WO2025239441A1 - ウロリチン類の１０位の水酸基を脱水酸化する酵素 - Google Patents

ウロリチン類の１０位の水酸基を脱水酸化する酵素

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WO2025239441A1
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acid sequence
seq
iii
urolithins
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夏乃 千葉
浩明 山本
順 小川
重信 岸野
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Daicel Corp
Kyoto University NUC
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Daicel Corp
Kyoto University NUC
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a novel enzyme that dehydroxylates the hydroxyl group at the 10-position of urolithins, which serve as substrates.
  • Urolithins represented by urolithin A and urolithin C, are known as metabolites of ellagic acid, which is derived from ellagitannins found in pomegranates, raspberries, blackberries, cloudberries, strawberries, walnuts, etc. When ingested, ellagitannins are known to be hydrolyzed in the body and converted into ellagic acid. Although the intestinal absorption of such ellagitannins and ellagic acid is very low, when ingested, they are further metabolized by the human colonic microflora and converted into urolithins.
  • Urolithin A is known to have antioxidant properties (Non-Patent Document 1), anti-inflammatory properties (Non-Patent Document 2), anti-glycation properties (Non-Patent Document 3), and mitophagy-promoting properties (Non-Patent Document 4), and urolithins are attracting attention as functional ingredients. For this reason, there are high expectations for cosmetics, foods, and pharmaceuticals that contain urolithin as an active ingredient.
  • Non-Patent Document 5 a chemical method has been reported in which 2-bromo-5-methoxybenzoic acid is used as a starting material and demethylated to produce 2-bromo-5-hydroxybenzoic acid, which is then reacted with resorcinol to obtain urolithin A (Non-Patent Document 5).
  • enzymatic techniques include a method for producing urolithin C from ellagic acid using a microorganism belonging to Gordonibacter urolithinfaciens, Gordonibacter pamelaeae, or a microorganism belonging to the genus Eggerthella (Patent Documents 1 and 2), and a method for producing urolithins dehydroxylated at the 9-position, such as urolithin E, urolithin M7, urolithin A, and urolithin B, from urolithins with a hydroxyl group at the 9-position, such as urolithin M5, urolithin M6, urolithin C, and isourolitin A, using enzymes derived from microorganisms belonging to Clostridium bolteae and Clostridium asparagiforme (Patent Document 3).
  • enzymatic methods are desirable for preparing urolithins.
  • the substrates available for obtaining the desired urolithins may be limited due to the specificities of the enzymes, or the specific activity of the enzymes themselves may limit production efficiency. Therefore, new enzymes capable of producing urolithins are needed.
  • the present disclosure therefore aims to provide a new enzyme that dehydroxylates the hydroxyl group at a specific position in urolithins.
  • Item 1 An enzyme derived from a microorganism of the genus Enterocloster or Clostridium and having the following property (1): (1) It has the activity of catalyzing the dehydroxylation of the 10-hydroxyl group of urolithins.
  • Item 2. The enzyme according to Item 1, further having the following property (2): (2) The activity is enhanced by a coenzyme selected from the group consisting of methyl viologen (MVCl 2 ), flavin mononucleotide (FMN), and flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • MVCl 2 methyl viologen
  • FMN flavin mononucleotide
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • the enzyme according to Item 2 further having the following property (2-1): (2-1) The activity is further improved by combining the coenzyme with reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH).
  • NADH reduced nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADPH nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • Items 1 to 5 which is an enzyme derived from Enterocloster asparagiformis, Enterocloster citroniae, or Clostridium sp. C2A.
  • a 10-position dehydroxylase of urolithins comprising a polypeptide shown in any one of the following (A1-i) to (A1-iii), a polypeptide shown in any one of the following (A2-i) to (A2-iii), and/or a polypeptide shown in any one of the following (A3-i) to (A3-iii):
  • A1-ii A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
  • A1-iii a polypeptide consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
  • Item 8 The 10-position dehydroxylase of urolithins according to Item 7, comprising a polypeptide represented by any one of (A1-i) to (A1-iii), a polypeptide represented by any one of (A2-i) to (A2-iii), and a polypeptide represented by any one of (A3-i) to (A3-iii).
  • a 10-position dehydroxylase of urolithins comprising a polypeptide shown in any one of the following (B1-i) to (B1-iii), a polypeptide shown in any one of the following (B2-i) to (B2-iii), and/or a polypeptide shown in any one of the following (B3-i) to (B3-iii): (B1-i) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4; (B1-ii) A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4; (B1-iii) a polypeptide consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4; (B2-i) a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5; (B2-ii) A polypeptide
  • Item 10 The 10-position dehydroxylase of urolithins according to Item 9, comprising the polypeptide shown in any one of (B1-i) to (B1-iii), the polypeptide shown in any one of (B2-i) to (B2-iii), and the polypeptide shown in any one of (B3-i) to (B3-iii).
  • Item 11 A polynucleotide encoding the enzyme according to any one of Items 7 to 10.
  • Item 12. An expression cassette or recombinant vector comprising the polynucleotide according to Item 11.
  • Item 13 An expression cassette or recombinant vector comprising the polynucleotide according to Item 11.
  • Item 14. A method for producing a 10-dehydroxylase of urolithins, comprising a step of culturing the transformant according to Item 13.
  • Item 15. A method for producing a 10-dehydroxylase of urolithins, comprising a step of culturing a microorganism selected from the group consisting of microorganisms of the genus Enterocloster and microorganisms of the genus Clostridium.
  • Item 17 A method for producing urolithins dehydroxylated at the 10-position, comprising the step of contacting a urolithin having a hydroxyl group at the 10-position with at least one of the following ⁇ 1> to ⁇ 4>: ⁇ 1> The enzyme according to any one of items 1 to 10. ⁇ 2> The transformant according to item 13.
  • ⁇ 3> A microorganism selected from the group consisting of microorganisms of the genus Enterocloster and microorganisms of the genus Clostridium
  • ⁇ 4> A treated product selected from the group consisting of resting cells, a product treated to improve cell membrane permeability, a product disrupted with cells, and a cell-free extract of the transformant described in ⁇ 2> or the microorganism described in ⁇ 3>.
  • Item 18 The production method according to Item 17, wherein the microorganism is selected from the group consisting of Enterocloster asparagiformis, Enterocloster citroniae, and Clostridium sp. C2A.
  • Item 19 The production method according to Item 17, wherein the microorganism is selected from the group consisting of Enterocloster asparagiformis, Enterocloster citroniae, and Clostridium sp. C2A.
  • urolithin having a hydroxyl group at the 10-position is selected from the group consisting of urolithin M5, urolithin M6, urolithin M7, and urolithin E.
  • the present disclosure provides an enzyme that has the activity to catalyze the dehydroxylation of the 10-hydroxyl group of urolithins.
  • urolithins are compounds represented by the following general formula [I]:
  • Enzyme (10-position dehydroxylase of urolithins)
  • the enzyme of the present disclosure is an enzyme having an activity that catalyzes the dehydroxylation of urolithins at position 10.
  • the enzyme of the present disclosure is composed of a first subunit, a second subunit, and/or a third subunit.
  • microorganism of Derivation The enzyme of one embodiment of the present disclosure is derived from a microorganism of the genus Enterocloster or Clostridium.
  • microorganisms of the genus Enterocloster preferably include Enterocloster asparagiformis and Enterocloster citroniae.
  • Enterocloster asparagiformis include preferably the DSM 15981 strain and strains substantially equivalent to the deposited strain.
  • Enterocloster citroniae include preferably the DSM 19261 strain and strains substantially equivalent to the deposited strain.
  • Clostridium genus microorganisms preferably include Clostridium sp. C2A.
  • Clostridium sp. C2A preferably include Clostridium sp. DC3656 (NITE BP-02708) strain and strains substantially equivalent to the deposited strain.
  • a substantially equivalent strain refers to a microorganism of the same species, a strain whose 16S rRNA gene base sequence has 98% or more (preferably 99% or more, more preferably 100%) homology to the 16S rRNA gene base sequence of the deposited strain in question, and which is capable of expressing the enzyme (10-position dehydroxylase of urolithins) disclosed herein.
  • numbers beginning with DSM are deposit numbers assigned to microorganisms preserved at DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). Numbers beginning with NITE BP- are deposit symbols assigned when microorganisms are internationally deposited with NITE (National Institute of Technology and Evaluation).
  • One embodiment of the enzyme of the present disclosure has the following property (1): (1) It has the activity of catalyzing the dehydroxylation of the 10-hydroxyl group of urolithins.
  • the above property (1) is that, using urolithins having a hydroxyl group at the 10-position (compounds of general formula [I] where R10 is —OH) as substrates, urolithins dehydroxylated at the 10-position (compounds of general formula [I] where R10 is —H) are produced.
  • urolithin E urolithin M5
  • urolithin M6 urolithin M7
  • urolithin M8 urolithin D, urolithin C, or urolithin A is produced, respectively.
  • the enzyme of the present disclosure has the following property (2): (2) The activity is enhanced by a coenzyme selected from the group consisting of methyl viologen (MVCl 2 ), flavin mononucleotide (FMN), and flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • MVCl2 is a preferred coenzyme from the viewpoint of enhancing the effect of improving the activity.
  • the above property (2) preferably also has the following properties (2-1) and/or (2-2).
  • (2-1) The activity is further improved by combining the coenzyme with reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH).
  • the enzyme of the present disclosure has the following properties (3), (4), and (5).
  • (3) The result of SDS-PAGE contains a band showing a relative molecular mass of 75,000 to 96,000; (4)
  • the working pH is 5.5 or more and 7.5 or less; (5)
  • the optimum temperature is 20°C or higher and 37°C or lower.
  • the band exhibiting a relative molecular mass of 75,000 to 96,000 corresponds to the first subunit and/or the third subunit.
  • the enzyme of the present disclosure may further include a band exhibiting a relative molecular mass of 10,000 to 30,000 in the SDS-PAGE results.
  • the band exhibiting a relative molecular mass of 10,000 to 30,000 corresponds to the second subunit, and preferably includes a band having a relative molecular mass of 13,000 to 25,000, more preferably 15,000 to 20,000.
  • the above property (4) (active pH of 5.5 or higher and 7.5 or lower) is preferably further provided by an optimum pH of 6.4 or higher and 6.6 or lower, preferably 6.5.
  • the optimum pH is a pH that exhibits a relative activity value of 70 or higher (preferably 80 or higher, more preferably 90 or higher), with the maximum activity being 100.
  • the above property (5) (optimum temperature of 20°C or higher and 37°C or lower) is preferably an optimum temperature of 20°C or higher and 30°C or lower, more preferably 20°C or higher and 28°C or lower.
  • the optimum temperature refers to a temperature at which the relative activity, with the maximum activity being 100, is 70 or higher (preferably 80 or higher, more preferably 90 or higher).
  • One embodiment of the enzyme of the present disclosure is a 10-position dehydroxylase of urolithins, comprising a polypeptide shown in any one of the following (A1-i) to (A1-iii), a polypeptide shown in any one of the following (A2-i) to (A2-iii), and/or a polypeptide shown in any one of the following (A3-i) to (A3-iii).
  • A1-i a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
  • A1-ii A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
  • A1-iii a polypeptide consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
  • A2-i a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • A2-ii A polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, added, inserted or deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • A2-iii a polypeptide consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • A3-i a polypeptide consisting of the amino acid sequence
  • a preferred embodiment of the enzyme disclosed herein includes a combination of a polypeptide shown in any one of (A1-i) to (A1-iii), a polypeptide shown in any one of (A2-i) to (A2-iii), and a polypeptide shown in any one of (A3-i) to (A3-iii).
  • SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 correspond to the amino acid sequences of the first subunit (EaUro10OH-1), second subunit (EaUro10OH-2), and third subunit (EaUro10OH-3), respectively, of Enterocloster asparagiformis DSM 15981 strain.
  • One embodiment of the enzyme disclosed herein is a 10-position dehydroxylase of urolithins, comprising a polypeptide shown in any one of (B1-i) to (B1-iii) below, a polypeptide shown in any one of (B2-i) to (B2-iii) below, and/or a polypeptide shown in any one of (B3-i) to (B3-iii) below.
  • a preferred embodiment of the enzyme disclosed herein includes a combination of a polypeptide shown in any one of (B1-i) to (B1-iii), a polypeptide shown in any one of (B2-i) to (B2-iii), and a polypeptide shown in any one of (B3-i) to (B3-iii).
  • SEQ ID NOs: 4, 5, and 6 correspond to the amino acid sequences of the first subunit (EcUro10OH-1), second subunit (EcUro10OH-2), and third subunit (EcUro10OH-3), respectively, of Enterocloster citroniae DSM 19261 strain.
  • polypeptides with the subnumbers "-ii” and “-iii” are polypeptides with similar sequences that share the amino acid sequence of the polypeptide with the subnumber "-i" as the basic backbone.
  • the amino acid modification introduced into the polypeptides designated with the above branch number "-ii” may include only one type of modification (e.g., substitution) from among substitution, addition, insertion, and deletion, or may include two or more types of modification (e.g., substitution and insertion).
  • the number of amino acids substituted, added, inserted, or deleted may be one or more or several, for example, 1 to 160, preferably 1 to 80, more preferably 1 to 40, even more preferably 1 to 25, even more preferably 1 to 16, particularly preferably 1 to 8, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2.
