WO2026018909A1 - 遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞 - Google Patents

遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞

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WO2026018909A1
WO2026018909A1 PCT/JP2025/025663 JP2025025663W WO2026018909A1 WO 2026018909 A1 WO2026018909 A1 WO 2026018909A1 JP 2025025663 W JP2025025663 W JP 2025025663W WO 2026018909 A1 WO2026018909 A1 WO 2026018909A1
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WO
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vertebrate cell
cell
antibody
gene
activator
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PCT/JP2025/025663
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English (en)
French (fr)
Inventor
健太 小村
結香 宮原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a recombinant polypeptide in a vertebrate cell, a genetically engineered vertebrate cell and a method for producing the same, and a method for increasing the productivity of a recombinant polypeptide by a vertebrate cell.
  • Biopharmaceuticals are produced using vertebrate cells, such as mammalian cells.
  • Biopharmaceuticals include antibodies, antibody fragments, ADCs (antibody-drug conjugates), nanobodies, Fc fusion proteins, growth factors, hormones, cytokines, enzymes, and other therapeutic polypeptides.
  • Polypeptides which are active ingredients in biopharmaceuticals, can be produced by expressing them as recombinant polypeptides in mammalian cells. Considering the production costs of recombinant polypeptides, there is a demand for improved production efficiency in production methods. Methods using genetically engineered cell lines for the expression of recombinant polypeptides have been reported (Patent Documents 2 to 5).
  • Non-Patent Document 1 the use of EDC3 in constructing a cell-free protein synthesis system using yeast or the like has been reported. Furthermore, other studies on the involvement of EDC3 in polypeptide expression have been reported (Non-Patent Documents 1 to 4).
  • a vertebrate cell for use in producing a recombinant polypeptide A genetically engineered vertebrate cell that has been modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene.
  • a vertebrate cell according to [1-1] in which functional expression of the mRNA decapping activator gene is reduced or eliminated by gene knockout, gene modification, gene deletion, gene silencing, or a combination thereof.
  • [1-19] The vertebrate cell according to any one of [1-1] to [1-18], wherein the recombinant polypeptide is selected from the group consisting of glycoproteins, antibodies, IgG antibodies, IgG1 antibodies, peptides, Fc fusion proteins, Fab fragments, protein complexes, peptidases, signal peptides, nanobodies, growth factors, hormones, cytokines, blood factors, and enzymes.
  • the recombinant polypeptide is an antibody, an IgG antibody, an IgG1 antibody, or a bispecific antibody.
  • a vertebrate cell according to any one of [1-1] to [1-20] which contains at least one heterologous polynucleotide encoding a selectable marker or a reporter polypeptide.
  • the vertebrate cell is a CHO cell, and contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, wherein the at least one modification causes a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene;
  • the recombinant polypeptide is an IgG antibody, and the mRNA decapping activator is EDC3;
  • a vertebrate cell according to any one of [1-1] to [1-12] and [1-14] to [1-26].
  • a genetically engineered vertebrate cell for use in producing a recombinant polypeptide wherein the cell has been modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene, the vertebrate cell is a CHO cell and contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, the at least one modification causing a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene;
  • a vertebrate cell, wherein the recombinant polypeptide is an IgG antibody, and the mRNA decapping activator is EDC3.
  • [2-1] A method for increasing the productivity of a recombinant polypeptide in a vertebrate cell, comprising: preparing a recombinant vertebrate cell that has been modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene in the vertebrate cell; A method which results in increased recombinant polypeptide productivity when cultured under the same conditions as compared to a vertebrate cell having the same genotype except for said modification.
  • [2-2] The method according to [2-1], wherein the functional expression of the mRNA decapping activator gene is reduced or eliminated by gene knockout, gene modification, gene deletion, gene silencing, or a combination thereof.
  • [2-3] The method according to [2-1] or [2-2], wherein functional expression of the mRNA decapping activator gene is eliminated by heterozygous knockout or homozygous knockout.
  • [2-4] The method according to any one of [2-1] to [2-3], which comprises introducing at least one heterologous polynucleotide encoding a recombinant polypeptide into the vertebrate cell.
  • [2-5] The method according to any one of [2-1] to [2-4], wherein the genome of the vertebrate cell is modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene.
  • [2-6] The method according to any one of [2-1] to [2-5], wherein the vertebrate cell contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene.
  • [2-7] The method according to [2-6], wherein the at least one modification is a modification that causes a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene.
  • [2-8] A method according to any one of [2-1] to [2-7], wherein the amino acid sequence of the modified endogenous mRNA decapping activator has at least 90% identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 as the mRNA decapping activator reference protein.
  • [2-9] The method according to any one of [2-1] to [2-8], wherein the mRNA decapping activator is PAT1, SCD6, EDC3, or DHH1.
  • [2-10] The method according to any one of [2-1] to [2-9], wherein the mRNA decapping activator is EDC3.
  • [2-11] The method according to any one of [2-1] to [2-10], wherein the vertebrate cells are mammalian cells.
  • [2-12] The method according to any one of [2-1] to [2-11], wherein the vertebrate cells are human cells.
  • [2-13] The method according to any one of [2-1] to [2-11], wherein the vertebrate cells are rodent cells.
  • [2-14] The method according to any one of [2-1] to [2-11] and [2-13], wherein the vertebrate cells are hamster cells.
  • [2-15] The method according to any one of [2-1] to [2-11], [2-13] and [2-14], wherein the vertebrate cell is a CHO cell.
  • [2-16] The method according to any one of [2-1] to [2-15], wherein the vertebrate cells are mammalian cells provided as cell clones or cell lines.
  • [2-17] The method according to any one of [2-1] to [2-16], wherein the recombinant polypeptide is a polypeptide used in therapy or diagnosis.
  • polypeptide selected from the group consisting of glycoproteins, antibodies, IgG antibodies, IgG1 antibodies, peptides, Fc fusion proteins, Fab fragments, protein complexes, peptidases, signal peptides, nanobodies, growth factors, hormones, cytokines, blood factors, and enzymes.
  • [2-24] The method according to [2-22] or [2-23], wherein the increase in productivity of the recombinant polypeptide is at least a 10% increase in the titer of the recombinant polypeptide in a culture medium of vertebrate cells in which functional expression of the mRNA decapping activator gene has been reduced or eliminated, compared to the titer of the recombinant polypeptide in a culture medium of vertebrate cells having the same genotype except for the modification, cultured under the same conditions.
  • [2-25] The method according to any one of [2-1] to [2-24], wherein the vertebrate cell does not express a detectable level of an mRNA decapping activator.
  • the vertebrate cell is a CHO cell, and contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, wherein the at least one modification causes a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene;
  • the recombinant polypeptide is an IgG antibody, and the mRNA decapping activator is EDC3;
  • the method according to any one of [2-1] to [2-11] and [2-13] to [2-27].
  • a method for increasing the productivity of a recombinant polypeptide in a vertebrate cell comprising: preparing a recombinant vertebrate cell that has been modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene in the vertebrate cell; increased productivity of the recombinant polypeptide when cultured under the same conditions compared to vertebrate cells having the same genotype except for said modification, cultured under the same conditions; the vertebrate cell is a CHO cell and contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, the at least one modification causing a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene;
  • the method, wherein the recombinant polypeptide is an IgG antibody, and the mRNA decapping activator is EDC3.
  • a method for producing a vertebrate cell comprising: preparing a recombinant vertebrate cell modified so that functional expression of the mRNA decapping activator gene is reduced or eliminated in the vertebrate cell; and introducing a polynucleotide encoding a recombinant polypeptide into the vertebrate cell, wherein the recombinant polypeptide is expressed in the vertebrate cell, the vertebrate cell is a genetically engineered vertebrate cell that has been modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene for use in the production of a recombinant polypeptide; the vertebrate cell is a CHO cell and contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, the at least one modification causing a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene;
  • the method, wherein the recombinant polypeptide is an IgG antibody
  • a method for producing a recombinant polypeptide comprising: (a) culturing the vertebrate cell according to any one of [1-1] to [1-29] under conditions that allow expression and secretion of the recombinant polypeptide into a cell culture medium; and (b) isolating the recombinant polypeptide from the cell culture medium.
  • a method comprising:
  • [5-1] A method for increasing the titer of an antibody obtained in a medium by CHO cell culture, comprising: preparing recombinant CHO cells modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene; The method, wherein the antibody titer in the culture medium of the CHO cells is increased compared to when cultured under the same conditions using CHO cells having the same genotype except for the modification.
  • [5-2] The method according to [5-1], wherein the functional expression of the mRNA decapping activator gene is reduced or eliminated by gene knockout, gene modification, gene deletion, gene silencing, or a combination thereof.
  • [5-3] The method according to [5-1] or [5-2], wherein functional expression of the mRNA decapping activator gene is eliminated by heterozygous knockout or homozygous knockout.
  • [5-4] The method according to any one of [5-1] to [5-3], comprising introducing at least one heterologous polynucleotide encoding an antibody into the CHO cells.
  • [5-5] The method according to any one of [5-1] to [5-4], wherein the genome of the CHO cell is modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene.
  • [5-6] The method according to any one of [5-1] to [5-5], wherein the CHO cells contain at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene.
  • [5-18] The method according to any one of [5-1] to [5-17], wherein the reduction or elimination of functional expression of the mRNA decapping activator gene is mediated by a gene targeting system selected from the group consisting of CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, zinc finger nuclease, TALEN, or meganuclease.
  • a gene targeting system selected from the group consisting of CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, zinc finger nuclease, TALEN, or meganuclease.
  • [5-19] The method according to any one of [5-1] to [5-18], wherein the functional expression of the mRNA decapping activator gene is reduced or eliminated by gene knockout before or after introduction of a polynucleotide encoding the antibody.
  • the CHO cell contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, wherein the at least one modification causes a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene; the antibody is an IgG antibody, and the mRNA decapping activator is EDC3; The method according to any one of [5-1] to [5-19].
  • a method for increasing the titer of an antibody obtained in a medium by CHO cell culture comprising: preparing CHO cells modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene in the CHO cells; the antibody titer in the CHO cell culture medium is increased compared to when CHO cells having the same genotype except for the modification are cultured under the same conditions; the CHO cells comprise at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, the at least one modification causing a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene;
  • the method wherein the antibody is an IgG antibody, and the mRNA decapping activator is EDC3.
  • [6-1] A genetically engineered vertebrate cell that has been modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene.
  • [6-2] A vertebrate cell described in [6-1], in which functional expression of the mRNA decapping activator gene is reduced or eliminated by gene knockout, gene modification, gene deletion, gene silencing, or a combination thereof.
  • [6-3] A vertebrate cell according to [6-1] or [6-2], in which functional expression of the mRNA decapping activator gene is eliminated by heterozygous knockout or homozygous knockout.
  • [6-4] A vertebrate cell according to any one of [6-1] to [6-3], wherein the genome of the vertebrate cell has been modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator.
  • [6-5] A vertebrate cell according to any of [6-1] to [6-4], wherein the vertebrate cell contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene.
  • [6-6] A vertebrate cell according to [6-5], wherein the at least one modification is a modification that causes a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene.
  • [6-7] A vertebrate cell described in any of [6-1] to [6-6], wherein the amino acid sequence of the modified endogenous mRNA decapping activator has at least 90% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 as the mRNA decapping activator reference protein.
  • [6-8] A vertebrate cell according to any one of [6-1] to [6-7], wherein the mRNA decapping activator is PAT1, SCD6, EDC3, or DHH1.
  • [6-9] A vertebrate cell according to any one of [6-1] to [6-8], wherein the mRNA decapping activator is EDC3.
  • the vertebrate cell is a CHO cell, and contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, the at least one modification causing a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene, and the mRNA decapping activator is EDC3.
  • a vertebrate cell according to any one of [6-1] to [6-16].
  • a genetically engineered vertebrate cell that has been modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene
  • the vertebrate cell is a CHO cell and contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, the at least one modification causing a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene, and the mRNA decapping activator is EDC3.
  • [7-1] A method for increasing the secretion rate of an antibody obtained in a medium by CHO cell culture, comprising: preparing recombinant CHO cells modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene; The method increases the secretion rate of the antibody into the culture medium of the CHO cells compared to when CHO cells having the same genotype except for the modification are cultured under the same conditions.
  • [7-2] The method according to [7-1], wherein the functional expression of the mRNA decapping activator gene is reduced or eliminated by gene knockout, gene modification, gene deletion, gene silencing, or a combination thereof.
  • [7-3] The method according to [7-1] or [7-2], wherein functional expression of the mRNA decapping activator gene is eliminated by heterozygous knockout or homozygous knockout.
  • [7-4] The method according to any one of [7-1] to [7-3], comprising introducing at least one heterologous polynucleotide encoding an antibody into the CHO cells.
  • [7-5] The method according to any one of [7-1] to [7-4], wherein the genome of the CHO cell is modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene.
  • [7-6] The method according to any one of [7-1] to [7-5], wherein the CHO cells contain at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene.
  • [7-7] The method according to [7-6], wherein the at least one modification is a modification that causes a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene.
  • [7-8] A method according to any one of [7-1] to [7-7], wherein the amino acid sequence of the modified endogenous mRNA decapping activator has at least 90% identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 as the mRNA decapping activator reference protein.
  • [7-9] The method according to any one of [7-1] to [7-8], wherein the mRNA decapping activator is PAT1, SCD6, EDC3, or DHH1.
  • [7-11] The method according to any one of [7-1] to [7-10], wherein the CHO cells are provided as a cell clone or a cell line.
  • [7-12] The method according to any one of [7-1] to [7-11], wherein the antibody is an antibody used in therapy or diagnosis.
  • [7-13] The method according to any one of [7-1] to [7-12], wherein the antibody is an IgG antibody, an IgG1 antibody, or a bispecific antibody.
  • [7-14] The method according to any one of [7-1] to [7-13], further comprising introducing at least one heterologous polynucleotide encoding a selection marker or a reporter polypeptide into the CHO cells.
  • [7-15] The method according to any one of [7-1] to [7-14], wherein the at least one heterologous polynucleotide encoding the target peptide is contained in an expression cassette.
  • [7-16] The method according to any one of [7-1] to [7-15], wherein the antibody secretion rate in the CHO cell medium is increased by at least 10% compared to when CHO cells having the same genotype except for the modification are cultured under the same conditions.
  • [7-17] The method according to any one of [7-1] to [7-16], wherein the CHO cells do not express a detectable level of mRNA decapping activator.
  • [7-18] The method according to any one of [7-1] to [7-17], wherein the reduction or elimination of functional expression of the mRNA decapping activator gene is mediated by a gene targeting system selected from the group consisting of CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, zinc finger nuclease, TALEN, or meganuclease.
  • a gene targeting system selected from the group consisting of CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, zinc finger nuclease, TALEN, or meganuclease.
  • [7-19] The method according to any one of [7-1] to [7-18], wherein the functional expression of the mRNA decapping activator gene is reduced or eliminated by gene knockout before or after introduction of a polynucleotide encoding the antibody.
  • the CHO cell contains at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, wherein the at least one modification causes a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene; the antibody is an IgG antibody, and the mRNA decapping activator is EDC3; The method according to any one of [7-1] to [7-19].
