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In der franz. Patentschrift Ni.1.463.651, welche der österr. Patentschrift Nr. 266317 entspricht, sind therapeutisch wirksame Derivate der 7-Amino-cephalosporansäure der Formel
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beschrieben, worin R. und l die unten angegebene Bedeutung haben und worin Ra unter anderem eine heterocyclisch verätherte Mercaptogruppe ist. Es wurde nun gefunden, dass besonders stark antibiotisch wirksame Verbindungen solche der Formel
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sind, worin H ein über ein Kohlenstoffatom an den Schwefel gebundener ungesättigter Heterocyclylrest mit 5 bis 6 Ringgliedern ist, der mindestens 2 Stickstoffatome und ausserdem ein weiteres Heteroatom der Gruppe Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel enthält.
In der obigen Formel I sind Rl und R2 gleich oder verschieden ; sie stehen für Wasserstoff oder für gegebenenfalls durch Halogenatome oder Nitrogruppen substituierte einwertige Kohlenwasserstoffreste mit höchstens 8 Kohlenstoffatomen oder für über Kohlenstoff gebundene ungesättigte Heterocyclylreste mit 5 bis 6 Ringgliedern oder zusammen einen zweiwertigen Kohlenwasserstoffrest der Formel
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bilden, worin R'und RJ die gleiche Bedeutung wie R1 und R2 haben oder zusammen einen Alkylenrest mit höchstens 8 Kohlenstoffatomen darstellen.
Gegebenenfalls substituierte einwertige Kohlenwasserstoffreste sind vor allem Niederalkyl-, Aryl- oder Aryl-niederalkylreste, wie gegebenenfalls substituiertes Phenyl, Toluyl oder Benzyl ; ungesättigte Heterocyclylreste sind besonders Heterocyclylreste aromatischen Charakters mit einem Schwefel-, Sauerstoff- oder Stick- stoffatom, wie Thienyl, Furyl, Pyridyl, Picolyl, Pyrryl, oder entsprechende Heterocyclyl-niederalkylreste, wie Thenyl, Furfuryl, Pyridyl (2) methyl.
Gegebenenfalls substituierte zweiwertige Kohlenwasserstoffreste sind beispielsweise gesättigte oder ungesättigte aliphatische, cycloaliphatische oder araliphatische Reste, wie Alkyliden-, Alkenyliden-, Cycloalkyl- den-oder Cycloalkenylidenreste, vor allem solche mit 1 bis 8, besonders 1 bis 6, Kohlenstoffatomen, wie Me-- thylen, und durch ein oder zwei Niederalkyl-oder Niederalkenylreste substituiertes Methylen, z. B. Allyliden, Äthyliden, Isopropyliden, Butyliden, Cyclopentyliden, Cyclohexyliden, oder durch Arylreste substituierte zweiwertige gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffreste, wie Phenylalkyliden- oder Phenylalkenylidenreste, wobei die Arylreste auch substituiert sein können, z.
B. durch eine oder mehrere Niederalkylgruppen, Nitrogruppen und/oder Halogenatome, besonders ein gegebenenfalls wie erwähnt substituierter Benzylidenoder Phenylallylidenrest.
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gruppen substituiertes Benzyliden. Weiter kann insbesondere für Wasserstoff und R für Niederalkyl-, Phenyl-, Phenyl-niederalkyl-oder 5-bis 6gliedrige Heterocyclylreste, die wie oben erwähnt substituiert sein können, stehen.
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tes Phenyl, z. B. durch eine oder mehrere Nitrogruppen oder Halogenatome oder Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen substituiertes Phenyl, oder durch Thienyl, besonders Thienyl- (2), substituiert sein.
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Als Beispiele für den Heterocyclylrest sind zu nennen : lH-l, 2,3-Triazol-5-yl, 1, 3, 4-Triazol-2-yl, 5-Methyl-l, 3, 4-triazol-2-yl, lH-l, 2, 4-Triazol-5-yl,
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diazol-5-yl, Thiatriazol-5-yl, sowie entsprechende Reste mit 6 Ringatomen.
Die Salze der neuen Verbindungen sind Metallsalze, vor allem solche von therapeutisch anwendbaren Alkali- oder Erdalkalimetallen, wie Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, oder Salze mit organischen Basen, z. B. Triäthylamin, N-Äthyl-piperidin, Dibenzyläthylendiamin, Procain, Diisopropylamin, Äthanolamin.
Ist die Gruppe R basisch, so können sich innere Salze bilden.
Die neuen Verbindungen wiesen eine besonders gute antibakterielle Wirkung auf. Sie sind sowohl gegen- über grampositiven wie vor allem auch gegenüber gramnegativen Bakterien wirksam, z. B. gegen Staphylococcus aureus, Penicillin-resistent, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhosa und Bacterium proteus, wie sich auch im Tierversuch, z. B. an Mäusen, zeigt. Sie können daher zur Bekämpfung von Infektionen, die durch solche Mikroorganismen hervorgerufen werden, verwendet werden, ferner als Futtermittelzusätze, zur Konservierung von Nahrungsmitteln oder als Desinfektionsmittel.
Besonders wertvoll sind Verbindungen, in denen der Acylrest in 7-Stellung ein Cyanacetyl-, Methylcyanacetyl-, Phenylcyanacetyl-, p-Chlorphenylcyanacetyl- oder Thienyl-(2)-cyanacetylrest und 1\ ein gegebenenfalls in 2-Stellung substituierter Tetrazol-5-yl- oder I, 3, 4-Thiadiazol-5-yl-rest ist.
Die eine Alkylidengruppe aufweisenden Verbindungen können auch als Zwischenprodukte zur Reindarstellung der Verbindungen mit unsubstituiertem Cyanacetylrest verwendet werden, da die Alkylidengruppe in wässerigem Medium, insbesondere bei erhöhter Temperatur und bei alkalischem PH, hydrolytisch abgespalten werden kann.
Die neuen Verbindungen werden erhalten, wenn man eine Verbindung der Formel
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worin R4 den Acylrest der Formel
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HS-f, Ib in der R die für die Formel I angegebene Bedeutung hat, oder einem Metallsalz davon umsetzt und, wenn erwünscht, eine erhaltene Verbindung der Formel I, worin R und 1) beide für Wasserstoff stehen, zweckmässig in Gegenwart von Katalysatoren, mit einem Aldehyd, Keton oder Nitril umsetzt und, wenn erwünscht, eine gegebenenfalls vorhandene Estergruppe spaltet, und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Metall-, wie Alkali- oder Erdalkalimetallsalze, oder Salze mit Ammoniak oder organischen Basen überführt oder aus erhaltenen Salzen die freien Carbonsäuren oder gegebenenfalls inneren Salze bildet.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Verbindungen sind bekannt oder können nach an sich bekannten Me-
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Nr. l. 588. 507 beschrieben. Salze davon sind z. B. Salze mit Alkali- oder Erdalkalimetallen oder mit Zink oder mit organischen Basen, z. B. Triäthylamin, Diisopropylamin, Äthanolamin.
Als Metallsalze der Thiole verwendet man besonders Alkalimetallsalze, wie das Natrium- oder Kaliumsalz. Die Salze können beispielsweise durch Umsetzung des Thiols mit Carbonaten, Bicarbonaten oder Hydroxyden der Alkalimetalle hergestellt werden.
Ester von Verbindungen der Formel II sind solche, in denen die Carboxylgruppe in 4-Stellung des Dihydrothiazinringes verestert ist. Da die Estergruppe, wenn erforderlich oder erwünscht, abgespalten werden soll, kommen in erster Linie Ester in Betracht, die leicht z. B. solvolytisch, hydrogenolytisch, reduktiv, durch nucleophilen Austausch oder photolytisch zur freien Carbonsäure gespalten werden können.
Reduktiv, z. B. durch Behandeln mit nascierendem Wasserstoff, in die freie Carboxylgruppe überführen lassen sich z. B. gewisse veresterte Carboxygruppen, insbesondere Carboniederalkoxygruppen, in welchen Niederalkyl in ss-Stellung Halogen-, insbesondere Chloratome, enthält, und insbesondere die Carbo-2, 2, 2-tri- chloräthoxy- sowie Carbo-2-jodäthoxygruppe. Sie können in an sich bekannter Weise, vorzugsweise beim Behandeln mit nascierendem Wasserstoff, unter sauren oder neutralen Bedingungen, z. B. mit Zink in Gegenwart einer geeigneten Niederalkancarbonsäure, wie Essigsäure, insbesondere leicht verdünnter, z. B. piger Essigsäure, oder mit einem stark reduzierenden Metallsalz, wie Cobalt-li-acetat in Gegenwart von wässerigen Medien, in die freie Carboxylgruppe übergeführt werden.
Eine Carbo-niederalkoxygruppe, in welcher Niederalkyl in ex-Stellung poly verzweigt ist und/oder in er Stel- lung Reste aromatischen Charakters, wie gegebenenfalls substituierte aromatische Kohlenwasserstoffgruppen, z. B. Phenylreste, oder heterocyclische Gruppen aromatischen Charakters, wie die 2-Furylgruppe, enthält, z. B.
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stellt, wie die Carbo-adamantyloxygruppe, lässt sich durch Behandeln mit einem geeigneten sauren Mittel, wie einer starken, organischen Carbonsäure, vorzugsweise einer halogenhaltigen Niederalkancarbonsäure, in erster Linie Trifluoressigsäure, in die freie Carboxylgruppe umwandeln.
Ebenfalls leicht und unter milden Bedingungen in die freie Carboxylgruppe überführbare veresterte Carboxylgruppen sind silylierte sowie stannylierte Carboxylgruppen. Dies sind Gruppen, die sich beim Behandeln von Verbindungen mit freier Carboxylgruppe sowie Salzen, wie Alkalimetall-, z. B. Natriumsalzen davon, mit einem geeigneten Silylierungsmittel, wie einem Triniederalkyl-silyl-halogenid, z. B. Trimethylsilylchlorid, oder einem N- (Tri-niederalkyl-silyl)-N-Ra-N-Rb-amin, worin Ra ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkylgruppe und Rb ein Wasserstoffatom, eine Niederalkylgruppe oder eine Tri-niederalkyl-silylgruppe darstellt (s. z. B. brit. Patentschrift Nr. 1, 073, 530), oder mit einem geeigneten Stannylierungsmittel, wie einem Bis- (tri-
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benden Mittel, insbesondere Wasser oder einem Alkohol, wie Nieder alkanol, z.
B. Äthanol, in die erwünschten Verbindungen mit freier Carboxylgruppe überführen.
Die Umsetzung mit dem Thiol wird wie in der belgischen Patentschrift Nr. 617687 oder in der holländischen Anmeldung Nr. 6805179 beschrieben in einem inerten Lösungsmittel, wie einem Alkohol, Äther, Keton, N, Ndisubstituierten Amid, z. B. Dimethylformamid, Dimethylacetamid, bei der Verwendung von Salzen vorzugweise in Wasser oder einem mit Wasser mischbaren inerten Lösungsmittel oder in einer Mischung von Wasser und einem solchen Lösungsmittel, z. B. in Aceton, Methanol, Äthanol, Dioxan, Tetrahydrofuran oder deren wässerigen Lösungen, vorzugsweise in wässerigem Aceton, vorgenommen. Die Reaktionstemperatur beträgt +15 bis 700C, vorzugsweise 40 bis 600C. Das PH der Lösung wird vorzugsweise zwischen 5,0 und 7,5 gehalten.
Wenn nötig, wird ein Puffer, z. B. ein Phosphatpuffer oder Natriumacetat, oder, wenn die Verbindung in Form eines Alkalimetallsalzes verwendet wird, z. B. Essigsäure zugesetzt.