  • the number of amino acids substituted, added, inserted, or deleted may be one or more or several, for example, 1 to 35, preferably 1 to 17, more preferably 1 to 8, even more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3, and particularly preferably 1 to 2.
  • the number of amino acids to be substituted, added, inserted, or deleted may be one or more or several, for example, 1 to 150, preferably 1 to 75, more preferably 1 to 37, even more preferably 1 to 22, even more preferably 1 to 15, and particularly preferably 1 to 7, 1 to 3, or 1 to 2.
  • sequence identity may be 80% or more, but is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more, 99.5% or more.
  • sequence identity refers to the amino acid sequence identity value obtained using the bl2seq program (Tatiana A. Tatsusova, Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett., Vol. 174, pp. 247-250, 1999) of BLAST PACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI)].
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Conservative substitutions refer to substitutions between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid; between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid; between Gln and Asn when the substitution site is a polar amino acid; between Lys, Arg, and His when the substitution site is a basic amino acid; between Asp and Glu when the substitution site is an acidic amino acid; and between Ser and Thr when the substitution site is an amino acid with a hydroxyl group.
  • conservative substitutions include substitution of Ala with Ser or Thr; substitution of Arg with Gln, His, or Lys; substitution of Asn with Glu, Gln, Lys, His, or Asp; substitution of Asp with Asn, Glu, or Gln; substitution of Cys with Ser or Ala; substitution of Gln with Asn, Glu, Lys, His, Asp, or Arg; substitution of Glu with Gly, Asn, Gln, Lys, or Asp; substitution of Gly with Pro; substitution of His with Asn, Lys, Gln, Arg, or Tyr; These include substitutions of Eu, Met, Val, or Phe; substitution of Leu with Ile, Met, Val, or Phe; substitution of Lys with Asn, Glu, Gln, His, or Arg; substitution of Met with Ile, Leu, Val, or Phe; substitution of Phe with Trp, Tyr, Met, Ile, or Leu; substitution of Ser with Thr or Ala; substitution of Thr with Ser
  • Polypeptides with the above subnumbers "-ii” and “-iii” include not only polypeptides obtained by artificial mutations such as mutation treatments and genetic recombination, but also mutant or variant polypeptides resulting from naturally occurring mutations based on individual or species differences in the organism from which the polypeptide is derived.
  • polynucleotide of the present disclosure is a polynucleotide that encodes the amino acid sequence of the 10-position dehydroxylase of urolithins shown in the above "(1-3) Amino Acid Sequence.”
  • a person skilled in the art can appropriately design and prepare the polynucleotide of the present disclosure according to the amino acid sequence of the 10-position dehydroxylase of urolithins shown in the above "(1-3) Amino Acid Sequence.”
  • the polynucleotide of the present disclosure includes various polynucleotides derived from codon degeneracy.
  • the nucleotide sequence of the polynucleotide of the present invention is one in which the codon usage frequency is optimized for the host.
  • polynucleotide of the present disclosure is a polynucleotide comprising the DNA shown in (a1-i) or (a1-ii) below, the DNA shown in (a2-i) or (a2-ii) below, and/or the DNA shown in (a3-i) or (a3-ii) below.
  • a preferred embodiment of the polynucleotide of the present disclosure includes a combination of DNA shown in (a1-i) or (a1-ii), DNA shown in (a2-i) or (a2-ii), and DNA shown in (a3-i) or (a3-ii).
  • the base sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 13 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 has codon usage frequency optimized for microorganisms belonging to the genus Rhodococcus.
  • the base sequences shown in SEQ ID NOs: 8 and 14 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 has codon usage frequency optimized for microorganisms belonging to the genus Rhodococcus.
  • the base sequences shown in SEQ ID NOs: 9 and 15 encode the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 has codon usage frequency optimized for microorganisms belonging to the genus Rhodococcus.
  • polynucleotide of the present disclosure is a polynucleotide comprising the DNA shown in (b1-i) or (b1-ii) below, the DNA shown in (b2-i) or (b2-ii) below, and/or the DNA shown in (b3-i) or (b3-ii) below.
  • a preferred embodiment of the polynucleotide of the present disclosure includes a combination of DNA shown in (b1-i) or (b1-ii), DNA shown in (b2-i) or (b2-ii), and DNA shown in (b3-i) or (b3-ii).
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • under stringent conditions refers to incubation for 4 hours to overnight at 50°C to 65°C in 6x SSC (1x SSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0) containing 0.5% SDS, 5x Denhartz's [0.1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400], and 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA.
  • SSC bovine serum albumin
  • Ficoll 400 0.1% polyvinylpyrrolidone
  • 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA.
  • Hybridization under stringent conditions is specifically performed as follows: A nylon membrane onto which a DNA library or cDNA library is immobilized is prepared, and the nylon membrane is blocked at 65°C in a prehybridization solution containing 6xSSC, 0.5% SDS, 5x Denhardt's buffer, and 100 ⁇ g/ml salmon sperm DNA. Subsequently, each 32P -labeled probe is added, and the membrane is incubated overnight at 65°C.
  • the nylon membrane is washed in 6xSSC at room temperature for 10 minutes, in 2xSSC containing 0.1% SDS at room temperature for 10 minutes, and in 0.2xSSC containing 0.1% SDS at 45°C for 30 minutes, and then autoradiography is performed to detect DNA that specifically hybridizes with the probe.
  • DNA obtained from an appropriate gene source is ligated into a plasmid or phage vector according to standard methods to prepare a DNA library.
  • This library is introduced into an appropriate host, and the resulting transformants are cultured on plates.
  • the grown colonies or plaques are transferred to a nitrocellulose or nylon membrane, denatured, and the DNA is immobilized on the membrane.
  • This membrane is then incubated under the stringent conditions described above in a solution containing a probe pre-labeled with 32P or similar, and hybridization is carried out.
  • the DNAs (a1-i) to (a1-ii), (a2-i) to (a2-ii), (a3-i) to (a-ii), (b1-i) to (b1-ii), (b2-i) to (b2-ii), and (b3-i) to (b3-ii) or portions thereof can be used as probes.
  • the polynucleotides of the present disclosure can also be isolated from Enterocloster or Clostridium microorganisms, which are the source microorganisms (producing bacteria) of the 10-position dehydroxylase of urolithins.
  • the target DNA can be isolated from the genome of the microorganism by PCR or hybridization using genomic DNA from the source microorganism as a template and primers or probes designed from known amino acid sequence information taking gene degeneracy into consideration, or primers or probes designed based on known nucleotide sequence information.
  • the polynucleotides disclosed herein include various polynucleotides resulting from codon degeneracy.
  • Various polynucleotides encoding the same amino acid sequence can be artificially created easily using known genetic engineering techniques. For example, in the production of a protein through genetic engineering, if the codons used in the original gene encoding the target protein are used infrequently in the host, the amount of protein expressed may be low. In such cases, high expression of the target protein can be achieved by optimizing the codon usage frequency for the host without changing the encoded amino acid sequence.
  • Methods for introducing mutations into genes and artificially modifying amino acid sequences include well-known methods such as the Kunkel method and the Gapped duplex method, as well as mutation introduction kits that utilize site-directed mutagenesis, such as the QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) and the GeneArtTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene).
  • mutation introduction kits that utilize site-directed mutagenesis, such as the QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) and the GeneArtTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene).
  • systems that can be used include the Directed Mutagenesis PLUS System (Invitrogen), the Takara Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit, etc.: Takara Bio).
  • the base sequence of a polynucleotide can be confirmed by sequencing using conventional methods. For example, the dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463) can be used. Alternatively, the sequence can be analyzed using an appropriate sequencer.
  • the obtained polynucleotide encodes the 10-position dehydroxylase of the desired urolithins can be confirmed by comparing the determined nucleotide sequence with the nucleotide sequences (a1-i), (a1-ii), (a2-i), (a2-ii), (a3-i), (a3-ii), (b1-i), (b1-ii), (b2-i), (b2-ii), (b3-i), and (b3-ii).
  • amino acid sequence deduced from the determined nucleotide sequence can be compared with the amino acid sequences (A1-i) to (A1-iii), (A2-i) to (A2-iii), (A3-i) to (A3-iii), (B1-i) to (B1-iii), (B2-i) to (B2-iii), and (B3-i) to (B3-iii).
  • Expression cassette or recombinant vector of the present disclosure comprises the polynucleotide of the present disclosure shown above in "[2] Polynucleotide.”
  • the expression cassette or recombinant vector of the present disclosure can be obtained by linking a promoter and terminator to the polynucleotide of the present disclosure, or by inserting the expression cassette or polynucleotide of the present disclosure into an expression vector.
  • the expression cassette or recombinant vector of the present disclosure may contain, as control elements, a promoter and a terminator, as well as transcription elements such as an enhancer, a CCAAT box, a TATA box, or an SPI site, as necessary. These control elements may be operably linked to the polynucleotide of the present disclosure. "Operably linked" means that the various control elements that regulate the polynucleotide of the present disclosure are linked to the polynucleotide of the present disclosure in a state that allows them to operate in a host cell.
  • Preferred expression vectors are those constructed for genetic recombination from phages, plasmids, or viruses that can replicate autonomously within a host. Such expression vectors are well known, and those skilled in the art can select and use an appropriate combination with a host cell. For example, when a microorganism is used as a host, Lactococcus lactis subsp. Cremoris - vector pNZ8148 (MoBiTech), Lactococcus lactis - pGKV11 (Appl. Environ.
  • Rhodococcus 5:310-315 (1988)
  • ACE vector Anaerobe, 41, 104-112 (2016)
  • Rhodococcus the pTip, pNit, and pCpi Vector series (Hokkaido System Science, Biotechnol. Bioeng., 86, 136-148 (2004)) are used for Rhodococcus.
  • vectors developed for various hosts can be used when using insects, plants, and animals as hosts in addition to microorganisms.
  • transformant of the present disclosure is obtained by transforming a host using the expression cassette or recombinant vector of the present disclosure shown in the above section "[3] Expression cassette or recombinant vector.”
  • the host used to produce the transformant is not particularly limited, as long as it is capable of introducing a gene, is capable of autonomous replication, and is capable of expressing the genetic traits of the polynucleotide of the present disclosure.
  • Examples include microorganisms such as lactic acid bacteria, bifidobacteria, clostridium, and rhodococcus, as well as insects, plants, and animals.
  • the host used to produce the transformant may be a microorganism from which the 10-position dehydroxylase of urolithins disclosed herein is derived.
  • an expression cassette or recombinant vector of the present disclosure is introduced into a host.
  • the location of introduction of the polynucleotide of the present disclosure is not particularly limited as long as it allows expression of the gene of interest, and may be on a plasmid or on the genome.
  • Specific methods for introducing the expression cassette or recombinant vector of the present disclosure include, for example, recombinant vector methods and genome editing methods.
  • the conditions for introducing the expression cassette or recombinant vector of the present disclosure into a host may be set appropriately depending on the type of host, etc.
  • [5] Method for producing 10-dehydroxylase of urolithins One embodiment of the method for producing the 10-dehydroxylase of urolithins disclosed herein comprises a step of culturing the transformant of the present disclosure shown above in "[4] Transformant" (culturing step). Another embodiment of the method for producing the 10-dehydroxylase of urolithins disclosed herein comprises a step of culturing the microorganism from which the enzyme is derived (i.e., a microorganism selected from the group consisting of microorganisms of the genus Enterocloster and microorganisms of the genus Clostridium shown above in "[1-1] Derivative microorganism” (culturing step).
  • the culture conditions for the transformant or derived microorganism of the present disclosure may be appropriately set taking into consideration the nutritional physiological properties of the host or derived microorganism.
  • liquid culture is used, and more preferably, agitation culture is used.
  • the environmental conditions for culture can be aerobic or anaerobic conditions before induction, and can be aerobic or anaerobic conditions after induction.
  • the temperature conditions for culture can be unchanged before and after induction, or the culture temperature can be lowered after induction than before induction.
  • Rhodococcus is preferred.
  • the environmental conditions are more preferably aerobic conditions before induction, and aerobic or anaerobic conditions after induction.
  • the culture temperature can be unchanged before and after induction, or the culture temperature can be lowered after induction than before induction.
  • the method for producing the 10-dehydroxylase of urolithins of the present disclosure may include other steps as necessary.
  • Other processes include a bacterial cell recovery process, a bacterial cell membrane permeability improvement process, a bacterial cell disruption process, a cell-free extract recovery process, a purification process, a concentration process, and/or a drying process.
  • the culture obtained by culturing is subjected to a solid-liquid separation method such as centrifugation. This allows the recovery of resting bacterial cells.
  • the permeability of the cell membrane of the recovered resting cells is improved using a surfactant such as sodium dodecyl sulfate or an organic solvent such as toluene, making the intracellular components more likely to leak. This results in a bacterial membrane permeability-improved product.
  • a surfactant such as sodium dodecyl sulfate or an organic solvent such as toluene
  • the resting bacterial cells recovered in the bacterial cell recovery process or the bacterial cell membrane permeability improvement treatment product are subjected to mechanical treatment such as ultrasonication, French press, or bead crushing, or to enzymatic treatment with a lytic enzyme such as lysozyme. This results in a disrupted bacterial cell product.