  • a method for increasing the secretion rate of an antibody obtained in a medium by CHO cell culture comprising: preparing CHO cells modified to reduce or eliminate functional expression of an mRNA decapping activator gene in the CHO cells; the secretion rate of the antibody into the CHO cell medium is increased compared to when CHO cells having the same genotype except for the modification are cultured under the same conditions; the CHO cells comprise at least one modification in at least one copy or all copies of the mRNA decapping activator gene, the at least one modification causing a frameshift in an exon of one or both alleles of the mRNA decapping activator gene;
  • the method wherein the antibody is an IgG antibody, and the mRNA decapping activator is EDC3.
  • FIG. 1 is a diagram of a plasmid in which the heavy and light chains of SOF10 are combined and the hygromycin resistance gene and DHFR gene are incorporated.
  • FIG. 2 is a diagram of a plasmid in which the heavy and light chains of RAY121 are combined and the hygromycin resistance gene and DHFR gene are incorporated.
  • the term “about” refers to a range of ⁇ 20% of the numerical value that follows. In certain embodiments, the term “about” refers to a range of ⁇ 10% of the numerical value that follows. In certain embodiments, the term “about” refers to a range of ⁇ 5% of the numerical value that follows.
  • the term "genetically engineered vertebrate cell” refers to a vertebrate cell containing a heterologous polynucleotide capable of expressing a polypeptide.
  • Such genetically engineered vertebrate cells are cells into which one or more heterologous nucleic acid(s) have been introduced, including the progeny of such cells.
  • the term "vertebrate cell containing at least one heterologous polynucleotide encoding a recombinant polypeptide” refers to a vertebrate cell containing a heterologous polynucleotide that has been integrated into the vertebrate cell and is capable of expressing the recombinant polypeptide.
  • the heterologous polynucleotide is introduced into the genome of the vertebrate cell, and in a particular embodiment, the vertebrate cell containing the heterologous polynucleotide is a cell that contains a heterologous polynucleotide sequence integrated at a single site within a locus in the genome of the cell.
  • the term "genetically engineered” refers to a state in which, after genetic modification, the organism has been engineered to be able to express a recombinant polypeptide of interest and to be used for the production of the recombinant polypeptide of interest on any scale.
  • Both “genetically engineered vertebrate cells” and “vertebrate cells containing at least one heterologous polynucleotide encoding a recombinant polypeptide” are “transformed cells.” This term includes the primary transformed cell and its progeny, regardless of the number of transfers. The progeny may not be completely identical to the parent cell, for example, in nucleic acid content, but may contain mutations. Mutant progeny that have the same function or biological activity as screened or selected for in the originally transformed cell are within the scope of the term.
  • polypeptides can be expressed in vertebrate cells.
  • polypeptide refers to a molecule comprising a polymer of amino acids linked by peptide bond(s).
  • Polypeptides include polypeptides of any length, including proteins (e.g., having more than 50 amino acids) and peptides (e.g., 2-49 amino acids).
  • Polypeptides include proteins and/or peptides of any activity, function, or size, and may include, for example, antibodies, enzymes (e.g., kinases, phosphatases), receptors, transporters, bacterial and/or endotoxin-binding proteins, structural polypeptides, membrane-bound polypeptides, glycopolypeptides, globular proteins, immune polypeptides, toxins, antibiotics, hormones, growth factors, blood factors, vaccines, viral glycopolypeptides, and the like.
  • Recombinant polypeptides expressed in one embodiment of the present invention can also be polypeptide subunits or domains, such as the heavy or light chain of an antibody, or functional fragments or derivatives thereof.
  • the term "recombinant polypeptide" can refer to such individual subunits or domains or to the final protein composed of each subunit or domain.
  • recombinant polypeptide refers to a polypeptide that is artificial with respect to the vertebrate cell in which it is expressed, regardless of whether the polypeptide is a naturally occurring polypeptide derived from a different cell/organism or an artificial polypeptide.
  • Recombinant polypeptides are not derived from a particular cell, and the respective encoding nucleic acid is introduced into the cell by a DNA delivery method, such as transfection, electroporation, or transformation.
  • Recombinant polypeptides are encoded by heterologous polynucleotides contained in vertebrate cells. Host vertebrate cells can contain two or more heterologous polynucleotides encoding recombinant polypeptides. Host vertebrate cells express or contain the recombinant polypeptide.
  • Recombinant polypeptides are secreted by vertebrate cells into cell culture medium, from which they can be recovered, e.g., isolated and purified.
  • the recombinant polypeptide is an immunoglobulin molecule such as an antibody.
  • the antibody is a multispecific antibody, e.g., a bispecific antibody.
  • the recombinant polypeptide is selected from the group of multispecific antibodies and antibody-multimeric fusion polypeptides.
  • the recombinant polypeptide may be a protein that is difficult to express, or a protein with a complex and/or non-native structure, e.g., a next-generation biological protein, e.g., a bispecific antibody, a fusion protein, or a glycosylated protein.
  • heterologous polynucleotide or “heterologous nucleic acid” refer specifically to a polynucleotide sequence introduced into a vertebrate cell by the use of recombinant techniques such as transfection.
  • Polynucleotide refers specifically to a polymer of nucleotides, usually linked from one deoxyribose or ribose to another, and refers to DNA as well as RNA, depending on the context. The term “polynucleotide” does not imply any size restriction.
  • an "isolated" polypeptide or antibody refers to a polypeptide or antibody molecule that has been separated from components of the natural environment in which it occurs.
  • selection marker refers to a gene that allows cells carrying that gene to be specifically selected, either positively or negatively, in the presence of a corresponding selection agent.
  • a selection marker may allow host cells transformed with that selection marker gene to be positively selected in the presence of the respective selection agent (under selective culture conditions). Untransformed host cells would be unable to grow or survive under selective culture conditions.
  • Selection markers may be positive, negative, or bifunctional. Positive selection markers may allow the selection of cells carrying the marker, while negative selection markers may allow the selective elimination of cells carrying the marker. Selection markers may confer resistance to drugs in host cells or complement metabolic or catabolic defects.
  • endogenous refers to a nucleotide sequence derived from a cell or a product based on that nucleotide sequence.
  • the product may be an mRNA decapping activator.
  • the vertebrate cell is preferably a mammalian cell, e.g., selected from the group consisting of rodent cells, human cells, and monkey cells.
  • Preferred vertebrate cells are rodent cells, such as cells derived from hamsters or mice.
  • the rodent cell may be a cell line selected from the group consisting of Chinese hamster cell lines (e.g., Chinese hamster ovary (CHO) cell lines), BHK cell lines, NS0 cell lines, C127 cell lines, mouse 3T3 fibroblast cell lines, and SP2/0 cell lines.
  • CHO cells such as CHO-K1-derived CHO cells, are particularly preferred.
  • CHO cells are the cellular progeny of Chinese hamster ovary cells and may be removed from the original primary cellular parent by any number of generations, including transformed progeny.
  • Transformants and transformed cells include the primary subject cell and cultures derived therefrom, regardless of the number of times of introduction. It is also understood that all progeny may not be precisely identical in DNA content, due to deliberate or inadvertent mutations. Mutant progeny that have the same function or biological activity as screened for in the originally transformed cell are included.
  • Amino acids such as paragine, L-aspartic acid, L-cystine, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, and L-valine; i-inositol, biotin, folic acid, lipoic acid, nicotinamide, nicotinic acid, p-aminobenzoic acid, calcium pantothenate, and pyridoxine hydrochloride.
  • Examples of media include vitamins such as sal, pyridoxine hydrochloride, riboflavin, thiamine hydrochloride, vitamin B12, ascorbic acid, etc., preferably biotin, folic acid, lipoic acid, nicotinamide, calcium pantothenate, pyridoxal hydrochloride, riboflavin, thiamine hydrochloride, vitamin B12, and ascorbic acid; lipid factors such as choline chloride, choline tartrate, linoleic acid, oleic acid, cholesterol, etc., preferably choline chloride; energy sources such as glucose, galactose, mannose, fructose, etc., preferably glucose; osmotic regulators such as sodium chloride, potassium chloride, potassium nitrate, etc., preferably sodium chloride; iron sources such as ferric EDTA, ferric citrate, ferrous chloride, ferric chloride, ferrous sulfate, ferric sulfate, ferr
  • trace metal elements such as copper sulfate, manganese sulfate, zinc sulfate, magnesium sulfate, nickel chloride, tin chloride, magnesium chloride, and sodium silicate, preferably copper sulfate, zinc sulfate, and magnesium sulfate; surfactants such as Tween 80 and Pluronic® F68; growth cofactors such as recombinant insulin, recombinant IGF, recombinant EGF, recombinant FGF, recombinant PDGF, recombinant TGF- ⁇ , ethanolamine hydrochloride, sodium selenite, retinoic acid, and putrescine hydrochloride, preferably sodium selenite, ethanolamine hydrochloride, recombinant IGF, and putrescine hydrochloride; and nucleosides such as deoxyadenosine, deoxycytidine, deoxyguanosine, aden
  • the contents of other components in the medium are suitably in the ranges of 0.05-1500 mg/mL for amino acids, 0.001-10 mg/mL for vitamins, 0-200 mg/mL for lipid factors, 1-20 g/mL for energy sources, 0.1-10,000 mg/mL for osmotic pressure regulators, 0.1-500 mg/mL for iron sources, 1-10,000 mg/mL for pH buffers, 0.00001-200 mg/mL for trace metal elements, 0-5,000 mg/mL for surfactants, 0.05-10,000 ⁇ g/mL for growth cofactors, and 0.001-50 mg/mL for nucleosides, and can be determined appropriately depending on the type of cells to be cultured, the type of desired protein, etc.
  • the pH of the medium varies depending on the cells being cultured, but generally it is pH 6.8 to 7.6, and in most cases pH 7.0 to 7.4.
  • the culture method is not particularly limited and can be used to culture a variety of vertebrate cells.
  • the method of the present invention can also be used to culture vertebrate cells to obtain native proteins produced by those vertebrate cells, and can be used to culture BHK cells, HeLa cells, and other cells in addition to the above-mentioned cells.
  • vectors can be introduced into host cells by methods such as the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, a method using the cationic liposome DOTAP (Boehringer Mannheim), electroporation, or lipofection.
  • methods such as the calcium phosphate method, the DEAE-dextran method, a method using the cationic liposome DOTAP (Boehringer Mannheim), electroporation, or lipofection.
  • protein production in vertebrate cells involves both simple culturing and special manipulations, and these manipulations or conditions may be appropriately determined depending on the vertebrate cells being cultured.
  • the antibody in the case of CHO cells transformed by genetic engineering with a vector containing a gene encoding a mouse-human chimeric antibody, the antibody can be obtained in the culture medium under the conditions described below.
  • the desired protein can be obtained by isolating and purifying this in accordance with standard methods (see, for example, Introduction to Antibody Engineering, Chijin Shokan, pp. 102-104; Affinity Chromatography Principles & Methods, Amersham Pharmacia Biotech, pp. 56-60, etc.).
  • culture conditions may be appropriately determined depending on the type of cells used.
  • CHO cells may be cultured in an atmosphere with a CO2 concentration in the gas phase of 0-40%, preferably 2-10%, at 30-39°C, preferably about 37°C, for 1-14 days.
  • various culture apparatuses for animal cell culture may be used, such as a fermenter-type tank culture apparatus, an airlift-type culture apparatus, a culture flask-type culture apparatus, a spinner flask-type culture apparatus, a microcarrier-type culture apparatus, a fluidized bed-type culture apparatus, a hollow fiber-type culture apparatus, a roller bottle-type culture apparatus, and a packed bed-type culture apparatus.
  • proteins secreted into the medium from cultured animal cells can be recovered from the culture medium by conventional methods.
  • proteins can be recovered from cell lysates of host cells by conventional methods.
  • the desired protein can be recovered by removing cells and cell debris from the cell culture medium or cell lysate by centrifugation or other methods, followed by application of common protein isolation and purification techniques. Examples of techniques that can be used include salting out (e.g., ammonium sulfate fractionation), alcohol precipitation (e.g., ethanol precipitation), PEG, electrophoresis, ion exchange chromatography, ultracentrifugation, gel filtration, hydrophobic chromatography, and affinity chromatography.
  • protein A chromatography is preferably used, but is not limited to this.
  • various affinity-based separation or fractionation methods can be used to separate antibodies into immunoglobulin classes or to separate them based on their antigen binding ability.
  • mRNA translation and degradation The control of mRNA translation and degradation is mediated by proteins that inhibit translation and promote decapping, while also acting to assemble cytoplasmic mRNA granules called processing bodies (P bodies).
  • Known mRNA decapping proteins include Pat1, Scd6, Edc3, and Dhh1.
  • the genetically engineered vertebrate cell is modified to reduce or eliminate functional expression of the mRNA decapping activator gene compared to an unmodified vertebrate cell that endogenously expresses the mRNA decapping activator.
  • the amount of protein expression is reduced by at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90%, preferably 100%, compared to an unmodified vertebrate cell that endogenously expresses the mRNA decapping activator.
  • the amount of protein expression can be measured by known methods, for example, by Western blotting.
  • the genetically engineered vertebrate cell can be transfected with an expression vector comprising a polynucleotide encoding a recombinant polypeptide to provide a host cell of the present disclosure that contains a heterologous polynucleotide encoding the recombinant polypeptide and secretes the recombinant polypeptide into cell culture medium.
  • gene knockout is a genetic technique in which a gene is disabled by disrupting its function. For example, a nucleic acid can be inserted into a coding sequence, thereby disrupting gene function. Furthermore, the mRNA decapping activator gene or a portion thereof can be deleted, such that no protein or no functional protein is expressed by the individually modified cell. Another option is to introduce one or more knockout mutations into the coding sequence. Alternatively, in one embodiment of the present invention, one or more stop codons can be introduced into the coding sequence.
  • the mRNA decapping activator gene contains one or more mutations that reduce or eliminate expression of the gene.
  • the one or more mutations are frameshift or stop codon mutations. Methods for achieving gene knockout, which suppress or eliminate functional expression of a target gene, are also well known to those skilled in the art and therefore do not require any detailed description herein.
  • the mRNA decapping activator gene is functionally knocked out by genetic engineering.
  • genetic engineering such as recombinant nuclease-mediated genome editing (GEEN), a type of genetic engineering in which DNA is inserted, replaced, or removed from the genome using recombinant nucleases, or "molecular scissors.”
  • GEEN recombinant nuclease-mediated genome editing
  • Nucleases create specific double-strand breaks (DSBs) at desired locations in the genome and utilize the cell's endogenous mechanisms to repair breaks induced by the natural processes of homologous recombination (HR) and non-homologous end joining (NHEJ).
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • TALENs transcription activator-like effector nucleases
  • CRISPR clustered regularly interspaced short palindromic repeat
  • homing endonucleases reengineered by recombinant meganucleases.
  • the reduction, elimination, or knockout of the endogenous gene is mediated by a nuclease-assisted gene targeting system.
  • the nuclease-assisted gene targeting system is selected from the group consisting of CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, zinc finger nucleases, TALENs, and meganucleases.
  • the knockout of the endogenous gene is performed i) before the introduction of a heterologous nucleic acid encoding a recombinant polypeptide, or ii) after the introduction of a heterologous nucleic acid encoding a recombinant polypeptide.
  • the gene knockout is a heterozygous knockout or a homozygous knockout.
  • gene deletion refers to the removal of at least a portion of a DNA sequence from or adjacent to a gene.
  • sequence subjected to gene deletion comprises an exon sequence of the gene.
  • sequence subjected to gene deletion comprises a promoter sequence of the gene.
  • sequence subjected to gene deletion comprises a flanking sequence of the gene.
  • the mRNA decapping activator has the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1-4. In one embodiment of the present invention, the mRNA decapping activator is PAT1, SCD6, EDC3, or DHH1. PAT1, SCD6, EDC3, and DHH1 bind to mRNA decapping enzymes.
