinacetatpuffer, PH = 4, 5, behandelt und sodann mit Phenylace- tylchlorid besprüht wurden, zeigten gleichfalls eine aktive Zone, wenn sie mit einem Testorganismus in
Kontakt gebracht wurden, womit das Vorhandensein des Phenylacetylderivates des Cephalosporin Cc-Kerns angezeigt wurde.
Beispiel 5 : a) Acylierung von 7-Aminocephalosporansäure auf Papier.
Muster (jedes 200 zig) einer Rohdarstellung des Cephalosporin C-Kerns wurden 2 h bei 14 Volt/cm in
Pyridinacetat-Puffer, PH = 4, 5, einer Elektrophorese auf Papier unterworfen. Papierstreifen, auf welchen jedes Muster fliessen gelassen worden war, wurden dann ausgeschnitten und jeder dieser Streifen zunächst mit m-Pyridin in 50% (Vol. /Vol.) Aceton und dann mit einer Lösung eines bestimmten Säurechlorids (0, 1 cm3) in Aceton (8 cm3) besprüht. Die Papierstreifen wurden auf mit Staph. aureus besäte Platten aufgelegt und Bioautographien (bioautographs) gemäss Beispiel 1 durchgeführt. Die Hemmungszonen wa- ren in allen Fällen in gleicher Entfernung von der Ausgangsstellung (1, 6 cm zu der Anode), wobei diese Stellungen der Wanderung des Cephalosporin C-Kerns entsprachen.
Auf diese Weise wurden die Phenyl- acetyl-, Phenoxyacetyl-, n-Propionyl-, Acetyl- und Isobutyrylderivate des Cephalosporin C-Kerns hergestellt. Die Zonen, die den Phenylacetyl- und den Phenoxyacetylderivaten des Kerns entsprachen, hat- ten einen Durchmesser von zirka 3, 5 cm. Die demPropionylderivat zukommende Zone wies einen Durchmesser von zirka 2 cm auf, wogegen die den Acetyl- und Isobutyrylderivaten zukommenden Zonen klar zu erkennen, jedoch sehr klein waren. b) Acylierung von 7-Aminocephalosporansäure in Lösung.
Ein Muster von rohem Cephalosporin C-Kern (4 mg) wurde in 50 11 einer Lösung aufgelöst, die durch
Zusatz von 1 cms Pyridin zu 5 cms Wasser erhalten worden war. Zu den Mustern (10 ill) der Lösung des Kerns wurden 10 11 einer Lösung eines bestimmten Säurechlorids in Aceton zugesetzt. (Die Säurechloridlösungen wurden durch Zusatz von 0, 68 cms Phenoxyacetylchlorid, 0, 62 cnr Phenylacetylchlorid bzw.
0, 37 cm3 n-Propionylchlorid zu 10 cm3 Aceton erhalten.) Die Mischungen wurden 15 min bei Raumtem- peratur gehalten, wenn erforderlich verdünnt und dann 5 pl Muster auf Papier zur Elektrophorese oder Chromatographie aufgetupft.
Papierchromatogramme wurden bei Zimmertemperatur in Äthylacetat aufgenommen, das mit einem wässerigen Natriumacetat-Puffer (0, 1 m auf Natrium), PH = 5,4, gesättigt war. Das Papier wurde durch Weichenlassen in der Pufferlösung, Ablöschen (blotting) und Aufhängen in einem Luftstrom bei Raumtemperatur vorbehandelt und, sobald es trocken war, verwendet. Mit diesem System erreichte die Fliessmittelfront den unteren Teil des Papieres in ungefähr 3 h, wobei jedoch das Chromatographieren 18 h fortgesetzt wurde.
Die Wirksamkeit der Acylderivate wurde gegenüber Staphylococcus aureus gemessen. Es wurde gefunden, dass die Wirksamkeit des Phenoxyacetylderivates der Wirksamkeit des Phenylacetylderivates entsprach, die Wirksamkeit des n-Propionylderivates beträchtlich geringer war und schliesslich dass die Benzoyl-, Isobutyryl- und Acetylderivate eine merkbare, jedoch geringe Wirksamkeit aufwiesen.
Es wurde festgestellt, dass alle diese Derivate einen gleichen Weg zu der Anode zurücklegten, wenn sie der Elektrophorese auf Papier bei einem PH-Wert von 4, 5 unterworfen wurden und ihre Stellung durch Untersuchungen gemäss Beispiel 1 (bioautographs) festgestellt wurde. Der Weg entsprach der Wanderung von Cephalosporin C und von Benzylpenicillin.
Die Phenylacetyl-, Phenoxyacetyl-und n-Propionylderivate des Cephalosporin C-Kerns konnten voneinander durch Papierchromatographie in dem Äthylacetat-Natriumacetat-Puffersystem, das von Hale, Müller und Kelly (Nature 1953, 172,545) angegeben wird, unterschieden werden. Die Tabelle 1 zeigt die RF-Werte der verschiedenen Derivate, bezogen auf die des Benzylpenicillins (Phenylacetylderivats
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der 6-Aminopenicillansäure; 6-aminopenicillanic acid). Die entsprechenden Rp-Werte sind mit dem ZeichenRPhenylacetyl-6-APAbezeichnet.