  • the bacterial cell disruption process may be performed under aerobic or anaerobic conditions.
  • the bacterial membrane permeability improvement treatment product or the disrupted bacterial cell product is subjected to solid-liquid separation such as centrifugation, and the liquid fraction is obtained as a cell-free extract (a fraction containing the 10-position dehydroxylase of urolithins).
  • the cell-free extract is subjected to gel filtration, hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, salting out, fractional precipitation, etc. to obtain a purified product with an increased degree of purity of the 10-position dehydroxylase of urolithins.
  • the purification process may be carried out under aerobic or anaerobic conditions.
  • the cell-free extract or the purified product can be subjected to vacuum concentration, membrane concentration, or the like to obtain a concentrate with an increased concentration of 10-position dehydroxylase of urolithins.
  • the product or concentrate can be subjected to a drying process such as freeze drying, vacuum drying, or spray drying to obtain a dried product (powder) of the 10-position dehydroxylase of urolithins.
  • a drying process such as freeze drying, vacuum drying, or spray drying to obtain a dried product (powder) of the 10-position dehydroxylase of urolithins.
  • excipients such as lactose, dextrin, or cornstarch can also be added.
  • the enzyme preparation of the present disclosure is an enzyme composition containing, as an active ingredient, the 10-position dehydroxylase of urolithins shown in "[1] Enzyme (10-position dehydroxylase of urolithins)" above.
  • the content of the 10-position dehydroxylase of urolithins in the enzyme preparation of the present disclosure is not particularly limited and can be set appropriately within a range in which the 10-position dehydroxylase activity of the enzyme is exerted.
  • the enzyme preparation of the present disclosure may contain other components in addition to the 10-position dehydroxylase of urolithins, as long as the 10-position dehydroxylase activity of the enzyme is exhibited.
  • other components include additives and culture residues generated by the production method described above in "(5) Method for producing 10-position dehydroxylase of urolithins.”
  • Additives can be selected appropriately depending on the formulation of the enzyme preparation, the stability of the 10-position dehydroxylase of urolithins, and other factors. Examples include excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, antiseptics, and water. Excipients include starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, and glycerol. Buffers include phosphates, citrates, and acetates. Stabilizers include propylene glycol and ascorbic acid.
  • Preservatives include benzoates (alkali metal salts such as potassium salts and sodium salts), sorbates (alkali metal salts such as potassium salts and sodium salts), phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, and methylparaben.
  • Preservatives include ethanol, benzalkonium chloride, parahydroxybenzoic acid, and chlorobutanol. These additives may be used alone or in combination.
  • Culture residues include components derived from the culture medium, contaminating proteins, bacterial components, cellular components, etc.
  • the formulation form of the enzyme preparation disclosed herein is not particularly limited, and examples include liquid and solid forms (powder, granules, etc.). Enzyme preparations in these formulation forms can be prepared using generally known methods.
  • Method for producing urolithins dehydroxylated at the 10-position includes a step of treating urolithins having a hydroxyl group at the 10-position with a urolithin-10-dehydroxylase (enzyme treatment step).
  • Enzyme Treatment Step In the enzyme treatment step, urolithins having a hydroxyl group at the 10-position are contacted with at least one of the following ⁇ 1> to ⁇ 4>:
  • ⁇ 1> a 10-position dehydroxylase of urolithins shown in the above “[1] Enzyme (10-position dehydroxylase of urolithins)”; ⁇ 2> The transformant shown in the above “[4] Transformant”, ⁇ 3> A microorganism selected from the group consisting of microorganisms of the genus Enterocloster and microorganisms of the genus Clostridium, and ⁇ 4> A treated product selected from the group consisting of resting cells, a product treated to improve cell membrane permeability, a product disrupted with cells, and a cell-free extract of the transformant described in ⁇ 2> or the microorganism described in ⁇ 3>.
  • Urolithins with a hydroxyl group at the 10-position are substrates for urolithin 10-dehydroxylases, and specific examples include urolithin E, urolithin M5, urolithin M6, and urolithin M7. Urolithins with a hydroxyl group at the 10-position may be used alone or in combination of two or more.
  • Enzyme treatment conditions can be appropriately set so that the 10-position dehydroxylation activity of urolithins can be exerted by ⁇ 1> to ⁇ 4>. These conditions can take into consideration the properties (2) (preferably, also properties (2-1) and/or (2-2)), (4), and/or (5) in the above "[1-2] Physicochemical properties.” Anaerobic conditions can be selected for the enzyme treatment conditions, and preferably anaerobic conditions containing hydrogen can be selected. Furthermore, a reducing agent can be used for the enzyme treatment conditions, and examples of such reducing agents include DTT, cysteine, ascorbic acid, and thioglycolic acid.
  • urolithins having a hydroxyl group at the 10-position When urolithins having a hydroxyl group at the 10-position are brought into contact with at least one of the above (1) to (4), they are subjected to the action of the urolithin 10-position dehydroxylase, which dehydroxylates the hydroxyl group at the 10-position. This produces urolithins dehydroxylated at the 10-position.
  • urolithin E produces urolithin M8
  • urolithin M5 produces urolithin D
  • urolithin M6 produces urolithin C and/or urolithin A
  • urolithin M7 produces urolithin A.
  • Other steps include a quantification step, an enzyme inactivation step, a purification step, a concentration step, and/or a drying step.
  • the quantification step can be carried out according to a conventional method capable of quantifying the product, urolithins dehydroxylated at the 10-position.
  • ethyl acetate optionally containing an acid such as formic acid
  • ethyl acetate is added to the reaction mixture obtained in the enzyme treatment step, followed by vigorously stirring and centrifugation to separate the ethyl acetate layer.
  • the same procedure is repeated several times as necessary, and the ethyl acetate layers are combined to obtain a urolithin extract.
  • This extract is concentrated and dried under reduced pressure using an evaporator or the like, and then dissolved in methanol.
  • the reaction mixture obtained in the enzyme treatment step is subjected to conditions that inactivate the 10-position dehydroxylase of urolithins.
  • These conditions can be selected from conditions for thermal inactivation, and specifically, can be appropriately determined taking into consideration property (5) in "[1-2] Physicochemical properties" above and the thermal properties of the product urolithins dehydroxylated at the 10-position.
  • the reaction mixture obtained in the enzyme treatment process or its enzyme-inactivated product can be subjected to processes such as sterilization by centrifugation, microfiltration (MF), ultrafiltration (UF), nanofiltration (NF), etc.; removal of solids and polymeric substances; extraction and crystallization using organic solvents or ionic liquids, etc.; chromatography such as adsorption using hydrophobic adsorbents, ion exchange resins, activated carbon columns, etc.; and decolorization.
  • the reaction mixture obtained in the enzyme treatment step, its enzyme-inactivated product, or a purified product thereof can be concentrated by vacuum concentration, membrane concentration, etc.
  • the reaction mixture obtained in the enzyme treatment process, its enzyme-inactivated product, their purified product, or their concentrate is subjected to a drying process such as freeze-drying or spray-drying to obtain a dried product (powder) of urolithins dehydroxylated at the 10-position.
  • a drying process such as freeze-drying or spray-drying to obtain a dried product (powder) of urolithins dehydroxylated at the 10-position.
  • excipients such as lactose, dextrin, or cornstarch can also be added.
  • Example 1 Confirmation of 10-position Dehydroxylation Reactivity by Enterocloster Microorganisms Modified GAM medium (manufactured by Nissui Chemical Co., Ltd.) was used as the basal medium, to which Urolithin M6 (a urolithin having a hydroxyl group at the 10-position) was added as a substrate, followed by heat sterilization.
  • DC3656 (NITE BP-02708) was inoculated into a basal medium containing the substrate at a final concentration of 50 mg/L, and cultured at 37°C for 3 days under a hydrogen atmosphere using an Anaeropack (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Inc.). After the culture was completed, 1.5 mL of DMSO (3 times the volume) was added to 0.5 mL of the culture medium for dissolution, and the urolithins were quantitatively analyzed by HPLC. HPLC was performed under the conditions described below, and urolithins manufactured by Sigma-Aldrich were dissolved in DMSO and used as standards. The quantitative results of urolithins are shown in Table 2.
  • urolithin A was produced from urolithin M6 in all microorganisms.
  • the three strains used have previously been known to dehydroxylate the hydroxyl group at position 9 of urolithins (for example, dehydroxylating urolithin C to produce urolithin A), indicating that all strains possess the activity to dehydroxylate not only position 9 of urolithins but also position 10 of urolithins.
  • Example 2 Dehydroxylation of C-10 by Enterocloster asparagiformis Using Urolithins M6 and M7 as Substrates 400 mL of sterilized GAM medium (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10 mg/L of urolithin M6 was added to a 500 mL Erlenmeyer flask. Enterocloster asparagiformis DSM 15981 strain was inoculated at 2% and then cultured with shaking at 37°C and 120 spm in an anaerobic chamber for 24 hours. The resulting culture was centrifuged (8,000 rpm, 10 minutes, 4°C), and bacterial cells were prepared as a precipitate fraction.
  • the resulting cells were suspended in 20 mM potassium phosphate buffer (KPB, pH 6.5) containing 1 mM DTT and disrupted using glass beads (0.1 mm) (2,700 rpm, 60 seconds on/60 seconds off, 6 cycles, 4°C).
  • the cell lysate was centrifuged (20,000 x g, 4°C, 60 minutes) to obtain the supernatant, which was used as a cell-free extract.
  • urolithin M6 or M7 urolithins with a hydroxyl group at the 10-position
  • 20 mM KPB (pH 6.5) containing 5 mM NADH, 2 mM methyl viologen, 0.2 mM FMN, and 1 mM DTT, and 33 mg/mL resting cells or 10% (v/v) cell-free extract were added to prepare a 500 ⁇ L reaction solution, which was then placed in a 2.0 mL tube.
  • the gas phase was the gas phase in an anaerobic chamber (COY vinyl anaerobic chamber), and the reaction was carried out at 37°C for 26 hours.
  • 50 ⁇ L of formic acid and 500 ⁇ L of DMSO were added, mixed, and centrifuged (20,000 ⁇ g, 4°C, 3 minutes). The resulting supernatant was analyzed by HPLC.
  • Enterocloster asparagiformis has previously been known to dehydroxylate the 9-hydroxyl group of urolithins.
  • urolithin M6 was used as a substrate to produce urolithin A, in which the 9- and 10-hydroxyl groups were removed.
  • urolithin M7 was used as a substrate, urolithin A, in which the 10-hydroxyl group was removed, was produced.
  • 10-dehydroxylation activity was confirmed in both urolithin M6 and urolithin M7, it can be inferred that Enterocloster asparagiformis exhibits 10-dehydroxylation activity for various urolithins.
  • Example 3 Effect of Addition of Coenzyme on 10-Dehydroxylation Reaction Using the cell-free extract prepared in Example 2, the effect of adding a coenzyme to the reaction mixture was evaluated.
  • urolithin M6 or M7 urolithins with a hydroxyl group at the 10-position
  • 20 mM KPB (pH 6.5) containing 1 mM DTT, 5 mM NADH, 5 mM NADPH, 0.2 mM FAD, 0.2 mM FMN, and/or 2 mM methyl viologen, and 10% (v/v) cell-free extract were added to prepare 500 ⁇ L of reaction solution, which was then placed in a 2.0 mL tube.
  • the gas phase was the gas phase in an anaerobic chamber (COY vinyl anaerobic chamber), and the reaction was carried out at 37°C for 26 hours.
  • 50 ⁇ L of formic acid and 500 ⁇ L of DMSO were added, mixed, and centrifuged (20,000 ⁇ g, 4°C, 3 minutes). The resulting supernatant was analyzed by HPLC.
  • the 10-dehydroxylation activity of urolithins was improved by MVCl2 , FMN, or FAD. Furthermore, the 10-dehydroxylation activity of urolithins was further improved by combining MVCl2 , FMN, or FAD with NADH, and by combining MVCl2 or FAD with NADH or NADPH.
  • Example 4 Identification of gene sequence A homology search based on the amino acid sequences of previously elucidated urolithin 9-dehydroxylase derived from Enterocloster volteae predicted a dehydroxylase gene capable of removing a hydroxyl group at position 10 that is present in Enterocloster asparagiformis DSM 15981 and Enterocloster citronniae DSM 19261 strains, which have 10-dehydroxylation activity, but is absent in Enterocloster volteae, which does not have 10-dehydroxylation activity. NCBI and GENTYX (Genetics Corporation) were used for the homology search and gene information analysis.
  • ORFs Three open reading frames (ORFs) represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 were predicted as subunits constituting the enzyme that dehydroxylates the 10th hydroxyl group of urolithins from Enterocloster asparagiformis DSM 15981. These genes were designated EaUro10OH-1, EaUro10OH-2, and EaUro10OH-3. Furthermore, three ORFs represented by SEQ ID NOs: 4 to 6 were predicted as subunits constituting the enzyme that dehydroxylates the 10th hydroxyl group of urolithins from Enterocloster citronniae DSM 19261. These genes were designated EcUro10OH-1, EcUro10OH-2, and EcUro10OH-3.
