CN115260086A - 一种氟代内标物及其应用和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氟代内标物及其应用和制备方法，所述氟代内标物用于氘代噻吩并吡啶类药物体内药代谢动力学研究的应用。通过液相色谱‑质谱联用方法，使用所述氟代内标物对所述氘代噻吩并吡啶类药物的体内代谢物及其衍生物进行定性、定量分析。经实验验证，所述氟代内标物完全满足药代分析方法要求，基于此建立的定量分析方法符合指导原则要求。
Description
技术领域
本发明属于药物分析研究技术领域，涉及到为生物样品中氘代药物体内代谢物及体外衍生物的液质分析方法选定内标物并合成。
背景技术
氘代药物是将已有药物结构中特定位置的氢原子替换为氘原子后形成的一类药物，氘代可在一定程度上改善原研药物的药物代谢动力学（下称药代）行为，是改良型新药开发的一个新方向。FDA于2017年批准了首个氘代药物-氘代丁苯那嗪（商品名Austedo，六氘代，上市），后续还有多个氘代药物（CTP-786，六氘代，III期临床）处于开发阶段。
氯吡格雷是一种噻吩并吡啶类抗血小板凝集药物，其自身没有生物活性，需在体内经过多种细胞色素P450酶代谢才能转化为具有抗血小板活性的代谢产物。大量的药代动力学研究表明（ACS Med. Chem. Lett. 2012, 3, 844–849），氯吡格雷的生物利用度很低，被成功转化为活性代谢物的比例不足给药量的1%，大部分的前药会因7-位甲酯的水解而失活。如WO/2019/033850公开的氘代噻吩并吡啶类药物通过将7-位甲酯替换为三氘代甲酯的办法有效地降低了药物水解失活比例，是更具吸引力的改良型新药。氘代噻吩并吡啶类药物（II）结构如图1所示，其中R为-H、磷酸酯基、羧酸酯基、氨酯取代基。
根据噻吩并吡啶类药物药代研究，噻吩环2-位氧化是代谢限速步骤，同类的普拉格雷通过在2-位引入乙酰氧基取代基的改构设计，有效地提高了药物活化速度。在此基础上，陆续有噻吩并吡啶磷酸酯（专利申请号201680036795.9）、羧酸酯、氨酯（专利申请号202210408644.9）派生物处于开发阶段，此类药物的代谢活化过程与初代噻吩并吡啶类药物噻氯吡啶是一致的。以噻氯吡啶为代表的噻吩并吡啶类药物体内代谢活化过程如图2所示。
为进一步支持氘代噻吩并吡啶类药物（II）的开发，需要对此类氘代药物的药代动力学进行完备的研究。如文献报道（Chem. Res. Toxicol. 2013, 26, 179−190），噻吩并吡啶类药物的药代行为十分复杂，会形成如式III所示一系列的代谢物及同分异构体（如图3所示）。式III结构中R6为-H或-CD3，R7为=CH-CO2H、=CH-CO-SG或-CH2-CO2H，当与R7、R8相连的一对碳原子间为双键时R7为-CH2-CO2H，R8为-SH、-S-OH、-S-CH3、-S-SG，-S-SR9或R7与R8共同组成2-氧噻吩环，-SG为谷胱甘肽且R7与R8不同时含有谷胱甘肽取代基，-SR9为氨基酸或蛋白片段。
其中，噻吩环氧化开环后形成的巯基、次磺酸、二硫化物等代谢物反应活性高、不稳定，在分析前往往需要将不稳定代谢物转化为相对稳定的衍生物。巯基可通过迈克尔加成、卤代烷或α-卤代酮取代、二硫交换等衍生化试剂转化为相对稳定的衍生物；次磺酸基团可通过与二甲酮、麦氏酸或巯基化合物发生取代反应转化为相对稳定的衍生物；二硫基团可与含巯基的衍生化试剂发生二硫交换反应。氯吡格雷及其派生药物体内经酶多步代谢最终都可形成含自由巯基的活性代谢物，因巯基的高反应活性，在体内会生成一组巯甲基化代谢物（式IV），包括一对如图4所示差向异构体M9-P1（S,S）和M9-P2（R,S），在新药的药代动力学研究中也应予以关注。分析时，通常会将活泼的巯基代谢物转化为间甲氧基苯酰基衍生物以提高其稳定性（Drug Metab. Dispos. 2010, 38, 92−99）。生物样本中的巯基代谢物经间甲氧基苯酰基体外衍生处理后会形成如式VI所示的衍生物，同样包括一对差向异构体M15-1-MP（S,S）和M15-2-MP（R,S）见图5。
液相色谱串联质谱联机（LC-MS/MS）方法是药代动力学分析标准方法，要建立灵敏、快速准确的生物样品定量分析方法需要从生物样品处理、色谱和质谱条件等方面进行选择和优化。为保证分析结果的准确性，标准的方法是通过加入内标物进行校正。内标法是通过监测内标物及被测组分峰面积的相对值进行定量计算，优点是测定的结果较为准确，可在一定程度上消除生物样品制备及分析过程中由提取回收率、离子化效率差异等因素引入的系统误差。国际人用药品注册技术协调会ICH协调指导原则《生物分析方法验证及样品分析M10》（2022版）中规定：“回收率是通过比较加入待测物并进行处理的生物样品中的待测物响应，与空白生物样品处理后加入待测物的响应来确定的。待测物的回收率不必达到100%，但待测物和内标（如果使用）的回收率应一致。”化学结构迥异的化合物在理化性质上也会有较大差异，如极性不同、气相裂解效率不同等，这样的差异在生物样品制备及分析过程中具体体现为提取回收率和离子化效率差异。理想的内标物具有与被测组分有基本相同的物理化学性质（如化学结构、官能团、极性、挥发度、溶解度等）、色谱行为、质谱离子化效率以及提取回收率，如被测物的同系物，最好是稳定同位素标记的被测物，如氘代物。
要达到上述目的，内标物的选择十分重要，内标物需要满足下述要求：内标物应是样品中不存在的组分；内标物需具有与被测物相似的理化性质，且稳定性好；内标物应是高纯度标准品，或含量已知物质，且加入量应接近于被测组分；最重要的，内标物应与被测物有足够的质谱区分度。
按照中国药典9012《生物样品定量分析方法验证指导原则》（下称指导原则），“当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结果的偏差。”《生物分析方法验证及样品分析M10》（2022版）中规定：“内标不需要提供分析证书，只要证明其适用性即可，例如能够证明该物质本身或其相关的任何杂质对于待测物的检测不会产生干扰。使用质谱检测时，建议尽可能使用稳定同位素标记的内标。同位素内标必须具有足够高的同位素纯度，并且不会发生同位素交换反应。”