  • recombinant polypeptides are produced by genetically engineered vertebrate cells.
  • the recombinant polypeptide is an antibody.
  • the amino acid positions of all constant regions and domains of the heavy and light chains are numbered according to the Kabat numbering system described in Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), and are referred to herein as "Kabat numbering.”
  • Kabat numbering system is based on the Kabat numbering system described in Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
  • antibody is used in the broadest sense and encompasses a variety of antibody structures, including, but not limited to, full-length antibodies, monoclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies), and antibody-antibody fragment-fusions and combinations thereof.
  • natural antibody refers to naturally occurring immunoglobulin molecules with a variety of structures.
  • natural IgG antibodies are heterotetrameric glycoproteins of approximately 150,000 daltons composed of two identical light chains and two identical heavy chains that are disulfide-bonded. From the N- to C-terminus, each heavy chain has a heavy chain variable region (VH) followed by three heavy chain constant domains (CH1, CH2, and CH3), thereby positioning a hinge region between the first heavy chain constant domain and the second heavy chain constant domain. Similarly, from the N- to C-terminus, each light chain has a light chain variable region (VL) followed by a light chain constant domain (CL).
  • the light chains of an antibody may be assigned to one of two types, called kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ), based on the amino acid sequence of their constant domains.
  • full-length antibody refers to an antibody having a structure substantially similar to that of a naturally occurring antibody.
  • a full-length antibody comprises two full-length antibody light chains, each comprising, from N- to C-terminus, a light chain variable region and a light chain constant domain, and two full-length antibody heavy chains, each comprising, from N- to C-terminus, a heavy chain variable region, a first heavy chain constant domain, a hinge region, a second heavy chain constant domain, and a third heavy chain constant domain.
  • full-length antibodies may comprise further immunoglobulin domains, such as one or more additional scFvs, or heavy or light chain Fab fragments, or scFabs conjugated to one or more ends of different chains of a full-length antibody, but with only one fragment at each end. These conjugates are also encompassed by the term full-length antibody.
  • an antibody antigen-binding site comprises amino acid residues from "hypervariable regions” or "HVRs.”
  • "Framework” or "FR” regions are variable domain regions other than the hypervariable region residues as defined herein.
  • the light and heavy chain variable domains of an antibody comprise, from the N- to C-terminus, the regions FR1, HVR1, FR2, HVR2, FR3, HVR3, and FR4.
  • the HVR3 region of the heavy chain variable domain is the region that contributes most to antigen binding and defines the binding specificity of the antibody.
  • a "functional binding site" is capable of specifically binding to its target.
  • hypervariable region refers to each region of an antibody variable domain that comprises stretches of amino acid residues that are hypervariable sequences ("complementarity determining regions” or “CDRs") and/or form structurally defined loops ("hypervariable loops") and/or contain residues that contact antigen ("antigen contacts”).
  • CDRs complementarity determining regions
  • hypervariable loops form structurally defined loops
  • antigen contacts typically, antibodies contain six HVRs: three in the heavy chain variable domain VH (H1, H2, H3) and three in the light chain variable domain VL (L1, L2, L3).
  • HVR residues and other residues in the variable domain are numbered herein according to Kabat et al., supra.
  • the "class" of an antibody refers to the type of constant domain or constant region, preferably the Fc region of the heavy chain.
  • the heavy chain constant domains corresponding to the different immunoglobulin classes are called ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ , respectively.
  • the term “heavy chain Fc region” refers to the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including at least a portion of the hinge region, the CH2 domain, and the CH3 domain.
  • the human IgG heavy chain Fc region extends from Asp221, Cys226, or Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain (numbering according to the Kabat EU index).
  • the C-terminal portion is identical to it.
  • the C-terminal lysine (Lys447) of the heavy chain Fc region may or may not be present (numbering according to the Kabat EU index).
  • the term “Fc region” refers to a dimer comprising two heavy chain Fc regions that can be covalently linked to each other via hinge region cysteine residues that form interchain disulfide bonds.
  • the constant region of an antibody is directly involved in complement activation, C1q binding, C3 activation, and Fc receptor binding.
  • the effect of an antibody on the complement system depends on the specific conditions, but binding to C1q is caused by a defined binding site in the Fc region.
  • binding sites are known in the prior art and are described, for example, in Lukas, T. J. et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J. J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D. R. et al., Nature 288 (1980) 338-344; T Subscribesen, J. E.
  • binding sites are, for example, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, and P329 (numbering according to the EU index of Kabat).
  • Fc region is used herein to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that comprises at least a portion of the constant region. This term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions.
  • a human IgG heavy chain Fc region extends from Cys226, or from Pro230, to the carboxyl terminus of the heavy chain, except that the C-terminal lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) residue at the Fc region may or may not be present.
  • the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is in accordance with Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.
  • the EU numbering system also known as the EU index
  • the EU index is set out in the Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991.
  • Fc Region Variants may be introduced into the Fc region of an antibody provided herein, thereby generating an Fc region variant.
  • the Fc region variant may comprise a human Fc region sequence (e.g., a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc region) containing an amino acid modification (e.g., substitution) at one or more amino acid positions.
  • antibody variants that retain some, but not all, effector functions are also contemplated by the present invention, making them desirable candidates for applications where in vivo half-life is important but certain effector functions (such as complement and ADCC) are unnecessary or deleterious.
  • In vitro and/or in vivo cytotoxicity assays can be performed to confirm reduced/lack of CDC and/or ADCC activity.
  • Fc receptor (FcR) binding assays can be performed to confirm that an antibody lacks Fc ⁇ R binding (and thus likely lacks ADCC activity) while retaining FcRn binding ability.
  • NK cells the primary cells for mediating ADCC, express only Fc ⁇ RIII, whereas monocytes express Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RII, and Fc ⁇ RIII.
  • FcRs on hematopoietic cells is discussed in detail in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991), page 464, Table 3.
  • Non-limiting examples of in vitro assays to assess ADCC activity of a molecule of interest are described in U.S. Pat. No. 5,500,362 (see, e.g., Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) and Hellstrom, I.
  • non-radioactive assays may be used (see, e.g., the ACT1TM non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA); and the CytoTox96® non-radioactive cytotoxicity assays (Promega, Madison, WI)).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK natural killer cells
  • ADCC activity of the molecule of interest may be assessed in vivo, e.g., in an animal model such as that described in Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998).
  • C1q binding assays may also be performed to confirm that the antibody is unable to bind C1q and thereby lacks CDC activity. See, e.g., C1q and C3c binding ELISAs in WO 2006/029879 and WO 2005/100402.
  • CDC measurements may also be performed to assess complement activation (see, e.g., Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); and Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)).
  • determination of FcRn binding and in vivo clearance/half-life may also be performed using methods known in the art (see, e.g., Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
  • Antibodies with reduced effector function include those with one or more substitutions at Fc region residues 238, 265, 269, 270, 297, 327, and 329 (U.S. Patent No. 6,737,056).
  • Such Fc variants include Fc variants with two or more substitutions at amino acid positions 265, 269, 270, 297, and 327, including the so-called "DANA" Fc variant with substitutions of residues 265 and 297 to alanine (U.S. Patent No. 7,332,581).
  • the antibody variant comprises an Fc region with one or more amino acid substitutions that improve ADCC (e.g., substitutions at positions 298, 333, and/or 334 (EU numbering) of the Fc region).
  • ADCC e.g., substitutions at positions 298, 333, and/or 334 (EU numbering) of the Fc region.
  • modifications are made in the Fc region that result in altered (i.e., either increased or decreased) C1q binding and/or complement-dependent cytotoxicity (CDC), e.g., as described in U.S. Pat. No. 6,194,551, WO 99/51642, and Idusogie et al. J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
  • C1q binding and/or complement-dependent cytotoxicity e.g., as described in U.S. Pat. No. 6,194,551, WO 99/51642, and Idusogie et al. J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
  • Antibodies with increased half-lives and increased binding to the neonatal Fc receptor (FcRn, which is responsible for the transfer of maternal IgGs to the fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) are described in U.S. Patent Application Publication No. 2005/0014934 A1 (Hinton et al.). These antibodies comprise an Fc region with one or more substitutions therein that increase binding of the Fc region to FcRn.
  • Such Fc variants include those with substitutions at one or more of Fc region residues: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, or 434 (e.g., substitution of Fc region residue 434 (U.S. Patent No. 7,371,826)).
  • monoclonal indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies and should not be construed as requiring production of the antibody by any particular method.
  • monoclonal antibodies used in accordance with the present invention may be produced by a variety of techniques, including, but not limited to, hybridoma methods, recombinant DNA methods, phage display methods, and methods utilizing transgenic animals containing all or part of the human immunoglobulin loci.
  • valency refers to the presence of a specific number of binding sites within an antibody.
  • bivalent refers to the presence of two binding sites, four binding sites, and six binding sites, respectively, within an antibody.
  • the term "monospecific antibody” refers to an antibody that has a single binding specificity, i.e., that specifically binds to one antigen.
  • Monospecific antibodies can be prepared as full-length antibodies or antibody fragments (e.g., F(ab')2), or combinations thereof (e.g., a full-length antibody with an additional scFv or Fab fragment).
  • Monospecific antibodies need not be monovalent; that is, they may contain more than one binding site that specifically binds to one antigen. For example, natural antibodies are monospecific but bivalent.
  • multispecific antibody refers to an antibody that has binding specificities for at least two different epitopes on the same antigen or two different antigens.
  • Multispecific antibodies can be prepared as full-length antibodies or antibody fragments (e.g., F(ab')2 bispecific antibodies), or combinations thereof (e.g., a full-length antibody with an additional scFv or Fab fragment).
  • Multispecific antibodies are at least bivalent, i.e., contain two antigen-binding sites.
  • multispecific antibodies are at least bispecific.
  • bivalent bispecific antibodies are the simplest form of multispecific antibodies. Engineered antibodies with two, three, or more (e.g., four) functional antigen-binding sites have been reported (see, e.g., US 2002/0004587).
  • the antibody is a multispecific antibody, e.g., at least a bispecific antibody.
  • a multispecific antibody is a monoclonal antibody that has binding specificities for at least two different antigens or epitopes. In certain aspects, one of the binding specificities is for a first antigen and the other is for a different second antigen. In certain aspects, a multispecific antibody can bind to two different epitopes of the same antigen. Multispecific antibodies can also be used to localize cytotoxic agents to cells expressing the antigen.
  • Multispecific antibodies include, but are not limited to, recombinant co-expression of two immunoglobulin heavy chain-light chain pairs with different specificities (see Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, and Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), and "knob-in-hole” engineering (see, e.g., U.S. Pat. No. 5,731,168). Multispecific antibodies can also be produced by modifying electrostatic steering effects to create antibody Fc heterodimeric molecules (WO 2009/089004); cross-linking two or more antibodies or fragments (see, e.g., U.S.
  • bispecific antibody fragments can be produced by using conventional light chain technology to avoid light chain mispairing problems (see, for example, WO 98/50431); by using "diabody” technology to generate bispecific antibody fragments (see, for example, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); and by preparing trispecific antibodies as described, for example, in Tutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69.
  • engineered antibodies or DVD-binding proteins having three or more antigen-binding sites including, for example, "Octopus antibodies” (see, e.g., WO 2001/77342 and WO 2008/024715).
  • Other examples of multispecific antibodies having three or more antigen-binding sites can be found in WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792, and WO 2013/026831.
  • Bispecific antibodies or antigen-binding fragments thereof also include "dual-acting Fabs" or "DAFs” (see, e.g., U.S. Patent Application Publication No. 2008/0069820 and WO 2015/095539).
  • Multispecific antibodies can also be provided in an asymmetric form with domain crossovers in one or more binding arms of the same antigen specificity, i.e., by exchanging VH/VL domains (see, e.g., WO 2009/080252 and WO 2015/150447), CH1/CL domains (see, e.g., WO 2009/080253), or complete Fab arms (see, e.g., WO 2009/080251, WO 2016/016299; see also Schaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 1187-1191, and Klein et al., MAbs 8 (2016) 1010-1020).
  • the multispecific antibody comprises cross-Fab fragments.
  • cross-Fab fragment or "xFab fragment” or “crossover Fab fragment” refer to a Fab fragment in which either the variable or constant regions of the heavy and light chains have been exchanged.
  • a cross-Fab fragment contains a polypeptide chain composed of a light chain variable region (VL) and a heavy chain constant region 1 (CH1), and a polypeptide chain composed of a heavy chain variable region (VH) and a light chain constant region (CL).
  • Asymmetric Fab arms can also be engineered by introducing charged or uncharged amino acid mutations at the domain interface to direct correct Fab pairing. See, e.g., WO 2016/172485.
  • the antibody or fragment may also be a multispecific antibody described in WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, or WO 2010/145793.
  • the antibody or fragment thereof may also be a multispecific antibody as disclosed in WO2012/163520.
  • domain crossover refers to deviations in the domain sequence from that of a native antibody in that, in a pair of an antibody heavy chain VH-CH1 fragment and its corresponding cognate antibody light chain, i.e., an antibody Fab (fragment-antigen binding), at least one heavy chain domain is replaced by its corresponding light chain domain, and vice versa.
  • the term "replaced by one another” with respect to corresponding heavy and light chain domains refers to the domain crossover described above.
  • the term refers to the domain crossover described under item (i) and the resulting heavy and light chain domain sequences.
  • the term refers to the domain crossover described under item (ii)
  • the term refers to the domain crossover described under item (ii)
  • Bispecific antibodies comprising domain crossovers are described, for example, in WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, and Schaefer, W., et al., Proc. This is reported in Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 11187-11192.
  • Such antibodies are generally called CrossMab.
  • a multispecific antibody also comprises at least one Fab fragment comprising either the domain crossover of the CH1 and CL domains described in item (i) above, the domain crossover of the VH and VL domains described in item (ii) above, or the domain crossover of the VH-CH1 and VL-VL domains described in item (iii) above.
  • Fabs that specifically bind to the same antigen are constructed to have the same domain sequence. Therefore, when more than one Fab with domain crossover is included in a multispecific antibody, the Fabs specifically bind to the same antigen.
  • a “humanized” antibody refers to an antibody that comprises amino acid residues from non-human HVRs and amino acid residues from human FRs.
  • a humanized antibody comprises substantially all of at least one, and typically two, variable domains, in which all or substantially all of the HVRs (e.g., CDRs) correspond to those of a non-human antibody and all or substantially all of the FRs correspond to those of a human antibody.
  • a humanized antibody may optionally comprise at least a portion of an antibody constant region derived from a human antibody.
  • a "humanized form" of an antibody refers to an antibody that has been humanized.
  • recombinant antibody refers to all antibodies (chimeric, humanized, and human) that are prepared, expressed, produced, or isolated by recombinant means, such as recombinant cells. This includes antibodies isolated from recombinant cells, such as NS0, HEK, BHK, amniotic cells, and CHO cells.
  • antibody fragment refers to a molecule other than an intact antibody that contains a portion of the intact antibody that binds to the antigen to which the intact antibody binds; i.e., it is a functional fragment.
  • antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, bispecific Fab, diabody, linear antibody, and single-chain antibody molecule (e.g., scFv or scFab).
  • One aspect of the present invention provides methods for producing a recombinant polypeptide, comprising culturing a host cell comprising nucleic acid encoding the recombinant polypeptide under conditions suitable for expression of the recombinant polypeptide, and optionally recovering the recombinant polypeptide from the host cell (or host cell culture).