Als Aldehyde, Ketone oder Nitrile sind beispielsweise solche aliphatischen Charakters zu nennen, wie Formaldehyd, Acetaldehyd, Aceton, Methyläthylketon, Äthylbutylketon, Cyclopentanon, Cyclohexanon, Cycloheptanon, Acetonitril, Trichloracetonitril oder Trifluoracetonitril, oder solche araliphatischen oder aromatischen Charakters mit höchstens 2 Ringen, die gegebenenfalls, wie oben erwähnt, substituiert sind, z. B. Benzaldehyd, p-Chlorbenzaldehyd, p-Nitroebenzaldehyd, Zimtaldehyd, Salicylaldehyd, Anisaldehyd, Vanillin, Acetophenon, Benzophenon, p-Oxyacetophenon, Phenylacetonitril, Benzonitril oder Zimtsäurenitril.
Als Katalysatoren für die Umsetzung mit den Carbonylverbindungen oder Nitrilen kommen vor allem Salze in Betracht, besonders Acetate von Ammoniak oder Aminen, z. B. Ammoniumacetat, Amylaminacetat, Piperidinacetat, Triäthylammoniumacetat, Dowex-3 (freie Base und Essigsäure-Salz ; Dow Chemical Comp.), ferner Verbindungen, die gleichzeitig saure und basische Gruppen aufweisen, z. B. p-Aminophenol. Weiter kön- nen als Katalysatoren die Salze von Verbindungen der Formel III, worin COR für die Carboxylgruppe steht, mit den genannten Basen dienen.
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Vorzugsweise verwendet man solche Ausgangsstoffe, die zu den erwähnten besonders wirksamen Endprodukten führen.
Die neuen Verbindungen können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, topicale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen, festen oder flüssigen Trägermaterial. Für die Bildung desselben kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Wasser, Gelatine, Lactose, Stärke, Stearylalkohol, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Propylenglykol, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Salben, Cremen, Kapseln oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel, Lösungsvermittler oder Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes oder Puffer. Sie können auch andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten. Die Präparate werden nach üblichen Methoden erhalten.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden die folgenden Systeme verwendet :
System 52A = n-Butanol-Eisessig-Wasser (67 : 10 : 23)
System 101A = n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (42 : 24 : 4 : 30)
System 102A = Essigester-Methyläthylketon-Ameisensäure-Wasser (50 : 30 : 10 : 10).
Die Flecke werden mit Jodspray sichtbar gemacht.
Beispiel 1 :
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tensivem Rühren das PH auf 6,4 eingestellt und unter Stickstoff während 6 h auf 600 erwärmt. Das Reaktionsgemisch nimmt dabei einen PH-Wert von 6, 9 an. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch mit zweimal 800 ml Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 10 ml Puffer PH 6,5 zurückgewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 1 l Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 4n-Salzsäure (zirka 8,5 ml) auf PH 2, 2 eingestellt. Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt. Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 11 und dann mit 0, 6 1 Essigester nach.
Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 40 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet, durch eine Säule von 90 g Silicagel (Durchmesser 4,5 cm, Höhe = 12,5 cm) filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einem Gemisch von Aceton und Methanol gelöst und mittels Natrium-ct-äthyl-hexanoat in das Natriumsalz übergeführt.
Durch Rückführung in die Säureform in der bei der Extraktion geschilderten Weise und anschliessende Filtration des in einem Gemisch aus gleichen Teilen von Chloroform und Aceton gelösten Rückstandes durch eine Säule von Silicagel (Durchmesser : Höhe = 1 : 9) erhält man 7-Cyanacetylamino-3- (2-me-
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b) In einer Lösung von 12, 8 g Natriumsalz der 7-Cyanacetylamino-cephalosporansäure in 280 ml Phosphatpuffer vom PH 6,4 werden 6,0 g 2-Methyl-l, 3,4-thiadiazolin-5-thion suspendiert. Dann wird durch tropfenweise Zugabe von 2n-Natriumcarbonatlösung unter intensivem Rühren das PH auf 6, 6 eingestellt und unter Stickstoff während 8 h auf 600 erwärmt. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch nacheinander mit 2 I und 1, 5 1 Essigester.
Die organischen Phasen werden zweimal mit je 20 ml Puffer PH 6,5 zurückgewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 2, 5 I Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 4n-Salzsäure (zirka 35 ml) auf PH 2,4 eingestellt. Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt. Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 1, 5 1 und dann mit 1 l Essigester nach. Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 100 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet, durch eine Säule von 150 g Silicagel (Durchmesser 4, 5 cm, Höhe = 21 cm) filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand (13, 9 g) wird in zirka 50 ml Aceton gelöst, mit trockenem Essigester versetzt und im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt. Dann nimmt man nochmals in Essigester auf, engt ein und gibt einige Tropfen Hexan dazu. Man lässt 1 h bei-150 stehen, nutscht das Präzipitat ab und wäscht zuerst mit Essigester + Hexan (3 : 1), dann mit Hexan nach. 3, 7 g des so erhaltenen Präzipitats werden aus einer acetonischen Lösung an 35 g neutralem Silicagel adsorbiert. Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 300 g Silicagel (Durchmesser 4, 5 cm, Höhe = 45 cm) und eluiert zuerst mit einem Gemisch aus 2 Vol.-Teilen Chloroform und 1 Vol. -
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Teil Aceton und später mit Chloroform + Aceton (1 : 1).
Die ersten 1, 2 I Eluat werden verworfen, die nachfolgenden 1, 21 enthalten das Reaktionsprodukt. Die letzten 1, 21 werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 40 Vol. -Teilen Aceton gelöst, 10 Vol. -Teile Methanol zugefügt und dann durch Zugabe von 1, 3 Vol. -Teilen einer 3m-methanolischen Lösung von Natrium-a-äthylhexanoat in das kristalline Natriumsalz der 7-Cyanacetylamino-3- (2-methyl-l, 3, 4-thiadiazol-5-yl-thio)-methyl-ceph-3-em-4-carbonsäure übergeführt. Das Natriumsalz besitzt keinen scharfen Schmelzpunkt, sondern zersetzt sich bei zirka 2150 unter Braunfärbung. Die freie Säure schmilzt bei 146 bis 1470 (im Vakuumröhrchen, unter Zersetzung).
Im UV-Spektrum ist ^max = 272 nm (e = 13 500) ;
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ester-Eisessig (9 : 1) = 0, 14.
Die Verbindung weist eine hohe Aktivität gegenüber grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen auf, sowohl bei parenteraler als auch bei peroraler Anwendung. Bei in-vitro-Tests (Verdünnungstest) mit Staphylococcus aureus liegt die minimale Hemmkonzentration (MIC) bei 0, 01 bis 1 y ; mit gramnegativen Keimen wie E. coli, Klebsiella pneumoniae oder Salmonella typhosa liegt die MIC im Verdünnungstest bei 0, 1 bis 0, 5 y.
Beispiel 2 : In einer Lösung von 12, 8 g NÅatriumsalz der 7-Cyanacetylamino-cephalosporansäure in 280 ml Phosphatpuffer (10%ig) vom PH 6,7 werden 5,27 g l-Methyl-5-mercapto-tetrazol suspendiert. Dann wird durch tropfenweise Zugabe von 2n-Natriumcarbonatlösung unter intensivem Rühren das PH auf 6,6 eingestellt und unter Stickstoff während 7 h auf 600 erwärmt. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch nacheinan-
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waschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 2,5 l Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 4n-Salzsäure (zirka 30 ml) auf PH 2,5 eingestellt. Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt.
Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 1, 51 und dann zweimal mit 11 Essigester nach. Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 100 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von zirka 150 ml eingeengt. Zu dieser Lösung gibt man in kleinen Portionen unter gutem Rühren 150 ml Hexan und lässt dann mehrere Stunden in der Kälte stehen. Man nutscht ab und wäscht den Rückstand mit einem Gemisch aus Essigester und Hexan (1 : 1). Das Filtrat wird verworfen. Der Rückstand (6, 57 g) wird aus einer acetonischen Lösung an 50 g neutrales Silicagel adsorbiert.
Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 450 g neutralem Silicagel (Durchmesser 5, 75 cm, Höhe = 41 cm) und eluiert mit einem Gemisch aus 2 Vol.-Teilen Chloroform und 1 Vol. -Teil Aceton. Die ersten 1,5 l Eluat werden verworfen, die nachfolgenden 2 l enthalten das Reaktionsprodukt. Diese 2 I werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 40 Vol. -Teilen Aceton gelöst, 10 Vol. -Teile Methanol zugefügt und dann durch Zugabe von 1,3 Vol. -Teilen einer 3m-methanolischen Lösung von Natrium-a-äthylhexanoat in das kristalline Natriumsalz der 7-Cyanacetylamino-3- (1-methyl-tetrazolyl-5-yl-thio)-methyl-ceph-3-em -4-carbonsäure übergeführt.
Im UV-Spektrum ist Xmax = 268 nm (e = 11150) ;
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Dann wird durch tropfenweise Zugabe von 2n-Natriumcarbonatlösung unter intensivem Rühren das PH auf 6,6 eingestellt und unter Stickstoff während 6 h auf 600 erwärmt. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch nacheinander mit 2 I und 1, 5 1 Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 20 ml Puffer PH 6,5 zurückgewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 2,5 l Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 4n-Salzsäure auf PH 2,5 eingestellt. Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt. Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 1, 5 l und dann zweimal mit 11 Essigester nach.
Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 100 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von zirka 60 ml eingeengt, wobei ein voluminöses Präzipitat entsteht. Zu diesem Brei gibt man in kleinen Portionen unter gutem Rühren 100 ml Hexan und lässt 1 h in der Kälte stehen. Man nutscht ab und wäscht den Rückstand mit einem Gemisch aus Essigester und Hexan (2 : 3). Das Filtrat wird verworfen.
Der Rückstand wird aus einer acetonischen Lösung an 50 g neutrales Silicagel adsorbiert. Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 450 g neutralem Silicagel (Durchmesser 5, 75 cm, Höhe = 41 cm) und eluiert
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-Teilenkristalline Natriumsalz der 7-Cyanacetylamino-3-(3-methyl-1, 2, 4-thiadiazol-5-yl-thio)-methyl-ceph-3-em- -4-carbonsäure übergeführt.
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diert. Dann wird durch tropfenweise Zugabe von 2n-Natriumcarbonatlösung unter intensivem Rühren das PH auf 6,6 eingestellt und unter Stickstoff während 6 h auf 600 erwärmt. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch nacheinander mit 2,5 l und 2 I Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 50 ml Puffer pH 6,5 zurückgewaschen und verworfen.
Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 2, 5 I Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 4n-Salzsäure auf PH 2,5 eingestellt. Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt. Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 1, 5 l und dann dreimal mit 11 Essigester nach. Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 100 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von zirka 400 ml eingeengt, wobei ein Präzipitat entsteht. Zu diesem Gemisch gibt man unter gutem Rühren 350 ml Hexan und lässt 1 h in der Kälte stehen. Man nutscht das voluminöse Präzipitat ab und wäscht den Rückstand mit einem Gemisch aus Essigester und Hexan (1 : 1).
Das Filtrat wird verworfen. Der Rückstand wird aus einer acetonischen Lösung an 50 g neutrales Silicagel adsorbiert. Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 750 g neutralem Silicagel (Durchmesser 5,75 cm, Höhe = 41 cm) und eluiert mit einem Gemisch aus 2 Vol. -Teilen Chloroform und 1 Vol.-Teil Aceton. Der erste Liter Eluat wird verworfen, die nachfolgenden 2 I enthalten das Reaktionsprodukt. Diese 2 I werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 40 Vol. -Teilen Aceton gelöst, 10 Vol.-Teile Methanol zugefügt und dann durch Zugabe von 1, 3 Vol.-Teilen einer 3m-methanolischen Lösung von Natrium-a-äthylhexanoat in das kristalline Natriumsalz der 7-Cyanacetylamino-3-(2-methylthio-1, 3, 4-thiadiazol-5-yl-thio)-methyl-ceph-3-em-4-carbonsäure übergeführt.
