CN105051025A - 噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化学领域。具体来说，本发明涉及噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物以及它们作为用于治疗、改善和预防心血管疾病的治疗剂的用途。

Description

噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物及其用途
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明根据由国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)颁发的AA020090和CA016954在政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明属于药物化学领域。具体来说，本发明涉及噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物(mixeddisulfideconjugate)以及它们作为用于治疗、改善和预防心血管疾病的治疗剂的用途。
引言
噻吩并吡啶基化合物广泛用作用以预防心脏病发作和中风的抗血小板剂。在这个类别中，氯吡格雷(clopidogrel)(波立维(Plavix))、噻氯匹定(ticlopidine)(抵克立得(Ticlid))和普拉格雷(prasugrel)(伊芬特(Effient))是三种通常使用的前药。这些药剂要求多态性细胞色素(P450)介导的氧化性生物活化。所述氧化性生物活化导致缓慢开始治疗作用和若干不利作用，包括嗜中性白细胞减少症和血栓性血小板减少性紫癜。
需要不要求多态性细胞色素(P450)介导的氧化性生物活化的改进抗血小板剂。
发明概述
氯吡格雷(波立维)、噻氯匹定(抵克立得)和普拉格雷(伊芬特)属于一类广泛用作用以预防心脏病发作和中风的抗血小板剂的噻吩并吡啶基化合物。然而，若干严重缺点已与这些药物相关联，包括缺乏反应、毒性和过度出血。这些缺点与它们都是要求由多态性细胞色素P450酶(P450)进行氧化性生物活化的前药的事实密切相关。
为克服与噻吩并吡啶化合物(氯吡格雷(波立维)、噻氯匹定(抵克立得)和普拉格雷(伊芬特))相关的缺点，开发了噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。实际上，在开发本发明的实施方案的过程期间进行的实验证明本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物能够在内源性谷胱甘肽(GSH)存在下产生活性噻吩并吡啶代谢物(例如能够具有抗血小板活性的活性噻吩并吡啶代谢物)而不需要由P450进行生物活化。这个方法不仅绕过由P450达成的氧化性生物活化过程，而且规避与噻吩并吡啶基药物相关的许多缺点。举例来说，因为自缀合物产生活性代谢物是可预测的，所以本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物使给药一致性改进。此外，使用本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物作为抗血小板剂使毒性降低，因为不通过巯基交换反应产生毒性反应性代谢物。此外，本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的治疗起效时间缩短，此使经历急性心血管事件的患者极大受益。举例来说，噻吩并吡啶的标准方案要求对患者连续给药3-5天，因为仅较小百分比的摄取噻吩并吡啶被转化成活性代谢物。相比之下，本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物在少于30min内以高产率释放活性代谢物。此外，本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物具有超过活性代谢物的优越稳定性，并且因此它们可用于定量产生活性代谢物以供在体外进行基础和临床研究。
因此，在某些实施方案中，本发明提供噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物，其能够克服与广泛用作抗血小板剂的噻吩并吡啶基化合物(例如氯吡格雷(波立维)、噻氯匹定(抵克立得)和普拉格雷(伊芬特))相关的所述缺点。本发明不限于噻吩并吡啶化合物的特定混合二硫键缀合物。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物被描述为式I：包括其药学上可接受的盐、溶剂合物和/或前药；其中R1、R2和R3独立地包括使得所得化合物能够在与内源性谷胱甘肽(GSH)相互作用后产生活性噻吩并吡啶代谢物(例如能够具有抗血小板活性的活性噻吩并吡啶代谢物)的任何化学部分。
在某一实施方案中，R1选自由以下组成的组：H、-CO-OCH3和
在一些实施方案中，R3是氯或氟。
在一些实施方案中，R2选自由以下组成的组：
在某些实施方案中，本发明提供包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。
在某些实施方案中，本发明提供经配制以供静脉内(IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物。在一些实施方案中，所述经配制以供静脉内(IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物用于治疗、改善和预防动脉粥样硬化血栓形成。在一些实施方案中，所述经配制以供静脉内(IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物用于快速抑制血小板聚集。在一些实施方案中，所述经配制以供静脉内(IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物在经皮冠脉干预程序(例如冠脉血管成形术)期间用于快速抑制血小板聚集。
在某些实施方案中，本发明提供治疗、改善或预防心血管疾病的方法，其包括向患者施用治疗有效量的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。在一些实施方案中，所述施用是静脉内施用。在一些实施方案中，心血管疾病选自由以下组成的组：冠状动脉疾病、外周血管疾病和脑血管疾病。在一些实施方案中，化合物使血小板聚集降低(例如通过不可逆结合P2Y12受体)(例如通过阻断ADP受体)。在一些实施方案中，化合物能够在内源性谷胱甘肽存在下产生活性噻吩并吡啶代谢物而不需要由P450进行生物活化。在一些实施方案中，所述方法进一步包括共同施用至少一种选自由以下组成的组的物质：HMG-CoA还原酶抑制剂、ACE抑制剂、钙通道阻断剂、血小板聚集抑制剂、多不饱和脂肪酸、纤维酸(FibricAcid)衍生物、胆汁酸螯合剂、抗氧化剂和抗心绞痛剂。
在某些实施方案中，本发明提供治疗、改善或预防患者的血小板于血管上聚集的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。在一些实施方案中，所述施用是静脉内施用。在一些实施方案中，所述患者具有发生心血管疾病(例如冠状动脉疾病、外周血管疾病和脑血管疾病)的风险或处于所述风险下。在一些实施方案中，治疗、改善或预防血小板聚集是通过不可逆结合P2Y12受体而发生。在一些实施方案中，治疗、改善或预防血小板聚集是通过阻断ADP受体而发生。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物能够在内源性谷胱甘肽存在下产生活性噻吩并吡啶代谢物而不需要由P450进行生物活化。
附图简述
图1显示硫醇还原剂对形成氯吡格雷的活性代谢物(AM)的影响。在0.1ml50mMKP缓冲液(pH7.4)中产生AM，所述缓冲液含有0.2mg/mlHLM、0.1mM2-氧代氯吡格雷、NADPH再生系统和硫醇还原剂。除各自是0.3mM的CPT、DFT和NPT之外，硫醇还原剂的浓度是1mM。通过添加5单位G6PD来引发反应，并且在37℃下孵育20min。接着如材料和方法中所述，以MP衍生物形式定量活性代谢物。报道的速率是对三个单独测量结果的平均。硫醇化合物的缩写提供于表1中。
图2显示氯吡格雷的代表性混合二硫键缀合物的提取离子色谱图(EIC)。在37℃下持续30min在0.2ml50mMKPi缓冲液(pH7.4)中产生混合二硫键缀合物，所述缓冲液含有1mg/mlHLM、0.1mM2-氧代氯吡格雷、各种硫醇还原剂和NADPH再生系统。如材料和方法中所述进行MS分析。(A)，在m/z432.06下的BME缀合物的EIC；(B)在m/z482.08下的DFT缀合物的EIC；(C)在m/z499.99下的CPT缀合物的EIC；(D)在m/z510.08下的NPT缀合物的EIC。
图3显示由HLM产生的AM和氯吡格雷的硫醇缀合物的相对量。在0.2ml50mMKP(pH7.4)中产生AM和缀合物，如图2中所述。对于这些分析，将50皮摩尔(S)-氯吡格雷外加至各样本中作为IS。如材料和方法中所述，使用LC-MS/MS以依赖性扫描模式分析AM与硫醇缀合物两者。图例：空心棒条，m/z356(AM)与m/z322(IS)的AUC比率；实心棒条，相应缀合物与IS的AUC比率。
图4显示CPT的混合二硫键缀合物的MS和MS2光谱。如图2中所述产生缀合物。如材料和方法中所述，使用LC-MS/MS以依赖性扫描模式获得MS和MS2光谱。(A)CPT缀合物的MS光谱；(B)CPT缀合物的母离子m/z499.99的MS2光谱；(C)，CPT缀合物的母离子m/z501.94的MS2光谱；(D)，对图4B中所示的碎裂样式的指定。
图5显示由GSH还原氯吡格雷的混合二硫键缀合物的动力学。自含有1mg/mlHLM、0.1mM2-氧代氯吡格雷、NADPH再生系统和各种硫醇还原剂的反应混合物制备混合二硫键缀合物，并且使用SPEC18柱进行纯化，如材料和方法中所述。接着混合纯化的缀合物与1mMGSH和0.2mg/ml胞质溶胶(当存在时)。使用LC-MS/MS分析剩余的缀合物和形成的AM。图例：(A)在0.2mg/ml胞质溶胶存在下由1mMGSH还原BME(○)、CPT(■)、NAC()、DFT(▲)和NPT(□)的缀合物。(B)在存在和不存在0.2mg/ml胞质溶胶下由1mMGSH还原CPT缀合物。图例：(○)，在不存在胞质溶胶下的AM形成；(△)，在存在胞质溶胶下的AM形成；(●)，在不存在胞质溶胶下的缀合物还原；(▲)，在存在胞质溶胶下的缀合物还原。实线和虚线是相对于单一指数函数的非线性曲线拟合。
图6显示观察的在m/z504下的提取离子色谱图，其显示自氯吡格雷的混合二硫键缀合物形成活性代谢物H4。在HLM中产生混合二硫键缀合物，并且用SPE柱纯化，如图3中所述。在MS分析之前，混合二硫键缀合物用DTT处理以释放AM，其接着随后用MPB衍生。如材料和方法中所述，使用LC-MS/MS分析AM-MP衍生物。图例：A，反式-氯吡格雷-MP(虚线)和顺式-氯吡格雷-MP(实线)标准物；B，在1mMGSH(虚线)和1mM抗坏血酸(实线)存在下获得的AM-MP；C，由CPT缀合物获得的AM-MP；D，由NPT缀合物获得的AM-MP；E，由DFT缀合物获得的AM-MP。幅值被乘以2。
