CN105362266A - 噻吩并吡啶类化合物或其在药学上可接受的盐在制备治疗或预防癫痫药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及噻吩并吡啶类化合物及其在药学上可接受的盐在制备治疗或预防癫痫药物中的应用。至今尚未见有关噻吩并吡啶类化合物抗癫痫活性及抗癫痫靶点活性的相关报道。本发明公开了以氯吡格雷、普拉格雷为代表的噻吩并吡啶类化合物及其盐在戊四唑(PTZ)诱导斑马鱼癫痫模型中的抗癫痫药效，说明在无毒浓度下，噻吩并吡啶类化合物及其盐在治疗或预防癫痫疾病中表现出较好的药效。

Description

噻吩并吡啶类化合物或其在药学上可接受的盐在制备治疗或预防癫痫药物中的应用

技术领域

本发明涉及噻吩并吡啶类化合物或其在药学上可接受的盐在制备治疗或预防癫痫药物中的应用，这些噻吩并吡啶类化合物从噻吩并吡啶类的结构式中衍生而来，它们在治疗或预防癫痫疾病中表现出较好的药效。

背景技术

癫痫(epilepsy)是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征，以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征。癫痫发作可表现运动、感觉、意识、精神、行为和自主神经等功能异常。癫痫是神经系统常见疾病之一，全球约5000万患者，发病率约1％。癫痫可发生在任何年龄段，与性别、社会经济地位无关。癫痫死亡率约为20％，给家庭、社会造成很大的负担。目前，经过现有的抗癫痫药物治疗，仍有大约30％的患者耐药不能控制。药物不能控制的癫痫即难治性癫痫的死亡率更高，可达50％，尽管对于药物不能控制的癫痫目前多采用手术治疗，但适合手术的患者只占一小部分。因此，寻找有效和安全的抗癫痫治疗药物是生物医学重要的目标之一。

啮齿类癫痫模型包括最大电休克模型，点燃模型，戊四唑(PTZ)、海仁酸、青霉素等诱导癫痫模型，这些模型对于癫痫药物研发及机制研究起到了重要的作用。但是，现阶段癫痫依然是一个棘手的医学问题，其机制尚不清楚。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因同源性高达85％，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，具有体积小(可用微孔板分析)、发育周期短、体外受精、透明(可直接用肉眼和解剖显微镜观察)、单次产卵数较高等特点。斑马鱼模型既具有体外实验快速、高效、低廉、用药量小等优势，又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高、可观察多个器官等优点，近年已在化合物药效、毒性评价中得到广泛应用。在斑马鱼胚胎发育早期多巴胺系统、5羟色胺系统和γ-氨基丁酸(简称GABA)系统发育，并且具有相应的功能。这为斑马鱼在神经系统疾病中的应用提供了可能。PTZ是γ-氨基丁酸受体拮抗剂，而GABA是脑内重要的抑制性神经递质，抑制GABA后可诱导癫痫发作。按照这种诱导机制，PTZ诱导大鼠癫痫模型可筛选各种作用机制的抗癫痫药物，癫痫的分级参照1972年Racine制定的标准可以分为：一级：静止不动伴随有嘴部/面部运动；二级：点头及落水狗样抖动；三级：前肢阵挛；四级：站立及双侧前肢阵挛；五级：持续站立及跌倒；六级：狂奔及尖叫。BarabanandBerghmans应用同样的机制，建立了PTZ诱导斑马鱼癫痫模型，可模拟哺乳动物癫痫状态，斑马鱼表现为运动增加、快速的“涡旋行为”及阵挛发作。多位研究者利用PTZ诱导斑马鱼癫痫模型验证了多种作用机制的抗癫痫药物在此模型中均能表现出一定的药效，包括钠离子阻滞剂：卡马西平、苯妥因纳；钙通道阻滞剂：加巴喷丁；抑制囊泡释放药：左乙拉西坦；GABA受体激动剂：地西泮；改变GABA再摄取和分解的药物：丙戊酸钠等。2012年国外研究者利用斑马鱼癫痫模型从2000个已知活性的化合物中，筛选出46个有潜在抗癫痫作用的化合物。这些化合物包括甾族化合物，抗真菌、抗炎、抗氧化、血管扩张剂、杀虫剂、除草剂，相关药物进入后续研发阶段。因此，斑马鱼癫痫模型可以高通量高效筛选抗癫痫药物，这对癫痫药物的研发意义重大。

