WO2025211892A1 - 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼 및 이를 포함하는 마크로파지 관련 질환의 타겟, 진단 또는 치료용 조성물 - Google Patents

표면 최적화된 알부민 나노플랫폼 및 이를 포함하는 마크로파지 관련 질환의 타겟, 진단 또는 치료용 조성물

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WO2025211892A1
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albumin
nanoplatform
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functional group
azide
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김규완
김진실
박지수
박지용
석승혁
유란지
이윤상
정혜원
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Definitions

  • the present invention provides an albumin nanoplatform obtained by a click chemistry reaction of albumin having an azide (N 3 ) or cyclooctyne functional group bound thereto and a carrier having an azide (N 3 ) or cyclooctyne functional group bound thereto, wherein when the albumin is bound to the azide functional group, the carrier is bound to the cyclooctyne functional group, and when the albumin is bound to the cyclooctyne functional group, the carrier is bound to the azide functional group, and the carrier comprises a sugar compound, and at least one of the azide or cyclooctyne functional groups bound to the albumin to which the carrier is not bound is inactivated.
  • the inactivation can be performed by binding a masking material having a substituent selected from the group consisting of an amino group (-NH 2 ), a carboxyl group (-COOH), and a hydroxyl group (-OH) to an azide or cyclooctane functional group bound to albumin.
  • a total of 1 to 10 of the above sugar compounds can be combined.
  • the phosphate buffer solution (PBS) may have a pH of 6.8 to 7.6, and preferably a pH of 7.0 to 7.4.
  • the amount of DMSO used to prepare the azide-NHS solution or the cyclooctane-NHS solution in step may be 2% (v/v) or less of the total reaction solution.
  • the mixing molar ratio of albumin and azide-NHS or cyclooctane-NHS in step may be 1:1 to 1:30.
  • a human serum albumin (HSA) solution and an ADIBO-NHS solution were mixed and reacted at room temperature for 4 hours to produce HSA-ADIBO.
  • the number of click reaction functional groups (azide or cyclooctane functional groups) introduced to the albumin surface by this method is preferably 1 to 30, and more preferably 9 to 20.
  • the number of click-reactive functional groups introduced on the albumin surface can be controlled by the reaction ratio of albumin and azide-NHS or cyclooctane-NHS.
  • the transmitter comprises a sugar compound.
  • the sugar compound may be a mannosyl group, a galactosyl group, or a glucosyl group.
  • the structures of the mannosyl group, the galactosyl group, and the glucosyl group are as shown in Formulas 1 to 3 below, respectively.
  • an albumin nanoplatform containing a mannosyl group, a galactosyl group, or a glucosyl group as a delivery agent has a specific targeting ability for a specific type of macrophage, thereby enabling drug delivery to the target macrophage, and as a result, can function as a platform for preemptive diagnosis and treatment of autoimmune diseases, inflammatory diseases, or cancer diseases associated with macrophages.
  • Mannose receptors are known to be abundant on cells involved in defense mechanisms, with Kupffer cells being a prime example of such immune cells.
  • Kupffer cells When the transmitter is mannosyl, it targets Kupffer cells, so it typically acts in the liver, but it can also affect the blood, muscles, spleen, and lungs.
  • the transmitter may indicate hepatobiliary excretion through the gall bladder.
  • glucosyl group When a glucosyl group is bound as a transporter, it has a targeting ability for M1 type macrophages that have overexpressed GLUT (Glucose Transporter) on their surface, and through this, it is selectively taken up by inflammatory macrophages in damaged tissues, and suppresses the inflammatory response and ROS production induced by inflammatory macrophages, thereby restoring the function of damaged mitochondria, and can be used as a nanoplatform that can prevent or treat progression to serious diseases by suppressing cell death in damaged tissues.
  • GLUT Glucose Transporter
  • the target selectivity can be changed or further increased depending on the type of glycosaminoglycan compound.
  • the delivery agent may include a mannosyl group.
  • the delivery agent when the delivery agent includes a mannosyl group, it can selectively target M2 macrophages or tumor-associated macrophages (TAM).
  • TAM tumor-associated macrophages
  • the mannosyl group may be combined in numbers of 1 to 10, but the number can be adjusted depending on the desired targeting macrophage type.
  • the number of mannosyl groups is preferably 1 to 4.
  • the number of mannosyl groups is preferably 5 to 10.
  • the number of mannosyl groups is most preferably 5 to 7.
  • the nanoplatform of the present invention may further comprise a galactosyl or glucosyl group in addition to a mannosyl group as a delivery agent.
  • the delivery agent comprises a galactosyl or glucosyl group in addition to a mannosyl group
  • tumor-associated macrophages TAM are selectively targeted regardless of the number of mannosyl groups. That is, when the number of mannosyl groups is three, M2 macrophages are targeted, but when three mannosyl groups are combined with three galactosyl or glucosyl groups, TAM macrophages are preferentially targeted.
  • the galactosyl group or glucosyl group may be included in 1 to 6 groups, and preferably in 2 to 4 groups.
  • the delivery agent may include all three groups: mannosyl, galactosyl, and glucosyl.
  • an albumin nanoplatform incorporating all three types of glycosaminoglycans targets M2 macrophages. Specifically, it was experimentally confirmed that even if three mannosyl groups are combined, M2 macrophages are preferentially targeted when three galactosyl and three glucosyl groups are combined.