  • Example 5 Gene Synthesis The gene sequences of EaUro10OH-1, EaUro10OH-2, and EaUro10OH-3, which are presumed to be enzymes derived from Enterocloster asparagiformis DSM 15981 that dehydroxylate the hydroxyl group at position 10 of urolithins, were optimized for heterologous expression in microorganisms belonging to the genus Rhodococcus, and the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 13 to 15, respectively, were designed.
  • Example 6 Construction of transformants The prepared recombinant vector was introduced into Rhodococcus erythropolis L88 strain (Hokkaido System Science Co., Ltd.) by electroporation. Chloramphenicol was used as a selection marker. The formed colonies were cultured (28°C) in LB medium (20 ⁇ g/mL chloramphenicol), and a glycerol stock (30% glycerol) was prepared from the culture medium and stored (-80°C) for subsequent protein expression.
  • Chloramphenicol was used as a selection marker.
  • the formed colonies were cultured (28°C) in LB medium (20 ⁇ g/mL chloramphenicol), and a glycerol stock (30% glycerol) was prepared from the culture medium and stored (-80°C) for subsequent protein expression.
  • Example 7 For heterologous expression of the enzyme , 5 mL of LB medium containing 20 ⁇ g/mL chloramphenicol was added to a 10 mL test tube, and the transformant was inoculated and cultured with shaking at 28°C and 200 spm for 2-3 days. 10% of the pre-preculture solution was inoculated into a 100 mL Erlenmeyer flask containing 25 mL of LB medium containing 20 ⁇ g/mL chloramphenicol, and cultured with shaking at 28°C and 200 spm for 24 hours.
  • a 10% portion of the preculture solution was inoculated into a 500 mL Erlenmeyer flask containing 100 mL of LB medium containing 20 ⁇ g/mL chloramphenicol and 0.2 ⁇ g/mL thiostrepton, and the enzyme was induced for 24 hours at 28°C, 200 spm, and an aerobic atmosphere. Resting cells were collected by centrifugation (8,000 ⁇ g, 10 minutes, 4°C). The washed cells were suspended in 20 mM KPB (pH 6.5) containing 1 mM DTT and disrupted using glass beads (2,700 rpm, 60 seconds on/60 seconds off, 6 cycles, 4°C). The resulting disrupted cell solution was centrifuged (20,000 g, 60 minutes, 4°C), and the supernatant was used as a cell-free extract.
  • Example 8 SDS-PAGE A 12.5% polyacrylamide gel was prepared, and the enzyme fraction (cell-free extract) obtained in Example 7 was subjected to sodium dodecyl sulfate electrophoresis (SDS-PAGE) to evaluate the molecular weight. ATTO AE-1440 Ezstandard was used as a molecular weight marker.
  • Example 9 Dehydroxylation of 10-position by transformant (urolithin M6) The activity of dehydroxylating the hydroxyl group at position 10 of urolithins was measured. Urolithin M6 (a urolithin with a hydroxyl group at position 10) was used as the substrate. The enzyme activity in resting cells was measured by quantifying urolithin C, which is produced upon dehydroxylation of the hydroxyl group at position 10.
  • Example 10 Dehydroxylation of 10-position by transformants (urolithin M7, urolithin E) The 10-position dehydroxylation activity of substrates other than urolithin M6 was evaluated. Urolithin M7 and urolithin E were used as substrates, and the enzyme activity in resting cells was measured by quantifying urolithin A and urolithin M8, which were produced by dehydroxylation of the 10-position hydroxyl group, respectively.
  • Example 11 Optimal Temperature of the Enzyme The optimal temperature of the enzyme in the reaction was evaluated using the cell-free extract of the transformant obtained in Example 7. 500 ⁇ L of enzyme activity reaction solution was prepared with 20 mM KPB (potassium phosphate buffer, pH 6.5) supplemented with 1 mM DTT (dithiothreitol) so that the final concentration of the cell-free extract was 30% (v/v), 2.0 mM urolithin M7, 5.0 mM NADH, and 2.0 mM MVCl 2 (methyl viologen).
  • the gas phase was the gas phase in an anaerobic chamber (COY vinyl anaerobic chamber), and the reaction was carried out at 20°C to 55°C for 24 hours (120 spm).
  • Example 12 Optimal pH of enzyme
  • the cell-free extract of the transformant obtained in Example 7 was used to evaluate the optimal pH of the enzyme in the reaction.
  • 500 ⁇ L of enzyme activity reaction solution was prepared with a buffer solution containing 1 mM DTT (dithiothreitol) and 30% (v/v) final concentrations of cell-free extract, 2.0 mM urolithin M7, 5.0 mM NADH, and 2.0 mM MVCl 2 (methyl viologen).
  • the buffers used were 100 mM citrate buffer (pH 2.5-3.5), 100 mM acetate buffer (pH 3.5-5.5), 100 mM phosphate buffer (pH 5.5-8), 100 mM Tris buffer (pH 8-9), and 100 mM carbonate buffer (pH 9-10).
  • the gas phase was the gas phase in an anaerobic chamber (COY vinyl anaerobic chamber), and the reaction was carried out at 28°C for 24 hours (120 spm).
  • 50 ⁇ L of formic acid and 500 ⁇ L of DMSO were added and mixed, and the mixture was centrifuged (20,000 ⁇ g, 4° C., 3 minutes), and the supernatant was analyzed by HPLC.

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Abstract

本発明は、所定の位置に水酸基を有するウロリチン類の当該位置の水酸基を脱水酸化する新たな酵素を提供することを目的とする。本発明の新規酵素は、エンテロクロスター（Enterocloster）属微生物又はクロストリジウム（Clostridium）属微生物に由来し、且つ、ウロリチン類の１０位水酸基を脱水酸化する反応を触媒する活性を持つ。

Description

ウロリチン類の１０位の水酸基を脱水酸化する酵素
　本発明は、１０位水酸基を持つウロリチン類を基質として当該１０位水酸基を脱水酸化する新規酵素に関する。
　ウロリチンＡ及びウロリチンＣに代表されるウロリチン類は、ザクロ、ラズベリー、ブラックベリー、クラウドベリー、イチゴ、クルミ等に含まれるエラジタンニンに由来するエラグ酸の代謝物として知られている。エラジタンニンは摂取されると体内で加水分解され、エラグ酸に変換されることが知られている。このようなエラジタンニン及びエラグ酸は体内の腸管吸収性は非常に低いが、これらが摂取された際、ヒト結腸微生物叢によって更に代謝されることによってウロリチン類に変換されることが知られている。
　ウロリチンＡには、抗酸化作用（非特許文献１）、抗炎症作用（非特許文献２）、抗糖化作用（非特許文献３）、マイトファジー促進作用（非特許文献４）といった機能性が知られている等、ウロリチン類は機能性成分として注目を集めている。このため、ウロリチン類を有効成分として配合した、化粧品、食品、医薬品が期待されている。
　ウロリチン類を機能的成分として商業的利用することを目的として、様々な調製方法が提案されている。
　例えば、化学的手法として、２－ブロモ－５－メトキシ安息香酸を出発原料として脱メチル化によって２－ブロモ－５－ヒドロキシ安息香酸とし、レゾルシノールと反応させることによってウロリチンＡを得る方法などが報告されている（非特許文献５）。
　また、酵素学的手法として、ゴルドニバクター・ウロリチンファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物、又はエガセラ（Eggerthella）属に属する微生物を用いて、エラグ酸からウロリチンＣを産生する方法（特許文献１、２）、及びクロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）に属する微生物由来の酵素を用いて、ウロリチンＭ５、ウロリチンＭ６、ウロリチンＣ、イソウロリチンＡといった９位水酸基を有するウロリチン類から、ウロリチンＥ、ウロリチンＭ７、ウロリチンＡ、及びウロリチンＢといった、９位脱水酸化されたウロリチン類を産生する方法（特許文献３）が知られている。
国際公開第２０１４／１４７２８０号 国際公開第２０１８／１５５４８５号 国際公開第２０２２／０４５２５７号
Biosci. Biotechnol. Biochem. 76, 395-399 (2012) J. Agric. Food Chem. 60, 8866-8876 (2012) Mol. Nutr. Food Res. 55, S35-S43 (2011) Nature Medicine volume 22, pages879-888 (2016) J. Agric. Food Chem., 56, 393-400 (2008)
　ウロリチン類の調製方法としては、食品等への応用を考慮すると、酵素学的手法によるものが望ましい。一方、ウロリチン類には、水酸基の置換位置及び置換数が異なる様々な種類の化合物があるため、これまで知られている酵素学的手法では、酵素の特異により所望のウロリチン類を得るための基質が制限されたり、酵素自体の比活性により生成効率が制限されたりすることが考えられる。従って、ウロリチン類を生成可能な新たな酵素が求められる。
　そこで、本開示は、所定の位置に水酸基を有するウロリチン類の当該位置の水酸基を脱水酸化する新たな酵素を提供することを目的とする。
　本発明者は、鋭意検討の結果、偶然にも、１０位水酸基を持つウロリチン類を基質として当該１０位水酸基を脱水酸化する新規酵素を見出した。本開示は、この知見に基づいて完成されたものである。
　即ち、本開示は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　エンテロクロスター（Enterocloster）属微生物又はクロストリジウム（Clostridium）属微生物に由来し、且つ、下記（１）の性質を有する酵素：
（１）ウロリチン類の１０位水酸基を脱水酸化する反応を触媒する活性を持つ。
項２．　さらに下記（２）の性質を有する、項１に記載の酵素：
（２）メチルビオロゲン（ＭＶＣｌ2）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）からなる群より選択される補酵素によって前記活性が向上する。
項３．　さらに下記（２－１）の性質を有する、項２に記載の酵素：
　（２－１）前記補酵素に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を組み合わせることで、前記活性がさらに向上する。
項４．　さらに下記（２－２）の性質を有する、項２に記載の酵素：
　（２－２）前記補酵素がＦＡＤ及び／又はＭＶＣｌ2である場合、前記補酵素に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及び／又はニコンチアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を組み合わせることで、前記活性がさらに向上する。
項５．　さらに下記（３）、（４）及び（５）の性質を有する、項１～４のいずれかに記載の酵素：
（３）ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果において、相対分子質量として７５，０００～９６，０００を示すバンドが含まれる；
（４）作用ｐＨが５．５以上７．５以下である；
（５）至適温度が２０℃以上３７℃以下である。
項６．　エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）、エンテロクロスター・シトロニアエ（Enterocloster citroniae）、又はクロストリジウム・エスピー（Clostridium sp. C2A）に由来する酵素である、項１～５のいずれかに記載の酵素。
項７．　下記（Ａ１－i）～（Ａ１－iii）のいずれかに示すポリペプチド、下記（Ａ２－i）～（Ａ２－iii）のいずれかに示すポリペプチド、及び／又は下記（Ａ３－i）～（Ａ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドを含む、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素：
（Ａ１－i）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ１－ii）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ１－iii）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ２－i）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ２－ii）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ２－iii）配列番号２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ３－i）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ３－ii）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ３－iii）配列番号３に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
項８．　前記（Ａ１－i）～（Ａ１－iii）のいずれかに示すポリペプチド、前記（Ａ２－i）～（Ａ２－iii）のいずれかに示すポリペプチド、及び前記（Ａ３－i）～（Ａ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドを含む、項７に記載のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素。
項９．　下記（Ｂ１－i）～（Ｂ１－iii）のいずれかに示すポリペプチド、下記（Ｂ２－i）～（Ｂ２－iii）のいずれかに示すポリペプチド、及び／又は下記（Ｂ３－i）～（Ｂ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドを含む、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素：