图7显示由氯吡格雷的混合二硫键缀合物抑制血小板聚集。在0.3mMCPT和NPT存在下，自反应混合物制备并纯化混合二硫键缀合物，连同三个对照样本含有1mMGSH、不含有硫醇还原剂或不含有G6PD。将所有样本都再混悬于0.5mlPPP中，其中一些用1mMGSH处理以释放AM。通过添加10μMADP来引发血小板聚集，并且用聚集计进行记录。相对于PRP的聚集百分比使聚集百分比标准化，并且对四个单独测量结果取平均值。关于细节参见材料和方法。图例：PRP，未处理的富含血小板血浆；GSH，含1mMGSH的PRP；-G6PD，在不存在G6PD下产生的代谢物；-SH，在不存在任何硫醇还原剂下产生的代谢物；GSH，在存在1mMGSH下产生的代谢物；CPT，在存在0.3mMCPT下产生的代谢物；CPT+GSH，在存在0.3mMCPT下产生，接着用1mMGSH处理的代谢物；NPT，在存在0.3mMNPT下产生的代谢物；NPT+GSH，在存在0.3mMNPT下产生，接着用1mMGSH处理的代谢物。
图8呈现如实施例X中所述，在重构系统中生物合成的纯(S)-clopNPT的总离子色谱图。在7.9、8.6和9.5min洗脱(S)-clopNPT的三种非对映异构体。
图9呈现如实施例X中所述，雄性NZ白兔在静脉内注射(S)-clopNPT之后的血小板活性。
定义
如本文所用的术语“噻吩并吡啶化合物”是指因其抗血小板活性而被使用的一类ADP受体/P2Y12抑制剂。实例包括但不限于氯吡格雷(波立维)、噻氯匹定(抵克立得)和普拉格雷(伊芬特)。
如本文所用的术语“噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物”是指能够在与内源性谷胱甘肽(GSH)相互作用后产生活性噻吩并吡啶代谢物的改性噻吩并吡啶化合物。
如本文所用的术语“前药”是指母体“药物”分子的药理学无活性衍生物，其要求在目标生理系统内进行生物转化(例如自发或酶促生物转化)以释放活性药物或使前药转化(例如以酶促方式、以生理方式、以机械方式、以电磁方式)成活性药物。前药被设计来克服与稳定性、水溶性、毒性、缺乏特异性或生物利用度有限相关的问题。示例性前药包含活性药物分子自身和化学掩蔽基团(例如可逆遏制所述药物的活性的基团)。一些前药是化合物的具有在代谢条件下可裂解的基团的变化形式或衍生物。前药可使用本领域中已知的方法易于自母体化合物来制备，所述方法如以下中所述的那些：ATextbookofDrugDesignandDevelopment，Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard(编)，Gordon&Breach，1991，具体是第5章：″DesignandApplicationsofProdrugs″；DesignofProdrugs，H.Bundgaard(编)，Elsevier，1985；Prodrugs：TopicalandOcularDrugDelivery，K.B.Sloan(编)，MarcelDekker，1998；MethodsinEnzymology，K.Widder等(编)，第42卷，AcademicPress，1985，具体是第309-396页；Burger′sMedicinalChemistryandDrugDiscovery，第5版，M.Wolff(编)，JohnWiley&Sons，1995，具体是第1卷以及第172-178页和第949-982页；Pro-DrugsasNovelDeliverySystems，T.Higuchi和V.Stella(编)，Am.Chem.Soc.，1975；以及BioreversibleCarriersinDrugDesign，E.B.Roche(编)，Elsevier，1987。
示例性前药在它们于生理条件下经受溶剂分解或经受酶促降解或其它生物化学转化(例如磷酸化、氢化、脱氢、糖基化)时变得在体内或在体外具有药学活性。前药常提供在哺乳动物生物体中具有水溶性、组织相容性或延迟释放的优势。(参见例如Bundgard，DesignofProdrugs，第7-9、21-24页，Elsevier，Amsterdam(1985)；以及Silverman，TheOrganicChemistryofDrugDesignandDrugAction，第352-401页，AcademicPress，SanDiego，CA(1992))。常见前药包括酸衍生物，如通过母体酸与适合醇(例如低级烷醇)反应来制备的酯或通过母体醇与适合羧酸(例如氨基酸)反应来制备的酯；通过母体酸化合物与胺反应来制备的酰胺；经碱性基团反应而形成的酰化碱衍生物(例如低级烷基酰胺)；或含磷衍生物，例如磷酸酯、膦酸酯和氨基磷酸酯，包括环状磷酸酯、膦酸酯和氨基磷酸酯(参见例如美国专利申请公布号US2007/0249564A1)。
如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的在目标动物(例如哺乳动物)中在生理上耐受的任何盐(例如通过与酸或碱反应获得)。本发明化合物的盐可衍生自无机或有机酸和碱。酸的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、丁二酸、甲苯对磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其它酸(如草酸)尽管本身不是药学上可接受的，但其可用于制备在获得本发明化合物及其药学上可接受的酸加成盐时适用作中间体的盐。
碱的实例包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和其中W是C1-4烷基的式NW4 +的化合物等。
盐的实例包括但不限于乙盐酸、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、反丁烯二酸盐、果糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、顺丁烯二酸盐、甲磺酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐等。盐的其它实例包括本发明化合物的阴离子与如Na+、NH4 +和NW4 +(其中W是C1-4烷基)等的适合阳离子的化合物。对于治疗用途，预期本发明化合物的盐是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可适用于例如制备或纯化药学上可接受的化合物。
如本文所用的术语“溶剂合物”是指本发明化合物与一个或多个有机或无机溶剂分子的物理缔合。这种物理缔合常包括氢键结。在某些情况下，溶剂合物能够分离，例如当一个或多个溶合分子被并入结晶固体的晶格中时。“溶剂合物”涵盖溶液相溶剂合物与可分离溶剂合物两者。示例性溶剂合物包括水合物、乙醇合物和甲醇合物。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指治疗剂足以达成病症的一种或多种症状改善，或防止病症进展，或使病症消退的那个量。举例来说，就治疗和/或预防血小板于血管上聚集而言，在一个实施方案中，治疗有效量将指治疗剂(例如噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物)使血小板聚集减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％而达成降低和/或防止的量。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的媒介物”涵盖任何标准药物载体、溶剂、表面活性剂或媒介物。适合药学上可接受的媒介物包括水性媒介物和非水性媒介物。标准药物载体和它们的制剂描述于Remington′sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCo.，Easton，PA，第19版，1995中。
发明详述
噻吩并吡啶基抗血小板剂包括三种临床使用药物，即氯吡格雷(波立维)、噻氯匹定(抵克立得)和普拉格雷(伊芬特)。氯吡格雷(波立维)、噻氯匹定(抵克立得)和普拉格雷(伊芬特)的化学结构和IUPAC名称如下：(噻氯匹定；5-(2-氯苯甲基)-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2c]吡啶)，(氯吡格雷；(+)-(S)-2-(2-氯苯基)-2-(6，7-二氢噻吩并[3，2-c]吡啶-5(4H)-基)乙酸甲酯)，以及(普拉格雷；(RS)-乙酸5-[2-环丙基-1-(2-氟苯基)-2-氧代乙基]-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基酯)。
噻吩并吡啶基抗血小板剂广泛用于治疗患有急性心血管综合征和外周血管疾病的患者，特别是经受经皮冠脉干预(例如冠脉血管成形术)的那些，以预防心脏病发作和中风。在美国，每年接近200万名患者接受冠脉和颈动脉支架，并且2010年单独波立维的年销售额价值65亿美元。
尽管广泛使用，但氯吡格雷在它的功效方面已显示出明显的个体间可变性(参见例如FreedmanJE和HylekEM(2009)NewEnglJMed360(4)：411-413；GurbelPA和TantryUS(2007)ThrombRes120(3)：311-321；SofiF等，(2011)PharmacogenomicsJ11(3)：199-206)。接近三分之一患者不对氯吡格雷疗法起反应(参见例如MasonPJ，JacobsAK和FreedmanJE(2005)JAmCollCardiol46(6)：986-993)。已进行试图鉴定与缺乏反应相关联的遗传标记，目的在于克服该个体间可变性的许多研究。已显示氯吡格雷在携带突变CYP2C19*2基因的患者中的有效性较小(参见例如DickRJ，DearAE和ByronKA(2011)HeartLungCirc20(10)：657-658；ShuldinerAR等，(2009)JAMA302(8)：849-857；SofiF等，(2011)PharmacogenomicsJ11(3)：199-206)。然而，CYP2C19*2突变基因仅对12％的反应变化负责(参见例如ShuldinerAR等，(2009)JAMA302(8)：849-857)。可能涉及其它因素，但尚未被鉴定。
实际上，尽管广泛用作抗血小板剂，但存在与噻吩并吡啶基抗血小板剂相关的缺点。氯吡格雷的主要短处是给药不一致。举例来说，接近三分之一患者不对氯吡格雷治疗起反应。噻氯匹定可导致在中度皮疹和腹泻症状至重度并且有时是致命性不利作用(如嗜中性白细胞减少症和骨髓发育不全)的范围内的一系列不利作用。在罕见情况下，它导致粒性白细胞缺乏症的重度特应性事件。过度出血已被与特别是在年长患者中使用普拉格雷相关联。
所述与噻吩并吡啶基抗血小板剂相关的缺点与这三种药物都是如流程1中所说明，要求由多态性细胞色素P450(P450)进行氧化性生物活化以得到活性代谢物(AM)的前药的事实密切相关。由于这个氧化性生物活化过程，由P450产生的活性代谢物的量随各患者的肝P450的基因组成而变化。此外，这些药物由P450充分代谢以产生多种代谢物，其中一些具有高度反应性和潜在毒性。已报道归因于噻氯匹定的重度特应性事件与产生反应性代谢物相关。
流程1.