为了保证与被测物有足够的质谱区分度，往往选择D3或更高氘代度的物质作为氘代内标。如六氘代丁苯那嗪的药代研究是以丁苯那嗪为内标，而丁苯那嗪则是以六氘代丁苯那嗪为内标（Clin. Transl. Sci. 2020, 13, 707–717）。但这种内标选择方法在氘代度较低的药物药代动力学研究时则遇到了困难。由于氘代药物及其代谢物自身已携带氘原子，内标则需要引入更多的氘原子以满足质谱对区分度的要求，这使得内标的合成成本急速攀升。若以氕代物作为氘代药物及其代谢物的内标也不失为一种选择，但这种内标质荷比（m/z）小于被测物质荷比的情况在实际操作中却有一定限制，即当内标与被测物质荷比相差不多时，氘代药物或其代谢物信号会受到氕代内标天然同位素的干扰，这种干扰当被测物浓度越低时越明显。当这种小质荷比内标结构中含有高丰度的稳定同位素时（如氯、溴），小质荷比内标对大质荷比被测物的干扰会因同位素信号干扰而变得异常严重。
此外，对于式II所示氘代噻吩并吡啶类药物而言，不能仅通过氕代的方法选择内标还有一个代谢物谱的原因。如前所述，氯吡格雷会因7-位甲酯的水解而失去活性，氘代后虽可减缓水解速度，但并不会完全阻止水解的发生。若内标与待测物区别仅在于7-位氕/氘代酯基，那么此种内标选择方法在分析系列7-位酯水解失氘代谢物时将面临巨大挑战。
发明内容
如前所述，氘代噻吩并吡啶类药物体内各种代谢物准确定量需要选择一个合适的内标，而传统的氘代内标选择方法在此处并不适用。本发明要解决的技术问题是，为氘代噻吩并吡啶类药物药代动力学研究选择并合成纯度高、经济、适合的内标并进行验证。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
氟作为卤族元素具有与氯相近的理化性质，且不存在如氯（35Cl 76%，37Cl 24%）或溴（79Br 51%，81Br 49%）高比例的稳定同位素。同为卤族元素且仅有一种稳定同位素的碘则在原子共价半径、电负性、化学稳定性等方面与氯相差甚远，也不适合选作内标物。因此本发明选择噻吩并吡啶类药物体内代谢物或其体外衍生物的氟代类似物作为液相色谱串联质谱方法内标，所述的氟代内标物（式I）如图6所示，用于氘代噻吩并吡啶类药物II药代动力学研究。
其中，R1为-H或-CH3，R2为=CH-CO2H、=CH-CO-SG或-CH2-CO2H，当与R2、R3相连的一对碳原子间为双键时R2为-CH2-CO2H，R3为-SH、-S-SG或-SR4或R2与R3共同组成2-氧噻吩环，-SG为谷胱甘肽，且R2与R3不同时含有谷胱甘肽取代基，R4为1-4个碳的烷基，酯基、酰胺、酮、氰基取代烷基，酯基、酰胺、酮、氰基取代的烯基，环酮、环酰亚胺、环内酯、巯基取代基。
具体地，R4为-CH3、-tBu、
、
、
、
、
、
、
、
、
、二甲酮、麦氏酸、
、
、
、
、-SG中任意一种，R5为H、1-4个碳的烷基，卤素、甲氧基或二甲胺基取代或未取代的苯基种任意一种。
所述氟代内标物为下列化合物优选为：
(Z)-2-((S)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(甲硫基)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(E)-2-((S)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(甲硫基)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(Z)-2-((R)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(甲硫基)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(E)-2-((R)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(甲硫基)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(S)-2-(1-(1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(甲硫基)-1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)乙酸；
(Z)-2-((S)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-((2-(3-甲氧苯基)-2-氧乙基)硫代)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(E)-2-((S)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-((2-(3-甲氧苯基)-2-氧乙基)硫代)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(Z)-2-((R)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-((2-(3-甲氧苯基)-2-氧乙基)硫代)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(E)-2-((R)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-((2-(3-甲氧苯基)-2-氧乙基)硫代)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(S)-2-(1-(1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(2-(3-甲氧苯基)-2-氧乙基)硫代)-1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)乙酸。