（Ｂ１－i）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ１－ii）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ１－iii）配列番号４に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ２－i）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ２－ii）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ２－iii）配列番号５に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ３－i）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ３－ii）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ３－iii）配列番号６に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
項１０．　前記（Ｂ１－i）～（Ｂ１－iii）のいずれかに示すポリペプチド、前記（Ｂ２－i）～（Ｂ２－iii）のいずれかに示すポリペプチド、及び前記（Ｂ３－i）～（Ｂ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドを含む、項９に記載のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素。
項１１．　項７～１０のいずれかに記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。
項１２．　項１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット又は組換えベクター。
項１３．　項１１に記載のポリヌクレオチドを発現可能に保持した、又は、項１２に記載の発現カセット又は組換えベクターを発現可能に保持した、形質転換体。
項１４．　項１３に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の製造方法。
項１５．　エンテロクロスター（Enterocloster）属微生物及びクロストリジウム（Clostridium）属微生物からなる群より選択される微生物を培養する工程を含む、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の製造方法。
項１６．　前記微生物が、エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）、エンテロクロスター・シトロニアエ（Enterocloster citroniae）、及びクロストリジウム・エスピー（Clostridium sp. C2A）からなる群より選択される、項１５に記載の製造方法。
項１７．　１０位水酸基を持つウロリチン類に、下記<１>～<４>の少なくともいずれかを接触させる工程を含む、１０位が脱水酸化されたウロリチン類の製造方法：
　　<１>項１～１０のいずれかに記載の酵素、
　　<２>項１３に記載の形質転換体、
　　<３>エンテロクロスター（Enterocloster）属微生物及びクロストリジウム（Clostridium）属微生物からなる群より選択される微生物、及び
　　<４>前記<２>に記載の形質転換体又は前記<３>に記載の微生物の、休止菌体、菌体膜透過性向上処理物、菌体破砕処理物、及び無細胞抽出物からなる群より選択される処理物。
項１８．　前記微生物が、エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）、エンテロクロスター・シトロニアエ（Enterocloster citroniae）、及びクロストリジウム・エスピー（Clostridium sp. C2A）からなる群より選択される、項１７に記載の製造方法。
項１９．　前記１０位水酸基を持つウロリチン類が、ウロリチンＭ５、ウロリチンＭ６、ウロリチンＭ７、及びウロリチンＥからなる群より選択される、項１７又は１８に記載の製造方法。
　本開示によれば、ウロリチン類の１０位水酸基を脱水酸化する反応を触媒する活性を持つ酵素が提供される。
エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）の休止菌体又は無細胞抽出液を用い、ウロリチンＭ６、Ｍ７の１０位脱水酸化反応によりウロリチンＡを生成した結果を示す。 エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）の無細胞抽出液の、補酵素の添加による１０位脱水酸化反応への影響を示す。 エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）由来のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素をコードするＤＮＡを異種発現させた形質転換体から取得された無細胞抽出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。 エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）由来のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素をコードするＤＮＡを異種発現させた形質転換体の休止菌体を用い、ウロリチンＭ６の１０位脱水酸化反応によりウロリチンＣを生成した結果を示す。 エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）由来のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素をコードするＤＮＡを異種発現させた形質転換体が産生した１０位脱水酸化酵素の、温度と酵素活性との関係を示す。 エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（aaEnterocloster asparagiformis）由来のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素をコードするＤＮＡを異種発現させた形質転換体が産生した１０位脱水酸化酵素の、ｐＨと酵素活性との関係を示す。
　本開示において、ウロリチン類は、下記一般式［I］で表される化合物である。
［１］酵素（ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素）
　本開示の酵素は、ウロリチン類の１０位を脱水酸化する反応を触媒する活性を持つ酵素である。本開示の酵素は、第一のサブユニット、第二のサブユニット、及び／又は第三のサブユニットで構成される。
［１－１］由来微生物
　本開示の一実施形態の酵素は、エンテロクロスター（Enterocloster）属微生物又はクロストリジウム（Clostridium）属微生物に由来する。
　本開示の酵素の由来微生物のうち、エンテロクロスター（Enterocloster）属微生物としては、好ましくはエンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）、エンテロクロスター・シトロニアエ（Enterocloster citroniae）が挙げられる。エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）としては、好ましくはＤＳＭ　１５９８１株、及び当該寄託菌株と実質的に同等の菌株が挙げられる。エンテロクロスター・シトロニアエ（Enterocloster citroniae）としては、好ましくはＤＳＭ　１９２６１株、及び当該寄託菌株と実質的に同等の菌株が挙げられる。
　本開示の酵素の由来微生物のうち、クロストリジウム（Clostridium）属微生物としては、好ましくはクロストリジウム・エスピー（Clostridium sp. C2A）が挙げられる。クロストリジウム・エスピー（Clostridium sp. C2A）としては、好ましくはクロストリジウム・エスピーＤＣ３６５６（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７０８）株、及び当該寄託菌株と実質的に同等の菌株が挙げられる。
　本開示において、実質的に同等の菌株とは、同種の微生物であって、その１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の、対象の寄託菌株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に対する相同性が、９８％以上（好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％）である菌株であって、本開示の酵素（ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素）を発現することができるものを指す。
　本開示において、ＤＳＭから始まる番号は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）に保存されている微生物に付与された寄託番号である。ＮＩＴＥ　ＢＰ－から始まる番号は、ＮＩＴＥ（独立行政法人製品評価技術基盤機構）に国際寄託された場合に付与された寄託記号である。
［１－２］理化学的性質
　本開示の酵素の一実施形態は、以下の（１）の性質を有する。
（１）ウロリチン類の１０位水酸基を脱水酸化する反応を触媒する活性を持つ。
　上記（１）の性質は、１０位水酸基を持つウロリチン類（一般式［I］のＲ10が－ＯＨである化合物）を基質とし、１０位で脱水酸化したウロリチン類（一般式［I］のＲ10が－Ｈである化合物）を生成するものである。例えば、ウロリチンＥ、ウロリチンМ５、ウロリチンМ６、又はウロリチンＭ７を基質とした場合、それぞれから、ウロリチンМ８、ウロリチンＤ、ウロリチンＣ、又はウロリチンＡを生成する。
　本開示の酵素は、好ましい実施形態において、以下の（２）の性質を有する。
（２）メチルビオロゲン（ＭＶＣｌ2）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）からなる群より選択される補酵素によって、前記活性が向上する。
　これらの補酵素の中でもＭＶＣｌ2は、前記活性の向上効果を高める観点で好ましい補酵素である。
　上記（２）の性質は、好ましくは以下の（２－１）及び／又は（２－２）の性質を併せ備える。
　（２－１）前記補酵素に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を組み合わせることで、前記活性がさらに向上する。
　（２－２）前記補酵素がＦＡＤ及び／又はＭＶＣｌ2である場合、前記補酵素に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及び／又はニコンチアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を組み合わせることで、前記活性がさらに向上する。
　本開示の酵素は、好ましい実施形態において、以下の（３）、（４）及び（５）の性質を有する。
（３）ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果において、相対分子質量として７５，０００～９６，０００を示すバンドが含まれる；
（４）作用ｐＨが５．５以上７．５以下である；
（５）至適温度が２０℃以上３７℃以下である。
　上記（３）の性質において、相対分子質量７５，０００～９６，０００を示すバンドは、第一のサブユニット及び／又は第三のサブユニットに対応する。上記（３）の性質において、好ましくは、相対分子質量７５，０００～９６，０００を示すバンドが、当該相対分子質量の範囲に２個存在し、具体的には、第一のサブユニットに対応するバンドとして、相対分子質量７５０００～９１７００、好ましくは７８９００～８７５００、より好ましくは８１７００～８４０００のバンドと、第三のサブユニットに対応するバンドとして、相対分子質量７８３００～９６０００、好ましくは８２７００～９１４００、より好ましくは８６０００～８８８００のバンドとが存在する。
　本開示の酵素は、好ましい実施形態において、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果において、相対分子質量として１００００～３００００を示すバンドがさらに含まれてもよい。相対分子質量１００００～３００００を示すバンドは、第二のサブユニットに対応し、好ましくは、相対分子質量１３０００～２５０００、より好ましくは１５０００～２００００のバンドが挙げられる。
　上記（４）の性質（作用ｐＨが５．５以上７．５以下）は、好ましくは、さらに至適ｐＨが６．４以上６．６以下、好ましくは６．５である性質を併せ備える。なお、至適ｐＨは、最大活性を１００とする相対活性値として７０以上（好ましくは８０以上、より好ましくは９０以上）を示すｐＨをいう。
　上記（５）の性質（至適温度が２０℃以上３７℃以下）は、好ましくは、至適温度が２０℃以上３０℃以下、より好ましくは２０℃以上２８℃以下である。なお、至適温度は、最大活性を１００とする相対活性値として７０以上（好ましくは８０以上、より好ましくは９０以上）を示す温度をいう。
［１－３］アミノ酸配列
　本開示の酵素の一実施形態は、下記（Ａ１－i）～（Ａ１－iii）のいずれかに示すポリペプチド、下記（Ａ２－i）～（Ａ２－iii）のいずれかに示すポリペプチド、及び／又は下記（Ａ３－i）～（Ａ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドを含む、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素である。
（Ａ１－i）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ１－ii）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ１－iii）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ２－i）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ２－ii）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ２－iii）配列番号２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ３－i）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ３－ii）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ａ３－iii）配列番号３に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　本開示の酵素の好ましい実施形態は、（Ａ１－i）～（Ａ１－iii）のいずれかに示すポリペプチドと、（Ａ２－i）～（Ａ２－iii）のいずれかに示すポリペプチドと、（Ａ３－i）～（Ａ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドとの組み合わせを含む。
　配列番号１、２及び３は、それぞれ、エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）ＤＳＭ　１５９８１株の、第一サブユニット（EaUro10OH-1）、第二サブユニット（EaUro10OH-2）、及び第三サブユニット（EaUro10OH-3）のアミノ酸配列に相当する。
　本開示の酵素の一実施形態は、下記（Ｂ１－i）～（Ｂ１－iii）のいずれかに示すポリペプチド、下記（Ｂ２－i）～（Ｂ２－iii）のいずれかに示すポリペプチド、及び／又は下記（Ｂ３－i）～（Ｂ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドを含む、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素である。
（Ｂ１－i）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ１－ii）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ１－iii）配列番号４に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ２－i）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ２－ii）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ２－iii）配列番号５に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ３－i）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ３－ii）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ３－iii）配列番号６に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　本開示の酵素の好ましい実施形態は、（Ｂ１－i）～（Ｂ１－iii）のいずれかに示すポリペプチドと、（Ｂ２－i）～（Ｂ２－iii）のいずれかに示すポリペプチドと、（Ｂ３－i）～（Ｂ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドとの組み合わせを含む。
　配列番号４、５及び６は、それぞれ、エンテロクロスター・シトロニアエ（Enterocloster citroniae）DSM 19261株の、第一サブユニット（EcUro10OH-1）、第二サブユニット（EcUro10OH-2）、及び第三サブユニット（EcUro10OH-3）のアミノ酸配列に相当する。
　上記ポリペプチドのうち、「－ii」及び「－iii」の枝番号が付されたポリペプチドは、「－i」の枝番号が付されたポリペプチドのアミノ酸配列を基本骨格とする配列類似のポリペプチドである。
　上記「－ii」の枝番号が付されたポリペプチドに導入されるアミノ酸の改変については、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいてもよい。（Ａ１－ii）（Ｂ１－ii）のポリペプチドにおいて、置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１～１６０個、好ましくは１～８０個、より好ましくは１～４０個、さらに好ましくは１～２５個、一層好ましくは１～１６個、特に好ましくは１～８個、１～４個、１～３個、又は１～２個が挙げられる。（Ａ２－ii）（Ｂ２－ii）のポリペプチドにおいて、置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１～３５個、好ましくは１～１７個、より好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～５個、一層好ましくは１～３個、特に好ましくは１～２個が挙げられる。（Ａ３－ii）（Ｂ３－ii）のポリペプチドにおいて、置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１～１５０個、好ましくは１～７５個、より好ましくは１～３７個、さらに好ましくは１～２２個、一層好ましくは１～１５個、特に好ましくは１～７個、１～３個、又は１～２個が挙げられる。
　上記「－iii」の枝番号が付されたポリペプチドにおいて、配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、一層好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上、９９．５％以上が挙げられる。
