WO2025239453A1 - 官能性化合物 - Google Patents

官能性化合物

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WO2025239453A1
WO2025239453A1 PCT/JP2025/017919 JP2025017919W WO2025239453A1 WO 2025239453 A1 WO2025239453 A1 WO 2025239453A1 JP 2025017919 W JP2025017919 W JP 2025017919W WO 2025239453 A1 WO2025239453 A1 WO 2025239453A1
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WO
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alkylene
salt
functional compound
group
formula
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PCT/JP2025/017919
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康次 酒井
隆史 林
昭 長袋
あゆか 出口
雄貴 西川
正貴 田中
理智 坂口
仁美 細見
美佳世 林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
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Anticipated expiration legal-status Critical

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/13—Labelling of peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • the present disclosure encompasses functional compounds.
  • chemoproteomics is a method for elucidating the structure and function of proteins using organic chemistry techniques.
  • Chemoproteomics is a method that enables unbiased and comprehensive identification of target proteins directly from living cells or tissues that reflect a phenotype, and is thought to make a significant contribution to drug development, such as identifying unknown target proteins of drug candidate compounds discovered through phenotypic screening and identifying antigens of unknown antibodies.
  • the purpose of this disclosure is to provide novel compounds that are useful for comprehensive analysis of cell surface proteins, etc.
  • the tyrosine residue reactive site R is a group represented by the following formula (1):
  • R1 and R2 are each independently selected from the group consisting of H, alkyl (preferably C1-6 alkyl) optionally substituted with one or more substituents, aryl (preferably C6-10 aryl) optionally substituted with one or more substituents, and heteroaryl (preferably 5-15 membered heteroaryl) optionally substituted with one or more substituents.
  • Q 1 , Q 2 , Q 3 , Q 4 , Q 5 and Q 6 are each independently H or alkyl (preferably C 1-6 alkyl), A 1 , A 2 , A 3 and A 4 are each independently arylene (preferably C 6-18 arylene); Pep is a peptide residue having an amino acid sequence represented by ENLYFQG (SEQ ID NO: 1), ENLYFQS (SEQ ID NO: 2 ) , or X1 , X2 , X3 , X4 , X5 , X6 , X7 ( X1 , X2 , X3, X5, X6, and X7 are each independently an amino acid residue other than K or R, and X4 is K or R).
  • ENLYFQG SEQ ID NO: 1
  • ENLYFQS SEQ ID NO: 2
  • X1 , X2 , X3 , X4 , X5 , X6 , X7 are each
  • S3 and S4 are each independently selected from S2, preferably S3 is an alkylene having 2 or more carbon atoms (preferably an alkylene having 2 to 30 carbon atoms) in which -O- is bonded to the R-side terminal and -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a - , -NR a -CO- , a group represented by formula (L-1), or a group represented by formula (L-2) may be bonded to the E-side terminal and/or between one or more adjacent -CH 2 -s, and the group may have one or more substituents R 3 ; and/or S4 is an alkylene having 2 or more carbon atoms (preferably an alkylene having 2 to 30 carbon atoms) in which -NH- is bonded to the Tag-side terminal and -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a -, -NR a Item 4.
  • S3 is a branched alkylene having 2 or more carbon atoms (preferably a branched alkylene having 2 to 30 carbon atoms) in which -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a -, -NR a -CO- , a group represented by formula (L- 1 ), or a group represented by formula (L-2) is bonded to the R-side terminal of the main chain, the E-side terminal of the main chain, and/or between one or more adjacent -CH 2 -, and the end of the side chain of the group has a substituent R 3 ; and/or S4 is a branched alkylene having 2 or more carbon atoms (preferably a branched alkylene having 2 to 30 carbon atoms) in which -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a -, -NR a -CO- Item 5.
  • the functional compound or salt thereof according to any one of Items 1 to 4 , wherein the functional compound or salt thereof is a group to which —CO—, a group represented by formula (L-1), or a group represented by formula (L-2) is bonded, and the end of the side chain of the group has a substituent R3.
  • [Section 6] -S3-E-S4- is -O-alkylene-(E-1)-(alkylene-O) a -alkylene-NH-, -O-alkylene-NH-CO-alkylene-(E-1)-(alkylene-O) a -alkylene-NH-, -O-alkylene-(E-1)-alkylene-NH-CO-alkylene-NH-CO-(alkylene-O) a -alkylene-NH-, -O-alkylene-(E-1)-alkylene-NH-CO-alkylene-(L-1)-alkylene-CO-NH-(alkylene-O) a -alkylene-NH-, -alkylene-(E-1)-(alkylene-O) a a group selected from the group consisting of -alkylene-NH-, -alkylene-(E-1)-alkylene-NH-CO-alkylene-NH-
  • R3 is selected from the group consisting of -N( R31 ) 2 and heteroaryl (preferably 5-15 membered heteroaryl) optionally substituted with -alkylene- SO3M (M is H or an alkali metal, preferably H, Na, or K, more preferably Na), wherein said alkylene is preferably C1-6 alkylene; 8.
  • R 32 is a residue of a reagent selected from the group consisting of TMT, fluorescein, Cy3 and transcyclooctene.
  • [Section 9e] The functional compound or salt thereof according to any one of items 1 to 9, 9a, and 9b, wherein one of R 1 and R 2 is H and the other is methyl.
  • the functional compound or salt thereof according to any one of items 1 to 9, 9a, 9b, 9d, and 9e, wherein M is 1-6 alkylene, M is H or an alkali metal, and T is any one of the following formulae (T-1), (T-2),
  • the functional compound or salt thereof according to any one of items 1 to 9, 9a, 9b, 9d, 9e, 9f, and 9g, wherein the functional compound is 1-6 alkylene - NH-CO- C1-6 alkylene-(L-1)-
  • S is -S3-E-S4-, and S4 is -(C 2 H 4 O) 4 -C 2 H 4 -NH-, -C 2 H 4 -NH-CO-(C 2 H 4 O) 4 -C 2 H 4 -NH-, -CH(CH 3 ) 2 -CH 2 -NH-CO-(C 2 H 4 O) 4 -C 2 H 4 -NH-, -C 5 H 10 -NH-CO-(1-NaSO 3 C 3 H 6 -1,2,3-triazol-4-yl-CH 2 -)CH-NH-CO-(C 2 H 4 O) 4 -C 2 H 4 -NH-, -CH 2 -NH-CO-(NH 2 C 4 H 8 -)CH-NH-CO-(C 2 H 4 O) 4 -C 2
  • the functional compound or salt thereof according to any one of items 1 to 9 , 9a, 9b , 9d , 9e, 9f, and 9
  • R is a group represented by the following formula (1A): Item 9d, Item 9e, Item 9f, Item 9g, Item 9h, and Item 9i.
  • a composition comprising a functional compound or a salt thereof according to any one of Items 9d, 9e, 9f, Item 9g, Item 9h, and Item 9i.
  • the functional compound or salt thereof according to any one of Items 1 to 9, 9a, and 9b is selected from the group consisting of functional compounds represented by any one of the following formulae (P1), (P2), (P3), (P4), (P5), (P6), (P7), (P8), (P9), (P10), (P11), (P12), (P13), (P14), (P15), (P16), (P17), (P18), (P19), (P20), (P21), (P22), (P23), (P24), (P25), (P26), (P27), and (P28) and salts thereof.
  • T is any one of the following formulas (T-1), (T-2), (T-3), (T-4), (T-5), (T-6), (T-7), (T-8), (T-9), and (T-10).
  • T is any one of the following formulas (T-1), (T-2), (T-3), (T-4), (T-5), (T-6), (T-7), (T-8), (T-9), and (T-10).
  • a functional compound represented by formula (P21) or a salt thereof, and a functional compound represented by formula (P22) or a salt thereof A composition comprising a functional compound represented by formula (P23) according to item 10 or a salt thereof and a functional compound represented by formula (P24) according to item 10 or a salt thereof, or a functional compound represented by formula (P25) according to item 10 or a salt thereof and a functional compound represented by formula (P26) according to item 10 or a salt thereof, or a functional compound represented by formula (P27) according to item 10 or a salt thereof and a functional compound represented by formula (P28) according to item 10 or a salt thereof.
  • T is any one of the following formulas (T-1), (T-2), (T-3), (T-4), (T-5), (T-6), (T-7), (T-8), (T-9), and (T-10).
  • T is any one of the following formulas (T-1), (T-2), (T-3), (T-4), (T-5), (T-6), (T-7), (T-8), (T-9), and (T-10).
  • T is any one of the following formulas (T-1), (T-2), (T-3), (T-4), (T-5), (T-6), (T-7), (T-8), (T-9), and (T-10).
  • P1 A functional compound represented by formula (P1) and a functional compound represented by formula (P2) according to item 11.
  • Item 11 A functional compound represented by formula (P3) and a functional compound represented by formula (P4) according to item 11.
  • Item 11 A functional compound (salt) represented by formula (P7a) and a functional compound (salt) represented by formula (P8a) according to item 11.
  • Item 11 which contains a functional compound represented by formula (P9) and a functional compound represented by formula (P10) described in item 11;
  • Item 11 includes a functional compound represented by formula (P11) and a functional compound represented by formula (P12) according to item 11,
  • Item 11 which contains a functional compound (salt) represented by formula (P13a) and a functional compound (salt) represented by formula (P14a) described in item 11;
  • Item 11 which contains a functional compound (salt) represented by formula (P15a) and a functional compound (salt) represented by formula (P16a) described in item 11;
  • Item 11 which contains a functional compound represented by formula (P17) and a functional compound represented by formula (P18) described in item 11;
  • Item 11 which contains a functional compound represented by formula (P9) and a functional compound represented by formula (P10) described in item 11;
  • Item 11 includes a functional compound represented by formula (P11) and a functional compound represented by formula (P12) according to
  • Item 11 which contains a functional compound (salt) represented by formula (P21a) and a functional compound (salt) represented by formula (P22a) described in item 11;
  • a composition comprising a functional compound (salt) represented by formula (P23a) according to item 11 and a functional compound (salt) represented by formula (P24a) according to item 11, or a functional compound represented by formula (P25) according to item 11 and a functional compound represented by formula (P26) according to item 11, or a functional compound represented by formula (P27) according to item 11 and a functional compound represented by formula (P28) according to item 11.
  • [Section 12] A method for detecting a protein having a tyrosine residue, comprising the following steps (1) and (2): (1) A step of binding a tyrosine residue reactive site R in the functional compound or salt thereof according to any one of Items 1 to 11, 9a, 9b, 9d, 9e, 9f, 9g, 9h, 9i, and 11b, or the functional compound or salt thereof contained in the composition according to any one of Items 9c, 9j, 10a, and 11a, to a tyrosine residue of a protein; and (2) a step of binding a labeling substance that binds to the protein purification tag site Tag in the functional compound or salt thereof bound to the protein, and detecting the label.
  • [Section 12a] Item 13.
  • a method for detecting or identifying a cell surface protein comprising the following steps (A), (B), (C), and (E): (A) reacting a functional compound or a salt thereof according to any one of Items 1 to 11, 9a, 9b, 9d, 9e, 9f, 9g, 9h, 9i, and 11b with cells or tissues in a sample, or a functional compound or a salt thereof contained in a composition according to any one of Items 9c, 9j, 10a, and 11a, to bind a tyrosine residue reactive site R in the functional compound or the salt thereof to a tyrosine residue of a cell surface protein; (B) purifying the fraction containing the cell surface protein bound to the functional compound or a salt thereof; (C) binding a labeling substance to the protein purification tag site (Tag) in the functional compound or salt thereof according to any one of Items 1 to 11, 9a, 9b, 9d, 9e, 9f, 9g, 9h, 9i, and
  • step (A) is a step of reacting the functional compound or its salt with cells or tissues in the sample by activating it with hydrogen peroxide and peroxidase, thereby binding a tyrosine residue reactive site R in the functional compound or its salt to a tyrosine residue of the cell surface protein.
  • step (B) is a step of purifying a fraction containing the cell surface protein bound to the functional compound or a salt thereof by lysing the cells.
  • step (C) is a step of reacting a protein purification tag site (Tag) in the functional compound or its salt with a labeling substance that binds to the Tag, and purifying the reaction product.
  • step (D) is a step of chemically or biochemically cleaving the complex at the cleavable site E.
  • step (E) is a step of detecting or identifying a cell surface protein obtained by purifying and/or hydrolyzing the cell surface binding domain fragment.
  • step (E) is a step of detecting or identifying a cell surface protein obtained by purifying and/or hydrolyzing the cell surface binding domain fragment.
  • step (E) is a step of detecting or identifying a cell surface protein obtained by purifying and/or hydrolyzing the cell surface binding domain fragment.
  • step (E) is a step of detecting or identifying a cell surface protein obtained by purifying and/or hydrolyzing the cell surface binding domain fragment.
  • step (E) is a step of detecting or identifying a cell surface protein obtained by purifying and/or hydrolyzing the cell surface binding domain fragment.
  • step (E) is a step of detecting or identifying a cell surface protein obtained by purifying and/or hydrolyzing the cell surface binding domain fragment.
  • step (E) is a step of detecting or identifying a cell surface protein obtained by purifying and/or
  • [Section 15-2] Use of the functional compound or salt thereof according to any one of Items 1 to 11, 9a, 9b, 9d, 9e, 9f, 9g, 9h, 9i, and 11b, or the composition according to any one of Items 9c, 9j, 10a, and 11a, in the method according to Item 13-1, 13-2, 14-1, 14-2, 14-3, or 14-4.
  • [Section 16-1] The functional compound or salt thereof according to any one of items 1 to 11, 9a, 9b, 9d, 9e, 9f, 9g, 9h, 9i, and 11b, or the composition according to any one of items 9c, 9j, 10a, and 11a, for use in detecting or identifying a cell surface protein.
  • [Section 16-2] The functional compound or salt thereof according to any one of items 1 to 11, 9a, 9b, 9d, 9e, 9f, 9g, 9h, 9i, and 11b, or the composition according to any one of items 9c, 9j, 10a, and 11a, for use in the method according to item 13-1, 13-2, 14-1, 14-2, 14-3, or 14-4.
  • [Section 17-1] Use of the functional compound or salt thereof according to any one of items 1 to 11 and items 9a, 9b, 9d, 9e, 9f, 9g, 9h, 9i, and 11b for producing a composition for use in detecting or identifying a cell surface protein.
  • the functional compounds or salts thereof disclosed herein are useful in the comprehensive analysis of cell surface proteins, enabling, for example, highly sensitive, simple, and comprehensive analysis of cell surface proteins. Furthermore, the functional compounds or salts thereof disclosed herein enable, for example, region-limited proximity-dependent labeling in a simple and relatively inexpensive manner. Furthermore, because the functional compounds or salts thereof disclosed herein enable specific labeling sites, they can be applied to analyses that rely on peptide sequence identification, such as phosphorylation fluctuation analysis.
  • FIG. 1 shows the distribution of the ratio of the amount of surface protein detected in the example to that in Comparative Example 1.
  • FIG. 2 shows the distribution of the ratio of the detected amounts of surface proteins and non-surface proteins in the examples and comparative examples.
  • FIG. 3 shows the total number of cell surface proteins among the identified proteins.
  • FIG. 4 shows the total number of non-cell surface proteins among the identified proteins.
  • Figure 5 shows the number of surface proteins among the top 100 identified.
  • Figure 6 shows the number of chemical probe modification sites detected.
  • FIG. 7 shows the intramolecular location of amino acids modified by chemical probes (EGFR).
  • Figure 8 shows cell staining.
  • Figure 9 shows an example of a product ion spectrum.
  • FIG. 10 shows the TMT quantification values of CD7, which is highly expressed in Jurkat cells.
  • FIG. 10 shows the TMT quantification values of CD7, which is highly expressed in Jurkat cells.
  • FIG. 11 shows the results of analysis of interacting molecules using proximity labeling.
  • FIG. 12 shows the results of analyzing receptor internalization upon stimulation with EGF addition.
  • FIG. 13 shows the results of an analysis of changes in membrane protein phosphorylation due to (1) stimulation with EGF addition and (2) stimulation with EGF and Gefitinib addition.
  • FIG. 14 shows the results of analysis of labeled peptides with the addition of the anti-TFRC antibody OKT9.
  • Figure 15 shows the labeling sites assigned to the known structural information of TFRC (PDB: 7ZQS).
  • alkyl refers to a monovalent radical derived from a straight-chain or branched-chain saturated aliphatic hydrocarbon alkane, represented by the formula "-C p H 2p+1 " (where p is an integer of 1 or greater). Alkyl includes straight-chain or branched-chain alkyls having 1 to 6 carbon atoms (C 1-6 ).
  • alkyl particularly C 1-6 alkyl
  • alkyl include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, isohexyl, and 3-methylpentyl.
  • Alkyl also includes alkyls in which at least some of the hydrogen atoms have been replaced with deuterium atoms.
  • substituents for "alkyl which may be substituted with one or more substituents” include the following.
  • Halogens e.g., F, Cl, Br, I
  • B -CN
  • C NO 2
  • D -NH2
  • E -OH
  • F CHO
  • G -COOH or its salts or esters
  • H -SO 3 H or its salts or esters
  • I -SO 2 H
  • J -SH
  • K O
  • N alkenyl (O) alkynyl
  • P cycloalkyl
  • Q cycloalkenyl
  • R aryl
  • S heterocyclyl
  • T heterocyclyl
  • alkylene refers to a divalent radical derived from a straight-chain or branched-chain alkane and represented by the formula "-[C(Z 1 )(Z 2 )] p -" (Z 1 and Z 2 are each independently H or alkyl, and p is an integer of 1 or greater).
  • Alkylene includes straight-chain or branched-chain alkylene having 1 to 30 carbon atoms (C 1-30 ), straight-chain or branched-chain alkylene having 2 or more carbon atoms (particularly, 2 to 30 carbon atoms), and the like.
  • alkylene particularly, alkylene having 30 or less carbon atoms
  • alkylene include methylene, ethylene, 1-methylethylene, 2-methylethylene, trimethylene, 2-methyltrimethylene, 2,2-dimethyltrimethylene, 1-methyltrimethylene, methylmethylene, ethylmethylene, dimethylmethylene, tetramethylene, pentamethylene, hexamethylene, and the like.
  • alkenyl refers to a monovalent radical derived from a straight-chain or branched-chain unsaturated aliphatic hydrocarbon alkene, represented by the formula "-C q H 2q-1 " (q is an integer of 2 or greater).
  • Alkenyl includes straight-chain or branched-chain alkenyl having 2 to 6 carbon atoms (C 2-6 ). Specific examples of alkenyl include vinyl and allyl.
  • alkynyl refers to a monovalent radical derived from an alkyne of a straight-chain or branched-chain unsaturated aliphatic hydrocarbon, represented by the formula "-C q H 2q-3 " (q is an integer of 2 or greater).
  • Alkynyl includes straight-chain or branched-chain alkynyl having 2 to 6 carbon atoms (C 2-6 ). Specific examples of alkynyl include ethynyl and propargyl.
  • cycloalkyl refers to a monovalent radical derived from a cycloalkane, a cyclic saturated aliphatic hydrocarbon. Cycloalkyl includes cycloalkyls containing 3 to 18 carbon atoms (C 3-18 ). Specific examples of cycloalkyl include cyclopropyl, cyclopentyl, and cyclohexyl.
  • cycloalkenyl refers to a monovalent radical derived from a cycloalkene, a cyclic unsaturated aliphatic hydrocarbon. Cycloalkenyl includes cycloalkenyls containing 5 to 18 carbon atoms (C 5-18 ). Specific examples of cycloalkenyl include cyclopentenyl and cyclohexynyl.
  • aryl refers to a monovalent radical derived from a monocyclic or polycyclic aromatic hydrocarbon, such as a bicyclic or tricyclic one.
  • Aryl includes aryls having 6 to 18 carbon atoms (C 6-18 ), preferably aryls having 6 to 10 carbon atoms (C 6-10 ). Specific examples of aryls include phenyl, naphthyl, biphenylyl, anthryl, phenanthryl, and terphenylyl.
  • Aryl may have one or more substituents.
  • substituents include alkyl, the substituents (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I), (J), (K), (L), (M), (N), (O), (P), and (Q) exemplified as alkyl substituents, and combinations thereof.
  • arylene refers to a divalent radical derived from a monocyclic or polycyclic aromatic hydrocarbon such as a bicyclic or tricyclic.
  • Arylene includes arylenes having 6 to 18 carbon atoms (C 6-18 ). Specific examples of arylene include phenylene, naphthylene, biphenyldiyl, anthrylene, phenanthrylene, and terphenyldiyl.
  • Arylene may have one or more substituents, and specific examples of the substituents include alkyl, the substituents (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I), (J), (K), (L), (M), (N), (O), (P), and (Q) exemplified as alkyl substituents, and combinations thereof.
  • heterocyclyl refers to a monovalent radical derived from a monocyclic or polycyclic (e.g., bicyclic, tricyclic) heterocyclic compound.
  • Heterocyclyl includes heterocyclyls (3- to 15-membered) having 1 to 5 heteroatoms independently selected from the group consisting of N, O, and S as ring-membering atoms, and/or having 3 to 15 ring-membering atoms.
  • Heterocyclyl includes heteroaryl. Heterocyclyl may have one or more substituents.
  • substituents include alkyl, the substituents (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I), (J), (K), (L), (M), (N), (O), (P), (Q), and (R) exemplified as alkyl substituents, and combinations thereof.
  • heteroaryl refers to a monovalent radical derived from a monocyclic or polycyclic (e.g., bicyclic, tricyclic) aromatic heterocyclic compound. Heteroaryl encompasses heteroaryls (5- to 15-membered) having 1 to 5 heteroatoms independently selected from the group consisting of N, O, and S as ring-constituting atoms, and/or having 5 to 15 ring-constituting atoms.
  • heteroaryls include pyrrolyl, pyrazolyl, imidazolyl, triazolyl, pyridyl, pyridazyl, pyrimidyl, pyrazyl, triazyl, indolyl, quinolinyl, oxazolyl, and thiazolyl.
  • Heteroaryls may have one or more substituents.
  • substituents include alkyl, the substituents (A), (B), (C), (D), (E), (F), (G), (H), (I), (J), (K), (L), (M), (N), (O), (P), (Q), and (R) exemplified as alkyl substituents, and combinations thereof.
  • protein and “peptide” have substantially the same meaning and refer to amino acid polymers of any length (peptides are typically referred to as fragments of proteins).
  • Amino acid polymers may be linear, branched, or cyclic.
  • the amino acids may be natural or unnatural amino acids, or mutant amino acids.
  • amino acids examples include glycine (G), alanine (A), valine (V), leucine (L), isoleucine (I), serine (S), threonine (T), aspartic acid (D), glutamic acid (E), cysteine (C), methionine (M), lysine (K), arginine (R), asparagine (N), glutamine (Q), proline (P), phenylalanine (F), tryptophan (W), histidine (H), tyrosine (Y), citrulline, ornithine, ⁇ -acetyl-lysine, ⁇ -alanine, aminobenzoic acid, 6-aminocaproic acid, aminobutyric acid, hydroxyproline, mercaptopropionic acid, 3-nitrotyrosine, norleucine, and pyroglutamic acid.
  • Amino acids may be, for example, L-amino acids, D-amino acids, or DL-amin
  • the protein may be a naturally occurring protein, a synthetic protein, or a naturally occurring protein with a synthetically engineered sequence.
  • the protein may be an intracellular protein, a cell surface protein (i.e., a protein bound to the surface of a cell), or a protein in solution (e.g., a protein secreted into the medium).
  • the protein may also be a glycoprotein or a membrane protein.
  • the protein may be any medicinally or commercially relevant protein with useful biological or chemical activity, such as a receptor, antibody, enzyme, hormone, regulator, antigen, or binding agent.
  • the proteins listed below that may be used in the present disclosure are merely exemplary and are not intended to be limiting.
  • any protein containing a tyrosine residue may be a target protein for one or more functional compounds or salts thereof.
  • a "target protein” can be a protein having tyrosine residues to which one or more functional compounds or salts thereof can bind.
  • target proteins are preferably, but not limited to, those that can be present in biological fluids, on cells, or in tissues derived from mammals, including humans and non-human animals. More preferably, they are proteins that are expressed and present on living cells or in living tissues. Therefore, if the target protein is, for example, a membrane protein expressed on the surface of a living cell, it will be associated with the cell membrane of the living cell, have at least one tyrosine residue exposed to the extracellular space, and be in a state where a functional compound or a salt thereof can bind.
  • the target protein is not particularly limited, but a membrane protein is preferred.
  • a membrane protein is a protein that can interact directly or indirectly with a lipid membrane, particularly a lipid bilayer membrane, and in which one or more of the amino acid residues (at least tyrosine residues) that make up the protein are present in the extracellular environment.
  • membrane proteins include G protein-coupled receptors, seven-transmembrane receptors, receptor tyrosine kinases, the immunoglobulin superfamily and related proteins, scavenger receptors, other receptors; transporters, ion channels, solution transporters, active transporters, auxiliary transporter proteins, enzymes, and others.
  • G protein-coupled receptors and seven-transmembrane receptors include Frizzled receptors, nucleic acid receptors, adenosine receptors, adrenergic receptors, angiotensin receptors, apelin receptors, vasopressin receptors, bradykinin receptors, bombesin receptors, chemokine receptors, cholecystokinin receptors, muscarinic acetylcholine receptors, cannabinoid receptors, cysteinyl leukotriene receptors, dopamine receptors, sphingolipid receptors, lysophosphatidin receptors, sphingosine monophosphate receptors, endothelin receptors, protease-activated receptors, free lipid receptors, galanin receptors, growth hormone secretagogue receptors, gonadotropin receptors, bile acid receptors, nicotinic acid receptors, lysophosphatidic acid receptors, an
  • receptors examples include releasing peptide receptors, orexin receptors, histamine receptors, serotonin receptors, interleukin receptors, leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptors, leukotriene receptors, adrenocorticotropic hormone receptors, melanocortin receptors, melanin-concentrating hormone receptors, melatonin receptors, neuromedin receptors, neuropeptide receptors, neurotensin receptors, opioid receptors, nociceptin receptors, oxoglutarate receptors, oxytocin receptors, P2Y purinergic receptors, prostaglandin receptors, rhodopsin, relaxin receptors, somatostatin receptors, succinate receptors, substance P receptors, substance K receptors, thromboxane receptors, urotensin receptors, calcitonin receptors, taste receptors, metabotropic glutamate receptors, and olfactory receptors.
  • receptor tyrosine kinases include activin receptors, bone morphogenetic protein receptors, TNF- ⁇ receptors, AXL receptors, epidermal growth factor receptors (EGF receptors), ephrin receptors, insulin receptors, nerve growth factor receptors, discoidin domain receptors, vascular endothelial growth factor receptors, leukocyte receptors, hepatocyte growth factor receptors, macrophage-stimulating protein receptors, platelet-derived growth factor receptors, and enterotoxin receptors, as well as their precursors.
  • EGF receptors epidermal growth factor receptors
  • ephrin receptors epidermal growth factor receptors
  • insulin receptors include nerve growth factor receptors, discoidin domain receptors, vascular endothelial growth factor receptors, leukocyte receptors, hepatocyte growth factor receptors, macrophage-stimulating protein receptors, platelet-derived growth factor receptors, and enterotoxin receptors, as well as their precursors
  • immunoglobulin superfamily and its related proteins examples include immunoglobulin receptors, killer cell immunoglobulin-like receptors, leukocyte immunoglobulin-like receptors, netrin receptors, T cell receptors, various cytokine receptors, various fragments of the T cell surface glycoprotein CD, superfamilies, and their precursors.
  • receptors include, for example, adiponectin receptors, progestin receptors, contactin-associated proteins, delrin, integrins and their precursors, neurexins, neuropilins, Notch receptors, plexins and their precursors, receptor tyrosine phosphatases, selectins and their precursors, syndecan receptors, tumor necrosis factor (TNF) receptors, Toll-like receptors, transferrin receptors, and sortilin and its precursors.
  • TNF tumor necrosis factor
  • transporters and ion channels include aquaporins, chloride ion channels, bestrophin, ryanodine receptors, voltage-gated potassium channels, cyclic nucleotide-gated channels, calcium-activated potassium channels, transient receptor potential channels (TRP channels), voltage-gated sodium channels, voltage-gated calcium channels, other voltage-gated channels, serotonin receptors, acetylcholine receptors, gamma-aminobutyric acid receptors, glycine receptors, ionotropic glutamate receptors, and P2X purinergic receptors.
  • aquaporins include aquaporins, chloride ion channels, bestrophin, ryanodine receptors, voltage-gated potassium channels, cyclic nucleotide-gated channels, calcium-activated potassium channels, transient receptor potential channels (TRP channels), voltage-gated sodium channels, voltage-gated calcium channels, other voltage-gated channels, serotonin receptors,
  • solution transporters include various SLC family proteins, and examples of active transporters include ion-transporting ATPases and ABC transporters.
  • enzymes include NADH-ubiquinone oxidoreductase, cytochrome c, flavin-containing monooxygenase, cytochrome P450, and other oxidoreductases; acyltransferases, glucosetransferases, sulfotransferases, and other transferases; ligases, tyrosine phosphatases, phosphodiester hydrolases, glycosylases, serine peptide endohydrolases, metalloendopeptidases, nucleoside diphosphate phosphatases, and other hydrolases.
  • sample encompasses any cell (e.g., living cell) or tissue (e.g., living tissue), and any solid or fluid sample obtained from an organism.
  • samples include, for example, cell cultures, tissue cultures, bioreactors, cells and tissues from humans or non-human animals, plants (including fruits and vegetables), single-celled microorganisms (e.g., bacteria, yeast), and multicellular organisms.
  • Biological samples can be, for example, blood, plasma, serum, urine, bile, semen, cerebrospinal fluid, aqueous humor, or vitreous humor; any bodily secretion, transudate, or exudate (e.g., fluid obtained from an abscess or any other site of infection or inflammation); or fluid obtained from a joint (e.g., biological fluid obtained from a normal joint or a joint affected by a disease such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, gout, or septic arthritis).
  • Biological samples can also be, for example, samples obtained from any organ or tissue (including biopsy or autopsy specimens).
  • Cells also include, for example, primary cells and cultured cells.
  • the cells or tissues are derived from humans or non-human animals.
  • Cells or “living cells” are not particularly limited as long as they express a protein, preferably a membrane protein, that can be detected using a functional compound or its salt. Specific examples include, but are not limited to, CHO cells, MDCK cells, 3T3-L1 cells, 293 cells, MCF7 cells, A431 cells, 3T3 cells, CV-I cells, HeLa cells, L cells, BHK21 cells, HL-60 cells, U937 cells, HaK cells, Jurkat cells, THP-1 cells, and other cell lines obtained by transformation.
  • cells isolated from any organ or tissue under non-denaturing conditions e.g., blood cells, organ-constituting cells, primary cultured cells, etc.
  • cell lines derived from in vitro cultures of primary tissues and primary explants e.g., organoid cultures.
  • cells into which a gene encoding a specific protein has been introduced using a vector or the like using these as a host may also be used, and although not limited to these, an example of such cells is CHO-K1 cells that stably express the dopamine D2 receptor.
  • tissue or "living tissue” is not particularly limited as long as it expresses a protein, preferably a membrane protein, that can be detected using a functional compound or its salt.
  • tissue slices and tissue culture samples e.g., tissue slices and organ slice cultures of the brain, liver, kidney, etc. isolated under non-denaturing conditions from any organ or tissue of a human or non-human mammal.
  • alkylation reaction hydrolysis reaction, amination reaction, esterification reaction, amidation reaction, etherification reaction, nucleophilic substitution reaction, addition reaction, oxidation reaction, and reduction reaction refer to methods known per se. Examples of such methods include those described in Lectures on Experimental Chemistry (5th ed., edited by the Chemical Society of Japan, Maruzen Co., Ltd.), Organic Functional Group Preparations, 2nd ed., published by ACADEMIC PRESS, INC. in 1989; Comprehensive Organic Transformations, published by VCH Publishers Inc. in 1989; and Greene's Protective Groups in Organic Synthesis by P.G.M. Wuts and T.W. Greene (4th ed., 2006); John Wiley &Sons; New York, 1991, p. 309.
  • protection and deprotection can be carried out by carrying out protection and deprotection reactions using commonly known protecting groups (see, for example, Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition, T.W. Greene, John Wiley & Sons Inc. (2006)).
  • protecting group includes, for example, t-butoxycarbonyl (BOC) group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl (Troc) group, benzyloxycarbonyl (Z) group, allyloxycarbonyl (Alloc) group, trifluoroacetyl group, phthaloyl group, paratoluenesulfonyl (Ts) group, and 2-nitrobenzenesulfonyl (Ns) group.
  • BOC t-butoxycarbonyl
  • Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl
  • Troc 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl
  • Z benzyloxycarbonyl
  • Alloc allyloxycarbonyl
  • the term "deprotecting agent” is not particularly limited as long as it can remove the protecting group, but examples include bases such as piperidine and lithium diisopropylamide, zinc, acids such as TFA, nucleophiles in the presence of a zero-valent palladium catalyst, basic aqueous solutions, methylamine, hydrazine, one-electron reducing agents, and thiols.
  • solvent refers to a solvent inert to the reaction, and examples include water, ethers (e.g., linear ethers such as diethyl ether, 1,2-dimethoxyethane, diethylene glycol dimethyl ether, and ethylene glycol dimethyl ether; cyclic ethers such as dioxane and tetrahydrofuran), halohydrocarbons (e.g., methylene chloride, chloroform, 1,2-dichloroethane, and carbon tetrachloride), aromatic hydrocarbons (e.g., benzene, toluene, and xylene), alcohols (e.g., lower alcohols such as methanol, ethanol, and isopropanol), amides (e.g., N,N-dimethylformamide (DMF), hexamethylphosphoric triamide), amines (e.g., cyclic amines such as N-methylpyrrol), amides (e.g.
  • base refers to, for example, inorganic bases, organic bases, etc.
  • Inorganic bases include alkali metal hydroxides (e.g., lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide), alkaline earth metal hydroxides (e.g., magnesium hydroxide, calcium hydroxide, barium hydroxide), alkali metal carbonates (e.g., sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate), alkaline earth metal carbonates (e.g., magnesium carbonate, calcium carbonate, barium carbonate), alkali metal bicarbonates (e.g., sodium bicarbonate, potassium bicarbonate), alkali metal phosphates (e.g., sodium phosphate, potassium phosphate, cesium phosphate), alkaline earth metal phosphates (e.g., magnesium phosphate, calcium phosphate), alkali metal alkoxides (e.g., sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide
  • organic bases include trialkylamines (e.g., trimethylamine, triethylamine (TEA), N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)), dialkylamines (e.g., diethylamine, diisopropylamine), 4-dimethylaminopyridine (DMAP), N-methylmorpholine, picoline, 1,5-diazabicyclo[4.3.0]non-5-ene, 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, and 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (DBU).