所述的氟代内标物用于氘代噻吩并吡啶类药物体内药代谢动力学研究的应用，所述氘代噻吩并吡啶类药物结构如式II所示：
其中，R为-H、磷酸酯基、羧酸酯基、氨酯取代基，通过液相色谱-质谱联用方法，使用所述氟代内标物，对所述氘代噻吩并吡啶类药物（式II）的体内代谢物及其衍生物进行定性、定量分析。
所述氘代噻吩并吡啶类药物的体内代谢物及其衍生物如式III所示：
对于氘代噻吩并吡啶类药物（式II）的体内代谢物：R6为-H或-CD3，R7为=CH-CO2H、=CH-CO-SG或-CH2-CO2H，当与R7、R8相连的一对碳原子间为双键时R7为-CH2-CO2H，R8为-S-CH3、-S-SG，-S-SR9或R7与R8共同组成2-氧噻吩环，-SG为谷胱甘肽且R7与R8不同时含有谷胱甘肽取代基，-SR9为氨基酸或蛋白片段；
对于氘代噻吩并吡啶类药物体内代谢物的衍生物：R6为-H或-CD3，R7为=CH-CO2H、=CH-CO-SG或-CH2-CO2H，当与R7、R8相连的一对碳原子间为双键时R7为-CH2-CO2H，R8为巯基的迈克尔加成反应、卤代烷或α-卤代酮取代反应、二硫交换反应产物，或-R8为次磺酸基的二甲酮、麦氏酸、巯基化合物取代反应产物。
液相条件：超高效液相色谱系统、反相色谱柱、酸性乙腈/水流动相、等度洗脱；质谱条件：三重四极杆串联质谱仪、ESI离子化源、正离子检测、多反应监测模式。
作为应用中的一种优选，所述氟代内标物用于所述氘代噻吩并吡啶类药物的体内代谢物进行定性、定量分析，所述氘代噻吩并吡啶类药物的体内代谢物为巯甲基代谢物，其结构如式IV所示；使用的氟代内标物如式V所示：
质谱多反应监测离子对的选择：使用的氟代内标物（此处为式V）选择：m/z 354.1→139.1；对应的氘代噻吩并吡啶类药物的体内代谢物（此处为式IV）选择: m/z 373.1→158.2。
作为应用中的另一种优选，所述氟代内标物用于所述氘代噻吩并吡啶类药物体内代谢物的衍生物进行定性、定量分析，所述氘代噻吩并吡啶类药物体内代谢物的衍生物为巯基代谢物的体外衍生物，其结构如VI所示；使用的氟代内标物如式VII所示：
质谱多反应监测离子对的选择：氟代内标物（此处为式VII）选择：m/z 488.2→139.2；对应的氘代噻吩并吡啶类药物体内代谢物的衍生物（此处为式VI）选择：m/z 507.1→158.2。
所述氘代噻吩并吡啶类药物体的内代谢物及其衍生物存在于血浆、尿液、胆汁、粪便、组织匀浆任意一项中。
所述氟代内标物的制备方法，反应制备过程如下：
如上述反应式所示，从o-氟代扁桃酸（F9-1）起始，经酯化反应得甲酯（F9-2），拆分得R-手性异构体（F9-3），将羟基转化为磺酸酯，优选p-硝基苯磺酸酯（F9-4），后经SN2反应得所述氟代内标物，其结构如式I。
作为其中的优选，制备氘代噻吩并吡啶类药物（式II）体内巯甲基代谢物（式IV）的氟代内标物（式V）制备过程如下：
反应从o-氟代扁桃酸磺酸酯（F9-4）起始，经SN2反应得乙酯中间体（F9-5），酸性条件下水解得到氟代内标物差向异构体混合物（式V），经拆分得到两种手性纯氟代内标物F9-P1和F9-P2。
作为另一种优选，用于制备氘代噻吩并吡啶类药物（式II）体内巯基代谢物的衍生物（式VI）的氟代内标物（式VII）制备过程如下：
反应从o-氟代扁桃酸磺酸酯（F9-4）起始，经SN2反应得乙酯中间体（F15-1），酸性条件下水解得到氟代内标物差向异构体混合物（式VII），经拆分得到两种手性纯氟代内标物F15-1-MP和F15-2-MP。
作为实施例，巯甲基化代谢物式IV（M9-P1、M9-P2）以及巯基代谢物间甲氧基苯酰基衍生物式VI（M15-1-MP、M15-2-MP）对应的手性纯的氟代内标式V（F9-P1、F9-P2，图7）和式VII（F15-1-MP、F15-2-MP，图8）通过化学方法被合成并分离出来。并依此建立了生物样品中氘代噻吩并吡啶类药物体内代谢物及其衍生物定量分析方法，并依照指导原则进行了验证。结果证明，基于合成氟代内标建立的定量分析方法符合指导原则要求，达到《生物分析方法验证及样品分析M10》（2022版）接受标准。
本发明的有益效果：
本发明为氘代噻吩并吡啶类药物药代动力学研究开发了一类氟代结构类似物作为定量分析内标、通过了方法学验证并提供了单一手性异构体的制备方法。氟代结构类似物一方面保证了内标与分析物理化性质方面的一致；另一方面回避了天然稳定同位素分布造成的干扰，这是氕/氘替换内标选择方法所不具备的；此外氟代内标在分析氘代药物的失氘代谢物时比氕/氘替换内标选择方法优势尤为突出。所述氟代内标在提取回收率、离子化效率方面与待测物差异小，准确度、精密度、特异性等方面完全满足药代分析需求，定量下限为0.200 ng/mL，基于此建立的定量分析方法符合指导原则要求。
附图说明
图1为氘代噻吩并吡啶类药物（II）结构；
图2为以噻氯吡啶为代表的噻吩并吡啶类药物体内代谢活化过程；
图3为氘代噻吩并吡啶类药物（II）体内代谢物及其衍生物结构（III）；
图4为氘代噻吩并吡啶类药物体内巯甲基化代谢物（IV）结构及两种差向异构体（M9-P1和M9-P2）绝对构型；
图5为氘代噻吩并吡啶类药物巯基代谢物的衍生物（VI）结构及两种差向异构体（M15-1-MP和M15-1-MP）绝对构型；
图6为氟代内标物（I）结构；
图7为与式IV化合物相对应的氟代内标物（V）结构及两种差向异构体（F9-P1和F9-P2）绝对构型；
图8为与式VI化合物相对应的氟代内标物（VII）结构及两种差向异构体（F15-1-MP和F15-2-MP）绝对构型；