  • nucleic acids encoding the recombinant polypeptides described above are isolated and inserted into one or more vectors for further cloning and/or expression in host cells. Such nucleic acids can be readily isolated and sequenced using standard procedures.
  • a nucleic acid that encodes a polypeptide, i.e., a coding sequence, is called a structural gene.
  • a structural gene is purely coding information. Therefore, its expression requires additional regulatory elements. Therefore, structural genes are usually incorporated into so-called expression cassettes.
  • the minimum control elements required for an expression cassette to be functional in mammalian cells are a promoter functional in the mammalian cell located upstream, i.e., on the 5' side, of the structural gene, and a polyadenylation signal sequence functional in the mammalian cell located downstream, i.e., on the 3' side, of the structural gene.
  • the promoter sequence, structural gene sequence, and polyadenylation signal sequence are arranged in an operably linked form.
  • the recombinant polypeptide is a heteromultimeric polypeptide composed of different (monomeric) polypeptides, such as an antibody or a complex antibody format, not only is a single expression cassette required, but multiple expression cassettes containing different structural genes are required, i.e., at least one expression cassette for each of the different (monomeric) polypeptides of the heteromultimeric polypeptide.
  • a full-length antibody is a heteromultimeric polypeptide containing two copies of a light chain and two copies of a heavy chain. A full-length antibody is therefore composed of two different polypeptides. Therefore, two expression cassettes are required for expression of a full-length antibody: one for the light chain and one for the heavy chain.
  • the full-length antibody is a bispecific antibody, i.e., the antibody contains two different binding sites that specifically bind to two different antigens, the two light chains and the two heavy chains are also different from each other. Therefore, such a bispecific full-length antibody is composed of four different polypeptides, and therefore requires four expression cassettes.
  • an expression vector is a nucleic acid that provides all the elements required to amplify the vector in bacterial cells and to express the contained structural gene in mammalian cells.
  • an expression vector contains a prokaryotic plasmid propagation unit, which, in the case of E. coli, for example, contains an origin of replication and a prokaryotic or eukaryotic selection marker, as well as an expression cassette required for expression of the structural gene of interest.
  • An "expression vector” is a delivery vehicle for introducing an expression cassette into mammalian cells.
  • CLD Cell line development
  • RI random integration
  • TI targeted integration
  • the genes introduced into the host cells can also be transient transfections that remain within the cells for a limited period of time.
  • RI When RI is used, multiple vectors or fragments thereof are generally integrated into the cell's genome at the same or different loci.
  • a single copy of a transgene containing different expression cassettes is typically integrated into a defined "hot spot" in the host cell's genome.
  • efficient production of a recombinant polypeptide using genetically engineered vertebrate cells obtained by the present invention means, for example, production that is more efficient than when non-genetically engineered vertebrate cells are used.
  • efficient production means, for example, improved productivity in the production of recombinant polypeptides using vertebrate cells.
  • productivity of a recombinant polypeptide by vertebrate cells is expressed by indicators such as titer and antibody secretion rate per cell.
  • productivity refers to the efficiency of recombinant polypeptide production by culturing vertebrate cells, and varies depending on factors such as the expression level of the recombinant polypeptide in individual cells and the growth rate of the cells in culture.
  • increased productivity refers to an increase in the amount of polypeptide produced compared to a control.
  • the amount of polypeptide produced can be measured by, for example, weighing the polypeptide isolated after purification or by HPLC.
  • the amount of polypeptide produced for example, the amount of antibody produced, can be calculated by measuring the titer or the antibody secretion rate per cell. Specifically, the antibody titer in the medium when non-genetically modified vertebrate cells are cultured under the same conditions as a control can be measured, and the increase in productivity can be calculated from the increase in antibody production.
  • the recombinant polypeptide of interest produced is isolated from the cell culture medium and, optionally, further processed by methods known in the art.
  • the polypeptide may be collected from the nutrient medium by conventional procedures, including, but not limited to, centrifugation, filtration, ultrafiltration, extraction, or precipitation.
  • Further processing steps such as purification steps, may be carried out by a variety of procedures known in the art, including, but not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic, isoelectric focusing, protein A or protein G chromatography and size exclusion), electrophoretic procedures (e.g., preparative isoelectric focusing), differential solubility (e.g., ammonium sulfate precipitation), or extraction.
  • the isolated, purified polypeptide of interest may be further processed, e.g., modified and/or formulated into a composition, e.g., a pharmaceutical composition.
  • Example 1 Preparation of knockout cells
  • a vial containing CHO cells (DXB11-derived) was thawed in a 37°C water bath and the contents were transferred to a centrifuge tube containing cell culture medium. The cells were then collected by centrifugation and seeded into a flask containing cell culture medium for shake culture. The cell culture after shake culture was subcultured in cell culture medium, and the cell culture was maintained and subcultured on a 3-day/4-day schedule. At this time, the cell culture was started at a seeding density of 2 x 10 5 cells/mL in 20 mL of maintenance medium.
  • Single cell cloning and cell expansion of transfectant pools Single cell cloning was performed from the transfectant pool using CellCelectorTM Nanowell Plate H100-100 330K Microplate 24-well 100 ⁇ m nanowells uncoated (Sartorius). Cells were seeded into the nanowells, and photographs of the cells were taken at the time of seeding, and on days 1, 2, and 3. From the images, cells that were single cells at the time of seeding and showed proliferation by day 3 were selected and expanded to a 384-well plate on day 4 after seeding. Culture was continued for nine days, and on day 13, when the cells had sufficiently proliferated, the entire volume was expanded to a 96-well plate.
  • antibody gene expression units were prepared by attaching a CAG promoter upstream of each of the heavy chain (H chain) and light chain (L chain) genes of each antibody and further attaching a rabbit beta globin (rBG) polyA signal sequence downstream thereof.
  • the constructed antibody gene expression units were combined in the order L, L, H, L, H, L or L, L, H, L, L, H, and then linked to a vector plasmid for CHO cell transfection incorporating the DHFR gene, creating a plasmid with an H:L ratio of 2:4, consisting of two copies of the antibody gene heavy chain and four copies of the light chain ( Figures 1 and 2).
  • Example 2 Production of antibody-producing cells and antibodies
  • the plasmid prepared in Example 1 was introduced by electroporation into the knockout cells prepared by the method described above and into unmodified CHO cell DXB11-derived cells, respectively, to integrate two copies of the plasmid into the same specific position in the CHO cell genome.
  • the cells were then cultured in the presence of 400 mg/mL hygromycin B to obtain a cell pool into which the expression plasmid had been introduced, and the culture was evaluated.
  • antibody titers were compared using fed-batch culture with ambr15. Culture was carried out under conditions of an initial culture volume of 12 mL, a culture temperature of 37°C, and an agitation speed of 800 rpm. The antibody concentration in the medium on day 14 after the start of culture was measured as the titer. The titer was determined by measuring the binding of antibodies present in the culture supernatant to a Protein A sensor using a biomolecular interaction analysis system (Octet Systems, Sartorius).
  • the antibody secretion rate (ng/cells/day) in Table 1 is the value obtained by dividing the titer by the integral viable cell density (IVCD).
  • IVCD represents the sum of the viable cell densities during the culture period. It was calculated from the viable cell densities at each time point (days 0, 3, 5, 7, 10, 12, and 14).
  • the formula for calculating IVCD is as follows: The average of the viable cell density (VCD) at adjacent time points was calculated for the duration of the period (t: duration in days).

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Abstract

組換えポリペプチドの製造に使用するための脊椎動物細胞であって、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変されている、遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞を提供する。

Description

遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞
　本発明は、脊椎動物細胞における組換えポリペプチドの製造方法、遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞およびその製造方法、ならびに脊椎動物細胞による組換えポリペプチドの生産性を増加させる方法に関する。
　多くのバイオ医薬は、哺乳動物細胞などの脊椎動物細胞を利用して製造されている。バイオ医薬として、抗体、抗体断片、ＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）、ナノボディ、Ｆｃ融合タンパク質、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、酵素およびその他の治療用ポリペプチドが挙げられる。バイオ医薬品の有効成分であるポリペプチドは組換えポリペプチドとして哺乳動物細胞において発現されることにより製造することができる。組換えポリペプチドの製造費用を考慮すると、製造方法における製造効率の向上が求められている。
　組換えポリペプチドの発現のために遺伝子組換え操作された細胞株を使用する方法が報告されている（特許文献２～５）。また、酵母などを用いて無細胞系タンパク質合成系の構築を行う場合のＥＤＣ３の利用について報告がされている（特許文献１）。また、その他にもポリペプチドの発現においてＥＤＣ３の関与に関する研究について報告がされている（非特許文献１～４）。
国際特許出願公開ＷＯ２０２０／１３５６２３Ａ１ 特表２０１７－５１４４８４号公報 特表２０２１－５３０２２５号公報 特表２０２２－５５２３２３号公報 特表２０２３－５４２２２８号公報
Robert W. Walters et al., G3、Vol. 4、April 2014、pp.613-622, doi: 10.1534/g3.114.010470； Mark Larance et al., Molecular & Cellular Proteomics 9.4、pp.682-694； Trach Nissan et al., Mol Cell. 2010 September 10、39(5): pp.773-783； Darach Miller et al., PLOS Genetics, May 21, 2018, https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007406。
　細胞培養による組換えポリペプチドの製造において製造効率を向上させた方法、特に脊椎動物細胞における組換えポリペプチド製造の生産性が向上した方法、および該方法において使用することができる脊椎動物細胞が求められている。
　発明者らは、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除するように遺伝子組換え操作をした脊椎動物細胞を使用することによって、組換えポリペプチドの効率的な製造が可能となることを見いだした。本明細書は以下の発明の開示を包含する。
　［１－１］組換えポリペプチドの製造に使用するための脊椎動物細胞であって、
　ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変されている、遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞。
　［１－２］遺伝子ノックアウト、遺伝子改変、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたはそれらの組み合わせによって、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除される、［１－１］に記載の脊椎動物細胞。
　［１－３］ヘテロ接合性ノックアウトまたはホモ接合性ノックアウトにより、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が排除される、［１－１］または［１－２］に記載の脊椎動物細胞。
　［１－４］前記脊椎動物細胞が、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む、［１－１］～［１－３］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－５］組換えポリペプチドを分泌する、［１－１］～［１－４］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－６］前記脊椎動物細胞のゲノムが、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子の機能的発現を低減また排除するように改変されている、［１－１］～［１－５］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－７］前記脊椎動物細胞が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含む、［１－１］～［１－６］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－８］前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変である、［１－７］に記載の脊椎動物細胞。