　ここで、上記「－iii」の枝番号が付されたポリペプチドにおいて、配列番号１～６に示すアミノ酸配列それぞれに対する配列同一性とは、配列番号１～６に示すアミノ酸配列それぞれと比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ　ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２　ｂｉｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ　ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　上記「－ii」及び「－iii」の枝番号が付されたポリペプチドにアミノ酸置換が導入される場合、アミノ酸置換の態様として、保存的置換が挙げられる。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で；置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で；極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で；塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で；酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で；ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間で互いに置換することを指す。保存的置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換；ArgからGln、His又はLysへの置換；AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換；AspからAsn、Glu又はGlnへの置換；CysからSer又はAlaへの置換；GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換；GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換；GlyからProへの置換；HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換；LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換；MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換；PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換；SerからThr又はAlaへの置換；ThrからSer又はAlaへの置換；TrpからPhe又はTyrへの置換；TyrからHis、Phe又はTrpへの置換；及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
　上記「－ii」及び「－iii」の枝番号が付されたポリペプチドには、変異処理及び遺伝子組換えなどの人為的に変異させて得られるポリペプチドのみならず、ポリペプチドが由来する生物の個体差又は種の違いに基づく、天然に生じる変異によって生じるミュータント又はバリアントのポリペプチドも含まれる。
［２］ポリヌクレオチド
　本開示のポリヌクレオチドは、上記「［１－３］アミノ酸配列」に示したウロリチン類の１０位脱水酸化酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本開示のポリヌクレオチドは、当業者であれば、上記「［１－３］アミノ酸配列」に示したウロリチン類の１０位脱水酸化酵素のアミノ酸配列に従って適宜配列を設計し、調製できる。
［２－１］塩基配列
　本開示のポリヌクレオチドには、コドンの縮重に由来する多種のポリヌクレオチドが包含される。また、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列は、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましい。
　本開示のポリヌクレオチドの一実施形態は、下記（ａ１－i）又は（ａ１－ii）に示すＤＮＡ、下記（ａ２－i）又は（ａ２－ii）に示すＤＮＡ、並びに／若しくは下記（ａ３－i）又は（ａ３－ii）に示すＤＮＡを含む、ポリヌクレオチドである。
（ａ１－i）配列番号７又は１３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ａ１－ii）配列番号７又は１３に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウロリチン類の１０位脱水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ａ２－i）配列番号８又は１４に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ａ２－ii）配列番号８又は１４に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウロリチン類の１０位脱水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ａ３－i）配列番号９又は１５に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ａ３－ii）配列番号９又は１５に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウロリチン類の１０位脱水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　本開示のポリヌクレオチドの好ましい実施形態は、（ａ１－i）又は（ａ１－ii）に示すＤＮＡと、（ａ２－i）又は（ａ２－ii）に示すＤＮＡと、（ａ３－i）又は（ａ３－ii）に示すＤＮＡとの組み合わせを含む。
　配列番号７、１３に示す塩基配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１３に示す塩基配列は、コドン利用頻度をロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物に最適化したものである。配列番号８、１４に示す塩基配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１４に示す塩基配列は、コドン利用頻度をロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物に最適化したものである。配列番号９、１５に示す塩基配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１５に示す塩基配列は、コドン利用頻度をロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物に最適化したものである。
　本開示のポリヌクレオチドの一実施形態は、下記（ｂ１－i）又は（ｂ１－ii）に示すＤＮＡ、下記（ｂ２－i）又は（ｂ２－ii）に示すＤＮＡ、並びに／若しくは下記（ｂ３－i）又は（ｂ３－ii）に示すＤＮＡを含む、ポリヌクレオチドである。
（ｂ１－i）配列番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ１－ii）配列番号１０に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウロリチン類の１０位脱水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ２－i）配列番号１１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ２－ii）配列番号１１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウロリチン類の１０位脱水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ３－i）配列番号１２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ３－ii）配列番号１２に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウロリチン類の１０位脱水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　本開示のポリヌクレオチドの好ましい実施形態は、（ｂ１－i）又は（ｂ１－ii）に示すＤＮＡと、（ｂ２－i）又は（ｂ２－ii）に示すＤＮＡと、（ｂ３－i）又は（ｂ３－ii）に示すＤＮＡとの組み合わせを含む。
　配列番号１０に示す塩基配列は、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするものである。配列番号１１に示す塩基配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列をコードするものである。配列番号１２に示す塩基配列は、配列番号６に示すアミノ酸配列をコードするものである。
　上記ポリヌクレオチドのうち、「－ii」の枝番号が付されたＤＮＡにおいて、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
　ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリ又はｃＤＮＡライブラリを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
［２－２］ポリヌクレオチドの調製
　本開示のポリヌクレオチドを調製する方法として、以下に示すハイブリダイゼーションに基づく方法が挙げられる。
　まず、適当な遺伝子源から得たＤＮＡを定法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してＤＮＡライブラリを作製する。このライブラリを適当な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜にうつしとり、変性処理の後にＤＮＡを膜に固定する。この膜をあらかじめ32Ｐ等で標識したプローブを含む上記の組成の溶液中、上記のストリンジェントな条件で保温し、ハイブリダイゼーションを行う。プローブとしては、前記（ａ１－i）～（ａ１－ii）、（ａ２－i）～（ａ２－ii）、（ａ３－i）～（ａ－ii）、（ｂ１－i）～（ｂ１－ii）、（ｂ２－i）～（ｂ２－ii）、（ｂ３－i）～（ｂ３－ii）のＤＮＡ又はその一部を使用することができる。
　ハイブリダイゼーションの終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィ等によりプローブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成クローンが単離できるまで繰り返す。最後に、得られたクローンの中から、目的の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択する。遺伝子の単離は、アルカリ法等の公知のポリヌクレオチド抽出法により実施できる。
　本開示のポリヌクレオチドは、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の由来微生物（産生菌）であるエンテロクロスター（Enterocloster）属微生物又はクロストリジウム（Clostridium）属微生物から単離することもできる。例えば、由来微生物由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、既知のアミノ酸配列情報から遺伝子の縮重を考慮して設計したプライマー若しくはプローブ又は既知の塩基配列情報に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーション法により、当該微生物のゲノムから目的のＤＮＡを単離することができる。
　本開示のポリヌクレオチドには、コドンの縮重に由来する多種のポリヌクレオチドが包含される。同じアミノ酸配列をコードする多種のポリヌクレオチドを人為的に作製することは、公知の遺伝子工学的手法を用いて容易に行うことができる。例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドン利用頻度を宿主に最適化することにより、目的タンパク質の高発現を図ることができる。
　遺伝子に変異を導入し、人為的にアミノ酸配列を改変する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法、及び部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入キット、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＡｒｔＴＭ  Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＰＬＵＳ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ，Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
　ポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、慣用の方法を用いて配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なシークエンサーを利用して配列を解析することができる。
　得られたポリヌクレオチドが目的のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドであるかどうかの確認は、決定された塩基配列を、塩基配列（ａ１－i）、（ａ１－ii）、（ａ２－i）、（ａ２－ii）、（ａ３－i）、（ａ３－ii）、（ｂ１－i）、（ｂ１－ii）、（ｂ２－i）、（ｂ２－ii）、（ｂ３－i）、（ｂ３－ii）と比較して行うことができる。あるいは決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を、アミノ酸配列（Ａ１－i）～（Ａ１－iii）、（Ａ２－i）～（Ａ２－iii）、（Ａ３－i）～（Ａ３－iii）、（Ｂ１－i）～（Ｂ１－iii）、（Ｂ２－i）～（Ｂ２－iii）、（Ｂ３－i）～（Ｂ３－iii）と比較して行うことができる。
［３］発現カセット又は組換えベクター
　本開示の発現カセット又は組換えベクターは、上記「［２］ポリヌクレオチド」に示した本開示のポリヌクレオチドを含む。
　本開示の発現カセット又は組換えベクターは、本開示のポリヌクレオチドにプロモーター及びターミネーターを連結することにより、若しくは、発現ベクターに本開示の発現カセット又は本開示のポリヌクレオチドを挿入することにより得ることができる。
　本開示の発現カセット又は組換えベクターには、制御因子として、プロモーター及びターミネーターの他、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。これらの制御因子は、本開示のポリヌクレオチドに作動可能に連結されていればよい。作動可能に連結とは、本開示のポリヌクレオチドを調節する種々の制御因子と本開示のポリヌクレオチドが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
　発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、宿主細胞との適切な組み合わせを当業者が適宜選択して用いることができる。例えば、微生物を宿主とする場合は、乳酸菌を宿主とする場合に用いられる、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. Cremoris）－ベクターpNZ8148（モビテック（MoBiTech）社）、ラクトコッカス・ラクティス－pGKV11（Appl. Environ. Microbiol., 50, 540-542 (1985)）、ラクトコッカス・ラクティス／ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）／ストレプトコッカス・フェーカリス（Streptococcus faecalis）等－pBE194（特開平6-253861）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Lactococcus lactis subsp.lactis）／ラクトバチルス・デルブリッキー（Lactobacillus delbrueckii）等－pSYE1（特開平5－176776）等；ビフィズス菌に用いられる、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）－pKKT427（Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 1 e3 doi:10.1093/nar/gkn884）、ビフィドバクテリウム・ロンガムなど幅広いビフィズス菌－pNC7（Res. Microbiol., 147, 133-143 (1996)）、ビフィドバクテリウム・ロンガム－pBS423（Appl. Environ. Microbiol., 78, 4984-4994 (2012)）等；クロストリジウム（Clostridium）菌に用いられる、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）－pTY10（Agric. Biol. Chem., 54 (2), 437-441 (1990)）／pMTL500E (Microbiol. Sci. 5:310-315 (1988))、ACE vector (Anaerobe, 41, 104-112 (2016)) 等；ロドコッカス（Rhodococcus）菌に用いられる、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）－pTip, pNit, pCpi Vector シリーズ（北海道システム・サイエンス、Biotechnol. Bioeng., 86, 136-148 (2004)）等が挙げられる。また、微生物の他、昆虫、植物、動物を宿主とする場合も、様々な宿主用に開発されているベクターを用いることができる。
［４］形質転換体
　本開示の形質転換体は、上記「［３］発現カセット又は組換えベクター」に示した本開示の発現カセット又は組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって得られるものである。
　形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能であり、且つ自律増殖可能で本開示のポリヌクレオチドに係る遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、乳酸菌、ビフィズス菌、クロストリジウム菌、ロドコッカス菌等の微生物、昆虫、植物、動物等が挙げられる。
　形質転換体の製造に使用される宿主としては、本開示のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の由来微生物であってもよい。
　本発明の形質転換体の作製においては、宿主に本開示の発現カセット又は組換えベクターを導入する。本開示のポリヌクレオチドを導入する場所は、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本開示の発現カセット又は本開示の組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。宿主に本開示の発現カセット又は組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。
［５］ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の製造方法
　本開示のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の製造方法の一実施形態は、上記「［４］形質転換体」に示した本開示の形質転換体を培養する工程（培養工程）を含む。また、本開示のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の製造方法の別の一実施形態は、当該酵素の由来微生物（つまり、上記「［１－１］由来微生物」に示したエンテロクロスター（Enterocloster）属微生物及びクロストリジウム（Clostridium）属微生物からなる群より選択される微生物）を培養する工程（培養工程）を含む。
［５－１］培養工程
　本開示の形質転換体又は由来微生物の培養条件は、宿主若しくは由来微生物の栄養生理学的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられ、より好ましくは攪拌培養が挙げられる。