  • a masking material can be reacted with a click reaction functional group bound to the albumin surface to inactivate it.
  • the masking material can be a material capable of inactivating the click reaction functional group, and is specifically a material having a substituent selected from the group consisting of an amino group (-NH 2 ), a carboxyl group (-COOH), and a hydroxyl group (-OH).
  • an amino group -NH 2
  • a carboxyl group a carboxyl group
  • -OH a hydroxyl group
  • one having an amino group is most preferable in terms of enabling the click reaction functional group to be recognized by the surface of albumin.
  • a compound containing the amino group and carboxyl group for example, lysine can be used, and as a compound containing a hydroxyl group, for example, polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • the above masking material reacts with the click-reactive functional group on the surface of the albumin nanoplatform that does not bind to the delivery agent, thereby deactivating it and returning the albumin nanoplatform to the albumin surface state with the existing amino or carboxyl functional group, thereby reducing uptake by the reticuloendothelial system without affecting the targeting or therapeutic ability of the delivery agent, thereby significantly increasing the half-life of the albumin nanoplatform in the body.
  • the present invention additionally confirmed the effect of further amplifying target selectivity by reducing the off-target effect in the body when a sugar compound is used as a delivery agent.
  • the albumin nanoplatform of the present invention can be manufactured by (1) preparing an albumin solution having an azide (N 3 ) or cyclooctyne functional group bound thereto; (2) mixing a solution containing a carrier having a cyclooctane (N 3 ) functional group or an azide (N 3 ) functional group with the solution prepared in step (1) and subjecting the mixture to a copper-free click chemistry reaction; and (3) mixing a solution containing a masking material having a cyclooctane (N 3 ) functional group or an azide (N 3 ) functional group with the albumin solution having the carrier bound thereto and subjecting the mixture to a copper-free click chemistry reaction.
  • the above step (3) reaction may be performed under pH conditions of 6 to 7 to maintain albumin stability. If the pH is higher than the above pH range, thermal denaturation of albumin may occur, and if the pH is lower than the above pH range, decomposition and oxidative damage due to acidification may occur.
  • the delivery material bound to the albumin nanoplatform is a combination of two or more materials
  • the combination of two or more materials may be bound to the albumin nanoplatform simultaneously, or each material may be bound sequentially, but is not limited thereto.
  • the additionally bindable carrier may be selected from the group consisting of target molecules, active substances, radioactive isotopes, fluorescent substances, and combinations thereof.
  • a tissue-specific substance may be a protein, RNA, a compound accumulated or produced, etc. existing tissue-specifically, and a disease-specific substance may be a protein, RNA, a compound accumulated or produced, etc. existing depending on the type of disease.
  • folic acid can be combined as the above-mentioned transmitting agent.
  • Folic acid is a vitamin, also known as vitamin B9 or vitamin M. Folic acid binds specifically to the folate receptor.
  • the folate receptor is a tumor-associated glycosylphosphatidylinositol anchor protein that allows bound folate or folate-conjugated substances to be uptaken through receptor-mediated endocytosis.
  • the delivery molecule RGD is a tripeptide composed of three amino acids—arginine (L-arginine), glycine (glycine), and aspartic acid (L-aspartic acid). It was first discovered in the cell adhesion region of fibronectin. Because it possesses a strong affinity for integrin receptors, which are primarily expressed on the endothelial cell layer of tumor blood vessels, it is widely used as a universal tool in research on drug-targeted therapy and simple reagents.
  • active substance may be a natural product, vitamin, active agent, biological agent, compound, amino acid, protein, peptide, nucleotide, nucleic acid, polypeptide, polynucleotide and analogs, homologues and derivatives thereof, and in particular, an anti-obesity drug, a central nervous system stimulant, a carotenoid, a corticosteroid, an elastase inhibitor, an antifungal agent, an anti-tumor agent, an antiemetic, an analgesic, a cardiovascular agent, an anti-inflammatory agent, an anthelmintic agent, an antiarrhythmic agent, an antibiotic, an anticoagulant, an antidepressant, an antidiabetic agent, an antiepileptic agent, an antihistamine, an antihypertensive agent, an antimuscarinic agent, an antimycobacterial agent, an immunosuppressant, an antithyroid agent, an antiviral agent, an anxiolytic agent,
  • the radioactive isotope as a carrier material can be labeled by a chelating agent.
  • Radioisotopes are elements with the same atomic number but different atomic masses. Among these isotopes, those that are radioactive are called radioisotopes. These radioisotopes can be used as valuable markers for diagnosing diseases or assessing pharmacodynamics by utilizing their characteristic ability to attenuate radioactivity by emitting gamma rays or other subatomic particles.

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Abstract

본 발명은 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼 및 이를 포함하는 염증성 질환의 타겟, 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 알부민 나노플랫폼은 알부민의 표면에 다양한 당화합물을 조합하여 결합시키고 당화합물이 결합되지 않은 클릭 작용기를 마스킹하여 비활성화시킴으로써, 세망내피계에 의한 섭취를 감소시킬 수 있어 체내 off-target 효과를 줄여 마크로파지 표적 특이성을 향상시킴으로써 표적 조직 또는 세포에 타겟 분자 또는 활성물질을 효과적으로 전달하여 우수한 치료 및 진단 효과를 얻을 수 있다.