　［１－９］改変後の内因性ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子のアミノ酸配列が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子参照タンパク質として配列番号１～４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する、［１－１］～［１－８］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－１０］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＰＡＴ１、ＳＣＤ６、ＥＤＣ３、またはＤＨＨ１である、［１－１］～［１－９］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－１１］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、［１－１］～［１－１０］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－１２］前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、［１－１］～［１－１１］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－１３］前記脊椎動物細胞がヒト細胞である、［１－１］～［１－１２］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－１４］前記脊椎動物細胞がげっ歯類細胞である、［１－１］～［１－１２］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－１５］前記脊椎動物細胞がハムスター細胞である、［１－１］～［１－１２］および［１－１４］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－１６］前記脊椎動物細胞がＣＨＯ細胞である、［１－１］～［１－１２］、［１－１４］および［１－１５］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－１７］前記脊椎動物細胞が細胞クローンまたは細胞株として提供される哺乳動物細胞である、［１－１］～［１－１６］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－１８］前記組換えポリペプチドが、治療または診断に使用される、［１－１］～［１－１７］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－１９］前記組換えポリペプチドが、糖タンパク質、抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ペプチド、Ｆｃ融合タンパク質、Ｆａｂ断片、タンパク質複合体、ペプチダーゼ、シグナルペプチド、ナノボディ、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、血液因子および酵素からなる群から選択される、［１－１］～［１－１８］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－２０］前記組換えポリペプチドが抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、または二重特異性抗体である、［１－１］～［１－１９］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－２１］選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む、［１－１］～［１－２０］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－２２］前記組換えポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、発現カセット中に含まれる、［１－１］～［１－２１］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－２３］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除された脊椎動物細胞による前記組換えポリペプチドの生産性が、前記改変を除いて同じ遺伝子型を有する脊椎動物細胞と比較して少なくとも１０％増加している、［１－１］～［１－２２］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－２４］前記組換えポリペプチドの生産性の増加が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除された脊椎動物細胞による前記組換えポリペプチドの生産量の、同一条件下で培養された、前記改変を除いて同じ遺伝子型を有する脊椎動物細胞による組換えポリぺプチドの生産量との比較における、少なくとも１０％の増加である、［１－２３］に記載の脊椎動物細胞。
　［１－２５］前記組換えポリペプチドの生産性の増加が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除された脊椎動物細胞の培地における前記組換えポリペプチドの力価の、同一条件下で培養された、前記改変を除いて同じ遺伝子型を有する脊椎動物細胞の培地における組換えポリぺプチドの力価との比較における、少なくとも１０％の増加である、［１－２３］または［１－２４］に記載の脊椎動物細胞。
　［１－２６］検出可能なレベルのｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子を発現しない、［１－１］～［１－２５］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－２７］前記脊椎動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、
　前記組換えポリペプチドがＩｇＧ抗体であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、
［１－１］～［１－１２］、［１－１４］～［１－２６］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［１－２８］組換えポリペプチドの製造に使用するための、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変されている、遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞であって、
　前記脊椎動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、
　前記組換えポリペプチドがＩｇＧ抗体であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、脊椎動物細胞。
　［１－２９］前記組換えポリペプチドの生産性の増加が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除された脊椎動物細胞の培地における前記組換えポリペプチドの抗体分泌速度の、同一条件下で培養された、前記改変を除いて同じ遺伝子型を有する脊椎動物細胞の培地における組換えポリぺプチドの抗体分泌速度との比較における、少なくとも１０％の増加である、［１－２３］または［１－２４］に記載の脊椎動物細胞。
　［２－１］脊椎動物細胞において組換えポリペプチドの生産性を増加させる方法であって、
　脊椎動物細胞においてｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除するように改変された組換え脊椎動物細胞を調製することを含み、
　前記改変を除いて同一の遺伝子型を有する脊椎動物細胞と比較して、同じ条件下での培養において組換えポリペプチドの生産性が増加する、方法。
　［２－２］遺伝子ノックアウト、遺伝子改変、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたはそれらの組み合わせによって、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除される、［２－１］に記載の方法。
　［２－３］ヘテロ接合性ノックアウトまたはホモ接合性ノックアウトにより、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が排除される、［２－１］または［２－２］に記載の方法。
　［２－４］前記脊椎動物細胞に、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを導入することを含む、［２－１］～［２－３］のいずれかに記載の方法。
　［２－５］前記脊椎動物細胞のゲノムにおいて、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除するように改変される、［２－１］～［２－４］のいずれかに記載の方法。
　［２－６］前記脊椎動物細胞が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含む、［２－１］～［２－５］のいずれかに記載の方法。
　［２－７］前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変である、［２－６］に記載の方法。
　［２－８］改変後の内因性ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子のアミノ酸配列が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子参照タンパク質として配列番号１～４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、［２－１］～［２－７］のいずれかに記載の方法。
　［２－９］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＰＡＴ１、ＳＣＤ６、ＥＤＣ３、またはＤＨＨ１である、［２－１］～［２－８］のいずれかに記載の方法。
　［２－１０］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、［２－１］～［２－９］のいずれかに記載の方法。
　［２－１１］前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、［２－１］～［２－１０］のいずれかに記載の方法。
　［２－１２］前記脊椎動物細胞がヒト細胞である、［２－１］～［２－１１］のいずれかに記載の方法。
　［２－１３］前記脊椎動物細胞がげっ歯類細胞である、［２－１］～［２－１１］のいずれかに記載の方法。
　［２－１４］前記脊椎動物細胞がハムスター細胞である、［２－１］～［２－１１］および［２－１３］のいずれかに記載の方法。
　［２－１５］前記脊椎動物細胞がＣＨＯ細胞である、［２－１］～［２－１１］、［２－１３］および［２－１４］のいずれかに記載の方法。
　［２－１６］前記脊椎動物細胞が細胞クローンまたは細胞株として提供される哺乳動物細胞である、［２－１］～［２－１５］のいずれかに記載の方法。
　［２－１７］前記組換えポリペプチドが、治療または診断において使用されるポリペプチドである、［２－１］～［２－１６］のいずれかに記載の方法。
　［２－１８］前記組換えポリペプチドが、糖タンパク質、抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ペプチド、Ｆｃ融合タンパク質、Ｆａｂ断片、タンパク質複合体、ペプチダーゼ、シグナルペプチド、ナノボディ、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、血液因子および酵素からなる群から選択される、［２－１］～［２－１７］のいずれかに記載の方法。
　［２－１９］前記組換えポリペプチドが抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、または二重特異性抗体である、［２－１］～［２－１８］のいずれかに記載の方法。
　［２－２０］前記脊椎動物細胞に、選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを、導入することをさらに含む、［２－１］～［２－１９］のいずれかに記載の方法。
　［２－２１］前記対象のペプチドをコードする前記少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、発現カセット中に含まれる、［２－１］～［２－２０］のいずれかに記載の方法。
　［２－２２］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除された脊椎動物細胞による組換えポリペプチドの生産性が、前記改変を除いて同じ遺伝子型を有する脊椎動物細胞と比較して少なくとも１０％増加している、［２－１］～［２－２１］のいずれかに記載の方法。
　［２－２３］前記組換えポリペプチドの生産性の増加が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除された脊椎動物細胞による前記組換えポリペプチドの生産量の、同一条件下で培養された、前記改変を除いて同じ遺伝子型を有する脊椎動物細胞による組換えポリぺプチドの生産量との比較における、少なくとも１０％の増加である、［２－２２］に記載の方法。
　［２－２４］前記組換えポリペプチドの生産性の増加が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除された脊椎動物細胞の培地における前記組換えポリペプチドの力価の、同一条件下で培養された、前記改変を除いて同じ遺伝子型を有する脊椎動物細胞の培地における組換えポリぺプチドの力価との比較における、少なくとも１０％の増加である、［２－２２］または［２－２３］に記載の方法。
　［２－２５］脊椎動物細胞が、検出可能なレベルのｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子を発現しない、［２－１］～［２－２４］のいずれかに記載の方法。
　［２－２６］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現の低減または排除がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される、［２－１］～［２－２５］のいずれかに記載の方法。
　［２－２７］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現のは排除が、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入前、または導入後の遺伝子ノックアウトにより行われる、［２－１］～［２－２６］のいずれかに記載の方法。
　［２－２８］前記脊椎動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、
　前記組換えポリペプチドがＩｇＧ抗体であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、
［２－１］～［２－１１］、［２－１３］～［２－２７］のいずれかに記載の方法。
　［２－２９］脊椎動物細胞において組換えポリペプチドの生産性を増加させる方法であって、
　脊椎動物細胞においてｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除するように改変された組換え脊椎動物細胞を調製することを含み、
　同じ条件下で培養された、前記改変を除いて同一の遺伝子型を有する脊椎動物細胞と比較して、同じ条件下での培養において組換えポリペプチドの生産性が増加し、
　前記脊椎動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、
　前記組換えポリペプチドがＩｇＧ抗体であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、方法。
　［２－３０］前記組換えポリペプチドの生産性の増加が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除された脊椎動物細胞の培地における前記組換えポリペプチドの抗体分泌速度の、同一条件下で培養された、前記改変を除いて同じ遺伝子型を有する脊椎動物細胞の培地における組換えポリぺプチドの抗体分泌速度との比較における、少なくとも１０％の増加である、［２－２２］または［２－２３］に記載の方法。
　［３－１］［１－１］～［１－２９］のいずれかに記載の脊椎動物細胞を製造するための方法であって、
　脊椎動物細胞において前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変された組換え脊椎動物細胞を調製すること、および
　前記脊椎動物細胞に、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入すること
を含み、前記脊椎動物細胞において前記組換えポリペプチドが発現する、方法。
　［３－２］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現の低減または排除がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される、［３－１］に記載の方法。
　［３－３］遺伝子ノックアウトが、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入前、または導入後に行われる、［３－１］または［３－２］に記載の方法。
　［３－４］脊椎動物細胞において前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変された組換え脊椎動物細胞を調製すること、および
　前記脊椎動物細胞に、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入すること
を含み、前記脊椎動物細胞において前記組換えポリペプチドが発現する、脊椎動物細胞を製造するための方法であって、
　前記脊椎動物細胞が、組換えポリペプチドの製造に使用するための、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変されている、遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞であり、
　前記脊椎動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、
　前記組換えポリペプチドがＩｇＧ抗体であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、方法。
　［４－１］組換えポリペプチドを製造するための方法であって、
　　（ａ）前記組換えポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、［１－１］～［１－２９］のいずれかに記載の脊椎動物細胞を培養すること、および
　　（ｂ）前記細胞培養培地から前記組換えポリペプチドを単離すること、
を含む、方法。
　［４－２］（ｃ）前記単離された組換えポリペプチドをプロセシングすることをさらに含む、［４－１］に記載の方法。
　［４－３］組換えポリペプチドを製造するための方法であって、
　　（ａ）前記組換えポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、脊椎動物細胞を培養すること、および
　　（ｂ）前記細胞培養培地から前記組換えポリペプチドを単離すること
を含み、
　前記単離された組換えポリペプチドをプロセシングすることを含んでもよく、
　前記脊椎動物細胞が、組換えポリペプチドの製造に使用するための、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変されている、遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞であり、
　前記脊椎動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、
　前記組換えポリペプチドがＩｇＧ抗体であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、方法。
　［５－１］ＣＨＯ細胞培養により培地中に得られる抗体の力価を増加させる方法であって、
　ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除するように改変された組換えＣＨＯ細胞を調製することを含み、
　前記改変を除いて同一の遺伝子型を有するＣＨＯ細胞を用いて同じ条件下で培養を行った場合と比較して、ＣＨＯ細胞の培地における抗体の力価が増加する、方法。
　［５－２］遺伝子ノックアウト、遺伝子改変、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたはそれらの組み合わせによって、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除される、［５－１］に記載の方法。
　［５－３］ヘテロ接合性ノックアウトまたはホモ接合性ノックアウトにより、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が排除される、［５－１］または［５－２］に記載の方法。
　［５－４］前記ＣＨＯ細胞に、抗体をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを導入することを含む、［５－１］～［５－３］のいずれかに記載の方法。
　［５－５］前記ＣＨＯ細胞のゲノムが、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除するように改変される、［５－１］～［５－４］のいずれかに記載の方法。
　［５－６］前記ＣＨＯ細胞が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含む、［５－１］～［５－５］のいずれかに記載の方法。
　［５－７］前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変である、［５－６］に記載の方法。
　［５－８］改変後の内因性ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子のアミノ酸配列が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子参照タンパク質として配列番号１～４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、［５－１］～［５－７］のいずれかに記載の方法。
　［５－９］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＰＡＴ１、ＳＣＤ６、ＥＤＣ３、またはＤＨＨ１である、［５－１］～［５－８］のいずれかに記載の方法。
　［５－１０］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、［５－１］～［５－９］のいずれかに記載の方法。
　［５－１１］前記ＣＨＯ細胞が細胞クローンまたは細胞株として提供される、［５－１］～［５－１０］のいずれかに記載の方法。
　［５－１２］前記抗体が、治療または診断において使用される抗体である、［５－１］～［５－１１］のいずれかに記載の方法。
　［５－１３］前記抗体が、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体または二重特異性抗体である、［５－１］～［５－１２］のいずれかに記載の方法。
　［５－１４］前記ＣＨＯ細胞に、選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを、導入することをさらに含む、［５－１］～［５－１３］のいずれかに記載の方法。
　［５－１５］前記対象のペプチドをコードする前記少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、発現カセット中に含まれる、［５－１］～［５－１４］のいずれかに記載の方法。
　［５－１６］前記改変を除いて同一の遺伝子型を有するＣＨＯ細胞を用いて同じ条件下で培養を行った場合と比較して、ＣＨＯ細胞の培地における抗体の力価が少なくとも１０％増加する、［５－１］～［５－１５］のいずれかに記載の方法。
　［５－１７］ＣＨＯ細胞が、検出可能なレベルのｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子を発現しない、［５－１］～［５－１６］のいずれかに記載の方法。
　［５－１８］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現の低減または排除がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される、［５－１］～［５－１７］のいずれかに記載の方法。
　［５－１９］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現の低減または排除が、抗体をコードするポリヌクレオチドの導入前、または導入後の遺伝子ノックアウトにより行われる、［５－１］～［５－１８］のいずれかに記載の方法。
　［５－２０］前記ＣＨＯ細胞が前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、
　前記抗体がＩｇＧ抗体であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、
［５－１］～［５－１９］のいずれかに記載の方法。
　［５－２１］ＣＨＯ細胞培養により培地中に得られる抗体の力価を増加させる方法であって、
　ＣＨＯ細胞においてｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除するように改変されたＣＨＯ細胞を調製することを含み、
　前記改変を除いて同一の遺伝子型を有するＣＨＯ細胞を用いて同じ条件下で培養を行った場合と比較して、ＣＨＯ細胞の培地における抗体の力価が増加し、
　前記ＣＨＯ細胞が前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、
　前記抗体がＩｇＧ抗体であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、方法。
　［６－１］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変されている、遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞。
　［６－２］遺伝子ノックアウト、遺伝子改変、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたはそれらの組み合わせによって、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除される、［６－１］に記載の脊椎動物細胞。
　［６－３］ヘテロ接合性ノックアウトまたはホモ接合性ノックアウトにより、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が排除される、［６－１］または［６－２］に記載の脊椎動物細胞。
　［６－４］前記脊椎動物細胞のゲノムが、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子の機能的発現を低減また排除するように改変されている、［６－１］～［６－３］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－５］前記脊椎動物細胞が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含む、［６－１］～［６－４］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－６］前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変である、［６－５］に記載の脊椎動物細胞。
　［６－７］改変後の内因性ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子のアミノ酸配列が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子参照タンパク質として配列番号１～４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する、［６－１］～［６－６］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－８］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＰＡＴ１、ＳＣＤ６、ＥＤＣ３、またはＤＨＨ１である、［６－１］～［６－７］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－９］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、［６－１］～［６－８］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－１０］前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、［６－１］～［６－９］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－１１］前記脊椎動物細胞がヒト細胞である、［６－１］～［６－１０］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－１２］前記脊椎動物細胞がげっ歯類細胞である、［６－１］～［６－１０］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－１３］前記脊椎動物細胞がハムスター細胞である、［６－１］～［６－１０］および［６－１２］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－１４］前記脊椎動物細胞がＣＨＯ細胞である、［６－１］～［６－１０］、［６－１２］および［６－１３］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－１５］前記脊椎動物細胞が細胞クローンまたは細胞株として提供される哺乳動物細胞である、［６－１］～［６－１４］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－１６］検出可能なレベルのｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子を発現しない、［６－１］～［６－１０］、［６－１２］～［６－１５］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－１７］前記脊椎動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、