综上所述，利用斑马鱼癫痫模型高通量筛选抗癫痫药物，寻求新的化合物来有效治疗或预防癫痫已成为研发热点，开发具有自主知识产权的抗癫痫药物迫在眉睫。

至今尚未见有关噻吩并吡啶类化合物抗癫痫活性及抗癫痫靶点活性的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供噻吩并吡啶类化合物或其在药学上可接受的盐在制备治疗或预防癫痫药物中的新用途。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：噻吩并吡啶类化合物或其在药学上可接受的盐在制备治疗或预防癫痫药物中的应用，所述噻吩并吡啶类化合物的通式Ⅰ如下：

上述通式Ⅰ中，X为F、Cl、Br或I；R₁为含1-4个碳的烷基、R₂NR₄或甲氧基，其中R₂、R₄各自独立地为氢或含1-3个碳的烷基；R₃为氢、羟基、甲氧基、乙酰氧基或环丙酰氧基。

作为优选，所述药学上可接受的盐选自盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲基磺酸盐、乙基磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。

作为优选，所述的噻吩并吡啶类化合物可以为普拉格雷或氯吡格雷，也可以为所述的噻吩并吡啶类化合物为噻氯匹定(化合物3)、2-乙酰氧基-2-(2-氟苯基)-2-(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5-基)乙酸甲酯(化合物4)、2-乙酰氧基-2-(2-碘苯基)-2-(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5-基)-N,N二甲基乙酰胺(化合物5)、2-乙酰氧基-2-(2-氯苯基)-2-(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5-基)乙酸异丙酯(化合物6)、2-乙酰氧基-2-(2-氟苯基)-2-(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5-基)-N环丙基乙酰胺(化合物7)、2-[2-(羟基)-4,5,6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-5(4H)-基]-1-环丙基-2-(2-氟苯基)乙酮(化合物8)、2-[2-(甲氧基)-4,5,6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-5(4H)-基]-1-环丙基-2-(2-氟苯基)乙酮(化合物9)或2-环丙酰氧基-2-(2-氟苯基)-2-(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5-基)乙酸甲酯(化合物10)。

作为优选，所述的药物采用口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或经皮给药剂型。

作为优选，所述的药物采用片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、贴剂或凝胶剂形式。

本发明利用PTZ诱导斑马鱼癫痫模型进行噻吩并吡啶类化合物抗癫痫药效学实验。PTZ是γ-氨基丁酸(简称GABA)受体拮抗剂，PTZ诱导后，即刻早期基因c-fos上调，斑马鱼立即表现出运动增加、快速的“涡旋行为”及阵挛发作，这与人类癫痫发作症状相似。利用ViewPoint(众维公司)的ZebraLab斑马鱼行为学分析系统记录斑马鱼运动轨迹，利用该分析系统分析快速运动距离，筛选抗癫痫药物。该方法简单，高效，高通量。

本发明以噻吩并吡啶类中具有代表性的化合物盐酸普拉格雷、硫酸氯吡格雷为例，在PTZ诱导斑马鱼癫痫模型中，可以显著的降低斑马鱼快速运动距离(相当于哺乳动物的癫痫状态)，对总的运动距离无影响，说明在无毒浓度下，盐酸普拉格雷、硫酸氯吡格雷表现出较好的抗癫痫药效，这表明以普拉格雷、氯吡格雷为代表的噻吩并吡啶类化合物及其在药学上可接受的盐可以治疗或预防癫痫的发生。

附图说明

图1为PTZ诱导斑马鱼癫痫模型轨迹图。黑色代表V>20mm/sec的运动轨迹，灰色代表4mm/sec<V<20mm/sec的运动轨迹，白色代表V<4mm/sec的运动轨迹。苯妥英钠在300μM浓度下，能显著降低快速运动距离，癫痫治疗效率达46％(p<0.01)；筛选的化合物Cmp8为盐酸普拉格雷，单浓素筛选中100μM浓度下，能显著降低快速运动距离，癫痫治疗效率达94％(p<0.01)。