如所指示，对氯吡格雷疗法的可变反应与氯吡格雷是要求由细胞色素P450(P450)进行氧化性生物活化以得到它的药理学活性代谢物(AM)的前药的事实密切相关(参见例如KazuiM等，(2010)DrugMetabDispos38(1)：92-99；SaviP等，(2000)ThrombHaemost84(5)：891-896)。文献充分记载的是P450介导的生物活化涉及两个连续氧化步骤(参见例如DansettePM，ThebaultS，BerthoG和MansuyD(2010)ChemResToxicol23(7)：1268-1274；DansettePM，RosiJ，BerthoG和MansuyD(2012)ChemResToxicol25(2)：348-356)；氯吡格雷首先被单加氧成2-氧代氯吡格雷，其转而在第二步中被氧化成AM。尽管已论证酯酶PON1负责使2-氧代氯吡格雷转化成AM(参见例如BoumanHJ等，(2011)NatMed17(1)：110-116)，但越来越多的证据支持2-氧代氯吡格雷是如流程2中所说明，通过次磺酸中间体转化成AM的想法(参见例如DansettePM，LibraireJ，BerthoG和MansuyD(2009)ChemResToxicol22(2)：369-373；DansettePM，RosiJ，BerthoG和MansuyD(2012)ChemResToxicol25(2)：348-356；DansettePM，RosiJ，DebernardiJ，BerthoG和MansuyD(2012)ChemResToxicol25(5)：1058-1065；DansettePM，ThebaultS，BerthoG和MansuyD(2010)ChemResToxicol23(7)：1268-1274)。
流程2
根据流程2，2-氧代氯吡格雷首先由P450氧化成次磺酸中间体。高度不稳定次磺酸接着由谷胱甘肽(GSH)快速还原以形成混合二硫键缀合物(RS-SG)，其随后由另一GSH分子还原以形成AM。这与GSH为在人肝微粒体(HLM)中形成AM所需的观察结果一致(参见例如KazuiM等，(2010)DrugMetabDispos38(1)：92-99)。广泛接受的是AM负责通过共价修饰血小板P2Y12受体来抑制血小板聚集(参见例如DingZ等，(2003)Blood101(10)：3908-3914；AlgaierI等，(2008)JThrombHaemost6(11)：1908-1914)。尚未测试混合二硫键缀合物RS-SG的抗血小板活性。
2-氧代氯吡格雷在N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)和L-半胱氨酸存在下代谢导致形成AM与混合二硫键缀合物两者(参见例如ZhangH，LauWC和HollenbergPF(2012)MolPharmacol82：302-309)。此外，据证明NAC和L-半胱氨酸的混合二硫键缀合物与GSH交换巯基，并且AM、AM缀合物和GSH之间的平衡由它们的氧化还原电势支配。次磺酸中间体的氧化还原电势可能较高，因为它是一种反应性氧化剂。
为克服与噻吩并吡啶化合物相关的缺点，开发了噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。在开发本发明的实施方案的过程期间进行的实验证明本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物能够在内源性谷胱甘肽(GSH)存在下产生活性代谢物而不需要由P450进行生物活化，如流程3中所说明。这个方法不仅绕过由P450达成的氧化性生物活化过程，而且规避噻吩并吡啶基药物的许多缺点。举例来说，因为自缀合物产生活性代谢物是可预测的，所以本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物使给药一致性改进。此外，使用本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物作为抗血小板剂使毒性降低，因为不通过巯基交换反应产生毒性反应性代谢物。此外，本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的治疗起效时间将缩短，此使经历急性心血管事件的患者极大受益。噻吩并吡啶的标准方案要求对患者连续给药3-5天，因为仅较小百分比的摄取噻吩并吡啶被转化成活性代谢物。相比之下，本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物可在少于30min内以高产率释放活性代谢物。此外，本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物具有超过活性代谢物的优越稳定性，并且因此它们可用于定量产生活性代谢物以在体外进行基础和临床研究。
流程3.
在流程3内，SR的实例包括但不限于(6-氯哒嗪-3-硫醇(CPT))、3-硝基吡啶-2-硫醇(NPT))、二甲基呋喃-3-硫醇(DFT))、(L-半胱氨酸(CYS))、(g-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸(GC))、(半胱氨酸-甘氨酸(CG))、(2-巯基乙醇(BME))、(半胱胺(CYA))、(N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC))和(谷胱甘肽(GSH))。
因此，本发明涉及噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物，其能够在内源性谷胱甘肽(GSH)存在下产生活性噻吩并吡啶代谢物而不需要由P450进行生物活化。本发明还涉及治疗、改善或预防患者的心血管病症，如对抗血小板剂(如氯吡格雷、噻氯匹定和普拉格雷)具有反应性的那些的方法，其包括向患者施用本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。所述病症包括但不限于冠状动脉疾病、外周血管疾病和脑血管疾病。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物用于例如通过阻断ADP受体(例如由此防止糖蛋白IIb/IIIa的允许血小板结合纤维蛋白原的构象变化)以改变血小板膜的功能来抑制血小板聚集。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物通过不可逆结合P2Y12受体来降低血小板聚集(“结块”)。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物用于经配制以供静脉内(IV)施用的药物组合物内(例如在要求静脉内施用抗血小板剂的医学情况(例如冠脉血管成形术)下)。
本发明不限于噻吩并吡啶化合物的特定混合二硫键缀合物。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物被描述为式I：包括其药学上可接受的盐、溶剂合物和/或前药。
式I的R1、R2和R3不限于特定化学部分。在一些实施方案中，R1、R2、R3各自独立地包括使得所得化合物能够在内源性谷胱甘肽(GSH)存在下产生活性噻吩并吡啶代谢物而不需要由P450进行生物活化的任何化学部分。在一些实施方案中，R1、R2、R3各自独立地包括使得所得化合物能够治疗、改善或预防患者的心血管病症(例如冠状动脉疾病、外周血管疾病和脑血管疾病)，如对抗血小板剂(如氯吡格雷、噻氯匹定和普拉格雷)具有反应性的那些的任何化学部分。在一些实施方案中，R1、R2、R3各自独立地包括使得所得化合物能够例如通过阻断ADP受体(例如由此防止糖蛋白IIb/IIIa的允许血小板结合纤维蛋白原的构象变化)以改变血小板膜的功能来抑制血小板聚集的任何化学部分。在一些实施方案中，R1、R2、R3各自独立地包括使得所得化合物能够通过不可逆结合P2Y12受体来降低血小板聚集(“结块”)的任何化学部分。
在一些实施方案中，R1是H、-CO-OCH3或
在一些实施方案中，R3是氯或氟。
在一些实施方案中，R2选自但不限于(6-氯哒嗪-3-硫醇(CPT))、3-硝基吡啶-2-硫醇(NPT))、二甲基呋喃-3-硫醇(DFT))、(L-半胱氨酸(CYS))、(g-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸(GC))、(半胱氨酸-甘氨酸(CG))、(2-巯基乙醇(BME))、(半胱胺(CYA))、(N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC))和(谷胱甘肽(GSH))。
在一些实施方案中，式I涵盖以下噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物：
在一些实施方案中，式I涵盖以下噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物： 或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药。