［６－１］～［６－１６］のいずれかに記載の脊椎動物細胞。
　［６－１８］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変されている、遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞であって、
　前記脊椎動物細胞が、ＣＨＯ細胞であり、かつ前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、脊椎動物細胞。
　［７－１］ＣＨＯ細胞培養により培地中に得られる抗体の分泌速度を増加させる方法であって、
　ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除するように改変された組換えＣＨＯ細胞を調製することを含み、
　前記改変を除いて同一の遺伝子型を有するＣＨＯ細胞を用いて同じ条件下で培養を行った場合と比較して、ＣＨＯ細胞の培地における抗体の分泌速度が増加する、方法。
　［７－２］遺伝子ノックアウト、遺伝子改変、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたはそれらの組み合わせによって、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除される、［７－１］に記載の方法。
　［７－３］ヘテロ接合性ノックアウトまたはホモ接合性ノックアウトにより、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が排除される、［７－１］または［７－２］に記載の方法。
　［７－４］前記ＣＨＯ細胞に、抗体をコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを導入することを含む、［７－１］～［７－３］のいずれかに記載の方法。
　［７－５］前記ＣＨＯ細胞のゲノムが、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除するように改変される、［７－１］～［７－４］のいずれかに記載の方法。
　［７－６］前記ＣＨＯ細胞が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含む、［７－１］～［７－５］のいずれかに記載の方法。
　［７－７］前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変である、［７－６］に記載の方法。
　［７－８］改変後の内因性ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子のアミノ酸配列が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子参照タンパク質として配列番号１～４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有する、［７－１］～［７－７］のいずれかに記載の方法。
　［７－９］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＰＡＴ１、ＳＣＤ６、ＥＤＣ３、またはＤＨＨ１である、［７－１］～［７－８］のいずれかに記載の方法。
　［７－１０］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、［７－１］～［７－９］のいずれかに記載の方法。
　［７－１１］前記ＣＨＯ細胞が細胞クローンまたは細胞株として提供される、［７－１］～［７－１０］のいずれかに記載の方法。
　［７－１２］前記抗体が、治療または診断において使用される抗体である、［７－１］～［７－１１］のいずれかに記載の方法。
　［７－１３］前記抗体が、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体または二重特異性抗体である、［７－１］～［７－１２］のいずれかに記載の方法。
　［７－１４］前記ＣＨＯ細胞に、選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを、導入することをさらに含む、［７－１］～［７－１３］のいずれかに記載の方法。
　［７－１５］前記対象のペプチドをコードする前記少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、発現カセット中に含まれる、［７－１］～［７－１４］のいずれかに記載の方法。
　［７－１６］前記改変を除いて同一の遺伝子型を有するＣＨＯ細胞を用いて同じ条件下で培養を行った場合と比較して、ＣＨＯ細胞の培地における抗体の分泌速度が少なくとも１０％増加する、［７－１］～［７－１５］のいずれかに記載の方法。
　［７－１７］ＣＨＯ細胞が、検出可能なレベルのｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子を発現しない、［７－１］～［７－１６］のいずれかに記載の方法。
　［７－１８］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現の低減または排除がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される、［７－１］～［７－１７］のいずれかに記載の方法。
　［７－１９］ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現の低減または排除が、抗体をコードするポリヌクレオチドの導入前、または導入後の遺伝子ノックアウトにより行われる、［７－１］～［７－１８］のいずれかに記載の方法。
　［７－２０］前記ＣＨＯ細胞が前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、
　前記抗体がＩｇＧ抗体であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、
［７－１］～［７－１９］のいずれかに記載の方法。
　［７－２１］ＣＨＯ細胞培養により培地中に得られる抗体の分泌速度を増加させる方法であって、
　ＣＨＯ細胞においてｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除するように改変されたＣＨＯ細胞を調製することを含み、
　前記改変を除いて同一の遺伝子型を有するＣＨＯ細胞を用いて同じ条件下で培養を行った場合と比較して、ＣＨＯ細胞の培地における抗体の分泌速度が増加し、
　前記ＣＨＯ細胞が前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含み、前記少なくとも１つの改変が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエクソン中にフレームシフトを生じさせる改変であり、
　前記抗体がＩｇＧ抗体であり、かつ
　前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、方法。
図１はＳＯＦ１０の重鎖及び軽鎖を結合させてハイグロマイシン耐性遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだプラスミドの図である。 図２はＲＡＹ１２１の重鎖及び軽鎖を結合させてハイグロマイシン耐性遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだプラスミドの図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　Ｉ．一般的な定義
　本明細書において用語「約」は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。特定の態様では、「約」という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。特定の態様では、「約」という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
　本明細書において「遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞」の用語は、ポリペプチドを発現することができる異種ポリヌクレオチドを含む脊椎動物細胞を意味する。そのような遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞は、そのような細胞の子孫を含む、１つ以上の異種核酸（複数可）が導入された細胞である。したがって、「組換えポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む脊椎動物細胞」という用語は、脊椎動物細胞に組み込まれ、組換えポリペプチドを発現することができる異種ポリヌクレオチドを含む細胞を意味する。本発明の一つの側面において、異種ポリヌクレオチドは脊椎動物細胞のゲノムに導入され、特定の態様では、異種ポリヌクレオチドを含む脊椎動物細胞は、該細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれる異種ポリヌクレオチド配列を含む細胞である。
　本明細書において「遺伝子組換え操作された」の用語は、遺伝子修飾後、例えば、目的の組換えポリペプチドを発現し、該目的の組換えポリペプチドの任意の規模での生産のために使用できるように操作された状態を意味する。
　「遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞」及び「組換えポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む脊椎動物細胞」はどちらも、「形質転換細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。子孫は、例えば、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなくてもよいが、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有している突然変異子孫は、前記用語の技術的範囲に包含される。
　本発明の一態様では脊椎動物細胞において組換えポリペプチドが発現され得る。本明細書において用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合（単数または複数）によって連結されたアミノ酸のポリマーを含む分子を意味する。ポリペプチドは、タンパク質（例えば、５０個を超えるアミノ酸を有する）およびペプチド（例えば、２～４９個のアミノ酸）を含む、任意の長さのポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意の活性、機能またはサイズのタンパク質および／またはペプチドを含み、例えば、抗体、酵素（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ）、受容体、輸送体、細菌および／または内毒素結合タンパク質、構造ポリペプチド、膜結合ポリペプチド、グリコポリペプチド、球状タンパク質、免疫ポリペプチド、毒素、抗生物質、ホルモン、増殖因子、血液因子、ワクチン、ウイルスグリコポリペプチドなどを含み得る。本発明の一態様において発現される組換えポリペプチドはまた、ポリペプチドのサブユニットまたはドメイン、例えば、抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその機能的断片または誘導体などであり得る。用語「組換えポリペプチド」は、文脈に応じて、このような個々のサブユニットまたはドメインまたはそれぞれのサブユニットまたはドメインから構成される最終タンパク質を指し得る。
　本明細書において「組換えポリペプチド」は、それを発現する脊椎動物細胞に対して人工的なポリペプチドを意味し、そのポリペプチドが異なる細胞／生物に由来する天然に存在するポリペプチドであるか、または人工ポリペプチドであるかどうかに依存しない。組換えポリペプチドは特定の細胞に由来せず、それぞれのコードする核酸が、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法によって当該細胞に導入される。組換えポリペプチドは、脊椎動物細胞中に含まれる異種ポリヌクレオチドによってコードされる。宿主の脊椎動物細胞は、組換えポリペプチドをコードする２種以上の異種ポリヌクレオチドを含み得る。宿主の脊椎動物細胞は、組換えポリペプチドを発現または含有する。組換えポリペプチドは、脊椎動物細胞によって細胞培養培地中に分泌され、それから回収、例えば、単離および精製され得る。
　本発明の一態様では、組換えポリペプチドは、抗体などの免疫グロブリン分子である。特定の態様では、抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特性抗体である。本発明の一態様では、組換えポリペプチドは、多重特異性抗体及び抗体－多量体融合ポリペプチドの群から選択される。本発明の一態様において、組換えポリペプチドは、発現が困難なタンパク質、または複合体および／または非天然構造を有するタンパク質、例えば、次世代生物学的タンパク質、例えば、二重特異性抗体、融合タンパク質、またはグリコシル化タンパク質でよい。
　本明細書において「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」等の表現は、特に、例えば、トランスフェクションなどの組換え技術の使用によって脊椎動物細胞中に導入されたポリヌクレオチド配列を指す。「ポリヌクレオチド」は、通常、１つのデオキシリボースまたはリボースから別のものに連結されるヌクレオチドのポリマーを特に指し、文脈によってＤＮＡならびにＲＮＡを指す。用語「ポリヌクレオチド」は、何らかのサイズ制限を含まない。
　本明細書において「単離された」ポリペプチドまたは抗体とは、それらが存在する天然環境に含まれる成分から分離されたポリペプチド分子又は抗体分子を意味する。
　本明細書において用語「組込み部位」は、異種ポリヌクレオチドが細胞ゲノム内に挿入される際の細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。本発明の一態様において、組込み部位は、細胞ゲノム中の隣り合う２つのヌクレオチドの間にある。本発明の一態様において、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。本発明の一態様において、組込み部位は、脊椎動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。本発明の一態様において、組込み部位は、脊椎動物細胞の内因性遺伝子内にある。
　本明細書において用語「ベクター」又は「プラスミド」は、同義的に用いることができ、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
　本明細書において、用語「選択マーカー」は、その遺伝子を有する細胞が、対応する選択剤の存在下でポジティブ又はネガティブに特異的に選択されることを可能にする遺伝子を意味する。例えば、限定するわけではないが、選択マーカーにより、その選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、各選択剤の存在下（選択的培養条件下）で、ポジティブに選択されることが可能になり得る。また、形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下で増殖することも生存することもできないと考えられる。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、又は二機能性であってよい。ポジティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞の選択が可能になり得るのに対し、ネガティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞を選択的に排除することが可能になり得る。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、又は代謝若しくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ））の遺伝子、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号及び国際公開第９４／２８１４３号に記載されている。
　対応する選択剤の存在下での選択を容易にすることを超えて、選択マーカーは、別法として、普通は細胞に存在しない分子、例えば、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅであってよい。例えば、コードされるポリペプチドが発する蛍光の検出又は不在にそれぞれ基づいて、そのような分子を発現する細胞を、この遺伝子を内部に持たない細胞と区別することができる。
　本明細書において用語「内因性」とは、細胞に由来するヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列に基づく産物を意味する。産物は、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子であってもよい。
　ＩＩ．遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞
　本発明の一態様において、脊椎動物細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞であり、例えば、げっ歯類細胞、ヒト細胞およびサル細胞からなる群から選択され得る。好ましい脊椎動物細胞は、例えば、ハムスターまたはマウスに由来する細胞などのげっ歯類細胞である。げっ歯類細胞は、チャイニーズハムスター細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株など）、ＢＨＫ細胞株、ＮＳ０細胞株、Ｃ１２７細胞株、マウス３Ｔ３線維芽細胞株およびＳＰ２／０細胞株からなる群から選択される細胞株であり得る。ＣＨＯ－Ｋ１由来ＣＨＯ細胞などのＣＨＯ細胞が特に好ましい。ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子は、ヒト細胞において発現される。したがって、本発明の一態様において、脊椎動物細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、造血細胞およびＨｅＬａ細胞からなる群から選択され得るヒト細胞に由来する。別の代替物として、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７細胞およびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択され得るサル細胞がある。一態様によれば、脊椎動物細胞は、細胞クローン、細胞株または細胞培養物として提供される。
　本明細書において用語「宿主細胞」とは、組換えポリペプチドを発現するために使用される、異種ポリヌクレオチドを導入した細胞を意味する。本発明の一つの側面において「脊椎動物細胞」を「宿主細胞」として使用することができ、「脊椎動物細胞」としては組換えＤＮＡ技術を使用するバイオ製品の産生において一般的に使用される哺乳動物細胞を例示することができる。
　本発明の一態様において、脊椎動物細胞は、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＤＧ４４等）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、リンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）、又はヒト羊膜細胞（例えば、ＣＡＰ－Ｔ等）である。好ましい一態様では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。
　本発明の一態様において、細胞は幹細胞である。一つの側面において、細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれかの分化形態である。一つの側面において、細胞は、培養中の任意の一次細胞に由来する細胞である。
　本明細書において「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」との用語は、全て細胞子孫を包含する概念をしめすものとして使用される。例えば、ＣＨＯ細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞の細胞子孫であり、任意の数の世代によって元の初代細胞親から除去され得、形質転換子孫細胞も含み得る。形質転換体及び形質転換細胞には、導入の回数に関係なく、初代対象細胞及びそれに由来する培養物が含まれる。また、全ての子孫が、意図的又は偶発的な変異のために、ＤＮＡ含有量が正確に同一でない場合があることも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。
　本発明の一態様において、用いる培地液用の成分としては、通常、細胞（好ましくは、動物細胞）培地で使用される各成分が適宜使用できるが、これらにはアミノ酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調整剤、鉄源、pH緩衝剤を含む。上記成分のほか、例えば、微量金属元素、界面活性剤、増殖補助因子、ヌクレオチドを添加してもよい。
　具体的には、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－オルニチン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン等、好ましくはＬ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン等のアミノ酸類；ｉ－イノシトール、ビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチンアミド、ニコチン酸、p-アミノ安息香酸、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等、好ましくはビオチン、葉酸、リポ酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、塩酸ピリドキサール、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンB12、アスコルビン酸等のビタミン類；塩化コリン、酒石酸コリン、リノール酸、オレイン酸、コレステロール等、好ましくは塩化コリン等の脂質因子；グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース等、好ましくはグルコース等のエネルギー源；塩化ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム等、好ましくは塩化ナトリウム等の浸透圧調節剤；EDTA鉄、クエン酸鉄、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄等、好ましくは塩化第二鉄、EDTA鉄、クエン酸鉄等の鉄源類；炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、HEPES、MOPS等、好ましくは炭酸水素ナトリウム等のpH緩衝液を含む培地を例示できる。
　上記成分のほか、例えば、硫酸銅、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、塩化ニッケル、塩化スズ、塩化マグネシウム、亜ケイ酸ナトリウム等、好ましくは硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム等の微量金属元素；Tween80、プルロニック（登録商標）F68等の界面活性剤；および組換え型インシュリン、組換え型IGF、組換え型EGF、組換え型FGF、組換え型PDGF、組換え型TGF-α、塩酸エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、レチノイン酸、塩酸プトレッシン等、好ましくは亜セレン酸ナトリウム、塩酸エタノールアミン、組換え型IGF、塩酸プトレッシン等の増殖補助因子；デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン等のヌクレオシドなどを添加してもよい。なお上記本発明の好適例においては、ストレプトマイシン、ペニシリンGカリウム及びゲンタマイシン等の抗生物質や、フェノールレッド等のpH指示薬を含んでいてもよい。
　また、培地中のその他の成分の含量は、アミノ酸は0.05－1500mg/mL、ビタミン類は0.001－10mg/mL、脂質因子は0－200mg/mL、エネルギー源は1－20g/mL、浸透圧調節剤は0.1－10000mg/mL、鉄源は0.1－500mg/mL、pH緩衝剤は1－10000mg/mL、微量金属元素は0.00001－200mg/mL、界面活性剤は0－5000mg/mL、増殖補助因子は0.05－10000μg/mLおよびヌクレオシドは0.001－50mg/mLの範囲が適当であり、培養する細胞の種類、所望のタンパク質の種類などより適宜決定出来る。
　培地のpHは培養する細胞により異なるが、一般的にはpH6.8～7.6、多くの場合pH7.0～7.4が適当である。
　本発明の一態様において、培養方法は特に限定されることなく種々の脊椎動物細胞の培養に使用できる。例えば、遺伝子工学的操作によって所望のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだCOS細胞やCHO細胞、あるいは、抗体を産生するマウス－ヒト、マウス－マウス、マウス－ラット等のハイブリドーマに代表される融合細胞を培養することが可能である。本発明の方法は、脊椎動物細胞を培養して該脊椎動物細胞の産生する天然型タンパク質を得ようとする場合にも使用でき、上述した細胞の他に、BHK細胞、HeLa細胞などの培養にも使用できる。
　本発明の一態様において、宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
　本発明の一態様において、脊椎動物細胞のタンパク質の産生は、単にそれを培養するのみで良いものおよび特殊な操作を必要とするものを含み、それらの操作又は条件等は培養する脊椎動物細胞により適宜決定すればよい。例えば、遺伝子工学操作によりマウス－ヒトキメラ抗体をコードする遺伝子を含むベクターでトランスフォームされたCHO細胞では、後述の条件下で抗体を培地中に得ることができる。これを定法（例えば、抗体工学入門、地人書館、p.102-104；Affinity Chromatography Principles & Methods、アマシャム ファルマシア バイテク（株）、p. 56 －60など参照）に従い単離、精製することによって、所望のタンパク質を得ることができる。
　本発明の一態様において、培養条件は使用する細胞の種類によって適宜好適な条件を決定すればよい。例えばCHO細胞であれば通常、気相のCO2濃度が0－40%、好ましくは、2－10%の雰囲気下、30－39℃、好ましくは、37℃程度で、1－14日間培養すればよい。
　また、動物細胞培養用の各種培養装置としては、例えば発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填層型培養装置等を用いて培養することができる。
　本発明の一態様において動物培養細胞から培地中に分泌されるタンパク質はその培養液から常用の方法で回収できる。あるいは、タンパク質は宿主細胞の細胞溶解物からも常用の方法で回収することができる。具体的には、所望のタンパク質の回収は、細胞培養液または細胞溶解物を遠心等により、細胞および細胞の破片を除去した後に、一般的なタンパク質の単離・精製技術を適用して行うことができる。すなわち、塩析法（例えば、硫酸アンモニウム分画法）、アルコール沈殿法（例えば、エタノール沈殿）、ＰＥＧ法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、超遠心法、ゲルろ過法、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィなどが用いられる。所望のタンパク質が抗体である場合、プロテインＡクロマトグラフィーが好適に用いられるが、これに限定されない。さらに、アフィニティを利用した様々な分離または分画法を用いることで、抗体を免疫グロブリンのクラスに分ける、または抗原結合性により分取することができる。
　ｍＲＮＡ翻訳および分解の制御は、翻訳を阻害してデキャッピングを促進すると同時にプロセシング体（Ｐ体）と呼ばれる細胞質ｍＲＮＡ顆粒の構築に作用するタンパク質によって媒介される。ｍＲＮＡデキャッピングタンパク質として、Ｐａｔ１、Ｓｃｄ６、Ｅｄｃ３およびＤｈｈ１が知られている。