图2为盐酸普拉格雷抗癫痫药效柱状图。空白组快速运动距离为100mm，溶剂组和模型组与空白组相比，快速运动距离显著增加(p<0.01,p<0.01)，表明PTZ诱导斑马鱼癫痫模型成功，且表现为快速运动距离增加。模型组与溶剂组相比，快速运动距离无差异，表明溶剂DMSO1.0％对斑马鱼行为无影响。苯妥英钠在300μM浓度下，能显著降低快速运动距离，癫痫治疗效率达46％(p<0.01)；盐酸普拉格雷单浓素筛选中100μM浓度下，能显著降低快速运动距离，癫痫治疗效率达94％(p<0.01)。

图3为多浓度盐酸普拉格雷对斑马鱼总的运动距离的影响。盐酸普拉格雷在10、30、100μM浓度的对正常斑马鱼总的运动距离抑制率为14％、8％、-19％，均无统计学差异，结果表明其在此浓度下，斑马鱼无毒性反应。

图4为多浓度盐酸普拉格雷对PTZ诱导斑马鱼癫痫模型的药效作用。在PTZ诱导癫痫模型中，盐酸普拉格雷在10、30、100μM浓度抗癫痫抑制率分别为39％(p<0.05)、58％(p<0.01)、98％(p<0.01)，量效关系明确，表现出较好的抗癫痫效果。

图5为盐酸普拉格雷在10、30、100μM浓度对PTZ诱导斑马鱼癫痫模型轨迹图。黑色代表V>20mm/sec的运动轨迹，灰色代表4mm/sec<V<20mm/sec的运动轨迹，白色代表V<4mm/sec的运动轨迹。

图6为多浓度硫酸氯吡格雷对斑马鱼总的运动距离的影响。硫酸氯吡格雷在5、10、25μM浓度的对正常斑马鱼总的运动距离抑制率为5％、-2％、2％，均无统计学差异，结果表明其在此浓度下，斑马鱼无毒性反应。

图7为多浓度硫酸氯吡格雷对PTZ诱导斑马鱼癫痫模型的药效作用。在PTZ诱导癫痫模型中，硫酸氯吡格雷在5、10、25μM浓度浓度抗癫痫抑制率分别为26％、37％(p<0.05)、76％(p<0.01)，量效关系明确，表现出较好的抗癫痫效果。

图8为硫酸氯吡格雷在10、30、100μM浓度对PTZ诱导斑马鱼癫痫模型轨迹图。黑色代表V>20mm/sec的运动轨迹，灰色代表4mm/sec<V<20mm/sec的运动轨迹，白色代表V<4mm/sec的运动轨迹。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步阐述，目的在于使得本领域技术人员更清楚地了解本发明，但以下内容不应以任何方式被理解为对本发明的权利要求书请求保护的范围的限制。

实施例1定量观察单浓度盐酸普拉格雷在斑马鱼癫痫模型中的药效

普拉格雷：2-[2-(乙酰氧基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-5(4H)-基]-1-环丙基-2-(2-氟苯基)乙酮，为噻吩并吡啶类化合物，本实施例观察其单浓度下盐酸普拉格雷对PTZ诱导斑马鱼癫痫的药效。