　また、培養の環境条件については、誘導前においては好気又は嫌気条件、誘導後においても好気又は嫌気条件が挙げられる。培養の温度条件については、誘導前後で不変であってもよいし、誘導後において、誘導前よりも培養温度を下げてもよい。これら環境条件および温度条件が適用される宿主については特に限定されないが、好ましくはロドコッカス菌が挙げられる。ロドコッカスを宿主として用いる場合の当該環境条件は、誘導前においては好気条件、誘導後においては好気又は嫌気条件がより好ましい。ロドコッカスを宿主として用いる場合の培養の温度については、誘導前後で不変であってもよいし、誘導後において誘導前よりも培養温度を下げてもよい。
［５－２］他の工程
　本開示のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の製造方法は、必要に応じて、他の工程を含むことができる。
　他の工程としては、菌体回収工程、菌体膜透過性向上処理工程、菌体破砕処理工程、無細胞抽出物回収工程、精製工程、濃縮工程、及び／又は乾燥工程が挙げられる。
　菌体回収工程においては、例えば、培養により得られた培養物を遠心分離等の固液分離法に供する。これにより、休止菌体を回収できる。
　菌体膜透過性向上処理工程においては、例えば、回収した休止菌体を、ドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤、又はトルエン等の有機溶媒により、細胞膜の透過性を向上させ、菌体内成分を易漏出状態とする。これにより、菌体膜透過性向上処理物が得られる。
　菌体破砕処理工程においては、例えば、菌体回収工程で回収された休止菌体、又は菌体膜透過性向上処理物を、超音波、フレンチプレス、ビーズ破砕等の機械的処理；リゾチーム等の溶菌酵素による酵素処理に供する。これにより、菌体破砕処理物が得られる。菌体破砕処理工程は、好気条件で行ってもよいし、嫌気条件で行ってもよい。
　無細胞抽出物回収工程においては、上記菌体膜透過性向上処理物又は上記菌体破砕処理物を、遠心分離等の固液分離法に供し、液体画分を、無細胞抽出物（ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素を含む画分）として得られる。
　精製工程においては、例えば上記無細胞抽出物を、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、塩析、分別沈殿等に供し、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の精製度が高められた精製物が得られる。精製工程は、好気条件で行ってもよいし、嫌気条件で行ってもよい。
　濃縮工程においては、例えば上記無細胞抽出物又は上記精製物を、減圧濃縮、膜濃縮、等に供することで、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の濃度が高められた濃縮物が得られる。
　乾燥工程においては、例えば上記生成物又は上記濃縮物を、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等の乾燥処理に供することで、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の乾燥物（粉末）が得られる。乾燥処理においては、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
［６］酵素製剤
　本開示の酵素製剤は、上記「［１］酵素（ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素）」に示すウロリチン類の１０位脱水酸化酵素を有効成分として含む酵素組成物である。
　本開示の酵素製剤におけるウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の含有量としては特に限定されず、当該酵素の１０位脱水酸化酵素活性が発揮される範囲で適宜設定することができる。
　本開示の酵素剤は、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素以外に、当該酵素の１０位脱水酸化酵素活性が発揮される限りにおいて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、添加剤、上記「［５］ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の製造方法」に示す製造方法で生じた培養残渣等が挙げられる。
　添加剤としては、酵素剤の製剤形態、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の安定性等に応じて適宜決定することができるが、例えば、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、水等が挙げられる。賦形剤としては、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ－グルコース、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖、グリセロール等が挙げられる。緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等が挙げられる。安定化剤としては、プロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。保存剤としては、安息香酸塩（カリウム塩、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩）、ソルビン酸塩（カリウム塩、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩）、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等が挙げられる。防腐剤としては、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等が挙げられる。これらの添加剤は、１種を単独で含んでもよいし、複数種の組み合わせで含んでもよい。
　培養残渣としては、培地由来の成分、夾雑タンパク質、菌体成分、細胞成分等が挙げられる。
　本開示の酵素製剤の製剤形態としては特に限定されず、例えば、液状、固形状（粉末、顆粒等）等が挙げられる。これらの製剤形態の酵素剤は、一般的に公知の方法で調製することができる。
［７］１０位が脱水酸化されたウロリチン類の製造方法
　本開示の１０位が脱水酸化されたウロリチン類の製造方法は、１０位水酸基を持つウロリチン類に、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素を作用させる工程（酵素処理工程）を含む。
［７－１］酵素処理工程
　酵素処理工程では、１０位水酸基を持つウロリチン類に、下記<１>～<４>の少なくともいずれかを接触させる。
　　<１>上記「［１］酵素（ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素）」に示すウロリチン類の１０位脱水酸化酵素、
　　<２>上記「［４］形質転換体」に示す形質転換体、
　　<３>エンテロクロスター（Enterocloster）属微生物及びクロストリジウム（Clostridium）属微生物からなる群より選択される微生物、及び
　　<４>前記<２>に記載の形質転換体又は前記<３>に記載の微生物の、休止菌体、菌体膜透過性向上処理物、菌体破砕処理物、及び無細胞抽出物からなる群より選択される処理物。
　１０位水酸基を持つウロリチン類は、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の基質であり、その具体例としては、ウロリチンＥ、ウロリチンＭ５、ウロリチンＭ６、ウロリチンＭ７等が挙げられる。１０位水酸基を持つウロリチン類は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　上記<１>の詳細については、上記「［１］酵素（ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素）」に示した通りであり、また、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素は、上記「［６］酵素製剤」に示す酵素製剤の形態で用いてもよいし、不溶性担体に固定化された形態（固定化酵素の形態）で用いてもよい。
　上記<２>の詳細については、上記「［４］形質転換体」に示した通りである。
　上記<３>の詳細については、上記「［１－１］由来微生物」に示した通りである。
　上記<４>の詳細については、上記「［５－２］他の工程」に示した通りである。
　酵素処理条件については、<１>～<４>によるウロリチン類の１０位脱水酸化酵素活性を発揮できる条件を、適宜設定することができる。当該条件については、上記「［１－２］理化学的性質」の（２）の性質（好ましくは、さらに（２－１）の性質及び／又は（２－２）の性質）、（４）の性質、及び／又は（５）の性質を勘案することができる。酵素処理条件において、嫌気条件を選択でき、好ましくは水素を含む嫌気条件を選択できる。また、酵素処理条件において、還元剤を用いることができ、当該還元剤としては、ＤＴＴ、システイン、アスコルビン酸、チオグリコール酸等が挙げられる。
　１０位水酸基を持つウロリチン類は、上記（１）～（４）の少なくともいずれかと接触させられることにより、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の作用を受け、１０位水酸基が脱水酸化される。これにより、１０位が脱水酸化されたウロリチン類が生成する。
　具体的には、ウロリチンＥからはウロリチンМ８、ウロリチンＭ５からはウロリチンＤ、ウロリチンＭ６からはウロリチンＣ及び／又はウロリチンＡ、ウロリチンＭ７からはウロリチンＡが生成する。
［７－２］他の工程
　本開示の１０位が脱水酸化されたウロリチン類の製造方法は、必要に応じて、他の工程を含むことができる。
　他の工程としては、定量工程、酵素失活工程、精製工程、濃縮工程、及び／又は乾燥工程が挙げられる。
　定量工程においては、生成物である１０位が脱水酸化されたウロリチン類を定量可能な常法に従うことができる。例えば、酵素処理工程で得られる反応混合物に、必要に応じてギ酸などの酸を添加した酢酸エチルを加えて、激しく撹拌した後に遠心し、酢酸エチル層を取り出す。必要に応じて同様の操作を数回行い、それら酢酸エチル層を合わせてウロリチン類抽出液を得る。この抽出液をエバポレーターなどを用いて減圧下に濃縮、乾固し、メタノールに溶解させる。これをポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜などの膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィーを用いて定量する。高速液体クロマトグラフィーの条件としては、例えば以下が挙げられるが、これに限定されない。
［高速液体クロマトグラフィー条件］
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３（２５０×４．６ｍｍ）（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
溶離液：水／アセトニトリル／酢酸＝７４／２５／１
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ（３０５ｎｍ）
　酵素失活工程においては、酵素処理工程で得られる反応混合物を、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素を失活させる条件に供する。当該条件については、熱失活のための条件を選択することができ、具体的には、上記「［１－２］理化学的性質」の性質（５）と、生成物である１０位が脱水酸化されたウロリチン類の熱特性とを勘案し、適宜決定することができる。
　精製工程においては、例えば、酵素処理工程で得られる反応混合物又はその酵素失活物を、遠心分離、精密濾過（ＭＦ）、限外濾過（ＵＦ）、ナノ濾過（ＮＦ）などによる除菌；固形物、高分子物質の除去；有機溶媒又はイオン性液体などによる抽出及び晶析；疎水性吸着剤、イオン交換樹脂、活性炭カラム等を用いた吸着等のクロマトグラフィー、脱色等の処理に供することができる。
　濃縮工程においては、酵素処理工程で得られる反応混合物、その酵素失活物、又はそれらの精製物を、減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮に供することができる。
　乾燥工程においては、酵素処理工程で得られる反応混合物、その酵素失活物、それらの精製物、又はそれらの濃縮物を凍結乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理に供し、１０位が脱水酸化されたウロリチン類の乾燥物（粉末）が得られる。乾燥処理においては、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
　本明細書に開示された各々の態様は、本明細書に開示された他のいかなる特徴とも組み合わせることができる。
　以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本開示は、実施形態によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。
［実施例１］エンテロクロスター属微生物による１０位脱水酸化反応性の確認
　変法ＧＡＭ培地（日水社製）を基本培地とし、基質としてウロリチンＭ６（１０位水酸基を有するウロリチン類）を添加した後、加熱滅菌したものを使用した。基質を終濃度５０ｍｇ／Ｌで含む基本培地に、エンテロクロスター・アスパラギフォルミスＤＳＭ　１５９８１株、エンテロクロスター・シトロニアエＤＳＭ　１９２６１株、またはクロストリジウム・エスピーＤＣ３６５６　（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２７０８）株をそれぞれ植菌し、気相をアネロパック（三菱ガス化学社製）によって水素雰囲気下として３７℃で３日間培養した。培養終了後、培養液０．５ｍＬに対して３倍量の１．５ｍＬのＤＭＳＯを添加して溶解し、ＨＰＬＣによってウロリチン類の定量分析を行った。なお、ＨＰＬＣは以下に記載の条件で行い、標品としては、シグマアルドリッチ社製のウロリチン類をＤＭＳＯに溶解して用いた。ウロリチン類の定量結果を表２に示す。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ‐３（２５０×４．６ｍｍ）（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ
社製）
溶離液：水／アセトニトリル／酢酸＝７４／２５／１
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：３０５ｎｍ
　表２に示されるように、いずれの微生物においてもウロリチンＭ６からウロリチンＡが生成した。使用した３株はこれまでにウロリチン類の９位の水酸基を脱水酸化（例えば、ウロリチンＣを脱水酸化してウロリチンＡを生成）することが知られているため、いずれの菌株もウロリチンの９位脱水酸化だけではなく、１０位脱水酸化活性を有することが示された。
［実施例２］エンテロクロスター・アスパラギフォルミスによるウロリチンＭ６、Ｍ７を基質とした１０位脱水酸化反応
　滅菌済みの１０ｍｇ／ＬのウロリチンＭ６を含むＧＡＭ培地（日本製薬株式会社）４００ｍＬを、５００ｍＬ三角フラスコに添加した。そこへエンテロクロスター・アスパラギフォルミスＤＳＭ　１５９８１株を２％植菌した後、嫌気チャンバー内で２４時間、３７℃、１２０ｓｐｍで振盪培養した。得られた培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、沈殿画分として菌体を調製した。
　得られた菌体を１ｍＭ　ＤＴＴを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ、ｐＨ６．５）に懸濁し、ガラスビーズ（０．１ｍｍ）を用いて菌体を破砕した（２，７００ｒｐｍ、６０秒ｏｎ／６０秒ｏｆｆを６サイクル、４℃）。細胞破砕液を遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃、６０分間）して上清を取得し、無細胞抽出液とした。
　０．５ｇ／ＬウロリチンＭ６またはＭ７（１０位水酸基を有するウロリチン類）を基質として用い、５ｍＭ　ＮＡＤＨ、２ｍＭ　メチルビオロゲン、０．２ｍＭ　ＦＭＮ、１ｍＭ　ＤＴＴを含む２０ｍＭ　ＫＰＢ（ｐＨ６．５）、及び３３ｍｇ／ｍＬの休止菌体または無細胞抽出液１０％（ｖ／ｖ）を添加して５００μＬの反応溶液を調製し２．０ｍＬチューブに入れた。気相を嫌気チャンバー内の気相（ＣＯＹ社ビニル嫌気チャンバー）とし、３７℃、２６時間反応させた。反応終了後に、ギ酸５０μＬ及びＤＭＳＯ５００μＬを添加し、混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃、３分間）し、得られた上清をＨＰＬＣ分析した。
　結果を図１に示す。エンテロクロスター・アスパラギフォルミスはこれまでにウロリチン類の９位の水酸基を脱水酸化することが知られている。休止菌体および無細胞抽出液を用いたどちらの場合においても、ウロリチンＭ６を基質とした場合に、９位と１０位の水酸基が脱離したウロリチンＡが生成した。また、ウロリチンＭ７を基質とした場合、１０位の水酸基が脱離したウロリチンＡが生成した。このように、ウロリチンＭ６及びウロリチンＭ７に共通して１０位脱水酸化活性が確認されたことから、エンテロクロスター・アスパラギフォルミスが、様々なウロリチン類に対して１０位脱水酸化活性を示すことが類推できる。
[実施例３]補酵素の添加による１０位脱水酸化反応への影響
　実施例２で調製した無細胞抽出液を用いて、反応液への補酵素添加による効果を評価した。
　０．５ｇ／ＬのウロリチンＭ６またはＭ７（１０位に水酸基を有するウロリチン類）を基質として用い、条件ごとに５ｍＭ　ＮＡＤＨ、５ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、０．２ｍＭ　ＦＡＤ、０．２ｍＭ　ＦＭＮ、及び／又は２ｍＭ　メチルビオロゲンを加えた、１ｍＭ　ＤＴＴを含む２０ｍＭ　ＫＰＢ（ｐＨ　６．５）、及び無細胞抽出液１０％（ｖ／ｖ）を添加して５００μＬの反応溶液を調製し２．０　ｍＬチューブに入れた。気相を嫌気チャンバー内の気相（ＣＯＹ社ビニル嫌気チャンバー）とし、３７℃、２６時間反応させた。反応終了後に、ギ酸５０μＬ及びＤＭＳＯ　５００μＬを添加し、混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃、３分間）し、得られた上清をＨＰＬＣ分析した。
　図２に示すように、ＭＶＣｌ2、ＦＭＮ、又はＦＡＤによって、ウロリチン類の１０位脱水酸化活性が向上した。さらに、ＭＶＣｌ2、ＦＭＮ、又はＦＡＤに、さらにＮＡＤＨを組み合わせること、及び、ＭＶＣｌ2又はＦＡＤに、さらにＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを組み合わせることで、ウロリチン類の１０位脱水酸化活性がさらに向上した。
［実施例４］遺伝子配列の特定
　これまでに明らかになっているエンテロクロスター・ボルテアエ由来のウロリチン類９位脱水酸化酵素のアミノ酸配列を元にしたホモロジー検索により、１０位脱水酸化活性を有するエンテロクロスター・アスパラギフォルミスＤＳＭ　１５９８１およびエンテロクロスター・シトロニアエＤＳＭ　１９２６１株中に存在し、且つ１０位脱水酸化活性を有しないエンテロクロスター・ボルテアエには存在しない遺伝子として、１０位の水酸基を脱離することができる脱水酸化酵素遺伝子を推測した。なお、ホモロジー検索及び遺伝子情報の解析には、ＮＣＢＩ及びＧＥＮＴＹＸ（株式会社ゼネティックス）を利用した。
　エンテロクロスター・アスパラギフォルミスＤＳＭ　１５９８１由来のウロリチン類の１０位の水酸基を脱水酸化する酵素を構成するサブユニットとして配列番号１～３の３つのオープンリーディングフレーム（ORF）を予測した。これらの遺伝子をEaUro10OH-1、EaUro10OH-2、EaUro10OH-3と命名した。またエンテロクロスター・シトロニアエＤＳＭ　１９２６１株由来のウロリチン類の１０位の水酸基を脱水酸化する酵素を構成するサブユニットとして配列番号４～６の３つのＯＲＦを予測した。これらの遺伝子をEcUro10OH-1、EcUro10OH-2、EcUro10OH-3と命名した。