　本発明の一態様において遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞は、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子を内因性に発現する、改変されていない脊椎動物細胞と比較して、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変されている。本発明の一態様において、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除する場合、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子を内因性に発現する、改変されていない脊椎動物細胞と比較して、タンパク質の発現量が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％減少し、好ましくは１００％減少する。タンパク質の発現量は既知の方法により測定可能であり、例えば、ウエスタンブロッティングによって測定可能である。
　安定な、均一な、したがって、予測可能な特徴を有する製造細胞株を提供するために、脊椎動物細胞のゲノムを変更して、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除させることが好ましい。遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞は、組換えポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、組換えポリペプチドを細胞培養培地中に分泌する、本開示の宿主細胞を提供するように、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされ得る。
　本発明の一態様において、細胞においてｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現は、「遺伝子ノックアウト」によって排除される。遺伝子ノックアウトは、遺伝子が、その機能を破壊することによって無効にされる遺伝子技術である。例えば、核酸が、コード配列中に挿入され、それによって遺伝子機能が破壊され得る。さらに、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子またはその一部が欠失し、それによって、個々に変更された細胞によって、タンパク質が発現されない、または機能的タンパク質が発現されないこともある。別の選択肢は、コード配列中に、１つまたは複数のノックアウト変異を導入することである。あるいは、本発明の一態様において、コード配列中に１つまたは複数の停止コドンが導入され得る。したがって、本発明の一態様において、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子は、遺伝子の発現を低減または排除させる、１つまたは複数の変異を含む。本発明の一態様において、前記１つまたは複数の変異は、フレームシフトまたは停止コドン変異である。標的遺伝子の機能的発現を抑制または排除する遺伝子ノックアウトを達成するための方法もまた、当業者に周知であり、したがって、本明細書において何らかの詳細な説明を必要としない。
　本発明の一態様において、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子は、遺伝子工学によって機能的にノックアウトされる。例えば、組換えヌクレアーゼを用いるゲノム編集（ＧＥＥＮ）などのゲノム編集が挙げられる。これは、組換えヌクレアーゼまたは「分子ハサミ」を使用して、ＤＮＡが挿入され、置換されるか、またはゲノムから除去される遺伝子工学の１種である。ヌクレアーゼは、ゲノム中の所望の位置で特定の二本鎖切断（ＤＳＢ）を創出し、相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然プロセスによって誘導された切断を修復するための細胞の内因性機序を利用する。この目的のために使用することができる組換えヌクレアーゼとして少なくとも４種のファミリーが知られている：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）を認識するヌクレアーゼおよびエ組換えメガヌクレアーゼによってリエンジニアリングされたホーミングエンドヌクレアーゼ。本発明の一態様において、内因性遺伝子の低減又は排除又はノックアウトは、ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムによって媒介される。ヌクレアーゼ支援遺伝子ターゲティングシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼからなる群から選択される。本発明の一態様において、内因性遺伝子のノックアウトは、ｉ）組換えポリペプチドをコードする異種核酸の導入前、又はｉｉ）組換えポリペプチドをコードする異種核酸の導入後に行われる。
　本発明の一態様において、遺伝子ノックアウトはヘテロ接合性ノックアウトまたはホモ接合性ノックアウトである。
　本発明の一態様において、「遺伝子欠失」は、遺伝子から、または遺伝子に近接したＤＮＡ配列の少なくとも一部を除去することを指す。いくつかの態様では、遺伝子欠失に供される配列は、遺伝子のエクソン配列を含む。いくつかの態様では、遺伝子欠失に供される配列は、遺伝子のプロモーター配列を含む。いくつかの態様では、遺伝子欠失に供される配列は、遺伝子の隣接配列を含む。
　本発明の一態様において、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子は配列番号１～４に示されるアミノ酸配列を有する。
　本発明の一態様において、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子はＰＡＴ１、ＳＣＤ６、ＥＤＣ３、またはＤＨＨ１が挙げられる。ＰＡＴ１、ＳＣＤ６、ＥＤＣ３、およびＤＨＨ１は、ｍＲＮＡ脱キャッピング酵素と結合する。
　ＩＩＩ．抗体
　本発明の一態様において、遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞によって組換えポリペプチドが製造される。一つの側面において、組換えポリペプチドは抗体である。
　本明細書において、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ら，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔら、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈｅｄ．、ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０ページを参照されたい）は、カッパアイソタイプ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、ＫａｂａｔＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３ページを参照されたい）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３であって、本明細書では、この場合には、「ＫａｂａｔＥＵインデックスによるナンバリング」と称することによってさらに明確にしている）に使用される。
　本明細書において「抗体」という用語は、最も広義に使用され、全長抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体－抗体断片－融合物並びにそれらの組み合わせを含む様々な抗体構造を包含するが、これらに限定されない。
　本明細書において「天然抗体」という用語は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）とそれに続く３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有し、それにより、第１の重鎖定常ドメインと第２の重鎖定常ドメインとの間にヒンジ領域が配置される。同様に、ＮからＣ末端に、各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）とそれに続く軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
　本明細書において「完全長抗体」という用語は、天然抗体の構造と実質的に類似した構造を有する抗体を意味する。完全長抗体は、それぞれがＮ末端からＣ末端の方向に、軽鎖可変領域及び軽鎖定常ドメインを含む２つの完全長抗体軽鎖、並びにそれぞれがＮ末端からＣ末端の方向に、重鎖可変領域、第１の重鎖定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の重鎖定常ドメイン、及び第３の重鎖定常ドメインを含む、２つの完全長抗体重鎖を含む。天然抗体とは対照的に、全長抗体は、１つ若しくは複数の追加のｓｃＦｖ、又は重鎖若しくは軽鎖Ｆａｂ断片、又は、全長抗体の異なる鎖の１つ若しくは複数の末端にコンジュゲートしているが各末端には１つの断片のみであるｓｃＦａｂなどのさらなる免疫グロブリンドメインを含んでもよい。これらのコンジュゲートもまた、完全長抗体という用語により包含される。
　本明細書において「抗体結合部位」という用語は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの対を意味する。抗原への適切な結合を確実にするために、これらの可変ドメインは同族の可変ドメインであり、すなわち一緒に属する。抗体の結合部位は、少なくとも３つのＨＶＲ（例えば、ＶＨＨの場合）又は３～６つのＨＶＲ（例えば、天然に存在する、すなわち、ＶＨ／ＶＬペアを有する従来の抗体の場合）を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成している。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと対応する抗体軽鎖可変ドメインのペアに含まれる。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ＮからＣ末端に向けて、領域ＦＲ１、ＨＶＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、ＨＶＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖可変ドメインのＨＶＲ３領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、特定の態様では結合アッセイにおいて、その標的への結合部位の結合を表す。そのような結合アッセイは、結合イベントが検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。例えば、抗体を表面に結合させ、該抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、結合アッセイである。あるいは、ブリッジングＥＬＩＳＡを使用することができる。
　本明細書において「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、超可変的な配列（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）であり、及び／又は構造的に定義されるループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有するアミノ酸残基ストレッチを含む、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、重鎖可変ドメインＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、軽鎖可変ドメインＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。
　別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従ってナンバリングされている。
　本明細書において抗体の「クラス」は、定常ドメイン又は定常領域、好ましくは重鎖が持つＦｃ領域の種類を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかを、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
　本明細書において「重鎖定常領域」という用語は、定常ドメイン、すなわち、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖の領域を意味する。特定の態様では、ヒトＩｇＧ定常領域は、重鎖のＡｌａ１１８からカルボキシル末端に及ぶ（ナンバリングはＫａｂａｔＥＵインデックスに従う）。しかし、定常領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、又は存在していなくてもよい（ナンバリングはＫａｂａｔＥＵインデックスに従う）。「定常領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖定常領域を含む二量体を意味する。
　本明細書において「重鎖Ｆｃ領域」という用語は、少なくともヒンジ領域の一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。特定の態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ａｓｐ２２１又はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に及ぶ（ナンバリングはＫａｂａｔＥＵインデックスに従う）。したがって、Ｆｃ領域は定常領域よりも小さいが、Ｃ末端部分はそれと同一である。しかしながら、重鎖Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよく、又は存在しなくてもよい（ＫａｂａｔＥＵインデックスによるナンバリング）。「Ｆｃ領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合することができる２つの重鎖Ｆｃ領域を含む二量体を意味する。
　抗体の定常領域、より正確にはＦｃ領域（及び同様に定常領域）は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化、及びＦｃ受容体結合に直接関与している。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における規定の結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０、Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．及びＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ２８８（１９８０）３３８－３４４、Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４、Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１－１２１６８、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８６（１９９５）３１９－３２４、及びＥＰ０３０７４３４において記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、及びＣ３活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑと結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて規定される。
　本明細書で用語「Ｆｃ領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のＦｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。一態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（Ｌｙｓ４４７）またはグリシン‐リジン（Ｇｌｙ４４６－Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ　Ｅｄ．　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ１９９１に記載の、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
　Ｆｃ領域変異体
　特定の態様において、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸修飾を導入して、それによりＦｃ領域変異体を生成してもよい。Ｆｃ領域変異体は、１つまたは複数のアミノ酸ポジションのところでアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
　特定の態様において、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を備える抗体変異体も、本発明の考慮の内であり、当該エフェクター機能は、抗体を、そのインビボでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣなど）は不要または有害である場合の適用に望ましい候補とするものである。ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の減少／欠乏を確認するために、インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害測定を行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合測定は、抗体がＦｃγＲ結合性を欠く（よってＡＤＣＣ活性を欠く蓋然性が高い）一方でＦｃＲｎ結合能を維持することを確かめるために行われ得る。ＡＤＣＣを媒介するプライマリ細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ　ａｎｄ　Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の第４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロ測定法（アッセイ）の非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９－７０６３（１９８６）参照）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）参照）に記載されている。あるいは、非放射性の測定法を用いてもよい（例えば、ＡＣＴ１（商標）ｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｉｎｃ．　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；および、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）ｎｏｎ－ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｓｓａｙｓ法（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）参照）。このような測定法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２－６５６（１９９８）に記載されるような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。また、抗体がＣ１ｑに結合できないこと、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合測定を行ってもよい。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。また、補体活性化を評価するために、ＣＤＣ測定を行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５－１０５２（２００３）；およびＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．　ａｎｄ　Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ１０３：２７３８－２７４３（２００４）参照）。さらに、ＦｃＲｎ結合性およびインビボでのクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野において知られた方法を用いて行い得る（例えばＰｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）参照）。
　減少したエフェクター機能を伴う抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９の１つまたは複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を伴ういわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、アミノ酸ポジション２６５、２６９、２７０、２９７、および３２７の２つ以上の置換を伴うＦｃ変異体を含む。
　ＦｃＲｓへの増加または減少した結合性を伴う特定の抗体変異体が、記述されている。（米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照のこと。）
　特定の態様において、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、Ｆｃ領域のポジション２９８、３３３、および／または３３４（ＥＵナンバリングでの残基）のところでの置換）を伴うＦｃ領域を含む。
　いくつかの態様において、例えば米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるように、改変された（つまり、増加したか減少したかのいずれかである）Ｃ１ｑ結合性および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす改変が、Ｆｃ領域においてなされる。
　増加した半減期、および新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ：母体のＩｇＧ類を胎児に移行させる役割を負う（Ｇｕｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）　ａｎｄ　Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）））に対する増加した結合性を伴う抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合性を増加する１つまたは複数の置換をその中に伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４の１つまたは複数のところでの置換（例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号））を伴うものを含む。
　Ｆｃ領域変異体の他の例については、Ｄｕｎｃａｎ　＆　Ｗｉｎｔｅｒ，　Ｎａｔｕｒｅ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１も参照のこと。
　本明細書において「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を意味する。集団を構成する個々の抗体は、同一であるか、または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない種々の技術によって作製されてもよい。
　本明細書において「価数」との用語は、本出願で使用される場合、抗体内の特定数の結合部位の存在を示す。したがって、「二価」、「四価」及び「六価」との用語は、抗体内のそれぞれ２個の結合部位、４個の結合部位及び６個の結合部位の存在を示す。
　本明細書において「単一特異性抗体」は、単一の結合特異性を有する、すなわち、１つの抗原に特異的に結合する抗体を意味する。単一特異性抗体を、全長抗体若しくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）又はそれらの組合せ（例えば、全長抗体と追加のｓｃＦｖ又はＦａｂ断片）として調製することができる。単一特異性抗体は、一価である必要はない。すなわち、単一特異性抗体は、１つの抗原に特異的に結合する１つを超える結合部位を含んでもよい。例えば、天然抗体は、単一特異性であるが二価である。
　本明細書において「多重特異性抗体」は、同じ抗原又は２つの異なる抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を表す。多重特異性抗体を、全長抗体若しくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）又はそれらの組合せ（例えば、全長抗体と追加のｓｃＦｖ又はＦａｂ断片）として調製することができる。多重特異性抗体は、少なくとも二価であり、すなわち、２つの抗原結合部位を含む。さらに、多重特異性抗体は、少なくとも二重特異性である。したがって、二価の二重特異性抗体は、多重特異性抗体の最も単純な形態である。２つ、３つ又はより多く（例えば、４つ）の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体が報告されている（例えば、ＵＳ２００２／０００４５８７を参照）。
　本発明の一態様において、抗体は、多重特異性抗体、例えば、少なくとも二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原又はエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、結合特異性の１つは第一の抗原に対するものであり、他は、異なる第二の抗原に対するものである。ある特定の態様では、多重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体を使用して、抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させることもできる。
　多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体－抗体断片－融合物として調製することができる。
　多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．及びＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ３０５（１９８３）５３７－５４０、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら、ＥＭＢＯＪ．１０（１９９１）３６５５－３６５９を参照されたい）、及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の改変（国際公開第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４６７６９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９（１９８５）８１－８３を参照のこと）；ロイシンジッパーを使用した二重特異的抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１５４７－１５５３を参照のこと）；軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用（例えば国際公開第９８／５０４３１号を参照のこと）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（１９９３）６４４４－６４４８を参照のこと）；及び、例えばＴｕｔｔ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）６０－６９に記載されている三重特異的抗体の調製により作製することができる。