  • TAA triethylamine
  • DIPEA N,N-diisopropylethylamine
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • N-methylmorpholine picoline
  • 1,5-diazabicyclo[4.3.0]non-5-ene 1,4-diazabicyclo[2.2.2]oct
  • the term "condensing agent” includes, for example, 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 3-hydroxy-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin-4-one (HOOBt), N-hydroxysuccinimide (NHS), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDAC), 2-(1H-7-azabenztriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), 2-(1H-benzo ...
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • HOOBt 3-hydroxy-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin-4-one
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropy
  • the functional compound or salt thereof of the present disclosure has a structure in which a tyrosine residue reactive site R is linked to a protein purification tag site Tag via a spacer S.
  • the tyrosine residue reactive site R is not particularly limited as long as it has a structure capable of reacting with a tyrosine residue in a protein.
  • a structure is preferably a luminol-derivative group or a group having a 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione skeleton, and is typically a group represented by the following formula (1):
  • R1 and R2 are each independently selected from the group consisting of H, alkyl (preferably C1-6 alkyl) optionally substituted with one or more substituents, aryl (preferably C6-10 aryl) optionally substituted with one or more substituents, and heteroaryl (preferably 5-15 membered heteroaryl) optionally substituted with one or more substituents.
  • R1 and R2 are each independently preferably selected from the group consisting of H, alkyl (preferably C1-6 alkyl) optionally substituted with one or more substituents, and aryl (preferably 5-15 membered heteroaryl), more preferably selected from the group consisting of H and alkyl (preferably C6-10 aryl) optionally substituted with one or more substituents.
  • Suitable combinations of R1 and R2 include the following: A combination in which R 1 is alkyl which may be substituted with one or more substituents, and R 2 is H. A combination in which R 1 is H, and R 2 is alkyl which may be substituted with one or more substituents.
  • the alkyl of R1 and/or R2 is preferably C1-6 alkyl, more preferably C1-4 alkyl, even more preferably C1-2 alkyl, and particularly preferably methyl.
  • the alkyl of R1 and/or R2 may be unsubstituted or substituted alkyl, and if it is substituted alkyl, the number of substitutions can be selected from the range of 1 or more to the maximum number of substitutions possible, for example, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 1 to 3, 1 or 2, etc.
  • * denotes a bond to the spacer S.
  • the bonding position to the spacer S in formula (1) may be any of formulas (1A), (1B), (1C), and (1D) below, but is preferably formula (1A) or (1B) below.
  • the spacer S is not particularly limited as long as it has a structure that can link the tyrosine residue reactive site R and the protein purification tag site Tag.
  • the type and length of the spacer can be selected so that steric congestion is minimized and the function of the functional group is not impaired.
  • S can be selected from the group consisting of -S1-, -S2-, and -S3-E-S4-.
  • S1 is alkylene which may be substituted with one or more substituents R3 . That is, S1 may be either unsubstituted alkylene or substituted alkylene.
  • the alkylene of S1 may preferably be linear or branched, C1-30 alkylene, C2-30 alkylene, C3-30 alkylene, C4-30 alkylene, C5-30 alkylene, or C6-30 alkylene, etc.
  • the number of substitutions by R3 can be selected from the range of 1 or more to the maximum possible number of substitutions, and can be, for example, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 1 to 3, 1, or 2.
  • each R3 may be the same or different.
  • substitution position of R3 is not particularly limited and may be any position.
  • R3 preferably substitutes at the end of the branched chain.
  • R 3 can be selected from the group consisting of —N(R 31 ) 2 and heteroaryl (preferably 5-15 membered heteroaryl) optionally substituted with one or more substituents.
  • the alkyl is preferably C1-6 alkyl, more preferably C1-4 alkyl, even more preferably C1-2 alkyl, and particularly preferably methyl.
  • the alkyl may be unsubstituted or substituted, and when it is substituted, the number of substituents can be selected from the range of 1 or more to the maximum number of possible substituents, and may be, for example, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 1 to 3, 1, or 2.
  • the carbonyl substituent is preferably, but not limited to, a residue of a reagent.
  • the reagent is typically a labeling reagent, examples of which include TMT (Tandem Mass Tag), fluorescein, Cy3, and TCO (transcyclooctene). Among these, TMT is preferred in terms of protein detection.
  • the substituted carbonyl is preferably any one of the following formulae (T-1), (T-2), (T-3), (T-4), (T-5), (T-6), (T-7), (T-8), (T-9), and (T-10).
  • the heteroaryl is preferably a 5- or 6-membered heteroaryl, more preferably a 5- or 6-membered N-containing heteroaryl.
  • the heteroaryl include pyrrolyl, pyrazolyl, imidazolyl, triazolyl, pyridyl, pyridazyl, pyrimidyl, pyrazyl, and triazyl.
  • the substituent that may be substituted on the heteroaryl of R3 is preferably alkyl which may have one or more substituents, more preferably alkyl which may be substituted with an anionic group such as -SO3M (M is H or a monovalent metal, preferably an alkali metal), and even more preferably alkyl substituted with -SO3M .
  • the alkyl is preferably C1-6 alkyl, more preferably C1-4 alkyl.
  • the alkali metal is a Group 1 element other than hydrogen, and includes Li, Na, K, Rb, Cs, and Fr, preferably Li, Na, K, or Cs, more preferably Na or K.
  • S2 is an alkylene having 2 or more carbon atoms (preferably an alkylene having 2 to 30 carbon atoms) in which -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a -, -NR a -CO- , a group represented by formula (L-1), or a group represented by formula (L-2) is bonded to at least one end and/or between one or more adjacent -CH 2 - groups, and the group may have one or more substituents R3 .
  • the group represented by formula (L-2) may also be a group represented by formula (L-3).
  • Examples of groups represented by formula (L-1) or formula (L-2) include the following:
  • the alkylene of S2 may preferably be a linear or branched C 2-30 alkylene, C 3-30 alkylene, C 4-30 alkylene, C 5-30 alkylene, or C 6-30 alkylene, or the like.
  • At least one end of the alkylene of S2 may be bonded with -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a - , or -NR a -CO- in order to link with R and/or Tag, and it is preferred that the Tag end be bonded with -NR a - or -CO-NR a -, particularly -NR a -.
  • the R end of S2 may be bonded with -O-, -CO-, -NR a -, or -CO-NR a -, particularly -O-.
  • -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a -, -NR a -CO-, a group represented by formula (L-1), or a group represented by formula (L-2) is bonded between one or more adjacent -CH 2 - groups in the alkylene of S2.
  • S2 includes at least one selected from the group consisting of -(alkylene-O) a - (a is an integer of 1 or more), -(O-alkylene) a - (a is an integer of 1 or more), -CO-NR a -, -NR a -CO-, a group represented by formula (L-1), and a group represented by formula (L-2).
  • S2 include the following: In the following, it is preferred that the left end is bound to R and the right end is bound to Tag, and at least one alkylene may be branched alkylene and may have one or more substituents R3 .
  • L1 in each occurrence, is independently -CO-NR a -, -NR a -CO-, a group represented by formula (L-1), or a group represented by formula (L-2), and b is an integer of 1 or greater. b may preferably be 1 to 6, 1 to 5, or 1 to 4, etc.
  • the -(alkylene-O) a - and -(O-alkylene) a - contained in S2 are preferably -(C 2 H 4 -O) a - or -(O-C 2 H 4 ) a -, respectively.
  • a is preferably 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 2 to 10, or 3 to 10, and is most preferably 1 to 4.
  • R a is H or alkyl optionally substituted with one or more substituents.
  • the alkyl of R a is preferably C 1-6 alkyl, more preferably C 1-4 alkyl, even more preferably C 1-2 alkyl, and particularly preferably methyl.
  • the alkyl of R a may be unsubstituted or substituted alkyl, and in the case of substituted alkyl, the number of substituents can be selected from the range of 1 or more to the maximum possible number of substitutions, and may be, for example, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 1 to 3, 1 or 2.
  • R a is preferably H.
  • the number of substitutions by R3 can be selected from the range of 1 or more to the maximum possible number, for example, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 1 to 3, 1 or 2.
  • each R3 may be the same or different.
  • substitution position of R3 is not particularly limited and may be any position.
  • R3 preferably substitutes at the end of the branched chain.
  • S3 and S4 are preferably each independently selected from S1 and S2, and more preferably selected from S2.
  • S3 is preferably an alkylene having 2 or more carbon atoms (preferably an alkylene having 2 to 30 carbon atoms) in which -O- is bonded to the R-side terminal and -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a -, -NR a -CO- , a group represented by formula (L-1), or a group represented by formula (L-2) may be bonded to the E-side terminal and/or between one or more adjacent -CH 2 -, and the group may have one or more substituents R3 .
  • S3 is preferably a branched alkylene having 2 or more carbon atoms (preferably a branched alkylene having 2 to 30 carbon atoms) in which -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a -, -NR a -CO-, a group represented by formula (L- 1 ), or a group represented by formula (L-2) is bonded to the R-side terminal of the main chain, the E -side terminal of the main chain, and/or between one or more adjacent -CH 2 -, and it is also preferable that the side chain terminal of such a group has a substituent R3 .
  • S3 include the following: In the following, it is preferred that the left end is bonded to R and the right end is bonded to E, and at least one alkylene may be branched alkylene and may have one or more substituents R3 .
  • L2 in each occurrence is independently -CO-NR a - or -NR a -CO-, and c is an integer of 0 or greater than 1.
  • c is preferably 0 to 4, more preferably 0 to 3, even more preferably 0 to 2, and even more preferably 0 or 1.
  • S3 is preferably —O—C 1-6 alkylene-, —O—C 1-6 alkylene-NH—CO—(NH 2 , NHT, NH(C 1-6 alkyl), N(C 1-6 alkyl) 2 , 1-(M-SO 3 —C 1-6 alkylene)-1,2,3-triazol-4-yl, and NH 2 C( ⁇ NH)NH)- or C 1-6 alkylene, and is preferably —O—C 6 H 12 —, —O—C 6 H 12 —NH—CO—C 2 H 4 —, —O—C 6 H 12 —NH—CO—CH(—C 4 H 8 NH 2 )—, —O—C 6 H 12 —NH— CO —CH(—C 4 H 8 NHT)—, or —C 2 H 4 - is more preferred.
  • S4 is preferably an alkylene having 2 or more carbon atoms (preferably an alkylene having 2 to 30 carbon atoms) in which -NH- is bonded to the Tag-side terminal and -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a -, -NR a -CO- , a group represented by formula (L-1), or a group represented by formula (L-2) may be bonded to the E-side terminal and/or between one or more adjacent -CH 2 -, and the group may have one or more substituents R3 .
  • S4 is preferably a branched alkylene having 2 or more carbon atoms (preferably a branched alkylene having 2 to 30 carbon atoms) in which -O-, -CO-, -NR a -, -CO-NR a -, -NR a -CO-, a group represented by formula (L- 1 ), or a group represented by formula (L-2) is bonded to the E-side terminal of the main chain, the Tag -side terminal of the main chain, and/or between one or more adjacent -CH 2 -, and it is also preferable that the side chain terminal of such a group has a substituent R3 .
  • Preferred examples of S4 include the following: In the following, it is preferred that the left end binds to E and the right end binds to a protein purification tag site Tag, and at least one alkylene may be branched alkylene and may have one or more substituents R3 .
  • L3 in each occurrence, is independently -CO-NR a -, -NR a -CO-, a group represented by formula (L-1), or a group represented by formula (L-2), and d is an integer of 0 or greater than 1.
  • d is preferably 0 to 4, more preferably 0 to 3, and even more preferably 0 to 2.
  • -(alkylene-O) a - contained in S41, -(C 2-6 alkylene-O) a - contained in S42, and -(C 2-5 alkylene-O) a - contained in S43 are preferably -(C 2 H 4 -O) a -.
  • -(alkylene-O) a -alkylene- contained in S41, -(C 2-6 alkylene-O) a -C 2-6 alkylene- contained in S42, and -(C 2-5 alkylene-O) a -C 2-5 alkylene- contained in S43 are preferably -(C 2 H 4 -O) a -C 2 H 4 -.
  • a may be 1 to 4, 2 to 4, 3 or 4, etc., and is most preferably 4.
  • S4 is —(C 1-6 alkylene-O) 1-4 —C 1-6 alkylene-NH—, —C 1-6 alkylene-NH—CO—(C 1-6 alkylene-O) 1-4 —C 1-6 alkylene-NH—, —C 1-6 alkylene-NH—CO—(1-(M-SO 3 —C 1-6 alkylene)-1,2,3-triazol-4-yl, branched C 2-6 alkylene optionally having a substituent selected from NH 2 , NH(C 1-6 alkyl), N(C 1-6 alkyl) 2 , NH 2 C( ⁇ NH)NH, and NHT)-NH—CO—(C 1-6 alkylene-O) 1-4 —C 1-6 alkylene-NH—, or —C 1-6 alkylene - NH—CO—C 1-6 alkylene-(L-1)-C 1-6 alkylene-CO-NH-(C 1-6 alkylene-O) 1-4 -C
  • E is a group (cleavable site) that can be cleaved under specific conditions.
  • groups There are no particular restrictions on such groups as long as they have the above-mentioned effect, but they are preferably groups that can be cleaved under mild reaction conditions. Examples of such groups include the following:
  • Q 1 , Q 2 , Q 3 , Q 4 , Q 5 , and Q 6 are each independently H or alkyl (preferably C 1-6 alkyl); A 1 , A 2 , A 3 , and A 4 are each independently arylene (preferably C 6-18 arylene); Pep is a peptide residue having an amino acid sequence represented by ENLYFQG (SEQ ID NO: 1), ENLYFQS (SEQ ID NO: 2 ) , or X1 , X2 , X3 , X4 , X5 , X6 , X7 ( X1 , X2 , X3, X5, X6, and X7 are each independently an amino acid residue other than K or R, and X4 is K or R).
  • ENLYFQG SEQ ID NO: 1
  • ENLYFQS SEQ ID NO: 2
  • Q1 and Q2 are alkyl
  • Q3 , Q4 , Q5 , and Q6 are H
  • alkyl is preferably C1-6 alkyl, more preferably C1-4 alkyl, even more preferably C1-3 alkyl, particularly preferably C1-2 alkyl, and especially preferably methyl.
  • A1 and A2 are preferably phenylene or naphthylene, more preferably phenylene.
  • A3 and A4 are preferably phenylene or naphthylene, more preferably phenylene (e.g., 1,3-phenylene, 1,4-phenylene).
  • mild reaction conditions are preferably conditions under which the captured protein is not degraded by the treatment and contaminating proteins nonspecifically bound to the avidin beads are not eluted.
  • Specific examples include conditions under which the cleavable site E is cleaved chemically or biochemically, such as treatment with a dilute aqueous hydrazine solution, a dilute aqueous sodium periodate solution, a dilute aqueous sodium dithionite solution, a dilute formic acid solution, a tobacco etch virus (TEV) protease solution, a dilute aqueous tris(2-carboxyethyl)phosphine solution, or a dilute aqueous dithiothreitol solution.
  • Treatment with a dilute aqueous hydrazine solution is more preferred.
  • dilute here refers to a concentration of 5% by mass or less, preferably 3% by mass or less, although this is not limited thereto.
  • S is preferably -S2- or -S3-E-S4-. Furthermore, from the standpoint of preventing nonspecific elution during protein purification, S is more preferably -S3-E-S4-, and even more preferably -S31-E-S41-, -S32-E-S41-, -S33-E-S42-, -S34-E-S42-, -S35-E-S42-, -S36-E-S42-, -S33-E-S43-, -S34-E-S43-, -S35-E-S43-, or -S36-E-S43-.
  • S include the following: In the following, it is preferred that the left end is bonded to R and the right end is bonded to Tag, and at least one alkylene may be branched alkylene and may have one or more substituents R3 .
  • S More preferred examples include the following: In the following, it is preferred that the left end is bonded to R and the right end is bonded to Tag, and the branched alkylene (particularly its end) preferably has one or more substituents R3 .
  • alkylene is preferably linear or branched C2-6 alkylene
  • branched alkylene is preferably C2-6 alkylene.
  • the protein purification tag site is not particularly limited as long as it can purify the protein.
  • tags include biotin tags, imidazolidinone tags, His tags, Halo tag ligands, FlagTM tags, Spot tags, C tags, Strep tags, GST (Glutathione-S-Transferase) tags, and MBP (Maltose binding protein) tags.
  • biotin tags, imidazolidinone tags, His tags, and Halo tag ligands are preferred, and specifically, the following formulas (2-1), (2-2), (2-3), and (2-4) are preferred, the following formulas (2-1), (2-2), and (2-3) are more preferred, and the following formula (2-1) is even more preferred.
  • RS-Tag can be any combination of the above R, S, and Tag. Suitable examples of RS-Tags include the following: (1A)-S3-E-S4-(2-1) (1B)-S3-E-S4-(2-1) (1A)-S31-E-S41-(2-1) (1B)-S31-E-S41-(2-1) (1A)-S32-E-S41-(2-1) (1B)-S32-E-S41-(2-1) (1A)-S33-E-S42-(2-1) (1A)-S34-E-S42-(2-1) (1A)-S35-E-S42-(2-1) (1A)-S36-E-S42-(2-1) (1A)-S33-E-S43-(2-1) (1A)-S34-E-S43-(2-1) (1A)-S34-E-S43-(2-1) (1A)-S34-E-S43-(2-1) (1A)-S34-E-S43-(
  • RS-Tags include the following: (1A)-(S-1)-(2-1) (1B)-(S-1)-(2-1) (1A)-(S-2)-(2-1) (1B)-(S-2)-(2-1) (1A)-(S-3)-(2-1) (1B)-(S-3)-(2-1) (1A)-(S-4)-(2-1) (1B)-(S-4)-(2-1) (1A)-(S-5)-(2-1) (1B)-(S-5)-(2-1) (1A)-(S-6)-(2-1) (1B)-(S-6)-(2-1) (1A)-(S-7)-(2-1) (1B)-(S-7)-(2-1) (1B)-(S-7)-(2-1) (1A)-(S-8)-(2-1) (1B)-(S-8)-(2-1) (1A)-(S-10)-(2-1) (1A)-(S-11)-(2-1) (1B)-(S-11)-(2-1) (1AA)-
  • the functional compound having an RS-Tag may be in the form of a salt.
  • the salt may be a salt with an acid or a salt with a base.
  • the acid is not particularly limited, but examples include inorganic acids and organic acids.
  • inorganic acids include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, hydrobromic acid, and phosphoric acid.
  • organic acids include acetic acid, trifluoroacetic acid, oxalic acid, phthalic acid, fumaric acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and 10-camphorsulfonic acid.
  • the acid may be used alone or in combination of two or more.
  • the base is not particularly limited, but examples include inorganic bases and organic bases.
  • inorganic bases include alkali metal hydroxides (e.g., sodium hydroxide, potassium hydroxide), alkaline earth metal hydroxides (e.g., magnesium hydroxide, calcium hydroxide), alkali metal carbonates (e.g., sodium carbonate, potassium carbonate), alkaline earth metal carbonates (e.g., magnesium carbonate, calcium carbonate), alkali metal bicarbonates (e.g., sodium bicarbonate, potassium bicarbonate), alkali metal phosphates (e.g., sodium phosphate, potassium phosphate), alkaline earth metal phosphates (e.g., magnesium phosphate, calcium phosphate), etc.
  • alkali metal hydroxides e.g., sodium hydroxide, potassium hydroxide
  • alkaline earth metal hydroxides e.g., magnesium hydroxide, calcium hydroxide
  • alkali metal carbonates e.g., sodium carbonate,
  • organic bases include trialkylamines (e.g., trimethylamine, triethylamine, diisopropylethylamine), picoline, 1,5-diazabicyclo[4.3.0]non-5-ene, 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene, etc.
  • trialkylamines e.g., trimethylamine, triethylamine, diisopropylethylamine
  • picoline 1,5-diazabicyclo[4.3.0]non-5-ene
  • 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene, etc.
  • Suitable examples of the functional compound or salt thereof of the present disclosure include functional compounds represented by any of the following formulae (P1), (P2), (P3), (P4), (P5), (P6), (P7), (P8), (P9), (P10), (P11), (P12), (P13), (P14), (P15), (P16), (P17), (P18), (P19), (P20), (P21), (P22), (P23), (P24), (P25), (P26), (P27), and (P28) and salts thereof.
  • T is preferably a substituted carbonyl, more preferably any of the following formulae (T-1), (T-2), (T-3), (T-4), (T-5), (T-6), (T-7), (T-8), (T-9), and (T-10).
  • Suitable examples of salts of functional compounds of the present disclosure include salts of functional compounds represented by formula (P5a) or (P6a), and trifluoroacetic acid (TFA) salts of functional compounds represented by formula (P7), (P8), (P13), (P14), (P15), (P16), (P19), (P20), (P21), (P22), (P23), or (P24).
  • Specific examples include the following:
  • Suitable examples of salts of functional compounds of the present disclosure include the compounds of Example 1, Example 2, Example 3, Example 4, Example 5, Example 6, Example 7, Example 8, Example 9, Example 10, Example 11, Example 12, Example 13, Example 14-1, Example 14-2, Example 14-3, Example 14-4, Example 14-5, Example 14-6, Example 14-7, Example 14-8, Example 14-9, and Example 14-10.
  • the raw material compounds may be commercially available or may be synthesized according to known methods or methods equivalent thereto.
  • the solvents, acids, bases, protecting groups, and leaving groups that may be used as appropriate in the production of the functional compounds or salts thereof disclosed herein are not particularly limited, as long as they are commonly used in the field of organic synthetic chemistry.
  • the product can be used in the next reaction either as the reaction liquid or as a crude product, or it can be isolated from the reaction mixture using conventional methods and easily purified using conventional separation means.
  • Conventional separation means include, for example, filtration, extraction, concentration, evaporation, crystallization, recrystallization, reprecipitation, distillation, chromatography, and optical resolution.
  • the raw material compounds, intermediate compounds, and final compounds may be in the form of salts, and the target compounds obtained in each reaction may also form salts.
  • each compound is a free compound, it can be converted into the target salt by a method known per se, and when the compound is a salt, it can be converted into the free form or another target salt by a method known per se.
  • the method for producing a functional compound or a salt thereof of the present disclosure typically includes a step of reacting R-SA with SB-Tag to obtain R-S-Tag.
  • SA and SB are precursor groups of S, and are not particularly limited as long as they are groups that link together to form S through a reaction.
  • the step of producing R-SA, or the step of producing SB-Tag at least one reaction selected from, for example, an alkylation reaction, hydrolysis reaction, amination reaction, esterification reaction, amidation reaction, etherification reaction, nucleophilic substitution reaction, addition reaction, oxidation reaction, and reduction reaction may be used.
  • protection with a protecting group and deprotection with a deprotecting agent may be performed as necessary.
  • R-S-Tag is R-S3-(E-1)-S4-Tag
  • R-S3-(E-1)-S4-Tag it can be obtained, for example, by reacting a compound represented by formula (R1) with a compound represented by formula (R2) in the presence of a base (e.g., a trialkylamine such as DIPEA) in a solvent (e.g., an amide solvent such as DMF), as shown in the reaction scheme below.
  • a base e.g., a trialkylamine such as DIPEA
  • solvent e.g., an amide solvent such as DMF
  • R-S-Tag is R-S3-(E-6)-S4-Tag, for example, as shown in the reaction scheme below, it can be obtained by reacting a compound represented by formula (R3) with a compound represented by formula (R4) in the presence of a compound represented by formula (R5) and a base (e.g., a trialkylamine such as TEA) in a solvent (e.g., a halohydrocarbon solvent such as DCM, or an amine solvent such as pyridine).
  • a base e.g., a trialkylamine such as TEA
  • a solvent e.g., a halohydrocarbon solvent such as DCM, or an amine solvent such as pyridine
  • R-S-Tag is R-S3-(E-7)-S41-Tag, for example, as shown in the reaction scheme below, it can be obtained by reacting a compound represented by formula (R6) with a compound represented by formula (R7) in the presence of a condensing agent (e.g., COMU) and a base (e.g., a trialkylamine such as DIPEA) in a solvent (e.g., an amide solvent such as DMF).
  • a condensing agent e.g., COMU
  • a base e.g., a trialkylamine such as DIPEA
  • a solvent e.g., an amide solvent such as DMF
  • composition of the present disclosure contains a functional compound or a salt thereof in which R is a group represented by formula (1A), and a functional compound or a salt thereof in which R is a group represented by formula (1B).
  • the functional compound in which R is a group represented by formula (1B) is an isomer of the functional compound in which R is a group represented by formula (1A), that is, R1 in formula (1B) is the same as R1 in formula (1A), and R2 in formula (1B) is the same as R2 in formula (1A).
  • the mass ratio (or molar ratio) of the functional compound or salt thereof in which R is a group represented by formula (1A) to the functional compound or salt thereof in which R is a group represented by formula (1B) is, for example, 10/90 to 90/10, preferably 20/80 to 80/20, and more preferably 30/70 to 70/30.
  • compositions of the present disclosure include the following compositions: A composition comprising a functional compound represented by formula (P1) or a salt thereof and a functional compound represented by formula (P2) or a salt thereof. A composition comprising a functional compound represented by formula (P3) or a salt thereof and a functional compound represented by formula (P4) or a salt thereof. A composition comprising a functional compound represented by formula (P5) or a salt thereof (preferably (P5a)) and a functional compound represented by formula (P6) or a salt thereof (preferably (P6a)).
  • a composition comprising a functional compound represented by formula (P7) or a salt thereof (preferably a TFA salt or (P7a)) and a functional compound represented by formula (P8) or a salt thereof (preferably a TFA salt or (P8a)).
  • a composition comprising a functional compound represented by formula (P9) or a salt thereof and a functional compound represented by formula (P10) or a salt thereof.
  • a composition comprising a functional compound represented by formula (P11) or a salt thereof and a functional compound represented by formula (P12) or a salt thereof.
  • a composition comprising a functional compound represented by formula (P13) or a salt thereof (preferably a TFA salt or (P13a)) and a functional compound represented by formula (P14) or a salt thereof (preferably a TFA salt or (P14a)).
  • a composition comprising a functional compound represented by formula (P15) or a salt thereof (preferably a TFA salt or (P15a)) and a functional compound represented by formula (P16) or a salt thereof (preferably a TFA salt or (P16a)); a composition comprising a functional compound represented by formula (P17) or a salt thereof and a functional compound represented by formula (P18) or a salt thereof; a composition comprising a functional compound represented by formula (P19) or a salt thereof (preferably a TFA salt or (P19a)) and a functional compound represented by formula (P20) or a salt thereof (preferably a TFA salt or (P20a)); a functional compound represented by formula (P21) or a salt thereof (preferably a TFA salt or (P21a)), A composition comprising a functional compound represented by formula (P22) or a salt thereof (preferably a TFA salt or (P22a)).
  • a composition comprising a functional compound represented by formula (P23) or a salt thereof (preferably a 2TFA salt or (P23a)) and a functional compound represented by formula (P24) or a salt thereof (preferably a 2TFA salt or (P24a)).
  • a composition comprising a functional compound represented by formula (P25) or a salt thereof and a functional compound represented by formula (P26) or a salt thereof.
  • a composition comprising a functional compound represented by formula (P27) or a salt thereof and a functional compound represented by formula (P28) or a salt thereof.
  • composition of the present disclosure can be produced, for example, as an intermediate product (or crude product) in the production method described above in (2-7).
  • the composition of the present disclosure can be suitably used as a chemical probe, and can also be suitably used for the detection or identification of cell surface proteins, comprehensive analysis of cell surface proteins, or proximity-dependent labeling, as described below.
  • the detection or identification of a protein using a chemical probe can be carried out by, but is not limited to, a method comprising the following steps (1) and (2).
  • the concentration of the chemical probe used in step (1) is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ g/mL or more, more preferably 5 ⁇ g/mL or more, and even more preferably 10 ⁇ g/mL or more.
  • the reaction temperature in step (1) is not particularly limited, but is, for example, 1 to 35°C.
  • the reaction time in step (1) may be, for example, 10 seconds or more, 30 seconds or more, or 1 minute or more, or may be 30 minutes or less, 20 minutes or less, 10 minutes or less, or 5 minutes or less.
  • the detection or identification of cell surface proteins using chemical probes is preferably carried out by a method comprising the following steps (A), (B), (C), and, if necessary, steps (D) and (E).
  • A reacting a chemical probe with cells or tissues in a sample (preferably by activating the chemical probe with hydrogen peroxide and peroxidase) to bind a tyrosine residue reactive site R in the chemical probe to a tyrosine residue of a cell surface protein
  • B purifying (preferably by lysing the cells) the fraction containing the cell surface protein bound to the chemical probe;
  • C binding the protein purification tag site (Tag) in the chemical probe to a labeling substance (for example, binding a biotin site (e.g., T) to avidin (e.g., a labeling substance) to form a chemical probe-labeling substance complex
  • D cleaving (preferably chemically or biochemically) the formed chemical probe-label complex at the cleavable site E in the chemical
  • Step A Step of binding tyrosine residue reactive site R to tyrosine residues of cell surface proteins. This step can be performed, but is not limited to, by culturing cells at 37°C in a 5% CO2 atmosphere until the cells reach confluence. The medium is then removed, washed with PBS or similar, and hydrogen peroxide (e.g., 0.00003% or more) and peroxidase (e.g., 0.0016% or more) diluted in PBS are added.
  • hydrogen peroxide e.g., 0.00003% or more
  • peroxidase e.g., 0.0016% or more
  • a chemical probe adjusted to a desired concentration in DMSO (e.g., 1 ⁇ g/mL or more, preferably 5 ⁇ g/mL or more, and more preferably 10 ⁇ g/mL or more) is then added, followed by allowing the mixture to stand at approximately 1 to 35°C for approximately 1 to 5 minutes.
  • the reaction solution is removed, and unreacted probe can be removed by washing with a medium such as DMEM. Furthermore, washing with a medium such as DMEM can inactivate unreacted probe due to the high content of phenol red and tyrosine as an amino acid.
  • Step of purifying fractions containing cell surface proteins bound to chemical probes This step can be performed, but is not limited to, by the following method: First, RIPA buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% Triton-X-100, Complete protease inhibitor (Roche)) is added to the cells, vortexed, incubated on ice for 30 minutes, and then centrifuged at 16,000 ⁇ g at 4°C for 20 minutes to recover the supernatant, allowing the fraction containing the proteins bound to the chemical probes to be recovered.
  • RIPA buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% Triton-X-100, Complete protease inhibitor (Roche)
  • (C) A step in which the protein purification tag site (e.g., biotin site) in the chemical probe is bound to a labeling substance (e.g., avidin) to form a chemical probe-labeling substance complex.
  • This step is not limited to, but may involve, for example, adding labeling substance magnetic particles (e.g., streptavidin magnetic particles) to the fraction recovered in (B) above.
  • labeling substance magnetic particles e.g., streptavidin magnetic particles
  • the biotin site which is an example of the protein purification tag site (e.g., avidin)
  • magnetic separation is then performed according to standard methods.
  • the supernatant is then discarded, allowing the chemical probe-labeling substance complex to be purified and recovered.
  • step (D) A step of cleaving the formed chemical probe-labeled substance complex at the cleavable site E in the chemical probe.
  • the compound recovered in step (C) is a chemical probe-avidin complex (magnetic particle complex)
  • this step can be performed by adding an aqueous solution of SDS (sodium dodecyl sulfate) and hydrazine to the complex and allowing it to stand at room temperature (1-30°C) for 30 minutes.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • hydrazine sodium dodecyl sulfate
  • This reaction cleaves the cleavable site in the chemical probe, separating the chemical probe-avidin complex into the target protein binding domain and the biotin-avidin binding domain.
  • the reaction solution is magnetically separated to obtain the supernatant, allowing the cell surface protein binding domain fragment to be recovered.
  • the previously collected complex or its cell surface protein-binding domain fragment may be subjected to purification and/or hydrolysis, as necessary. Specifically, but not limited to, for example, dithiothreitol is added to the obtained supernatant and the mixture is left to stand at 70°C for 15 minutes. Next, iodoacetamide is added and the mixture is stirred at room temperature for 30 minutes. SP3 beads are added to the resulting solution, followed by MeCN and incubation for 18 minutes. After incubation, magnetic separation is performed and the supernatant is discarded.
  • dithiothreitol is added to the obtained supernatant and the mixture is left to stand at 70°C for 15 minutes.
  • iodoacetamide is added and the mixture is stirred at room temperature for 30 minutes.
  • SP3 beads are added to the resulting solution, followed by MeCN and incubation for 18 minutes. After incubation, magnetic separation is performed and the supernatant is discarded.
  • peptide degradation is performed by adding a trypsin solution to the residue collected above and incubating at 37°C for 12 to 16 hours. MeCN is added, followed by incubation for 18 minutes, magnetic separation is performed, and the supernatant is discarded. Aqueous TFA solution is added to the residue and the mixture is incubated for 3 minutes. After magnetic separation, the supernatant is obtained.
  • the peptides thus prepared are desalted and resuspended in an appropriate buffer solution for analysis using a high-mass accuracy mass spectrometer.
  • the mass spectrometer is operated in a data-dependent acquisition mode, for example but not limited to, where an ion signal above a predetermined threshold automatically triggers the instrument to switch from MS to MS/MS mode to generate a collision-induced dissociation (CID) spectrum or a higher-energy collisional dissociation (HCD) spectrum of the peptide. It may also be operated in a data-independent acquisition mode, for example but not limited to, where all MS/MS spectra are searched against a standard protein database.
  • CID collision-induced dissociation
  • HCD collisional dissociation
  • the peptides thus obtained are analyzed. Any method for analyzing such compounds available in the art can be used, with mass spectrometry being the preferred method. Mass spectrometry methods are well known to those skilled in the art (see, for example, Yates, J. Mass Spect. 33:1-19 (1998); Kinter and Sherman, Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry, John Wiley and Sons, New York (2000); Aebersold and Goodlett, Chem. Rev. 101:269-295 (2001)).
  • liquid chromatography ESI-MS/MS or automated LC-MS/MS can be used, using capillary reversed-phase chromatography as the separation method (Yates et al., Methods Mol. Biol. 112:553-569 (1999)).
  • CID collision-induced dissociation
  • HCD collision-induced dissociation
  • mass spectrometers are typically operated in a data-dependent acquisition mode, in which ion signals above a predetermined threshold automatically trigger the instrument to switch from MS to MS/MS mode to generate a collision-induced dissociation (CID) or higher-energy collision-induced dissociation (HCD) spectrum of the peptide.
  • CID collision-induced dissociation
  • HCD collision-induced dissociation
  • MS/MS spectra are searched against standard protein databases using standard algorithms (SEQUEST, Mascot, X!tandem, MS Aanda, etc.), with typical filtering to limit the false-positive protein identification rate to less than 1%.
  • the concentration of membrane proteins in a sample can be quantitatively compared with a control sample, allowing for the detection of specific enrichment of target membrane protein receptors.
  • reversed-phase chromatography immediately prior to mass analysis can be displayed as an MS feature map, plotting retention time features against mass/charge ratio. As detected by the mass spectrometer, peptides in such a map appear in distinct isotopic patterns over a given time period and at defined ion current intensities depending on their abundance in the sample.