Im UV-Spektrum ist #max = 274 nm (E = 13500) ;
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Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52A = 0,40, Rf101A = 0,45, Rf102A = 0,78; Rf in Essigester-Eisessig (9 : 1) = 0, 30.
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Dann wird durch tropfenweise Zugabe von 2n-Natriumcarbonatlösung unter intensivem Rühren das PH auf 6,6 eingestellt und unter Stickstoff während 7 h auf 60 erwärmt. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch nacheinander mit 21 und 1, 51 Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 20 ml Puffer PH 6,5 zurückgewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 2 I Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 4n-Salzsäure auf PH 2, 5 eingestellt.
Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt. Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 1, 5 l und dann zweimal mit 11 Essigester nach. Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 100 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von zirka 200 ml eingeengt, wobei ein Präzipitat entsteht. Zu diesem Brei gibt man unter gutem Rühren 200 ml Hexan und lässt 1 h in der Kälte stehen. Man nutscht ab und wäscht den Rückstand mit einem Gemisch aus Essigester und Hexan (1 : 1). Das Filtrat wird verworfen. Der Rückstand wird aus einer acetonischen Lösung an 30 g neutrales Silicagel adsorbiert.
Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 570 g neutralem Silicagel (Durchmesser 5,75 cm, Höhe = 47 cm) und eluiert mit einem Gemisch aus 2 Vol. Teilen Chloroform und 1 Vol. -Teil Aceton. Die ersten 2 I Eluat werden verworfen, die nachfolgenden 2 I enthalten das Reaktionsprodukt. Diese 2 l werden im Vakuum zur Trockne eingedampft und dann in wenig Essigester aufgenommen. Man erhält auf diese Weise nahezu farblose, stark solvatisierte Kristalle der Säureform.
Diese werden in 40 Vol. -Teilen Aceton gelöst, 10 Vol.-Teile Methanol zugefügt und dann durch Zugabe von 1,3 Vol. -Teilen einer 3m-methanolischen Lösung von Natrium-α-äthylhexanoat unter langsamem Einengen der
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(2-methyl-ceph-3-em-4-carbonsäureübergeführt.
Im UV-Spektrum ist ^max : : 268 nm (E = 10 500) ;
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unter Stickstoff während 6h auf 600 erwärmt. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch nacheinander mit 750 ml und 500 ml Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 30 ml Puffer PH 6,5 gewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 11 Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 4n-Salzsäure (zirka 15 ml) auf PH 2, 5 eingestellt.
Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt. Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 0, 51 und dann noch zweimal mit je 250 ml Essigester nach. Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 50 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf zirka 100 ml Volumen eingeengt. Zu dieser Lösung gibt man unter intensivem Rühren 100 ml Hexan zu, wobei sich ein Niederschlag bildet. Man lässt 1/2 h bei 00 stehen, nutscht das Präzipitat ab und wäscht zuerst mit Essigester + Hexan (l : l), dann mit Hexan nach. 3,66 g des so erhaltenen Präzipitates werden aus einer acetonischen Lösung an 30 g Silicagel adsorbiert.
Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 400 g Silicagel (Durchmesser 5, 75 cm, Höhe = 35 cm) und eluiert mit einem Gemisch aus 2 Vol. -Teilen Chloroform und 1 Vol.-Teil Aceton. Die ersten 1, 7 I Eluat werden verworfen, die nachfolgenden 1, 5 I enthalten das Reaktionsprodukt. Sie werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand wird in wenig Essigester aufgenommen und durch Einengen der Lösung in eine solvatisierte farblose Kristallform übergeführt.
Diese schon nahezu reine Substanz wird in der 20fachen Menge Methanol suspendiert, durch Zugabe von 1, 3 Vol.-Teilen einer 3m-methanolischen Lösung von Natrium-cx-äthylhexanoat in Lösung gebracht und durch Einengen der Lö-
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(I,thyl-ceph -3-em -4-carbonsäure übergeführt.
Im UV-Spektrum ist Amax = 270 nm (e = 13 150) ;
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Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52A = 0, 31, Rf101A =0, 47, Rflo2A = 0, 68 ; Rf in Essigester-Eisessig (9 : 1) = 0, 21.
Beispiel 7 : In einer Lösung von 12, 8 g Natriumsalz der 7-Cyanacetylamino-cephalosporansäure in
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wird durch tropfenweise Zugabe von 2n-Natriumcarbonatlösung unter intensivem Rühren das PH auf 6,8 eingestellt und unter Stickstoff während 8 h auf 600 erwärmt. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch dreimal mit je 1, 5 l Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 50 ml Puffer PH 6,5 gewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 2 l Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 4n-Salzsäure (zirka 45 ml) auf PH 2,5 eingestellt. Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt. Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 1, 5 1 und dann mit 1 I Essigester nach.
Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 100 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf zirka 300 ml eingeengt. Zu dieser Lösung gibt man unter intensivem Rühren 300 ml Hexan zu, wobei sich ein Niederschlag bildet. Man lässt 1/2 h bei 00 stehen, nutscht das Präzipitat ab und wäscht zuerst mit Essigester + Hexan (1 : 1), dann mit Hexan nach. 5,9 g des so erhaltenen Präzipitates werden aus einer acetonischen Lösung an 30 g Silicagel adsorbiert. Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 470 g Silicagel (Durchmesser 5, 75 cm, Höhe = 42 cm) und eluiert zuerst mit einem Gemisch aus 2 Vol. -Teilen Chloroform und 1 Vol. -Teil
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kuum zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird mit Essigester verrieben.
Nach Filtration erhält man die 7-Cyanacetylamino-3- (3-methyl-l, 2, 4-triazol-5-yl-thio)-methyl-ceph-3-em-4-carbonsäure als leicht gefärbtes Pulver. Dieses wird in Methanol suspendiert, durch Zugabe von 1, 3 Vol. -Teilen einer 3n-methanolischen Lösung von Natrium-et-äthylhexanoat in Lösung gebracht und nach Zugabe des gleichen Volumens abs.
Äthanols und Einengen auf ein kleines Volumen in das feste Natriumsalz übergeführt. Die leichte Färbung der Substanz kann durch Behandlung mit Aktivkohle in methanolischer Lösung entfernt werden. Zur Reinigung wird das Natriumsalz durch Ansäuern seiner wässerigen Lösung auf PH 2,5 und Extraktion mit Essigester wieder in die Säure übergeführt, diese wie oben mit Essigester verrieben und daraus in der oben beschriebenen Weise wieder das Natriumsalz gewonnen.
Im UV-Spektrum ist Xmax = 267 nm (e = 9900) ; [fx] =-11 1 (c = 1, 0 in Wasser).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52A = 0,31, Rf101A = 0,45, Rf102A = 0,57; Rf in Essigester-Eisessig (9 : 1) = 0, l.
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8 : In- tetrazol suspendiert. Dann wird durch tropfenweise Zugabe von 2n-Natriumcarbonatlösung unter intensivem Rühren das PH auf 6,6 eingestellt und unter Stickstoff während 7 h auf 600 erwärmt. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch nacheinander mit 200 ml und 150 ml Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 5 ml Puffer pp 6, 5 zurückgewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 300 ml Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 2n-Salzsäure (zirka 6 ml) auf PH 2,5 eingestellt.
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Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt.
Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert noch zweimal mit je 150 ml Essigester nach. Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 10 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von zirka 20 ml eingeengt. Zu dieser Lösung gibt man in kleinen Portionen unter gutem Rühren 20 ml Hexan und lässt dann mehrere Stunden in der Kälte stehen. Man nutscht ab und wäscht den Rückstand mit einem Gemisch aus Essigester und Hexan (1 : 1). Das Filtrat wird verworfen. Der Rückstand wird aus einer acetonischen Lösung an 5 g neutrales Silicagel adsorbiert. Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 50 g neutralem Silicagel und eluiert mit einem Gemisch aus 2 Vol.-Teilen Chloroform und 1 Vol. -Teil Aceton.
Die ersten 160 ml Eluat werden verworfen, die nachfolgenden 200 ml enthalten das Reaktionsprodukt. Sie werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 30 Vol. Teilen Aceton gelöst, 5 Vol. -Teile Methanol zugefügt und dann durch Zugabe von 1, 3 Vol. -Teilen einer 3mmethanolischen Lösung von Natrium-ct-äthylhexanoat in das kristalline Natriumsalz der 7-Cyanacetylamino-
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ester-Eisessig (9 : 1) = 0, 19.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden : 20, 0 g (36,7 mMol) N, N-Phthaloyl-cephalosporin C (72%ig) werden in 400 ml destilliertem Wasser aufgeschlämmt und mit 71 ml In-Natronlauge in Lösung gebracht. Die Lösung wird mit 400 mg der Acetylesterase aus Bacillus subtilis ATCC 6633 20 h bei 37 unter Konstanthaltung eines pH-Wertes von 7, 3 gerührt. Man neutralisiert die bei der enzymatischen Verseifung frei werdende Essigsäure mit 32 ml n-Natronlauge. Nach Beendigung der Verseifungsreaktion gibt man Essigester und unter Kühlen auf 00 und Rühren tige Phosphorsäure zu, bis ein PH von 2,3 erreicht ist. Die wässerige Phase wird mit Natriumchlorid gesättigt und noch dreimal mit 300 ml Essigester nachextrahiert.
Die Extrakte werden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das desacetylierte Rohprodukt von N, N-Phthaloyl-cephalosporin C wird in 320 ml Dioxan und 80 ml Methanol aufgenommen, portionenweise mit 18 g Diphenyldiazomethan versetzt und 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird zur Trockne verdampft und zweimal mit 400 ml Äther digeriert. Der Rückstand wird in Benzol gelöst und an 200 g säuregewaschenem Silicagel (Kolonnendurchmesser 4, 15 cm) chromatographiert ; es werden Fraktionen zu 100 ml entnommen. Je drei Benzol-, Benzol-Essigester (9 : 1)- und Benzol-Essigester (5 : 5)-Fraktionen werden verworfen.
Mit den nächsten vier Benzol-Essigester (5 : 5)-Fraktionen wird der 7-(5'¯hthalimido-5'-carboxybenzhydryl-valeroyl)-amino-ceph-3-em-3-hydroxy- methyl-4-carbonsäure-benzhydrylester eluiert und aus Essigester-Cyclohexan kristallisiert, F. 113 bis 1150 ;
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UV-Absorptionsspektrum (in Feinsprit) : Xmax 259 rgu (E = 9100) und \fl 241 mfi (e = 14600).
Die Substanz hat im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Toluol-Aceton (4 : 1) einen RfWert von 0,11 (Entwicklung mit Jod).
Unter Trockeneiskühlung wird zu einem Gemisch von 3,46 ml (40 mMol) Propionsäurechlorid und 2,90 ml (36 mMol) Pyridin in 30 ml absolutem Dimethylformamid eine Lösung von 3, 34 g (4 mMol) 7- (51-Phthalimido- -5'-carboxybenzhydryl-valeroyl)-amino-ceph-3-em-3-hydroxymethyl-4-carbonsäure-benzhydrylester in 7 ml Dimethylformamid zugetropft. Man lässt 3 h bei Raumtemperatur reagieren. Das Reaktionsprodukt wird zwi-
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Essigester extrahiert. Der Essigesterextrakt wird mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der 7-(5'-Phthalimido-5'-carboxybenzhydryl-valeroyl)-amino-ceph-3-em- - 3-propionyloxymethyl-4-carbonsäure-benzhydrylester kristallisiert in farblosen Drusen aus Aceton-Essigester ; F. 163 bis 1650 ;
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Wert von 0,19.