在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物用于治疗、改善或预防动物(例如哺乳动物患者，包括但不限于人和兽医学动物)的心血管病症，如对抗血小板剂(如氯吡格雷、噻氯匹定和普拉格雷)具有反应性的那些，此举包括向患者施用本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。所述病症包括但不限于冠状动脉疾病、外周血管疾病、动脉粥样硬化血栓形成和脑血管疾病。实际上，在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物用于降低血小板聚集和/或抑制血栓形成。就此而言，所述疾病和病变适于使用本发明方法和噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物进行治疗或防治。
在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物用于预防患有症状性动脉粥样硬化的患者的血管缺血性事件。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物用于治疗或预防无ST段升高的急性冠脉综合征。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物用于预防在放置冠脉内支架之后的血栓形成。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物用于例如通过阻断ADP受体(例如由此防止糖蛋白IIb/IIIa的允许血小板结合纤维蛋白原的构象变化)以改变血小板膜的功能来抑制血小板聚集。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物通过不可逆结合P2Y12受体来降低血小板聚集(“结块”)。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物用于延长出血时间。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物用于降低高风险患者的中风发生率。
在一些实施方案中，本发明提供经配制以供静脉内(IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物。在一些实施方案中，所述经配制以供静脉内(IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物用于治疗、改善和预防动脉粥样硬化血栓形成。在一些实施方案中，所述经配制以供静脉内(IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物用于快速抑制血小板聚集。在一些实施方案中，所述经配制以供静脉内(IV)施用的包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的药物组合物在经皮冠脉干预程序(例如冠脉血管成形术)期间用于快速抑制血小板聚集。实际上，抗血小板疗法是预防和治疗动脉粥样硬化血栓形成的基石。由激动因素(如斑块破裂和来自支架的剪切压应力)达成的血小板活化在动脉粥样硬化血栓形成的发展中起重要作用。在其中患者罹患急性心血管综合征或经受经皮心血管干预的某些临床情况下，需要快速并且完全抑制血小板聚集以预防心血管性死亡和缺血性并发症。所述医学方案要求静脉内施用具有短暂起效时间的抗血小板剂。然而，这仍然是未满足的医学需要，因为当前使用的抗血小板剂具有缓慢起效时间，或不能静脉内施用(参见例如Silvain，J.和Montalescot，G，(2012)Circ.Cariovasc.Interv.5：328-331)。本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物满足这个未满足的医学需要，因为所述化合物可以口服与静脉内两种方式施用，并且具有短暂起效时间。
本发明的一些实施方案提供用于施用有效量的本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物以及至少一种其它治疗剂(包括但不限于已知用以治疗、改善或预防心血管病症的治疗剂)和/或治疗技术(例如手术干预)的方法。预期许多已知用以治疗、改善或预防心血管病症的治疗剂用于本发明方法中。实际上，本发明预期但不限于施用众多已知用以治疗、改善或预防心血管病症的治疗剂。实例包括但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂(例如阿托伐他汀(Atorvastatin)(立普妥(Lipitor))普伐他汀(Pravastatin)(普伐科尔(Pravachol))、辛伐他汀(Simvastatin)(舒降之(Zocor))、瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)(可定(Crestor))、匹伐他汀(Pitavastatin)(利维乐(Livalo))、洛伐他汀(Lovastatin)(美降脂(Mevacor)、阿托可(Altocor))、氟伐他汀(Fluvastatin)(来适可(Lescol)))、ACE抑制剂(例如雷米普利(Ramipril)(阿泰斯(Altace))、喹那普利(Quinapril)(阿库普利(Accupril))、卡托普利(Captopril)(开搏通(Capoten))、依那普利(Enalapril)(泛利尿(Vasotec))、赖诺普利(Lisinopril)(捷赐瑞(Zestril)))、钙通道阻断剂(例如胺氯地平(Amlodipine)(络活喜(Norvasc))、硝苯地平(Nifedipine)(普罗卡地(Procardia))、维拉帕米(Verapamil)(卡兰(Calan))、非洛地平(Felodipine)(波依定(Plendil))、地尔硫卓(Diltiazem)(卡地赞姆(Cardizem)))、血小板聚集抑制剂(除噻氯匹定、氯吡格雷和普拉格雷以外)(例如阿昔单抗(Abciximab)(瑞奥普(ReoPro))、阿司匹林(Aspirin)、华法林(Warfarin)(可密定(Coumadin))、肝素(Heparin))、多不饱和脂肪酸(例如ω-3多不饱和脂肪酸(鱼油))、纤维酸衍生物(例如非诺贝特(Fenofibrate)(曲考(Tricor))、吉非罗齐(Gemfibrozil)(诺衡(Lopid)))、胆汁酸螯合剂(例如考来替泊(Colestipol)(考来斯替(Colestid))、消胆胺(Cholestyramine)(降胆敏(Questran)))、抗氧化剂(例如维生素E)、烟酸衍生物(例如烟酸(Niacin)(诺之平(Niaspan)))、溶栓剂(例如阿替普酶(Alteplase)(阿克伐司(Activase)))和抗心绞痛剂(例如雷诺嗪(Ranolazine)(雷里沙(Ranexa)))。
在本发明的一些实施方案中，在一种或多种以下条件下向患者施用本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物和一种或多种其它治疗剂：在不同周期下、在不同持续时间下、在不同浓度下、通过不同施用途径等。在一些实施方案中，在其它治疗剂之前，例如在施用其它治疗剂之前0.5、1、2、3、4、5、10、12或18小时、1、2、3、4、5或6天、或1、2、3或4周施用噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。在一些实施方案中，在其它治疗剂之后，例如在施用其它治疗剂之后0.5、1、2、3、4、5、10、12或18小时、1、2、3、4、5或6天、或1、2、3或4周施用噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。在一些实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物和其它治疗剂是同时，但按照不同时程施用，例如每日施用噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物，而一周一次、每两周一次、每三周一次、或每四周一次施用其它治疗剂。在其它实施方案中，一周一次施用噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物，而每日、一周一次、每两周一次、每三周一次、或每四周一次施用其它治疗剂。
在本发明的范围内的组合物包括其中以有效达成它的预定目的的量含有本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的所有组合物。尽管个体需要不同，但确定各组分的有效量的最优范围属于本领域的技能。通常，化合物可在每天每kg针对对诱导细胞凋亡具有反应性的病症加以治疗的哺乳动物的体重0.0025至50mg的剂量或其药学上可接受的盐的等效量下向例如人的哺乳动物经口服施用。在一个实施方案中，经口服施用约0.01至约25mg/kg以治疗、改善或预防所述病症。对于肌肉内注射，剂量通常是约一半口服剂量。举例来说，适合肌肉内剂量将为约0.0025至约25mg/kg或约0.01至约5mg/kg。
单位口服剂量可包含约0.01至约1000mg，例如约0.1至约100mg的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物。可每日一次或多次以一个或多个各自含有约0.1至约10mg，适宜地约0.25至50mg的化合物或它的溶剂合物的片剂或胶囊形式施用单位剂量。