图9为标准曲线图（A. M15-1-MP；B. M9-P2；C. M15-2-MP）。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
F9-P1和F9-P2的制备：
将10.0 g（55 mmol）M9-0溶于10 mL二氯甲烷中，冰浴降温。将15.0 g（75 %， 66mmol）m-CPBA分批加入反应液中，加料完毕后自然升至室温。TLC监测原料完全反应后，滤去固体、水处理、分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩。硅胶柱分离得M9-11无色油状物7.5 g。NMR（CDCl3，300MHz）δ= 1.40（s，9H），1.80-1.98（m，2H），3.05（m，1H），3.11（m，1H），3.22（m，1H），3.38（m，1H），3.67（m，1H），3.82（m，1H）。[M+H]+ 200.1285 （理论值200.1281）。
将4.0 g（20 mmol）M9-11溶于40 mL甲醇中，冰浴降温。将8.4 g（20 %，24 mmol）MeSNa溶液滴入反应液中，滴加完毕后自然升至室温。TLC监测原料完全反应后，减压浓缩。加乙酸乙酯水处理、分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩得粗品4.1 g。粗品不经分离直接用于下一步。
在氩气环境下，将草酰氯3.9 g（30 mmol）二氯甲烷溶液冷却至-20 ℃，滴入DMSO4.7 g（61 mmol）并控温不超过0 ℃。将5.0 g（20 mmol）M9-2溶于二氯甲烷中，滴入反应液并控温不超过0 ℃。滴加完毕后滴入TEA 8.2 g（81 mmol），反应液变为黄色。TLC监测原料完全反应后，水处理、分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩。硅胶柱分离得M9-3浅黄色油状物2.5 g。NMR（CDCl3，400MHz）δ= 1.42（s，9H），2.04（s，3H），2.04（m，1H），2.30（m，1H），3.21（m，1H），3.38（m，1H），4,10（d，J=16 Hz, 1H），4,23（d，J=16 Hz, 1H）。[M+H]+ 246.1160（理论值246.1158）。
在氩气环境下，4.1 g NaH（60%，102 mmol）冰浴下溶于THF，将25.9 g（82 mmol）(CF3CH2O)2P(=O)CH2CO2Et的THF溶液滴入反应液，并控温不超过0 ℃。将10.0 g（41 mmol）M9-3溶于THF中，滴入反应液并控温不超过0 ℃。TLC监测原料完全反应后，低温下加入饱和NH4Cl水溶液和EA进行水处理、分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩。硅胶柱分离得M9-4浅黄色粘稠物3.0 g。[M+H]+ 316.1597 （理论值316.1577）。
将2.0 g（7 mmol）M9-4溶于10 mL二氯甲烷中，冰浴降温。将5.0 mL TFA滴入反应液中，滴加完毕后自然升至室温。TLC监测原料完全反应后，减压浓缩得M9-5共1.8 g，直接用于下一步。
将69.4 g（625 mmol）SeO2和6.3 g（156 mmol）NaOH溶于360 mL二氧六环与120 mL水混合溶液中，氩气换气三次后加热回流。回流下将40.0 g（313 mmol）F9-0滴入反应液中，滴加完毕后回流过夜。TLC监测原料完全反应后，硅藻土过滤，滤液以1% NaOH稀释，二氯甲烷洗涤。水相加1 N HCl调pH至1.0左右，EA萃取分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩得粗品。粗品以PE/EA混合液10/1打浆、过滤、干燥，得到11.0 g F9-1粗品不经分离直接用于下一步。NMR（CDCl3，400MHz）δ= 5.43（s，1H），7.02-7.38（m，4H）。[M+H]+ 171.0462 （理论值171.0452）。
将5.0 g（29 mmol）F9-1溶于50 mL甲醇中，加入0.2 mL浓硫酸后加热回流。TLC监测原料完全反应后，冷却、减压浓缩。加EA水处理、分液、有机相用饱和NaHCO3水溶液洗涤、干燥、滤去干燥剂、减压浓缩得粗品5.0 g。F9-2粗品经柱色谱DCM/MeOH分离得手性纯F9-3。NMR（CDCl3，300MHz）δ= 3.52（d，J=3 Hz，1H），3.77（s，1H），5.42（d，J=3 Hz，1H），7.05-7.41（m，4H）。[M+H]+ 185.0616 （理论值185.0608）。
将1.8 g（10 mmol）F9-3溶于15 mL二氯甲烷中，加入2.7 g（12 mmol）对硝基苯磺酰氯以及61 mg（0.5 mmol）DMAP后冷却至-10 ℃。缓慢滴入1.2 g（12 mmol）TEA至反应液并控温不超过0 ℃，滴加完毕后自然升至室温。TLC监测原料完全反应后，加0.5 N HCl淬灭，加DCM萃取、饱和NaCl水洗涤、分液、有机相用干燥、滤去干燥剂、减压浓缩得粗品。F9-4粗品以甲醇重结晶，母液降至0 ℃后过滤晶体、干燥，得F9-4固体2.0 g。NMR（CDCl3，400MHz）δ=3.75（s，3H），6.22（s，1H），7.02（t，J=8 Hz，1H），7.12（t，J=8 Hz，1H），7.32（m，2H），7.08（d，J=8 Hz，2H），7.30（d，J=8 Hz，2H）。[M+H]+ 370.0404 （理论值370.0391）。
将1.2 g（3 mmol）F9-4溶于15 mL乙腈中，继而加入1.0 g（3 mmol）M9-5及1.3 g（10 mmol）K2CO3至反应液中，室温下搅拌。TLC监测原料完全反应后，加EA水处理、分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩。粗品不经分离直接用于下一步。硅胶柱分离得F9-5粗品0.8g。