  • MS feature maps of different samples can then be overlaid and compared to obtain peptide abundance ratios. For stochastically labeled peptides derived from membrane proteins, these ratios should be approximately 1, with membrane protein peptides that are specifically captured based on their ligands obtaining higher values compared to the control sample.
  • alternative mass spectrometry-based quantification methods can be used, such as single reaction monitoring (SRM), stable isotope labeling of amino acids in cell culture (SILAC; see, e.g., Nilsson et al., Nat Methods (2010) vol. 7(9) pp.
  • SRM single reaction monitoring
  • SILAC stable isotope labeling of amino acids in cell culture
  • SWATH MS data-independent acquisition of mass spectra
  • TMT tandem mass tags
  • MS analysis may be replaced by other analytical methods. Such other methods are included as part of this method.
  • the chemical probe of the present invention By using the chemical probe of the present invention to identify peptide sequences with a portion of the probe structure attached by mass spectrometry, the topology of membrane proteins can be determined. Furthermore, the solvent-exposed portions of the protein can be identified, which can be used as structural information.
  • Region-restricted proximity-dependent labeling By using the above-described functional compound or a salt thereof as a chemical probe, it is possible to carry out region-restricted proximity-dependent labeling of, for example, proteins having tyrosine residues, particularly surface proteins of cells present in living cells or living tissues.
  • Regionally restricted proximity-dependent labeling can be achieved by restricting the peroxidase used for labeling to a specific region.
  • ligands or antibodies specific to membrane proteins can be used as a means of restricting localization to a specific region.
  • proximity-dependent labeling can be achieved by adding a peroxidase-labeled ligand or peroxidase-labeled antibody, or by fusing peroxidase to a specific membrane protein through genetic engineering and expressing it.
  • Detection or identification of a protein by proximity-dependent labeling using a chemical probe can be carried out by a method including, but not limited to, the following steps (1a), (1b), and (2).
  • the concentration of the chemical probe used in step (1b) is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ g/mL or more, more preferably 5 ⁇ g/mL or more, and even more preferably 10 ⁇ g/mL or more.
  • the concentration of hydrogen peroxide used in step (1b) is not particularly limited, but may be, for example, 0.00003% or more, 0.00004% or more, or 0.00005% or more.
  • the reaction temperature in step (1b) is not particularly limited, but is, for example, 1 to 35°C.
  • the reaction time in step (1b) may be, for example, 10 seconds or more, 30 seconds or more, or 1 minute or more, or may be 30 minutes or less, 20 minutes or less, 10 minutes or less, or 5 minutes or less.
  • Proximity-dependent labeling using a chemical probe is preferably carried out by a method comprising the following steps (A1), (A2), (B), (C), (D), and (E).
  • A1 a step of reacting a peroxidase-labeled ligand or a peroxidase-labeled antibody with cells or tissues in a sample to bring peroxidase into close proximity with specific cell surface proteins;
  • A2) A step of activating a chemical probe with hydrogen peroxide to react with cells or tissues in a sample, thereby binding a tyrosine residue reactive site R in the chemical probe to a tyrosine residue of a specific cell surface protein and a protein in its vicinity;
  • B purifying (preferably by lysing the cells) the fraction containing the cell surface protein bound to the chemical probe;
  • C binding the protein purification tag site (Tag) in the chemical probe to a labeling substance (for example, binding a biotin site (e.g., T) to avidin
  • This step can be performed, but is not limited to, by culturing cells at 37°C in a 5% CO2 atmosphere, confirming that the cells are confluent, removing the medium, washing with PBS or similar containing 2% FCS (fetal calf serum), adding a peroxidase-labeled ligand or peroxidase-labeled antibody, and allowing the cells to stand on ice for approximately 20 minutes.
  • a buffer such as PBS.
  • a step of binding a tyrosine residue reactive site R to a tyrosine residue of a cell surface protein in the presence of hydrogen peroxide can be carried out by adding hydrogen peroxide diluted with PBS (e.g., 0.00003% or more), adding a chemical probe adjusted to a desired concentration with DMSO (e.g., 1 ⁇ g/mL or more, preferably 5 ⁇ g/mL or more, and more preferably 10 ⁇ g/mL or more), and allowing to stand at about 1 to 35°C for about 1 to 5 minutes.
  • the reaction solution can be removed, and unreacted probe can be removed by washing with a medium such as DMEM. Furthermore, washing with a medium such as DMEM can inactivate unreacted probe, since it contains a large amount of phenol red and tyrosine as an amino acid.
  • room temperature generally refers to a temperature between about 10°C and about 35°C. Ratios shown for mixed solvents are by volume unless otherwise specified. % refers to weight % unless otherwise specified.
  • H NMR (proton nuclear magnetic resonance) spectra were measured using a Fourier transform NMR (Bruker AVANCE III 400 (400 MHz), Bruker AVANCE III HD (500 MHz), BRUKER AVANCE 400 (400 MHz), or BRUKER AVANCE III 300N (300 MHz)). Spectra were analyzed using either MestReNova version: 14.1.2 (Mestrelab Research) or ACD/Spectrus ProcessorTM (ACD). Mass spectra (MS) were measured using LC/MS (either ACQUITY UPLC H-Class or Shimadzu LCMS2020). Electrospray ionization (ESI) was used, and the data reported are actual measurements.
  • ESI Electrospray ionization
  • M1-1 and Example 1 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • M2-1 the constituent atoms of the ring are numbered for convenience in explaining the substitution positions.
  • M2-1, M2-3, M2-4, and Example 2 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • M3-12, M3-13, and Example 3 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • M4-1, M4-3, M4-4, M4-6, and Example 4 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • M5-9 the constituent atoms of the ring are numbered for convenience in explaining the substitution positions.
  • M5-9, M5-10, and Example 5 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • Example 5 (Synthesis of Example 5) To a mixture of M5-10 (6.0 mg) and DCM (0.5 mL), TFA (0.2 mL) was added and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was evaporated, and the residue was purified by column chromatography (ODS, water/MeCN, containing 0.1% TFA) to give Example 5 (4.9 mg).
  • M6-5, M6-6, and Example 6 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • Trifluoromethylbenzene (6.1 mL) and M6-2 (tert-butyl aziridine-1-carboxylate) (0.19 mL) were added, and the mixture was irradiated with blue LED light for 2 hours.
  • the solvent was evaporated, and the residue was purified by column chromatography (silica gel, hexane/AcOEt) to obtain the desired product (104 mg).
  • M7-1, M7-3, and Example 7 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • Example 7 (Synthesis of Example 7) To a mixture of M7-3 (10 mg) and DCM (0.5 mL), TFA (0.1 mL) was added and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was evaporated, and the residue was purified by column chromatography (ODS, water/MeCN, containing 0.1% TFA) to give Example 7 (8.4 mg).
  • M8-8 In the 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione M8-8, the constituent atoms of the ring are numbered for convenience in explaining the substitution positions.
  • M8-8 and Example 8 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • M9-8, M9-9, and Example 9 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • Example 9 (Synthesis of Example 9) To a mixture of M9-9 (10 mg) and DCM (0.5 mL) was added TFA (0.5 mL) and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was evaporated, and the residue was purified by column chromatography (ODS, water/MeCN, containing 0.1% TFA) to give Example 9 (6.3 mg).
  • M10-8 In the 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione M10-8, the constituent atoms of the ring are numbered for convenience in explaining the substitution positions.
  • M10-8 and Example 10 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • Example 10 (Synthesis of Example 10) To a mixture of M10-7 (12 mg) prepared above, M10-8 (4.2 mg) represented by the formula above, and DMF (1 mL) was added DIPEA (7.5 ⁇ L), and the mixture was stirred for 4 hours at 60° C. The reaction mixture was purified by column chromatography (ODS, water/MeCN, containing 0.1% TFA) to obtain Example 10 (5.1 mg).
  • M11-5 and Example 11 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • M12-1 In the 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione M12-1, the constituent atoms of the ring are numbered for convenience in explaining the substitution positions.
  • M12-1 and Example 12 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • Example 12 (Synthesis of Example 12) To a mixture of M12-1 (7.6 mg), M12-2 (d-desthiobiotin) (5.6 mg), and DMF (1 mL), WSC ⁇ HCl (6.0 mg) and HOBt ⁇ H 2 O (4.8 mg) were added and stirred at room temperature for 15 hours. The solvent was evaporated, and the residue was purified by column chromatography (ODS, water/MeCN) to give Example 12 (8.9 mg).
  • M13-1 In the 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione M13-1, the constituent atoms of the ring are numbered for convenience in explaining the substitution positions.
  • M13-1 and Example 13 are mixtures of a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 6-position, and its isomer (a compound having methyl (R 1 ) at the 2-position, H (R 2 ) at the 3-position, and a substituent at the 7-position).
  • Example 14 is the same isomer mixture as Example 4.
  • Example 14 used in Test Example 3 was prepared as follows.
  • the TMT reagent shown in the table below i.e., TMT10plex TM Isobaric Label Reagents (cat:90110, Thermo Scientific TM ), was dissolved in acetonitrile to make a 50 mM solution.
  • TMT10plex TM Isobaric Label Reagents catalog:90110, Thermo Scientific TM
  • Example 4 10 mg/mL
  • DMSO and 1 M TEAB was added, and the mixture was allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • PBS was added to adjust the concentration of the TMT-labeled probe to 100 ⁇ g/mL, and this was used for cell labeling in Test Example 3.
  • Comparative example 1 N-(15-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-18-(4-hydroxyphenyl)-3,6,9,12-tetraoxa -16-azaoctadecyl)-5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamide
  • Comparative example 2 sodium 2,5-dioxo-1-((3-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)ethyl)disulfaneyl)propanoyl)oxy)pyrrolidine-3-sulfonate
  • Test Example 1 Comprehensive analysis of cell surface proteins using chemical probes 1.
  • Cell Culture and Treatment of Cultured Cells with the Compound A549 cells (ATCC® Registration No. CCL185 TM ) were seeded at 2 x 105 cells per well in a 24-well plate and cultured overnight at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. After washing with PBS, the cells were immersed in a 0.2% HRP solution prepared with PBS. A labeling solution containing 0.006% hydrogen peroxide and 20 ⁇ g/mL of the probe shown in Examples 1 to 13 or Comparative Example 1, prepared with PBS, was then added in an amount equal to the HRP solution added previously. The final concentrations were 10 ⁇ g/mL probe, 0.003% hydrogen peroxide, and 0.1% HRP.
  • Cell lysis RIPA buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% Triton-X-100, Complete protease inhibitor (Roche)) was added to the cells, vortexed, and incubated on ice for 30 minutes. The cells were then centrifuged at 16,000 ⁇ g at 4°C for 20 minutes, and the supernatant was collected to prepare the cell lysate.
  • RIPA buffer 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% Triton-X-100, Complete protease inhibitor (Roche)
  • Biotinylated proteins were recovered from cell lysates using Pierce TM Streptavidin Magnetic Beads (#88817, Thermo Scientific TM ). Purification was performed using a KingFisher TM Flex (Thermo Scientific TM ). After adsorption of the proteins onto the beads, they were washed with RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5/150 mM NaCl/0.1% SDS/0.5% SDC/1% Triton X-100) containing 8 M urea and 400 mM arginine.
  • RIPA buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.5/150 mM NaCl/0.1% SDS/0.5% SDC/1% Triton X-100
  • the resulting beads were then incubated with 2% hydrazine/0.05% SDS solution at room temperature for 1 hour (two 30-minute incubations, with magnetic separation and supernatant recovery after each incubation). This cleaved the proteins from the biotin, and the resulting solution was then recovered.
  • Sulfo-NHS-SS-Biotin was used as a probe, the protein was cleaved from biotin by reductive elution with DTT according to the manufacturer's instructions, and the solution was recovered by magnetic separation.
  • the recovered solution was concentrated using a Savant TM SpeedVac TM centrifugal concentrator (Thermo Scientific TM ), reduced with 5 mM DTT (incubated at 70°C for 15 minutes), and alkylated with 50 mM iodoacetamide (incubated at room temperature for 30 minutes with shaking, protected from light).
  • Proteins were purified using Sera-Mag TM SpeedBead Carboxylate-Modified [E3, E7] Magnetic Particles (#65152105050250, #45152105050250, Cytiva) on a Bravo (Agilent) automated purification system.
  • LC-MS Analysis and Identification of Target Proteins was performed using an LC-MS system combining a nano-HPLC UltiMate TM 3000 (Thermo Scientific TM ) with an Orbitrap Eclipse TM mass spectrometer equipped with a FAIMS Pro TM interface.
  • the nano-HPLC system consisted of a trap column (C18 Acclaim TM PepMap TM , Thermo Scientific TM ) and a tip column (75 ⁇ m id, 12 cm long, 3 ⁇ m C18 particles, Nikkyo Technos) as the stationary phase.
  • Reversed-phase gradient analysis was performed using a 0.1% formic acid-acetonitrile mobile phase.
  • the flow rate was 300 nL/min, and peptides were eluted with a linear gradient increasing the acetonitrile concentration from 4% to 35%.
  • Mass spectrometry was performed using either data-dependent acquisition (DDA) or data-independent acquisition (DIA), both of which were performed using nanoelectrospray ionization in positive ion mode.
  • DDA data-dependent acquisition
  • DIA data-independent acquisition
  • MS1 spectra were measured from m/z 375 to 1500.
  • Precursors were data-dependently selected and fragmented by HCD to obtain MS2 spectra.
  • FAIMS was performed under three CV conditions: -40V, -60V, and -80V.
  • DDA data were analyzed using Proteome Discovere 3.0 (PD 3.0, Thermo Scientific TM ).
  • the identified proteins were identified as surface proteins by matching them with the in silico surfaceome database (Bausch-Fluck, D., Goldmann, U., Muller, S., van Oostrum, M., Muller, M., Schubert, O. T., & Wollscheid, B. (2018).
  • the in silico human surfaceome Proceedings of the National Academy of Sciences, 115(46), E10988-E10997.).
  • the amount of surface protein detected relative to Comparative Example 1 was determined from the surface protein identification results obtained with each probe. Specifically, the ratio of each Comparative Example to Comparative Example 1 was expressed as a logarithmic value with the base 2, and the distribution is shown in the histogram in Figure 1. When the average value of the distribution was calculated, 29.04 times more surface protein was detected on average in Example 1, 36.76 times more in Example 2, 41.64 times more in Example 5, and 35.02 times more in Example 6 than in Comparative Example 1. The average ratio of the amount of surface protein detected in each Example to Comparative Example 1 was as shown in Table 1.
  • Example 2 had an average of -2.14 times the amount detected for Comparative Example 1, and Example 6 had an average of -1.77 times the amount detected for Comparative Example 1 ( Figures 2(c) and (d)). This means that the Examples have higher selectivity for surface protein than Comparative Example 2.
  • FIG. 5 shows the number of surface proteins for the top 100 identified proteins in Comparative Example 1, Comparative Example 2, and each Example.
  • Comparative Example 1 30 of the top 100 were surface proteins, while in each Example, 57 to 64 were surface proteins. Furthermore, in Comparative Example 2, there were 50 surface proteins, which decreased to 44 after 2 hours of labeling. Comparative Example 2 is currently widely used, but is less stable due to hydrolysis, making long-term storage in solution difficult. Furthermore, because it is constantly reactive, the reaction cannot generally be controlled.
  • activation relies on HRP, so it activates and reacts only near HRP, which does not enter cells, i.e., outside the cells. Inactivation can be easily achieved by washing away extracellular HRP and hydrogen peroxide, and even if there is residual probe present during cell lysis, it will not be labeled.
  • Example 6 Using the identification in Example 6, in order to analyze the localization of chemically modified residues in membrane proteins, the modification positions were analyzed using Protter 1.0 (https://wlab.ethz.ch/protter/#), which visualizes based on estimated membrane topology information. As an example, the results for the EGF receptor are shown in Figure 7. As a result, the modification positions in Example 6 selectively modified tyrosine residues in the extracellular region, and no traces of chemical modification by the probe were detected in tyrosine residues in the intracellular region. Because this compound reacts with extracellular tyrosine residues, it is suggested that it is possible to detect and recover cell surface proteins with high selectivity.
  • Protter 1.0 https://wlab.ethz.ch/protter/#
  • Test Example 2 A549 cells were labeled using Example 6 according to the method of Test Example 1. After labeling, 4% paraformaldehyde was added to the labeled cells and the cells were fixed by leaving them on ice for 20 minutes. After washing the cells with FCSB (eBioscience TM Flow Cytometry Staining Buffer, #00-4222-26), fluorescent reagents (Streptavidin-Alexa 10 ⁇ g/mL, DAPI 500 ng/mL) were added and incubated at room temperature for 20 minutes. Finally, the cells were washed once with FCSB and twice with PBS, and images were taken using a CellVoyager TM CV8000 (Yokogawa Electric Corporation).
  • FCSB eBioscience TM Flow Cytometry Staining Buffer, #00-4222-26
  • fluorescent reagents Streptavidin-Alexa 10 ⁇ g/mL, DAPI 500 ng/mL
  • Test example 3 [TMT label on probe] TMT labeling of Example 4 was carried out as described in Example 14.
  • Jurkat cells (ATCC® Accession No. TIB-152 TM ), THP-1 cells (ATCC® Accession No. TIB-202 TM ), and K562 cells (ATCC® Accession No. CCL-243 TM ) were cultured at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. They were washed with PBS and immersed in a 0.2% HRP solution prepared with PBS. Hydrogen peroxide diluted with PBS and the 10 TMT-labeled probes prepared above in Examples 14-1 to 14-10 were then added.
  • the TMT-labeled probes, cells, and cell numbers were as follows: 2 x 10 Jurkat cells were labeled in Examples 14-1, 14-2, and 14-3; 2 x 10 K562 cells were labeled in Examples 14-4, 14-5, and 14-6; 2 x 10 THP-1 cells were labeled in Examples 14-7, 14-8, and 14-9; and 0.7 x 10 Jurkat, K562, and THP-1 cells were labeled in Example 14-10.
  • the final concentrations of each reagent were 10 ⁇ g/mL for TMT-labeled Example 4, 0.003% hydrogen peroxide, and 0.1% HRP. After incubation on ice for 5 minutes, the cells were centrifuged, discarded, and washed with PBS.
  • the resin was washed five times with 0.1% NP-40 solution, three times with TBS, and three times with MilliQ water, and then eluted from the resin using a 40% MeCN/2% TFA solution.
  • the eluted solution was dried using a centrifugal evaporator, dissolved in 0.1% TFA, and subjected to LC-MS analysis.
  • LC-MS analysis and target protein identification was performed using an LC-MS system combining a nano-HPLC UltiMate TM 3000 (Thermo Scientific TM ) with an Orbitrap Exploris TM 480 mass spectrometer (Thermo Scientific TM ) equipped with a FAIMS Pro TM interface.
  • the nano-HPLC system consisted of a trap column (C18 Acclaim TM PepMap TM , Thermo Scientific TM ) and a tip column (75 ⁇ m id, 12 cm long, 3 ⁇ m C18 particles, Nikkyo Technos) as the stationary phase. Reversed-phase chromatography was performed using a 0.1% formic acid-acetonitrile mobile phase.
  • the flow rate was 300 nL/min, and peptides were eluted with a linear gradient increasing from 4% to 35% acetonitrile.
  • Mass spectrometry was performed using data-dependent acquisition in positive ion mode with nanoelectrospray ionization. MS1 spectra were measured from m/z 375 to 1500, and precursors were selected data-dependently and fragmented by HCD to obtain MS2 spectra.
  • FIG. 10 shows the TMT quantification values for CD7, which is highly expressed in Jurkat cells.
  • the peptide shown is QLGPQPQDII Y YEDGVVPTTDRR (SEQ ID NO: 4) derived from the CD7 protein, with TMT conjugation Example 4 attached to the 11th tyrosine residue.
  • CD7 is a protein highly expressed in Jurkat cells, the signals from the TMT reporter ions 126, 127N, and 127C labeled in Jurkat cells were high, while the signals from reporter ions derived from other cells were low.
  • TMT conjugation Example 4 can be used to directly isobarically label surface proteins in live cells, enabling quantitative analysis.
  • Tagging reagents such as TMT reagents are generally applied to peptides, and are subject to errors in the multi-step sample preparation process, which involves protein extraction from cells, affinity purification, digestion with trypsin, and peptide purification.
  • the method used in this example in which an isobaric reagent is directly labeled on the cell surface of living cells, allows multiple samples to be mixed and performed simultaneously from the protein extraction stage onwards, enabling quantitative analysis that is not affected by sample preparation.
  • Test Example 4 Proximity-labeled Jurkat cells were cultured at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. After harvesting, the cells were washed with PBS and then with SB (staining buffer: PBS/2% FCS). Next, Fc block (Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal Antibody, eBioscience TM ) was added, the cells were incubated at 4°C for 15 minutes, and the supernatant was removed by centrifugation. An antibody solution (10 ⁇ g/mL antibody, 1% Fc block in SB) containing a primary antibody (OKT3, eBioscience TM ) was added to the cell pellet and the cells were incubated at 4°C for 20 minutes.
  • Fc block Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal Antibody, eBioscience TM
  • Mouse IgG2a (BioLegendTM, Cat# 401508) was used as the primary antibody for the negative control IgG. After washing with SB, an antibody solution (1 ⁇ g/mL antibody, 1% Fc block in SB) containing Goat anti-mIgG-HRP (SouthernBiotech, #1030-05) was added and incubated at 4°C for 20 minutes. The cells were washed with SB and PBS and suspended in PBS. A hydrogen peroxide solution and probe mixture in PBS was then added to the cell suspension to achieve a final concentration of 10 ⁇ g/mL probe (Comparative Example 1, Example 1, or Example 6) and 0.003% hydrogen peroxide.
  • an antibody solution (1 ⁇ g/mL antibody, 1% Fc block in SB) containing Goat anti-mIgG-HRP (SouthernBiotech, #1030-05) was added and incubated at 4°C for 20 minutes. The cells were washed with SB and PBS and suspended in PBS. A hydrogen peroxide solution and probe mixture in
  • Results The results of the analysis of interacting molecules using proximity labeling are shown in Figure 11.
  • the graph is a volcano plot, with the horizontal axis representing the abundance ratio of each protein between groups (OKT3/Control IgG) and the vertical axis representing the p-value indicating significance.
  • Volcano plots were created individually for the results using (a) Comparative Example 1, (b) Example 1, or (c) Example 6 as the chemical probe.
  • the known CD3 complex was detected in all results when OKT3 was used.
  • the tyramide-type Comparative Example 1 was used, many nonspecific membrane proteins other than the CD3 complex were detected, making it difficult to say that the overall analysis results selectively identified a specific complex.
  • Test Example 5 EGF Receptor Internalization. A549 cells seeded in a 24-well plate were washed twice with PBS(-). 37°C serum-free RPMI 1640 medium (#11875, Thermo Scientific TM ) was added and the cells were incubated at 37°C for 3 hours. Next, 4°C serum-free RPMI 1640 medium was added, and EGF was added and incubated at 4°C for 15 minutes. The medium containing the EGF solution was removed, rinsed with PBS(-), and then PBS(-) was added and the cells were left to stand at room temperature for 5 to 30 minutes. PBS was used instead of the EGF solution for the negative control.
  • Example 6 A labeling solution containing 0.1% HRP solution, 0.003% hydrogen peroxide, and 10 ⁇ g/mL of Example 6 prepared in 4°C PBS was added, and the cells were left to stand on ice for several minutes (5 minutes). The labeling solution was discarded and the cells were washed with PBS. The cells were collected using a cell scraper, and purified using streptavidin beads and analyzed for proteins by LC-MS according to the method in Test Example 1. Three samples were prepared for each of the EGF and control groups, and the abundance ratio of each protein between the groups and the significant difference p-value were calculated.
  • Figure 12 shows the analysis results of receptor internalization following EGF stimulation.
  • the horizontal axis of the graph represents the abundance ratio of each protein between groups (EGF/Control), and the vertical axis is a volcano plot showing the p-value indicating significance.
  • Each detected protein is plotted, with black dots indicating those specifically annotated as cell surface proteins.
  • EGF stimulation was performed for 5, 15, and 30 minutes, and EGF receptor (EGFR) specifically decreased at all stimulation times, while no significant changes were observed in other membrane proteins.
  • EGFR EGF receptor
  • This method can be performed in a short time under low-temperature conditions, making it possible to label even when recycling is suppressed by low temperature. Moreover, since labeling is completed in a short time, it is possible to perform profiling analysis of receptor internalization with low false positives.
  • Test Example 6 Analysis of Membrane Protein Phosphorylation. A431 cells seeded in a 12-well plate were washed twice with PBS(-). 37°C serum-free RPMI 1640 medium (#11875, Thermo Scientific TM ) was added and the cells were cultured at 37°C for 3 hours. Next, 4°C serum-free RPMI 1640 medium was added, and 1 ⁇ M gefitinib (sc-202166, Santa Cruz) was added and incubated at 4°C for 60 minutes. DMSO was used instead of gefitinib as a negative control. EGF was then added and incubated at 4°C for 10 minutes. PBS was used instead of EGF solution as a negative control.
  • the medium was removed, the cells were rinsed with PBS(-), and then PBS(-) was added and the cells were allowed to stand at room temperature for 5 minutes. Next, after removing the PBS(-), the cells were rinsed with 4°C PBS(-).
  • the cells were harvested with a cell scraper and purified with streptavidin beads and digested with trypsin according to the method described in Test Example 1.
  • Phosphorylated peptides were purified from the digested peptides using MagReSyn® Ti-IMAC HP (#MR-THP005, ReSyn Biosciences). A KingFisher TM Flex (Thermo Fisher Scientific) was used for purification.
  • the digested peptides were prepared in 80% acetonitrile/5% TFA solution and reacted with Ti-IMAC for 20 minutes, followed by three washes with wash buffer.
  • the washing buffer used was 80% MeCN/5% TFA for the first wash, 80% MeCN/1% TFA for the second wash, and 10% MeCN/0.2% TFA for the third wash.
  • Elution from Ti-IMAC was performed using a 1% ammonia solution.
  • the recovered 1% ammonia solution was dried in a centrifuge and dissolved in 0.1% TFA for LC-MS analysis.
  • Figure 13 shows the results of the analysis of membrane protein phosphopeptides.
  • Figure 13 plots membrane protein-derived phosphopeptides. The horizontal axis of the graph represents the abundance ratio of each protein between groups, and the vertical axis is a volcano plot showing the p-value indicating significance.
  • EGFR-derived phosphopeptides are indicated by black dots.
  • Figure 13 (1) shows that several phosphorylations were increased or decreased after 5 minutes of stimulation with EGF compared to the control. In particular, phosphorylation of EGFR, the ligand for EGF, was significantly increased, including phosphopeptides containing tyrosine 1172, which is phosphorylated by EGF stimulation.
  • Figure 13 (2) also shows the effect of gefitinib, an EGFR tyrosine kinase inhibitor, on EGF-induced phosphorylation.
  • Gefitinib treatment significantly suppressed EGF-induced phosphorylation.
  • Test Example 7 Analysis of Membrane Proteins by Labeling.
  • A549 cells cultured in a 12-well plate were washed twice with PBS(+), then added with 37°C serum-free RPMI 1640 medium and cultured at 37°C for 3 hours.
  • the culture plate was placed on ice and washed with 4°C PBS(-).
  • 4°C serum-free RPMI 1640 medium was added, and an antibody against the transferrin receptor (anti-TFRC antibody, OKT9) was added to a concentration of 0.5 mg/mL.
  • the cells were incubated on ice for 10 minutes, after which the antibody solution was removed and washed with cold PBS(+).
  • PBS was added instead of the anti-TFRC antibody solution.
  • Results Figure 14 shows the results of analyzing labeled peptides after addition of the anti-TFRC antibody OKT9.
  • the horizontal axis of the graph represents the ratio of peptide abundance between groups (anti-TFRC antibody/control), and the vertical axis is a volcano plot showing the p-value indicating significance.
  • the graph plots labeled peptides derived from membrane proteins, with TFRC-derived labeled peptides in particular indicated by black circles.
  • the numbers in the figure represent the amino acid residue positions in the TFRC sequence. Addition of the antibody significantly changed the labeled peptides of membrane proteins, all of which were TFRC-derived peptides. The most significant changes were observed at lysines 205, 231, 371, and 374 in the TFRC sequence.
  • FIG. 15 shows the assignment of these labeled sites to the known TFRC structure (PDB: 7ZQS). Lysines 205, 231, 371, and 374, which showed reduced labeling, were confirmed to be in the same region of the 3D configuration. This region has been reported to be the OKT9 antigen epitope region on TFRC (J Virol. 2021 Sep; 95(17): e01868-20).