在外用制剂中，化合物可以每克载体约0.01至100mg的浓度存在。在一个实施方案中，噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物以约0.07-1.0mg/ml，例如约0.1-0.5mg/ml，并且在一个实施方案中约0.4mg/ml的浓度存在。
除以原始化学物质形式施用噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物之外，本发明化合物也可作为含有有助于将化合物加工成可在药学上使用的制剂的适合药学上可接受的载体(包括赋形剂和助剂)的药物制剂的一部分施用。制剂，特别是可经口服或以外用方式施用以及可用于一种施用类型的那些制剂，如片剂、糖衣丸、缓慢释放糖锭和胶囊、口腔冲洗剂和口腔洗涤剂、凝胶剂、液体混悬液、毛发冲洗剂、毛发凝胶剂、香波以及可经直肠施用的制剂(如栓剂)以及用于通过静脉内输注、注射、以外用方式或经口服来施用的适合溶液，含有约0.01％至99％，在一个实施方案中约0.25％至75％的活性化合物以及赋形剂。
本发明的药物组合物可向可经受本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物的有益作用的任何患者施用。在所述患者之中，最主要的是哺乳动物，例如人，但本发明不意图被如此限制。其它患者包括兽医学动物(母牛、绵羊、猪、马、狗、猫等)。
化合物及其药物组合物可通过达成它们的预定目的的任何手段来施用。举例来说，所述施用可通过胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、经颊、鞘内、颅内、鼻内或外用途径来达成。或者或同时，所述施用可通过口服途径来达成。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和重量、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需作用的性质。
本发明的药物制剂是以自身已知的方式制造，例如借助于常规混合、粒化、糖衣丸制备、溶解或冻干过程。因此，供口服使用的药物制剂可通过以下方式来获得：组合活性化合物与固体赋形剂，任选研磨所得混合物，以及需要或必要时在添加适合助剂之后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。
适合赋形剂具体来说是填充剂，如糖(例如乳糖或蔗糖)、甘露糖醇或山梨糖醇、纤维素制剂和/或磷酸钙(例如磷酸三钙或磷酸氢钙)，以及粘合剂，如使用例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉的淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。需要时，可添加崩解剂，如以上提及的淀粉以及羧甲基-淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。助剂最主要是流动调控剂和润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐(如硬脂酸镁或硬脂酸钙)和/或聚乙二醇。糖衣丸核心具有适合包衣，其需要时可抵抗胃液。出于这个目的，可使用浓缩糖溶液，其可任选含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适合有机溶剂或溶剂混合物。为产生可抵抗胃液的包衣，使用如乙酰基纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基-纤维素邻苯二甲酸酯的适合纤维素制剂的溶液。染料或颜料可添加至片剂或糖衣丸包衣中，例如以识别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可经口服使用的其它药物制剂包括由明胶制得的推入-配合型胶囊以及由明胶和塑化剂(如甘油或山梨糖醇)制得的软质密封胶囊。推入-配合型胶囊可含有呈颗粒形式的活性化合物，其可与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选稳定剂混合。在软质胶囊中，在一个实施方案中，活性化合物溶解或混悬于适合液体，如脂肪油或液体石蜡中。此外，可添加稳定剂。
可经直肠使用的可能的药物制剂包括例如由一种或多种活性化合物与栓剂基质的组合组成的栓剂。适合栓剂基质是例如天然或合成甘油三酯或石蜡烃。此外，也有可能使用明胶直肠胶囊，其由活性化合物与基质的组合组成。可能的基质物质包括例如液体甘油三酯、聚乙二醇或石蜡烃。
适用于胃肠外施用的制剂包括呈水溶性形式(例如水溶性盐)的活性化合物的水溶液和碱性溶液。此外，可施用呈适当油性注射混悬液形式的活性化合物混悬液。适合亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或聚乙二醇-400。水性注射混悬液可含有增加混悬液的粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。任选地，混悬液也可含有稳定剂。
在一个实施方案中，通过选择适当载体，本发明的外用组合物被配制成油剂、乳膏剂、洗剂、软膏剂等。适合载体包括植物油或矿物油、白石蜡脂(白色软石蜡)、支链脂肪或油、动物脂肪和高分子量醇(大于C12)。载体可为活性成分于其中可溶的那些。需要时，也可包括乳化剂、稳定剂、保湿剂和抗氧化剂以及赋予颜色或香气的试剂。另外，经皮渗透增强剂可用于这些外用制剂中。所述增强剂的实例可见于美国专利号3,989,816和4,444,762中。
可通过混合活性成分于如杏仁油的植物油中的溶液与温热软石蜡，以及使混合物冷却来配制软膏剂。所述软膏剂的一典型实例是以重量计，包括约30％杏仁油和约70％白色软石蜡的软膏剂。洗剂可通过将活性成分溶解于适合高分子量醇，如丙二醇或聚乙二醇中来方便地制备。
本领域普通技术人员将易于认识到先前所述仅代表对本发明的某些优选实施方案的详细描述。上述组合物和方法的各种修改和改变可使用本领域中可用的专门技能来容易地达成，并且在本发明的范围内。
实施例
以下实施例说明而非限制本发明的化合物、组合物和方法。通常在临床疗法中遇到，并且为本领域技术人员显而易见的各种条件和参数的其它适合修改和改适在本发明的精神和范围内。
实施例I.
这个实施例描述氯吡格雷和噻氯匹定的混合二硫键缀合物的合成。
根据流程4，使用人肝微粒体(HLM)，在50mM磷酸钾缓冲液中进行氯吡格雷和噻氯匹定的混合二硫键缀合物的合成。
流程4.
在流程4内，RS(或-SR)是选自但不限于以下的含巯基试剂：(6-氯哒嗪-3-硫醇(CPT))、3-硝基吡啶-2-硫醇(NPT))、(2，5-二甲基呋喃-3-硫醇(DFT))、(L-半胱氨酸(CYS))、(g-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸(GC))、(半胱氨酸-甘氨酸(CG))、(2-巯基乙醇(BME))、(半胱胺(CYA))、(N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC))和(谷胱甘肽(GSH))。在流程4内，AM-SR代表本发明的混合二硫键缀合物。
结果显示全部十种RS化合物均形成相应缀合物。此外，使用串联质谱测定法确认反应物RS通过混合二硫键与活性代谢物形成缀合物。使用反相色谱法自反应混合物纯化缀合物。
实施例II.
这个实施例描述自混合二硫键缀合化合物产生活性代谢物。
选择缀合物Clop-CPT
[(Z)-2-(1-(2-氯苯基)-2-甲氧基-2-氧代乙基)-4-((6-氯哒嗪-3-基)二硫基)哌啶-3-亚基)乙酸]和Tic-NPT
[(Z)-2-(1-(2-氯苯甲基)-4-((3-硝基吡啶-2-基)二硫基)哌啶-3-亚基)乙酸]进行进一步研究。
接着测试混合二硫键缀合物Clop-CPT和Tic-NPT在谷胱甘肽存在下产生活性代谢物(AM)的能力。Clop-CPT由1mMGSH快速还原，其中伴有氯吡格雷的AM的量增加。自clop-CPT缀合物产生氯吡格雷的AM的半衰期仅是1.8min。对于tic-NPT缀合物同样如此，但半衰期是14.7min。
实施例III.
这个实施例描述由本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物抑制血小板聚集。
为证明本发明的噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物能够在GSH存在下抑制血小板聚集，进行血小板聚集测定。自兔抽取约20ml血液，并且通过离心来收集血小板，而收集上清液作为血小板贫瘠血浆(PPP)。在抑制测定之前，将缀合物Clop-CPT和Tic-NPT溶解于0.5mlPPP中，并且在37℃下与1mMGSH一起孵育30min以产生活性代谢物。接着将血小板温和地再混悬于含有活性代谢物的PPP中。在37℃下孵育1小时之后，通过添加5μM激动剂ADP来引发血小板聚集。接着使用聚集计记录血小板聚集。
相较于不含有缀合物的阴性对照，在1mMGSH存在下，缀合物Clop-CPT和Tic-NPT使血小板聚集抑制约60％。这个抑制水平与含有自人肝微粒体(HLM)产生的活性代谢物的阳性对照近似相同。
实施例IV.