Tabelle 1
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<tb>
<tb> Derivat <SEP> Phenylacetyl-8-APA
<tb> n-Propionyl-7-ACA <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP>
<tb> Phenylacetyl-7-ACA <SEP> 0, <SEP> 46 <SEP>
<tb> Phenoxyacetyl-7-ACA <SEP> 0, <SEP> 51 <SEP>
<tb> n-Propionyl-6-APA <SEP> (Äthylpenicillin) <SEP> 0,43
<tb> Phenylacetyl-6-APA <SEP> (Benzylpenicillin) <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Phenoxyacetyl-6-APA <SEP> (Phenoxymethylpenicillin) <SEP> 1, <SEP> 07 <SEP>
<tb> α-Phenoxypropionyl-6-APA <SEP> (α-Phenoxyäthylpenicillin) <SEP> 1,20
<tb>
Die N -Acylderivate der 7-Aminocephalosporansäure reagierten mit wässerigem Pyridin in einem PH-
Bereich von zirka 7 unter Bildung aktiver Verbindungen der CA-Art (III).
Diese CA-Verbindungen ver- hielten sich so, als hätten sie keine Ladung (net charge) bei Elektrophorese auf Papier bei einem PH-Wert von 4, 5 oder 7, 0, wogegen die N-Acylderivate selbst zu der Anode wanderten.
Beispiel 6 : Herstellung des cx-Phenoxypropionylderivates der 7-Aminocephalosporansäure.
Kristalline 7-ACA (5, 6 mg) wurden in einer Mischung von Wasser (0,9 cm) und 0, 1 sema 8% Na- triumbicarbonat (mit CO2 auf einen pH-Wert von 7, 0 gebracht) gelöst. Dieser Lösung wurde Aceton (1, 0 cm3) zugesetzt und die Mischung sodann auf OOC abgekühlt. Die abgekühlte Lösung wurde mit einem magnetischen Rührer gerührt, während eine Lösung von 6 jul von frisch destilliertem cx-Phenoxypropionyl- chlorid in 1,0 cm3 trockenem Aceton innerhalb von 20 min durch eine Kapillare eingeführt wurde. Während des Zusatzes des Säurechlorids wurde 1 cm3 einer Lösung, die 25 l 8% Natriumbicarbonat (PH =
7, 0) enthielt, durch eine zweite Kapillare hinzugefügt.
Nach Zusatz des Säurechlorids und des Puffers wurde die Mischung bei 0 C weitere 20 min gerührt. Das Eisbad wurde dann entfernt, die Mischung auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und 20 min bei dieser Temperatur gehalten.
Hierauf wurde die Lösung auf ein PH von ungefähr 5, 0 angesäuert, wonach Wasser (5 cm3) zugesetzt wurden. Das Aceton wurde im Vakuum entfernt ; es blieben ungefähr 3 cm3 einer wässerigen Lösung zurück. Dieser Lösung wurde n Hel zugesetzt, bis ein PH-Wert von 3, 5 erreicht war, wonach die saure Lösung, zwecks Entfernung von vorhandener freier a-Phenoxypropionsäure, dreimal mit einem gleichen
Volumen an Benzol extrahiert wurde. Der wässerige Rückstand wurde auf einen pH-Wert von 2, 0 gebracht und, zwecks Entfernung des a-Phenoxypropionylderivats des 7-ACA, zweimal mit dem gleichen Volumen Butylacetat extrahiert. Die vereinigten Butylacetatextrakte (6 cm3) wurden mit 1, 5 cm3 Wasser gewaschen.
Das α-Phenoxypropionylderivat der 7-ACA wurde, nachdem zu der Mischung 0, 1 n Natronlauge zugesetzt worden war, bis der PH-Wert der wässerigen Lösung im Gleichgewicht bei 5, 4 lag, als Natriumsalz in ein gleiches Volumen Wasser rückextrahiert. Es wurde eine zweite Extraktion mit einem gleichen Volumen an Wasser vorgenommen ; die vereinigten wässerigen Extrakte wurden einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei 9 mg eines flaumigen weissen Pulvers erhalten wurden.
Eigenschaften des α-Phenoxypropionylderivates der 7-ACA :
Biologische Wirksamkeit :
Das teilweise reine Natriumsalz des < x-Phenoxypropionylderivates von 7-ACA enthielt, wie festgestellt werden konnte, wenn es Benzylpenicillin gegenüber geprüft wurde, wobei die Plattenmethode (whole plate method) und als Testorganismus Staphylococcus aureus verwendet wurde, 107 Penicillin- Einheiten/mg. Da spektrophotometrische Untersuchungen zeigen, dass das verwendete Muster einen Reinheitsgrad von ungefähr 70% hat (s. unten), ist zu erwarten, dass das reine Natriumsalz des α-Phenoxy- propionylderivates von 7-ACA ungefähr 150 Penicillin-Einheiten/mg aufweist.