Description

표면 최적화된 알부민 나노플랫폼 및 이를 포함하는 마크로파지 관련 질환의 타겟, 진단 또는 치료용 조성물
본 발명은 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼 및 이를 포함하는 마크로파지 관련 질환의 타겟, 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알부민 나노플랫폼의 표면에 다양한 당화합물을 조합하여 결합시키고 당화합물이 결합되지 않은 클릭 작용기를 마스킹하여 비활성화시킴으로써, 표적 세포에 결합 특이성을 증가시킨 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼 및 이를 이용하여 질환을 진단 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
생체 내의 마크로파지(macrophage)는 식균 작용에 의한 이물, 노폐물의 제거 또는 자연면역에 중심적인 역할을 하고 있는 것과 더불어, 항원처리기능에 의해 획득면역의 조절에도 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 마크로파지의 비정상적인 활성 또는 기능 항진은 생체에 있어 병적인 상태를 초래하기도 한다.
마크로파지는 주요한 염증세포로 알려져 있으며 분극화에 의해 두 가지 타입으로 존재한다. M1 타입은 전염증(pro-inflammatory)의 특징을 가지는 염증성 마크로파지의 형태를 띤다. LPS(Lipopolysaccharide)는 마크로파지 매개 염증반응을 유발하는 대표적인 병원성 물질로 알려져 있으며, 마크로파지 표면에 발현하는 TLR4와 결합하여 염증성 사이토카인(cytokines)의 분비를 통해 염증 반응을 유발한다. 이와 반대로, 항염증(anti-inflammatory)의 특징을 가지고 있는 M2 타입은 IL-4 및 IL-13과 같은 사이토카인에 의해 유도되며, IL-10과 같은 항염증성 사이토카인을 분비한다. 그에 따라 상처 회복 및 조직의 리모델링과 같은 항상성을 유지하는데 작용함으로써 염증을 해소하는데 주요한 역할을 한다.
또한, 종양의 성장에 중요한 역할을 하는 종양관련 마크로파지(tumor associated macrophage, TAM)는 암의 성장, 전이 등의 전반적인 종양 미세환경과 밀접하게 관련되어 있다. TAM는 마크로파지 중 M2 타입으로 분류되고, 일반적인 염증성 마크로파지인 M1 타입과 달리 암의 성장을 촉진하는 IL-10, TGFβ 및 CCL18과 같은 사이토카인을 생성한다. 또한, M2 타입 TAM의 표면에 존재하는 PDL1 및 B7-1/2와 같은 수용체들은 T 세포, NK 세포의 항종양 활성을 억제하는 것으로 보고되고 있다. 따라서, M2 타입 TAM이 다량으로 존재하는 미세환경에서는 종양의 성장, 분화 및 전이가 활발하게 이루어진다.
이와 같이 다양한 질병을 치료하기 위해서는 다양한 타입의 마크로파지의 활성을 적절하게 조절하는 것이 중요하며, 이를 달성하기 위해서는 약물을 마크로파지 특이적으로 전달할 수 있는 전달체가 필요한 실정이다.
알부민(albumin)은 혈액 내에서 20일 이상을 순환하는 매우 안정한 단백질로서 기존 저분자 화학약물, 단백질 또는 형체 등을 화학적으로 알부민에 결합시켜 다양한 약물의 생체내 안정성을 향상시키는 약물전달시스템(Drug Delivery System)으로 사용되고 있다. 이러한 알부민을 이용한 약물전달시스템은 진단 및 치료에 응용되어 다양한 의약학 분야에서 활용되고 있으며, 대표적으로 소수성 항암제인 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉사트(methotrexate, MTX) 등이 화학적으로 알부민에 결합하여, 암 표적성을 향상시키고, 약물의 혈액내 안정성을 향상시키는 연구가 진행되었다.
이 외에도 알부민을 이용한 나노입자를 제조하는 연구도 활발히 진행되었는데, 알부민은 체내에서 독성과 면역원성이 없고 분해가능한 생분해성 물질이기 때문에, 알부민으로 형성된 나노입자는 약물 전달체로 매우 유용하다.
대한민국 등록특허공보 제10-1043407호에서는 친수성 알부민과 소수성 담즙산을 결합하여 약물 전달용 복합체를 이루는 기술이 알려져 있으나, 상기 단백질 복합체는 친수성 환경에서 자가 조립체를 형성하여 나노입자 형태로 약물을 전달하는 것으로, 특히 소수성 약물 전달에 목적이 있으며, 나노입자의 표적 특이성을 증가시켜 약물 전달 효율을 증가시키는 효과에 대해서는 개시되어 있지 않다.