这个实施例描述用于实施例5-9的材料和方法。
化学物质。(S)-氯吡格雷、外消旋2-氧代氯吡格雷和顺式-氯吡格雷-MP购自TorontoResearchCompany(Ontario，Canada)。谷胱甘肽(GSH)、γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸(GC)、Cys-Gly(CG)、L-半胱氨酸、β-巯基乙醇(BME)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、半胱胺(CYA)盐酸盐、2，5-二甲基呋喃-3-硫醇、6-氯哒嗪-3-硫醇、3-硝基吡啶-2-硫醇和2-溴-3’-甲氧基苯乙酮(MPB)购自Sigma-Aldrichcompany(St.Louis，MO)。汇合的HLM和胞质溶胶购自XenoTech(Lenexa，KS)。
测定在各种硫醇还原剂存在下由HLM形成AM的速率。为考查各种硫醇还原剂对形成活性代谢物(AM)的影响，测定产生AM的速率。在0.1ml50mM磷酸钾(KPi)缓冲液(pH7.4)中进行AM的产生，所述缓冲液含有0.2mg/mLHLM、0.1mM2-氧代氯吡格雷、NADPH再生系统和1mM各硫醇还原剂，不同之处在于使用0.3mMCPT、DFT或NPT。通过添加5单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)来引发反应，并且在37℃下孵育20min。接着在室温下用4mMMPB使AM衍生10min，随后用乙酸酸化成3％(v/v)。对于定量，添加50皮摩尔(S)-氯吡格雷至各反应混合物中作为内标物(IS)。使用LC-MS/MS定量衍生的AM(AM-MP)。
如先前所报道在离子阱质谱仪(LGQDecaXP，ThermoFisherScientific，Waltham，MA)上对反应混合物进行MS分析(Zhang等，2012)。简而言之，使用二元流动相在0.2ml/min的流速下，在反相C18柱(2×100mm，3μm，Phenemonex，CA)上分离2-氧代氯吡格雷的代谢物。使用柱加热器(RestekCorporationLancaster，PA)使C18柱的温度维持在40℃下。以电喷雾正离子化模式，用以下设置来操作质谱仪：加热的毛细管温度，200℃；喷雾电压，+4.5kV；鞘气流，60(任意单位)；辅助气体，20(任意单位)。在MS中通过碰撞诱导的解离(CID)在35％能量水平下使AM-MP和IS片段化。m/z504→m/z354(针对AM-MP)以及m/z322→m/z212(针对IS)的转换用于基于由顺式-氯吡格雷-MP的各种浓度组成的校正曲线来定量AM-MP的量。
使用LC-MS/MS分析氯吡格雷的混合二硫键缀合物。由HLM产生混合二硫键缀合物以进行结构分析与半定量分析两者。如上所述在0.2ml50mMKP缓冲液(pH7.4)中进行2-氧代氯吡格雷的代谢，不同之处在于使HLM的浓度增加至1mg/ml。在37℃下孵育反应物30min，接着通过添加0.1ml含10％乙酸的乙腈加以淬灭。在13,000×g下离心淬灭的样本10min以移除HLM。将50μl上清液的等分试样装载于质谱仪上以分析活性代谢物与缀合代谢物两者。
如上所述进行MS分析，不同之处在于以依赖性扫描模式操作MS检测器。自m/z300至700来扫描前体离子，而自m/z100至700来获得四种最丰富离子的MS2光谱。对于半定量分析，将50皮摩尔IS外加至已被淬灭的各样本中。将AM和相应缀合物的相对量计算为代谢物的AUC与IS的AUC的比率。
测定混合二硫键缀合物转化成AM的动力学。为考查混合二硫键缀合物的反应性，测定由GSH还原混合二硫键缀合物的动力学。在1ml50mMKPi缓冲液(pH7.4)中产生混合二硫键缀合物，所述缓冲液含有1mg/mlHLM、0.1mM2-氧代氯吡格雷和0.3或1mM硫醇还原剂。在通过添加G6PD进行引发之后，在37℃下孵育反应物50min。接着在13,000×g下离心反应混合物以移除HLM，并且将上清液装载至预调SPE柱(C18，100mg/1ml，AgilentTechnologies，CA)，并用2ml甲醇洗脱混合二硫键缀合物。接着使用Speedvac浓缩器干燥洗脱液，并且将干燥样本储存在-80℃下直至使用。在动力学测量之前，首先将干燥样本再溶解于0.5ml50mMKPi缓冲液(pH7.4)中，接着在37℃下平衡5min。分别将储备GSH和胞质溶胶(当存在时)溶液的少量等分试样(1-5μl)以1mM和0.2mg/ml添加至缀合物样本中以引发巯基-二硫键交换反应。在指定时间，取出50μl反应混合物的等分试样，并且与25μl含10％乙酸的乙腈混合以终止巯基-二硫键交换反应。制备t＝0样本后立即添加GSH。如上所述使用LC-MS/MS分析混合二硫键缀合物和AM的量。
自氯吡格雷的混合二硫键缀合物形成活性代谢物H4。因为AM的抗血小板活性与它的立体化学密切相关，所以由于在CPT、DFT或NPT存在下形成的混合二硫键缀合物的氧化还原电势相对较高而探究它们的立体化学。由于缺乏AM的立体异构体的纯正标准物，所以首先用GSH处理混合二硫键缀合物以释放AM，接着用MPB衍生AM以便比较AM-MP衍生物与顺式-氯吡格雷-MP标准物。如上所述进行缀合物的制备以及用GSH的还原。在37℃下与1mMGSH一起孵育20min之后，在4mM下添加MPB以使AM烷基化。通过添加一半体积的含10％乙酸的乙腈来在10min内终止烷基化反应。对50μl反应混合物的等分试样进行如对于AM的定量所述的LC-MS/MS分析。
氯吡格雷的混合二硫键缀合物的抗血小板活性。为产生足量混合二硫键缀合物，在2ml含有1mg/mlHLM、0.1mM2-氧代氯吡格雷、NADPH再生系统和0.3mMCPT或NPT或1mMGSH的反应混合物中进行2-氧代氯吡格雷的代谢。通过添加10单位G6PD来引发反应，并且在37℃下孵育50min。平行制备两个对照样本。一个对照样本不合有任何G6PD(-G6PD)，其被设计来考查2-氧代氯吡格雷和HLM中存在的其它组分是否有助于抗血小板活性。另一对照(-SH)不含有任何硫醇还原剂，其意图考查除AM和缀合物以外的任何代谢物是否干扰抗血小板活性测定。在孵育50min之后，在13,000×g下离心反应混合物以移除HLM。将上清液装载于SPEC18柱上以富集混合二硫键缀合物。在用水彻底洗涤以移除盐和其它水溶性代谢物之后，用2ml甲醇洗脱缀合物样本。使用Speedvac浓缩器干燥甲醇洗脱份，并且接着将干燥样本再混悬于1ml血小板贫瘠血浆(PPP)中。在抗血小板活性测定之前，将再混悬的缀合物分成两个相等体积(各自0.5ml)，其中一个用1mMGSH在37℃下处理30min以产生AM。接着将两个样本均放置在冰上直至使用。
先前报道了用于测定先体外后体内抗血小板活性的程序(参见例如AbellLM和LiuEC(2011)JPharmExpTher339(2)：589-596)。
雄性新西兰白兔(2.2-2.9kg)用作血液供体。自中心耳动脉抽取全血至含有3.7％柠檬酸钠作为抗凝剂的塑料注射器中(柠檬酸盐与血液的体积比是1∶10)。用MedonicCA620血液学分析器(ClinicalDiagnosticSolutions，Inc.，Plantation，FL，USA)测定全血细胞计数。富含血小板血浆(PRP)，即在100×g下离心全血10min之后存在的上清液，用PPP稀释以达成约300,000个/μl的血小板计数。通过在1,500×g下离心剩余血液10min并且丢弃底部细胞层来制备血小板贫瘠血浆。将稀释的PRP分成0.5ml样本，在170×g下再次离心10min，并且丢弃所得上清液。将血小板沉淀再混悬于含有如先前所述制备的各种化学抑制剂的血小板贫瘠血浆中，并且在37℃下在温和振荡下孵育60min以修饰P2Y12受体。用确定的浊度测定方法，使用4通道聚集计(BioDataPAP-4；BioDataCorp.，Horsham，PA，USA)，通过记录透射穿过维持在37℃下的PRP的搅拌混悬液的光的增加来评估先体外后体内血小板聚集。用ADP(10μM)诱导血小板聚集。亚聚集浓度的肾上腺素(550nM)在添加激动剂之前用于致敏血小板。
实施例V.
这个实施例描述硫醇还原剂对形成氯吡格雷的活性代谢物(AM)的影响。为考查硫醇还原剂的影响，测定在各种硫醇还原剂存在下形成AM的稳态速率。除CPT、DPT和NPT之外，代谢反应中存在的硫醇还原剂的浓度是1mM。作为替代，由于这三种硫醇还原剂的Km值较低，所以它们的浓度是0.3mM。如图1中所示，在除三种硫醇还原剂之外的所有硫醇还原剂存在下都形成AM。观察到在人体中的内源性还原剂GSH存在下形成AM的速率最高。具体来说，在1mMGSH存在下，在167皮摩尔AM/min/mgHLM的速率下产生AM。同样，L-半胱氨酸在产生AM方面的活性是GSH的～84％。如先前所观察(参见例如ZhangH等，(2012)MolPharmacol82：302-309)，在1mMNAC存在下仅形成低水平的AM。速率仅为在1mMGSH存在下观察的速率的～7％。在CPT、DFT和NPT存在下未观察到AM。总之，形成AM的速率按顺序GSH＞CYS＞CG＞GC＞CYA＞BME＞NAC＞CPT或DFT或NPT降低。这个广泛速率范围强调硫醇还原剂在形成AM方面的关键作用。
实施例VI.