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Abstract

細胞表面タンパク質の網羅的解析などに有用な新規化合物を提供する。 チロシン残基反応部位RがスペーサーSを介してタンパク質精製タグ部位Tagに連結してなる官能性化合物又はその塩であって、前記チロシン残基反応部位Rは、下記式（1）で示される基である、官能性化合物又はその塩が開示される。（式中、＊は、スペーサーSとの結合を意味し、R１及びR２は、それぞれ独立して、H、1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキル、1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリ―ル、及び1つ以上の置換基で置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択される。）

Description

官能性化合物
　本開示は、官能性化合物を包含する。
　近年、ケミカルバイオロジーという研究分野において、分子生物学的な手法に加えて有機化学的な手法を駆使して、タンパク質又は生理活性物質などの微量の生体内分子を検出・定量し、その生体内分子の機能又は反応を解明する研究が行われている。それらの一環として生体内分子の機能又は反応の解明のために、生体内分子に特異的に作用する化合物、すなわちケミカルプローブの開発が行われている。
　この研究分野で、有機化学的手法を用いてタンパク質の構造と機能を解明する方法としてケモプロテオミクス法がある。
　ケモプロテオミクス法は、フェノタイプを反映する生細胞又は生組織から、不偏かつ網羅的に標的タンパク質を直接同定することを可能とする方法であり、表現型スクリーニングで見出された医薬品候補化合物の未知標的タンパク質の同定及び抗原未知抗体の抗原同定など、医薬品の開発に大きく寄与すると考えられている。
　創薬研究において重要な細胞表面タンパク質を包括的に解析する方法として、アミン標識試薬などを用いて網羅的な標識を行う従来法は、反応温度や時間に依存するため生細胞における一過的な現象を捉える方法としては適していない。さらに、一過的な現象を捉えることが可能なビオチンチラミドを用いる方法（例えば、非特許文献1に記載のPECSL(peroxidase-mediated cell surface labeling)）では、反応効率が低いことや標識位置の特定が困難などの問題がある。また特定の膜タンパク質を検出可能な近接依存性標識法においても、従来法（例えば非特許文献2に記載のSPPLAT(selective proteomic proximity labeling assay using tyramide)）では部位限局的な標識や標識位置の特定が困難という問題がある。他の近接ラベル法として、例えばμMAP法（非特許文献3）があるが、光照射装置と高額な試薬が必要である。
　なお、タンパク質分子の特定のアミノ酸と選択的に反応する反応基として、リジンと反応するNHS(N-Hydroxysuccinimide)や、チロシンと反応するチラミド以外にルミノール誘導体が報告されている（非特許文献4）。
Analytical Chemistry 2021, 93, 4542-4551 Current Protocols in Protein Science 19.27.1-18 Science 367, 1091-1097 (2020) ChemBioChem 2017, 18, 475-478
　本開示の目的は、細胞表面タンパク質の網羅的解析などに有用な新規化合物を提供することを包含する。
　上記目的を達成するため、鋭意検討した結果、チロシン残基反応部位RがスペーサーSを介してタンパク質精製タグ部位Tagに連結してなる官能性化合物又はその塩が、細胞表面タンパク質の網羅的解析などに有用であることを見出した。
　本発明は、こうした知見に基づいて、さらなる検討を重ねて完成したものであり、下記の項に記載の態様を含む。
［項1］
　チロシン残基反応部位RがスペーサーSを介してタンパク質精製タグ部位Tagに連結してなる官能性化合物又はその塩であって、
　前記チロシン残基反応部位Rは、下記式（1）で示される基であり、
（式中、
＊は、スペーサーSとの結合を意味し、
R１及びR２は、それぞれ独立して、H、1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキル（好ましくはC１－６アルキル）、1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリール（好ましくはC６－１０アリール）、及び1つ以上の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール（好ましくは5～15員のヘテロアリール）からなる群から選択される。）
　前記スペーサーSは、－S1－、－S2－、及び－S3－E－S4－からなる群から選択され、S1は、1つ以上の置換基R３で置換されていてもよいアルキレン（好ましくはC１－３０アルキレン）であり、
R３は、－N(R３１)２、及び1つ以上の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール（好ましくは5～15員のヘテロアリール）からなる群から選択され、
2つのR３１は、それぞれ独立して、H、1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキル（好ましくはC１－６アルキル）、置換カルボニル、及び－C(＝NH)NH２からなる群から選択され、
S2は、炭素数2以上のアルキレン（好ましくは炭素数2以上30以下のアルキレン）において、少なくとも一方の末端及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合する基であり、当該基は1つ以上の置換基R３を有していてもよく、
Rａは、H又は1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキル（好ましくはC１－６アルキル）であり、
前記式（L-1）及び（L-2）は、下記式であり、
（式中、mは、0又は1であり、nは、0又は1である。）
S3及びS4は、それぞれ独立して、S1及びS2からなる群から選択され、
Eは、切断可能部位である、官能性化合物又はその塩。
［項2］
　Sは、－S3－E－S4－である、項1に記載の官能性化合物又はその塩。
［項3］
　Eは、下記式（E-1）、（E-2）、（E-3）、（E-4）、（E-5）、（E-6）、（E-7）、（E-8）、及び（E-9）からなる群から選択される、項1又は2に記載の官能性化合物又はその塩。
（式中、
一方の波線は、S3との結合を意味し、他方の波線は、S4との結合を意味し、
Q１、Q２、Q３、Q４、Q５、及びQ６は、それぞれ独立して、H又はアルキル（好ましくはC１－６アルキル）であり、A１、A２、A３、及びA４は、それぞれ独立して、アリーレン（好ましくはC６－１８アリーレン）であり、
Pepは、ENLYFQG（配列番号1）、ENLYFQS（配列番号2）、又はX１X２X３X４X５X６X７（X１、X２、X３、X５、X６、及びX７は、それぞれ独立して、K又はR以外のアミノ酸残基であり、X４は、K又はRである。）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド残基である。）
［項4］
　S3及びS4は、それぞれ独立して、S2から選択される、好ましくは、
　S3は、炭素数2以上のアルキレン（好ましくは炭素数2以上30以下のアルキレン）において、R側末端に－O－が結合し、E側末端及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合してもよい基であり、当該基は1つ以上の置換基R３を有していてもよく、及び／又は
　S4は、炭素数2以上のアルキレン（好ましくは炭素数2以上30以下のアルキレン）において、Tag側末端に－NH－が結合し、E側末端及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合してもよい基であり、当該基は1つ以上の置換基R３を有していてもよい、項1～3のいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項5］
　S3は、炭素数2以上の分岐鎖状アルキレン（好ましくは炭素数2以上30以下の分岐鎖状アルキレン）において、主鎖のR側末端、主鎖のE側末端、及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合する基であり、当該基の側鎖の末端は置換基R３を有しており、及び／又は
　S4は、炭素数2以上の分岐鎖状アルキレン（好ましくは炭素数2以上30以下の分岐鎖状アルキレン）において、主鎖のE側末端、主鎖のTag側末端、及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合する基であり、当該基の側鎖の末端は置換基R３を有している、項1～4のいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項6］
　－S3－E－S4－は、－O－アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－O－アルキレン－NH－CO－アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－O－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－O－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－アルキレン－(L-1)－アルキレン－CO－NH－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－O－アルキレン－(E-6)－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、及び－O－アルキレン－NH－CO－アルキレン－(E-7)－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－からなる群から選択される基であり、当該基の各アルキレンは好ましくはC１－６アルキレンであり、当該基の各アルキレンは置換基R３を有していてもよく、
aは、1以上の整数（好ましくは1～4の整数）である、項1～5のいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項7］
　－S3－E－S4－は、－O－アルキレン－NH－CO－分岐鎖状アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－O－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－分岐鎖状アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、及び－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－分岐鎖状アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－からなる群から選択される基であり、当該基のアルキレン及び分岐鎖状アルキレンは、それぞれ、好ましくはC１－６アルキレン及び分岐鎖状C１－６アルキレンであり、当該基の分岐鎖状アルキレンは置換基R３を有する、項6に記載の官能性化合物又はその塩。
［項8］
　R３は、－N(R３１)２、及び－アルキレン－SO3M（MはH又はアルカリ金属、好ましくはH、Na、又はK、さらに好ましくはNaである）で置換されていてもよいヘテロアリール（好ましくは5～15員のヘテロアリール）からなる群から選択され、前記アルキレンは好ましくはC１－６アルキレンであり、
2つのR３１は、それぞれ独立して、H、1つ以上の置換基で置換されていてもよいC１－６アルキル、－C(＝O)R３２、及び－C(＝NH)NH２からなる群から選択され、R３２は、TMT、フルオレセイン、Cy3、及びトランスシクロオクテンからなる群から選択される試薬の残基である、項1～7のいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項9］
　前記タンパク質精製タグ部位Tagは、下記式（2-1）、（2-2）、（2-3）、及び（2-4）からなる群から選択される、項1～8のいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
（式中、
＊は、スペーサーSとの結合を意味し、
pは1から10の整数である。）
［項9a］
　R１及びR２は、それぞれ独立して、H、及び1つ以上の置換基で置換されていてもよいC１－６アルキルからなる群から選択される、項1～9のいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項9b］
　Rは、下記式（1A）又は（1B）で示される基である、項1～9及び項9aのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
（式中、＊、R１、及びR２は、前記と同意義である。）
［項9c］
　Rが、下記式（1A）で示される基である、項1～9及び項9aのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩と、Rが、下記式（1B）で示される基である、項1～9及び項9aのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩とを含む組成物。
（式中、＊、R１、及びR２は、前記と同意義であり、式（1A）のR１は式（1B）のR１と同じであり、式（1A）のR２は式（1B）のR２と同じである。）
［項9d］
　R１及びR２の一方がHであり、他方がC１－６アルキルである、項1～9、項9a、及び項9bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項9e］
　R１及びR２の一方がHであり、他方がメチルである、項1～9、項9a、及び項9bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項9f］
　Sが－S3－E－S4－であり、S3が－O－C１－６アルキレン－、－O－C１－６アルキレン－NH－CO－(NH２、NHT、NH(C１－６アルキル)、N(C１－６アルキル)２、1－(M－SO３－C１－６アルキレン)－1,2,3－トリアゾール－4－イル、及びNH２C(＝NH)NHから選択される置換基を有していてもよい分岐鎖を有するC２－６アルキレン)－、又はC１－６アルキレンであり、MがH又はアルカリ金属であり、Tが下記式（T-1）、（T-2）、（T-3）、（T-4）、（T-5）、（T-6）、（T-7）、（T-8）、（T-9）、及び（T-10）のいずれかである、項1～9、項9a、項9b、項9d、及び項9eのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項9g］
　Sが－S3－E－S4－であり、S3が－O－C６H１２－、－O－C６H１２－NH－CO－C２H４－、－O－C６H１２－NH－CO－CH(－C４H８NH２)－、－O－C６H１２－NH－CO－CH(－C４H８NHT)－、又は－C２H４－である、項9fに記載の官能性化合物又はその塩。
［項9h］
　Sが－S3－E－S4－であり、S4が－(C１－６アルキレン－O)１－４－C１－６アルキレン－NH－、－C１－６アルキレン－NH－CO－(C１－６アルキレン－O)１－４－C１－６アルキレン－NH－、－C１－６アルキレン－NH－CO－(1－(M－SO３－C１－６アルキレン)－1,2,3－トリアゾール－4－イル、NH２、NH(C１－６アルキル)、N(C１－６アルキル)２、NH２C(＝NH)NH、及びNHTから選択される置換基を有していてもよい分岐鎖を有するC２－６アルキレン)－NH－CO－(C１－６アルキレン－O)１－４－C１－６アルキレン－NH－、又は－C１－６アルキレン－NH－CO－C１－６アルキレン－(L-1)－C１－６アルキレン－CO－NH－(C１－６アルキレン－O)１－４－C１－６アルキレン－NH－であり、MがH又はアルカリ金属であり、Tが下記式（T-1）、（T-2）、（T-3）、（T-4）、（T-5）、（T-6）、（T-7）、（T-8）、（T-9）、及び（T-10）のいずれかである、項1～9、項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、及び項9gのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項9i］
　Sが－S3－E－S4－であり、S4が－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－C２H４－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－CH(CH３)２－CH２－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－C５H１０－NH－CO－(1－NaSO３C３H６－1,2,3－トリアゾール－4－イル－CH２－)CH－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－CH２－NH－CO－(NH２C４H８－)CH－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－CH２－NH－CO－(N(CH３)２－C４H８－)CH－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－CH２－NH－CO－(NH２－C(＝NH)－NH－C３H６－)CH－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、又は－CH２－NH－CO－C２H４－(L-1)－C２H４－CO－NH－CH２－(C２H４O)３－C３H６－NH－である、項1～9、項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、及び項9gのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項9j］
　Rが、下記式（1A）で示される基である、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、及び項9iのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩と、Rが、下記式（1B）で示される基である、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、及び項9iのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩とを含む組成物。
（式中、＊、R１、及びR２は、前記と同意義であり、式（1A）のR１は式（1B）のR１と同じであり、式（1A）のR２は式（1B）のR２と同じである。）
［項10］
　下記式（P1）、（P2）、（P3）、（P4）、（P5）、（P6）、（P7）、（P8）、（P9）、（P10）、（P11）、（P12）、（P13）、（P14）、（P15）、（P16）、（P17）、（P18）、（P19）、（P20）、（P21）、（P22）、（P23）、（P24）、（P25）、（P26）、（P27）、及び（P28）のいずれかで示される官能性化合物及びそれらの塩からなる群から選択される、項1～9並びに項9a及び項9bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
（P5）及び（P6）において、Mは、H又はアルカリ金属であり、
（P9）及び（P10）において、Tは、下記式（T-1）、（T-2）、（T-3）、（T-4）、（T-5）、（T-6）、（T-7）、（T-8）、（T-9）、及び（T-10）のいずれかである。
［項10a］
　項10に記載の式（P1）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P2）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P3）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P4）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P5）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P6）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P7）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P8）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P9）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P10）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P11）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P12）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P13）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P14）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P15）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P16）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P17）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P18）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P19）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P20）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P21）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P22）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、
項10に記載の式（P23）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P24）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、又は
項10に記載の式（P25）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P26）で示される官能性化合物又はその塩とを含むか、又は
項10に記載の式（P27）で示される官能性化合物又はその塩と、項10に記載の式（P28）で示される官能性化合物又はその塩とを含む、組成物。
［項11］
　下記の群から選択される、項1～10並びに項9a及び項9bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
（P9）及び（P10）において、Tは、下記式（T-1）、（T-2）、（T-3）、（T-4）、（T-5）、（T-6）、（T-7）、（T-8）、（T-9）、及び（T-10）のいずれかである。
［項11a］
　項11に記載の式（P1）で示される官能性化合物と、項11に記載の式（P2）で示される官能性化合物とを含むか、
項11に記載の式（P3）で示される官能性化合物と、項11に記載の式（P4）で示される官能性化合物とを含むか、
項11に記載の式（P5a）で示される官能性化合物（塩）と、項11に記載の式（P6a）で示される官能性化合物（塩）とを含むか、
項11に記載の式（P7a）で示される官能性化合物（塩）と、項11に記載の式（P8a）で示される官能性化合物（塩）とを含むか、
項11に記載の式（P9）で示される官能性化合物と、項11に記載の式（P10）で示される官能性化合物とを含むか、
項11に記載の式（P11）で示される官能性化合物と、項11に記載の式（P12）で示される官能性化合物とを含むか、
項11に記載の式（P13a）で示される官能性化合物（塩）と、項11に記載の式（P14a）で示される官能性化合物（塩）とを含むか、
項11に記載の式（P15a）で示される官能性化合物（塩）と、項11に記載の式（P16a）で示される官能性化合物（塩）とを含むか、
項11に記載の式（P17）で示される官能性化合物と、項11に記載の式（P18）で示される官能性化合物とを含むか、
項11に記載の式（P19a）で示される官能性化合物（塩）と、項11に記載の式（P20a）で示される官能性化合物（塩）とを含むか、
項11に記載の式（P21a）で示される官能性化合物（塩）と、項11に記載の式（P22a）で示される官能性化合物（塩）とを含むか、
項11に記載の式（P23a）で示される官能性化合物（塩）と、項11に記載の式（P24a）で示される官能性化合物（塩）とを含むか、又は
項11に記載の式（P25）で示される官能性化合物と、項11に記載の式（P26）で示される官能性化合物とを含むか、又は
項11に記載の式（P27）で示される官能性化合物と、項11に記載の式（P28）で示される官能性化合物とを含む、組成物。
［項11b］
　実施例1、実施例2、実施例3、実施例4、実施例5、実施例6、実施例7、実施例8、実施例9、実施例10、実施例11、実施例12、実施例13、実施例14-1、実施例14-2、実施例14-3、実施例14-4、実施例14-5、実施例14-6、実施例14-7、実施例14-8、実施例14-9、及び実施例14-10の化合物からなる群から選択される、項1～10並びに項9a及び項9bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩。
［項12］
　チロシン残基を有するタンパク質を検出する方法であって、下記工程（1）及び（2）を含む方法。
（1）項1～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩、或いは、項9c、項9j、項10a、及び項11aのいずれかに記載の組成物に含まれる官能性化合物又はその塩中のチロシン残基反応部位Rとタンパク質のチロシン残基とを結合させる工程、及び
（2）前記タンパク質に結合した前記官能性化合物又はその塩中のタンパク質精製タグ部位Tagに結合する標識物質を結合させて、標識を検出する工程。
［項12a］
　前記官能性化合物又はその塩が、項2～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩である、項12に記載の方法。
［項13-1］
　細胞表面タンパク質を検出又は同定する方法であって、下記工程（A）、（B）、（C）、（D）、及び（E）を含む方法。
（A）試料中の細胞又は組織に、項2～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩、或いは、項9c、項9j、項10a、及び項11aのいずれかに記載の組成物に含まれる官能性化合物又はその塩を反応させて、前記官能性化合物又はその塩中のチロシン残基反応部位Rと細胞表面タンパク質のチロシン残基とを結合させる工程、
（B）前記官能性化合物又はその塩が結合した細胞表面タンパク質を含む画分を精製する工程、
（C）精製した画分中の前記官能性化合物又はその塩中のタンパク質精製タグ部位Tagと標識物質とを結合させて複合体を得る工程、
（D）前記複合体を、切断可能部位Eで開裂する工程、
（E）開裂後の細胞表面タンパク質結合断片から細胞表面タンパク質を検出又は同定する工程。
［項13-2］
　細胞表面タンパク質を検出又は同定する方法であって、下記工程（A）、（B）、（C）、及び（E）を含む方法。
（A）試料中の細胞又は組織に、項1～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩、或いは、項9c、項9j、項10a、及び項11aのいずれかに記載の組成物に含まれる官能性化合物又はその塩を反応させて、前記官能性化合物又はその塩中のチロシン残基反応部位Rと細胞表面タンパク質のチロシン残基とを結合させる工程、
（B）前記官能性化合物又はその塩が結合した細胞表面タンパク質を含む画分を精製する工程、
（C）精製した画分中の項1～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩中のタンパク質精製タグ部位Tagと標識物質とを結合させて複合体を得る工程、
（E）前記複合体又はその細胞表面タンパク質結合断片から細胞表面タンパク質を検出又は同定する工程。
［項14-1］
　前記工程（A）が、前記試料中の細胞又は組織に前記官能性化合物又はその塩を過酸化水素とペルオキシダーゼにより活性化させることで反応させて、前記官能性化合物又はその塩中のチロシン残基反応部位Rと前記細胞表面タンパク質のチロシン残基とを結合させる工程である、項13-1又は項13-2に記載の方法。
［項14-2］
　前記工程（B）が、前記官能性化合物又はその塩が結合した細胞表面タンパク質を含む画分を細胞を溶解させることにより精製する工程である、項13-1、項13-2、又は項14-1に記載の方法。
［項14-3］
　前記工程（C）が、前記官能性化合物又はその塩中のタンパク質精製タグ部位TagとTagに結合する標識物質とを反応させて、反応生成物を精製する工程である、項13-1、項13-2、項14-1、又は項14-2に記載の方法。
［項14-4］
　前記工程（D）が、前記複合体を、化学的又は生化学的に切断可能部位Eで開裂する工程である、項13-1、項14-1、項14-2、又は項14-3に記載の方法。
［項14-5］
　前記工程（E）が、前記細胞表面結合領域断片を精製処理及び/又は加水分解処理した細胞表面タンパク質を検出又は同定する工程である、項13-1、項13-2、項14-1、項14-2、項14-3、又は項14-4に記載の方法。
［項15-1］
　細胞表面タンパク質を検出又は同定するための、項1～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩、或いは、項9c、項9j、項10a、及び項11aのいずれかに記載の組成物の使用。
［項15-2］
　項13-1、項13-2、項14-1、項14-2、項14-3、又は項14-4に記載の方法における、項1～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩、或いは、項9c、項9j、項10a、及び項11aのいずれかに記載の組成物の使用。
［項16-1］
　細胞表面タンパク質を検出又は同定に使用するための、項1～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩、或いは、項9c、項9j、項10a、及び項11aのいずれかに記載の組成物。
［項16-2］
　項13-1、項13-2、項14-1、項14-2、項14-3、又は項14-4に記載の方法に使用するための、項1～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩、或いは、項9c、項9j、項10a、及び項11aのいずれかに記載の組成物。
［項17-1］
　細胞表面タンパク質を検出又は同定に使用するための組成物を製造するための、項1～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩の使用。
［項17-2］
　項13-1、項13-2、項14-1、項14-2、項14-3、又は項14-4に記載の方法に使用するための組成物を製造するための、項1～11並びに項9a、項9b、項9d、項9e、項9f、項9g、項9h、項9i、及び項11bのいずれかに記載の官能性化合物又はその塩の使用。
　本開示の官能性化合物又はその塩は、細胞表面タンパク質の網羅的解析などにおいて有用であり、例えば、感度、簡便性、及び網羅性の高い細胞表面タンパク質の分析を可能とする。また本開示の官能性化合物又はその塩は、例えば簡便及び比較的安価に、領域限定的な近位依存性標識を可能とする。さらに本開示の官能性化合物又はその塩は、標識部位の特定が可能であるため、リン酸化変動解析などペプチド配列同定に依存的な解析に適用できる。
図1は実施例における比較例1に対する表面タンパク質の検出量比の分布を示す。 図2は実施例における比較例に対する表面タンパク質及び非表面タンパク質の検出量比の分布を示す。 図3は同定タンパク質中における細胞表面タンパク質の総数を示す。 図4は同定タンパク質中における非細胞表面タンパク質の総数を示す。 図5は同定上位100位中の表面タンパク質の数を示す。 図6はケミカルプローブ修飾サイトの検出数を示す。 図7はケミカルプローブにより修飾されたアミノ酸の分子内局在（EGFR)を示す。 図8は細胞染色を示す。 図9はプロダクトイオンスペクトルの一例を示す。 図10はJurkat細胞に発現の高いCD7のTMT定量値を示す。 図11は近接ラベルによる相互作用分子の解析結果を示す。 図12はEGF添加刺激による受容体内在化の解析結果を示す。 図13は（1）EGF添加刺激（2）EGF及びGefitinib添加刺激による膜タンパク質のリン酸化変動の解析結果を示す。 図14は抗TFRC抗体OKT9の添加によるラベルペプチドの解析結果を示す。 図15はラベル部位を既知のTFRCの構造情報（PDB:7ZQS）にアサインしたものを示す。
(1) 本明細書で使用する用語の説明
　特に断りのない限り、本明細書で用いる用語は、以下に説明する意味で使用される。
　本明細書において「含む（comprise）」とは「実質的にからなる（essentially consist of）」及び「からなる（consist of）」という概念を包含する。
　本明細書において引用される全ての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
　本明細書において「アルキル」は、式「－CｐH２ｐ＋１」（pは1以上の整数である）で示される、直鎖状又は分岐鎖状の飽和脂肪族炭化水素のアルカンから誘導される一価ラジカルである。アルキルは、炭素数1～6（C１－６）の直鎖状又は分枝鎖状のアルキルを包含する。アルキル（特にC１－６アルキル）の具体例としては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、イソヘキシル、3-メチルペンチルなどが挙げられる。アルキルには、少なくとも一部の水素原子が重水素原子に置換されたアルキルも包含される。
　本明細書において「1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキル」において、置換基の例としては、下記が挙げられる。
（A）ハロゲン（例えばF、Cl、Br、I）
（B）－CN
（C）－NO2
（D）－NH2
（E）－OH
（F）－CHO
（G）－COOH又はその塩もしくはエステル
（H）－SO3H又はその塩もしくはエステル
（I）－SO2H
（J）－SH
（K）＝O
（L）＝S
（M）－PO3H2又はその塩もしくはエステル、
（N）アルケニル
（O）アルキニル
（P）シクロアルキル
（Q）シクロアルケニル
（R）アリール
（S）ヘテロシクリル
（T）これら2種以上を組合せてなる基
　本明細書において「アルキレン」は、式「－[C(Z１)(Z２)]ｐ－」（Z１及びZ２は、それぞれ独立して、H又はアルキルであり、pは1以上の整数である）で示される、直鎖状又は分岐鎖状のアルカンから誘導される二価ラジカルである。アルキレンは、炭素数1～30（C１－３０）の直鎖状又は分岐鎖状のアルキレン、炭素数2以上（特に炭素数2以上30以下）の直鎖状又は分岐鎖状のアルキレン等を包含する。アルキレン（特に炭素数30以下のアルキレン）の具体例としては、メチレン、エチレン、1-メチルエチレン、2-メチルエチレン、トリメチレン、2-メチルトリメチレン、2,2-ジメチルトリメチレン、1-メチルトリメチレン、メチルメチレン、エチルメチレン、ジメチルメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレンなどが挙げられる。
　本明細書において「アルケニル」は、式「－CｑH２ｑ－１」（qは2以上の整数である）で示される、直鎖状又は分岐鎖状の不飽和脂肪族炭化水素のアルケンから誘導される一価ラジカルである。アルケニルは、炭素数2～6（C２－６）の直鎖状又は分枝鎖状のアルケニルを包含する。アルケニルの具体例としては、ビニル、アリルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキニル」は、式「－CｑH２ｑ－３」（qは2以上の整数である）で示される、直鎖状又は分岐鎖状の不飽和脂肪族炭化水素のアルキンから誘導される一価ラジカルである。アルキニルは、炭素数2～6（C２－６）の直鎖状又は分枝鎖状のアルキニルを包含する。アルキニルの具体例としては、エチニル、プロパルギルなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルキル」は、環状の飽和脂肪族炭化水素のシクロアルカンから誘導される一価ラジカルである。シクロアルキルは、炭素数3～18（C3－１８）のシクロアルキルを包含する。シクロアルキルの具体例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルケニル」は、環状の不飽和脂肪族炭化水素のシクロアルケンから誘導される一価ラジカルである。シクロアルケニルは、炭素数5～18（C５－１８）のシクロアルケニルを包含する。シクロアルケニルの具体例としては、シクロペンテニル、シクロヘキシニルなどが挙げられる。
　本明細書において「アリール」は、単環式、又は二環式、三環式などの多環式の芳香族炭化水素から誘導される一価ラジカルである。アリールは、炭素数6～18（C６－１８）のアリール、好ましくは炭素数6～10（C６－１０）のアリールを包含する。アリールの具体例としては、フェニル、ナフチル、ビフェニルイル、アントリル、フェナントリル、テルフェニルイルなどが挙げられる。アリールは1つ以上の置換基を有していてもよく、置換基の具体例としては、アルキル、アルキルの置換基として例示した置換基（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）、（G）、（H）、（I）、（J）、（K）、（L）、（M）、（N）、（O）、（P）、（Q）、これらの組合せなどが挙げられる。
　本明細書において「アリーレン」は、単環式、又は二環式、三環式などの多環式の芳香族炭化水素から誘導される二価ラジカルである。アリーレンは、炭素数6～18（C６－１８）のアリーレンを包含する。アリーレンの具体例としては、フェニレン、ナフチレン、ビフェニルジイル、アントリレン、フェナントリレン、テルフェニルジイルなどが挙げられる。アリーレンは1つ以上の置換基を有していてもよく、置換基の具体例としては、アルキル、アルキルの置換基として例示した置換基（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）、（G）、（H）、（I）、（J）、（K）、（L）、（M）、（N）、（O）、（P）、（Q）、これらの組合せなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロシクリル」は、単環式、又は二環式、三環式などの多環式の複素環式化合物から誘導される一価ラジカルである。ヘテロシクリルは、環構成原子としてN、O、及びSからなる群から独立して選択されるヘテロ原子を1～5個有する、及び／又は、3～15個の環構成原子を有する（3～15員の）ヘテロシクリルを包含する。ヘテロシクリルには、ヘテロアリールが含まれる。ヘテロシクリルは1つ以上の置換基を有していてもよく、置換基の具体例としては、アルキル、アルキルの置換基として例示した置換基（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）、（G）、（H）、（I）、（J）、（K）、（L）、（M）、（N）、（O）、（P）、（Q）、（R）、これらの組合せなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリール」は、単環式、又は二環式、三環式などの多環式の芳香族複素環式化合物から誘導される一価ラジカルである。ヘテロアリールは、環構成原子としてN、O、及びSからなる群から独立して選択されるヘテロ原子を1～5個有する、及び／又は、5～15個の環構成原子を有する（5～15員の）ヘテロアリールを包含する。ヘテロアリールの具体例としては、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピリジル、ピリダジル、ピリミジル、ピラジル、トリアジル、インドリル、キノリニル、オキサゾリル、チアゾリルなどが挙げられる。ヘテロアリールは1つ以上の置換基を有していてもよく、置換基の具体例としては、アルキル、アルキルの置換基として例示した置換基（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）、（G）、（H）、（I）、（J）、（K）、（L）、（M）、（N）、（O）、（P）、（Q）、（R）、これらの組合せなどが挙げられる。
　本明細書において「タンパク質」及び「ペプチド」は、実質的に同じ意味を有し、任意の長さを有するアミノ酸ポリマー（典型的にはペプチドはタンパク質の断片と呼ばれる）を指す。アミノ酸ポリマーは、直鎖状、分枝鎖状、又は環状であってもよい。アミノ酸は、天然もしくは非天然のアミノ酸、又は変異アミノ酸であってもよい。アミノ酸としては、グリシン（G）、アラニン（A）、バリン（V）、ロイシン（L）、イソロイシン（I）、セリン（S）、トレオニン（T）、アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）、システイン（C）、メチオニン（M）、リジン（K）、アルギニン（R）、アスパラギン（N）、グルタミン（Q）、プロリン（P）、フェニルアラニン（F）、トリプトファン（W）、ヒスチジン（H）、チロシン（Y）、シトルリン、オルニチン、ε-アセチル-リジン、β-アラニン、アミノ安息香酸、6-アミノカプロン酸、アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸、3-ニトロチロシン、ノルロイシン、ピログルタミン酸などが挙げられる。アミノ酸は、例えばL-アミノ酸、D-アミノ酸、又はDL-アミノ酸であってもよい。
　タンパク質は、天然に存在するタンパク質であっても、また合成されたものであってもよく、天然に存在するタンパク質において合成的に操作された配列を有するものであってもよい。タンパク質は、細胞内タンパク質、細胞表面タンパク質（すなわち、細胞の表面に結合したタンパク質）又は溶液中のタンパク質（例えば、培地中に分泌されるタンパク質）であってよい。またタンパク質は糖タンパク質であっても、また膜タンパク質であってもよい。タンパク質は、有用な生物学的又は化学的活性を有する任意の医薬的、又は商業的に関連するタンパク質、例えば、受容体、抗体、酵素、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤であることができる。本開示において使用され得る以下に列記するタンパク質は単なる例示であり、これらに限定されるものではない。当業者であれば、チロシン残基を有する任意のタンパク質が1又は複数の官能性化合物又はその塩の標的タンパク質になり得ることを理解することができる。
　本明細書において「標的タンパク質」は、1又は複数の官能性化合物又はその塩が結合し得るチロシン残基を有するタンパク質であり得る。このような標的タンパク質は、制限されないものの、好ましくはヒトや非ヒト動物を含む哺乳動物に由来する生体液中、細胞上、又は組織中に存在し得るものである。より好ましくは生細胞上、又は生組織中で発現し存在するタンパク質である。このため、標的タンパク質が、例えば生細胞表面上で発現している膜タンパク質である場合、生細胞の細胞膜と会合し、細胞外空間に曝される少なくとも1つのチロシン残基を有し、官能性化合物又はその塩が結合可能な状態にあることができる。
　標的タンパク質は、特に限定されないが、膜タンパク質が好ましい。膜タンパク質とは、脂質膜、特に脂質二重膜と直接的又は間接的に相互作用し得るタンパク質であり、タンパク質を構成するアミノ酸残基（少なくともチロシン残基）が細胞外の環境に一つ以上存在するものを指す。膜タンパク質としては、例えば、Gタンパク質共役受容体、7回膜貫通型受容体、受容体型チロシンキナーゼ、免疫グロブリンスーパーファミリーとその関連タンパク質、スカベンジャー受容体、その他の受容体；輸送体、イオンチャンネル、溶液輸送体、能動輸送体、補助輸送体タンパク質、酵素、その他のものが挙げられる。
　より具体的には、Gタンパク質共役受容体及び7回膜貫通型受容体の例としては、Frizzled受容体、核酸受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、アンジオテンシン受容体、アペリン受容体、バソプレシン受容体、ブラジキニン受容体、ボンベシン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、カンナビノイド受容体、システイニルロイコトリエン受容体、ドパミン受容体、スフィンゴ脂質受容体、リゾホスファチジン受容体、スフィンゴシン一リン酸受容体、エンドセリン受容体、プロテアーゼ活性化受容体、遊離脂質受容体、ガラニン受容体、成長ホルモン分泌促進因子受容体、性腺刺激ホルモン受容体、胆汁酸受容体、ニコチン酸受容体、リゾホスファチジン酸受容体、アナフェラトキシン走化性受容体、ガストリン放出ペプチド受容体、オレキシン受容体、ヒスタミン受容体、セロトニン受容体、インターロイキン受容体、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体、ロイコトリエン受容体、副腎皮質刺激ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラトニン受容体、ニューロメジン受容体、神経ペプチド受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、ノシセプチン受容体、オキソグルタル酸受容体、オキシトシン受容体、P2Yプリン受容体、プロスタグランジン受容体、ロドプシン、リラキシン受容体、ソマトスタチン受容体、コハク酸受容体、サブスタンスP受容体、サブスタンスK受容体、トロンボキサン受容体、ウロテンシン受容体、カルシトニン受容体、味覚受容体、代謝型グルタミン受容体、及び嗅覚受容体などを挙げることができる。
　受容体型チロシンキナーゼの例としては、アクチビン受容体、骨形成タンパク質受容体、TNF-β受容体、AXL受容体、上皮成長因子受容体（EGF受容体）、エフリン受容体、インシュリン受容体、神経性成長因子受容体、ジスコイジンドメイン受容体、血管内皮増殖因子受容体、白血球受容体、肝細胞増殖因子受容体、マクロファージ刺激タンパク質受容体、血小板由来増殖因子受容体、及びエンテロトキシン受容体、並びにそれらの前駆体を挙げることができる。
　免疫グロブリンスーパーファミリーとその関連タンパク質の例としては、免疫グロブリン受容体、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、白血球免疫グロブリン様受容体、ネトリン受容体、T細胞受容体、各種サイトカイン受容体、T細胞表面糖タンパクCDの各種フラグメント、スーパファミリー、及びそれらの前駆体が挙げられる。
　その他の受容体には、例えば、アディポネクチン受容体、プロゲスチン受容体、コンタクチン関連タンパク質、デルリン、インテグリン及びその前駆体、ニューレキシン，ニューロピリン、Notch受容体、プレキシン及びその前駆体、受容体型チロシンホスファターゼ、セレクチン及びその前駆体、シンデカン受容体、腫瘍壊死因子（TNF)受容体、Toll様受容体、トランスフェリン受容体、ソルチリン及びその前駆体が含まれる。
　輸送体及びイオンチャンネルの例としては、アクアポリン、塩素イオンチャンネル、ベストロフィン、リアノジン受容体、電位開口型カリウムチャンネル、環状ヌクレオチド依存性チャンネル、カルシウム活性化カリウムチャンネル、一過性受容器電位チャンネル（TRPチャンネル）、電位開口型ナトリウムチャンネル、電位開口型カルシウムチャンネル、その他電位開口型チャンネル、セロトニン受容体、アセチルコリン受容体、γアミノ酪酸受容体、グリシン受容体、イオンチャンネル型グルタミン酸受容体、P2Xプリン受容体などが挙げられる。
　溶液輸送体の例としては、各種SLCファミリータンパク質が挙げられ、また能動輸送体の例としては、イオン輸送性ATP分解酵素、ABCトランスポーターなどが挙げられる。
　酵素の例としては、NADH-ユビキノン酸化還元酵素、シトクロームc、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、シトクロームP450、その他の酸化還元酵素；アシル転移酵素、グルコース転移酵素、硫酸転移酵素、その他の転移酵素；リガーゼ、チロシンホスファターゼ、リン酸ジエステル加水分解酵素、グリコシラーゼ、セリンペプチド内部加水分解酵素、金属エンドペプチダーゼ、ヌクレオシド2リン酸ホスファターゼ、その他の加水分解酵素が挙げられる。
　本明細書において「試料」又は「生体試料」は、任意の細胞（例えば生細胞）又は組織（例えば生組織）、及び生物から得られる任意の固体又は流体試料を包含する。これらには、例えば、細胞培養物や組織培養物、バイオリアクター、ヒト又は非ヒト動物由来の細胞や組織、植物（果物や野菜を含む）、単細胞微生物（例えば、細菌、酵母）、及び多細胞生物が含まれる。生体試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、精液、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液、又は任意の身体分泌物、漏出液、滲出物（例えば、膿瘍又は感染症もしくは炎症の任意の他の部位から得られる流体）、又は関節から得られる流体（例えば、正常な関節又は関節リウマチ、変形性関節症、痛風又は敗血症性関節炎などの疾患に侵された関節から得られる生体液）であってもよい。生体試料は、また、例えば、任意の器官又は組織（生検又は剖検標本を含む）から得られた試料であってもよい。また細胞には、例えば、初代細胞及び培養細胞が含まれる。
　好ましくは、ヒト又は非ヒト動物に由来する生細胞又は生組織である。