이처럼 약물전달체로서의 알부민 나노입자의 중요성이 주목받고 있는 바, 생체 내 알부민 나노입자의 안정성을 향상시키면서 표적 세포에 특이적으로 약물을 전달하기 위한 기술 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 표적 마크로파지에 대한 결합 특이성을 증가시킨 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적 마크로파지에 대한 결합 특이성을 증가시킨 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼을 포함하는 질환의 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 아자이드(N3) 또는 사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기가 결합된 알부민(albumin)과, 아자이드(N3) 또는 사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기가 결합된 전달물질의 클릭 화학(click chemistry) 반응에 의해 얻어지되, 상기 알부민이 아자이드 작용기와 결합되는 경우, 상기 전달물질은 사이클로옥타인 작용기와 결합되고, 상기 알부민이 사이클로옥타인 작용기와 결합되는 경우, 상기 전달물질은 아자이드 작용기와 결합되며, 상기 전달물질이 당화합물을 포함하고, 상기 알부민에 결합된 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기 중 전달물질이 결합되지 않은 작용기의 하나 이상이 불활성화된, 알부민 나노플랫폼을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민에 도입된 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기가 1 내지 30 개일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민에 도입된 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기는 1 내지 30 개일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 불활성화는 아미노기(-NH2), 카르복실기(-COOH) 및 하이드록시기(-OH)로 이루어진 군에서 선택되는 치환기를 갖는 마스킹물질을 알부민에 결합된 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기에 결합시켜 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마스킹물질은 라이신(lysine) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마스킹물질의 결합은 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기가 결합된 마스킹물질을 전달물질이 결합된 알부민과 클릭 화학 반응시켜 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민이 아자이드 작용기와 결합되는 경우, 상기 마스킹물질은 사이클로옥타인 작용기와 결합되고, 상기 알부민이 사이클로옥타인 작용기와 결합되는 경우, 상기 마스킹물질은 아자이드 작용기와 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 당화합물은 글루코실기(glucosyl group), 만노실기(mannosyl group) 및 갈락토실기(galactosyl group)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민 나노플랫폼은 M1 타입 마크로파지, M2 타입 마크로파지 및 종양관련 대식세포(tumor associated macrophage, TAM)로 이루어진 군에서 선택되는 마크로파지를 타겟팅할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 당화합물은 총 1 내지 10개 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 당화합물은 만노실기를 4 내지 8개 포함하고, 알부민 나노플랫폼이 TAM 마크로파지를 타겟팅할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 당화합물은 만노실기, 갈락토실기 및 글루코실기를 모두 포함하고, 알부민 나노플랫폼이 M2 마크로파지를 타겟팅할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전달물질은 엽산 또는 이의 유도체, RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid) 또는 이의 유도체, 활성물질, 방사성 동위원소 및 형광물질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 3H,　11C,　18F,　14Cl,　32P,　35S,　36Cl,　45Ca,　51Cr,　57Co,　58Co,　59F,　64Cu, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 90Y,　99Mo,　99mTc,　111In,　131I,　125I,　124I,　123I,　186Re,　188Re, 225Ac, 212Pb, 117mSn, 및　177Lu로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방사성 동위원소가 킬레이트제에 의해 표시되고, 상기 킬레이트제가 NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DFO (3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea), DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), N2S2(diaminedithiol), p-SCN-Bn-NOTA (2-(4'-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), p-SCN-Bn-DOTA (2-(4'-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), TETA (1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid), p-SCN-Bn-DTPA (2-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaacetic acid), p-SCN-Bn-DFO (1-(4-Isothiocyanatophenyl)-3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[Nacetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea) 및 HYNIC (hydrazinonicotinic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광물질은 FNR(Ferrodoxin NADP(+) reductase), 시아닌(cyanine)계 형광 물질, TAMRA(tetramethylrhodamine-5-maleimide), Flamma® 형광 물질 및 ICG(indocyanine green)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명은 또한, (1) 아자이드(N3) 또는 사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기가 결합된 알부민(albumin) 용액을 준비하는 단계; (2) 상기 단계 (1)에서 제조된 용액에 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 작용기 또는 아자이드(N3) 작용기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액을 혼합하여 