这个实施例描述分析氯吡格雷的混合二硫键缀合物。AM的形成受存在的硫醇还原剂极大影响。在这个实验中，考查硫醇还原剂对形成混合二硫键缀合物的影响。这对于了解在CPT、DFT和NPT存在下不形成任何AM的原因特别重要。与对于AM的观察结果形成鲜明对比，在所有考查的硫醇还原剂存在下都形成混合二硫键缀合物。这些混合二硫键缀合物的母离子MH+的m/z和保留时间概述于表1中，并且四种所选混合二硫键缀合物的提取离子色谱图(EIC)呈现于图2中。观察到的母离子MH+与这些缀合物的理论值极度一致。在β-巯基乙醇(BME)存在下，观察到在m/z432下的四个自8.9至9.72min洗脱的缀合物峰(图2A)。这四个AM峰可能归因于形成氯吡格雷的多个立体异构体，如先前所报道(参见例如PereilloJM，等(2002)DrugMetabDispos30(11)：1288-1295)。观察到在CPT和NPT存在下有两个主要缀合物峰(分别图2C和4D)。然而，在DFT存在下，在15.8min时观察到一个具有m/z482的主要缀合物峰(图2B)。形成CPT、NPT和DFT缀合物的Km值被分别测定为23、51和30μM，此显著低于我们先前报道的GSH的Km300μM(参见例如ZhangH等，(2012)MolPharmacol82：302-309)。
表1.在LC-MS分析中对氯吡格雷的混合二硫键缀合物观察的母离子(MH+)和保留时间(RT)。
a，最强烈峰的保留时间；b，由分子式计算的精确质量；c，来自ZhangH等，(2012)MolPharmacol82：302-309的数据。
对缀合物的各EIC的曲线下面积(AUC)积分给出产生的混合二硫键缀合物的相对量。如图3中所示，混合二硫键缀合物的相对量彼此实质上不同。仅形成低水平的谷胱甘肽基缀合物，从而指示在GSH存在下，2-氧代氯吡格雷的代谢极大有利于形成AM。尽管在BME存在下形成AM与混合二硫键缀合物两者，但明显缀合物的形成比AM更有利。尽管不形成AM，但形成大量CPT、DFT和NPT的混合二硫键缀合物。由于缺乏这些缀合物的纯正标准物，所以不能定量这些缀合物的绝对量。应注意基于AUC比率比较缀合物的绝对量，因为这些缀合物对MS检测器的响应可能不同。
为确定这些缀合物的化学结构，获得MS和MS2光谱。所有十种缀合物的MS光谱都显示在如表1中概述的预期m/z比率下的主要MH+峰，以及一对表征在氯吡格雷中存在一个Cl原子的35Cl/37Cl同位素峰。这个的唯一例外是含有两个氯原子的CPT缀合物。它的MS和MS2光谱显示于图4中。观察到在m/z499.99下的这个缀合物，所述m/z在预期m/z值500.03的实验误差80ppm内。此外，也观察到在501.94下的强度是基峰的～75％的强烈同位素峰，从而指示在这个缀合物中存在两个氯原子。在m/z499.99下的母离子的MS2显示形成多个子离子。观察到在m/z353.99下的主要子离子，并且其它次要子离子在m/z465.90、211.93和183.34下。除存在35Cl/37Cl同位素峰之外，这个碎裂样式也与图4D中所示的具有混合二硫键的缀合物的化学结构一致。主要子离子m/z353.99被指定为在混合二硫键处裂解的较大片段，如我们先前对于GSH、NAC和L-半胱氨酸与氯吡格雷的缀合物所报道(参见例如ZhangH等，(2012)MolPharmacol82：302-309)。在m/z212和183下的子离子也表征氯吡格雷(参见例如DansettePM等，(2010)ChemResToxicol23(7)：1268-1274；PereilloJM等，(2002)DrugMetabDispos30(11)：1288-1295)。在m/z501.94下的同位素峰的MS2光谱提供这个指定的进一步证据。如图4C中所示，观察到一对子离子而非单一离子相隔两个质量单位，此支持存在两个氯原子。其余缀合物的MS2光谱就在m/z354下的特征子离子而言展现极其类似的碎裂样式。
实施例VII.
这个实施例描述由GSH还原氯吡格雷的混合二硫键缀合物的动力学。测定各种混合二硫键缀合物与GSH之间的巯基-二硫键交换反应的动力学，并且结果显示于图5中。缀合物与GSH和胞质溶胶一起孵育导致混合二硫键缀合物的量以时间依赖性方式降低(图5A)。相对于单指数函数拟合动力学数据给出BME、CPT、NAC、DFT和NPT的混合二硫键缀合物损失的一级速率常数分别是0.07、0.79、0.43、1.65和0.13min-1。因为这些动力学是在GSH过量(1mM)的假一级条件下测定，所以这些速率常数分别等效于二级速率常数1.2、13、7.2、28和2.2M-1s-1。数据也证明这些缀合物与GSH的反应性可变。DFT缀合物和CPT缀合物的反应性分别比BME缀合物大10至20倍。似乎例如甚至在孵育40min之后，仍然剩余～50％的BME缀合物，从而指示例如这个缀合物的巯基-二硫键交换已达到平衡。
为考查胞质溶胶的影响以及同时监测缀合物和AM，测定在存在和不存在胞质溶胶下AM的形成与CPT缀合物的还原两者的动力学。如图5B中所示，CPT缀合物的量的降低相伴AM的量的增加而发生，其中速率常数几乎相同。在胞质溶胶存在下，缀合物的还原以及AM的形成的速率常数分别是0.73和0.50min-1。在不存在胞质溶胶下，CPT缀合物的还原的快速性是约一半，其中缀合物的还原的速率常数是0.39min-1，并且AM的形成的速率常数是0.35min-1。这指示胞质溶胶加速巯基-二硫键交换反应的还原，如先前所观察(参见例如HagiharaK等，(2012)DrugMetabDispos40(9)：1854-1859；HagiharaK等，(2011)DrugMetabDispos39(2)：208-214)。
实施例VIII.
这个实施例描述自氯吡格雷的混合二硫键缀合物形成活性代谢物H4。如流程2中所示，活性代谢物含有两个手性中心(C7和C4)和一个双键(C3-C16)。因此，外消旋2-氧代氯吡格雷的代谢可潜在产生多达八种立体异构体。然而，在常规反相C18柱上仅可分离四种非对映异构体(以往称为H1、H2、H3和H4)，而其它四种立体异构体以对映异构体形式共同洗脱。已确定H4在人体中负责抗血小板活性，并且H4的双键呈顺式构型(参见例如PereilloJM等，(2002)DrugMetabDispos30(11)：1288-1295；SaviP等，(2000)ThrombHaemost84(5)：891-896；TuffalG等，(2011)ThrombHaemost105(4)：696-705)。为评估这些缀合物的治疗潜力，考查用混合二硫键缀合物是否形成H4，并且结果呈现于图6中。
在GSH存在下由HLM代谢2-氧代氯吡格雷致使形成四种在8至11min之间洗脱的立体异构体(虚线，图6B)。基于AM-MP衍生物在反相C18柱上的洗脱顺序(参见例如TuffalG等，(2011)ThrombHaemost105(4)：696-705)，有可能的是在10.2min洗脱的异构体是H4的顺式异构体。这与图6A中所示的顺式-氯吡格雷-MP标准物(实线)的保留时间一致。同样，DFT缀合物的MP衍生物也展现与在GSH存在下观察到的峰类似的四个峰，从而指示DFT缀合物在巯基交换反应之后产生AM的顺式异构体。相比之下，CPT和NPT缀合物的MP衍生物显示在9.4和10.2min的两个主要峰，此与选择性形成活性异构体H4一致(图6C和D)。
实施例IX.
这个实施例描述CPT和NPT的混合二硫键缀合物的抗血小板活性。作为概念验证，出于若干原因考查两种混合二硫键缀合物(即CPT和NPT缀合物)的抗血小板活性。首先，可在不形成任何AM下产生两种缀合物，此消除在抗血小板活性测定期间来自AM的任何干扰。其次，两种缀合物在相对快速速率下与GSH交换巯基，此避免AM的潜在衰退。第三，还原两种缀合物产生已知在人体中负责抗血小板活性的H4异构体。先体外后体内抗血小板活性测定的结果显示于图7中。相对于PRP的聚集百分比使聚集百分比标准化以抵消归因于环境因素(如血液来源、PRP制剂等)的任何变化。如所示，三个对照样本显示不抑制血小板聚集。第一对照显示游离GSH在1mM浓度下对血小板聚集无影响(GSH，图7)，并且第二对照显示反应混合物中存在的非代谢物组分(如2-氧代氯吡格雷和相关杂质)不抑制血小板聚集(-G6PD，图7)。已知氯吡格雷可通过非酶促氧化分解成副产物(参见例如MohanA等，(2008)JPharmBiomedAnal47(1)：183-189；FayedAS等，(2009)JPharmBiomedAnal49(2)：193-200)。这些副产物似乎对血小板聚集不具有任何抑制作用。在第三对照中，据证明在不存在任何硫醇还原剂下来自反应混合物的代谢物也对血小板聚集无影响。然而，观察到自含有GSH的反应混合物制备的样本中有～60％的血小板聚集抑制(AM，图7)。这是所预期的，因为在1mMGSH存在下，2-氧代氯吡格雷的代谢产生AM，如图1中所示。PRP与CPT和NPT缀合物一起孵育不抑制血小板聚集，从而指示缀合物本身不具有抗血小板活性(CPT和NPT，图7)。鲜明对比的是，PRP与已用1mMGSH处理的CPT和NPT缀合物一起孵育分别使血小板聚集显著抑制～50％和70％。这个抑制活性最可能由GSH自缀合物释放AM所产生。这些结果证明氯吡格雷的缀合物不具有抗血小板活性，并且也确认AM仅负责抑制血小板聚集。此外，它们证明有可能在不需要由多态性P450进行生物活化下递送AM。值得注意要指出的是在GSH、CPT+GSH和NPT+GSH样本中观察到的聚集百分比的变化最可能归因于AM浓度的变化。据估计这些样本中的AM的浓度在1-4μM的范围内。
实施例X.