2,03 g (2,28 mMol) 7-(5'-Phthalimido-5'-carboxybenzhydryl-valeroyl)-amino-ceph-3-em-3-propionyl - oxymethyl-4-carbonsäurebenzhydrylester werden in 20 ml Methylenchlorid gelöst, auf-100 gekühlt und mit 1, 75 ml (21,7 mMol) absolutem Pyridin versetzt. Dann gibt man unter Rühren innerhalb 12 min 11, 4 ml (5,5 mMol) einer frisch zubereiteten zuigen Phosphorpentachloridlösung in absolutem Methylenchlorid zu.
Man rührt anschliessend 40 min bei-100. Die Lösung wird innerhalb 3 min mit 7, 62 ml (188 mMol) auf-200 gekühltem, absolutem Methanol versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 30 min bei-100 und 60 min bei +200 weitergerührt. Unter gutem Mischen gibt man 19 ml (19 mMol) In-Salzsaure zu und lässt 45 min bei 200 ausreagieren. Darauf wird das Gemisch mit 3,8 ml 50%figer wässeriger Trikaliumphosphatlösung und 18, 3 ml 2nNatronlauge auf PH 8, 0 eingestellt. Die Phasen werden getrennt, der über Natriumsulfat getrocknete Methylenchlorid-Extrakt wird eingedampft und 2 h am Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wird in 50 ml Toluol-
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Essigester (3 : 1) aufgenommen und dreimal mit je 20 ml Äthanol-2n-Salzsäure (l : l) extrahiert.
Die vereinigten unteren Phasen werden mit 30 ml 2n-Sodalösung auf PH 7, 0 gestellt, der Alkohol abgedampft und die wässerige Lösung mit Essigester reextrahiert. Der getrocknete und eingedampfte Essigesterextrakt wird unmittelbar darauf in l, 14ml (10, 5 mMol) Anisol aufgenommen, auf-300 gekühlt und mit 3,32 ml (43,5 mMol) Trifluoressigsäure versetzt. Man lässt die Säure 30 min bei +200 einwirken und dampft sie darauf unter Zusatz von Toluol gut ab. Der Rückstand wird mit 40 ml auf-300 gekühltem Methanol versetzt und mit 0,4 ml Triäthylamin auf PH 3, 5 gestellt. Der sich spontan bildende Niederschlag wird abzentrifugiert und je zweimal mit 5 ml Methanol, Methylenchlorid und Äther gewaschen und am Hochvakuum getrocknet.
Die 3-Propionyloxymethyl- - 7 -amino-ceph-3-em-4-carbonsäure ist ein amorphes Pulver.
[ (x] '=+110 1 (c = 1, 000 in 0, 5n-Natriumbicarbonat).
UV-Absorptionsspektrum (in 0, 5n-Natriumbicarbonat) : Àmax = 262 mg (E = 8200).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (30 : 20 : 6 : 24) zeigt die Substanz einen Rf-Wert von 0,58 (7-Aminocephalosporansäure Rf 0, 55).
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amin in 6,5 mI Methylenchlorid zugegeben und anschliessend 45 min bei -50 bis -700 unter Stickstoff gerührt.
Darauf wird der Ansatz mit 10 ml 10% iger wässeriger Kaliumdihydrogenphosphatlösung gerührt, wobei sich ein PH von 5,0 einstellt. Man trennt die untere organische Phase ab und extrahiert die wässerige Phase mit 5 ml Methylenchlorid und mit 10 ml Essigester nach. Die wässerige Phase wird mit 20 ml Essigester überschichtet, mit 2n-Salzsäure auf PH 2,0 angesäuert und-nach Sättigen mit Kochsalz und Phasentrennung - noch zweimal mit je 10 ml Essigester nachextrahiert. Die drei Essigesterauszüge werden mit 10 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und durch eine Säule (Durchmesser 16 mm, Höhe = 10 cm) von 5 g Silicagel filtriert. Man wäscht die Säule mit 20 ml Essigester nach und engt die vereinigten Filtrate auf 2,3 bis 3,0 g ein.
Aus der konzentrierten Lösung wird mit 50 ml Äther-Petroläther (l : l) die 3-Propionyloxymethyl- - 7 -cyanacetylamino-ceph-3-em-4-carbonsäure ausgefällt und aus Tetrahydrofuran-Essigester umkristallisiert.
F. 146 bis 1500.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (67 : 10 : 23) ist der Rf-
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0, 5 I Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 20 ml Puffer PH 6,5 zurückgewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 1, 5 1 Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 4n-Salzsäure (zirka 37 ml) auf PH 2,6 eingestellt. Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt. Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 11 und dann mit 0, 5 l Essigester nach. Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 70 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von zirka 100 ml eingeengt.
Zu dieser Lösung gibt man in kleinen Portionen unter gutem Rühren 100 ml Hexan und lässt dann mehrere Stunden in der Kälte stehen. Man nutscht ab und wäscht den Rückstand mit einem Gemisch aus Essigester und Hexan (1 : 1). Das Filtrat wird verworfen. Der Rückstand (8,5 g) wird aus einer acetonischen Lösung an 50 g neutrales Silicagel adsorbiert. Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 450 g neutralem Silicagel (Durchmesser 5,75 cm, Höhe = 41 cm) und eluiert mit einem Gemisch aus 2 Vol. -Teilen Chloroform und 1 Vol. -Teil Aceton. Der erste Liter Eluat wird verworfen, die nachfolgenden Fraktionen enthalten das Reaktionsprodukt. Diese werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 40 Vol.
Teilen Aceton gelöst, 10 Vol.-Teile Methanol zugefügt und dann durch Zugabe von 1,3 Vol. -Teilen einer 3m-methanolischen Lösung von Natrium-ct-äthyl-hexanoat in das kristalline Natriumsalz der 7- (a-Phenyl- -α-cyanacetylamino)-3-(1-methyltetrazolyl-5-yl-thio)-methyl-ceph-3-em-4-carbonsäure übergeführt.
'Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52A = 0, 44, Rf in Essigester-Eisessig (9 : 1), Laufstrecke 16 cm =0, 33.
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:K HPO unter intensivem Rühren das PH auf 6,5 eingestellt und unter Stickstoff während 7 h auf 600 erwärmt. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch mit zweimal 40 ml Essigester. Die organischen Phasen werden mit je 3 ml Puffer PH 6, 5 zurückgewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 50 ml Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 4n-Salzsäure auf PH 2,6 eingestellt. Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt.
Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit
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Kochsalz und extrahiert mit 30 ml und dann mit 20 ml Essigester nach. Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 5 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfatgetrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einem Chloroform-Aceton (1 : -Gemisch gelöst, durch eine Säule von 20 g Silicagel (Durchmesser : Höhe = 1 : 9) filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Aceton gelöst und mittels einer 3m-methanolischen Lösung von Natrium-ct-äthyl-hexanoat in das Natriumsalz der 7- (a-Phenyl-a-cyanacetylamino) -3- (2-methyl-l, 3, 4-thiadi- azol-5-yl-thio)-methyl-ceph-3-em-4-carbonsäure übergeführt.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52A = 0, 49, Rf in Essigester-Eisessig (9 : 1), Laufstrecke 15 cm = 0, 25.
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Laufstrecke 15 cm = 0,36.
Beispiel 11 : In einer Lösung von 421 mg 7- [ct-Thienyl- (2)-a-cyanacetylamino] -cephalosporansäure in 9 ml Phosphatpuffer (10%ig) vom pH 6,7 werden 152 mg 1-Methyl-5-mercaptotetrazol suspendiert. Dann wird durch Zugabe von 3, 75 ml einer zuigen Lösung von K HPO unter intensivem Rühren das PH auf 6,5 eingestellt und unter Stickstoff während 7 h auf 60 erwärmt. Man kühlt ab und extrahiert das Gemisch nachein- ander mit 50 ml und 25 ml Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 5 ml Puffer PH 6,5 zurückgewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 80 ml Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 2n-Salzsäure auf PH 2,6 eingestellt. Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt.
Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 50 ml und dann mit 25 ml Essigester nach. Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 10 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von zirka 5 ml eingeengt. Zu dieser Lösung gibt man tropfenweise unter gutem Rühren 5 ml Hexan und lässt dann mehrere Stunden in der Kälte stehen. Man nutscht ab und wäscht den Rückstand mit einem Gemisch aus Essigester und Hexan (1 : 1). Das Filtrat wird verworfen. Der Rückstand wird aus einer acetonischen Lösung an 2,5 g neutrales Silicagel adsorbiert. Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 25 g neutralem Silicagel (Durchmesser 2,0 cm, Höhe = 17 cm) und eluiert mit einem Gemisch aus 2 Vol.
Teilen Chloroform und 1 Vol. -Teil Aceton. Ein Vorlauf von 50 ml wird verworfen, die nachfolgenden Fraktionen enthalten das Reaktionsprodukt. Diese werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in
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Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52A = 0, 42, Rf in Essigester-Eisessig (9 : 1), Laufstrecke 15 cm = 0, 3.
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ander mit 80 ml und 40 ml Essigester. Die organischen Phasen werden zweimal mit je 5 ml Puffer PH 6,5 zurückgewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 100 ml Essigester überschichtet und unten intensivem Rühren mittels 2n-Salzsäure auf PH 2,6 eingestellt. Eine dabei auftretende braune Fällung wird durch Filtration entfernt. Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert mit 80 ml und dann mit 40 ml Essigester nach.
Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 10 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von zirka 10 ml eingeengt. Zu dieser Lösung gibt man in kleinen Portionen unter gutem Rühren 10 ml Hexan und lässt dann mehrere Stunden in der Kälte stehen. Man nutscht ab und wäscht den Rückstand mit einem Gemisch aus Essigester und Hexan (1 : 1). Das Filtrat wird verworfen. Der Rückstand wird aus einer acetonischen Lösung an 4 g neutrales Silicagel adsorbiert. Das trockene Adsorbat gibt man auf eine Säule von 40 g neutralem Silicagel (Durchmesser 2, 4 cm, Höhe = 18,5 cm) und eluiert mit einem Gemisch aus 2 Vol. Teilen Chloroform und 1 Vol. -Teil Aceton.
Ein Vorlauf von 60 ml wird verworfen, die nachfolgenden Fraktionen enthalten das Reaktionsprodukt. Diese werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 40 Vol. -Teilen Aceton gelöst, 10 Vol. -Teile Methanol zugefügt und dann durch Zugabe von 1, 3 Vol. -Teilen einer 3m-methanolischen Lösung von Natrium-a-äthyl-hexanoat in das Natriumsalz der 7- (a-p-Chlorphenyl- -α-cyanacetylamino)-3-(1-methyltetrazol-5-yl-thio)-methyl-ceph-3-em-4-carbonsäure übergeführt.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52A = 0, 47, Rf in Essigester-Eisessig (9 : 1), Laufstrecke 15 cm = 0, 4.
Beispiel 13 : In einer Lösung von 345 mg 7- (a-Cyanpropionylamino)-cephalosporansäure in 8 ml Phos-
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fer PH 6,5 zurückgewaschen und verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen werden mit 75 ml Essigester überschichtet und unter intensivem Rühren mittels 2n-Salzsäure auf PH 2,6 eingestellt. Eine dabei auftretende hellbraune Fällung wird durch Filtration entfernt. Man trennt die Phasen, sättigt die wässerige Lösung mit Kochsalz und extrahiert zweimal mit 40 ml Essigester nach. Nachdem die organischen Phasen zweimal mit je 10 ml gesättigter Kochsalzlösung durchgeschüttelt worden sind, werden sie mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird in einem Chloroform -Aceton (1 : 1) -Gemisch gelöst, durch eine Säule von 20 g Silicagel (Durchmesser : Höhe : : 1 : 9) filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird in wenig Aceton gelöst und mittels einer 3m-methanolischen Lösung von Natrium-ct-äthyl-
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hexanoatthyl-ceph-3-em-4-carbonsäure übergeführt.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf52A =0, 38, Rf in Essigester-Eisessig (9 : 1), Laufstrecke 15 cm =0, 15.