Ultraviolett-Absorptionsspektrum : Das U. V. -Spektrum des teilweise reinenNatriumsalzesdés cx-Phenoxypropionylderivates von 7-ACA
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derivat der 7-ACA berechneten U. V.-Spektrum zeigte, dass der Reinheitsgrad des vorliegenden Musters bei ungefähr 70%war.
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EMI9.1
Wenn unter Verwendung eines Fliessmittelsystems, das aus mit Natriumacetat-Puffer (PH = 5, 0, 0, 1 m bezogen auf Natrium) gesättigtem Äthylacetat besteht, aufWhatmanNr.
l-Papierchromatographiert wird, welches mit der gleichen Natriumacetat-Pufferlösung behandelt und gerade luftgetrocknet worden war, wies das Natriumsalz des a-Phenoxypropionylderivates der 7-ACA, ersehen aus einem Bio-
EMI9.2
Derivate der 7-ACA und der 6-Aminopenicillansäure (6-aminopenicillanic acid, 6-APA) folgende RPenicillin G - Werte :
EMI9.3
<tb>
<tb> Substanz <SEP> RP--Wert
<tb> Natriumbenzylpenicillin <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Natrium-6- <SEP> (ct-phenoxypropionamid)- <SEP>
<tb> penicillanat <SEP> 1, <SEP> 20 <SEP>
<tb> (Natrium-a-phenoxyäthylpenicillin)
<tb> Natrium-7-(α
-phenoxypropionamid)-
<tb> -cephalosporanat <SEP> 0, <SEP> 775
<tb> Natrium-6- <SEP> (2',6'-dimethoxybenzamid)penicillanat <SEP> 0, <SEP> 414
<tb> (Natrium-2,6-dimethoxyphenylpenicillin)
<tb> Natrium-7- <SEP> (2', <SEP> 6'-dimethoxybenzamid)- <SEP>
<tb> - <SEP> cephalosporanat <SEP> 0, <SEP> 115 <SEP>
<tb>
PATENTANSPRÜCHE : 1.
Verfahren zur Herstellung antibiotisch wirksamer Verbindungen der allgemeinen Formel
EMI9.4
worin X für einen Rest des Kerns von Cephalosporin C, Cephalosporin Ce oder einer Cephalosporin CAVerbindung steht und in der sowohl Rl als auch R2 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-, Aryl-, Alkyloxyoder Aryloxygruppe darstellen, sowie von Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalzen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern des Cephalosporin C, Cephalosporin Cc oder einer Cephalosporin CA-Verbindung mit einem die funktionelle Gruppe
EMI9.5
enthaltenden Acylierungsmittel, wobei Rl und % die oben angeführte Bedeutung haben, behandelt wird.
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Process for the preparation of derivatives of 7-aminocephalosporanic acid u. similar links
The invention relates to processes for the preparation of antibiotic compounds, namely derivatives of 7-aminocephalosporanic acid and similar compounds.
It was found that by treating cephalosporin C with acid, the molecule can, under certain conditions, be cleaved into two parts, namely into a complex ring system as well as a side chain which has been identified as α-aminoadipic acid. The side chain adheres to the amino group of a complex ring system in the 7-position. This compound, known as 7-aminocephalosporanic acid (cephalosporin C core), corresponds to the formula
EMI1.1
By further saponifying the acetyl ester group, a lactone (cephalosporin Cc core) of the following formula can be obtained
EMI1.2
By substituting the acetyl radical of 7-aminocephalosporanic acid with a tertiary amino group, a compound with a weakly basic quaternary amino group can be obtained.
The compound with betaine character corresponds to the general formula
<Desc / Clms Page number 2>
EMI2.1
EMI2.2
EMI2.3
EMI2.4
EMI2.5
containing acylating agents, where R and R have the meaning given above, is treated.
Suitable functional derivatives of the acid RCH. COOH, e.g. B. an acid halide can be used. The sodium, potassium and ammonium salts of the derivatives can be obtained from the acylation products by treatment with sodium, potassium or. Ammonium hydroxide can be produced.
When X represents the remainder of the core of a cephalosporin CA compound, the preferred residue is that of the cephalosporin CA (pyridine).
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pen, groups with 1-10 carbon atoms and especially those with 1-6 carbon atoms being preferred. If one of the symbols R or R represents a substituted phenyl group, groups with nitro, chlorine, alkyl and alkoxy substituents are preferred. Of the alkoxy groups, the methoxy and ethoxy groups should be emphasized in particular.
Compounds of the above formula which are of particular importance include: the phenylacetyl, phenoxyacetyl, n-propionyl, cc-phenoxypropionyl and isobutyryl derivatives of the core of cephalosporin C, cephalosporin Cc and cephalosporin CA (pyridine). Also of interest are the hexanoyl, p-nitrophenylacetyl and p-nitrophenoxyacetyl derivatives of the core of cephalosporin C, cephalosporin c. and Cephalosporin CA (pyridine).