将2.0 g（5 mmol）F9-5溶于30 mL浓盐酸中，升温至45 ℃。TLC监测原料完全反应后，冷却至0-5 ℃，加饱和NaHCO3水溶液调pH至4.0-5.0。加二氯甲烷萃取、分液、干燥、滤去干燥剂、减压浓缩得差向异构体混合物，其结构式为式V 2.0 g。差向异构体混合物（式V）经柱色谱PE/EA/FA多次分离得手性纯F9-P1（96.98%）50 mg和F9-P2（97.35%）150 mg。F9-P1，NMR（D6-DMSO，1H，500MHz）δ= 1.83（m，1H），1.90（s，3H），2.11（m，1H），2.79（m，1H），2.87（m，1H），3.29（d，J=12 Hz，1H），3.46（d，J=12 Hz，1H），3.67（s，3H），5.79（s，1H），7.28（t，J=8Hz，2H），7.46（t，J=8 Hz，2H）；（D6-DMSO，13C，125 MHz）δ= 13.4，29.4，38.6，39.5，45.6，52.3，52.4，63.9，115.8，115.9，118.9，120.3，124.8，131.1，150.7，159.4，161.4，166.8，169.3。F9-P2，NMR（D6-DMSO，1H，500MHz）δ= 1.83（d，J=14 Hz，1H），1.91（s，3H），2.10（m，1H），2.62（m，1H），2.82（m，1H），3.32（m，1H），3.60（m，1H），3.68（s，3H），5.03（m，2H），5.82（s，1H），7.29（t，J=8 Hz，2H），7.46（t，J=8 Hz，2H）；（D6-DMSO，13C，125 MHz）δ= 13.5，29.3，38.6，39.5，45.2，52.5，52.3，63.9，115.8，116.0，119.0，124.9，130.9，131.2，150.7，159.4，161.3，166.8，169.3。
实施例2
F15-1-MP和F15-2-MP的制备：
将30.0 g（200 mmol）M15-0溶于300 mL二氯甲烷中，冰浴降温。将38.4 g（240mmol）溴素二氯甲烷溶液滴入反应液中，滴加完毕后自然升至室温。TLC监测原料完全反应后，加饱和NaHCO3水溶液、分液、萃取、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩得粗品45.6 g。粗品不经分离直接用于下一步。NMR（CDCl3，300MHz）δ= 3.87（s，3H），4.45（s，2H），7.13-7.20（m，1H），7.37-7.44（m，1H），7.50-7.65（m，2H）。[M+H]+ 228.9880，230.9862 （理论值228.9859，230.9838）。
将45.6 g（200 mmol）M15-1溶于200 mL丙酮中，将34.2 g（20 %，300 mmol）KSAc溶于200 mL乙醇中滴入反应液，滴加完毕后室温下搅拌。TLC监测原料完全反应后，过滤。滤液蒸干后加EA水处理、分液、饱和食盐水洗、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩得粗品。硅胶柱分离得M15-2固体20.0 g。NMR（CDCl3，300MHz）δ= 2.35（s，3H），3.80（s，3H），4.33（s，2H），7.06-7.11（m，1H），7.33（t，J=8 Hz，1H），7.45（m，1H），7.51（d，J=8 Hz，1H）。[M+H]+225.0600 （理论值225.0580）。
将20.0 g（89 mmol）M15-2溶于150 mL原碳酸三乙酯和150 mL乙二醇混合液中，加入催化量p-TSA后升温至60 ℃。TLC监测原料完全反应后，将反应液浓缩，加EA后用饱和食盐水洗。分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩得粗品。硅胶柱分离得M15-3黄色粘稠液体22.0 g。NMR（CDCl3，300MHz）δ= 2.33（s，3H），3.47（s，2H），3.82（s，3H），3.83（m，2H），4.07（m，2H），6.83-6.88（m，1H），7.04-7.11（m，2H），7.27（dd，J=6，8 Hz，1H）。[M+H]+ 269.0893（理论值269.0842）。
将20.0 g（75 mmol）M15-3溶于200 mL甲醇中，冰浴冷却。滴加1 N NaOH水溶液82mL（82 mmol），滴加完毕后缓慢升至室温。TLC监测原料完全反应后，减压浓缩得粗品不经分离直接用于下一步。
将M15-4粗品溶于200 mL乙腈中，加入14.9 g（75 mmol）M9-11后升温至回流。滴加1 N NaOH水溶液82 mL（82 mmol），滴加完毕后继续回流1 h。TLC监测原料完全反应后，冷却至室温，加EA水处理、分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩。硅胶柱分离得M15-5共17.0g直接用于下一步。
在氩气环境下，将草酰氯7.6 g（60 mmol）二氯甲烷溶液400 mL冷却至-20 ℃，滴入DMSO 9.4 g（120 mmol）并控温不超过0 ℃。将17.0 g（40 mmol）M15-5溶于二氯甲烷中，滴入反应液并控温不超过0 ℃。滴加完毕后滴入TEA 24.2 g（240 mmol）。TLC监测原料完全反应后，水处理、分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩。硅胶柱分离得M15-6共16.0 g直接用于下一步。