Beispiel 14 : 1, 0 g7-Cyanacetylamino-3- (l-methyl-tetrazol-5-yl-fhio)-methyl-ceph-3-em-4-car- bonsäure und 220 mg wasserfreies Ammoniumacetat werden in einem Gemisch von 20 ml Aceton und 14 ml Dimethylformamid gelöst und 20 h bei 220 unter Lichtausschluss stehengelassen. Man dampft im Hochvakuum zur Sirupdicke ein, nimmt den Rückstand in 30 ml 10% Phosphatpuffer PH 6,3 auf und extrahiert mit 100 ml und dann mit 50 ml Essigester. Die Extrakte werden zweimal mit je 20 ml Puffer rückextrahiert. Die Essigesterlösungen werden verworfen. Die vereinigten wässerigen Phasen überschichtet man mit 150 ml Essigester und stellt mittels 2n-Salzsäure unter intensivem Rühren auf PH 2, 4 ein. Die Phasen werden getrennt, die wässerige mit Kochsalz gesättigt und noch zweimal mit je 60 ml Essigester nachextrahiert.
Die Essigesterphasen wäscht man
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gereinigt. Durch Gemische aus Chloroform-Aceton (98 : 2) und (95 : 5) wird dabei die 7- (cx-Cyano-ss -dime- thylacrylamino)-3- (l-methyl-tetrazol-5-yl-thio)-methyl-ceph-3-em-4-carbonsäure in reiner Form eluiert.
Sie kristallisiert aus einem Gemisch von Methanol und Äther.
Schmelzpunkt 1700 unter Zersetzung.
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Laufstrecke 15 cm = 0, 23.
Das wasserlösliche Natriumsalz lässt sich mittels Natrium-cx-äthyl-hexanoat in Methanol-Aceton-Lösung in kristallisierter reiner Form darstellen.
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In the French Patent specification Ni.1.463.651, which corresponds to the Austrian patent specification No. 266317, are therapeutically effective derivatives of 7-amino-cephalosporanic acid of the formula
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described, in which R. and l have the meaning given below and in which Ra is, inter alia, a heterocyclically etherified mercapto group. It has now been found that particularly strong antibiotic compounds are those of the formula
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are, in which H is an unsaturated heterocyclyl radical which is bonded to the sulfur via a carbon atom and has 5 to 6 ring members and contains at least 2 nitrogen atoms and also a further heteroatom from the group nitrogen, oxygen and sulfur.
In the above formula I, R1 and R2 are identical or different; they stand for hydrogen or for monovalent hydrocarbon radicals optionally substituted by halogen atoms or nitro groups with a maximum of 8 carbon atoms or for unsaturated heterocyclyl radicals bonded via carbon with 5 to 6 ring members or together a divalent hydrocarbon radical of the formula
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form, where R 'and RJ have the same meaning as R1 and R2 or together represent an alkylene radical with a maximum of 8 carbon atoms.
Optionally substituted monovalent hydrocarbon radicals are above all lower alkyl, aryl or aryl-lower alkyl radicals, such as optionally substituted phenyl, toluyl or benzyl; Unsaturated heterocyclyl radicals are especially heterocyclyl radicals of aromatic character with a sulfur, oxygen or nitrogen atom, such as thienyl, furyl, pyridyl, picolyl, pyrryl, or corresponding heterocyclyl-lower alkyl radicals, such as thenyl, furfuryl, pyridyl (2) methyl.
Optionally substituted divalent hydrocarbon radicals are, for example, saturated or unsaturated aliphatic, cycloaliphatic or araliphatic radicals, such as alkylidene, alkenylidene, cycloalkyldene or cycloalkenylidene radicals, especially those with 1 to 8, especially 1 to 6, carbon atoms, such as methylene , and methylene substituted by one or two lower alkyl or lower alkenyl radicals, e.g. B. allylidene, ethylidene, isopropylidene, butylidene, cyclopentylidene, cyclohexylidene, or substituted by aryl radicals divalent saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon radicals, such as phenylalkylidene or phenylalkenylidene radicals, where the aryl radicals can also be substituted, e.g.
B. by one or more lower alkyl groups, nitro groups and / or halogen atoms, especially an optionally substituted benzylidene or phenylallylidene radical as mentioned.
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group-substituted benzylidene. Furthermore, in particular hydrogen and R can stand for lower alkyl, phenyl, phenyl-lower alkyl or 5- to 6-membered heterocyclyl radicals, which can be substituted as mentioned above.
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tes phenyl, e.g. B. phenyl substituted by one or more nitro groups or halogen atoms or lower alkyl or lower alkoxy groups, or by thienyl, especially thienyl- (2).
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Examples of the heterocyclyl radical are: 1H-1, 2,3-triazol-5-yl, 1, 3, 4-triazol-2-yl, 5-methyl-1, 3, 4-triazol-2-yl , lH-l, 2, 4-triazol-5-yl,
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diazol-5-yl, thiatriazol-5-yl, and corresponding radicals with 6 ring atoms.
The salts of the new compounds are metal salts, especially those of therapeutically applicable alkali or alkaline earth metals, such as sodium, potassium, ammonium, calcium, or salts with organic bases, e.g. B. triethylamine, N-ethyl-piperidine, dibenzylethylenediamine, procaine, diisopropylamine, ethanolamine.
If the group R is basic, internal salts can form.
The new compounds showed a particularly good antibacterial effect. They are effective against both gram-positive and especially against gram-negative bacteria, e.g. B. against Staphylococcus aureus, penicillin-resistant, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhosa and Bacterium proteus, as has also been found in animal experiments, e.g. B. on mice shows. They can therefore be used to combat infections caused by such microorganisms, and also as feed additives, for preserving food or as disinfectants.
Compounds in which the acyl radical in the 7-position is a cyanoacetyl, methylcyanacetyl, phenylcyanacetyl, p-chlorophenylcyanacetyl or thienyl- (2) -cyanacetyl radical and a tetrazol-5-yl optionally substituted in the 2-position are particularly valuable - or I, 3, 4-thiadiazol-5-yl radical.
The compounds containing an alkylidene group can also be used as intermediates for the purification of the compounds with an unsubstituted cyanoacetyl radical, since the alkylidene group can be split off hydrolytically in an aqueous medium, in particular at elevated temperature and at alkaline pH.
The new compounds are obtained by using a compound of the formula
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wherein R4 is the acyl radical of the formula
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HS-f, Ib in which R has the meaning given for the formula I, or a metal salt thereof and, if desired, a compound of the formula I obtained in which R and 1) both represent hydrogen, advantageously in the presence of catalysts, reacts with an aldehyde, ketone or nitrile and, if desired, cleaves an optionally present ester group, and, if desired, converts the compounds obtained into their metal, such as alkali or alkaline earth metal salts, or salts with ammonia or organic bases or from salts obtained forms the free carboxylic acids or, if appropriate, internal salts.
The compounds used as starting materials are known or can be prepared according to known methods
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No. l. 588,507. Salts thereof are e.g. B. salts with alkali or alkaline earth metals or with zinc or with organic bases, e.g. B. triethylamine, diisopropylamine, ethanolamine.
The metal salts of the thiols are particularly alkali metal salts, such as the sodium or potassium salt. The salts can be prepared, for example, by reacting the thiol with carbonates, bicarbonates or hydroxides of the alkali metals.
Esters of compounds of the formula II are those in which the carboxyl group in the 4-position of the dihydrothiazine ring is esterified. Since the ester group, if necessary or desired, is to be cleaved off, esters are primarily considered which are easily z. B. solvolytically, hydrogenolytically, reductively, by nucleophilic exchange or photolytically can be cleaved to the free carboxylic acid.
Reductive, e.g. B. by treatment with nascent hydrogen, can be converted into the free carboxyl group z. B. certain esterified carboxy groups, especially carbo-lower alkoxy groups, in which lower alkyl in the ss-position contains halogen, especially chlorine atoms, and especially the carbo-2,2,2-trichloroethoxy and carbo-2-iodoethoxy groups. You can in a manner known per se, preferably when treating with nascent hydrogen, under acidic or neutral conditions, for. B. with zinc in the presence of a suitable lower alkanecarboxylic acid such as acetic acid, especially slightly diluted, e.g. B. piger acetic acid, or with a strongly reducing metal salt such as cobalt-li-acetate in the presence of aqueous media, can be converted into the free carboxyl group.
A carbo-lower alkoxy group in which lower alkyl is poly-branched in the ex position and / or radicals of aromatic character in this position, such as optionally substituted aromatic hydrocarbon groups, e.g. B. phenyl radicals, or heterocyclic groups of aromatic character, such as the 2-furyl group, contains e.g. B.
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such as the carbo-adamantyloxy group can be converted into the free carboxyl group by treatment with a suitable acidic agent such as a strong organic carboxylic acid, preferably a halogen-containing lower alkanecarboxylic acid, primarily trifluoroacetic acid.
Esterified carboxyl groups which can likewise be converted into the free carboxyl group easily and under mild conditions are silylated and stannylated carboxyl groups. These are groups that are involved in treating compounds with a free carboxyl group and salts such as alkali metal, e.g. Sodium salts thereof with a suitable silylating agent such as a tri-lower alkyl silyl halide, e.g. B. trimethylsilyl chloride, or an N- (tri-lower alkyl-silyl) -N-Ra-N-Rb-amine, in which Ra is a hydrogen atom or a lower alkyl group and Rb is a hydrogen atom, a lower alkyl group or a tri-lower alkyl-silyl group (cf. B. British Patent No. 1, 073, 530), or with a suitable stannylating agent such as a bis- (tri-
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benden agent, especially water or an alcohol such as lower alkanol, z.
B. ethanol, in the desired compounds with free carboxyl groups.
The reaction with the thiol is as described in Belgian patent specification No. 617687 or in Dutch application No. 6805179 in an inert solvent such as an alcohol, ether, ketone, N, N-disubstituted amide, e.g. B. dimethylformamide, dimethylacetamide, when using salts preferably in water or a water-miscible inert solvent or in a mixture of water and such a solvent, e.g. B. in acetone, methanol, ethanol, dioxane, tetrahydrofuran or their aqueous solutions, preferably in aqueous acetone, made. The reaction temperature is +15 to 700C, preferably 40 to 600C. The pH of the solution is preferably maintained between 5.0 and 7.5.
If necessary, a buffer, e.g. A phosphate buffer or sodium acetate, or, when the compound is used in the form of an alkali metal salt, e.g. B. acetic acid added.
Examples of aldehydes, ketones or nitriles that may be mentioned are those of an aliphatic character, such as formaldehyde, acetaldehyde, acetone, methyl ethyl ketone, ethyl butyl ketone, cyclopentanone, cyclohexanone, cycloheptanone, acetonitrile, trichloroacetonitrile or trifluoroacetonitrile, optionally with at most 2 aromatic rings or araliphatic rings as mentioned above, are substituted, e.g. B. benzaldehyde, p-chlorobenzaldehyde, p-nitroebenzaldehyde, cinnamaldehyde, salicylaldehyde, anisaldehyde, vanillin, acetophenone, benzophenone, p-oxyacetophenone, phenylacetonitrile, benzonitrile or cinnamonitrile.