The core to be acylated can, if desired, be prepared in situ in the reaction mixture by acid treatment of the cephalosporin C, cephalosporin Cc or a cephalosporin CA compound. After the acid treatment and prior to acylation, the solution is preferably buffered to a pH of about 6-7. To concentrate the core, in such a process the solution containing the core can expediently be brought into contact with a strongly basic anion exchange resin in acetate form, after which the fractions containing the core are collected after elution with acetic acid. A resin that is excellently suited for this purpose is Dowex-1 X8 in acetate form, a suitable eluent is approximately 0.5 n-n acetic acid.
As mentioned before, when R1 and R2 represent alkyl groups, these groups can be quite large. When R represents a hydrogen atom or an alkyl group and R represents an alkyl group, the total number of carbon atoms in the groups R and R should preferably be 4 and, desirably, not more than 4. When red denotes phenyl, phenoxy, substituted phenyl, or substituted phenoxy and R denotes an alkyl group, R preferably contains 1 carbon atom and desirably no more than 3-4 carbon atoms.
The invention is illustrated by the following examples: Example 1: Conversion of 7-aminocephalosporanic acid (produced in situ in solution by acid treatment of cephalosporin C) into the phenylacetyl derivative of this acid (benzylcephalosporin).
300 cm 3 of acetone containing 3 cm 3 of phenylacetyl chloride were added to a cooled aqueous solution of 7-aminocephalosporanic acid and the pH was adjusted to 7. It was then left to stand for 1 hour and the temperature allowed to rise to room temperature, after which the acetone was removed by distillation in vacuo. The volume of the aqueous residue was now 325 cm \ the pH value 5.9. To remove acetone that had not been distilled off, the mixture was extracted with 2 x 150 cms benzene, then the p-value was adjusted to 3.3 with syrupy phosphoric acid and the solution was added twice more
EMI3.2
X 150 cm TiBenzylcephalosporin however not.
To complete this extraction, the pH of the solution, which had risen to 3.8, was brought back to 3.3 and the extraction was continued with 3 × 150 cms of benzene. The pH was then lowered to 2.5 with phosphoric acid and the solution was extracted with 3 × 150 cm 3 ethyl acetate. The combined extracts were washed with 2 × 30 cm3 of water and, after drying over anhydrous sodium sulfate, concentrated to 2-3 cm3 in vacuo. An addition of 10 to 15 vol. Petroleum ether (Sp. 60-80 ° C) caused the precipitation of a yellow substance (97 mg), which was centrifuged off, washed several times with petroleum ether boiling at 40-60 ° C and then dried in a vacuum desiccator. It was then redissolved in ethyl acetate (2 cm3); then 10 to 15 volumes of ether were added.
This addition caused the precipitation of a small amount of a substance that was not used.
EMI3.3
n / 10 sodium hydroxide solution titrated to pH = 6; Vigorous stirring is required during the titration. A small portion of the insoluble material was filtered and the aqueous solution was subjected to freeze drying, leaving a somewhat sticky substance. This was dissolved in a minimum of a mixture of acetone: water 9: 1 (# 1 cm3) and precipitated by adding anhydrous acetone. A fluffy precipitate of fine, colorless needles (31.2 mg) formed. Further purification was done by redissolving in aqueous acetone and reprecipitating with anhydrous acetone.
Physical properties of the crystalline sodium salt of benzylcephalosporin:
When heated, the sodium salt darkened and decomposed at 1600C.
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28 + 1220U. V. Spectrum in water: X 259 m E1% 190, max 1 cm # 234 m E1% 138.5. mm 1 cm
I. R. spectrum:
The infrared spectrum in Nujol mull. is shown in FIG.
Paper chromatography:
The solvent system used was butanol: ethanol: water (4: 1: 5). The top phase from this mixture was flowed onto Whatman # 1 paper, buffered to PH = 6. RF = 0.65 to 0.67.
Electrophoresis:
The migrations to the anode proceeded at about the same rate as penicillin G in collidine acetate buffer at PH = 7.0.
The effectiveness of 7-phenylacetamidocephalosporanic acid (benzylcephalosporin) against various bacteria was tested by means of the tube dilution technique. Unless otherwise specified, the organisms were grown in nutrient broth, the tubes containing 2 cm * medium inoculated with 0.1 cm3 of a 1/100 dilution of an approximately 12 hour nutrient broth culture and incubated at 370C for 48 hours. The results are given as the minimum inhibitory concentration in g / cm3.