在氩气环境下，NaH 3.3 g（60%，83 mmol）THF溶液冰水冷却，将(EtO)2P(=O)CH2CO2Et的THF溶液15.9 g（76 mmol）滴入反应液，并控温不超过5 ℃。将16.0 g（38 mmol）M15-6溶于THF中，滴入反应液并控温不超过0 ℃。TLC监测原料完全反应后，低温下加入饱和NH4Cl水溶液和EA进行水处理、分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩。硅胶柱分离得M15-7无色粘稠物8.0 g。NMR（CDCl3，300MHz）δ= 1.24（t，J=6 Hz，3H），1.44（s，9H），1.85-2.10（m，2H），2.96（d，J=14 Hz，1H），3.16（m，1H），3.20（d，J=14 Hz，1H），3.81（s，3H），3.83（m，2H），4.11（m，6H），5.29（m，1H），5.72（m，1H），6.81-6.86（m，1H），7.02-7.07（m，2H），7.24（m，1H）。
将8.0 g（17 mmol）M15-7溶于120 mL二氯甲烷中，滴入20.0 mL TFA，室温下搅拌。TLC监测原料完全反应后，减压浓缩得M15-8粗品，不经分离直接用于下一步。
将5.0 g（14 mmol）F9-4粗品溶于80 mL乙腈中，加入4.7 g（14 mmol）M15-8和5.6g（41 mmol）K2CO3室温下搅拌。TLC监测原料完全反应后，加乙酸乙酯水处理、分液、干燥有机层、滤去干燥剂、减压浓缩。硅胶柱分离得F15-1共5.6 g直接用于下一步。
将4.0 g（8 mmol）F15-1溶于50 mL浓盐酸中，升温至45 ℃。TLC监测原料完全反应后，冷却至0-5 ℃，加饱和NaHCO3水溶液调pH至4.0-5.0。加二氯甲烷萃取、分液、干燥、滤去干燥剂、减压浓缩得粗品4.1 g。硅胶柱初步分离（DCM/MeOH）得差向异构体混合物（式VII化合物）共3.8 g。
差向异构体混合物化合物式VII经柱色谱（DCM/MeOH/FA）多次分离得手性纯F15-1-MP（100.00%）111 mg和F15-2-MP（100.00%）140 mg。F15-1-MP，NMR（D6-DMSO，1H，500MHz）δ= 1.91（m，1H），2.11（m，1H），2.82（m，1H），2.91（m，1H），3.28（d，J=12 Hz，1H），3.50（d，J=12Hz，1H），3.68（s，3H），3.80（s，3H），4.09（d，J=16 Hz，1H），4.11（d，J=16 Hz，1H），5.04（m，1H），5.11（m，1H），5.74（s，1H），7.17-7.21（m，2H），7.29（m，2H），7.36（m，1H），7.39-7.50（m，4H）；（D6-DMSO，13C，125 MHz）δ= 29.7，38.1，38.3，45.7，52.4，52.5，55.3，63.9，112.8，115.8，116.0，119.2，120,0，120.6，124.9，129.9，131.2，131.3，137.1，150.9，159.3，159.4，161.4，166.8，169.2。F15-2-MP，NMR（D6-DMSO，1H，500MHz）δ= 1.90（m，1H），2.11（m，1H），2.64（m，1H），2.85（d，J=12 Hz，1H），3.32（d，J=12 Hz，1H），3.64（m，1H），3.68（s，3H），3.80（s，3H），4.07（d，J=16 Hz，1H），4.12（d，J=16 Hz，1H），5.01（m，1H），5.10（m，1H），5.76（s，1H），7.18-7.21（m，2H），7.29（m，2H），7.37（m，1H），7.39-7.50（m，4H）；（D6-DMSO，13C，125MHz）δ= 29.6，38.1，38.3，45.3，52.5，53.6，55.3，63.9，112.9，115.8，116.0，119.2，120.1，120.6，124.9，124.9，129.9，130.9，131.2，131.3，137.1，150.8，159.4，159.4，161.4，166.8，169.3。
实施例3
F9-P2和F15-2-MP作为内标用于定量。
生物样品处理：
1)取50 μL大鼠空白血浆样本置于2 mL EP管中；
2)所有样本中加入50 μL待测物工作液；
3)所有样本中加入50 μL内标物工作液；
4)所有样本均加入250 μL乙腈沉淀，混合均匀；
5)离心条件：13000 rpm离心10min；
6)将离心后的上清溶液转移至干净的EP管中，取100 μL上清与200 μL水混合均匀，13000 rpm离心10 min，10 μL样品进入LC-MS/MS分析。
液相条件：
色谱柱： ACQUITYTM BEH C18柱（100×2.1 mm，1.7 μm）；
柱温： 45 ℃；
流动相 A： 0.05%甲酸-水；
流动相 B： 乙腈；
洗针溶剂： 甲醇/水（1/1，v/v）；
进样量： 10 µL；
总流速： 0.45 mL/min；
运行时间： 10.0 min；
保留时间：
质谱条件：
仪器型号： Sciex TRIPLE QUAD 6500 plus；
离子源： ESI；
检测模式： 正离子；
喷雾电压（IS）： 5500 V；
离子化温度（TEM）： 500 ℃；
雾化气（Gas1）： 氮气压力35 psi；
加热气（Gas2）： 氮气压力30 psi；
气帘气（CUR）： 氮气压力30 psi；
碰撞气（CAD）： 氮气压力10 psi；
多反应监测（MRM）条件：
标准曲线样品：使用大鼠血浆制备标准曲线样品，按照“生物样品处理”项处理。制备一系列包含7个浓度样品的氘代药物体内代谢物的衍生物样品标准曲线。
M15-1-MP浓度范围为0.200 -200 ng/mL，标准曲线样品的浓度分别为：0.200、1.00、2.00、10.0、20.0、100、200 ng/mL。