Particularly suitable catalysts for the reaction with the carbonyl compounds or nitriles are salts, especially acetates of ammonia or amines, e.g. B. ammonium acetate, amylamine acetate, piperidine acetate, triethylammonium acetate, Dowex-3 (free base and acetic acid salt; Dow Chemical Comp.), Also compounds that simultaneously have acidic and basic groups, e.g. B. p-aminophenol. The salts of compounds of the formula III, in which COR stands for the carboxyl group, with the bases mentioned can also serve as catalysts.
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It is preferable to use those starting materials which lead to the particularly effective end products mentioned.
The new compounds can be used as remedies, e.g. B. in the form of pharmaceutical preparations, use. These contain the compounds in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic, solid or liquid carrier material suitable for enteral, topical or parenteral administration. For the formation of the same substances come into question that do not react with the new compounds, such as. B. water, gelatin, lactose, starch, stearyl alcohol, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gum, propylene glycol, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known excipients. The pharmaceutical preparations can e.g. B. as tablets, coated tablets, ointments, creams, capsules or in liquid form as solutions, suspensions or emulsions.
If necessary, they are sterilized and / or contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers, solubilizers or salts for changing the osmotic pressure or buffers. They can also contain other therapeutically valuable substances. The preparations are obtained by customary methods.
The invention is described in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
The following systems are used in the thin-layer chromatogram on silica gel:
System 52A = n-butanol-glacial acetic acid-water (67: 10: 23)
System 101A = n-butanol-pyridine-glacial acetic acid-water (42: 24: 4: 30)
System 102A = ethyl acetate-methyl ethyl ketone-formic acid-water (50: 30: 10: 10).
The stains are made visible with iodine spray.
Example 1 :
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The pH is adjusted to 6.4 with vigorous stirring and heated to 600 under nitrogen for 6 h. The reaction mixture assumes a pH of 6.9. It is cooled and the mixture is extracted twice with 800 ml of ethyl acetate. The organic phases are washed back twice with 10 ml pH 6.5 buffer each time and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 1 l of ethyl acetate and adjusted to pH 2.2 using 4N hydrochloric acid (approx. 8.5 ml) with vigorous stirring. A brown precipitate which occurs is removed by filtration. The phases are separated, the aqueous solution is saturated with sodium chloride and extracted with 11 and then with 0.6 l of ethyl acetate.
After the organic phases have been shaken twice with 40 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate, filtered through a column of 90 g silica gel (diameter 4.5 cm, height = 12.5 cm) and evaporated to dryness in vacuo. The residue is dissolved in a mixture of acetone and methanol and converted into the sodium salt using sodium ct-ethyl-hexanoate.
By returning to the acid form in the manner described for the extraction and subsequent filtration of the residue dissolved in a mixture of equal parts of chloroform and acetone through a column of silica gel (diameter: height = 1: 9), 7-cyanoacetylamino-3- (2-me-
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b) 6.0 g of 2-methyl-1,3,4-thiadiazoline-5-thione are suspended in a solution of 12.8 g of the sodium salt of 7-cyanoacetylamino-cephalosporanic acid in 280 ml of phosphate buffer of pH 6.4. The pH is then adjusted to 6.6 by dropwise addition of 2N sodium carbonate solution with vigorous stirring and heated to 600 for 8 hours under nitrogen. It is cooled and the mixture is extracted successively with 2 l and 1.5 l of ethyl acetate.
The organic phases are washed back twice with 20 ml of pH 6.5 buffer each time and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 2.5 l of ethyl acetate and adjusted to pH 2.4 with vigorous stirring using 4N hydrochloric acid (about 35 ml). A brown precipitate which occurs is removed by filtration. The phases are separated, the aqueous solution is saturated with common salt and extracted with 1.5 liters and then with 1 liter of ethyl acetate. After the organic phases have been shaken twice with 100 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate, filtered through a column of 150 g silica gel (diameter 4.5 cm, height = 21 cm) and evaporated to dryness in vacuo.
The residue (13.9 g) is dissolved in about 50 ml of acetone, mixed with dry ethyl acetate and concentrated to a small volume in vacuo. Then take up again in ethyl acetate, concentrate and add a few drops of hexane. The mixture is left to stand at -150 for 1 h, the precipitate is filtered off with suction and washed first with ethyl acetate + hexane (3: 1), then with hexane. 3.7 g of the precipitate obtained in this way are adsorbed from an acetone solution onto 35 g of neutral silica gel. The dry adsorbate is placed on a column of 300 g of silica gel (diameter 4.5 cm, height = 45 cm) and first eluted with a mixture of 2 parts by volume of chloroform and 1 volume.
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Part acetone and later with chloroform + acetone (1: 1).
The first 1.2 l of eluate are discarded, the following 1, 21 contain the reaction product. The last 1, 21 are evaporated to dryness in vacuo, the residue is dissolved in 40 parts by volume of acetone, 10 parts by volume of methanol are added and then 1.3 parts by volume of a 3m methanolic solution of sodium α-ethylhexanoate converted into the crystalline sodium salt of 7-cyanoacetylamino-3- (2-methyl-1,3,4-thiadiazol-5-yl-thio) -methyl-ceph-3-em-4-carboxylic acid. The sodium salt does not have a sharp melting point, but rather decomposes at around 2150, turning brown. The free acid melts at 146 to 1470 (in a vacuum tube, with decomposition).
In the UV spectrum, ^ max = 272 nm (e = 13,500);
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ester glacial acetic acid (9: 1) = 0.14.
The compound has a high activity against gram-positive and gram-negative microorganisms, both when used parenterally and perorally. In in vitro tests (dilution test) with Staphylococcus aureus, the minimum inhibitory concentration (MIC) is 0.01 to 1 y; with Gram-negative germs such as E. coli, Klebsiella pneumoniae or Salmonella typhosa, the MIC in the dilution test is 0.1 to 0.5 y.
Example 2: 5.27 g of 1-methyl-5-mercapto-tetrazole are suspended in a solution of 12.8 g of the sodium salt of 7-cyanoacetylamino-cephalosporanic acid in 280 ml of phosphate buffer (10%) of pH 6.7. The pH is then adjusted to 6.6 by the dropwise addition of 2N sodium carbonate solution with vigorous stirring and heated to 600 under nitrogen for 7 h. It is cooled and the mixture is extracted one after the other
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wash and discard. The combined aqueous phases are covered with a layer of 2.5 l of ethyl acetate and adjusted to pH 2.5 with vigorous stirring using 4N hydrochloric acid (approx. 30 ml). A brown precipitate which occurs is removed by filtration.
The phases are separated, the aqueous solution is saturated with common salt and extracted with 1.51 and then twice with 11.1 of ethyl acetate. After the organic phases have been shaken twice with 100 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate and concentrated in vacuo to a volume of approximately 150 ml. 150 ml of hexane are added to this solution in small portions with thorough stirring and then left to stand in the cold for several hours. It is suction filtered and the residue is washed with a mixture of ethyl acetate and hexane (1: 1). The filtrate is discarded. The residue (6.57 g) is adsorbed from an acetone solution onto 50 g of neutral silica gel.
The dry adsorbate is placed on a column of 450 g of neutral silica gel (diameter 5.75 cm, height = 41 cm) and eluted with a mixture of 2 parts by volume of chloroform and 1 part by volume of acetone. The first 1.5 l of eluate are discarded, the following 2 l contain the reaction product. These 2 l are evaporated to dryness in vacuo, the residue is dissolved in 40 parts by volume of acetone, 10 parts by volume of methanol are added and then 1.3 parts by volume of a 3m methanolic solution of sodium a- ethyl hexanoate converted into the crystalline sodium salt of 7-cyanoacetylamino-3- (1-methyl-tetrazolyl-5-yl-thio) -methyl-ceph-3-em -4-carboxylic acid.
In the UV spectrum, Xmax = 268 nm (e = 11150);
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The pH is then adjusted to 6.6 by the dropwise addition of 2N sodium carbonate solution with vigorous stirring and heated to 600 under nitrogen for 6 h. It is cooled and the mixture is extracted successively with 2 l and 1.5 l of ethyl acetate. The organic phases are washed back twice with 20 ml of pH 6.5 buffer each time and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 2.5 l of ethyl acetate and adjusted to pH 2.5 with vigorous stirring using 4N hydrochloric acid. A brown precipitate which occurs is removed by filtration. The phases are separated, the aqueous solution is saturated with sodium chloride and extracted with 1.5 liters and then twice with 11 liters of ethyl acetate.
After the organic phases have been shaken twice with 100 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulphate and concentrated in vacuo to a volume of about 60 ml, a voluminous precipitate being formed. 100 ml of hexane are added to this pulp in small portions with thorough stirring and left to stand in the cold for 1 h. It is suction filtered and the residue is washed with a mixture of ethyl acetate and hexane (2: 3). The filtrate is discarded.
The residue is adsorbed from an acetone solution onto 50 g of neutral silica gel. The dry adsorbate is placed on a column of 450 g of neutral silica gel (diameter 5.75 cm, height = 41 cm) and eluted
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Partly crystalline sodium salt of 7-cyanoacetylamino-3- (3-methyl-1, 2, 4-thiadiazol-5-yl-thio) -methyl-ceph-3-em--4-carboxylic acid converted.
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dated. The pH is then adjusted to 6.6 by the dropwise addition of 2N sodium carbonate solution with vigorous stirring and heated to 600 under nitrogen for 6 h. It is cooled and the mixture is extracted successively with 2.5 l and 2 l of ethyl acetate. The organic phases are backwashed twice with 50 ml of buffer pH 6.5 each time and discarded.
The combined aqueous phases are covered with 2.5 l of ethyl acetate and adjusted to pH 2.5 using 4N hydrochloric acid with vigorous stirring. A brown precipitate which occurs is removed by filtration. The phases are separated, the aqueous solution is saturated with common salt and extracted with 1.5 liters and then three times with 11 liters of ethyl acetate. After the organic phases have been shaken twice with 100 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulphate and concentrated in vacuo to a volume of approximately 400 ml, a precipitate being formed. 350 ml of hexane are added to this mixture with thorough stirring and the mixture is left to stand in the cold for 1 h. The voluminous precipitate is filtered off with suction and the residue is washed with a mixture of ethyl acetate and hexane (1: 1).
The filtrate is discarded. The residue is adsorbed from an acetone solution onto 50 g of neutral silica gel. The dry adsorbate is placed on a column of 750 g of neutral silica gel (diameter 5.75 cm, height = 41 cm) and eluted with a mixture of 2 parts by volume of chloroform and 1 part by volume of acetone. The first liter of eluate is discarded, the following 2 liters contain the reaction product. These 2 l are evaporated to dryness in vacuo, the residue is dissolved in 40 parts by volume of acetone, 10 parts by volume of methanol are added and then 1.3 parts by volume of a 3m methanolic solution of sodium a- ethyl hexanoate converted into the crystalline sodium salt of 7-cyanoacetylamino-3- (2-methylthio-1, 3, 4-thiadiazol-5-yl-thio) -methyl-ceph-3-em-4-carboxylic acid.
In the UV spectrum, #max = 274 nm (E = 13500);
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In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf52A = 0.40, Rf101A = 0.45, Rf102A = 0.78; Rf in ethyl acetate-glacial acetic acid (9: 1) = 0.30.
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The pH is then adjusted to 6.6 by the dropwise addition of 2N sodium carbonate solution with vigorous stirring and the mixture is heated to 60 for 7 hours under nitrogen. It is cooled and the mixture is extracted successively with 21 and 1.51 ethyl acetate. The organic phases are washed back twice with 20 ml of pH 6.5 buffer each time and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 2 l of ethyl acetate and adjusted to pH 2.5 by means of 4N hydrochloric acid with vigorous stirring.