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<tb>
<tb>
Organism <SEP> Strain <SEP> Medium <SEP> Minimum <SEP> inhibition concentration <SEP> in <SEP> g / cm3
<tb> staph. <SEP> aureus <SEP> 1 <SEP> (Nutrient <SEP> Broth) <SEP> 0.28
<tb> nutrient broth
<tb> 2 <SEP> nutrient broth <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP>
<tb> 3 <SEP> nutrient broth <SEP> 0.28
<tb> 4 <SEP> nutrient broth <SEP> 0.14
<tb> 5 <SEP> nutrient broth <SEP> 0.38
<tb> 6 <SEP> nutrient broth <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP>
<tb> 7 <SEP> * <SEP> nutrient broth <SEP> 1, <SEP> 14 <SEP>
<tb> 8 <SEP> * <SEP> nutrient broth <SEP> 0.57
<tb> 9 <SEP> nutrient broth <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP>
<tb> 10 <SEP> nutrient broth <SEP> 1, <SEP> 14 <SEP>
<tb> 11 <SEP> nutrient broth <SEP> 0, <SEP> 28
<tb> 12 <SEP> * <SEP> nutrient broth <SEP> 1.14
<tb> 13 <SEP> nutrient broth <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP>
<tb> 14 <SEP> nutrient broth <SEP> 2, <SEP> 28 <SEP>
<tb> 15 <SEP> nutrient broth <SEP> 0.28
<tb> 16 <SEP> * <SEP> nutrient broth <SEP> 0,
<SEP> 56 <SEP>
<tb> 17 <SEP> nutrient broth <SEP> 0.28
<tb> 18 <SEP> * <SEP> nutrient broth <SEP> 1.14
<tb> 19 <SEP> * <SEP> nutrient broth <SEP> 0.57
<tb> 20 <SEP> nutrient broth <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP>
<tb> 21 <SEP> * <SEP> nutrient broth <SEP> 3.00
<tb> 22 <SEP> * <SEP> nutrient broth <SEP> 3.00
<tb> 23 <SEP> nutrient broth <SEP> 3, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 1 <SEP> nutrient broth <SEP> 0, <SEP> 56 <SEP>
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> nutrient broth <SEP> 2, <SEP> 20 <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> 2 <SEP> Brain-Heart Infusion <SEP> 0.14
<tb> haemolyticus <SEP> (brain-heart-infusion)
<tb> + <SEP> 10% <SEP> serum
<tb>
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<tb>
<tb>
Organism <SEP> Strain <SEP> Medium <SEP> Minimum <SEP> inhibiting concentration <SEP> in <SEP> g / cm3
<tb> Streptococcus <SEP> 3 <SEP> Brain-Heart Infusion <SEP> 0.28
<tb> haemolyticus <SEP> + 10% <SEP> serum <SEP>
<tb> 4 <SEP> brain-heart infusion <SEP> 0.14
<tb> + 10% <SEP> serum
<tb> Streptococcus <SEP> - <SEP> Brain-Heart Infusion <SEP> 0.14
<tb> agalactiae <SEP> + 10% <SEP> serum
<tb> Streptococcus <SEP> - <SEP> Brain-Heart Infusion <SEP> 0.07
<tb> dysgalactiae <SEP> + 10% <SEP> serum
<tb> Corynebacterium nutrient broth <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 0.07
<tb> pyogenes
<tb> Corynebacterium <SEP> - <SEP> nutrient broth <SEP> + <SEP> 10% <SEP> serum <SEP> 0.14
<tb> coryzae
<tb> Bacillus <SEP> subtilis nutrient broth <SEP> 0.07
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> - <SEP> nutrient broth <SEP> 0,
56
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalis <SEP> 1 <SEP> nutrient broth <SEP> + <SEP> 10% <SEP> serum <SEP> 0.28
<tb> 2 <SEP> nutrient broth <SEP> + <SEP> 10% <SEP> serum <SEP> 0.28
<tb> Haemophilus <SEP> pertussis <SEP> 1 <SEP> Bordet Gengou agar <SEP>> <SEP> 15 <SEP>
<tb> + <SEP> 10% <SEP> sheep blood <SEP>
<tb> 2 <SEP> Bordet Gengou Agar <SEP>> 15
<tb> + <SEP> 10% <SEP> sheep blood <SEP>
<tb> 3 <SEP> Bordet Gengou Agar <SEP>> 15 <SEP>
<tb> + <SEP> 10% <SEP> sheep blood
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1 <SEP> nutrient broth <SEP> 61
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 2 <SEP> nutrient broth <SEP>> <SEP> 122 <SEP>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> - <SEP> nutrient broth <SEP> 15
<tb> Salmonella <SEP> typhi nutrient broth <SEP> 7,
5
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> - <SEP> nutrient broth <SEP> 61
<tb> Salmonella <SEP> meloagidis <SEP> - <SEP> nutrient broth <SEP> 122
<tb> Salmonella <SEP> heidelburg <SEP> - <SEP> nutrient broth <SEP>> <SEP> 122
<tb> Shigella <SEP> flexneri <SEP> - <SEP> nutrient broth <SEP>> <SEP> 122
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> - <SEP> nutrient broth <SEP>> <SEP> 122
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> - <SEP> nutrient broth <SEP> 1.5
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> - <SEP> nutrient broth <SEP> + <SEP> 2% <SEP> glucose <SEP>> <SEP> 122
<tb> Leptospira <SEP> pomona <SEP> - <SEP> Korthof's <SEP> + <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 20
<tb> Leptospira <SEP> ictero- <SEP> - <SEP> Korthof's <SEP> ¯ <SEP> 10% <SEP> Serum <SEP> 10
<tb> haemorrhagiae
<tb>
Example 2: Preparation of 7-phenylacetamidocephalosporanic acid.