　「細胞」又は「生細胞」は、官能性化合物又はその塩を用いて検出することができるタンパク質、好ましくは膜タンパク質が発現しているものであればよく、特に限定されない。具体例として、例えば、CHO細胞、MDCK細胞、3T3-L1細胞、293細胞、MCF7細胞、A431細胞、3T3細胞、CV-I細胞、HeLa細胞、L細胞、BHK21細胞、HL-60細胞、U937細胞、HaK細胞、Jurkat細胞、THP-1細胞、その他の形質転換により得られた細胞株などが挙げられるが、これらに制限されない。また、細胞株として樹立された哺乳類又は哺乳類以外を由来とする細胞を培養して変性処理を施していないもの；任意の器官又は組織より非変性条件にて単離された細胞（例えば、血球細胞や器官を構成する細胞、初代培養細胞など）；初代組織及び初代移植片のin vitro培養物に由来する細胞株；2次元的培養以外にも3次元培養システムにて培養されたもの（例えばオルガノイド培養物など）も含まれる。さらに、これらを宿主とし、特定のタンパク質をコードする遺伝子をベクター等によって導入した細胞等でもよく、制限されないものの、例えばドパミンD2受容体を安定に発現するCHO-K1細胞などを例示することができる。
　「組織」又は「生組織」も、官能性化合物又はその塩を用いて検出することができるタンパク質、好ましくは膜タンパク質が発現しているものであればよく、特に限定されない。具体例として、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物の任意の器官又は組織より非変性条件にて単離された組織切片や組織培養試料（例えば脳、肝、腎などの組織スライス切片や臓器スライス培養物）などが挙げられるが、これらに制限されない。
　本明細書において、アルキル化反応、加水分解反応、アミノ化反応、エステル化反応、アミド化反応、エーテル化反応、求核置換反応、付加反応、酸化反応、還元反応とは、自体公知の方法を意味する。このような方法としては、例えば、実験化学講座（第5版、日本化学会編、丸善株式会社）、オーガニック・ファンクショナル・グループ・プレパレーションズ（ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS）第2版、アカデミックプレス社（ACADEMIC PRESS, INC.）1989年刊；コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ（Comprehensive Organic Transformations）VCH Publishers Inc.、1989年刊、ウッツ（P.G.M.Wuts）及びグリーン（T.W.Greene）著、「Greene's Protective Groups in Organic Synthesis」(第4版、2006年）；John Wiley & Sons; New York, 1991, P.309などに記載の方法等が挙げられる。
　本明細書において、保護及び脱保護は、一般的に知られている保護基を用いて、保護・脱保護反応（例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第4版（Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth edition）、グリーン（T.W.Greene）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（John Wiley & Sons Inc.）（2006年）など参照）を行うことにより実施することができる。
　本明細書において「保護基」とは、例えば、t-ブトキシカルボニル（BOC）基、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル（Troc）基、ベンジルオキシカルボニル（Z）基、アリルオキシカルボニル（Alloc）基、トリフルオロアセチル基、フタロイル基、パラトルエンスルホニル（Ts）基、2-ニトロベンゼンスルホニル（Ns）基が挙げられる。
　本明細書において「脱保護剤」とは、保護基を脱離させることができれば特に限定されないが、例えば、ピペリジンやリチウムジイソプロピルアミドなどの塩基、亜鉛、TFAなどの酸、０価パラジウム触媒を共存させた求核剤、塩基性水溶液、メチルアミン、ヒドラジン、一電子還元剤、チオール類が挙げられる。
　本明細書において「溶媒」とは、反応に不活性な溶媒を意味し、例えば、水、エーテル（例えば、ジエチルエーテル、1,2-ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテルなどの鎖状エーテル；ジオキサン、テトラヒドロフランなどの環状エーテル）、ハロ炭化水素（例えば、塩化メチレン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、四塩化炭素）、芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン）、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール）、アミド（例えば、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ヘキサメチルリン酸トリアミド）、アミン（例えば、N-メチルピロリドン（NMP）、ピリジンなどの環状アミン）、スルホキシド（例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO））、ニトリル（例えば、アセトニトリル）が挙げられる。これらの溶媒は、1種単独で又は2種以上混合して使用される。
　本明細書において「塩基」としては、例えば、無機塩基、有機塩基等が挙げられる。無機塩基としては、アルカリ金属水酸化物（例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、アルカリ土類金属水酸化物（例えば、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム）、アルカリ金属炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム）、アルカリ土類金属炭酸塩（例えば、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸バリウム）、アルカリ金属炭酸水素塩（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム）、アルカリ金属リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸セシウム）、アルカリ土類金属リン酸塩（例えば、リン酸マグネシウム、リン酸カルシウム）、アルカリ金属アルコキシド（例えば、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド）、アルカリ金属ヒドリド（例えば、ナトリウムヒドリド、カリウムヒドリド）等が挙げられる。有機塩基としては、トリアルキルアミン（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン（TEA）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA））、ジアルキルアミン（例えば、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン）、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）、N-メチルモルホリン、ピコリン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノン-5-エン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン及び1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン（DBU）等が挙げられる。これらから１種又は２種以上を適宜選択、混合して使用することができる。
　本明細書において「縮合剤」としては、例えば、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、3-ヒドロキシ-3,4-ジヒドロ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4-オン（HOOBt）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド（EDAC）、2-(1H-7-アザベンズトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（HATU）、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（HBTU）、3,4-ジヒドロ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4-オン-3-オキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（HDTU）、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（BOP）、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-(ピロリジノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（PyBop）、(3,4-ジヒドロ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4-オン-3-オキシ)ジエチルホスファート（DEPBt）、3,4-ジヒドロ-1,2,3-ベンゾトリアジン-4-オン-3-オキシトリス-(ピロリジノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（PDOP）、2-(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)-1,3-ジメチル-2-ピロリジン-1-イル-1,3,2-ジアザホスホリジニウムヘキサフルオロホスファート（BOMP）、5-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)-3,4-ジヒドロ-1-メチル2H-ピロリウムヘキサクロロアンチモナート（AOMP）、(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（AOP）、5-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-3,4-ジヒドロ-1-メチル2H-ピロリウムヘキサクロロアンチモナート：N-オキシド（BDMP）、2-ブロモ-3-エチル-4-メチルチアゾリウムテトラフルオロボラート（BEMT）、2-ブロモ-1-エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（BEP）、2-ブロモ-1-エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（BEPH）、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-N,N-ジメチルメタンイミニウムヘキサクロロアンチモナート（BOMI）、N,N’-ビス(2-オキソ-3-オキサゾリジニル)ホスフィン酸クロリド（BOP-Cl）、1-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)フェニルメチレンピロリジニウムヘキサクロロ－アンチモナート（BPMP）、1,1,3,3-ビス(テトラメチレン)フルオロウロニウムヘキサフルオロホスファート（BTFFH）、4-(クロロ-4-モルホリニルメチレン)モルホリニウムヘキサフルオロホスファート（CMMM）、2-クロロ-1,3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾリウムヘキサフルオロホスファート（CMBI）、2-フルオロ-1-エチルピリジニウムテトラフルオロボラート（FEP）、2-フルオロ-1-エチルピリジニウムヘキサクロロアンチモナート（FEPH）、1-(1-ピロリジニル-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジン-1-イルメチレン)ピロリジニウムヘキサフルオロ-ホスファートN-オキシド（HAPyU）、O-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-ビス-(ペンタメチレン)ウロニウムヘキサフルオロホスファート（HBPipU）、O-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)N,N,N0,N0-ビス(テトラメチレン)ウリニウムヘキサフルオロホスファート（HBPyU）、(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（PyAOP）、ブロモ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（PyBrOp）、クロロ－トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（PyClOP）、1,1,3,3-ビス(テトラメチレン)クロロウロニウムヘキサフルオロホスファート（PyClU）、テトラメチルフルオロ－マミジニウムヘキサフルオロホスファート（TFFH）、トリホスゲン、トリアジン系試薬［塩化シアヌル、フッ化シアヌル、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM）、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン（CDMT）］、ビス(2-クロロフェニル)ホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロクロリダート、ジフェニルホスホロアジド（DPPA）、N－[1－(シアノ－2－エトキシ－2－オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ(モルホリノ)]ウロニウム ヘキサフルオロリン酸（COMU)、N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボラート(TSTU)等を挙げられる。
(2) 官能性化合物又はその塩
　本開示の官能性化合物又はその塩は、チロシン残基反応部位RがスペーサーSを介してタンパク質精製タグ部位Tagに連結してなる構造を有する。
(2-1) チロシン残基反応部位R
　本開示の官能性化合物又はその塩において、チロシン残基反応部位Rは、タンパク質のチロシン残基に反応し得る構造であれば、特に限定されない。そのような構造としては、ルミノール誘導性基、又は2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオン骨格を有する基であることが好ましく、典型的には下記式（1）で示される基である。
　式（1）中、R１及びR２は、それぞれ独立して、H、1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキル（好ましくはC１－６アルキル）、1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリール（好ましくはC６－１０アリール）、及び1つ以上の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール（好ましくは5～15員のヘテロアリール）からなる群から選択される。R１及びR２は、それぞれ独立して、H、1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキル、及び1つ以上の置換基で置換されていてもよいアリールからなる群から選択されることが好ましく、H、及び1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキルからなる群から選択されることが更に好ましい。
　R１及びR２の好適な組合せには、下記が含まれる。
・R１が1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキル、R２がHである組合せ
・R１がH、R２が1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキルである組合せ
　上記の各々の場合において、R１及び／又はR２のアルキルは、好ましくはC１－６アルキルであり、更に好ましくはC１－４アルキル、更により好ましくはC１－２アルキル、特に好ましくはメチルである。また、上記の各々の場合において、R１及び／又はR２のアルキルは、無置換アルキルであっても置換アルキルであってもよく、置換アルキルの場合、置換基の置換数は1以上置換可能な最大数以下の範囲から選択することができ、例えば、1～10、1～8、1～6、1～4、1～3、1又は2などであり得る。
　式（1）中、＊は、スペーサーSとの結合を意味する。式（1）のスペーサーSとの結合位置は、下記式（1A）、（1B）、（1C）、及び（1D）のいずれであってもよいが、下記式（1A）又は（1B）であることが好ましい。
(2-2) スペーサーS
　本開示の官能性化合物又はその塩において、スペーサーSは、チロシン残基反応部位Rとタンパク質精製タグ部位Tagとを連結させ得る構造であれば、特に限定されない。スペーサーは、立体的な混雑が最小限に抑えられ、官能基の作用が損なわれないように、その種類及び長さを選択することができる。一実施形態において、Sは、－S1－、－S2－、及び－S3－E－S4－からなる群から選択され得る。
　S1は、1つ以上の置換基R３で置換されていてもよいアルキレンである。すなわち、S1は、無置換アルキレン及び置換アルキレンのいずれであってもよい。S1のアルキレンは、好ましくは、直鎖状又は分岐鎖状の、C１－３０アルキレン、C２－３０アルキレン、C３－３０アルキレン、C４－３０アルキレン、C５－３０アルキレン、又はC６－３０アルキレンなどであり得る。
　S1が置換アルキレンの場合、R３の置換数は、1以上置換可能な最大数以下の範囲から選択することができ、例えば、1～10、1～8、1～6、1～4、1～3、1又は2であり得る。R３の置換数が2以上の場合、各R３は互いに同一であっても異なっていてもよい。
　R３の置換位置は、特に限定されず、任意の位置であり得る。例えば、S1のアルキレンが分岐鎖を有する場合、当該分岐鎖の末端にR３が置換することが好ましい。
　R３は、－N(R３１)２、及び1つ以上の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール（好ましくは5～15員のヘテロアリール）からなる群から選択することができる。
　R３が－N(R３１)２の場合、2つのR３１は、それぞれ独立して、H、1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキル（好ましくはC１－６アルキル）、置換カルボニル、及び－C(＝NH)NH２からなる群から選択することができる。
　2つのR３１の少なくとも一方がアルキルである場合、当該アルキルは、好ましくはC１－６アルキルであり、更に好ましくはC１－４アルキル、更により好ましくはC１－２アルキル、特に好ましくはメチルである。当該アルキルは、無置換アルキルであっても置換アルキルであってもよく、置換アルキルの場合、置換基の置換数は1以上置換可能な最大数以下の範囲から選択することができ、例えば、1～10、1～8、1～6、1～4、1～3、1又は2であり得る。
　2つのR３１の少なくとも一方が置換カルボニルである場合、カルボニルの置換基は、特に限定されないが、試薬の残基であることが好ましい。試薬は、典型的には標識試薬であり、その例としては、TMT（Tandem Mass Tag）、フルオレセイン、Cy3、TCO（トランスシクロオクテン）などが挙げられる。これらのうち、タンパク質検出量の点から、TMTが好ましい。
　置換カルボニルは、下記式（T-1）、（T-2）、（T-3）、（T-4）、（T-5）、（T-6）、（T-7）、（T-8）、（T-9）、及び（T-10）のいずれかであることが好ましい。
　R３が1つ以上の置換基で置換されていてもよいヘテロアリールである場合、当該ヘテロアリールは、5員又は6員のヘテロアリールであることが好ましく、5員又は6員のN含有ヘテロアリールであることが更に好ましい。当該ヘテロアリールの例としては、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピリジル、ピリダジル、ピリミジル、ピラジル、トリアジルなどが挙げられる。
　R３のヘテロアリールに置換し得る置換基は、1つ以上の置換基を有していてもよいアルキルであることが好ましく、－SO3M（MはH又は1価の金属、好ましくはアルカリ金属である）などのアニオン性基で置換されていてもよいアルキルであることがより好ましく、－SO3Mで置換されたアルキルが更に好ましい。上記の各々の場合において、アルキルは、好ましくはC１－６アルキルであり、更に好ましくはC１－４アルキルである。上記アルカリ金属は、水素以外の第一族元素であり、Li、Na、K、Rb、Cs、及びFrが含まれ、好ましくはLi、Na、K、又はCsであり、更に好ましくはNa又はKである。
　S2は、炭素数2以上のアルキレン（好ましくは炭素数2以上30以下のアルキレン）において、少なくとも一方の末端及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合する基であり、当該基は1つ以上の置換基R３を有していてもよい。
　式（L-1）及び（L-2）の各々において、mは0又は1であり、nは0又は1である。
　なお、式（L-2）で示される基は、式（L-3）で示される基であってもよい。
　式（L-1）又は式（L-2）で示される基の例としては、下記が挙げられる。
　S2のアルキレンは、好ましくは、直鎖状又は分岐鎖状の、C２－３０アルキレン、C３－３０アルキレン、C４－３０アルキレン、C５－３０アルキレン、又はC６－３０アルキレンなどであり得る。
　S2のアルキレンの少なくとも一方の末端には、R及び／又はTagと連結させる点から、－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、又は－NRａ－CO－が結合していてもよく、Tag側末端には、－NRａ－又は－CO－NRａ－、特に－NRａ－が結合することが好ましい。S2のR側末端には、－O－、－CO－、－NRａ－、又は－CO－NRａ－、特に－O－が結合していてもよい。
　S2のアルキレンの1以上の隣接する－CH２－の間には、－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合していることが好ましい。一実施形態において、S2には、－(アルキレン－O)ａ－（aは1以上の整数である）、－(O－アルキレン)ａ－（aは1以上の整数である）、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、及び式（L-2）で示される基からなる群から選択される少なくとも一種が含まれることが好ましい。
　好ましいS2としては、下記が挙げられる。下記において、左側末端がRに結合し、右側末端がTagに結合することが好ましく、少なくとも1つのアルキレンは、分岐鎖状アルキレンであってもよく、1つ以上の置換基R３を有していてもよい。
　－O－アルキレン－(L１－アルキレン)ｂ－(O－アルキレン)ａ－NRａ－（S21）
　－アルキレン－(L１－アルキレン)ｂ－(O－アルキレン)ａ－NRａ－　 （S22）
　－O－アルキレン－NRａ－　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（S23）
　S21及びS22の各々において、L１は、各出現において、独立して、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基であり、bは、1以上の整数である。bは、好ましくは1～6、1～5、又は1～4などであり得る。
　S2に含まれ得る－(アルキレン－O)ａ－及び－(O－アルキレン)ａ－は、それぞれ、－(C２H４－O)ａ－又は－(O－C２H４)ａ－であることが好ましい。aは、好ましくは1～10、1～8、1～6、1～4、2～10、又は3～10などであり得、最も好ましくは1～4である。
　S2に含まれ得る－NRａ－において、Rａは、H又は1つ以上の置換基で置換されていてもよいアルキルである。Rａのアルキルは、好ましくはC１－６アルキルであり、更に好ましくはC１－４アルキル、更により好ましくはC１－２アルキル、特に好ましくはメチルである。Rａのアルキルは、無置換アルキルであっても置換アルキルであってもよく、置換アルキルの場合、置換基の置換数は1以上置換可能な最大数以下の範囲から選択することができ、例えば、1～10、1～8、1～6、1～4、1～3、1又は2であり得る。Rａは、好ましくはHである。
　S2が1つ以上の置換基R３を有する場合、R３の置換数は、1以上置換可能な最大数以下の範囲から選択することができ、例えば、1～10、1～8、1～6、1～4、1～3、1又は2であり得る。R３の置換数が2以上の場合、各R３は互いに同一であっても異なっていてもよい。
　R３の置換位置は、特に限定されず、任意の位置であり得る。例えば、S2に含まれるアルキレンが分岐鎖を有する場合、当該分岐鎖の末端にR３が置換することが好ましい。
　S3及びS4は、それぞれ独立して、S1及びS2から選択されることが好ましく、S2から選択されることが更に好ましい。
　S3は、炭素数2以上のアルキレン（好ましくは炭素数2以上30以下のアルキレン）において、R側末端に－O－が結合し、E側末端及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合してもよい基であることが好ましく、当該基は1つ以上の置換基R３を有していてもよい。また、S3は、炭素数2以上の分岐鎖状アルキレン（好ましくは炭素数2以上30以下の分岐鎖状アルキレン）において、主鎖のR側末端、主鎖のE側末端、及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合する基であることが好ましく、当該基の側鎖の末端は置換基R３を有していることも好ましい。
　好ましいS3としては、下記が挙げられる。下記において、左側末端がRに結合し、右側末端がEに結合することが好ましく、少なくとも1つのアルキレンは、分岐鎖状アルキレンであってもよく、1つ以上の置換基R３を有していてもよい。
　－O－アルキレン－(L２－アルキレン)ｃ－　　　　　　　　　（S31）
　－アルキレン－(L２－アルキレン)ｃ－　　　　　　　　　　 （S32）
　－O－C１－６アルキレン－(L２－C１－６アルキレン)ｃ－　　　　　（S33）
　－C１－６アルキレン－(L２－C１－６アルキレン)ｃ－　　　　　　 （S34）
　－O－C２－６アルキレン－(L２－分岐鎖状C２－６アルキレン)ｃ－　（S35）
　－C２－６アルキレン－(L２－分岐鎖状C２－６アルキレン)ｃ－　　 （S36）
　S31、S32、S33、S34、S35、及びS36の各々において、L２は、各出現において、独立して、－CO－NRａ－又は－NRａ－CO－であり、cは、0又は1以上の整数である。cは、好ましくは0～4、より好ましくは0～3であり、更に好ましくは0～2であり、更により好ましくは0又は1である。
　一実施形態において、S3は、－O－C１－６アルキレン－、－O－C１－６アルキレン－NH－CO－(NH２、NHT、NH(C１－６アルキル)、N(C１－６アルキル)２、1－(M－SO３－C１－６アルキレン)－1,2,3－トリアゾール－4－イル、及びNH２C(＝NH)NHから選択される置換基を有していてもよい分岐鎖を有するC２－６アルキレン)－、又はC１－６アルキレンであることが好ましく、－O－C６H１２－、－O－C６H１２－NH－CO－C２H４－、－O－C６H１２－NH－CO－CH(－C４H８NH２)－、－O－C６H１２－NH－CO－CH(－C４H８NHT)－、又は－C２H４－であることがより好ましい。
　S4は、炭素数2以上のアルキレン（好ましくは炭素数2以上30以下のアルキレン）において、Tag側末端に－NH－が結合し、E側末端及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合してもよい基であることが好ましく、当該基は1つ以上の置換基R３を有していてもよい。また、S4は、炭素数2以上の分岐鎖状アルキレン（好ましくは炭素数2以上30以下の分岐鎖状アルキレン）において、主鎖のE側末端、主鎖のTag側末端、及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合する基であることが好ましく、当該基の側鎖の末端は置換基R３を有していることも好ましい。
　好ましいS4としては、下記が挙げられる。下記において、左側末端がEに結合し、右側末端がタンパク質精製タグ部位Tagに結合することが好ましく、少なくとも1つのアルキレンは、分岐鎖状アルキレンであってもよく、1つ以上の置換基R３を有していてもよい。
　－(アルキレン－L３)ｄ－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NRａ－　　　　　　　（S41）
　－(C２－６アルキレン－L３)ｄ－(C２－６アルキレン－O)ａ－C２－６アルキレン－NRａ－ （S42）
　－(C２－５アルキレン－L３)ｄ－(C２－５アルキレン－O)ａ－C２－５アルキレン－NRａ－ （S43）
　S41、S42、及びS43の各々において、L３は、各出現において、独立して、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基であり、dは、0又は1以上の整数である。dは、好ましくは0～4、より好ましくは0～3であり、更に好ましくは0～2である。
　S41に含まれる－(アルキレン－O)ａ－、S42に含まれる－(C２－６アルキレン－O)ａ－、及びS43に含まれる－(C２－５アルキレン－O)ａ－は、－(C２H４－O)ａ－であることが好ましい。S41に含まれる－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－、S42に含まれる－(C２－６アルキレン－O)ａ－C２－６アルキレン－、及びS43に含まれる－(C２－５アルキレン－O)ａ－C２－５アルキレン－は、－(C２H４－O)ａ－C２H４－であることが好ましい。aは、1～4、2～4、3又は4等であり得、最も好ましくは4である。
　一実施形態において、S4は、－(C１－６アルキレン－O)１－４－C１－６アルキレン－NH－、－C１－６アルキレン－NH－CO－(C１－６アルキレン－O)１－４－C１－６アルキレン－NH－、－C１－６アルキレン－NH－CO－(1－(M－SO３－C１－６アルキレン)－1,2,3－トリアゾール－4－イル、NH２、NH(C１－６アルキル)、N(C１－６アルキル)２、NH２C(＝NH)NH、及びNHTから選択される置換基を有していてもよい分岐鎖を有するC２－６アルキレン)－NH－CO－(C１－６アルキレン－O)１－４－C１－６アルキレン－NH－、又は－C１－６アルキレン－NH－CO－C１－６アルキレン－(L-1)－C１－６アルキレン－CO－NH－(C１－６アルキレン－O)１－４－C１－６アルキレン－NH－であることが好ましく、－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－C２H４－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－CH(CH３)２－CH２－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－C５H１０－NH－CO－(1－HSO３C３H６－1,2,3－トリアゾール－4－イル－CH２－)CH－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－C５H１０－NH－CO－(1－NaSO３C３H６－1,2,3－トリアゾール－4－イル－CH２－)CH－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－C５H１０－NH－CO－(1－KSO３C３H６－1,2,3－トリアゾール－4－イル－CH２－)CH－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－CH２－NH－CO－(NH２C４H８－)CH－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－CH２－NH－CO－(N(CH３)２－C４H８－)CH－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、－CH２－NH－CO－(NH２－C(＝NH)－NH－C３H６－)CH－NH－CO－(C２H４O)４－C２H４－NH－、又は－CH２－NH－CO－C２H４－(L-1)－C２H４－CO－NH－CH２－(C２H４O)３－C３H６－NH－であることがより好ましい。
　Eは、所定の条件下にて開裂することが可能な基（切断可能部位）である。かかる基としては、上記作用を有する基であれば特に制限されないが、好ましくは穏和な反応条件下で開裂可能な基である。かかる基の例としては、下記が挙げられる。
（式中、
一方の波線は、S3との結合を意味し、他方の波線は、S4との結合を意味し、
Q１、Q２、Q３、Q４、Q５、及びQ６は、それぞれ独立して、H又はアルキル（好ましくはC１－６アルキル）であり、
A１、A２、A３、及びA４は、それぞれ独立して、アリーレン（好ましくはC６－１８アリーレン）であり、
Pepは、ENLYFQG（配列番号1）、ENLYFQS（配列番号2）、又はX１X２X３X４X５X６X７（X１、X２、X３、X５、X６、及びX７は、それぞれ独立して、K又はR以外のアミノ酸残基であり、X４は、K又はRである。）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド残基である。）
　好ましくはQ１及びQ２がアルキルであり、Q３、Q４、Q５、及びQ６がHである。ここでアルキルは、好ましくはC１－６アルキルであり、更に好ましくはC１－４アルキルであり、更により好ましくはC１－３アルキルであり、特に好ましくはC１－２アルキルであり、特により好ましくはメチルである。
　A１及びA２は、好ましくはフェニレン又はナフチレンであり、更に好ましくはフェニレンである。A３及びA４は、好ましくはフェニレン又はナフチレンであり、更に好ましくはフェニレン（例えば1,3-フェニレン、1,4-フェニレン）である。
　上記において穏和な反応条件とは、その処理によって捕捉したタンパク質が分解せず、またアビジンビーズに非特異的に結合した夾雑タンパク質が溶出しないような条件であることが好ましい。具体的には切断可能部位Eを化学的あるいは生化学的に切断する条件を挙げることができ、例えば希薄ヒドラジン水溶液、希薄過ヨウ素酸ナトリウム水溶液、希薄亜ジチオン酸ナトリウム水溶液、希薄ギ酸溶液、tobacco etch virus（TEV）プロテアーゼ溶液、希薄トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン水溶液、希薄ジチオトレイトール水溶液による処理を挙げることができる。より好ましくは希薄ヒドラジン水溶液による処理である。なお、ここで希薄とは、制限されないものの、5質量％以下、好ましくは3質量％以下の濃度を意味する。
　Sは、－S2－又は－S3－E－S4－であることが好ましい。また、Sは、タンパク質精製において非特異的溶出を防ぐ観点から、－S3－E－S4－であることがより好ましく、－S31－E－S41－、－S32－E－S41－、－S33－E－S42－、－S34－E－S42－、－S35－E－S42－、－S36－E－S42－、－S33－E－S43－、－S34－E－S43－、－S35－E－S43－、又は－S36－E－S43－であることが更に好ましい。
　好ましいSとしては、下記が挙げられる。下記において、左側末端がRに結合し、右側末端がTagに結合することが好ましく、少なくとも1つのアルキレンは、分岐鎖状アルキレンであってもよく、1つ以上の置換基R３を有していてもよい。
　－O－アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-1）
　－O－アルキレン－NH－CO－アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-2）
　－O－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-3）
　－O－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－アルキレン－(L-1)－アルキレン－CO－NH－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-4）
　－アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-5）
　－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-6）
　－O－アルキレン－(E-6)－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-7）
　－O－アルキレン－NH－CO－アルキレン－(E-7)－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-8）
　－O－アルキレン－NH－　（S-9）
　上記の各々において、アルキレンは、直鎖状又は分岐鎖状C２－６アルキレンであることが好ましく、(アルキレン－O)ａ中のアルキレンは、C２－５アルキレンであることが好ましく、C２－４アルキレンであることがより好ましく、C２－３アルキレンであることが更に好ましく、C２アルキレンであってもよい。
　更に好ましいSとしては、下記が挙げられる。下記において、左側末端がRに結合し、右側末端がTagに結合することが好ましく、分岐鎖状アルキレン（特にその末端）は、1つ以上の置換基R３を有することが好ましい。
　－O－アルキレン－NH－CO－分岐鎖状アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-10）、
　－O－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－分岐鎖状アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-11）
　－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－分岐鎖状アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－　（S-12）
　上記の各々において、アルキレンは、直鎖状又は分岐鎖状C２－６アルキレンであることが好ましく、分岐鎖状アルキレンは、C２－６アルキレンであることが好ましく、(アルキレン－O)ａ中のアルキレンは、C２－５アルキレンであることが好ましく、C２－４アルキレンであることがより好ましく、C２－３アルキレンであることが更に好ましく、C２アルキレンであってもよい。
(2-3) タンパク質精製タグ部位Tag
　タンパク質精製タグ部位Tagは、タンパク質を精製可能である限り、特に制限されない。このようなタグとしては、例えば、ビオチンタグ、イミダゾリジノンタグ、Hisタグ、Haloタグリガンド、Flag(商標)タグ、Spotタグ、Cタグ、ストレップタグ、GST(Glutathione-S-Transferase)タグ、MBP(Maltose binding protein)タグなどが挙げられる。これらのうち、ビオチンタグ、イミダゾリジノンタグ、Hisタグ、又はHaloタグリガンドが好ましく、具体的には、下記式（2-1）、（2-2）、（2-3）、又は（2-4）が好ましく、下記式（2-1）、（2-2）、又は（2-3）がより好ましく、下記式（2-1）が更に好ましい。
　式（2-1）、（2-2）、（2-3）、及び（2-4）の各々において、＊は、スペーサーSとの結合を意味する。式（2-3）において、pは1から10の整数である。
(2-4) R－S－Tag
　R－S－Tagは、上記R、S、及びTagの任意の組合せであり得る。R-S-Tagの好適な例としては、下記が挙げられる。
　(1A)－S3－E－S4－(2-1)
　(1B)－S3－E－S4－(2-1)
　(1A)－S31－E－S41－(2-1)
　(1B)－S31－E－S41－(2-1)
　(1A)－S32－E－S41－(2-1)
　(1B)－S32－E－S41－(2-1)
　(1A)－S33－E－S42－(2-1)
　(1A)－S34－E－S42－(2-1)
　(1A)－S35－E－S42－(2-1)
　(1A)－S36－E－S42－(2-1)
　(1A)－S33－E－S43－(2-1)
　(1A)－S34－E－S43－(2-1)
　(1A)－S35－E－S43－(2-1)
　(1A)－S36－E－S43－(2-1)
　(1A)－S2－(2-2)
　(1B)－S2－(2-2)
　(1A)－S2－(2-3)
　(1B)－S2－(2-3)
　R－S－Tagのより好適な例としては、下記が挙げられる。
　(1A)－(S-1)－(2-1)
　(1B)－(S-1)－(2-1)
　(1A)－(S-2)－(2-1)
　(1B)－(S-2)－(2-1)
　(1A)－(S-3)－(2-1)
　(1B)－(S-3)－(2-1)
　(1A)－(S-4)－(2-1)
　(1B)－(S-4)－(2-1)
　(1A)－(S-5)－(2-1)
　(1B)－(S-5)－(2-1)
　(1A)－(S-6)－(2-1)
　(1B)－(S-6)－(2-1)
　(1A)－(S-7)－(2-1)
　(1B)－(S-7)－(2-1)
　(1A)－(S-8)－(2-1)
　(1B)－(S-8)－(2-1)
　(1A)－(S-10)－(2-1)
　(1B)－(S-10)－(2-1)
　(1A)－(S-11)－(2-1)
　(1B)－(S-11)－(2-1)
　(1A)－(S-12)－(2-1)
　(1B)－(S-12)－(2-1)
　(1A)－(S-9)－(2-2)
　(1B)－(S-9)－(2-2)
　(1A)－(S-9)－(2-3)
　(1B)－(S-9)－(2-3)
(2-5) 塩形態
　R－S－Tagを有する官能性化合物は、塩の形態であってもよい。塩は、酸との塩であってもよく塩基との塩であってもよい。
　酸は、特に限定されないが、例えば、無機酸、有機酸が挙げられる。無機酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸などが挙げられる。有機酸の例としては、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、フタル酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、10-カンファースルホン酸などが挙げられる。酸は1種単独であっても2種以上の組合せであってもよい。
　塩基は、特に限定されないが、例えば、無機塩基、有機塩基が挙げられる。無機塩基の例としては、アルカリ金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム）、アルカリ土類金属水酸化物（例えば、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム）、アルカリ金属炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム）、アルカリ土類金属炭酸塩（例えば、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム）、アルカリ金属炭酸水素塩（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム）、アルカリ金属リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム）、アルカリ土類金属リン酸塩（例えば、リン酸マグネシウム、リン酸カルシウム）などが挙げられる。有機塩基の例としては、トリアルキルアミン（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン）、ピコリン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノン-5-エン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エンなどが挙げられる。
(2-6) 好適な例
　本開示の官能性化合物又はその塩の好適な例には、下記式（P1）、（P2）、（P3）、（P4）、（P5）、（P6）、（P7）、（P8）、（P9）、（P10）、（P11）、（P12）、（P13）、（P14）、（P15）、（P16）、（P17）、（P18）、（P19）、（P20）、（P21）、（P22）、（P23）、（P24）、（P25）、（P26）、（P27）、及び（P28）のいずれかで示される官能性化合物及びそれらの塩が含まれる。
　（P5）及び（P6）において、Mは、H又はアルカリ金属であることが好ましく、H、Na、又はKであることが好ましく、Naであることが更に好ましい。（P9）及び（P10）において、Tは、置換カルボニルであることが好ましく、下記式（T-1）、（T-2）、（T-3）、（T-4）、（T-5）、（T-6）、（T-7）、（T-8）、（T-9）、及び（T-10）のいずれかであることが更に好ましい。
　本開示の官能性化合物の塩の好適な例には、式（P5a）又は（P6a）で示される官能性化合物の塩、及び、式（P7）、（P8）、（P13）、（P14）、（P15）、（P16）、（P19）、（P20）、（P21）、（P22）、（P23）、又は（P24）で示される官能性化合物のトリフルオロ酢酸（TFA）塩が含まれる。具体的には、下記が挙げられる。
　本開示の官能性化合物の塩の好適な例には、実施例1、実施例2、実施例3、実施例4、実施例5、実施例6、実施例7、実施例8、実施例9、実施例10、実施例11、実施例12、実施例13、実施例14-1、実施例14-2、実施例14-3、実施例14-4、実施例14-5、実施例14-6、実施例14-7、実施例14-8、実施例14-9、及び実施例14-10の化合物が含まれる。
(2-7) 製造方法
　本開示の官能性化合物又はその塩の製造方法は、例えば下記に示す製法に基づき製造することができるが、これらに限定されない。
　原料化合物は、市販のものを用いてもよく、自体公知の方法又はそれに準ずる方法に従って合成してもよい。
　本開示の官能性化合物又はその塩の製造において適宜用いられる溶媒、酸、塩基、保護基及び脱離基は、有機合成化学分野で通常用いられるものであれば特に限定されない。
　本開示の官能性化合物又はその塩の製造において、生成物は反応液のまま、又は粗生成物として次反応に用いることもできるが、常法に従って反応混合物から単離することもでき、通常の分離手段により容易に精製することもできる。通常の分離手段としては、例えば濾過、抽出、濃縮、留去、結晶化、再結晶、再沈殿、蒸留、クロマトグラフィー、光学分割が挙げられる。
　本開示の官能性化合物又はその塩の一般製法において、原料化合物、中間体化合物、及び最終化合物は、塩の形態であってもよく、また各反応で得られる目的化合物も塩を形成していてもよい。各化合物が遊離化合物である場合には、自体公知の方法によりその目的とする塩に変換することができ、当該化合物が塩である場合には、自体公知の方法によりその遊離体又は目的とする他の塩に変換することができる。
　本開示の官能性化合物又はその塩の製造方法は、典型的には、R－SAをSB－Tagと反応させてR－S－Tagを得る工程を含む。SA及びSBは、Sの前駆基であり、反応により連結してSを形成する基であれば、特に制限されない。上記の工程、R-SAを製造する工程、又はSB-Tagを製造する工程において、例えば、アルキル化反応、加水分解反応、アミノ化反応、エステル化反応、アミド化反応、エーテル化反応、求核置換反応、付加反応、酸化反応、及び還元反応から選択される少なくとも一種の反応を利用してもよい。各反応に際し、必要に応じて、保護基による保護、及び脱保護剤による脱保護を実施してもよい。
　R－S－TagがR－S3－(E-1)－S4－Tagである場合、例えば、下記の反応スキームで示されるように、式（R1）で表される化合物と式（R2）で表される化合物とを、塩基（例えば、DIPEAなどのトリアルキルアミン）の存在下、溶媒（例えば、DMFなどのアミド溶媒）中で反応させることにより得られる。
　R－S－TagがR－S3－(E-6)－S4－Tagである場合、例えば、下記の反応スキームで示されるように、式（R3）で表される化合物と式（R4）で表される化合物とを、式（R5）で表される化合物及び塩基（例えば、TEAなどのトリアルキルアミン）の存在下、溶媒（例えば、DCMなどのハロ炭化水素溶媒、ピリジンなどのアミン溶媒）中で反応させることにより得られる。
　R－S－TagがR－S3－(E-7)－S41－Tagである場合、例えば、下記の反応スキームで示されるように、式（R6）で表される化合物と式（R7）で表される化合物とを、縮合剤（例えば、COMU）及び塩基（例えば、DIPEAなどのトリアルキルアミン）の存在下、溶媒（例えば、DMFなどのアミド溶媒）中で反応させることにより得られる。
　他のSであっても、上記の反応スキームと同様に、又は、化学合成に関する通常の知識に基づいて適宜設計し得る反応スキームに従って、R－S－Tagを有する官能性化合物又はその塩を製造することができる。
(3) 組成物
　本開示の組成物は、Rが式（1A）で示される基である官能性化合物又はその塩と、Rが式（1B）で示される基である官能性化合物又はその塩とを含む。ここで、Rが式（1B）で示される基である官能性化合物は、Rが式（1A）で示される基である官能性化合物の異性体であること、すなわち、式（1B）のR１が式（1A）のR１と同じであり、式（1B）のR２が式（1A）のR２と同じであることが好ましい。
　本開示の組成物において、Rが式（1A）で示される基である官能性化合物又はその塩と、Rが式（1B）で示される基である官能性化合物又はその塩との質量比（又はモル比）は、例えば、10／90～90／10、好ましくは20／80～80／20、更に好ましくは30／70～70／30である。
　本開示の組成物の好適な例には、下記の組成物が含まれる。
式（P1）で示される官能性化合物又はその塩と、式（P2）で示される官能性化合物又はその塩とを含む組成物
式（P3）で示される官能性化合物又はその塩と、式（P4）で示される官能性化合物又はその塩とを含む組成物
式（P5）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくは（P5a））と、式（P6）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくは（P6a））とを含む組成物
式（P7）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくはTFA塩又は（P7a））と、式（P8）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくはTFA塩又は（P8a））とを含む組成物式（P9）で示される官能性化合物又はその塩と、式（P10）で示される官能性化合物又はその塩とを含む組成物