A brown precipitate which occurs is removed by filtration. The phases are separated, the aqueous solution is saturated with sodium chloride and extracted with 1.5 liters and then twice with 11 liters of ethyl acetate. After the organic phases have been shaken twice with 100 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulphate and concentrated in vacuo to a volume of approximately 200 ml, a precipitate being formed. 200 ml of hexane are added to this paste while stirring well and the mixture is left to stand in the cold for 1 h. It is suction filtered and the residue is washed with a mixture of ethyl acetate and hexane (1: 1). The filtrate is discarded. The residue is adsorbed from an acetone solution onto 30 g of neutral silica gel.
The dry adsorbate is placed on a column of 570 g of neutral silica gel (diameter 5.75 cm, height = 47 cm) and eluted with a mixture of 2 parts by volume of chloroform and 1 part by volume of acetone. The first 2 l of eluate are discarded, the following 2 l contain the reaction product. These 2 l are evaporated to dryness in a vacuum and then taken up in a little ethyl acetate. In this way, almost colorless, strongly solvated crystals of the acid form are obtained.
These are dissolved in 40 parts by volume of acetone, 10 parts by volume of methanol are added and then 1.3 parts by volume of a 3m methanolic solution of sodium α-ethylhexanoate are added with slow concentration
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(2-methyl-ceph-3-em-4-carboxylic acid converted.
In the UV spectrum, ^ max:: 268 nm (E = 10 500);
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heated to 600 under nitrogen for 6 h. It is cooled and the mixture is extracted successively with 750 ml and 500 ml of ethyl acetate. The organic phases are washed twice with 30 ml of pH 6.5 buffer each time and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 11 ethyl acetate and adjusted to pH 2.5 by means of 4N hydrochloric acid (approx. 15 ml) while stirring vigorously.
A brown precipitate which occurs is removed by filtration. The phases are separated, the aqueous solution is saturated with sodium chloride and extracted with 0.51 and then twice more with 250 ml of ethyl acetate each time. After the organic phases have been shaken twice with 50 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate and concentrated in vacuo to a volume of approximately 100 ml. 100 ml of hexane are added to this solution with vigorous stirring, a precipitate being formed. The mixture is left to stand at 00 for 1/2 h, the precipitate is filtered off with suction and washed first with ethyl acetate + hexane (1: 1), then with hexane. 3.66 g of the precipitate obtained in this way are adsorbed onto 30 g of silica gel from an acetone solution.
The dry adsorbate is placed on a column of 400 g of silica gel (diameter 5.75 cm, height = 35 cm) and eluted with a mixture of 2 parts by volume of chloroform and 1 part by volume of acetone. The first 1.7 l of eluate are discarded, the following 1.5 l contain the reaction product. They are evaporated to dryness in vacuo, the residue is taken up in a little ethyl acetate and converted into a solvated colorless crystal form by concentrating the solution.
This almost pure substance is suspended in 20 times the amount of methanol, brought into solution by adding 1.3 parts by volume of a 3m methanolic solution of sodium cx-ethylhexanoate and concentrating the solution
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(I, thyl-ceph -3-em -4-carboxylic acid converted.
In the UV spectrum, Amax = 270 nm (e = 13 150);
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In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf52A = 0.31, Rf101A = 0.47, Rflo2A = 0.68; Rf in ethyl acetate-glacial acetic acid (9: 1) = 0.21.
Example 7: In a solution of 12.8 g of the sodium salt of 7-cyanoacetylamino-cephalosporanic acid in
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the pH is adjusted to 6.8 by the dropwise addition of 2N sodium carbonate solution with vigorous stirring and heated to 600 for 8 h under nitrogen. It is cooled and the mixture is extracted three times with 1.5 l of ethyl acetate each time. The organic phases are washed twice with 50 ml pH 6.5 buffer each time and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 2 l of ethyl acetate and adjusted to pH 2.5 with vigorous stirring using 4N hydrochloric acid (approx. 45 ml). A brown precipitate which occurs is removed by filtration. The phases are separated, the aqueous solution is saturated with common salt and extracted with 1.5 liters and then with 1 liter of ethyl acetate.
After the organic phases have been shaken twice with 100 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate and concentrated in vacuo to approximately 300 ml. 300 ml of hexane are added to this solution with vigorous stirring, a precipitate being formed. The mixture is left to stand at 00 for 1/2 h, the precipitate is filtered off with suction and washed first with ethyl acetate + hexane (1: 1), then with hexane. 5.9 g of the precipitate thus obtained are adsorbed onto 30 g of silica gel from an acetone solution. The dry adsorbate is placed on a column of 470 g of silica gel (diameter 5.75 cm, height = 42 cm) and first eluted with a mixture of 2 parts by volume of chloroform and 1 part by volume
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evaporated to dryness kuum, and the residue is triturated with ethyl acetate.
After filtration, the 7-cyanoacetylamino-3- (3-methyl-1,2,4-triazol-5-yl-thio) -methyl-ceph-3-em-4-carboxylic acid is obtained as a slightly colored powder. This is suspended in methanol, brought into solution by adding 1.3 parts by volume of a 3N methanolic solution of sodium et-ethylhexanoate and, after adding the same volume, abs.
Ethanol and concentrated to a small volume in the solid sodium salt. The slight coloration of the substance can be removed by treatment with activated charcoal in a methanolic solution. For purification, the sodium salt is converted back into the acid by acidifying its aqueous solution to pH 2.5 and extraction with ethyl acetate, this is triturated with ethyl acetate as above and the sodium salt is recovered therefrom in the manner described above.
In the UV spectrum, Xmax = 267 nm (e = 9900); [fx] = -11 1 (c = 1.0 in water).
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf52A = 0.31, Rf101A = 0.45, Rf102A = 0.57; Rf in ethyl acetate-glacial acetic acid (9: 1) = 0.1.
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8: In- tetrazole suspended. The pH is then adjusted to 6.6 by the dropwise addition of 2N sodium carbonate solution with vigorous stirring and heated to 600 under nitrogen for 7 h. It is cooled and the mixture is extracted successively with 200 ml and 150 ml of ethyl acetate. The organic phases are washed back twice with 5 ml of buffer pp 6, 5 each time and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 300 ml of ethyl acetate and adjusted to a pH of 2.5 using 2N hydrochloric acid (approx. 6 ml) while stirring vigorously.
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A brown precipitate which occurs is removed by filtration.
The phases are separated, the aqueous solution is saturated with common salt and extracted twice more with 150 ml of ethyl acetate each time. After the organic phases have been shaken twice with 10 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate and concentrated in vacuo to a volume of about 20 ml. 20 ml of hexane are added to this solution in small portions with thorough stirring and then left to stand in the cold for several hours. It is suction filtered and the residue is washed with a mixture of ethyl acetate and hexane (1: 1). The filtrate is discarded. The residue is adsorbed onto 5 g of neutral silica gel from an acetone solution. The dry adsorbate is placed on a column of 50 g of neutral silica gel and eluted with a mixture of 2 parts by volume of chloroform and 1 part by volume of acetone.
The first 160 ml of eluate are discarded, the following 200 ml contain the reaction product. They are evaporated to dryness in vacuo, the residue is dissolved in 30 parts by volume of acetone, 5 parts by volume of methanol are added and then 1.3 parts by volume of a 3-methanolic solution of sodium ct-ethylhexanoate are converted into the crystalline sodium salt the 7-cyanoacetylamino
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ester glacial acetic acid (9: 1) = 0.19.
The starting material can be prepared as follows: 20.0 g (36.7 mmol) of N, N-phthaloyl-cephalosporin C (72%) are suspended in 400 ml of distilled water and dissolved with 71 ml of sodium hydroxide solution. The solution is stirred with 400 mg of the acetyl esterase from Bacillus subtilis ATCC 6633 for 20 h at 37 while keeping the pH constant at 7.3. The acetic acid released during the enzymatic saponification is neutralized with 32 ml of n-sodium hydroxide solution. After the saponification reaction is complete, ethyl acetate is added, followed by phosphoric acid with cooling to 00 and stirring until a pH of 2.3 is reached. The aqueous phase is saturated with sodium chloride and extracted three more times with 300 ml of ethyl acetate.
The extracts are washed with saturated sodium chloride solution, dried with sodium sulfate and evaporated. The deacetylated crude product of N, N-phthaloyl-cephalosporin C is taken up in 320 ml of dioxane and 80 ml of methanol, 18 g of diphenyldiazomethane are added in portions and the mixture is stirred at room temperature for 3 h. The solution is evaporated to dryness and digested twice with 400 ml of ether. The residue is dissolved in benzene and chromatographed on 200 g of acid-washed silica gel (column diameter 4, 15 cm); 100 ml fractions are taken. Three benzene, benzene-ethyl acetate (9: 1) and benzene-ethyl acetate (5: 5) fractions are discarded.
With the next four benzene-ethyl acetate (5: 5) fractions the 7- (5'¯hthalimido-5'-carboxybenzhydryl-valeroyl) -amino-ceph-3-em-3-hydroxymethyl-4-carboxylic acid benzhydryl ester eluted and crystallized from ethyl acetate-cyclohexane, mp 113 to 1150;
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UV absorption spectrum (in fine spirit): Xmax 259 rgu (E = 9100) and \ fl 241 mfi (e = 14600).
In the thin-layer chromatogram on silica gel in the toluene-acetone system (4: 1), the substance has an Rf value of 0.11 (development with iodine).
While cooling with dry ice, a solution of 3.34 g (4 mmol) of 7- (51-phthalimido- - is added to a mixture of 3.46 ml (40 mmol) of propionic acid chloride and 2.90 ml (36 mmol) of pyridine in 30 ml of absolute dimethylformamide. 5'-carboxybenzhydryl-valeroyl) -amino-ceph-3-em-3-hydroxymethyl-4-carboxylic acid benzhydryl ester in 7 ml of dimethylformamide was added dropwise. It is left to react for 3 hours at room temperature. The reaction product is between
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Ethyl acetate extracted. The ethyl acetate extract is washed with saturated sodium chloride solution, dried with sodium sulfate and evaporated. The 7- (5'-phthalimido-5'-carboxybenzhydryl-valeroyl) -amino-ceph-3-em- - 3-propionyloxymethyl-4-carboxylic acid benzhydryl ester crystallizes in colorless drusen from acetone-ethyl acetate; F. 163 to 1650;
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Value of 0.19.
2.03 g (2.28 mmol) of 7- (5'-phthalimido-5'-carboxybenzhydryl-valeroyl) -amino-ceph-3-em-3-propionyl-oxymethyl-4-carboxylic acid benzhydryl ester are dissolved in 20 ml of methylene chloride, cooled to -100 and treated with 1.75 ml (21.7 mmol) of absolute pyridine. Then, while stirring, 11.4 ml (5.5 mmol) of a freshly prepared zuigen phosphorus pentachloride solution in absolute methylene chloride are added within 12 minutes.
The mixture is then stirred at -100 for 40 minutes. The solution is treated with 7.62 ml (188 mmol) cooled to -200, absolute methanol within 3 min. The reaction mixture is stirred for a further 30 min at -100 and 60 min at +200. 19 ml (19 mmol) of in hydrochloric acid are added with thorough mixing and the mixture is left to react at 200 for 45 min. The mixture is then adjusted to pH 8.0 with 3.8 ml of 50% aqueous tripotassium phosphate solution and 18.3 ml of 2N sodium hydroxide solution. The phases are separated, the methylene chloride extract, dried over sodium sulfate, is evaporated and dried in a high vacuum for 2 hours. The residue is dissolved in 50 ml of toluene
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Acetate (3: 1) was added and extracted three times with 20 ml of ethanol-2N hydrochloric acid (1: 1) each time.