　例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１１２１９３、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２、及びＷＯ２０１３／０２６８３１に見出すことができる。二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、「二重作用Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」もまた含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照のこと）。
　多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）又は完全なＦａｂアーム（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０８（２０１１）１１８７－１１９１、及びＫｌｅｉｎｅｔａｌ．，ＭＡｂｓ８（２０１６）１０１０－１０２０も参照）を交換することによっても提供され得る。一態様では、多重特異性抗体はクロスＦａｂ断片を含む。「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域１（ＣＨ１）とで構成されるポリペプチド鎖、及び重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸突然変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、ＷＯ２０１６／１７２４８５を参照。
　本発明の一態様において、抗体又は断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号又は国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載されている多重特異性抗体であり得る。
　本発明の一態様において、抗体又はその断片はまた、ＷＯ２０１２／１６３５２０に開示されるような多重特異性抗体であってもよい。
　多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）９５－１０６を参照のこと）。
　二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の２つの異なる重複しないエピトープ又は異なる抗原上の２つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。
　「ノブ・イントゥー・ホール」二量体化モジュール及び抗体操作におけるその使用は、ＣａｒｔｅｒＰ．；ＲｉｄｇｗａｙＪ．Ｂ．Ｂ．；ＰｒｅｓｔａＬ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ２，Ｎｕｍｂｅｒ１，Ｆｅｂｒｕａｒｙ１９９６，ｐｐ．７３－７３（１）に記載されている。
　抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変することができる。例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；及びＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１に、いくつかの例を伴って詳細に記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変して、これら２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、他方は「ホール」である。ジスルフィドブリッジの導入はさらに、ヘテロ二量体を安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）、収率を増加させる。
　（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｗは、「ノブ変異」又は「変異ノブ」として表され、（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは、「ホール変異」又は「変異ホール」として表される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）も、例えば、「ノブ変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ変異を導入（「ノブ－ｃｙｓ－変異」又は「変異ノブ－ｃｙｓ」と表記）すること、及び「ホール変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を導入（「ホール－ｃｙｓ－変異」又は「変異ホール－ｃｙｓ」と表記）することにより、使用できる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）。
　「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片とその対応する同族の抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体Ｆａｂ（断片－抗原結合）において、少なくとも１つの重鎖ドメインが、その対応する軽鎖ドメインによって置換されており、その逆も同様である、という点について、ドメイン配列が天然抗体の配列から逸脱していることを表す。ドメインクロスオーバーは、一般的に３種類あり、（ｉ）ＣＨ１及びＣＬドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列（又はＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する全長抗体重鎖）がもたらされるもの、（ｉｉ）ＶＨ及びＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされるもの、並びに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）及び完全なＶＨ－ＣＨ１重鎖断片のドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＬドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの（上述のすべてのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）がある。
　本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、並びに結果として生じる重鎖及び軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨ及びＶＬが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、かつＶＨ及びＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．，ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０８（２０１１）１１１８７－１１１９２において報告されている。このような抗体は、一般にＣｒｏｓｓＭａｂと呼ばれる。
　多重特異性抗体はまた、一態様では、上記の項目（ｉ）で述べたＣＨ１及びＣＬドメインのドメインクロスオーバー、又は上記の項目（ｉｉ）で述べたＶＨ及びＶＬドメインのドメインクロスオーバー、又は上記の項目（ｉｉｉ）で述べたＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＶＬドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも１つのＦａｂ断片を含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原に特異的に結合するＦａｂは、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う１つを超えるＦａｂが、多重特異性抗体に含まれる場合、Ｆａｂは、同じ抗原に特異的に結合する。
　本明細書において「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基、及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を意味する。本発明の一態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、そこで、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
　「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え細胞などの組換え手段により調製、発現、作製又は単離された全ての抗体（キメラ、ヒト化及びヒト）を表す。これには、ＮＳ０、ＨＥＫ、ＢＨＫ、羊膜細胞、ＣＨＯ細胞などの組換え細胞から単離された抗体が含まれる。
　本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的な断片である。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ又はｓｃＦａｂ）が挙げられる。
　ＩＶ．組換えポリペプチドの製造方法
　本発明の一態様では、組換えポリペプチドを製造する方法であって、組換えポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、組換えポリペプチドの発現に好適な条件下で培養することと、任意に、組換えポリペプチドを宿主細胞（又は宿主細胞培養物）から回収することとを含む、方法が提供される。
　組換えポリペプチド、例えば組換え抗体の産生に関しては、例えば、上述の組換えポリペプチドをコードする核酸が単離され、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞内での発現のために、一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて配列決定することができる。
　通常、例えば治療用抗体のような組換えポリペプチドの大量生産のためには、該ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。この細胞は、「組換え細胞」又は「組換え生産細胞」と呼ばれ、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第１の工程において、例えばＣＨＯ細胞等の適切な宿主細胞に、当該組換えポリペプチドの発現に適した核酸配列をトランスフェクトする。第２の工程において、組換えポリペプチドを安定に発現する細胞を、組換えポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。
　ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は、純粋なコード情報である。したがって、その発現にはさらなる調節エレメントが必要である。したがって、通常、構造遺伝子はいわゆる発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の制御エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち５’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、及び構造遺伝子の下流、すなわち３’側に位置する、当該哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター配列、構造遺伝子配列、及びポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で並べられる。
　組換えポリペプチドが、異なる（単量体）ポリペプチド、例えば、抗体又は複合体抗体フォーマットなどから構成されるヘテロ多量体ポリペプチドである場合、単一の発現カセットが必要であるだけでなく、含まれる構造遺伝子が異なる多数の発現カセット、すなわち、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なる（単量体）ポリペプチドのそれぞれに対して少なくとも１つの発現カセットが必要である。例えば、全長抗体は、軽鎖の２個のコピー及び重鎖の２個のコピーを含むヘテロ多量体ポリペプチドである。したがって、全長抗体は、２つの異なるポリペプチドから構成される。したがって、全長抗体の発現のためには２つの発現カセット、すなわち軽鎖のための１個及び重鎖のための１個が必要とされる。例えば、完全長抗体が二重特異性抗体である場合、すなわち、抗体が２つの異なる抗原に特異的に結合する２つの異なる結合部位を含む場合、２つの軽鎖並びに２つの重鎖もまた互いに異なる。したがって、このような二重特異性完全長抗体は、４つの異なるポリペプチドで構成されているため、４つの発現カセットが必要となる。
　組換えポリペプチドのための発現カセットは、次に、１つ又は複数のいわゆる「発現ベクター」に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で該ベクターを増幅し、かつ含まれる構造遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされるすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合、複製開始点及び原核生物選択マーカー、さらには真核生物選択マーカー、並びに目的の構造遺伝子の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、哺乳動物細胞に発現カセットを導入するための輸送運搬体である。
　多重特異性抗体などの組換えポリペプチドを発現する組換え細胞を生成するための細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的の組換えポリペプチドの発現及び産生に必要なそれぞれの発現カセットを含む核酸のランダム組込み（ＲＩ）又は標的指向性組込み（ＴＩ）のいずれかを使用する。本発明の一態様において、宿主細胞に導入される遺伝子は、限られた期間だけ細胞内に存在する一過性トランスフィクションであることもできる。
　ＲＩを使用すると、一般に、複数のベクター又はその断片が、同一又は異なる遺伝子座で細胞のゲノムに組み込まれる。
　ＴＩを使用すると、一般に、異なる発現カセットを含む導入遺伝子の単一コピーが、宿主細胞のゲノムの所定の「ホットスポット」に組み込まれる。
　本発明の一側面において、本発明で得られた遺伝子組換え操作をした脊椎動物細胞を使用した組換えポリペプチドの効率的な製造とは、例えば、遺伝子組換え操作をされていない脊椎動物細胞を使用した場合と比較して効率的な製造である。ここで、効率的な製造とは、例えば、脊椎動物細胞による組換えポリペプチドの製造における生産性の向上を意味する。
　本発明の一側面において、脊椎動物細胞による組換えポリペプチドの生産性は、例えば、力価、細胞当たりの抗体分泌速度（antibody secretion rate）などの指標によって表される。ここで、生産性は脊椎動物細胞の培養による組換えポリペプチドの生産効率を意味し、個々の細胞における組換えポリペプチドの発現量、および培養における細胞の増殖量などに起因して変動する。
　本発明の一側面において、生産性の増加とは、対照との比較におけるポリペプチドの生産量の増加を意味する。ここで、ポリペプチドの生産量は、精製後に単離されたポリペプチドの重量測定またはＨＰＬＣなどによって測定することができる。本発明の一側面において、ポリペプチドの生産量、例えば、抗体の生産量は、力価または細胞当たりの抗体分泌速度などを測定することによって算出することができる。具体的には、遺伝子改変のない脊椎動物細胞を対照として用いて同一条件下で培養を行った場合の培地における抗体の力価を測定し、抗体の生産量の増加から生産性の増加を算出することができる。
　本発明の一態様において、製造される対象の組換えポリペプチドは、細胞培養培地から単離され、任意選択で、当技術分野で公知の方法によってさらにプロセシングされる。例えば、ポリペプチドは、それだけには限らないが、遠心分離、濾過、限外濾過、抽出または沈殿を含めた従来手順によって栄養培地から収集され得る。精製ステップなどのさらなる処理ステップが、それだけには限らないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、等電点電気泳動、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィーおよびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、分取等電点電気泳動）、差次的溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出を含めた、当技術分野で公知の種々の手順によって実施され得る。さらに、単離された、精製された対象のポリペプチドは、例えば、修飾される、および／または組成物、例えば、医薬組成物に製剤化されるなどさらに処理され得る。
　［実施例１］ノックアウト細胞の調製
　［ＣＨＯ細胞の培養］
　ＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１由来）を含有するバイアルを、３７℃の湯浴中で解凍し、中身を細胞培養培地の入った遠沈管に移した。その後細胞のみを遠心分離によって収集し、細胞培養培地の入ったフラスコに播種して振とう培養した。細胞培養培地中において振とう培養後の細胞培養液の継代培養を行い、３日／４日のスケジュールで細胞培養物の維持及び継代をした。このとき、細胞培養物を、２０ｍＬの維持培地中に２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの播種密度として、培養を開始した。
　［Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体のトランスフェクション］
　１）Ｃａｓ９タンパク質及び２）ＥＤＣ３遺伝子に特異的なガイドＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡをアニーリングさせたものを混合し、Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体を作製した。作製したＣａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体を上記で培養された細胞にエレクトロポレーション法でトランスフェクションし、その後３７℃の温度および５％ＣＯ２ガス下で４日間２．５ｃｍ振幅および１００ｒｐｍの振とう速度で培養した。
　［トランスフェクタントプールのシングルセルクローニングと細胞の拡大］
　トランスフェクタントプールから、ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒ（商標）Ｎａｎｏｗｅｌｌ　Ｐｌａｔｅ　Ｈ１００－１００　３３０Ｋ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　２４ｗｅｌｌ　１００μｍ　ｎａｎｏｗｅｌｌｓ　ｕｎｃｏａｔｅｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いてシングルセルクローニングを行った。Ｎａｎｏｗｅｌｌに細胞を播種し、播種時，１日目，２日目，３日目と細胞の写真撮影を行った。その画像から播種時にシングルセルでかつ３日目までに増殖が見られた細胞を選抜し、播種後４日目で３８４ウェルプレートに拡大した。その後９日間培養を継続し、１３日目に十分に細胞が増殖した状態で全量を９６ウェルプレートに拡大した。
　［ノックアウト細胞の樹立］
　９６ウェルプレートで７日培養後、９６ウェルプレートで一律１０分の１に継代を行い、残った継代元の細胞からそれぞれゲノム抽出を行った。抽出したゲノムを用い、ガイドＲＮＡを設計した付近のゲノム配列をＰＣＲで増幅した。得られたＤＮＡを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）用のライブラリとし、ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）２０００（イルミナ株式会社）を用いてシーケンシングを行った。得られた配列データをリファレンス配列にマッピングし、ゲノム編集によるフレームシフトが起こっているかどうか確認した。フレームシフトが確認できた細胞のみをピックアップし、ノックアウト細胞を取得した。
　〔実施例２〕発現ベクターの作製
　ＩｇＧ１抗体（抗体Ａ：ＳＯＦ１０，抗体Ｂ：ＲＡＹ１２１）について、各抗体の重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）の遺伝子のそれぞれ上流にＣＡＧプロモーターを結合し、更に下流にＲａｂｂｉｔ　ｂｅｔａ　ｇｌｏｂｉｎ（ｒＢＧ）ｐｏｌｙＡシグナル配列を結合した抗体遺伝子発現ユニットを作成した。
　作成された抗体遺伝子発現ユニットを、Ｌ、Ｌ、Ｈ、Ｌ、Ｈ、ＬまたはＬ、Ｌ、Ｈ、Ｌ、Ｌ、Ｈの順で結合させて、さらにＤＨＦＲ遺伝子を組み込んだＣＨＯ細胞導入用ベクタープラスミドと連結させ、抗体遺伝子のＨ鎖２コピー、Ｌ鎖４コピーで構成される、Ｈ：Ｌ＝２：４のプラスミドを作製した（図１、および２）。
　〔実施例２〕抗体産生細胞および抗体の製造
　実施例１で作製したプラスミドを、上記の方法で調製したノックアウト細胞および改変されていないＣＨＯ細胞ＤＸＢ１１由来細胞にそれぞれエレクトロポレーションにより導入し、ＣＨＯ細胞のゲノムの同一の特定位置に、２コピーのプラスミドをインテグレートさせた。引き続き細胞を４００ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ存在下で培養することで、発現プラスミドが導入された細胞プールを取得して培養評価を行った。
　取得したプラスミド導入細胞プールを用いて、ａｍｂｒ１５を用いたフェドバッチ培養で抗体の力価の比較を行った。培養は初発培養液量１２ｍＬ、培養温度３７℃、撹拌速度８００ｒｐｍの条件で実施した。培養開始後１４日目の培地中の抗体濃度を力価として測定した。力価は、生体分子間相互作用解析システム（Ｏｃｔｅｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いて、培養上清中に存在する抗体とＰｒｏｔｅｉｎＡセンサーの結合を測定することによって決定した。
　抗体Ａを産生する細胞プール（試料１～８）および抗体Ｂを産生する細胞プール（試料９～１１）を用いて培養を行った。試料１～７、９および１０ではＥＤＣ３ノックアウト細胞の異なるクローン株を使用し、試料８および１１では野生型のＣＨＯ細胞を使用して、各試料における細胞当たりの抗体の力価および分泌速度（secretion rate）を確認した。その結果、抗体Ａ、および抗体ＢのＥＤＣ３ノックアウト細胞を使用した場合、野生型の細胞を用いた場合と比較して細胞当たりの抗体の力価および分泌速度が高かった。
　ここで、表１における抗体分泌速度（ｎｇ／ｃｅｌｌｓ／ｄａｙ）とは力価を累積生細胞密度（ＩＶＣＤ：integral viable cell density）で除することによって得た値である。ここで、ＩＶＣＤとは、培養期間中の生細胞密度の和を表す。各時点（０、３、５、７、１０、１２、１４日目）における生細胞密度から算出した。
　ＩＶＣＤを算出するための計算式を下記する。隣接する時点の生細胞密度（ＶＣＤ）の平均が、その期間続いていたとして計算した（ｔ：期間（日））。

Claims (16)

  1. 　組換えポリペプチドの製造に使用するための脊椎動物細胞であって、
    　ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変されている、遺伝子組換え操作された脊椎動物細胞。
  2. 　遺伝子ノックアウト、遺伝子改変、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたはそれらの組み合わせによって、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除される、請求項１に記載の脊椎動物細胞。
  3. 　前記脊椎動物細胞が、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の脊椎動物細胞。
  4. 　前記脊椎動物細胞のゲノムが、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子の発現を低減また排除するように改変されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
  5. 　前記脊椎動物細胞が、前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に少なくとも１つの改変を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
  6. 　改変後の内因性ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子のアミノ酸配列が、ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子参照タンパク質として配列番号１～４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
  7. 　ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＰＡＴ１、ＳＣＤ６、ＥＤＣ３、またはＤＨＨ１である、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された脊椎動物細胞。
  8. 　ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子がＥＤＣ３である、請求項１～７のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
  9. 　前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
  10. 　前記脊椎動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１～９のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
  11. 　前記組換えポリペプチドが抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、または二重特異性抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
  12. 　ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現を低減または排除された脊椎動物細胞の生産性が、前記改変を除いて同じ遺伝子型を有する脊椎動物細胞と比較して少なくとも１０％増加している、請求項１～１１のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞。
  13. 　脊椎動物細胞において組換えポリペプチドの生産性を増加させる方法であって、
    　脊椎動物細胞においてｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除するように改変された組換え脊椎動物細胞を調製することを含み、
    　同前記改変を除いて同一の遺伝子型を有する脊椎動物細胞と比較して、同じ条件下での培養おいて組換えポリペプチドの生産性が増加する、方法。
  14. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞を製造するための方法であって、
    　脊椎動物細胞において前記ｍＲＮＡ脱キャッピング活性化因子遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように改変された組換え脊椎動物細胞を調製すること、および
    　前記脊椎動物細胞に、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入すること
    を含み、前記脊椎動物細胞において前記組換えポリペプチドが発現する、方法。
  15. 　組換えポリペプチドを製造するための方法であって、
    　　（ａ）前記組換えポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、請求項１～１２のいずれか一項に記載の脊椎動物細胞を培養すること、および
    　　（ｂ）前記細胞培養培地から前記組換えポリペプチドを単離すること
    を含む、方法。
  16. 　（ｃ）前記単離された組換えポリペプチドをプロセシングすることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
     
     
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