2 g of the sodium salt of Cephalosporin C were dissolved in 30 cm3 of water. The pH was then adjusted to 2.5 by adding Dowex 50 X 8 (H +), the resin was filtered and washed with 10 cm3 of water, after which 10.2 cm3 of N HCl were added to the combined filtrates and washing liquids. The solution was left to stand for 3 days at 200 ° C. and introduced into a column of Dowex 1 (acetate form), 2.1 cm in diameter × 7 cm. The percolate was collected in 5 cm3 fractions (1-12), after which
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was eluted with water until a total of 34 fractions were collected. Then elution with
0.5 N acetic acid made; an additional 66 fractions were collected. The optical density of each fraction was measured at 260 ml.
Fractions 2-16 were pooled. The solution obtained, which contained 7-aminocephalosporanic acid and other degradation products of cephalosporin C formed under the moderately acidic conditions, was neutralized and buffered to pH = 7.0 in a CO 2 atmosphere with a sodium bicarbonate solution. Phenylacetyl chloride (1.2 equiv., Based on the amount of cephalosporin C used) in acetone was slowly added to the neutral solution, which had been cooled to 0 C, and mixed with enough acetone that the acetone concentration, after addition of the phenylacetyl chloride solution, on
50% was brought. After 1 h the pH of the mixture was adjusted to 5.0 (glass electrode) and the
Acetone removed in vacuo.
The pH was then lowered to 2.0, after which the 7-phenylacetamidocephalosporanic acid, together with N-phenacetylcephalosporin Cc and N-phenylacetylcephalosporin C, was extracted with butyl acetate. The butyl acetate was separated off, after which it was extracted again with water, which was brought to a pH value of 5.0 by adding alkali. The aqueous extract was subjected to freeze-drying. When part of the product (150 mg) was chromatographed on paper in n-butanol-ethanol-water (4: 1: 5 by volume) it was found that this three compared to Staph. aureus active components (see Fig. 1) contained. The predominantly active component was 7-phenylacetamidocephalosporanic acid.
The other active components were N-phenylacetylcephalosporin Cc and N-phenylacetylcephalosporin C, the latter two
Components were only partially extracted by the butyl acetate.
The 7-phenylacetamidocephalosporanic acid was separated from the other active components of the crude
Mixture (17 units / mg compared to Staph. Aureus) separated by means of chromatography on a Grycksbo paper column (paper roll column; LKB-Produkter-Sweden) and by means of countercurrent distribution.
The elution from the column was carried out with n-butanol saturated with water; In a preliminary experiment, the sodium salt of 7-phenylacetamidocephalosporanic acid was obtained from the column as a powder with an efficiency of 167 units / mg. This material was far from pure.
Countercurrent distributions were then made in two solvent systems. The first system consisted of equal parts of butyl acetate and 10/0 acetic acid (solvent I) and the second of n-butanol and 0.05 M sodium phosphate buffer, pH = 6.0 (solvent II). After eight transfers in solvent 1 (10 cm3 upper layer and 20 cm3 lower layer) the concentration of 7-phenylacetamidocesshalosporanic acid reached a maximum between tubes 6 and 7, whereas the other active components were found in tubes 0 and 1. A product obtained from tubes 5,6 and 7 showed an effectiveness of about 50 units / mg.
Paper chromatography of this material in n-butanol-water-ethanol (4: 5: 1 by volume) indicated that 7-phenylacetamidocephalosporanic acid was the only effective substance.
After eight transfers in Solvent II (20 cc each layer), the sodium phenylacetamidocephalosporanate peaked between tubes 3 and 4, but most of the remainder of the active material remained in tube 0.
7-Phenylacetamidocephalosporanic acid moved to the anode at almost the same rate as penicillin G when subjected to electrophoresis on paper in collidine acetate buffer, PH = 7.0. After incubation with aqueous pyridine at 37 ° C., the phenylacetamidocephalosporanic acid was partially converted into an active derivative of the cephalosporin CA (pyridine) type. This derivative reacted as a neutral substance when subjected to electrophoresis at PH = 7.0.
7-Phenylacetamidocephalosporanic acid (approx. 10 gag) was not substantially inactivated by a solution of penicillinase which contained ten times the amount of enzyme which completely inactivated 50 μg penicillin G under the same conditions.
Example 3: Preparation of the phenylacetyl derivative of the Cephalosporin CA (pyridine) core from Cephalosporin'CA (pyridine).
Cephalosporin CA (pyridine) is kept in 0, 1 n or n HC1 for three or more days at room temperature. When the reaction products are analyzed by electrophoresis on paper in pyridine acetate buffer (PH = 4.0) and the paper is subsequently brought into contact with agar plates containing Staph. aureus were inoculated, a single active zone, namely that of the unchanged cephalosporin CA (pyridine), was found at the concentration used. Duplicate paper strips that had been sprayed with m-pyridine in 50% aqueous acetone and 0.15% phenylacetyl chloride in dry acetone,
<Desc / Clms Page number 7>
show an additional effective zone on the seeded plates due to the product of phenylacetylation of the cephalosporin CA (pyridine) core.