斑马鱼：

本实施例使用的斑马鱼为野生型斑马鱼，饲养和使用标准严格参照美国实验动物管理和使用委员会(IACUC)的要求进行。

养鱼水(Fishwater)：

配置方法：1L反渗透水(reverseosmosis(RO)water)加入0.3g海盐(InstantOceansalts)。

二甲基亚砜(DMSO，分析纯)：

购买于阿拉丁(货号#1095515，批号#30573)。1％DMSO溶液(阴性对照)配置：使用时，用养鱼水配置成浓度为1.0％的工作液，现配现用。

PTZ(戊四唑，诱导剂)：

购自美国sigma公司，批号069K1245。使用时，用0.1％DMSO溶液配置成实验所需的浓度，本实验中PTZ的使用浓度为10mM。

苯妥英纳(阳性对照药)：

购自北京百灵威科技有限公司，批号GF01-FD。使用时，用1.0％DMSO溶液配置成实验所需的浓度，本实验中苯妥因纳的使用浓度为300μM。

盐酸普拉格雷：购买于sigma公司，批号078235。使用时，用1.0％DMSO溶液配置成100μM进行实验。

实验方法：

(1)实验分组及幼鱼处理：取96尾发育良好的斑马鱼幼鱼，幼鱼发育时相为受精后6dpf(day-postfertilization，dpf)，随机分为12组(模型组、溶剂组、阳性药物组、药物组)，每组胚胎数量为8只。操作时将幼鱼随机分配至96孔细胞培养平板(Greiner，德国)中，每孔1尾幼鱼，每孔饲养用水200μL。

(2)药物预处理：用移液器(量程100～1000μL，Eppendorf)迅速将预先配置好的药液加入96孔细胞培养平板对应的孔中，每孔180μL。加药液之前，用移液器(量程10～1000μL，Eppendorf)将96孔板中孵育胚胎的饲养用水尽力移出，此操作需在短时间内预先完成，以防止胚胎干燥。实验环境温度控制在28.5℃左右，相对湿度40～70％。然后用锡箔纸将96孔板包裹好，做好实验标记，迅速放置于斑马鱼培养箱中继续培养1h(培养箱温度控制在28.5±0.5℃)。

(3)PTZ诱导：药物预处理1h后，加入PTZ20μL，使终浓度为10mM。稳定10分钟后，利用ViewPoint行为学分析仪(即ZebraLab斑马鱼行为学分析系统)记录60分钟内斑马鱼的运动情况。

(4)对斑马鱼的快速运动(V>20mm/sec)距离(D)进行定量分析，计算药物的抗癫痫治疗效率，公式如下：

(5)同时，在轨迹记录结束后，在解剖显微镜下观察鱼的状态，包括：心率变化、是否侧翻、是否有触碰反应等。

(6)统计学处理结果以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用Dunnett’sT-检验进行统计学处理，p<0.05为差异性显著。

实验结果见表1，图1、图2。在96孔板中可以一次单浓度筛选8个化合物，每组8尾鱼，空白组快速运动距离为100mm，溶剂组和模型组与空白组相比，快速运动距离显著增加(p<0.01，p<0.01)，表明PTZ诱导斑马鱼癫痫模型成功，且表现为快速运动距离增加。模型组与溶剂组相比，快速运动距离无差异，表明溶剂DMSO1.0％对斑马鱼行为无影响。苯妥英钠是一个钠离子通道阻滞剂，是一传统的抗癫痫药物。本实验中，苯妥英钠在300μM浓度下，能显著降低快速运动距离，癫痫治疗效率达46％(p<0.01)；筛选的化合物Cmp8为盐酸普拉格雷，单浓度筛选中100μM浓度下，能显著降低快速运动距离，癫痫治疗效率达94％(p<0.01)。同时在轨迹记录结束后，在解剖显微镜下观察鱼的状态，盐酸普拉格雷给药组，触碰后均有逃避反应，未见其它异常表型，表明盐酸普拉格雷100μM浓度下未见毒性反应，快速运动距离下降亦是一种抗癫痫药效表现。

表1盐酸普拉格雷在PTZ诱导斑马鱼癫痫模型中的治疗效率(mean±sem)

	浓度(μM)	快速运动距离(mm)	癫痫治疗效率％
				空白组	-	100±1.6	-
模型组	-	1586±135##	-
				溶剂组	1.0％DMSO	1814±202##	-
苯妥英纳	300	857±185**	46**
				盐酸普拉格雷	100	89±37**	94**

与空白组相比，#，p<0.05，##，p<0.01；与溶剂组相比，*，p<0.05，**，p<0.01。

实施例2定量观察多浓度盐酸普拉格雷在斑马鱼癫痫模型中的药效及安全性

实验材料和实验方法同实施例1。通过软件(即ZebraLab斑马鱼行为学分析系统中的软件)分析总的运动距离，来考察10、30、100μM浓度的盐酸普拉格雷对正常斑马鱼运动的影响。及在PTZ诱导癫痫模型中，考察10、30、100μM浓度的盐酸普拉格雷对斑马鱼快速运动距离的影响，判断其有无抗癫痫药效。