The combined lower phases are adjusted to pH 7.0 with 30 ml of 2N soda solution, the alcohol is evaporated and the aqueous solution is re-extracted with ethyl acetate. The dried and evaporated ethyl acetate extract is immediately taken up in 1.14 ml (10.5 mmol) anisole, cooled to -300 and mixed with 3.32 ml (43.5 mmol) trifluoroacetic acid. The acid is left to act for 30 minutes at +200 and then evaporated well with the addition of toluene. The residue is mixed with 40 ml of methanol cooled to -300 and adjusted to pH 3.5 with 0.4 ml of triethylamine. The precipitate which forms spontaneously is centrifuged off and washed twice with 5 ml of methanol, methylene chloride and ether each time and dried in a high vacuum.
3-Propionyloxymethyl- - 7-amino-ceph-3-em-4-carboxylic acid is an amorphous powder.
[(x] '= +110 1 (c = 1,000 in 0.5N sodium bicarbonate).
UV absorption spectrum (in 0.5N sodium bicarbonate): Àmax = 262 mg (E = 8200).
In the thin-layer chromatogram on silica gel in the n-butanol-pyridine-glacial acetic acid-water system (30: 20: 6: 24) the substance shows an Rf value of 0.58 (7-aminocephalosporanic acid Rf 0.55).
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amine in 6.5 ml of methylene chloride was added and the mixture was then stirred for 45 min at -50 to -700 under nitrogen.
The batch is then stirred with 10 ml of 10% strength aqueous potassium dihydrogen phosphate solution, a pH of 5.0 being established. The lower organic phase is separated off and the aqueous phase is extracted with 5 ml of methylene chloride and with 10 ml of ethyl acetate. The aqueous phase is covered with 20 ml of ethyl acetate, acidified to pH 2.0 with 2N hydrochloric acid and - after saturation with sodium chloride and phase separation - extracted twice more with 10 ml of ethyl acetate each time. The three ethyl acetate extracts are washed with 10 ml of saturated sodium chloride solution, dried with sodium sulfate and filtered through a column (diameter 16 mm, height = 10 cm) of 5 g of silica gel. The column is washed with 20 ml of ethyl acetate and the combined filtrates are concentrated to 2.3 to 3.0 g.
The 3-propionyloxymethyl- 7-cyanacetylamino-ceph-3-em-4-carboxylic acid is precipitated from the concentrated solution with 50 ml of ether-petroleum ether (1: 1) and recrystallized from tetrahydrofuran-ethyl acetate.
F. 146 to 1500.
In the thin-layer chromatogram on silica gel in the system n-butanol-glacial acetic acid-water (67: 10: 23) the Rf-
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0.5 l of ethyl acetate. The organic phases are washed back twice with 20 ml of pH 6.5 buffer each time and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 1.5 liters of ethyl acetate and adjusted to a pH of 2.6 using 4N hydrochloric acid (about 37 ml) while stirring vigorously. A brown precipitate which occurs is removed by filtration. The phases are separated, the aqueous solution is saturated with common salt and extracted with 11 and then with 0.5 l of ethyl acetate. After the organic phases have been shaken twice with 70 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate and concentrated in vacuo to a volume of approximately 100 ml.
100 ml of hexane are added to this solution in small portions with thorough stirring and then left to stand in the cold for several hours. It is suction filtered and the residue is washed with a mixture of ethyl acetate and hexane (1: 1). The filtrate is discarded. The residue (8.5 g) is adsorbed from an acetone solution onto 50 g of neutral silica gel. The dry adsorbate is placed on a column of 450 g of neutral silica gel (diameter 5.75 cm, height = 41 cm) and eluted with a mixture of 2 parts by volume of chloroform and 1 part by volume of acetone. The first liter of eluate is discarded, the subsequent fractions contain the reaction product. These are evaporated to dryness in vacuo, the residue in 40 vol.
Dissolved parts of acetone, added 10 parts by volume of methanol and then by adding 1.3 parts by volume of a 3m methanolic solution of sodium ct-ethyl-hexanoate into the crystalline sodium salt of 7- (a-phenyl- -? ; -cyanacetylamino) -3- (1-methyltetrazolyl-5-yl-thio) -methyl-ceph-3-em-4-carboxylic acid converted.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf52A = 0.44, Rf in ethyl acetate-glacial acetic acid (9: 1), distance 16 cm = 0.33.
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: K HPO adjusted the pH to 6.5 with vigorous stirring and heated to 600 for 7 h under nitrogen. It is cooled and the mixture is extracted twice with 40 ml of ethyl acetate. The organic phases are washed back with 3 ml of buffer PH 6.5 and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 50 ml of ethyl acetate and adjusted to pH 2.6 using 4N hydrochloric acid with vigorous stirring. A brown precipitate which occurs is removed by filtration.
The phases are separated and the aqueous solution is saturated with
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Table salt and extracted with 30 ml and then with 20 ml of ethyl acetate. After the organic phases have been shaken twice with 5 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo. The residue is dissolved in a chloroform-acetone (1: mixture, filtered through a column of 20 g of silica gel (diameter: height = 1: 9) and evaporated to dryness in vacuo. The residue is dissolved in a little acetone and removed using a 3m -methanolic solution of sodium ct-ethyl-hexanoate in the sodium salt of 7- (a-phenyl-a-cyanoacetylamino) -3- (2-methyl-1,3,4-thiadiazol-5-yl-thio) -methyl-ceph-3-em-4-carboxylic acid converted.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf52A = 0.49, Rf in ethyl acetate-glacial acetic acid (9: 1), distance 15 cm = 0.25.
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Running distance 15 cm = 0.36.
Example 11: In a solution of 421 mg of 7- [ct-thienyl- (2) -a-cyanoacetylamino] -cephalosporanic acid in 9 ml of phosphate buffer (10%) with a pH of 6.7, 152 mg of 1-methyl-5-mercaptotetrazole are added suspended. The pH is then adjusted to 6.5 by adding 3.75 ml of an excessive solution of K HPO with vigorous stirring and the mixture is heated to 60 for 7 hours under nitrogen. The mixture is cooled and extracted successively with 50 ml and 25 ml of ethyl acetate. The organic phases are washed back twice with 5 ml of pH 6.5 buffer each time and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 80 ml of ethyl acetate and adjusted to pH 2.6 using 2N hydrochloric acid with vigorous stirring. A brown precipitate which occurs is removed by filtration.
The phases are separated, the aqueous solution is saturated with common salt and extracted with 50 ml and then with 25 ml of ethyl acetate. After the organic phases have been shaken twice with 10 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate and concentrated in vacuo to a volume of approximately 5 ml. 5 ml of hexane are added dropwise to this solution with thorough stirring and the mixture is then left to stand in the cold for several hours. It is suction filtered and the residue is washed with a mixture of ethyl acetate and hexane (1: 1). The filtrate is discarded. The residue is adsorbed from an acetone solution onto 2.5 g of neutral silica gel. The dry adsorbate is placed on a column of 25 g of neutral silica gel (diameter 2.0 cm, height = 17 cm) and eluted with a mixture of 2 vol.
Parts of chloroform and 1 part by volume of acetone. A first run of 50 ml is discarded, the following fractions contain the reaction product. These are evaporated to dryness in vacuo, the residue in
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In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf52A = 0.42, Rf in ethyl acetate-glacial acetic acid (9: 1), distance 15 cm = 0.3.
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other with 80 ml and 40 ml of ethyl acetate. The organic phases are washed back twice with 5 ml of pH 6.5 buffer each time and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 100 ml of ethyl acetate and adjusted to pH 2.6 with intensive stirring using 2N hydrochloric acid. A brown precipitate which occurs is removed by filtration. The phases are separated, the aqueous solution is saturated with common salt and extracted with 80 ml and then with 40 ml of ethyl acetate.
After the organic phases have been shaken twice with 10 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate and concentrated in vacuo to a volume of about 10 ml. 10 ml of hexane are added to this solution in small portions with thorough stirring and then left to stand in the cold for several hours. It is suction filtered and the residue is washed with a mixture of ethyl acetate and hexane (1: 1). The filtrate is discarded. The residue is adsorbed from an acetone solution onto 4 g of neutral silica gel. The dry adsorbate is placed on a column of 40 g of neutral silica gel (diameter 2.4 cm, height = 18.5 cm) and eluted with a mixture of 2 parts by volume of chloroform and 1 part by volume of acetone.
A first run of 60 ml is discarded, the following fractions contain the reaction product. These are evaporated to dryness in vacuo, the residue is dissolved in 40 parts by volume of acetone, 10 parts by volume of methanol are added and then 1.3 parts by volume of a 3m methanolic solution of sodium a-ethyl- hexanoate converted into the sodium salt of 7- (ap-chlorophenyl- -α-cyanoacetylamino) -3- (1-methyltetrazol-5-yl-thio) -methyl-ceph-3-em-4-carboxylic acid.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf52A = 0.47, Rf in ethyl acetate-glacial acetic acid (9: 1), distance 15 cm = 0.4.
Example 13: In a solution of 345 mg of 7- (a-cyanopropionylamino) -cephalosporanic acid in 8 ml of phosphorus
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fer PH 6.5 backwashed and discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 75 ml of ethyl acetate and adjusted to pH 2.6 using 2N hydrochloric acid while stirring vigorously. A light brown precipitate which occurs is removed by filtration. The phases are separated, the aqueous solution is saturated with common salt and extracted twice with 40 ml of ethyl acetate. After the organic phases have been shaken twice with 10 ml of saturated sodium chloride solution each time, they are dried with sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo.
The residue is dissolved in a chloroform-acetone (1: 1) mixture, filtered through a column of 20 g of silica gel (diameter: height: 1: 9) and evaporated to dryness in vacuo.
The residue is dissolved in a little acetone and treated with a 3m methanolic solution of sodium ct-ethyl
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hexanoatthyl-ceph-3-em-4-carboxylic acid converted.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf52A = 0.38, Rf in ethyl acetate-glacial acetic acid (9: 1), distance 15 cm = 0.15.
Example 14: 1.0 g of 7-cyanoacetylamino-3- (l-methyl-tetrazol-5-yl-fhio) -methyl-ceph-3-em-4-carboxylic acid and 220 mg of anhydrous ammonium acetate are in a mixture of 20 ml of acetone and 14 ml of dimethylformamide dissolved and left to stand for 20 h at 220 with exclusion of light. It is evaporated to the syrup thickness in a high vacuum, the residue is taken up in 30 ml of 10% phosphate buffer PH 6.3 and extracted with 100 ml and then with 50 ml of ethyl acetate. The extracts are back-extracted twice with 20 ml of buffer each time. The ethyl acetate solutions are discarded. The combined aqueous phases are covered with a layer of 150 ml of ethyl acetate and adjusted to pH 2.4 with 2N hydrochloric acid while stirring vigorously. The phases are separated, the aqueous phase is saturated with common salt and extracted twice more with 60 ml of ethyl acetate each time.
The ethyl acetate phases are washed
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cleaned. Mixtures of chloroform-acetone (98: 2) and (95: 5) produce the 7- (cx-cyano-ss -dimethylacrylamino) -3- (l-methyl-tetrazol-5-yl-thio) - methyl-ceph-3-em-4-carboxylic acid eluted in pure form.
It crystallizes from a mixture of methanol and ether.
Melting point 1700 with decomposition.
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Running distance 15 cm = 0.23.
The water-soluble sodium salt can be prepared in crystallized pure form by means of sodium cx-ethyl hexanoate in methanol-acetone solution.
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