The phenylacetyl derivative of the cephalospo-
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7, formed in 16 h and subsequent phenylacetylation.
Example 4: Production of the phenylacetyl derivative of the cephalosporin Cc core from cephalosporin cc. a Cephalosporin C (50 mg) was kept in n or 0.5 n Hel (l. 33 cm) for 2 or 3 days at 20 C.
Under these conditions, the 7-aminocephalosporanic acid disappeared, which after
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The cephalosporin Cc core was also formed when cephalosporin C was kept in contact with an equal weight of wet Dowex 50 X 8 (-H "1 ion exchange resin for 15-48 hours at 200C.
Strips of ionograms that were treated with pyridine acetate buffer, PH = 4.5, and then sprayed with phenylacetyl chloride also showed an active zone when they were exposed to a test organism
Were brought into contact, indicating the presence of the phenylacetyl derivative of the cephalosporin Cc core.
Example 5: a) Acylation of 7-aminocephalosporanic acid on paper.
Samples (200 each) of a raw representation of the Cephalosporin C core were placed at 14 volts / cm in. For 2 hours
Pyridine acetate buffer, PH = 4.5, subjected to electrophoresis on paper. Paper strips on which each pattern had been allowed to flow were then cut out and each of these strips first with m-pyridine in 50% (v / v) acetone and then with a solution of a certain acid chloride (0.1 cm3) in acetone (8 cm3) sprayed. The paper strips were opened with staph. aureus-seeded plates are placed and bioautographs (bioautographs) according to Example 1 are carried out. The zones of inhibition were in all cases at the same distance from the starting position (1.6 cm to the anode), these positions corresponding to the migration of the cephalosporin C core.
In this way the phenyl acetyl, phenoxyacetyl, n-propionyl, acetyl and isobutyryl derivatives of the cephalosporin C core were prepared. The zones, which corresponded to the phenylacetyl and the phenoxyacetyl derivatives of the core, had a diameter of about 3.5 cm. The zone associated with the propionyl derivative had a diameter of approximately 2 cm, whereas the zones associated with the acetyl and isobutyryl derivatives were clearly visible but very small. b) Acylation of 7-aminocephalosporanic acid in solution.
A sample of crude Cephalosporin C core (4 mg) was dissolved in 50 µl of a solution made by
Addition of 1 cms of pyridine to 5 cms of water had been obtained. To the samples (10 l) of the solution of the core, 10 l of a solution of a certain acid chloride in acetone was added. (The acid chloride solutions were made by adding 0.68 cms of phenoxyacetyl chloride, 0.62 cms of phenylacetyl chloride or
0.37 cm3 of n-propionyl chloride to 10 cm3 of acetone were obtained.) The mixtures were kept at room temperature for 15 min, diluted if necessary and then 5 μl samples were dabbed on paper for electrophoresis or chromatography.
Paper chromatograms were recorded at room temperature in ethyl acetate which was saturated with an aqueous sodium acetate buffer (0.1 M on sodium), pH 5.4. The paper was pretreated by soaking in the buffer solution, blotting, and hanging in a stream of air at room temperature, and used once dry. With this system, the flux front reached the bottom of the paper in approximately 3 hours, but chromatography continued for 18 hours.
The effectiveness of the acyl derivatives was measured against Staphylococcus aureus. It was found that the activity of the phenoxyacetyl derivative corresponded to the activity of the phenylacetyl derivative, the activity of the n-propionyl derivative was considerably lower and finally that the benzoyl, isobutyryl and acetyl derivatives had a noticeable but low activity.
It was found that all of these derivatives traveled the same route to the anode when they were subjected to electrophoresis on paper at a pH value of 4.5 and their position was determined by tests according to Example 1 (bioautographs). The path corresponded to the migration of cephalosporin C and benzylpenicillin.
The phenylacetyl, phenoxyacetyl and n-propionyl derivatives of the cephalosporin C core could be distinguished from one another by paper chromatography in the ethyl acetate-sodium acetate buffer system given by Hale, Müller and Kelly (Nature 1953, 172,545). Table 1 shows the RF values of the various derivatives, based on that of the benzylpenicillin (phenylacetyl derivative
<Desc / Clms Page number 8>
6-aminopenicillanic acid; 6-aminopenicillanic acid). The corresponding Rp values are denoted by the symbol R-phenylacetyl-6-APA.
Table 1
EMI8.1
<tb>
<tb> derivative <SEP> phenylacetyl-8-APA
<tb> n-Propionyl-7-ACA <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP>
<tb> Phenylacetyl-7-ACA <SEP> 0, <SEP> 46 <SEP>
<tb> Phenoxyacetyl-7-ACA <SEP> 0, <SEP> 51 <SEP>
<tb> n-Propionyl-6-APA <SEP> (ethyl penicillin) <SEP> 0.43
<tb> Phenylacetyl-6-APA <SEP> (Benzylpenicillin) <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Phenoxyacetyl-6-APA <SEP> (Phenoxymethylpenicillin) <SEP> 1, <SEP> 07 <SEP>
<tb> α-phenoxypropionyl-6-APA <SEP> (α-phenoxyethylpenicillin) <SEP> 1.20
<tb>
The N -acyl derivatives of 7-aminocephalosporanic acid reacted with aqueous pyridine in a PH
Area of about 7 with the formation of active compounds of the CA type (III).