式（P11）で示される官能性化合物又はその塩と、式（P12）で示される官能性化合物又はその塩とを含む組成物
式（P13）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくはTFA塩又は（P13a））と、式（P14）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくはTFA塩又は（P14a））とを含む組成物
式（P15）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくはTFA塩又は（P15a））と、式（P16）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくはTFA塩又は（P16a））とを含む組成物
式（P17）で示される官能性化合物又はその塩と、式（P18）で示される官能性化合物又はその塩とを含む組成物
式（P19）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくはTFA塩又は（P19a））と、式（P20）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくはTFA塩又は（P20a））とを含む組成物
式（P21）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくはTFA塩又は（P21a））と、式（P22）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくはTFA塩又は（P22a））とを含む組成物
式（P23）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくは2TFA塩又は（P23a））と、式（P24）で示される官能性化合物又はその塩（好ましくは2TFA塩又は（P24a））とを含む組成物
式（P25）で示される官能性化合物又はその塩と、式（P26）で示される官能性化合物又はその塩とを含む組成物
式（P27）で示される官能性化合物又はその塩と、式（P28）で示される官能性化合物又はその塩とを含む組成物
　本開示の組成物は、例えば、上記（2-7）に記載の製造方法における中間生成物（又は粗生成物）として製造することができる。本開示の組成物は、ケミカルプローブとして好適に利用することができ、さらに後述の細胞表面タンパク質の検出又は同定、細胞表面タンパク質の網羅的解析又は近位依存性標識に好適に利用することができる。
(4) 細胞表面タンパク質の網羅的解析
　前述する官能性化合物又はその塩あるいは組成物をケミカルプローブとして用いることで、例えば、チロシン残基を有するタンパク質、特に生細胞又は生組織に存在する細胞の表面タンパク質を網羅的に同定することが可能である。前述する官能性化合物又はその塩あるいは組成物をケミカルプローブとして用いることで、例えばペルオキシダーゼと過酸化水素という一般的に入手が容易な試薬を用いて、近位依存性標識することもできる。また、前述する官能性化合物又はその塩を用いることで、タンパク質のリン酸化変動（例えば、GefinitibのようなEGFRチロシンキナーゼ阻害剤によるEGFRリン酸化変動）を解析することもできる。
　ケミカルプローブを用いたタンパク質の検出又は同定は、制限されないものの、下記の工程（1）及び（2）を有する方法で実施することができる。
（1）ケミカルプローブ中のチロシン残基反応部位Rとタンパク質のチロシン残基とを結合させる工程、及び
（2）前記タンパク質に結合したケミカルプローブ中のタンパク質精製タグ部位Tagに結合する標識物質を結合させて、標識を検出する工程。
　工程（1）に用いられるケミカルプローブの濃度は、特に限定されないが、好ましくは1μg/mL以上、より好ましくは5μg/mL以上、更に好ましくは10μg/mL以上である。工程（1）の反応温度は、特に限定されないが、例えば1～35℃である。また、工程（1）の反応時間は、例えば、10秒以上、30秒以上、又は1分以上であってもよく、30分以下、20分以下、10分以下、又は5分以下であってもよい。
　ケミカルプローブを用いた細胞表面タンパク質の検出又は同定は、下記の工程（A）と、工程（B）と、工程（C）と、必要により工程（D）と、工程（E）とを有する方法で実施することが好ましい。
(A) 試料中の細胞又は組織にケミカルプローブを反応（好ましくは過酸化水素とペルオキシダーゼにより活性化させることで反応）させて、ケミカルプローブ中のチロシン残基反応部位Rと細胞表面タンパク質のチロシン残基とを結合させる工程、
(B) ケミカルプローブが結合した細胞表面タンパク質を含む画分を精製（好ましくは細胞を溶解させることにより精製）する工程、
(C) ケミカルプローブ中のタンパク質精製タグ部位Tagと標識物質とを結合（例えばTの一例であるビオチン部位を標識物質の一例であるアビジンと結合）させて、ケミカルプローブ－標識物質複合体を形成する工程、
(D) 形成したケミカルプローブ－標識複合体を、ケミカルプローブ中の切断可能部位Eで開裂（好ましくは化学的又は生化学的に開裂）する工程、
(E) 前記複合体又はその細胞表面タンパク質結合領域断片から細胞表面タンパク質を検出又は同定する工程。
　以下、これらの各工程について説明する：
(A) チロシン残基反応部位Rと細胞表面タンパク質のチロシン残基とを結合する工程
　本工程は、制限されないものの、一例として、細胞を5％CO2雰囲気下37℃にて培養して、細胞がコンフルエントになったことを確認した後、培地を除きPBS等で洗浄後にPBSで希釈した過酸化水素（例えば0.00003％以上）及びペルオキシダーゼ（例えば0.0016％以上）を加えDMSOにて所望の濃度（例えば1μg/mL以上、好ましくは5μg/mL以上、更に好ましくは10μg/mL以上）に調整したケミカルプローブを添加し1～35℃程度で1～5分程度静置することで実施することができる。ラベル後は反応液を除き、DMEMなどの培地にて洗浄することで未反応プローブを除去することができる。また、DMEMなどの培地にて洗浄することで、フェノールレッドやアミノ酸としてチロシンが多量に含まれているため、未反応プローブを不活化することができる。
(B) ケミカルプローブが結合した細胞表面タンパク質を含む画分を精製する工程
　本工程は、制限されないものの、一例を挙げると、下記の方法を用いることができる。まず細胞にRIPAバッファー（50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% Triton-X-100, Complete protease inhibitor (Roche)）を加えボルテックスし、氷上で30分間インキュベート後に16000×g，4℃で20分間遠心分離して上清を回収することで、ケミカルプローブが結合したタンパク質を含む画分を回収することができる。
(C) ケミカルプローブ中のタンパク質精製タグ部位Tag（例えばビオチン部位）を標識物質（例えばアビジン）と結合させて、ケミカルプローブ－標識物質複合体を形成する工程　本工程は、制限されないものの、例えば、上記（B）で回収した画分に、例えば標識物質磁気粒子（例えばストレプトアビジン磁気粒子）を加える。斯くして、ケミカルプローブ中のタンパク質精製タグ部位Tagの一例であるビオチン部位が標識物質（例えばアビジン）と結合して、さらに、定法に従って磁気分離を行い、上清を廃棄することで、ケミカルプローブ－標識物質複合体を精製し回収することできる。
(D) 形成したケミカルプローブ－標識物質複合体を、ケミカルプローブ中の切断可能部位Eで開裂する工程
　本工程は、制限されないものの、例えば、前記工程（C）で回収したものがケミカルプローブ－アビジン複合体（磁気粒子複合体）の場合、当該複合体に、SDS（sodium dodecyl sulfate）及びヒドラジン水溶液を加え、室温（1～30℃）で30分静置することで実施することができる。この反応により、ケミカルプローブ中の切断可能部位が開裂し、ケミカルプローブ－アビジン複合体を、標的タンパク質の結合領域とビオチン・アビジン結合領域とに分断することができる。反応液を磁気分離して、上清を得ることで、細胞表面タンパク質の結合領域断片を回収することができる。
(E) 細胞表面タンパク質を検出又は同定する工程
　細胞表面タンパク質を検出又は同定するにあたり、必要に応じて、事前に回収した複合体又はその細胞表面タンパク質結合領域断片を精製処理及び／又は加水分解処理に供してもよい。制限されないものの、具体的には、例えば、得られた上清にジチオトレイトールを加え、15分間70℃で静置する。次にヨードアセトアミドを加え、30分間室温で撹拌する。斯くして得られた溶液にSP3ビーズを添加し、MeCNを加え、18分間インキュベーションする。インキュベーション終了後、磁気分離を行い、上清を廃棄する。ペプチド分解処理は、例えば、上記で回収した残渣にトリプシン溶液を添加し、37℃で12～16時間インキュベーションする。MeCNを添加し、18分間インキュベーションし、磁気分離を行い、上清を廃棄する。残渣にTFA水溶液を添加し、3分間インキュベーションする。磁気分離して、上清を得る。
　斯くして調製したペプチドは脱塩され、高質量精度質量分析計を用いた分析のための適切な緩衝溶液中に再懸濁される。質量分析計は、制限されないものの、例えば所定の閾値を超えるイオン信号が、ペプチドの衝突誘起解離（CID）スペクトル又は高エネルギー衝突解離（HCD）スペクトルを生成するためにMSからMS／MSモードに切り替えるように装置を自動的に始動させる、データ依存的取得モードで操作される。これに限定されることなく、データ非依存的取得モードで操作してもよい。全てのMS／MSスペクトルを標準タンパク質データベースに対して検索する。
　このようにして得られたペプチドを分析する。この分野で利用可能なこのような化合物を分析するための任意の方法を使用することができ、好ましい方法は質量分析法である。質量分析法の方法は、当業者に周知である（例えば、Yates、J.Mass Spect.33:1-19（1998）；Kinter及びSherman、タンデム質量分析法を用いたタンパク質配列決定及び同定（Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry）、John Wiley and Sons、New York（2000）；Aebersold及びGoodlett、Chem.Rev.101:269-295（2001）を参照）。高分解能ポリペプチド断片分離のために、分離法としてキャピラリー逆相クロマトグラフィーを使用する液体クロマトグラフィーESI-MS／MS又は自動LC-MS／MSを使用することができる（Yatesら、Methods Mol.Biol.112:553-569（1999））。好ましくは、動的除外を伴うデータ依存性衝突誘起解離（CID）又は高エネルギー衝突解離（HCD）が、選択される質量分析法として使用される（Goodlettら、Anal.Chem.72：1112-1118（2000））。このような分析のために、質量分析計は、典型的には、所定の閾値を超えるイオン信号が、ペプチドの衝突誘起解離（CID）スペクトル又は高エネルギー衝突解離（HCD）スペクトルを生成するためにMSからMS／MSモードに切り替えるように装置を自動的に始動させる、データ依存的取得モードで操作される。
　タンパク質同定においては、標準アルゴリズム（SEQUEST、Mascot、X!tandem、MS Aandaなど）を使用して、全てのMS／MSスペクトルを標準タンパク質データベースに対して検索し、偽陽性タンパク質識別率を1％未満に制限するために典型的なフィルタリングを行う。
　1つの実施形態において、試料中の膜タンパク質の濃度を対照試料と定量的に比較してもよい。これは、標的膜ンパク質受容体の特異的濃縮を検出可能にする。この非標識質量分析のために、質量分析の直前の逆相クロマトグラフィーを、質量／電荷比に対して保持時間の特徴をプロットしたMS特徴マップとして表示することができる。質量分析計によって検出されるように、このようなマップ中のペプチドは、所定の時間にわたって明確な同位体パターンで現れ、試料中の存在量に応じて規定されたイオン電流強度で現れる。ペプチドが断片化及びMS／MS分析によって同定されると、この情報をMSマップの特定のペプチドの特徴に割り当てることができ、MaxQuant（Coxら、Nature Biotechnology（2008）vol.26 pp.1367-1372頁）又はProteome Discoverer（Thermo Fischer scientific）のようなオープンソースまたは商用アルゴリズムを用いた半定量的データ解析と組み合わせることができる。次いで、ペプチド存在量の比率を得るために、異なる試料のMS特徴マップ（例えば、試料対対照）を重ね合わせて比較することができる。膜タンパク質由来の確率論的に標識されたペプチドについては、これらの比は約1のはずであり、リガンドに基づいて特異的に捕捉される膜タンパク質ペプチドは、対照試料に比してより高い値を得る。
　他の実施形態において、代わりの質量分析に基づく定量方法、例えば単一反応モニタリング（SRM）、細胞培養物におけるアミノ酸による安定同位体標識（SILAC；例えば、Nilssonら、Nat Methods（2010）vol.7(9)pp.681-5頁）、質量スペクトルのデータ非依存的取得（SWATH MS；例えば、Gilletら、（Targeted Data Extraction of the MS/MS Spectra Generated by Data-independent Acquisition：A New Concept for Consistent and Accurate Proteome Analysis）を参照）、タンデム質量タグ（TMT；例えば、Dayonら、（Relative Quantification of Proteins in Human Cerebrospinal Fluids by MS/MS using 6-Plex Isobaric Tags）を参照）などを使用することができる。
　MS分析は、他の分析方法に置き換えることができると考えられる。このような他の方法は、本方法の一部として含まれる。
　本発明のケミカルプローブを用いてプローブ構造の一部が付加されたペプチド配列を質量分析法によって同定することにより、膜タンパク質のトポロジーが分かる。さらに、タンパク質の溶媒露出部位が分かるので、構造関連情報として利用できる。
（5）領域限定的な近位依存性標識
　前述する官能性化合物又はその塩をケミカルプローブとして用いることで、例えば、チロシン残基を有するタンパク質、特に生細胞又は生組織に存在する細胞の表面タンパク質の領域限定的な近位依存性標識をすることが可能である。
　ラベルに用いるペルオキシダーゼを一部の領域に限局させることで、領域限定的な近位依存性標識ができる。一部の領域に限定的に局在させる手段としては、例えば、膜タンパク質に特異的なリガンドや抗体を利用できる。一例としては、細胞表面網羅的ラベル化に用いることができるペルオキシダーゼを加える代わりに、ペルオキシダーゼ標識リガンドやペルオキシダーゼ標識抗体を加えることで、及び、遺伝子操作で特定の膜タンパク質にペルオキシダーゼを融合させて発現させることで、近位依存性標識を行うことができる。
　ケミカルプローブを用いた近位依存性標識によるタンパク質の検出又は同定は、制限されないものの、下記の工程（1a）、（1b）、及び（2）を有する方法で実施することができる。
（1a）ペルオキシダーゼ標識リガンドやペルオキシダーゼ標識抗体を細胞又は組織（例えば生細胞又は生組織）に結合させる工程、
（1b）過酸化水素の存在下、ケミカルプローブ中のチロシン残基反応部位Rと細胞表面タンパク質のチロシン残基とを結合させる工程、及び
（2）前記タンパク質に結合したケミカルプローブ中のタンパク質精製タグ部位Tagに結合する標識物質を結合させて、標識を検出する工程。
　工程（1b）に用いられるケミカルプローブの濃度は、特に限定されないが、好ましくは1μg/mL以上、より好ましくは5μg/mL以上、更に好ましくは10μg/mL以上である。工程（1b）に用いられる過酸化水素の濃度は、特に限定されないが、例えば、0.00003％以上、0.00004％以上、又は0.00005％以上であってもよい。工程（1b）の反応温度は、特に限定されないが、例えば1～35℃である。また、工程（1b）の反応時間は、例えば、10秒以上、30秒以上、又は1分以上であってもよく、30分以下、20分以下、10分以下、又は5分以下であってもよい。
　ケミカルプローブを用いた近位依存性標識は、下記の工程（A1）と、工程（A2）と、工程（B）と、工程（C）と、工程（D）と、工程（E）とを有する方法で実施することが好ましい。
（A1）試料中の細胞又は組織にペルオキシダーゼ標識リガンドやペルオキシダーゼ標識抗体を反応させ、特定の細胞表面タンパク質にペルオキシダーゼを近接させる工程、
（A2）試料中の細胞又は組織にケミカルプローブを、過酸化水素により活性化させることで反応させて、ケミカルプローブ中のチロシン残基反応部位Rと特定の細胞表面タンパク質及びその近傍タンパク質のチロシン残基とを結合させる工程、
（B）ケミカルプローブが結合した細胞表面タンパク質を含む画分を精製（好ましくは細胞を溶解させることにより精製）する工程、
（C）ケミカルプローブ中のタンパク質精製タグ部位Tagと標識物質とを結合（例えばTの一例であるビオチン部位を標識物質の一例であるアビジンと結合）させて、ケミカルプローブ－標識物質複合体を形成する工程、
（D）形成したケミカルプローブ－標識複合体を、ケミカルプローブ中の切断可能部位Eで開裂（好ましくは化学的又は生化学的に開裂）する工程、
（E）前記複合体又はその細胞表面タンパク質結合領域断片から細胞表面タンパク質を検出又は同定する工程。
　以下、これらの各工程について説明する：
（A1）試料中の細胞又は組織にペルオキシダーゼ標識リガンドやペルオキシダーゼ標識抗体を反応させ、特定の膜タンパク質にペルオキシダーゼを近接させる工程
　本工程は、制限されないものの、一例として、細胞を5％CO2雰囲気下37℃にて培養して、細胞がコンフルエントになったことを確認した後、培地を除き2% FCS（Fetal Calf Serum）を含むPBS等で洗浄後にペルオキシダーゼ標識リガンドやペルオキシダーゼ標識抗体を添加し、氷上で20分程度静置することで実施することができる。ペルオキシダーゼ標識リガンドやペルオキシダーゼ標識抗体が特定の受容体と結合した後は、PBSなどのバッファーにて洗浄することで未結合のリガンドを除去することができる。
(A2) 過酸化水素の存在下、チロシン残基反応部位Rと細胞表面タンパク質のチロシン残基とを結合する工程
　PBSで希釈した過酸化水素（例えば0.00003％以上）を加えDMSOにて所望の濃度（例えば1μg/mL以上、好ましくは5μg/mL以上、更に好ましくは10μg/mL以上）に調整したケミカルプローブを添加し1～35℃程度で1～5分程度静置することで実施することができる。ラベル後は反応液を除き、DMEMなどの培地にて洗浄することで未反応プローブを除去することができる。また、DMEMなどの培地にて洗浄することで、フェノールレッドやアミノ酸としてチロシンが多量に含まれているため、未反応プローブを不活化することができる。
　以降の工程は、細胞表面タンパク質の網羅的解析の方法に記載の方法に準じて行うことができる。
　本発明は、更に以下の実施例によって詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。
　以下の実施例中の「室温」は、通常、約10℃～約35℃を示す。混合溶媒において示した比は、特に断らない限り容量比を示す。％は、特に断らない限り重量％を示す。
　1HNMR（プロトン核磁気共鳴スペクトル）はフーリエ変換型NMR（Bruker AVANCE III 400（400MHz）、Bruker AVANCE III HD（500 MHz）、BRUKER AVANCE 400 (400 MHz) 及びBRUKER AVANCE III 300N (300 MHz)の何れか）で測定した。スペクトルは、MestReNova version:14.1.2（Mestrelab Research社）およびACD/Spectrus ProcessorTM（ACD社）の何れかを用いて解析した。
　MS（マススペクトル）は、LC/MS（ACQUITY UPLC H-ClassおよびShimadzu LCMS2020の何れか）により測定した。イオン化法としては、ESI法を用い、データは実測値(found)を記載した。通常、分子イオンピーク（[M+H]+、[M-H]-など）が観測される。塩の場合は、通常、フリー体の分子イオンピークもしくはフラグメントイオンピークが観測される。
　シリカゲルカラムクロマ卜グラフィーにおいて、塩基性と記載した場合は、アミノプロピルシラン結合シリカゲルを用いた。
　実施例において、以下の略語を用いることがある。
　AcOEt：酢酸エチル
　AcOH：酢酸
　COMU：(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロホスファート
　DCM：ジクロロメタン
　DIPEA：N,N-ジイソプロピルエチルアミン
　DMAP：4-ジメチルアミノピリジン
　DMEM：ダルベッコ改変イーグル培地
　DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
　DTT：ジチオトレイトール
　EtOH：エタノール
　FCS：ウシ胎児血清
　Fmoc：9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
　HOBt：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
　HRP：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
　MeCN：アセトニトリル
　MeOH：メタノール
　NHS：N-ヒドロキシコハク酸イミド
　ODS：オクタデシルシリル
　Pbf：2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル　PBS：リン酸緩衝生理食塩水
　Ph：フェニル
　RIPA：放射性免疫沈降アッセイ
　RPMI: ロズウェルパーク記念研究所
　SDC：デオキシコール酸ナトリウム
　TBS：トリス緩衝生理食塩水
　TEAB：重炭酸トリエチルアンモニウム
　TFA：トリフルオロ酢酸
　THF：テトラヒドロフラン
　TMT：タンデム質量タグ
　Tris：トリスヒドロキシメチルアミノメタン
　WSC：1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
［実施例1］
　なお、M1-1の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M1-1及び実施例1は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
　上記式に示す中間体M1-1 (75 mg)及び上記式に示す中間体M1-2 (140 mg)をDMF (5 mL)に溶解し、DIPEA (159 μL)を加え、60 ℃にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、実施例1 (165 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.48 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 11.55 (br, 1H), 8.11 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 7.82 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 2.6 Hz, 0.5H), 7.45-7.38 (m, 1H), 7.29 (d, J = 2.2 Hz, 0.5H), 6.41 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.17-4.10 (m, 3H), 3.61 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.56-3.47 (m, 17H), 3.39-3.23 (m, overlapped with water signal), 3.17 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 3.10-3.05 (m, 1H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.26 (s, 4H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.81-1.78 (m, 2H), 1.66-1.40 (m, 10H), 1.36-1.23 (m, 2H), 0.93 (s, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 887.29.
［実施例2］
　なお、M2-1の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M2-1、M2-3、M2-4、及び実施例2は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（M2-3の合成）
　上記式に示すM2-1 (17 mg)及び上記式に示すM2-2 (16 mg)をDMF (1 mL)に溶解し、COMU (37 mg)及びDIPEA (30 μL)を加え、室温にて5時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M2-3 (19 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.31 (d, J = 8.8 Hz, 0.4H), 8.02 (d, J = 8.8 Hz, 0.6H), 7.76 (d, J = 2.6 Hz, 0.6H), 7.41 (s, 0.4H), 7.35-7.31 (m, 1H), 6.21-6.13 (m, 1H), 5.09-5.02 (m, 1H), 4.15-4.10 (m, 2H), 3.72-3.69 (m, 3H), 3.44 (dd, J = 12.6, 6.3 Hz, 2H), 3.33-3.27 (m, 2H), 3.04-2.97 (m, 2H), 2.80 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.88-1.81 (m, 2H), 1.60-1.44 (m, 15H);LC-MS: [M+H]+ = 555.32.
（実施例2の合成）
　前記で製造したM2-3 (19 mg)、DCM (0.5 mL)及びMeOH (0.1 mL)の混合物に、4 M HCl酢酸エチル溶液 (428 μL)を加え、室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣に上記式に示すM2-5 (17 mg)，COMU (22 mg)及びDIPEA (30 μL)を加え、室温にて3時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、実施例2 (15 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.10-8.03 (m, 1+0.4H), 7.94-7.82 (m, 2+0.6H), 7.56 (d, J = 2.5 Hz, 0.6H), 7.41 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 0.6H), 7.35-7.31 (m, 2x0.4H), 6.41 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.30 (dd, J = 7.6, 5.2 Hz, 1H), 4.14-4.09 (m, 3H), 3.58 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.53-3.03 (m, overlapped with water signal), 2.88 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.75 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.59-2.43 (m, overlapped with DMSO signal), 2.31 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.06 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.80-1.72 (m, 2H), 1.65-1.56 (m, 1H), 1.53-1.23 (m, 11H);LC-MS: [M+H]+ = 928.42.
［実施例3］
　なお、M3-12の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M3-12、M3-13、及び実施例3は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（M3-3の合成）
　上記式に示すM3-1 (300 mg)及びDMF (5 mL)の混合物に、M3-2(アリルブロミド) (168 μL)及びDIPEA (340 μL)を加え、室温にて7時間撹拌した。M3-2(アリルブロミド) (168 μL)及びDIPEA (340 μL)を追加し、室温にて13時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル, ヘキサン/AcOEt）で精製して、M3-3 (329 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.97-5.87 (m, 1H), 5.31 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.23 (ddt, J = 10.4, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 4.57 (dt, J = 5.8, 1.4 Hz, 2H), 4.52 (br, 1H), 3.11 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.69-1.62 (m, 2H), 1.53-1.44 (m, 11H), 1.39-1.31 (m, 2H);LC-MS: [M+Na]+ = 294.34.
（M3-6の合成）
　前記で製造したM3-3 (20 mg)に4 M HCl酢酸エチル溶液(921 μL)を加え、室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣にDMF (1 mL)、M3-5(N-(tert-ブトキシカルボニル)-L-プロパルギルグリシン) (16 mg)、COMU (47 mg)及びDIPEA (64 μL)を加え、室温にて3時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M3-6 (22 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.29 (br, 1H), 5.97-5.87 (m, 1H), 5.34-5.22 (m, 3H), 4.58 (dt, J = 5.8, 1.36 Hz, 2H), 4.24-4.22 (m, 1H), 3.29 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 2.80 (ddd, J = 16.8, 5.3, 2.7 Hz, 1H), 2.58 (ddd, J = 16.8, 7.0, 2.6 Hz, 1H), 2.34 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.08 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.69-1.62 (m, 2H), 1.58-1.50 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.41-1.33 (m, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 367.34.
（M3-9の合成）
　前記で製造したM3-6 (22 mg)に4 M HCl酢酸エチル溶液 (1 mL)を加え、室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣にDMF (1 mL)、上記式に示すM3-8 (30 mg)、COMU (39 mg)及びDIPEA (52 μL)を加え、室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M3-9 (39 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.10 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 6.31 (br, 1H), 5.96-5.87 (m, 1H), 5.31 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.23 (ddt, J = 10.4, 1.3, 1.3 Hz, 1H), 5.15 (br, 1H), 4.63-4.56 (m, 3H), 4.53-4.50 (m, 1H), 4.36-4.33 (m, 1H), 3.76 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.65-3.64 (m, 12H), 3.58 (t, J = 4.9 Hz, 2H), 3.50-3.38 (m, 2H), 3.36-3.27 (m, 1H), 3.21-3.13 (m, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.76-2.61 (m, 3H), 2.60-2.46 (m, 2H), 2.34 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.08 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.78-1.32 (m, 12H);
LC-MS: [M+H]+ = 740.84.
（M3-10の合成）
　前記で製造したM3-9 (39 mg)及びDCM (2 mL)の混合物に、Pd(PPh3)4 (6.1 mg)及び1,3-ジメチルバルビツル酸(16 mg)を加え、室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M3-10 (31 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.05-8.02 (m, 1H), 4.53-4.47 (m, 2H), 4.33 (dd, J = 7.8, 4.5 Hz. 1H), 3.82-3.73 (m, 2H), 3.66-3.62 (m, 12H), 3.56 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.39 (q, J = 5.0 Hz, 2H), 3.28-3.16 (m, 3H), 2.95 (dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 1H), 2.74-2.59 (m, 3H), 2.55 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.43 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 2.31 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.24 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.81-1.36 (m, 12H);LC-MS: [M+H]+ = 700.73.
（M3-11の合成）
　前記で製造したM3-10 (31 mg)及びDMF (1 mL)の混合物に、ジメドン (6.8 mg)、WSC・HCl (8.9 mg)及びDMAP (5.4 mg)を加え、室温にて20時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、M3-11 (24 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.12 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.07 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 6.32 (s, 1H), 5.26 (s, 1H), 4.61 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.54-4.51 (m, 1H), 4.36-4.32 (m, 1H), 3.76 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.65-3.64 (m, 12H), 3.58 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.50-3.38 (m, 2H), 3.36-3.27 (m, 1H), 3.22-3.13 (m, 2H), 3.01 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.76-2.61 (m, 3H), 2.60-2.47 (m, 4H), 2.35 (s, 2H), 2.20 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.11 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.78-1.37 (m, 12H), 1.08 (s, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 823.14.
（M3-13の合成）
　前記で製造したM3-11 (24 mg)及びDMF (1 mL)の混合物に上記式に示すM3-12 (8.5 mg)及びDIPEA (20 μL)を加え、60 ℃にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M3-13 (28 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.46-13.45 (m, 1H), 8.28 (d, J = 8.8 Hz, 0.4H), 8.01 (d, J = 8.8 Hz, 0.6H), 7.72 (d, J = 1.8 Hz, 0.6H), 7.60 (d. J = 8.2 Hz, 0.4H), 7.53 (d, J = 8.0 Hz, 0.6H), 7.42 (d, J = 2.3 Hz, 0.4H), 7.33-7.21 (m, 2H), 7.06-6.98 (m, 1H), 6.56 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.96-5.82 (m, 1H), 4.71-4.62 (m, 1H), 4.55-4.52 (m, 1H), 4.37-4.34 (m, 1H), 4.16-4.10 (m, 2H), 3.78-3.75 (m, 2H), 3.67-3.56 (m, 17H), 3.45-3.16 (m, 7H), 2.94-2.91 (m, 3H), 2.77-2.48 (m, 5H), 2.34 (d, J = 5.2 Hz, 4H), 2.21 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.15-2.14 (m, 1H), 1.90-1.84 (m, 2H), 1.73-1.47 (m, 18H), 1.02 (d, J = 3.8 Hz, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 1096.21.
（実施例3の合成）
　前記で製造したM3-13及び上記式に示す M3-14 (3.1 mg)をTHF/H2O (3:1, 1 mL)に溶解し、硫酸銅(II)五水和物 (0.7 mg)及びL-アスコルビン酸ナトリウム (1.1 mg)を加え、室温にて16時間撹拌した。M3-14 (5.1 mg)、硫酸銅(II)五水和物 (1.7 mg)及びL-アスコルビン酸ナトリウム (2.7 mg)を加え、室温にて4時間撹拌した。M3-14 (5.1 mg)、硫酸銅(II)五水和物 (1.7 mg)及びL-アスコルビン酸ナトリウム (2.7 mg)を追加し、室温にて2時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、実施例3 (11 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.35 (s, 1H), 11.57-11.46 (m, 1H), 8.12-8.06 (m, 1+0.4H), 7.87-7.82 (m, 2+0.6H), 7.75 (s, 1H), 7.58 (s, 0.6H), 7.42 (t, J = 11.0 Hz, 1H), 7.28 (s, 0.4H), 6.41 (s, 1H), 6.34 (s, 1H), 4.47-4.38 (m, 3H), 4.32-4.28 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 3H), 3.56-3.27 (m, overlapped with water signal), 3.17 (q, J = 5.7 Hz, 2H), 3.11-2.79 (m, 8H), 2.59-2.49 (m, overlapped with DMSO signal), 2.39-2.32 (m, 4H), 2.25 (s, 4H), 2.08-204 (m, 4H), 1.79 (br, 1H), 1.64-1.24 (m, 18H), 0.92 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1260.72.
［実施例4］
　なお、M4-1の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M4-1、M4-3、M4-4、M4-6、及び実施例4は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（M4-3の合成）
　上記式に示すM4-1 (20 mg)、M4-2(Nε-(tert-Butoxycarbonyl)-Nα-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-lysine) (32 mg)及びDMF (2 mL)の混合物に、WSC・HCl (16 mg)及びHOBt・H2O (13 mg)を加え、室温にて15時間撹拌した。溶媒を留去して水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、濾液の溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル, ヘキサン/AcOEt→AcOEt/MeOH）で精製して、M4-3 (34 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.14 (d, J = 8.7 Hz, 0.5H), 7.93-7.85 (m, 1+0.5H), 7.75-7.72 (m, 2H), 7.64-7.61 (m, 2+0.5H), 7.55-7.45 (m, 0.5H), 7.37-7.26 (m, 5+0.5H), 7.20 (d, J = 6.5 Hz, 0.5H), 4.39-4.31 (m, 2H), 4.18 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 4.12-4.02 (m, 3H), 3.64-3.63 (m, 3H), 3.24-3.19 (m, 2H), 3.02 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.84-1.71 (m, 3H), 1.66-1.28 (m, 20H);
LC-MS: [M+H]+ = 742.46.
（M4-6の合成）
　前記で製造したM4-3 (34 mg)及びDMF (2 mL)の混合物にピペリジン (9 μL)を加え、室温にて16時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製した。得られたM4-4（不純物を含む）をDMF (2 mL)に溶解し、上記式に示すM4-5 (32 mg)及びDIPEA (24 μL)を加え、60 ℃にて2時間撹拌した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M4-6 (38 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.62 (d. J = 8.2 Hz, 1H), 8.28-8.23 (m, 1H), 8.08 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 7.84-7.80 (m, 1H), 7.56 (d, J = 2.6 Hz, 0.5H), 7.41 (dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 0.5H), 7.35 (d, J = 8.1 Hz, 0.5 H), 7.30 (d, J = 2.4 Hz, 0.5H), 6.76-6.73 (m, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.34 (s, 1H), 4.50 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.14-4.10 (m, 3H), 3.56-3.02 (m, overlapped with water signal), 2.87 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.29 (s, 4H), 2.07-2.04 (m, 2H), 1.76-1.55 (m, 6H), 1.49-1.19 (m, 23H), 0.94 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1115.74.
（実施例4の合成）
　前記で製造したM4-6 (14 mg)及びDCM (1 mL)の混合物にTFA (0.3 mL)を加え、室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、実施例4 (4.2 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.24 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.7 Hz, 0.1H), 7.90-7.84 (m, 1+0.9H), 7.53 (d, J = 2.6 Hz, 0.9H), 7.38-7.35 (m, 1H), 7.19 (dd, J = 8.8, 2.7 Hz, 0.1H), 6.41 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.48 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 3H), 3.57-2.99 (m, overlapped with water signal), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.49 (m, overlapped with DMSO signal), 2.29 (s, 4H), 2.06 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.77-1.23 (m, 20H), 0.94 (s, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 1016.13.
［実施例5］
　なお、M5-9の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M5-9、M5-10、及び実施例5は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（M5-3の合成）
　上記式に示すM5-1 (51 mg)、M5-2((S)-Allyl 2-amino-6-[(tert-butoxycarbonyl)amino]hexanoate hydrochloride) (34 mg)及びDMF (2 mL)の混合物に、WSC・HCl (30 mg)、HOBt・H2O (24 mg)及びDIPEA (36 μL)を加え、室温にて2日間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M5-3 (73 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.32 (br, 1H), 6.84 (br, 1H), 5.95-5.85 (m, 2H), 5.33 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.25 (dd, J = 10.4, 1.2 Hz, 1H), 5.04-4.85 (br, 2H), 4.63-4.49 (m, 4H), 4.34-4.32 (m, 1H), 3.79-3.74 (m, 2H), 3.65-3.63 (m, 12H), 3.57 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.46-3.44 (m, 2H), 3.18-3.08 (m, 3H), 2.92 (dd, J = 12.9, 5.0 Hz, 1H), 2.74 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.54 (br, 2H), 2.22 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 1.83-1.44 (m, 21H);
LC-MS: [M+H]+ = 760.40.