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계; 및 (3) 전달물질이 결합된 알부민 용액에 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 작용기 또는 아자이드(N3) 작용기가 결합된 마스킹물질을 포함하는 용액을 혼합하여 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하되, 상기 전달물질이 당화합물을 포함하고, 상기 알부민이 아자이드 작용기와 결합되는 경우, 상기 전달물질 및 마스킹물질은 사이클로옥타인 작용기와 결합되고, 상기 알부민이 사이클로옥타인 작용기와 결합되는 경우, 상기 전달물질 및 마스킹물질은 아자이드 작용기와 결합된, 알부민 나노플랫폼의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 (3) 단계에서, 알부민 및 마스킹물질의 몰비는 1:10 내지 1:100일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 알부민 나노플랫폼을 포함하는 마크로파지 관련 질환의 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다. 이 때 상기 마크로파지 관련 질환은 급성신장염, 치주염, 근감소증, 췌장암, 두경부암, 자궁내막암, 골암, 유방암, 중추 또는 말초 신경계 암, 소화기암, 생식세포암, 선암, 혈액암, 신장-요로 암, 간암, 폐암, 흉막암, 전립선암, 육종 및 피부암에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼은 알부민 표면의 다양한 당화합물을 단독 또는 조합하여 결합시킴으로써, 표적 염증세포에 대한 결합 특이성을 증가시킬 수 있으며, 당화합물이 결합되지 않은 클릭반응 작용기를 비활성화시킴으로써 세망내피계에 의한 섭취를 감소시킬 수 있어 체내 off-target 효과를 줄여 마크로파지 표적 특이성을 향상시킴으로써 표적 조직 또는 세포에 타겟 분자 또는 활성물질을 효과적으로 전달하여 우수한 치료 및 진단 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 클릭화학반응으로 다양한 조합의 당화합물을 표면에 결합시킨 알부민 플랫폼의 복합당화 여부를 확인한 UV 스펙트럼 분석 결과로, 도 1a는 3개의 만노스를 기본으로 6개의 갈락토오스 또는 글루코오스 조합으로 당화된 알부민의 UV 스펙트럼이며, 도 1b는 6개의 만노스를 기본으로 3개의 갈락토오스 또는 글루코오스 조합으로 당화된 알부민의 UV 스펙트럼 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다양한 조합으로 복합 당화된 알부민을 마스킹하고 마스킹에 따른 알부민의 물리적 성질을 확인한 UV 스펙트럼 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 다양한 조합으로 복합 당화된 알부민의 마크로파지에 대한 결합 특이성을 확인하기 위해 타입별 마크로파지에 섭취된 복합 당화 알부민 수준을 확인한
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 다양한 조합으로 복합 당화시킨 후 마스킹한 알부민 중 TAM에 대한 특이성을 나타내는 조합을 확인하기 위해, TAM에 섭취된 복합 당화 알부민 수준을 확인한 FACS 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 알부민과 6개의 만노스가 결합된 알부민의 마스킹 여부에 따른 TAM 특이성을 확인하기 위해, TAM에 섭취된 비마스킹 또는 마스킹된 복합 당화 알부민 수준을 확인한 FACS 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 마스킹 유뮤에 따른 결합특이성을 확인한 FACS 결과로 도 6a는 복합 당화된 알부민의 마스킹 전 섭취 경향을 확인한 결과이며, 도 6b는 복합 당화된 알부민의 마스킹 후 섭취 경향을 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 구체적인 구현 형태에 대해서 보다 상세히 설명한다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라, 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 특정 마크로파지에 대한 결합 특이성을 증가시킨 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼을 제공한다.
마크로파지는 크게 염증성 M1 타입과 항염증성 M2 타입으로 나뉘는데 주변 환경의 자극에 따라 재분화(repolarization)을 통해 타입을 변화시킬 수 있고, 이러한 마크로파지 타입 변화가 직접적으로 병인기전이 되기도 한다.
본 발명자들은 당화합물이 결합된 알부민이 타입별 마크로파지에 특이적으로 결합하는 것을 확인하고, M1, M2 또는 TAM 타입별 마크로파지를 선택적으로 타겟팅할 수 있는 최적의 당화합물 또는 당화합물의 조합을 확인하였다.
구체적으로 본 발명에서는 전달물질인 당화합물의 조합을 다양하게 구성하여 알부민 표면에 결합시킨 나노플랫폼을 제공함에 따라, 특정 마크로파지의 비정상적인 활성에 의해 유도되는 여러 자가 면역, 기타 염증성 질환이나 암질환의 진단 또는 치료에 활용될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 선행연구에서 알부민 표면의 아민 작용기와 반응하여 클릭화된 표면 작용기를 가지는 알부민 나노플랫폼을 제안한 바 있다(등록특허공보 제10-1879682호, 알부민 기반 질환 추적 진단 또는 치료 나노플랫폼). 선행연구에서는 알부민과 클릭 작용기가 1:1 내지 1:12의 몰비로 반응하는 것을 제안하였는데, 이는 그 이상의 몰비를 이용한 반응에서는 세망내피계로의 빠른 섭취로 인하여 나노플랫폼의 활용도가 크게 제한되는 문제가 있었기 때문이다.
그러나, 다양한 타겟 물질 혹은 약물로 클릭화된 작용기를 도입하기 위해서는 1:12 이상의 몰비로 클릭 반응기를 반응시켜 알부민 표면에 9개 이상의 많은 클릭화된 작용기를 도입하는 것이 더욱 효과적이다.
따라서, 본 발명에서는 알부민의 표면에 다수의 클릭반응 작용기를 결합시키면서도 간에서의 섭취율을 감소시키고 체내 반감기가 크게 개선된 알부민 나노플랫폼을 제공하고자 하였다.
구체적으로, 본 발명에서는 알부민 표면에 결합된 클릭반응 작용기에 다양한 당화합물을 결합시킨 복합 당화 알부민 나노플랫폼의 체내 반감기를 증가시키기 위해 알부민 나노플랫폼의 표면의 당화합물이 결합되지 않은 클릭반응 작용기에 마스킹물질을 결합시켜 이를 비활성화시킴으로써 세망내피계에 의한 섭취를 감소시켜 체내 off-target 효과를 줄여 당화합물이 결합된 알부민의 마크로파지 표적 특이성에 도움을 줄 수 있는 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼을 제공하고자 하였다.
이와 같은 측면에서, 본 발명은 아자이드(N3) 또는 사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기가 결합된 알부민(albumin)과, 아자이드(N3) 또는 사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기가 결합된 전달물질의 클릭 화학(click chemistry) 반응에 의해 얻어지는 알부민 나노플랫폼으로서, 상기 알부민이 아자이드 작용기와 결합되는 경우, 상기 전달물질은 사이클로옥타인 작용기와 결합되고, 상기 알부민이 사이클로옥타인 작용기와 결합되는 경우, 상기 전달물질은 아자이드 작용기와 결합되며, 상기 전달물질이 당화합물을 포함하고, 상기 알부민에 결합된 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기 중 전달물질이 결합되지 않은 작용기의 하나 이상이 불활성화된 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼을 제공한다.