M9-P2的浓度范围为0.200 - 200 ng/mL，标准曲线样品的浓度分别为：0.200、1.00、2.00、10.0、20.0、100、200 ng/mL。
M15-2-MP浓度范围为0.200 -200 ng/mL，标准曲线样品的浓度分别为：0.200、1.00、2.00、10.0、20.0、100、200 ng/mL。
《生物分析方法验证及样品分析M10》（2022版）接受标准：校准曲线应包括空白样品、零浓度样品（仅加入内标的空白样品）和至少6个浓度水平的校正标样（包括定量下限和定量上限）。在定量下限水平，校正标样的回算浓度应在标示浓度的±20%以内，其他水平应在标示值的±15%以内。至少有75%的校正标样且至少6个浓度水平应符合上述标准。
回归模型：方法的回归模型将在氘代药物体内代谢物的衍生物的标准曲线浓度范围从0.200 - 200 ng/mL内进行评估。大鼠血浆中M15-1-MP、M9-P2和M15-2-MP浓度和响应之间的关系由线性最小二乘法回归（权重为1/X2）进行拟合，标准曲线图如图9（A.M15-1-MP；B.M9-P2；C.M15-2-MP）所示。
分析物对内标的干扰：为评估分析物对内标的干扰，按照“生物样品处理”项下处理，不加内标，以相应体积稀释剂（乙腈-水，1:1，v/v）代替，分别平行制备、处理并分析六份仅含分析物且不加内标的定量上限浓度样品。
《生物分析方法验证及样品分析M10》（2022版）接受标准：干扰组分的响应不高于定量下限样品中内标响应的5%。
内标对分析物的干扰：单个内标分别评估。为评估内标对分析物的干扰，按照“生物样品处理”项下处理，加入空白基质，分别平行制备、处理并分析六份仅含单个内标且不加分析物的样品，单个内标浓度于方法验证时所用内标浓度一致。
《生物分析方法验证及样品分析M10》（2022版）接受标准：干扰组分的响应不应超过待测物定量下限响应的20%。
分析物对内标的干扰结果：
内标对分析物的干扰结果：
批内和批间准确度和精密度：取四个不同浓度的质控样品（M9-P2的浓度分别为0.200，0.600，6.00和150 ng/mL；M15-1-MP的浓度分别为0.200，0.600，6.00和150 ng/mL；M15-2-MP的浓度分别为0.200，0.600，6.00和150 ng/mL），进行LC-MS/MS方法测定大鼠血浆中M9-P2、M15-1-MP和M15-2-MP浓度的批内及批间准确度和精密度的考察。每一个浓度平行制备6份，按照“生物样品处理”项下处理。用3个独立分析批的4个浓度水平的质控样品的平行6份样品来评估批间准确度和精密度。
《生物分析方法验证及样品分析M10》（2022版）接受标准：除LLOQ外，每个浓度水平质控样品的准确度应在标示值的±15%以内，LLOQ的准确度应在标示值的±20%以内。除LLOQ外，每个浓度水平质控样品的精密度（%CV）不应超过15%，LLOQ的精密度不应超过20%。对于非准确度和精密度验证的分析批，至少2/3的QC样品、每个浓度水平的至少50%应在标示值的±15%以内。
提取回收率样品制备：提取回收率样品由三个浓度水平（0.600，6.00和150 ng/mL）的基质样品分别平行制备六份，按照“标准曲线样品”项处理，与同批随行的标曲样品一同进样。
回收率参比样品：提取过程与上面的描述相同，分析物和内标溶液均在提取后，在最终的稀释前加入。
在分析批中，提取回收率样品和回收率参比样品的浓度相同。
接受标准：提取回收率不需要很高，但是测定的结果要可重现。每个浓度水平质控样品的峰面积比值的相对标准偏差（%CV）不大于15.0%。
《生物分析方法验证及样品分析M10》（2022版）接受标准：待测物的回收率不必达到100%，但待测物和内标（如果使用）的回收率应一致。
当以F9-P2作为M9-P2内标时，需对二者提取回收率进行考察。以待测物M9-P2与内标F9-P2的峰面积比计内标归一化后M9-P2提取回收率（共3个浓度组，每组6个样品）：
当以F15-1-MP作为M15-1-MP内标时，考察二者提取回收率，以待测物M15-1-MP与内标F15-1-MP的峰面积比计内标归一化后M15-1-MP提取回收率（共3个浓度组，每组6个样品）：
当以F15-2-MP作为M15-2-MP内标时，考察二者提取回收率，以待测物M15-2-MP与内标F15-2-MP的峰面积比计内标归一化后M15-2-MP提取回收率（共3个浓度组，每组6个样品）：
结果证明，基于合成氟代物内标建立的LC-MS/MS分析方法用于氘代噻吩并吡啶类药物药代动力学定量研究完全符合药典9012《生物样品定量分析方法验证指导原则》要求，达到《生物分析方法验证及样品分析M10》（2022版）接受标准。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案（比如合成策略或分析方法步骤先后顺序的调整等）进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种氟代内标物，其特征在于：其结构如式I所示：
其中，R1为-H或-CH3，R2为=CH-CO2H、=CH-CO-SG或-CH2-CO2H，当与R2、R3相连的一对碳原子间为双键时R2为-CH2-CO2H，R3为-SH、-S-SG、-SR4或R2与R3共同组成2-氧噻吩环，-SG为谷胱甘肽，且R2与R3不同时含有谷胱甘肽取代基，R4为1-4个碳的烷基，酯基、酰胺、酮、氰基取代烷基，酯基、酰胺、酮、氰基取代的烯基或环酮、环酰亚胺、环内酯、巯基取代基。
2.根据权利要求1中所述的氟代内标物，其特征在于：R4为-CH3、-tBu、
、
、
、
、
、
、
、
、
、二甲酮、麦氏酸、
、
、
、
、-SG中任意一种，R5为H、1-4个碳的烷基，卤
素、甲氧基或二甲胺基取代或未取代的苯基种任意一种。
3.根据权利要求1中所述的氟代内标物，其特征在于，所述氟代内标物为下列化合物中任意一种：