这个实施例描述氯吡格雷的混合二硫键缀合物的体内抗血小板活性。通过静脉内注射测定氯吡格雷的混合二硫键缀合物在雄性新西兰(NZ)白兔中的抗血小板活性。使用以下技术来生物合成混合二硫键缀合物。
第I部分.生物合成氯吡格雷的混合二硫键缀合物
在含有重组细胞色素P4502C19(CYP2C19)和其它必需组分的重构系统中合成氯吡格雷的混合二硫键缀合物。在重构系统中，在相应硫醇化合物存在下，CYP2C19使2-氧代氯吡格雷转化成混合二硫键缀合物。流程5说明氯吡格雷与3-硝基吡啶-2-硫醇之间的称为clopNPT的混合二硫键缀合物的生物合成。
流程5.氯吡格雷的混合二硫键缀合物clopNPT的生物合成。
在一典型反应中，将50纳摩尔CYP2C19、150纳摩尔P450还原酶和250纳摩尔细胞色素b5重构于磷脂囊泡中以形成活性蛋白质复合物。分别在最终浓度0.05和0.3mM下添加2-氧代氯吡格雷和3-硝基吡啶-2-硫醇。通过添加1mMNADPH来引发clopNPT的生物合成。在37℃下孵育反应物2小时。
为纯化clopNPT，含有clopNPT的反应混合物首先经截断值是10kDa的膜过滤以移除所有蛋白质组分。接着在固相提取(SPE)柱上富集含有clopNPT的滤液。用80％甲醇/20％水自SPE柱洗脱ClopNPT。在50℃下在真空下将洗脱液浓缩至～5ml。将浓缩混合物装载于制备型反相C18柱上，并且使用高压液相色谱法(HPLC)纯化ClopNPT。在3ml/min的流速下用由42％甲醇/35％乙腈/22.9％水/0.1％甲酸组成的等度流动相自制备型C18柱洗脱ClopNPT。汇合含有clopNPT的HPLC洗脱份，并且在真空下干燥。最终产率是～25％。用液相色谱法-串联质谱测定法(LC-MS/MS)估计的clopNPT的纯度＞90％，如图8中所示。
第II部分.氯吡格雷的混合二硫键缀合物的抗血小板活性
使用雄性NZ白兔(1.2-1.25kg)测定氯吡格雷的混合二硫键缀合物的抗血小板活性。
为制备静脉内溶液，在0.7mg/ml下将(S)-clopNPT溶解于5、15和80(v/v)比率的N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、聚乙二醇(PEG)400和盐水的混合物中。使用两种不同方法在2mg/kg的(S)-clopNPT下对雄性NZ白兔给药。在方法1中，首先混合静脉内溶液与5mM谷胱甘肽。在37℃下孵育15min以活化(S)-clopNPT之后，通过颈静脉将混合物静脉内注射至兔中。在方法2中，雄性NZ白兔每日一次持续三天用5mlReadisorb谷胱甘肽溶液喂食以增加细胞谷胱甘肽浓度。在第三天，将溶解于DMA/PEG400/盐水中的(S)-clopNPT静脉内注射至Readisorb处理的兔中。作为阴性对照，也在2mg/kg下用(S)-氯吡格雷向雄性NZ白兔静脉内给药。在用(S)-clopNPT给药之前以及在用(S)-clopNPT给药之后1和2小时，自颈动脉抽取全血至含有3.7％柠檬酸钠作为抗凝剂的塑料注射器中(柠檬酸盐与血液的体积比是1∶10)。用MedonicCA620血液学分析器(ClinicalDiagnosticSolutions，Inc.，Plantation，FL，USA)测定全血细胞计数。富含血小板血浆(PRP)，即在100×g下离心全血10min之后存在的上清液，用血小板贫瘠血浆(PPP)稀释以达成约300,000个/μl的血小板计数。通过在1,500×g下离心剩余血液10min，并且丢弃底部细胞层来制备血小板贫瘠血浆。将稀释的PRP分成0.5ml样本，在170×g下再次离心10min，并且丢弃所得上清液。用确定的浊度测定方法，使用4通道聚集计(BioDataPAP-4；BioDataCorp.，Horsham，PA，USA)，通过记录透射穿过维持在37℃下的PRP的搅拌混悬液的光的增加来评估血小板聚集。用ADP(10μM)诱导血小板聚集。亚聚集浓度的肾上腺素(550nM)在添加激动剂之前用于致敏血小板。
结果呈现于图9中。如所示，在2mg/kg的剂量下，(S)-氯吡格雷不抑制血小板聚集。然而，(S)-clopNPT强烈抑制血小板聚集，因为超过50％的血小板聚集受(S)-clopNPT抑制，无论(S)-clopNPT用谷胱甘肽或Readisorb谷胱甘肽配料。这些结果证明(S)-clopNPT缀合物可由外来谷胱甘肽或内源性谷胱甘肽活化。明显的是内源性谷胱甘肽在活化(S)-clopNPT方面更有效，因为Readisorb处理的兔的血小板活性在静脉内注射1小时内被抑制了～70％。众多研究已显示谷胱甘肽在心脏病和中风、抗氧化应激、老化等方面的有益作用。共同施用谷胱甘肽和氯吡格雷的混合二硫键缀合物可能不仅提供(S)-clopNPT作为抗血小板剂的益处，而且也提供与单独使用谷胱甘肽相关的益处。
这些结果证明氯吡格雷的混合二硫键缀合物是比氯吡格雷更有效的抗血小板剂。
现已充分描述本发明，本领域技术人员应了解本发明可在广泛以及等效条件、制剂和其它参数范围内进行而不影响本发明或其任何实施方案的范围。本文引用的所有专利、专利申请和公布都以引用的方式整体完全并入本文。
以引用的方式并入
本文提及的专利文件和科学文章各自的整个公开内容出于所有目的以引用的方式并入本文。
等效物
本发明可以其它特定形式体现而不脱离其精神或主要特征。因此，前述实施方案在所有方面都应被视为说明而非限制本文所述的本发明。因此，本发明的范围由随附权利要求而非由先前描述所指示，并且落入权利要求的等效含义和范围内的所有变化都意图包括在其中。

Claims (26)

1.一种具有式I的化合物：
式I：包括其药学上可接受的盐、溶剂合物和/或前药；其中R1、R2和R3独立地包括使得所得化合物能够在与内源性谷胱甘肽(GSH)相互作用后产生活性噻吩并吡啶代谢物的任何化学部分。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1选自由以下组成的组：H、-CO-OCH3和
3.如权利要求1所述的化合物，其中R3是氯或氟。
4.如权利要求1所述的化合物，其中R2选自由以下组成的组：
5.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的组：
6.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的组：
7.一种药物组合物，其包含如权利要求1-6中任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述药物组合物经配制以供静脉内施用。
9.一种治疗、改善或预防患者的心血管疾病的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述施用选自由以下组成的组：口服施用和静脉内施用。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述心血管疾病选自由以下组成的组：冠状动脉疾病、外周血管疾病、动脉粥样硬化血栓形成和脑血管疾病。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述化合物降低血小板的聚集。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述降低所述血小板的聚集是通过不可逆结合P2Y12受体而发生。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述降低所述血小板的聚集是通过阻断ADP受体而发生。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述化合物能够在内源性谷胱甘肽存在下产生活性噻吩并吡啶代谢物而不需要由P450进行生物活化。
16.如权利要求9所述的方法，其进一步包括共同施用至少一种选自由以下组成的组的物质：HMG-CoA还原酶抑制剂、ACE抑制剂、钙通道阻断剂、血小板聚集抑制剂、多不饱和脂肪酸、纤维酸衍生物、胆汁酸螯合剂、抗氧化剂、溶栓剂和抗心绞痛剂。
17.一种治疗、改善或预防患者的血小板于血管上聚集的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述施用选自由以下组成的组：口服施用和静脉内施用。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述治疗、改善或预防所述血小板的所述聚集是通过不可逆结合P2Y12受体而发生。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述治疗、改善或预防所述血小板的所述聚集是通过阻断ADP受体而发生。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述化合物能够在内源性谷胱甘肽存在下产生活性噻吩并吡啶代谢物而不需要由P450进行生物活化。
22.如权利要求18所述的方法，其进一步包括共同施用至少一种选自由以下组成的组的物质：HMG-CoA还原酶抑制剂、ACE抑制剂、钙通道阻断剂、血小板聚集抑制剂、多不饱和脂肪酸、纤维酸衍生物、胆汁酸螯合剂、抗氧化剂、溶栓剂和抗心绞痛剂。
23.一种药物组合物，其包含噻吩并吡啶化合物的混合二硫键缀合物，治疗有效量的如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中所述药物组合物经配制以供静脉内施用。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述药物组合物在治疗、改善和预防动脉粥样硬化血栓形成时向患者静脉内施用。
25.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述药物组合物在经皮冠脉干预程序期间向患者静脉内施用。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述经皮冠脉干预程序是冠脉血管成形术。
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