알부민(albumin)은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로, 혈액 중에 매우 많이 존재하며, 간에서 생성되는 단백질을 의미한다. 상기 알부민은 자연상태에 존재하는 단순 단백질 중 가장 분자량이 적다. 혈액 중의 혈청알부민은 혈장부피를 유지하고 회복시키는 기능이 있어서 과다 출혈에 따른 쇼크를 방지하고 수술 및 화상치료 등에 사용된다. 또한 헤모글로빈과 유사한 산소전달 능력을 갖는 것으로 알려져 있다.
상기 알부민은 제제화가 가능한 모든 알부민을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 인간 혈장으로부터 유래한 것이거나, 유전자 조작에 의해 제조된 재조합 인간혈청알부민일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 알부민에 대한 유전적 정보는 NCBI GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
알부민의 표면에 노출된 아미노기(-NH2)는 15 내지 35개일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 생체적합성을 갖는 알부민을 기반으로 생체 내 표적 조직을 타겟하여 약물 또는 형광물질과 같은 전달물질을 전달하여 질환을 치료하거나 진단하는 효과를 나타낼 수 있는 나노플랫폼을 제조하고자, 대표적인 인간혈청알부민(human serum albumin, HSA)을 사용하였으며, 인간혈청알부민의 표면에 클릭화학(Click chemistry)의 한쪽 작용기인 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 또는 아자이드(N3)기를 HSA의 변성을 최소화한 반응 조건으로 도입하였다.
본 발명에서, 아자이드(azide, N3)는 질소 3개에 의해서 이루어진 반응기로, 높은 반응성을 가지며, 특히 Cu-Free click chemistry의 일종인 1,3-dipolar cycloaddition 반응에서 전자공여체(electron donor) 역할을 하여 triaza-5-membered ring을 만드는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기는 ring strain을 받고 있는 삼중결합을 포함하는 8원 지방족 고리로, 특히 Cu-Free click chemistry의 일종인 1,3-dipolar cycloaddition 반응에서 전자수용체(electron acceptor) 역할을 하여, triaza-5-membered ring을 만드는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 사이클로옥타인의 구조적 특징, 즉 ring strain을 받고 있는 삼중결합 구조로 인하여 Cu(I) 촉매 없이도 click chemistry를 가능하게 한다.
사이클로옥타인 작용기는 4-cyclooctyn-1-yl(), 3-cyclooctyn-1-yl(), 2-cyclooctyn-1-yl(), Monofluorinated cyclooctyne(MOFO)(), Difluororinated cyclooctyne(DIFO)(), Dimethoxyazacyclooctyne(DIMAC)(), Dibenzocyclooctyne(DIBO)(), Azadibenzocyclooctyne(ADIBO)기() 및 biarylazacyclooctynone(BARAC)()로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
아자이드(N3) 또는 사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기가 결합된 알부민은, (a) 알부민을 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)에 녹이는 단계, (b) 아자이드-NHS 또는 사이클로옥타인-NHS를 DMSO에 녹이는 단계, 및 (c) 얻어진 용액을 혼합한 후, 20 내지 37℃에서 4 내지 24시간 동안 반응시키는 단계에 의해 얻어질 수 있다.
(a) 단계에서 인산완충용액(PBS)은 pH 6.8 내지 7.6일 수 있고, 바람직하게는 pH 7.0 내지 7.4일 수 있다.
(b) 단계에서 아자이드-NHS 용액 또는 사이클로옥타인-NHS 용액을 제조하는데 사용되는 DMSO의 양은 전체 반응 용액의 2%(v/v) 이하일 수 있다.
(c) 단계에서 알부민과 아자이드-NHS 또는 사이클로옥타인-NHS의 혼합 몰비율은 1:1 내지 1:30일 수 있다.
(c) 단계에서 알부민 용액과 아자이드-NHS 용액을 혼합시킬 경우, 알부민에 결합된 작용기가 아자이드 작용기일 수 있고, (c) 단계에서 알부민 용액과 사이클로옥타인-NHS 용액을 혼합시킬 경우, 알부민에 결합된 작용기가 사이클로옥타인 작용기일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간혈청알부민(HSA) 용액과 ADIBO-NHS 용액을 혼합시키고, 실온에서 4시간 동안 반응시켜, HSA-ADIBO를 제조하였다.
본 발명에서, 이와 같은 방법에 의해 알부민 표면에 도입된 클릭반응 작용기(아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기)의 개수는 1 내지 30개인 것이 바람직하고, 9 내지 20개인 것이 보다 바람직하다.
본 발명자의 선행기술에서는 클릭반응 작용기의 개수가 10개를 초과하는 경우 체내 주입 시 바로 간에 섭취되어 다른 타겟 질환 부위로의 섭취가 제한될 수 있기 때문에 클릭반응 작용기의 개수를 제한하였다. 그러나, 본 발명에 따르면 전달물질이 결합되지 않은 클릭반응 작용기를 불활성화시킴으로써 간 섭취가 제한되기 때문에, 다수의 클릭반응 작용기를 도입함으로써 보다 다양한 전달물질을 결합할 수 있으며 동시에 세망내피계에 의한 섭취를 감소시켜 체내 off-target 효과를 줄여 체내 잔존 기간도 길어지는 효과가 있다.