（M5-4の合成）
　前記で製造したM5-3 (73 mg)及びDCM (2 mL)の混合物に、Pd(PPh3)4 (11 mg)及び1,3-ジメチルバルビツル酸(30 mg)を加え、室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M5-4 (49 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.26-7.23 (m, 1H), 7.06-7.03 (m, 2H), 5.07 (br, 1H), 4.83 (br, 1H), 4.57-4.52 (m, 2H), 4.38-4.35 (m, 1H), 3.80-3.70 (m, 2H), 3.65-3.58 (m, 14H), 3.51-3.40 (m, 2H), 3.21-3.16 (m, 1H), 3.13-3.07 (m, 2H), 2.94 (dd, J = 12.9, 4.9 Hz, 1H), 2.73 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 2.53-2.51 (m, 2H), 2.33-2.21 (m, 2H), 1.94-1.85 (m, 1H), 1.79-1.66 (m, 5H), 1.53-1.43 (m, 15H);LC-MS: [M+H]+ = 720.74.
（M5-6の合成）
　前記で製造したM5-4 (78 mg)、上記式に示すM5-5及びDMF (2 mL)の混合物にWSC・HCl (31 mg)、HOBt・H2O (25 mg)及びDIPEA (38 μL)を加え、室温にて17時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M5-6 (88 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.99-5.89 (m, 1H), 5.33 (ddt, J = 17.2, 1.5, 1.5 Hz, 1H), 5.23 (ddt, J = 10.5, 1.2, 1.2 Hz, 1H), 4.63 (dt, J = 5.6, 1.3 Hz, 2H), 4.51-4.47 (m, 1H), 4.37 (dd, J = 8.7, 5.3 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.94 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.75 (td, J = 6.1, 1.2 Hz, 2H), 3.63-3.61 (m, 12H), 3.54 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.36 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.23-3.18 (m, 1H), 3.04 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.93 (dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.52 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.89-1.55 (m, 6H), 1.51-1.38 (m, 15H);
LC-MS: [M+H]+ = 817.79.
（M5-7の合成）
　前記で製造したM5-6 (29 mg)及びDCM (1 mL)の混合物に、Pd(PPh3)4 (4.1 mg)及び1,3-ジメチルバルビツル酸(11 mg)を加え、室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M5-7 (26 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.15 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.02 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 4.49 (dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 1H), 4.41-4.36 (m, 1H), 4.30 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 1H), 3.96-3.86 (m, 2H), 3.77-3.72 (m, 2H), 3.64-3.59 (m, 12H), 3.54 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.38-3.34 (m, 2H), 3.23-3.18 (m, 1H), 3.03 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.93 (dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.52 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.90-1.81 (m, 1H), 1.78-1.53 (m, 5H), 1.49-1.37 (m, 15H);LC-MS: [M+H]+ = 777.72.
（M5-8の合成）
　前記で製造したM5-7 (24 mg)及びDMF (1 mL)の混合物にジメドン (4.8 mg)、WSC・HCl (6.5 mg)及びDMAP (3.8 mg)を加え、室温にて5時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、M5-8 (8.3 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.52-7.46 (m, 2H), 7.07 (br, 1H), 6.31 (br, 1H), 5.21 (br, 1H), 4.89 (br, 1H), 4.76-4.60 (m, 2H), 4.56-4.50 (m, 2H), 4.36-4.33 (m, 1H), 3.77 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.64-3.63 (m, 12H), 3.57 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.44-3.41 (m, 2H), 3.18-3.09 (m, 3H), 2.91 (dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.72 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.54-2.45 (m, 6H), 2.20 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.89-1.58 (m, 6H), 1.52-1.43 (m, 15H), 1.08 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 899.63.
（M5-10の合成）
　前記で製造したM5-8 (4.8 mg)、上記式に示すM5-9 (1.6 mg)及びDMF (0.5 mL)の混合物に、DIPEA (3.7 μL)を加え、60 ℃にて3時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M5-10 (6.0 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.18 (d, J = 8.8 Hz, 0.4H), 8.00 (d, J = 8.8 Hz, 0.6H), 7.68 (d, J = 2.5 Hz, 0.6H), 7.45-7.36 (m, 1.4H), 6.52 (br, 1H), 4.52-4.43 (m, 3H), 4.31-4.25 (m, 2H), 4.19-4.16 (m, 2H), 3.84-3.78 (m, 2H), 3.76-3.69 (m, 2H), 3.68-3.61 (m, 15H), 3.53 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.35 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.22-3.17 (m, 1H), 3.00 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 12.7, 4.9 Hz, 1H), 2.70 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.56-2.43 (m, 2H), 2.37 (s, 4H), 2.21 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.92-1.88 (m, 2H), 1.83-1.54 (m, 12H), 1.47-1.30 (m, 15H), 1.02 (s, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 1173.01.
（実施例5の合成）
　前記で製造したM5-10 (6.0 mg)及びDCM (0.5 mL)の混合物に、TFA (0.2 mL)を加え、室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して、実施例5 (4.9 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.29 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 11.54 (br, 1H), 8.13-8.10 (m, 1+0.5H), 7.91-7.87 (m, 1+0.5H), 7.82 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.60-7.58 (m, 3+0.5H), 7.45-7.39 (m, 1H), 7.29 (s, 0.5H), 6.40 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.43-4.29 (m, 3H), 4.25-4.20 (m, 1H), 4.17-4.11 (m, 3H), 3.67 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 3.61-3.06 (m, overlapped with water signal), 2.82 (dd, J = 12.5, 5.1 Hz, 1H), 2.77-2.69 (m, 2H), 2.58 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 2.43-2.29 (m, 6H), 2.06 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.81-1.76 (m, 2H), 1.65-1.56 (m, 4H), 1.51-1.39 (m, 10H), 1.35-1.23 (m, 4H), 0.95 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1072.86.
［実施例6］
　なお、M6-5の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M6-5、M6-6、及び実施例6は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（M6-3の合成）
　Nickel(II) chloride, dimethoxyethane adduct (0.8 mg)、4,4'-Di-tert-butyl-2,2'-dipyridyl (1.0 mg)及びトリフルオロメチルベンゼン (1.2 mL)の混合物に、Tris(trimethylsilyl)silane (0.23 mL)及び(4,4'-Di-tert-butyl-2,2'-bipyridine)bis[3,5-difluoro-2-[5-trifluoromethyl-2-pyridinyl-κN)phenyl-κC]iridium(III) Hexafluorophosphate (8.2 mg)を加えた溶液を、上記式に示すM6-1 (200 mg)に添加した。トリフルオロメチルベンゼン (6.1 mL)及びM6-2(tert-Butyl aziridine-1-carboxylate) (0.19 mL)を加え、blue LEDの光を2時間照射した。溶媒を留去し，残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル，ヘキサン/AcOEt）で精製して、目的物 (104 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.70 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 7.37 (dd, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 4.55 (br, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.39 (dt, J = 6.7, 6.7 Hz, 2H), 2.87 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H);LC-MS: [M+Na]+ = 360.30.
（M6-4の合成）
　前記で製造したM6-3 (52 mg)及びMeOH (1 mL)の混合物に、5 M水酸化ナトリウム水溶液 (0.15 mL)を加え、室温にて7時間撹拌した。5 M水酸化ナトリウム水溶液 (0.15 mL)を追加し、室温にて16時間撹拌した。塩酸を加えて中和し、反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M6-4 (35 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.72 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.42 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 3.34-3.28 (m, 2H), 2.85 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.41 (s, 9H);LC-MS: [M+Na]+ = 332.23.
（M6-5の合成）
　前記で製造したM6-4 (35 mg)及びTHF (1 mL)の混合物に、無水酢酸 (53 μL)を加え、加熱還流条件下4時間撹拌した。EtOH (1 mL)及びメチルヒドラジン (30 μL)を加え、加熱還流条件下4時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M6-5 (32 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.21 (d, J = 8.2 Hz, 0.5H), 8.13 (d, J = 1.1 Hz, 0.5H), 8.00 (d, J = 8.2 Hz, 0.5H), 7.91 (d, J = 1.3 Hz, 0.5H), 7.76-7.71 (m, 1H), 6.69 (br, 1H), 3.66-3.65 (m, 3H), 3.37-3.30 (m, 2H), 2.98 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H);
LC-MS: [M+H]+ = 320.30.
（M6-6の合成）
　前記で製造したM6-5 (32 mg)及びMeOH (0.5 mL)の混合物に、4 M HCl 1,4-ジオキサン溶液(2 mL)を加え、室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、M6-6 (26 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.28 (d, J = 8.2 Hz, 0.5H), 8.19 (s, 0.5H), 8.08 (d, J = 8.2 Hz, 0.5H), 8.00 (s, 0.5H), 7.83-7.77 (m, 1H), 3.67-3.66 (m, 3H), 3.31-3.27 (m, 2H), 3.18 (t, J = 7.4 Hz, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 220.20.
（実施例6の合成）
　前記で製造したM6-6 (4.6 mg)、上記式に示すM6-7 (11 mg)及びDMF (1 mL)の混合物に、DIPEA (13 μL)を加え、60 ℃にて2時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、実施例6 (13 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.45 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 8.16-8.14 (m, 1H), 7.91 (d, J = 8.1 Hz, 0.5H), 7.87 (s, 0.5), 7.83-7.78 (m, 2H), 6.40 (s, 1H), 6.34 (s, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 4.14-4.10 (m, H), 3.89 (q, J = 5.9 Hz, 2H), 3.60-3.06 (m, overlapped with water signal), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.25 (s, 4H), 2.05 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.64-1.56 (m, 1H), 1.52-1.40 (m, 3H), 1.34-1.23 (m, 2H), 0.93 (s, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 815.63.
［実施例7］
　なお、M7-1の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M7-1、M7-3、及び実施例7は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（M7-3の合成）
　M7-1(実施例6で合成したM6-6) (2.4 mg)、M7-2(実施例5で合成したM5-8) (8.3 mg)及びDMF (0.5 mL)の混合物に、DIPEA (6.5 μL)を加え、60 ℃にて2時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M7-3 (10 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 13.53 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 8.1 Hz, 0.5H), 8.23 (s, 0.5H), 8.03-8.01 (m, 1H), 7.71 (dd, J = 8.1, 1.2 Hz, 0.5), 7.66 (dd, J = 8.2, 1.5 Hz, 0.5H), 7.54 (br, 1H), 7.41-7.34 (m, 1H), 6.98-6.89 (m, 1H), 6.66 (s, 1H), 5.64 (br, 1H), 4.95-4.91 (m, 1H), 4.53 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.42-4.31 (m, 4H), 4.27-4.14 (m, 2H), 3.75-3.54 (m, 18H), 3.45-3.41 (m, 2H), 3.18-3.05 (m, 6H), 2.91 (dd, J = 12.9, 4.9 Hz, 1H), 1.10 (dd, J = 12.7, 4.4 Hz, 1H), 2.53-2.49 (m, 2H), 2.38-2.35 (m, 4H), 2.26-2.19 (m, 2H), 1.78-1.58 (m, 6H), 1.43-1.23 (m, 15H), 1.02 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1100.82.
（実施例7の合成）
　前記で製造したM7-3 (10 mg)及びDCM (0.5 mL)の混合物に、TFA (0.1 mL)を加え、室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して、実施例7 (8.4 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.23 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 11.62 (br, 1H), 8.17-8.08 (m, 2H), 7.92-7.78 (m, 4H), 7.59 (br, 3H), 6.40 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 4.40-4.29 (m, 3H), 4.27-4.19 (m, 1H), 4.14-4.11 (m, 1H), 4.05-3.97 (m, 2H), 3.62-3.06 (m, overlapped with water signal), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.77-2.71 (m, 2H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.42-2.29 (m, 6H), 2.06 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.65-1.56 (m, 2H), 1.54-1.40 (m, 6H), 1.37-1.24 (m, 4H), 0.95 (s, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 1000.67.
［実施例8］
　なお、M8-8の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M8-8及び実施例8は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（M8-2の合成）
　M8-1(N-(tert-ブトキシカルボニル)グリシン) (106 mg)及びDMF (6 mL)の混合物にジメドン (93 mg)、WSC・HCl (122 mg)及びDMAP (74 mg)を加え、室温にて15時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製した。得られた化合物（不純物を含む）に4 M HCl 1,4-ジオキサン溶液(3 mL)を加え、室温にて30分撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、M8-2 (26 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.14 (br, 3H), 4.28 (s, 2H), 2.52-2.49 (m, 4H), 1.02 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 198.27.
（M8-4の合成）
　前記で製造したM8-2(24 mg)、上記式に示すM8-3 (28 mg)及びDMF (1 mL)の混合物にWSC・HCl (23 mg)、HOBt・H2O (19 mg)及びDIPEA (35 μL)を加え、室温にて3時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、M8-4 (27 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.80 (br, 1H), 6.76 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.28 (dd, J = 18.4, 6.4 Hz, 1H), 3.96 (dd, J = 18.4, 4.4 Hz, 2H), 2.88-2.82 (m, 2H), 2.62 (s, 6H), 2.07 (s, 4H), 1.66-1.61 (m, 2H), 1.53-1.48 (m, 2H), 1.42-1.28 (m, 11H);LC-MS: [M+H]+ = 455.01.
（実施例8の合成）
　前記で製造したM8-4 (27 mg)に4 M HCl 1,4-ジオキサン溶液(1 mL)を加え、室温にて30分撹拌した。溶媒を留去し、残渣にDMF (1 mL)、上記式に示すM8-6 (29 mg)、WSC・HCl (14 mg)、HOBt・H2O (11 mg)及びDIPEA (52 μL)を加え、室温にて3時間撹拌した。DIPEA (21 μL)を追加し、室温にて1時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製した。得られたM8-7（不純物を含む）にDMF (0.5 mL)、上記式に示すM8-8 (1.0 mg)及びDIPEA (2.1 μL)を加え、60 ℃にて2時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製し、実施例8 (0.8 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.18 (d, J = 8.7 Hz, 0.5H), 8.00 (d, J = 8.9 Hz, 0.5H), 7.68 (d, J = 2.5 Hz, 0.5H), 7.45-7.42 (m, 1H), 7.38 (dd, J = 8.9, 1.9 Hz, 0.5H), 4.50-4.47 (m, 3H), 4.34-4.28 (m, 2H), 4.20-4.16 (m, 2H), 3.82-3.69 (m, 4H), 3.66-3.61 (m, 15H), 3.53 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.36-3.17 (m, overlapped with methanol signal), 3.00-2.96 (m, 2H), 2.92 (dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.79 (s, 6H), 2.70 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.53-2.46 (m, 2H), 2.36 (s, 4H), 2.21 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.93-1.52 (m, 16H), 1.47-1.37 (m, 4H), 1.02 (s, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 1101.61.
［実施例9］
　なお、M9-8の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M9-8、M9-9、及び実施例9は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（M9-3の合成）
　M9-1(Fmoc-Arg(Pbf)-OH) (100 mg)、上記式に示すM9-2 (23 mg)及びDMF (3 mL)の混合物にWSC・HCl (36 mg)、HOBt・H2O (28 mg)及びDIPEA (54 μL)を加え、室温にて3時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製した。得られた化合物（不純物を含む）にDMF (2 mL)及びピペリジン (15 μL)を加え、室温にて15時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M9-3 (19 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.98-5.88 (m, 1H), 5,32 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.22 (ddt, J = 10.4, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 4.62 (dt, J = 5.7, 1.4 Hz, 2H), 4.02 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.93 (d, J = 17.6 Hz, 1H), 3.34 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 3.16 (br, 2H), 3.00 (s, 2H), 2.57 (s, 3H), 2.51 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 1.70-1.63 (m, 1H), 1.61-1.51 (m, 3H), 1.45 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 524.67.
（M9-5の合成）
　前記で製造したM9-3 (19 mg)，上記式に示すM9-4 (18 mg)及びDMF (1 mL)の混合物にWSC・HCl (8.4 mg)及びHOBt・H2O (6.7 mg)を加え、室温にて4時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M9-5 (28 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.98-5.88 (m, 1H), 5.32 (ddt, J = 17.2, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 5.22 (ddt, J = 10.5, 1.4, 1.4 Hz, 1H), 4.62 (dt, J = 5.6, 1.4 Hz, 2H), 4.48 (dd, J = 7.8, 4.3 Hz, 1H), 4.42 (dd, J = 8.6, 5.1 Hz, 1H), 4.29 (dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 17.5 Hz, 1H), 3.93 (d, J = 17.5 Hz, 1H), 3.73 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.63-3.58 (m, 12H), 3.53 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.35 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.22-3.15 (m, 3H), 3.00 (s, 2H), 2.91 (dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.69 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.58 (s, 3H), 2.51-2.48 (m, 5H), 2.21 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.08 (s, 3H), 1.92-1.82 (m, 1H), 1.78-1.54 (m, 7H), 1.47-1.40 (m, 8H);LC-MS: [M+H]+ = 998.28.
（M9-6の合成）
　前記で製造したM9-5 (28 mg)及びDCM (1 mL)の混合物に、Pd(PPh3)4(3.2 mg)及び1,3-ジメチルバルビツル酸 (8.8 mg)を加え、室温にて2時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M9-6 (22 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.48 (dd, J = 7.9, 4.3 Hz, 1H), 4.43-4.40 (m, 1H), 4.29 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 1H), 3.95-3.85 (m, 2H), 3.73 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.64-3.58 (m, 12H), 3.53 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.37-3.33 (m, 2H), 3.24-3.17 (m, 3H), 3.00 (s, 2H), 2.91 (dd, J = 12.8, 5.1 Hz, 1H), 2.69 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.57 (s, 3H), 2.51-2.48 (m, 5H), 2.21 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.08 (s, 3H), 1.91-1.83 (m, 1H), 1.78-1.54 (m, 7H), 1.47-1.39 (m, 8H);LC-MS: [M+H]+ = 958.18.
（M9-7の合成）
　前記で製造したM9-6 (22 mg)及びDMF (1 mL)の混合物にジメドン (3.5 mg)、WSC・HCl (4.9 mg)及びDMAP (2.8 mg)を加え、室温に4時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、M9-7 (11 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.13-8.11 (m, 1H), 7.97 (t, J = 4.7 Hz, 1H), 4.66-4.55 (m, 2H), 4.49-4.44 (m, 2H), 4.29 (dd, J = 7.8, 4.5 Hz, 1H), 3.73 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.63-3.58 (m, 12H), 3.53 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.37-3.33 (m, 2H), 3.21-3.17 (m, 3H), 3.00 (s, 3H), 2.91 (dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.69 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.57-2.47 (m, 12H), 2.21 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.08 (s, 3H), 1.93-1.85 (m, 1H), 1.77-1.54 (m, 7H), 1.47-1.39 (m, 8H), 1.08 (s, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 1080.71.
（M9-9の合成）
　前記で製造したM9-7 (11 mg)、上記式に示すM9-8 (3.0 mg)及びDMF (1 mL)の混合物に、DIPEA (5.3 μL)を加え、60 ℃にて2時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M9-9 (10 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.18 (d, J = 8.8 Hz, 0.4H), 7.97 (d, J = 8.8 Hz, 0.6H), 7.68 (d, J = 2.5 Hz, 0.6H), 7.43-7.37 (m, 1.4H), 4.50-4.43 (m, 3H), 4.31-4.27 (m, 2H), 4.18-4.14 (m, 2H), 3.85-3.55 (m, 19H), 3.52 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.34 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.20-3.13 (m, 3H), 2.98 (s, 2H), 2.90 (dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.69 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.58-2.40 (m, 8H), 2.06 (s, 4H), 1.95-1.85 (m, 2H), 1.81-1.51 (m, 14H), 1.45-1.38 (m, 8H), 1.00 (s, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 1354.17.
（実施例9の合成）
　前記で製造したM9-9 (10 mg)及びDCM (0.5 mL)の混合物にTFA (0.5 mL)を加え、室温にて1時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して、実施例9 (6.3 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.16-8.11 (m, 1.4H), 7.94 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 0.6H), 7.83 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 2.6 Hz, 0.6H), 7.45-7.39 (m, 1.4H), 7.00 (br, 4H), 6.41 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.44-4.26 (m, 4H), 4.17-4.11 (m, 3H), 3.68-3.05 (m, overlapped with water signal), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.35 (m, overlapped with DMSO signal), 2.29 (s, 4H), 2.06 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.83-1.75 (m, 2H), 1.68-1.56 (m, 4H), 1.53-1.37 (m, 10H), 1.35-1.23 (m, 2H), 0.95 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1101.14.
［実施例10］
　なお、M10-8の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M10-8及び実施例10は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（M10-2の合成）
　上記式に示すM10-1 (283 mg)、THF (2 mL)及びH2O (20 mL)の混合物に、0.25 M 水酸化ナトリウム水溶液 (5.3 mL)を加え、氷冷下1時間撹拌した。塩酸を加えて中和し、溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M10-2 (79 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 3.70 (s, 3H), 3.21-3.16 (m, 6H), 2.81-2.76 (m, 6H), 2.59-2.53 (m, 4H);
LC-MS: [M+H]+ = 245.33.
（M10-4の合成）
　前記で製造したM10-2 (10 mg)、上記式に示すM10-3 (20 mg)及びDMF (1 mL)の混合物にWSC・HCl (9.4 mg)、HOBt・H2O (7.5 mg)及びDIPEA (21 μL)を加え、室温にて16時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M10-4 (29 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.50 (dd, J = 7.9, 4.3 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.65-3.63 (m, 4H), 3.60-3.58 (m, 4H), 3.54-3.50 (m, 4H), 3.31-3.08 (m, overlapped with methanol signal), 2.93 (dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 1H), 2.75-2.69 (m, 3H), 2.63-2.58 (m 2H), 2.20 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.80-1.55 (m, 8H), 1.48-1.40 (m, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 245.33.
（M10-5の合成）
　前記で製造したM10-4 (28 mg)及びMeOH (0.5 mL)の混合物に5 M 水酸化ナトリウム水溶液 (41 μL)を加え、室温にて3日間撹拌した。塩酸を加えて中和し、反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、M10-5 (21 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.50-4.47 (m, 1H), 4.30 (dd, J = 7.9, 4.4 Hz, 1H), 3.65-3.63 (m, 4H), 3.60-3.58 (m, 4H), 3.54-3.50 (m, 4H), 3.31-3.14 (m, overlapped with methanol signal), 2.93 (dd, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 2.77-2.69 (m, 7H), 2.53 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.39 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.79-1.55 (m, 8H), 1.49-1.40 (m, 2H);
LC-MS: [M+H]+ = 660.05.
（M10-7の合成）
　前記で製造したM10-5 (21 mg)、M10-6(実施例8で合成したM8-2) (7.5 mg)及びDMF (1 mL)の混合物にWSC・HCl (7.3 mg)、HOBt・H2O (5.9 mg)及びDIPEA (11 μL)を加え、室温にて4時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%AcOH含有）で精製して、M10-7 (12 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.53 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 7.81 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 6.68 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 6.09 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 4.72 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 4.53-4.50 (m, 1H), 4.34-4.31 (m, 1H), 3.65-3.52 (m, 12H), 3.37-3.29 (m, 4H), 3.19-3.14 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 12.8, 5.0 Hz, 1H), 2.80-2.43 (m, 18H), 2.21-2.17 (m, 2H), 2.04 (s, 4H), 1.81-1.60 (m, 8H), 1.49-1.41 (m, 2H), 1.09 (s, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 839.39.
（実施例10の合成）
　前記で製造したM10-7 (12 mg)、上記式に示すM10-8 (4.2 mg)及びDMF (1 mL)の混合物にDIPEA (7.5 μL)を加え、60 ℃にて4時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して、実施例10 (5.1 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.27 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 11.61 (br, 1H), 8.27 (br, 1H), 8.12 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 8.04 (br, 1H), 7.88 (d, J = 9.0 Hz, 0.5H), 7.74 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 2.6 Hz, 0.5H), 7.45-7.39 (m, 1H), 7.29 (d, J = 2.1 Hz, 0.5H), 6.41 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 4.41-4.39 (m, 2H), 4.31 (dd, J = 7.6, 4.7 Hz, 1H), 4.17-4.11 (m, 3H), 3.71-3.04 (m, overlapped with water signal), 2.82 (dd, J = 12.4, 5.1 Hz, 1H), 2.59-2.45 (m, overlapped with DMSO signal), 2.31 (s, 4H), 2.04 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.82-1.75 (m, 2H), 1.66-1.24 (m, 16H), 0.96 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1112.74.
［実施例11］
　なお、M11-5の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M11-5及び実施例11は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（M11-3の合成）
　上記式に示すM11-1 (500 mg)、上記式に示すM11-2 (710 mg)及びDMF (10 mL)の混合物に炭酸カリウム (493 mg)を加え、50 ℃にて7時間撹拌した。溶媒を留去し、水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、濾液の溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル, ヘキサン/AcOEt）で精製して、M11-3 (828 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.79 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.36-7.32 (m, 4H), 7.30-7.25 (m, 1H), 7.04 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 8.7, 2.6 Hz, 1H), 4.50 (s, 2H), 4.00 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.48 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.83-1.77 (m, 2H), 1.68-1.62 (m, 2H), 1.52-1.40 (m, 4H);LC-MS: [M+H]+ = 401.29.
（M11-4の合成）
　前記で製造したM11-3 (828 mg)及びMeOH (20 mL)の混合物に5 M 水酸化ナトリウム水溶液 (4.1 mL)を加え、室温にて20時間撹拌した。5 M 水酸化ナトリウム水溶液 (1.2 mL)を追加し、室温にて4時間撹拌した。塩酸を加えて中和し、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、濾液の溶媒を留去し、M11-4 (968 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.78 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.36-7.25 (m, 5H), 7.12 (s, 1H), 7.06 (dd, J = 8.6, 2.6 Hz), 4.44 (s, 2H), 4.06-4.00 (m, 2H), 3.44-3.41 (m, 2H), 1.75-1.69 (m, 2H), 1.59-1.53 (m, 2H), 1.45-1.34 (m, 4H);LC-MS: [M+H]+ = 373.26.
（M11-5の合成）
　前記で製造したM11-4 (770 mg)及びTHF (20 mL)の混合物に無水酢酸 (971 μL)を加え、加熱還流条件下4時間撹拌した。EtOH (20 mL)及びメチルヒドラジン (550 μL)を加え、加熱還流条件下4時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル, ヘキサン/AcOEt→AcOEt/MeOH）で精製した。得られた化合物（不純物を含む）にEtOH (150 mL)を加え、窒素雰囲気下、氷冷下10%Pd/C (440 mg)を加え、水素置換し室温にて6時間撹拌した。濾過後、濾液の溶媒を留去し、残渣をMeOHで洗浄して濾過することで固体を得た。濾液の溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して固体を得た。得られた固体を合わせてMeOHを加えて撹拌後溶媒を留去することでM11-5 (475 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.11 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 7.57 (d, J = 2.6 Hz, 0.5H), 7.45-7.38 (m, 1H), 7.29 (d, J = 2.4 Hz, 0.5H), 4.35 (br, 1H), 4.13 (dt, J = 6.1 Hz, 2H), 3.55-3.53 (m, 3H), 3.41-3.38 (m, 2H), 1.80-1.73 (m, 2H), 1.48-1.34 (m, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 293.32.
（実施例11の合成）
　上記式に示すM11-6及びDCM (1 mL)の混合物にトリエチルアミン(18 μL)及びジクロロジフェニルシラン (10 μL)を加え、室温にて3時間撹拌した。前記で製造したM11-5 (34 mg)及びピリジン (0.5 mL)の混合物を反応液に添加し、室温にて15時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル, DCM/MeOH及びODS, 水/MeCN）で精製して実施例11 (2.1 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.14 (d, J = 8.8 Hz, 0.5H), 8.01 (d, J = 8.7 Hz, 0.5H), 7.65-7.61 (m, 4+0.5H), 7.49 (s, 0.5H), 7.42-7.33 (m, 5+0.5H), 7.29 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 0.5H), 4.48-4.45 (m, 1H), 4.28 (dd, J = 7.7, 4.5 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.79 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.64-3.48 (m, 17H), 3.35-3.30 (m, 4H), 3.20-3.15 (m, 1H), 2.90 (dd, J = 12.7, 5.0 Hz, 1H), 2.68 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 2.45 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.20 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.84-1.38 (m, 14H), 1.25 (s, 6H);
LC-MS: [M+H]+ = 1035.88.
［実施例12］
　なお、M12-1の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M12-1及び実施例12は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（実施例12の合成）
　上記式に示すM12-1 (7.6 mg)、M12-2(d-デスチオビオチン) (5.6 mg)及びDMF (1 mL)の混合物にWSC・HCl (6.0 mg)及びHOBt・H2O (4.8 mg)を加え、室温にて15時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN）で精製して、実施例12 (8.9 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.09 (d, J = 8.8 Hz, 0.4H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 0.6H), 7.72 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 2.6 Hz, 0.6H), 7.42 (dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 0.6H), 7.37 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 0.4H), 7.29 (d, J = 2.4 Hz, 0.4H), 6.28 (s, 1H), 6.10 (s, 1H), 4.12 (dt, J = 6.3 Hz, 2H), 3.62-3.42 (m, 5H), 3.03 (dt, J = 6.4 Hz, 2H), 2.03 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.80-1.72 (m, 2H), 1.50-1.12 (m, 14H), 0.94 (d, J = 6.4 Hz, 3H);
LC-MS: [M+H]+ = 488.59.
［実施例13］
　なお、M13-1の2,3-ジヒドロフタラジン-1,4-ジオンにおいて、置換位置を説明するため、便宜上、環の構成原子上に番号を付した。M13-1及び実施例13は、2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、6位に置換基を有する化合物と、その異性体（2位にメチル（R１）、3位にH（R２）、7位に置換基を有する化合物）との混合物である。
（実施例13の合成）
　上記式に示すM13-1 (9.1 mg)及びDMF (0.5 mL)の混合物にM13-2(N-ヒドロキシスクシンイミド) (13 mg)及びWSC・HCl (22 mg)を加え、室温にて10時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製した。得られたM13-3（不純物を含む）にDMF (1 mL)、M13-4(Hexa-His) (6.7 mg)及びDIPEA (4.2 μL)を加え、室温にて2時間撹拌した。DIPEA (13.9 μL)を追加し、室温にて2時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー（ODS, 水/MeCN, 0.1%TFA含有）で精製して、実施例13 (2.8 mg)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.81-8.63 (m, 7H), 8.48-8.41 (m, 2H), 8.32-8.28 (m, 2H), 8.23-8.21 (m, 1H), 8.12 (d, J = 8.8 Hz, 0.6H), 7.95-7.93 (m, 1H), 7.89 (d, J = 8.8 Hz, 0.4H), 7.57 (d, J = 2.6 Hz, 0.4H), 7.42 (dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 0.4H), 7.38 (dd, J = 8.8, 2.6 Hz, 0.6H), 7.32 (s, 1H), 7.28-7.21 (m, 5+0.6H), 4.54-4.45 (m, 6H), 4.14-4.10 (m, 2H), 3.55-2.83 (m, overlapped with water signal), 2.53-2.32 (m, overlapped with DMSO signal), 1.76-1.72 (m, 2H), 1.45-1.24 (m, 6H);LC-MS: [M+H]+ = 1214.97.
［実施例14］
　なお、実施例14は、実施例4と同様の異性体混合物である。
（実施例14-2の合成）
　上記式に示す実施例4のDMSO溶液 (10 mg/mL, 1 μL)，TMT試薬：TMT10plexTM Isobaric Label Reagents（cat:90110, Thermo ScientificTM）のうちM14-1のアセトニトリル溶液 (60 mM, 2.5 μL)及び1 M TEAB (Triethylammonium bicarbonate, 1 μL)を混合し、室温にて1時間反応させた。LC-MSにより目的物である実施例14-2の生成を確認した。試験例3では、同様にして、10種類の標識付加体を生成した。
LC-MS: [M+H]+ = 1244.91. 
　試験例3に用いた実施例14は以下のように調製した。
　下記表に示すTMT試薬、すなわちTMT10plexTM Isobaric Label Reagents（cat:90110, Thermo ScientificTM）をアセトニトリルに溶解し、50 mM 溶液とする。このTMT溶液2.5 μLに、DMSOに溶解した実施例4（10 mg/ml）と1M TEABをそれぞれ1 μL加え，室温にて1時間反応させた。反応後にPBSを加えて、TMTラベル化したプローブの濃度を100μg/mLとし、これを試験例3の細胞ラベルに用いた。
［比較例］
　比較例1：N-(15-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-18-(4-hydroxyphenyl)-3,6,9,12-tetraoxa-16-azaoctadecyl)-5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamide
　上記式に示す化合物RM-1 (cas no. 2567570-42-5) (21 mg)、チラミン塩酸塩 (6 mg)及びDMF (1 mL)の混合物にDIPEA (24 μL)を加え，60 ℃にて4時間撹拌した。反応液をカラムクロマトグラフィー (ODS, 水/MeCN)で精製して，比較例1 (21 mg)を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.40 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 9.25 (s, 1H), 7.82 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.06 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.68 (dt, J = 8.5, 2.3 Hz, 2H), 6.41 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.47 (dd, J = 7.6, 5.1 Hz, 1H), 4.14-4.10 (m, 1H), 3.72 (q, 6.5 Hz, 2H), 3.56 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.48-3.46 (m, 12H), 3.40-3.33 (m, overlapped with water signal), 3.20-3.15 (m, 4H), 3.11-3.06 (m, 1H), 2.83-2.76 (m, 3H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.26 (s, 4H), 2.06 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.65-1.40 (m, 4H), 1.35-1.24 (m, 2H), 0.93 (s, 1H);LC-MS: [M+H]+ = 733.06.