结果见图3、4、5。盐酸普拉格雷在10、30、100μM浓度的对正常斑马鱼总的运动距离抑制率为14％、8％、-19％，均无统计学差异，结果表明其在此浓度下，斑马鱼无毒性反应。在PTZ诱导癫痫模型中，盐酸普拉格雷在10、30、100μM浓度抗癫痫抑制率分别为39％(p<0.05)、58％(p<0.01)、98％(p<0.01)，量效关系明确，表现出较好的抗癫痫效果。

实施例3定量观察多浓度硫酸氯吡格雷在斑马鱼癫痫模型中的药效及安全性

实验材料和实验方法同实施例2。氯吡格雷：(S)-alpha-(2-氯苯基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-5(4H)乙酸甲酯，为噻吩并吡啶类化合物，本实施例观察其多浓度下硫酸氯吡格雷对PTZ诱导斑马鱼癫痫的药效。

通过软件(即ZebraLab斑马鱼行为学分析系统中的软件)分析总的运动距离，来考察5、10、25μM浓度的硫酸氯吡格雷对正常斑马鱼运动的影响。及在PTZ诱导癫痫模型中，考察5、10、25μM浓度的硫酸氯吡格雷对斑马鱼快速运动距离的影响，判断其有无抗癫痫药效。

结果见图6、7、8。硫酸氯吡格雷在5、10、25μM浓度的对正常斑马鱼总的运动距离抑制率为5％、-2％、2％，均无统计学差异，结果表明其在此浓度下，斑马鱼无毒性反应。在PTZ诱导癫痫模型中，硫酸氯吡格雷在5、10、25μM浓度浓度抗癫痫抑制率分别为26％、37％(p<0.05)、76％(p<0.01)，量效关系明确，表现出较好的抗癫痫效果。

实施例4-11定量观察单浓度噻吩并吡啶类化合物3-10在斑马鱼癫痫模型中的药效

实验材料和实验方法同实施例1。结果见下表：

表2化合物3-10在PTZ诱导斑马鱼癫痫模型中的治疗效率(mean±sem)

与溶剂组相比，*，p<0.05，**，p<0.01。

Claims (7)

1.噻吩并吡啶类化合物或其在药学上可接受的盐在制备治疗或预防癫痫药物中的应用，所述噻吩并吡啶类化合物的通式Ⅰ如下：

上述通式Ⅰ中，X为F、Cl、Br或I；R₁为含1-4个碳的烷基、R₂NR₄或甲氧基，其中R₂、R₄各自独立地为氢或含1-3个碳的烷基；R₃为氢、羟基、甲氧基、乙酰氧基或环丙酰氧基。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐选自盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲基磺酸盐、乙基磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的噻吩并吡啶类化合物为普拉格雷。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的噻吩并吡啶类化合物为氯吡格雷。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的噻吩并吡啶类化合物为噻氯匹定、2-乙酰氧基-2-(2-氟苯基)-2-(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5-基)乙酸甲酯、2-乙酰氧基-2-(2-碘苯基)-2-(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5-基)-N,N二甲基乙酰胺、2-乙酰氧基-2-(2-氯苯基)-2-(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5-基)乙酸异丙酯、2-乙酰氧基-2-(2-氟苯基)-2-(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5-基)-N环丙基乙酰胺、2-[2-(羟基)-4,5,6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-5(4H)-基]-1-环丙基-2-(2-氟苯基)乙酮、2-[2-(甲氧基)-4,5,6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-5(4H)-基]-1-环丙基-2-(2-氟苯基)乙酮或2-环丙酰氧基-2-(2-氟苯基)-2-(4,5,6,7-四氢噻吩[3,2-c]并吡啶-5-基)乙酸甲酯。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物采用口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或经皮给药剂型。

7.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物采用片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、贴剂或凝胶剂形式。