알부민 표면에 도입된 클릭반응 작용기의 개수는 알부민과 아자이드-NHS 또는 사이클로옥타인-NHS의 반응 비율에 따라 조절할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 전달물질은 당화합물을 포함한다. 상기 당화합물은 만노실기(mannosyl group), 갈락토실기(galactosyl group) 또는 글루코실기(glucosyl group)일 수 있다. 만노실기, 갈락토실기 및 글루코실기의 구조는 각각 아래의 식 1 내지 3에 나타낸 바와 같다.
[식 1]
[식 2]
[식 3]
이와 같은 당화합물 전달물질로 인해, 본 발명의 일 양태인 알부민 나노플랫폼이 마크로파지에 대한 표적능을 갖게 되며, 이에 대해서는 본 발명자의 선행연구인 등록특허공보 제10-2366189를 통해 상세히 밝힌 바 있다.
구체적으로, 만노실기, 갈락토실기 또는 글루코실기를 전달물질로서 포함하는 알부민 나노플랫폼은 특정 타입의 마크로파지에 대한 특이적 표적능을 갖게 되며, 이를 통해 표적 마크로파지로의 약물 전달이 가능해지고, 그 결과 마크로파지와 연관된 자가면역질환, 염증성 질환 또는 암 질환에 대한 선제적 진단 및 치료를 위한 플랫폼으로 기능할 수 있다.
만노즈(mannose) 수용체는 방어기제를 담당하는 세포에 많이 분포되어 있는 것으로 알려져 있으며, 그 중 대표적인 면역 세포가 쿠퍼성 세포(Kupffer cells)이다. 전달물질이 만노실기인 경우, 쿠퍼성 세포에 표적 작용하기 때문에 대부분 간에서 작용하지만, 혈액, 근육, 비장, 폐에서도 작용이 일어날 수 있다.
또한, 전달물질이 갈락토실기인 경우, 쓸개(Gall bladder)를 통한 감답즙 배출(hepatobiliary excretion)을 나타낼 수 있다.
전달물질로 글루코실기가 결합된 경우, 표면에 GLUT (Glucose Transporter)가 과발현되어 있는 M1 타입 마크로파지에 대한 표적능을 갖게 되며, 이를 통하여 손상된 조직 내 염증성 마크로파지에 선택적으로 섭취되어, 염증성 마크로파지에 의해 유도되는 염증 반응 및 ROS 생성을 억제하여 손상된 미토콘드리아의 기능을 회복시키고, 손상 조직의 세포사를 억제하여 심각한 질환으로의 진행을 예방하거나 치료할 수 있는 나노플랫폼으로 사용이 가능하다.
본 발명에서는 이와 같이 표적 선택성을 갖는 당화합물을 전달물질로 결합시킨 알부민 나노플랫폼에 대하여, 전달물질이 결합되지 않은 클릭반응 작용기를 비활성화시킬 경우, 당화합물의 종류에 따른 표적 선택성이 변경되거나 더욱 증대될 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 선행연구에서, 알부민 나노플랫폼 표면의 클릭반응 작용기 중에서 전달물질이 결합되지 않은 클릭반응 작용기를 불활성화시킴으로써 다수의 클릭반응 작용기를 도입함으로써 보다 다양한 전달물질을 결합할 수 있으며 동시에 체내 잔존 기간도 길어지는 효과가 있음을 확인한 바 있다(특허출원 제10-2024-0004801호).
그런데, 본 발명에서 당화합물을 전달물질로 결합시킨 알부민 나노플랫폼에 대하여 전달물질이 결합되지 않은 클릭반응 작용기를 불활성화시킨 경우, 체내 잔존기가 길어지는 효과에 더하여 추가적으로, 세망내피계에 의한 섭취를 감소시켜 체내 off-target 효과를 줄여 당화합물의 종류에 따른 표적 선택성이 변경되거나 더욱 증대되는 예측하지 못했던 새로운 효과를 발견하였다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 상기 전달물질은 만노실기를 포함할 수 있다. 상기 전달물질이 만노실기를 포함하는 경우 M2 마크로파지 또는 종양관련 마크로파지(TAM)를 선택적으로 타겟팅할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는, 전달물질로서 결합되는 만노실기의 개수가 3개인 경우 M2 마크로파지를 우선적으로 타겟팅하지만, 만노실기의 개수가 6개로 늘어난 경우 종양관련 마크로파지(TAM)를 우선적으로 타겟팅하며, 나아가, 만노실기의 개수가 6개인 경우 다른 당화합물이 결합되더라도 만노실기의 경향성을 따른다는 것을 확인하였다.