　比較例2：sodium 2,5-dioxo-1-((3-((2-(5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)ethyl)disulfaneyl)propanoyl)oxy)pyrrolidine-3-sulfonate
　比較例2として、EZ-LinkTM Sulfo-NHS-SS-Biotin（Thermo ScientificTM, 製品番号A39258）を用いる。
［試験例］
　以下に、本発明のケミカルプローブのうち代表的な化合物を用いた試験結果を示すことにより、本発明の化合物の作用を説明する。但し、本発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
試験例1：ケミカルプローブを用いた細胞表面タンパク質の網羅的解析
1．細胞培養、及び本化合物による培養細胞の処理方法
　A549細胞（ATCC(R) 登録番号CCL185TM）を24ウェルプレートに2×10５細胞を播種し、5％CO2雰囲気下37℃にて一晩培養した。細胞をPBSで洗浄後、PBSで調整した0.2%のHRP溶液に浸した。その後PBSで調整した、0.006%の過酸化水素と20 μg/mLの実施例1～13又は比較例1で示すプローブを含むラベル溶液を、先に加えたHRP溶液と等量加えた。最終濃度は、プローブ 10 μg/mL、過酸化水素 0.003%、HRP 0.1%とした。軽く撹拌後に氷上で5分間静置し、ラベル溶液を捨てた後にPBSで洗浄した。細胞はセルスクレーパーにて回収し、－80℃にて凍結保存した。
　アミンラベルの場合は、24ウェルプレートに培養したA549細胞をPBSにて洗浄し、PBSに溶解して0.25 mg/mLに調整した比較例2のプローブを加え、氷上にて所定の時間静置した。次にラベル溶液を除去し、TBS（+）で細胞を洗浄後にセルスクレーパーにて回収した。回収した細胞ペレットは－80℃にて凍結保存した。
2．細胞の溶解
　細胞にRIPAバッファー（50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% Triton-X-100, Complete protease inhibitor (Roche)）を加えボルテックスし、氷上で30分間インキュベート後に16000×g、4℃で20分間遠心分離して上清を回収してセルライゼートとした。
3．ビオチン化タンパク質の精製
　セルライゼートからビオチン化タンパク質を回収するために、PierceTM Streptavidin Magnetic Beads（#88817，Thermo ScientificTM）を用いた。精製作業はKingFisherTM Flex（Thermo ScientificTM）を用いた。ビーズにタンパク質を吸着させた後、8M Urea及び400 mM Arginineを含むRIPAバッファー（50 mM Tris-HCl pH7.5/ 150 mM NaCl/ 0.1% SDS/ 0.5% SDC/ 1% Triton X-100）にて洗浄し、得られたビーズに2%ヒドラジン/0.05% SDS溶液を加え、室温で1時間インキュベーション（30分間を2回，1回ごとに磁気分離して上清を回収）することでビオチンからタンパク質を切り離し、溶液を回収した。Sulfo-NHS-SS-Biotinをプローブとして用いた場合、製品手順書に従いDTTによる還元溶出を行うことでビオチンからタンパク質を切り離し、磁気分離により溶液を回収した。回収した溶液はSavantTM SpeedVacTM 遠心濃縮装置（Thermo ScientificTM）にて濃縮し、最終濃度5 mMのDTTによる還元（70℃ 15分間インキュベーション）と最終濃度50 mMのヨードアセトアミドによるアルキル化（遮光下室温 30分間振とうインキュベーション）を施した。Sera-MagTM SpeedBead Carboxylate-Modified [E3，E7] Magnetic Particles（#65152105050250，#45152105050250，Cytiva）を用い、自動精製装置Bravo（Agilent）にてタンパク質精製を行った後，0.025 μgのTrypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade（#V5073，プロメガ）を加え、37℃にて一晩消化を行った。消化後のペプチドは、同じSpeedBeadsを使ってBRAVOにて精製し、LC-MSの分析に供した。
4．LC-MS解析、及び標的タンパク質の同定
　LC-MSは、nano-HPLC 装置UltiMateTM 3000（Thermo ScientificTM）とFAIMS ProTM インターフェースを備えた質量分析装置Orbitrap EclipseTM（Thermo ScientificTM）を組み合わせたLC-MSシステムにて行った。Nano-HPLC 装置においては、トラップカラム（C18 AcclaimTM PepMapTM, Thermo ScientificTM）とチップカラム（75μm i.d., 12 cm long, 3 μm C18 particles, 日京テクノス）にて構成されるカラム（固定相）と、移動相に0.1％ギ酸－アセトニトリル系を用いた逆相クロマトグラフィーによるグラジエント分析にて行った。流速は300 nL/minで行い、アセトニトリル濃度を4％から35％に増加させるリニアグラジエントでペプチドを溶出した。質量分析は、データ依存的取得法（Data-dependent acquisition, DDA）あるいはデータ非依存的取得法（Data-independent acquisition, DIA）にて行い、いずれもナノエレクトロスプレーによるイオン化を正イオンモードで行った。データ依存的取得法DDAの場合、MS1スペクトルはm/z 375～1500を測定し、データ依存的にプレカーサーを選別してHCDによるフラグメント化を行い、MS2スペクトルを得た。FAIMSはCV=-40V, -60V, -80Vの3条件にて行った。DDAにて得られたデータは、解析ソフトウェアProteome Discovere 3.0（PD 3.0, Thermo ScientificTM）にて解析した。タンパク質同定はUniprotよりダウンロードしたデータベースに対して検索を行い、偽陽性タンパク質識別率1％未満にてタンパク質同定とした。タンパク質の定量は、PD3.0のラベルフリー定量にて算出した。データ非依存的取得法DIAの場合、MS1スペクトルはm/z 495～745を測定し、この範囲を分離幅4Thで区切って順次HCDによるフラグメント化を行い、それぞれMS2スペクトルを得た。FAIMSはCV=-45Vにて行った。得られたデータはDIA-NN 1.8.1にて解析し、タンパク質同定及び定量を行った。タンパク質同定はUniprotよりダウンロードしたデータベースに対して検索を行い、偽陽性タンパク質識別率1％未満にてタンパク質同定とした。同定されたタンパク質は、In silico surfaceome database（Bausch-Fluck, D., Goldmann, U., Muller, S., van Oostrum, M., Muller, M., Schubert, O. T., & Wollscheid, B. (2018). The in silico human surfaceome. Proceedings of the National Academy of Sciences, 115(46), E10988-E10997.）に照合することで表面タンパク質の判別を行った。
5．結果
　各プローブにて得られた表面タンパク質同定結果より、比較例1に対する表面タンパク質の検出量を求めた。具体的には、比較例1に対する各比較例の比を2を底とする対数値で表し、その分布を図1にヒストグラムで示した。分布の平均値を求めたところ、比較例1に対し、実施例1では平均29.04倍、実施例2では平均36.76倍、実施例5では平均41.64倍、実施例6では平均35.02倍多くの表面タンパク質を検出した。その他各実施例における比較例1に対する表面タンパク質の検出量比の平均値は表1の通りであった。
　次に、比較例2に対する表面タンパク質及び非表面タンパク質の検出量を求めた。具体的には、比較例２に対する各比較例の比を2を底とする対数値で表し、その分布より平均値を求めた。ラベル時間は比較例、実施例共に5分にて実施した。その結果を図2のヒストグラムで示した。表面タンパク質については、比較例1に対し、実施例2では平均1.27倍、実施例6では平均1.10倍となり、ほぼ同等の結果を示した（図2(a)及び(b)）。非表面タンパク質については、比較例1に対し、実施例2では平均－2.14倍、実施例6では平均－1.77倍となった（図2(c)及び(d)）。このことは、実施例においては比較例2と比較して、表面タンパク質に対して選択性の高いものであると言える。
　次に、各比較例及び各実施例における同定タンパク質の同定数を図3に示した。比較例1に対して、各実施例においては2倍近くの多くの種類の表面タンパク質を同定した。非表面タンパク質の同定数に関しては図4に表した。比較例1は総タンパク質の検出数が少ないために非表面タンパク質の同定数も少ない。比較例2に対しては、各実施例において非表面タンパク質の同定数は少なく、表面タンパク質への選択性が高いことが示唆された。
　比較例1、比較例2及び各実施例における同定上位100個のタンパク質について、表面タンパク質の数を図5に表した。比較例1においては、上位100個中30個が表面タンパク質であったのに対し、各実施例においては57～64個が表面タンパク質であった。また、比較例2においては、表面タンパク質は50個であり、2時間のラベル条件においては44個に減少した。比較例2は現在広く利用されているが、加水分解を受けるために安定性が低く、溶液にて長期保存が難しい。また、反応性を常時有しているため、基本的に反応を制御することはできない。各実施例においてはHRPに活性化を依存しているため、細胞内に入ることのないHRPの近傍でのみ、すなわち細胞外でのみ活性化し反応する。不活性化についても、細胞外のHRPや過酸化水素を洗浄することで容易に行うことができ、細胞溶解時に残留プローブがあったとしてもラベルされることはない。これらのことから、選択性の高い細胞表面タンパク質ラベルが行えるものと考察される。
　試験例1においてLC-MSにより得られたデータをPD3.0にて解析する際、プローブ化合物の結合の痕跡を検出するために、化学修飾による質量変動を想定して同定を行った。すなわち、実施例1、実施例6、実施例9、実施例10、実施例11はチロシンに対して非固定的に＋289.1426、実施例４は＋435.2376、実施例5、実施例7は＋217.0851、比較例1は＋434.1624（アルキル化を含む）を化学修飾による質量変動値として設定して解析した。比較例2の場合、リジンに対して非固定的に＋145.0197を設定した。その結果、各プローブによる修飾が検出された数は、図6の通りであった。
　実施例6の同定を用いて、膜タンパク質の化学修飾残基の局在位置を解析する目的で、膜トポロジー推定情報を元に可視化するProtter 1.0 (https://wlab.ethz.ch/protter/#)にて修飾位置を解析した。その一例として、EGF受容体の結果を図7に示した。その結果、実施例6の修飾位置は細胞外領域のチロシン残基を選択的に修飾しており、細胞内領域のチロシン残基にプローブによる化学修飾の痕跡は検出されなかった。本化合物が細胞外チロシン残基に対して反応することから、高い選択性もって細胞表面タンパク質を検出及び回収することが可能であると示唆される。
試験例2：試験例1の方法に従い、実施例6を用いてA549細胞をラベルした。ラベル後の細胞に4%パラホルムアルデヒドを加え，氷上で20分間静置して固定した。細胞をFCSB（eBioscienceTM Flow Cytometry Staining Buffer，# 00-4222-26）にて洗浄後，蛍光試薬（Streptavidin-Alexa 10 ug/mL，DAPI 500ng/mL）を加え，室温で20分間インキュベーションした。最後に細胞をFCSBで1回，PBSで2回洗浄し，CellVoyagerTM CV8000（横河電機）により撮像を行った。
　細胞の染色結果を図8に示した。Streptavidin-AlexaFluor 647で染色された領域は細胞辺縁部であり、このことは実施例６によるビオチン化は細胞表面タンパク質を選択的にラベルしていることを示唆するものである。
試験例3： 
［プローブのTMTラベル］
　実施例14に記載の通り、実施例4のTMTラベル化を行なった。
［TMT化プローブによる細胞のラベル］
　Jurkat細胞（ATCC(R) 登録番号TIB-152TM）、THP-１細胞（ATCC(R) 登録番号TIB-202TM）、K562細胞（ATCC(R) 登録番号CCL-243TM）を5％CO2雰囲気下37℃にて培養した。 PBSで洗浄し、PBSで調整した0.2%のHRP溶液に浸した。その後PBSで希釈した過酸化水素と、上記で作製した実施例14-1～実施例14-10の10種類のTMTラベル化プローブを加えた。各TMTラベル化プローブと細胞及びその細胞数は、実施例14-1、14-2、及び14-3はそれぞれ2×10６個のJurkat細胞をラベルし、実施例14-4、14-5、及び14-6はそれぞれ2×10６個のK562細胞をラベルし、実施例14-7、14-8、及び14-9はそれぞれ2×10６個のTHP-1細胞をラベルし、実施例14-10はJurkat細胞とK562細胞とTHP-1細胞をそれぞれ0.7×10６個ずつ混合したものをラベルした。各試薬の最終濃度は、TMTラベル実施例4は10 μg/mL、過酸化水素は0.003%、HRPは0.1%とした。氷上で5分間静置し、細胞を遠心後にラベル溶液を捨て、PBSにて洗浄した。
［ラベルペプチドの精製］
　上記の通りに実施例14等のTMTラベル化プローブでラベル化した10種類の細胞を一つにまとめ、試験例1の方法に従って細胞の溶解及びビオチン化タンパク質の精製を行った。消化後のペプチドはTBSにて溶解した。Immobilized Anti-TMTTM Resin （# 90076、Thermo ScientificTM）を用いて、TMTラベル化ペプチドを精製した。まず、Anti-TMT ResinをTBSで3回洗浄し、ペプチド溶液を加えて室温にて2時間反応させた。0.1% NP-40溶液にて5回、TBSにて3回、MilliQ水にて3回洗浄し、40% MeCN/ 2% TFA溶液を用いてレジンから溶出した。溶出後の溶液を遠心エバポレーターにて乾固し、0.1% TFAに溶解してLC-MSの分析に供した。
［LC-MS解析、及び標的タンパク質の同定］
　LC-MSは、nano-HPLC 装置UltiMateTM 3000 (Thermo ScientificTM）とFAIMS ProTM インターフェースを備えた質量分析装置Orbitrap ExplorisTM 480 (Thermo ScientificTM)を組み合わせたLC-MSシステムにて行った。Nano-HPLC 装置においては、トラップカラム（C18 AcclaimTM PepMapTM, Thermo ScientificTM） とチップカラム(75μm i.d., 12 cm long, 3 μm C18 particles, 日京テクノス)にて構成されるカラム（固定相）と、移動相に0.1％ギ酸－アセトニトリル系を用いた逆相クロマトグラフィーによるグラジエント分析にて行った。流速は300 nL/minで行い、アセトニトリル濃度を4％から35％ に増加させるリニアグラジエントでペプチドを溶出した。質量分析は、データ依存的取得法にて行い、いずれもナノエレクトロスプレーによるイオン化を正イオンモードで行った。MS1スペクトルはm/z 375～1500を測定し、データ依存的にプレカーサーを選別してHCDによるフラグメント化を行い、MS2スペクトルを得た。FAIMSはCV=-50V,-70Vの2条件にて行った。DDAにて得られたデータは、解析ソフトウェアProteome Discovere 3.0（PD 3.0, Thermo ScientificTM)にて解析した。タンパク質同定はUniprotよりダウンロードしたデータベースに対して検索を行い、偽陽性タンパク質識別率１％未満にてタンパク質同定とした。タンパク質の定量は、PD3.0のTMTラベル定量にて算出した。
［結果］
　分析の結果、540種類のTMTラベルペプチドを同定し、TMTのレポーターイオンの検出を確認することができた。プロダクトイオンスペクトルの一例を図9に示した。例示したペプチドはReceptor-type tyrosine-protein phosphatase Cの356番目のアミノ酸から始まるLENLEPEHEYK（配列番号3）で、この配列中のチロシン残基にTMTラベル化実施例4が付加したものとして同定されている。プロダクトイオンスペクトルのm/z126から131の領域に、TMT試薬のレポーターイオンが測定された。
　このTMTレポーターイオンを定量することにより、各細胞に特徴的な細胞表面タンパク質を得ることができる。一例として、Jurkat細胞に発現の高いCD7のTMT定量値を図10に示した。例示したペプチドはCD7タンパク質由来のペプチドQLGPQPQDIIYYEDGVVPTTDRR（配列番号4）であり、11番目のチロシン残基にTMT化実施例4が付加されたものであった。CD7はJurkat細胞に発現の高いタンパク質であるが、Jurkat細胞をラベルしたTMTレポーターイオン126、127N、127Cのシグナルが高く、他の細胞由来のレポーターイオンのシグナルは低かった。また、3種類の細胞を混ぜたサンプル由来のレポーターイオン131は、他の9サンプルのシグナル値の平均値に近い値を示した。以上より、TMT化実施例4を用いることで、生細胞の表面タンパク質に対して直接アイソバリック標識を行うことができ、これを用いて定量的分析を行うことが可能であると示唆された。
　TMT試薬のようなタグ試薬は、一般的にはペプチドに対して行うものであり、細胞からのタンパク質抽出、アフィニティ精製、トリプシンによる消化及びペプチド精製というマルチステップのサンプル調整誤差に影響を受ける。本実施例のように生きた細胞の細胞表面に直接アイソバリック試薬をラベルする方法は、細胞からのタンパク質抽出段階より多サンプルを混合し、一括して実施することが可能なため、サンプル調製の影響を受けない定量解析が可能となる。
試験例4：近接ラベル
　Jurkat細胞を5％CO2雰囲気下37℃にて培養し、細胞を回収後にPBSで洗浄し、さらにSB（Staining Buffer：PBS/2% FCS）にて洗浄した。次に、Fc block (Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal Antibody, eBioscienceTM)を加え、4℃にて15分間静置し、遠心して上清を除いた。細胞ペレットに一次抗体（OKT3, eBioscienceTM）を含む抗体溶液（抗体10 μg/mL, 1 % Fc block, in SB）を添加し、4℃で20分間静置した。陰性対象のControl IgGは、mouse IgG2a（BioLegend(商標), Cat# 401508）を一次抗体として用いた。SBで洗浄後、Goat anti-mIgG-HRP（SouthernBiotech, # 1030-05）を含む抗体溶液（抗体1 μg/mL, 1 % Fc block, in SB）を添加し，4℃で20分間静置した。細胞をSBとPBSで洗浄し、PBSに懸濁した後、PBSに溶解した過酸化水素水及びプローブ混合溶液を細胞懸濁液に加え、最終濃度をプローブ(比較例1, 実施例1, 又は実施例6) 10 μg/mL、過酸化水素0.003%とした。軽く撹拌後に氷上で5分間静置した後、DMEMを加え遠心して上清を除いた後、PBSにて洗浄し、遠心して細胞ペレットを得た。この細胞ペレットを用い、試験例1の方法に従って、ストレプトアビジンビーズによる精製及びLC-MSによるタンパク質の解析を行った。OKT3及びControl IgG群はそれぞれ3つのサンプルを用意し、群間における各タンパク質の存在量比及び差異の有意差p値を計算した。
結果
　近接ラベルによる相互作用分子の解析結果を図11に示す。グラフは、横軸に群間における各タンパク質の存在量比（OKT3/Control IgG）を表し、縦軸は有意性を示すp値を表しているボルケーノプロットで示した。ボルケーノプロットはケミカルプローブとして(a)比較例1, (b)実施例1又は(c)実施例6を使用した結果を個別に作成した。その結果、全ての結果においてOKT3を用いた場合に既知のCD3複合体が検出された。しかしチラミドタイプの比較例1を用いた場合、CD3複合体以外の非特異的な膜タンパク質が多く検出されており、解析結果全体として特定の複合体を選択的に同定しているとは言い難い。一方、実施例1, 実施例6を使用した場合はCD3複合体以外の膜タンパク質は少なく、比較例1に比べてより特異的にTCR/CD3複合体の構成タンパク質を検出している。
（チラミドやルミノールなどは常時不活性状態であり、ペルオキシダーゼや過酸化水素の存在下で活性化するプローブである。ペルオキシダーゼは抗体や遺伝子操作による発現において局在化させることが可能なため、ペルオキシダーゼ周囲においてのみプローブを活性化させ、領域限定的に標識可能である。これは、N-ヒドロキシスクシンイミドなどの常時活性化型のプローブでは実行不可能なものである。）
試験例5：EGF受容体の内在化
　24ウェルプレートに播種したA549細胞をPBS（-）にて2回洗浄した。37℃の血清を含まないRPMI 1640培地（#11875，Thermo ScientificTM）を添加し、37℃で3時間培養した。次に、4℃の血清を含まないRPMI 1640培地を添加し、EGFを添加後に4℃で15分間インキュベートした。EGF溶液を含む培地を除去し、PBS（-）でリンス後にPBS（-）を添加し、室温にて5分間から30分間静置した。陰性対象Controlは、EGF溶液の代わりにPBSを用いた。次に、PBS（-）を除去後に4℃のPBS（-）で細胞をリンスした後、4℃のPBSで調整した0.1%HRP溶液と0.003%の過酸化水素、10 μg/mLの実施例6を含むラベル溶液を加え、氷上で数分間静置し（5分）、ラベル溶液を捨てた後にPBSで洗浄した。細胞はセルスクレーパーにて回収し、試験例1の方法に従って、ストレプトアビジンビーズによる精製及びLC-MSによるタンパク質の解析を行った。EGF及びControl群はそれぞれ3つのサンプルを用意し、群間における各タンパク質の存在量比及び差異の有意差p値を計算した。
結果
　EGF添加刺激による受容体内在化の解析結果を図12に示す。グラフ横軸は、群間における各タンパク質の存在量比（EGF/Control）を表し、縦軸は有意性を示すp値を表すボルケーノプロットで示した。検出された各タンパク質をプロットし、特に細胞表面タンパク質とアノテーションされたものについては黒点で示した。EGFによる刺激時間を5分、15分、30分間行った結果、いずれの刺激時間においてもEGF受容体（EGFR）が特異的に減少し、他の膜タンパク質に有意な変動は見られなかった。この結果より、実施例6プローブを用いた本手法による膜タンパク質の解析は定量的であり、刺激時間5分という短い時間で細胞膜上で起こる変化を捉えることが可能であることが示唆された。特に膜タンパク質は通常状態では細胞膜と細胞質との間で流動的に局在変動しており、このリサイクリング現象を低温状態にすることで抑制しなければリガンド特異的な受容体内在化現象を捉えることは困難である。本手法は短時間かつ低温条件下で実施可能であるため、低温によるリサイクリング抑制状態でもラベルが可能であり、しかも短時間でラベルが完了するため、擬陽性の低い受容体内在化のプロファイリング解析が可能と言える。
試験例6：膜タンパク質のリン酸化解析
　12ウェルプレートに播種したA431細胞をPBS（-）にて2回洗浄した。37℃の血清を含まないRPMI 1640培地（#11875，Thermo ScientificTM）を添加し、37℃で3時間培養した。次に、4℃の血清を含まないRPMI 1640培地を添加し、Gefitinib（sc-202166 、Santa Cruz)を1 μM添加後に4℃で60分間インキュベートした。陰性対象Controlは、Gefitinibの代わりにDMSOを用いた。次にEGFを添加し、4℃で10分間インキュベートした。EGFの陰性対象Controlは、EGF溶液の代わりにPBSを用いた。培地を除去し、PBS（-）でリンス後にPBS（-）を添加し、室温にて5分間静置した。次に、PBS（-）を除去後に4℃のPBS（-）で細胞をリンスした後、4℃のPBSで調整した0.1%HRP溶液と0.003%の過酸化水素、10 μg/mLの実施例6を含むラベル溶液を加え、氷上で5分間静置し、ラベル溶液を捨てた後にPBSで洗浄した。細胞はセルスクレーパーにて回収し、試験例1の方法に従って、ストレプトアビジンビーズによる精製及びトリプシンによる消化を行った。消化後のペプチドを、MagReSyn(R) Ti-IMAC HP（#MR-THP005，ReSyn Biosciences）を用いてリン酸化ペプチドを精製した。精製作業にはKingFisherTM Flex（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いた。消化後のペプチドを80% アセトニトリル/ 5% TFA溶液として調製し，Ti-IMACと20分間反応させた後，洗浄バッファーにより3回洗浄した。洗浄バッファーは，1回目は80% MeCN/ 5% TFA，2回目は80% MeCN/ 1% TFA，3回目は10% MeCN/ 0.2% TFAを用いた。Ti-IMACからの溶出は，1% アンモニア溶液を用いて行った。回収した1% アンモニア溶液を濃縮遠心機にて乾燥させ，0.1% TFAに溶解してLC-MSの分析に供した。
結果
　膜タンパク質のリン酸化ペプチドの解析結果を図13に示す。図13には膜タンパク質由来のリン酸化ペプチドをプロットした。グラフ横軸は、群間における各タンパク質の存在量比を表し、縦軸は有意性を示すp値を表すボルケーノプロットで示した。検出されたリン酸化ペプチドのうち、特にEGFR由来のリン酸化ペプチドを黒点で示した。図13の（1）はEGF添加後5分間の刺激において、コントロールと比較していくつかのリン酸化が亢進あるいは減少することが確認された。特にEGFのリガンドであるEGFRのリン酸化が有意に増加しており、その中にはEGF刺激においてリン酸化が亢進する1172番目のチロシン残基を含むリン酸化ペプチドも含まれていた。また図13の（2）は、EGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるGefitinibをEGF刺激前に添加し、EGFリン酸化変動に及ぼすGefitinibの影響を解析したものである。その結果、Gefitinib処理によりEGF刺激によるリン酸化をGefitinibが有意に抑制していることが確認された。これらの結果より、実施例6プローブを用いた本手法による膜タンパク質の解析は膜タンパク質のリン酸化変動を解析する手段になり得ることが示された。特にキナーゼによるタンパク質のリン酸化は迅速に起こるため、あるリン酸化状態を維持するためには速やかに低温状態に移行させ、キナーゼ活性を抑えることが必要である。本手法は、キナーゼ活性を抑制する低温条件においても迅速にラベル可能である。これにより、一過的なリン酸化状態を保持した膜タンパク質のリン酸化プロファイリング解析には有用な手法となり得る。
試験例7：ラベリングによる膜タンパク質の解析
　12ウェルプレートに培養したA549細胞をPBS（+）にて2回洗浄後、37℃の血清を含まないRPMI 1640培地を添加し、37℃で3時間培養した。培養プレートを氷上に置き、4℃のPBS（-）にて洗浄した。4℃の血清を含まないRPMI 1640培地を添加し、トランスフェリン受容体に対する抗体（抗TFRC抗体、OKT9）を0.5 mg/mLになるように添加した。氷上で10分間、抗体溶液を取り除いて冷えたPBS（+）で細胞を洗浄した。陰性対象のControlとして、抗TFRC抗体溶液の代わりにPBSを添加した。PBSで調整した1.5 mMのSulfo-NHS Acetate (Thermo ScientificTM,#26777)を加え、氷上にて1時間インキュベートした。反応後の溶液を捨て、冷えたPBS（+）で洗浄し、続いて4℃のPBSで調整した0.1%HRP溶液と0.003%の過酸化水素、10 μg/mLのプローブを含むラベル溶液を加え、氷上で5分間静置し、ラベル溶液を捨てた後にPBSで洗浄した。細胞はセルスクレーパーにて回収し、試験例1の方法に従って、ストレプトアビジンビーズによる精製及びLC-MSによるタンパク質の解析を行った。PD3.0にて解析する際、ラベル試薬を検出するために、化学修飾による質量変動を想定して同定を行った。すなわち、Sulfo-NHS Acetateによるアセチル化修飾はリジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシンに対して非固定的に＋42.0106、 実施例6による化学修飾はチロシンに対して非固定的に＋289.1426を質量変動値として設定して解析した。OKT9及びControl群はそれぞれ4つのサンプルを用意し、群間における各修飾ペプチドの存在量比及び差異の有意差p値を計算した。
結果
　抗TFRC抗体OKT9の添加によるラベルペプチドの解析結果を図14に示した。グラフ横軸は、群間におけるペプチドの存在量比（抗TFRC抗体/Control）を表し、縦軸は有意性を示すp値を表すボルケーノプロットで示した。グラフは膜タンパク質由来のラベルペプチドをプロットし、特にTFRC由来のラベルペプチドは黒丸で表示した。図中の数字はTFRC配列中のアミノ酸残基の位置を表している。抗体を添加することで膜タンパク質のラベルペプチドが有意に変化しており、それらは全てTFRC由来のペプチドであった。特に有意な変動を示したものは、TFRC配列中の205番目のリジン、231番目のリジン、371番目のリジン、374番目のリジンであった。これらは、OKT9抗体がTFRCに結合することでアセチル化が低下したことが推定できる。
　これらのラベル部位を既知のTFRCの構造情報（PDB:7ZQS）にアサインしたものを図15に示した。ラベル量が減少していた205番目のリジン、231番目のリジン、371番目のリジン、374番目のリジンは、立体的な配置において同じ領域にある部位であることが確認された。この領域は、TFRC上のOKT9の抗原エピトープ領域であることが報告されている（J Virol. 2021 Sep; 95(17): e01868-20）。

Claims (15)

  1. 　チロシン残基反応部位RがスペーサーSを介してタンパク質精製タグ部位Tagに連結してなる官能性化合物又はその塩であって、
    　前記チロシン残基反応部位Rは、下記式（1）で示される基であり、
    （式中、
    ＊は、スペーサーSとの結合を意味し、
    R１及びR２は、それぞれ独立して、H、1つ以上の置換基で置換されていてもよいC１－６アルキル、1つ以上の置換基で置換されていてもよいC６－１０アリール、及び1つ以上の置換基で置換されていてもよい5～15員のヘテロアリールからなる群から選択される。）
    　前記スペーサーSは、－S1－、－S2－、及び－S3－E－S4－からなる群から選択され、S1は、1つ以上の置換基R３で置換されていてもよいC１－３０アルキレンであり、
    R３は、－N(R３１)２、及び1つ以上の置換基で置換されていてもよい5～15員のヘテロアリールからなる群から選択され、
    2つのR３１は、それぞれ独立して、H、1つ以上の置換基で置換されていてもよいC１－６アルキル、置換カルボニル、及び－C(＝NH)NH２からなる群から選択され、
    S2は、炭素数2以上30以下のアルキレンにおいて、少なくとも一方の末端及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合する基であり、当該基は1つ以上の置換基R３を有していてもよく、
    Rａは、H又は1つ以上の置換基で置換されていてもよいC１－６アルキルであり、
    前記式（L-1）及び（L-2）は、下記式であり、
    （式中、mは、0又は1であり、nは、0又は1である。）
    S3及びS4は、それぞれ独立して、S1及びS2からなる群から選択され、
    Eは、切断可能部位である、官能性化合物又はその塩。
  2. 　Sは、－S3－E－S4－である、請求項1に記載の官能性化合物又はその塩。
  3. 　Eは、下記式（E-1）、（E-2）、（E-3）、（E-4）、（E-5）、（E-6）、（E-7）、（E-8）、及び（E-9）からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の官能性化合物又はその塩。
    （式中、
    一方の波線は、S3との結合を意味し、他方の波線は、S4との結合を意味し、
    Q１、Q２、Q３、Q４、Q５、及びQ６は、それぞれ独立して、H又はC１－６アルキルであり、A１、A２、A３、及びA４は、それぞれ独立して、C６－１８アリーレンであり、
    Pepは、ENLYFQG（配列番号1）、ENLYFQS（配列番号2）、又はX１X２X３X４X５X６X７（X１、X２、X３、X５、X６、及びX７は、それぞれ独立して、K又はR以外のアミノ酸残基であり、X４は、K又はRである。）で示されるアミノ酸配列を有するペプチド残基である。）
  4. 　S3及びS4は、それぞれ独立して、S2から選択される、請求項1又は2に記載の官能性化合物又はその塩。
  5. 　S3は、炭素数2以上30以下の分岐鎖状アルキレンにおいて、主鎖のR側末端、主鎖のE側末端、及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合する基であり、当該基の側鎖の末端は置換基R３を有しており、及び／又は
    S4は、炭素数2以上30以下の分岐鎖状アルキレンにおいて、主鎖のE側末端、主鎖のTag側末端、及び／又は1以上の隣接する－CH２－の間に－O－、－CO－、－NRａ－、－CO－NRａ－、－NRａ－CO－、式（L-1）で示される基、又は式（L-2）で示される基が結合する基であり、当該基の側鎖の末端は置換基R３を有している、請求項1又は2に記載の官能性化合物又はその塩。
  6. 　－S3－E－S4－は、－O－アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－O－アルキレン－NH－CO－アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－O－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－O－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－アルキレン－(L-1)－アルキレン－CO－NH－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－O－アルキレン－(E-6)－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、及び－O－アルキレン－NH－CO－アルキレン－(E-7)－アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－からなる群から選択される基であり、当該基の各アルキレンは置換基R３を有していてもよく、
    aは、1以上の整数である、請求項1又は2に記載の官能性化合物又はその塩。
  7. 　－S3－E－S4－は、－O－アルキレン－NH－CO－分岐鎖状アルキレン－(E-1)－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、－O－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－分岐鎖状アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－、及び－アルキレン－(E-1)－アルキレン－NH－CO－分岐鎖状アルキレン－NH－CO－(アルキレン－O)ａ－アルキレン－NH－からなる群から選択される基であり、当該基の分岐鎖状アルキレンは置換基R３を有する、請求項6に記載の官能性化合物又はその塩。
  8. 　R３は、－N(R３１)２、及び－C１－６アルキレン－SO3M（MはH又はアルカリ金属である）で置換されていてもよい5～15員のヘテロアリールからなる群から選択され、
    2つのR３１は、それぞれ独立して、H、1つ以上の置換基で置換されていてもよいC１－６アルキル、－C(＝O)R３２、及び－C(＝NH)NH２からなる群から選択され、R３２は、TMT、フルオレセイン、Cy3、及びトランスシクロオクテンからなる群から選択される試薬の残基である、請求項1又は2に記載の官能性化合物又はその塩。
  9. 　前記タンパク質精製タグ部位Tagは、下記式（2-1）、（2-2）、（2-3）、及び（2-4）からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の官能性化合物又はその塩。
    （式中、
    ＊は、スペーサーSとの結合を意味し、
    pは1から10の整数である。）
  10. 　下記式（P1）、（P2）、（P3）、（P4）、（P5）、（P6）、（P7）、（P8）、（P9）、（P10）、（P11）、（P12）、（P13）、（P14）、（P15）、（P16）、（P17）、（P18）、（P19）、（P20）、（P21）、（P22）、（P23）、（P24）、（P25）、（P26）、（P27）、及び（P28）のいずれかで示される官能性化合物及びそれらの塩からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の官能性化合物又はその塩。
    （P5）及び（P6）において、Mは、H又はアルカリ金属であり、
    （P9）及び（P10）において、Tは、下記式（T-1）、（T-2）、（T-3）、（T-4）、（T-5）、（T-6）、（T-7）、（T-8）、（T-9）、及び（T-10）のいずれかである。
  11. 　下記の群から選択される、請求項10に記載の官能性化合物又はその塩。
    （P9）及び（P10）において、Tは、下記式（T-1）、（T-2）、（T-3）、（T-4）、（T-5）、（T-6）、（T-7）、（T-8）、（T-9）、及び（T-10）のいずれかである。
  12. 　チロシン残基を有するタンパク質を検出する方法であって、下記工程（1）及び（2）を含む方法。
    （1）請求項1に記載の官能性化合物又はその塩中のチロシン残基反応部位Rとタンパク質のチロシン残基とを結合させる工程、及び
    （2）前記タンパク質に結合した前記官能性化合物又はその塩中のタンパク質精製タグ部位Tagに結合する標識物質を結合させて、標識を検出する工程。
  13. 　細胞表面タンパク質を検出又は同定する方法であって、下記工程（A）、（B）、（C）、及び（E）を含む方法。
    （A）試料中の細胞又は組織に請求項1に記載の官能性化合物又はその塩を反応させて、前記官能性化合物又はその塩中のチロシン残基反応部位Rと細胞表面タンパク質のチロシン残基とを結合させる工程、
    （B）前記官能性化合物又はその塩が結合した細胞表面タンパク質を含む画分を精製する工程、
    （C）精製した画分中の前記官能性化合物又はその塩中のタンパク質精製タグ部位Tagと標識物質とを結合させて複合体を得る工程、
    （E）前記複合体又はその細胞表面タンパク質結合断片から細胞表面タンパク質を検出又は同定する工程
  14. 　細胞表面タンパク質を検出又は同定する方法であって、下記工程（A）、（B）、（C）、（D）、及び（E）を含む方法。
    （A）試料中の細胞又は組織に請求項2に記載の官能性化合物又はその塩を反応させて、前記官能性化合物又はその塩中のチロシン残基反応部位Rと細胞表面タンパク質のチロシン残基とを結合させる工程、
    （B）前記官能性化合物又はその塩が結合した細胞表面タンパク質を含む画分を精製する工程、
    （C）精製した画分中の前記官能性化合物又はその塩中のタンパク質精製タグ部位Tagと標識物質とを結合させて複合体を得る工程、
    （D）前記複合体を、切断可能部位Eで開裂する工程、
    （E）開裂後の細胞表面タンパク質結合断片から細胞表面タンパク質を検出又は同定する工程。
  15. 　細胞表面タンパク質を検出又は同定するための、請求項1に記載の官能性化合物又はその塩の使用。
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