These CA compounds behaved as if they had no net charge during electrophoresis on paper at a pH of 4.5 or 7.0, whereas the N-acyl derivatives themselves migrated to the anode.
Example 6: Preparation of the cx-phenoxypropionyl derivative of 7-aminocephalosporanic acid.
Crystalline 7-ACA (5.6 mg) were dissolved in a mixture of water (0.9 cm) and 0.1 sema 8% sodium bicarbonate (brought to a pH of 7.0 with CO2). Acetone (1.0 cm3) was added to this solution and the mixture was then cooled to OOC. The cooled solution was stirred with a magnetic stirrer while a solution of 6 μl of freshly distilled cx-phenoxypropionyl chloride in 1.0 cm3 of dry acetone was introduced through a capillary within 20 min. During the addition of the acid chloride, 1 cm3 of a solution containing 25 l of 8% sodium bicarbonate (PH =
7, 0) was added through a second capillary.
After adding the acid chloride and the buffer, the mixture was stirred at 0 C for a further 20 min. The ice bath was then removed, the mixture allowed to warm to room temperature and held at that temperature for 20 minutes.
The solution was then acidified to a pH of approximately 5.0, after which water (5 cm3) was added. The acetone was removed in vacuo; about 3 cm3 of an aqueous solution remained. This solution was added n Hel until a pH value of 3.5 was reached, after which the acidic solution, in order to remove any free α-phenoxypropionic acid present, three times with the same
Volume of benzene was extracted. The aqueous residue was brought to a pH of 2.0 and, in order to remove the α-phenoxypropionyl derivative of 7-ACA, extracted twice with an equal volume of butyl acetate. The combined butyl acetate extracts (6 cm3) were washed with 1.5 cm3 of water.
The α-phenoxypropionyl derivative of 7-ACA, after 0.1 N sodium hydroxide solution had been added to the mixture until the equilibrium pH of the aqueous solution was 5.4, was back-extracted as the sodium salt into an equal volume of water. A second extraction was made with an equal volume of water; the combined aqueous extracts were subjected to freeze-drying, whereby 9 mg of a fluffy white powder were obtained.
Properties of the α-phenoxypropionyl derivative of 7-ACA:
Biological effectiveness:
The partially pure sodium salt of the <x -phenoxypropionyl derivative of 7-ACA contained, as could be determined when it was tested against benzylpenicillin using the whole plate method and Staphylococcus aureus as the test organism, 107 penicillin units / mg. Since spectrophotometric studies show that the sample used has a purity of approximately 70% (see below), the pure sodium salt of the α-phenoxypropionyl derivative of 7-ACA is expected to be approximately 150 penicillin units / mg.
Ultraviolet absorption spectrum: The U.V. spectrum of the partially pure sodium salt of the cx-phenoxypropionyl derivative of 7-ACA
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Derivative of the 7-ACA calculated U.V. spectrum showed that the purity of the present sample was about 70%.
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If using a solvent system consisting of ethyl acetate saturated with sodium acetate buffer (PH = 5, 0, 0, 1 m based on sodium), on Whatman No.
l-paper chromatographed, which had been treated with the same sodium acetate buffer solution and had just been air-dried, showed the sodium salt of the a-phenoxypropionyl derivative of 7-ACA, seen from a bio-
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Derivatives of 7-ACA and 6-aminopenicillanic acid (6-APA) have the following RPenicillin G values:
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<tb>
<tb> substance <SEP> RP - value
<tb> Sodium benzylpenicillin <SEP> 1, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Sodium-6- <SEP> (ct-phenoxypropionamide) - <SEP>
<tb> penicillanat <SEP> 1, <SEP> 20 <SEP>
<tb> (sodium a-phenoxyethylpenicillin)
<tb> Sodium-7 - (?
-phenoxypropionamide) -
<tb> -cephalosporanate <SEP> 0, <SEP> 775
<tb> Sodium 6- <SEP> (2 ', 6'-dimethoxybenzamide) penicillanate <SEP> 0, <SEP> 414
<tb> (sodium 2,6-dimethoxyphenylpenicillin)
<tb> Sodium-7- <SEP> (2 ', <SEP> 6'-dimethoxybenzamide) - <SEP>
<tb> - <SEP> cephalosporanate <SEP> 0, <SEP> 115 <SEP>
<tb>
PATENT CLAIMS: 1.
Process for the preparation of antibiotic compounds of the general formula
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wherein X stands for a radical of the nucleus of cephalosporin C, cephalosporin Ce or a cephalosporin CA compound and in which both Rl and R2 represent a hydrogen atom, an alkyl, aryl, alkyloxy or aryloxy group, as well as sodium, potassium and ammonium salts of these Compounds, characterized in that the core of the cephalosporin C, cephalosporin Cc or a cephalosporin CA compound with a the functional group
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containing acylating agent, where Rl and% have the meaning given above, is treated.