［実施例５］遺伝子合成
　エンテロクロスター・アスパラギフォルミスＤＳＭ　１５９８１由来のウロリチン類の１０位の水酸基を脱水酸化する酵素と推測されるEaUro10OH-1、EaUro10OH-2、EaUro10OH-3の各遺伝子配列を、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を用いた異種発現のために最適化し、それぞれ配列番号１３～１５で表される塩基配列を設計した。
　配列番号１３～１５で表される各塩基配列を含む、配列番号１６の各塩基配列を人工合成し、Ｎｃｏ　Ｉによって切断したロドコッカス（Rhodococcus）属発現ベクターｐＴｉｐＱＣ１（北海道システム・サイエンス株式会社）へIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を使用して挿入することで異種発現用プラスミド（pTipQC1_EaUro10OH_opt.）を取得した。
［実施例６］形質転換体の構築
　作製した組換えベクターをエレクトロポレーションによりロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）Ｌ８８株（北海道システム・サイエンス株式会社）に導入した。選択マーカーとしてクロラムフェニコールを用いた。形成したコロニーをＬＢ培地（２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール）にて培養（２８℃）し、培養液からグリセロールストック（３０％グリセロール）を作製・保存（－８０℃）し、後のタンパク質発現に用いた。
［実施例７］酵素の異種発現
　前培養として、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５ｍＬを１０ｍＬ容試験管に添加し、前記形質転換株を植菌し、２８℃、２００ｓｐｍで２－３日間振盪培養した。２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地２５ｍＬを含む１００ｍＬ容三角フラスコに前々培養液を１０％植菌し、２８℃、２００ｓｐｍで２４時間振盪培養した。
　２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび０．２μｇ／ｍＬのチオストレプトンを含むＬＢ培地１００ｍＬを含む５００ｍＬ容三角フラスコに前培養液を１０％植菌し、２８℃、２００ｓｐｍ、好気性雰囲気下で酵素を２４時間誘導した。遠心分離（８，０００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、休止菌体を取得した。洗浄菌体を１ｍＭ　ＤＴＴを含む２０ｍＭ　ＫＰＢ（ｐＨ６．５）に懸濁し、ガラスビーズを用いて菌体を破砕した（２，７００ｒｐｍ、６０秒ｏｎ／６０秒ｏｆｆを６サイクル、４℃）。得られた菌体破砕液を遠心分離（２０，０００ｇ、６０分、４℃）し、上清を無細胞抽出液とした。
［実施例８］ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　１２．５％ポリアクリルアミドゲルを作製し、実施例７で取得した酵素画分（無細胞抽出液）のドデシル硫酸ナトリウム－電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を行い、分子量を評価した。分子量マーカーには、ATTO製AE-1440 Ezstandardを用いた。
　結果を図３に示す。図中、「Ｍ」は分子量マーカーのレーンであり、「Vector control」の「Ｓ」はコントロールとなる空ベクターを導入した形質転換体の無細胞抽出液のレーンであり、「UroE」の「Ｓ」はEaUro10OHを導入し発現させた形質転換体の無細胞抽出液のレーンである。「UroE」の「Ｓ」のレーンにおいて、三角で示すバンドEauro10OH-1及びEauro10OH-2が確認された。各バンドの分子量は、計算値（それぞれ８７．１ｋＤａ、８３．４ｋＤａ）とよく一致した。
［実施例９］形質転換体による１０位脱水酸化反応（ウロリチンＭ６）
　ウロリチン類の１０位の水酸基を脱水酸化する活性を測定した。基質としてウロリチンＭ６（１０位に水酸基を有するウロリチン類）を用いた。１０位の水酸基が脱水酸化されて生成するウロリチンＣを定量することにより休止菌体での酵素活性を測定した。
　実施例７で取得した休止菌体を用い、０．５ｍｇ／ｍＬウロリチンＭ６、１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）を添加した２０ｍＭ　ＫＰＢ（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ　６．５）、及び実施例７で得た休止菌体２４０ｍｇ／ｍＬを含む酵素活性反応液５００μＬをチューブに入れた。気相は嫌気チャンバー内の気相（ＣＯＹ社ビニル嫌気チャンバー）とし、３７℃で２４時間反応させた（１２０ｓｐｍ）。反応終了液にギ酸５０μＬ及びＤＭＳＯ　５００μＬを添加し混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃、３分間）後の上清をＨＰＬＣにより分析した。
　結果を図４に示す。基質のウロリチンＭ６から１０位の水酸基が脱離したウロリチンＣのみが生成した。
［実施例１０］形質転換体による１０位脱水酸化反応（ウロリチンＭ７、ウロリチンＥ）
　ウロリチンＭ６以外の基質に対する１０位脱水酸化活性の評価を実施した。基質としては、ウロリチンＭ７、ウロリチンＥを用い、それぞれ１０位の水酸基が脱水酸化されてできるウロリチンＡ、ウロリチンＭ８を定量することにより休止菌体での酵素活性を測定した。
　実施例７で取得した休止菌体を用い、０．５ｍｇ／ｍＬウロリチンＭ７又はＥ、１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）を添加した２０ｍＭ　ＫＰＢ（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５）、及び実施例７で得た休止菌体２４０ｍｇ／ｍＬを含む酵素活性反応液５００μＬをチューブに入れた。気相は嫌気チャンバー内の気相（ＣＯＹ社ビニル嫌気チャンバー）とし、３７℃で２４時間反応させた（１２０ｓｐｍ）。反応終了液にギ酸５０μＬ及びＤＭＳＯ５００μＬを添加し混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃、３分間）後の上清をＨＰＬＣにより分析した。
　その結果、ウロリチンＭ７を基質とした場合、１０位の水酸基が脱離したウロリチンＡのみが生成し、その生成量は０．０５６ｍＭであった。また、ウロリチンＥを基質とした場合、１０位の水酸基が脱離したウロリチンＭ８のみが生成し、その生成量は０．０３１ｍＭであった。
［実施例１１］酵素の至適温度
　実施例７で得た、形質転換体の無細胞抽出液を用い、反応における酵素の至適温度を評価した。終濃度が３０％（ｖ／ｖ）の無細胞抽出液、２．０ｍＭウロリチンＭ７、５．０ｍＭ　ＮＡＤＨ、２．０ｍＭ　ＭＶＣｌ2（メチルビオロゲン）となるように、１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）を添加した２０ｍＭ　ＫＰＢ（リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ　６．５）とともに酵素活性反応液５００μＬを調製した。気相は嫌気チャンバー内の気相（ＣＯＹ社ビニル嫌気チャンバー）とし、２０℃から５５℃の間で２４時間反応させた（１２０ｓｐｍ）。反応終了液にギ酸５０μＬ及びＤＭＳＯ５００μＬを添加し混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃、３分間）後の上清をＨＰＬＣにより分析した。
結果を図５に示す。基質ウロリチンＭ７の１０位水酸基の脱離によるウロリチンＡ生成は全ての温度帯で確認された。ウロリチンＡ生成量は、反応温度２８℃で最大値となり、２０～３７℃の範囲で、当該最大値の７０％以上を維持した。
［実施例１２］酵素の至適ｐＨ
　実施例７で得た、形質転換体の無細胞抽出液を用い、反応における酵素の至適ｐＨを評価した。終濃度が３０％（ｖ／ｖ）の無細胞抽出液、２．０ｍＭウロリチンＭ７、５．０ｍＭ　ＮＡＤＨ、２．０ｍＭ　ＭＶＣｌ2（メチルビオロゲン）となるように、１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）を添加したバッファー溶液とともに酵素活性反応液５００μＬを調製した。バッファーとしてはそれぞれ、１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ２．５～３．５）、１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ３．５～５．５）、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ５．５～８）、１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８～９）、１００ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９～１０）を用いた。気相は嫌気チャンバー内の気相（ＣＯＹ社ビニル嫌気チャンバー）とし、２８℃で２４時間反応させた（１２０ｓｐｍ）。反応終了液にギ酸５０μＬ及びＤＭＳＯ５００μＬを添加し混合後、遠心分離（２０，０００×ｇ、４℃、３分間）後の上清をＨＰＬＣにより分析した。
　結果を図６に示す。基質ウロリチンＭ７の１０位水酸基の脱離によるウロリチンＡ生成はｐＨ５．５～７．５の範囲で確認され、ウロリチンＡ生成量はｐＨ６．５（リン酸バッファー下）で最大となった。

Claims (19)

  1. 　エンテロクロスター（Enterocloster）属微生物又はクロストリジウム（Clostridium）属微生物に由来し、且つ、下記（１）の性質を有する酵素：
    （１）ウロリチン類の１０位水酸基を脱水酸化する反応を触媒する活性を持つ。
  2. 　さらに下記（２）の性質を有する、請求項１に記載の酵素：
    （２）メチルビオロゲン（ＭＶＣｌ2）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、及びフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）からなる群より選択される補酵素によって前記活性が向上する。
  3. 　さらに下記（２－１）の性質を有する、請求項２に記載の酵素：
    　（２－１）前記補酵素に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を組み合わせることで、前記活性がさらに向上する。
  4. 　さらに下記（２－２）の性質を有する、請求項２に記載の酵素：
    　（２－２）前記補酵素がＦＡＤ及び／又はＭＶＣｌ2である場合、前記補酵素に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）及び／又はニコンチアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を組み合わせることで、前記活性がさらに向上する。
  5. 　さらに下記（３）、（４）及び（５）の性質を有する、請求項１に記載の酵素：
    （３）ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果において、相対分子質量として７５，０００～９６，０００を示すバンドが含まれる；
    （４）作用ｐＨが５．５以上７．５以下である；
    （５）至適温度が２０℃以上３７℃以下である。
  6. 　エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）、エンテロクロスター・シトロニアエ（Enterocloster citroniae）、又はクロストリジウム・エスピー（Clostridium sp. C2A）に由来する酵素である、請求項１に記載の酵素。
  7. 　下記（Ａ１－i）～（Ａ１－iii）のいずれかに示すポリペプチド、下記（Ａ２－i）～（Ａ２－iii）のいずれかに示すポリペプチド、及び／又は下記（Ａ３－i）～（Ａ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドを含む、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素：
    （Ａ１－i）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ａ１－ii）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ａ１－iii）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ａ２－i）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ａ２－ii）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ａ２－iii）配列番号２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ａ３－i）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ａ３－ii）配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ａ３－iii）配列番号３に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  8. 　前記（Ａ１－i）～（Ａ１－iii）のいずれかに示すポリペプチド、前記（Ａ２－i）～（Ａ２－iii）のいずれかに示すポリペプチド、及び前記（Ａ３－i）～（Ａ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドを含む、請求項７に記載のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素。
  9. 　下記（Ｂ１－i）～（Ｂ１－iii）のいずれかに示すポリペプチド、下記（Ｂ２－i）～（Ｂ２－iii）のいずれかに示すポリペプチド、及び／又は下記（Ｂ３－i）～（Ｂ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドを含む、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素：
    （Ｂ１－i）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｂ１－ii）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｂ１－iii）配列番号４に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｂ２－i）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｂ２－ii）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｂ２－iii）配列番号５に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｂ３－i）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｂ３－ii）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、付加、挿入又は欠失されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｂ３－iii）配列番号６に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  10. 　前記（Ｂ１－i）～（Ｂ１－iii）のいずれかに示すポリペプチド、前記（Ｂ２－i）～（Ｂ２－iii）のいずれかに示すポリペプチド、及び前記（Ｂ３－i）～（Ｂ３－iii）のいずれかに示すポリペプチドを含む、請求項９に記載のウロリチン類の１０位脱水酸化酵素。
  11. 　請求項７～１０のいずれかに記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。
  12. 　請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット又は組換えベクター。
  13. 　請求項１１に記載のポリヌクレオチドを発現可能に保持した、又は、請求項１２に記載の発現カセット又は組換えベクターを発現可能に保持した、形質転換体。
  14. 　請求項１３に記載の形質転換体を培養する工程を含む、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の製造方法。
  15. 　エンテロクロスター（Enterocloster）属微生物及びクロストリジウム（Clostridium）属微生物からなる群より選択される微生物を培養する工程を含む、ウロリチン類の１０位脱水酸化酵素の製造方法。
  16. 　前記微生物が、エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）、エンテロクロスター・シトロニアエ（Enterocloster citroniae）、及びクロストリジウム・エスピー（Clostridium sp. C2A）からなる群より選択される、請求項１５に記載の製造方法。
  17. 　１０位水酸基を持つウロリチン類に、下記<１>～<４>の少なくともいずれかを接触させる工程を含む、１０位が脱水酸化されたウロリチン類の製造方法：
    　　<１>請求項１～１０のいずれかに記載の酵素、
    　　<２>請求項１３に記載の形質転換体、
    　　<３>エンテロクロスター（Enterocloster）属微生物及びクロストリジウム（Clostridium）属微生物からなる群より選択される微生物、及び
    　　<４>前記<２>に記載の形質転換体又は前記<３>に記載の微生物の、休止菌体、菌体膜透過性向上処理物、菌体破砕処理物、及び無細胞抽出物からなる群より選択される処理物。
  18. 　前記微生物が、エンテロクロスター・アスパラギフォルミス（Enterocloster asparagiformis）、エンテロクロスター・シトロニアエ（Enterocloster citroniae）、及びクロストリジウム・エスピー（Clostridium sp. C2A）からなる群より選択される、請求項１７に記載の製造方法。
  19. 　前記１０位水酸基を持つウロリチン類が、ウロリチンＭ５、ウロリチンＭ６、ウロリチンＭ７、及びウロリチンＥからなる群より選択される、請求項１７に記載の製造方法。
PCT/JP2025/017783 2024-05-16 2025-05-15 ウロリチン類の１０位の水酸基を脱水酸化する酵素 Pending WO2025239441A1 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2021015267A1 (ja) * 2019-07-25 2021-01-28 株式会社ダイセル ウロリチン類の水酸基を脱水酸化する酵素
WO2024083910A1 (en) * 2022-10-18 2024-04-25 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Microbial method for reproducing the human urolithin metabotypes in vitro and in vivo

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DATABASE UNIPROTKB 25 January 2012 (2012-01-25), XP093372951, Database accession no. G5HFE6 *
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