(Z)-2-((S)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(甲硫基)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(E)-2-((S)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(甲硫基)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(Z)-2-((R)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(甲硫基)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(E)-2-((R)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(甲硫基)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(S)-2-(1-(1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(甲硫基)-1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)乙酸；
(Z)-2-((S)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-((2-(3-甲氧苯基)-2-氧乙基)硫代)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(E)-2-((S)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-((2-(3-甲氧苯基)-2-氧乙基)硫代)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(Z)-2-((R)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-((2-(3-甲氧苯基)-2-氧乙基)硫代)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(E)-2-((R)-1-((S)-1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-((2-(3-甲氧苯基)-2-氧乙基)硫代)哌啶-3-亚叉基)乙酸；
(S)-2-(1-(1-(2-氟苯基)-2-甲氧基-2-氧乙基)-4-(2-(3-甲氧苯基)-2-氧乙基)硫代)-1,2,5,6-四氢吡啶-3-基)乙酸。
4.权利要求1~3中任意一项所述的氟代内标物用于氘代噻吩并吡啶类药物体内药代谢动力学研究的应用，所述氘代噻吩并吡啶类药物结构如式II所示：
其中，R为-H、磷酸酯基、羧酸酯基或氨酯取代基，其特征在于：通过液相色谱-质谱联用方法，使用所述氟代内标物，对所述氘代噻吩并吡啶类药物的体内代谢物及其衍生物进行定性、定量分析。
5.根据权利要求4中所述的氟代内标物用于氘代噻吩并吡啶类药物体内药代谢动力学研究的应用，其特征在于：所述氘代噻吩并吡啶类药物的体内代谢物及其衍生物如式III所示：
对于氘代噻吩并吡啶类药物的体内代谢物：R6为-H或-CD3，R7为=CH-CO2H、=CH-CO-SG或-CH2-CO2H，当与R7、R8相连的一对碳原子间为双键时R7为-CH2-CO2H，R8为-S-CH3、-S-SG，-S-SR9或R7与R8共同组成2-氧噻吩环，-SG为谷胱甘肽且R7与R8不同时含有谷胱甘肽取代基，-SR9为氨基酸或蛋白片段；
对于氘代噻吩并吡啶类药物体内代谢物的衍生物：R6为-H或-CD3，R7为=CH-CO2H、=CH-CO-SG或-CH2-CO2H，当与R7、R8相连的一对碳原子间为双键时R7为-CH2-CO2H，R8为巯基的迈克尔加成反应、卤代烷或α-卤代酮取代反应、二硫交换反应产物，或R8为次磺酸基的二甲酮、麦氏酸、巯基化合物取代反应产物。
6.根据权利要求5所述的氟代内标物用于氘代噻吩并吡啶类药物体内药代谢动力学研究的应用，其特征在于：液相条件：超高效液相色谱系统、反相色谱柱、酸性乙腈/水流动相、等度洗脱；质谱条件：三重四极杆串联质谱仪、ESI离子化源、正离子检测、多反应监测模式。
7.根据权利要求6所述的氟代内标物用于氘代噻吩并吡啶类药物体内药代谢动力学研究的应用，所述氟代内标物用于所述氘代噻吩并吡啶类药物的体内代谢物进行定性、定量分析，其特征在于：所述氘代噻吩并吡啶类药物的体内代谢物为巯甲基代谢物，其结构如式IV所示；使用的氟代内标物如式V所示：
氟代内标物质谱多反应监测离子对的选择：m/z 354.1→139.1。
8.根据权利要求6所述的氟代内标物用于氘代噻吩并吡啶类药物体内药代谢动力学研究的应用，所述氟代内标物用于所述氘代噻吩并吡啶类药物体内代谢物的衍生物进行定性、定量分析，其特征在于：所述氘代噻吩并吡啶类药物体内代谢物的衍生物为巯基代谢物的体外衍生物，其结构如VI所示；使用的氟代内标物如式VII所示：
氟代内标物质谱多反应监测离子对的选择：m/z 488.2→139.2。
9.根据权利要求6所述的氟代内标物用于氘代噻吩并吡啶类药物体内药代谢动力学研究的应用，其特征在于：所述氘代噻吩并吡啶类药物体的内代谢物及其衍生物存在于血浆、尿液、胆汁、粪便、组织匀浆任意一项中。
10.权利要求1所述氟代内标物的制备方法，其特征在于：反应制备过程如下：从o-氟代扁桃酸起始，经酯化反应得甲酯，拆分得R-手性异构体，将羟基转化为磺酸酯，后经SN2反应得所述氟代内标物，其结构如式I。
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