이와 같은 측면에서, 상기 만노실기는 1 내지 10개 결합될 수 있으나, 원하는 타겟팅 마크로파지 타입에 따라 그 개수를 조절할 수 있다. 예를 들어, M2 마크로파지를 타겟팅하려는 경우 만노실기는 1 내지 4개가 바람직하다. 또한, TAM 마크로파지를 타겟팅하려는 경우 만노실기는 5 내지 10개 결합하는 것이 바람직하다. 본 발명의 실험예에서는 또한, 만노실기의 수가 많다고 더 좋은 효과가 나타나는 것은 아니며 만노실기가 6개 결합될 때 가장 우수한 타겟 선택능이 나타난다는 것을 확인하였다. 이와 같은 측면에서, 만노실기는 5 내지 7개 결합되는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 나노 플랫폼은 또한, 전달물질로서 만노실기 외에 갈락토실기 또는 글루코실기를 더 포함할 수 있다. 전달물질로서 만노실기에 더하여 갈락토실기 또는 글루코실기를 더 포함하는 경우, 만노실기의 개수와 관계 없이 종양관련 마크로파지(TAM)를 선택적으로 타겟팅하게 된다. 즉, 만노실기의 개수가 3개인 경우 M2 마크로파지를 타겟팅하지만, 만노실기 3개에 갈락토실기 또는 글루코실기가 3개 결합되는 경우 TAM 마크로파지를 우선적으로 타겟팅한다.
이 때 상기 갈락토실기 또는 글루코실기는 1 내지 6개 포함될 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 4개 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 상기 전달물질은 만노실기, 갈락토실기 및 글루코실기를 모두 포함할 수 있다. 이와 같이 3종류의 당화합물을 모두 결합시킨 알부민 나노플랫폼은 M2 마크로파지를 타겟팅하게 된다. 즉, 만노실기의 개수가 3개 결합되더라도 갈락토실기 및 글루코실기가 각각 3개 결합되는 경우 M2 마크로파지를 우선적으로 타겟팅한다는 것을 실험적으로 확인하였다.
이와 같이, 본 발명에서는 당화합물의 종류와 개수를 조절함으로써 원하는 타입의 마크로파지를 선택적으로 타겟팅할 수 있으며, 이와 같은 마크로파지에 대한 선택성은 마스킹 작업에 의해 더욱 확대될 수 있다.
본 발명에서는 알부민 표면에 결합된 클릭반응 작용기에 마스킹물질을 반응시켜 이를 불활성화시킬 수 있다. 상기 마스킹물질은 클릭반응 작용기를 불활성화시킬 수 이는 물질을 사용할 수 있으며, 구체적으로 아미노기(-NH2), 카르복실기(-COOH) 및 하이드록시기(-OH)로 이루어진 군에서 선택되는 치환기를 갖는 물질이다. 특히, 클릭반응 작용기를 알부민의 표면으로 인식할 수 있도록 한다는 측면에서 아미노기를 갖는 것이 가장 바람직하다. 상기 아미노기 및 카르복실기를 포함하는 화합물로는 예를 들어 라이신(Lysine)을 사용할 수 있으며, 하이드록시기를 포함하는 화합물로는 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 사용할 수 있다.
상기 마스킹물질은 알부민 나노플랫폼 표면에 전달물질과 결합하지 않는 클릭반응 기능기와 반응하여 이를 비활성화시키고, 알부민 나노플랫폼을 기존의 아미노기 또는 카르복실기 작용기를 갖는 알부민 표면 상태로 되돌려 놓음으로써, 전달물질의 타켓팅 또는 치료 능력에는 영향을 미치지 않으면서, 세망내피계에 의한 섭취를 감소시켜 알부민 나노플랫폼의 체내 반감기를 크게 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명에서는 당화합물을 전달물질로 사용할 경우의 체내 off-target 효과를 줄여 표적 선택성을 더 증폭시킬 수 있는 효과를 추가적으로 확인하였다.
본 발명에서, 알부민 나노플랫폼은 전술한 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기가 결합된 알부민을 포함하는 용액과, 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액을 혼합하여 클릭 화학(click chemistry) 반응시켜 얻어지며, 여기서 클릭 화학 반응은 구리 촉매 없는(Cu-free) 클릭 화학 반응일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서 클릭 화학 작용기로 사용하는 아자이드 작용기는 전자공여체(electron donor)이고, 사이클로옥타인 작용기는 전자수용체(electron acceptor)이므로, 알부민에 결합된 작용기가 아자이드 작용기인 경우, 전달물질에 결합된 작용기는 사이클로옥타인 작용기인 것이 바람직하고, 알부민에 결합된 작용기가 사이클로옥타인 작용기인 경우, 전달물질에 결합된 작용기는 아자이드 작용기인 것이 바람직하다.
다음으로, 상기 전달물질이 결합된 알부민 나노플랫폼 용액에 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기가 결합된 마스킹물질을 포함하는 용액을 혼합하여 클릭 화학 반응시켜 표면 개질된 알부민 나노플랫폼을 얻을 수 있다. 이 때, 마스킹물질에 결합된 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기는 전달물질에 결합된 작용기와 동일한 것이 바람직하다.
예를 들어, 아자이드가 결합된 마스킹물질로는 H-L-Lys(N3)-OH, H-L-Aha-OH, H-L-Lys(N3)-OH*HCl, H-L-Aha-OH*HCl, H-L-Phe(4-N3)-OH, 3-아지도-1-프로판올(3-azido-1-propanol), 3-아지도프로피오닉산(3-azidopropionic acid) 등을 사용할 수 있으며, 상기 화합물은 PEG를 링커로서 포함할 수 있다.
이와 같은 측면에서, 본 발명의 알부민 나노플랫폼은 (1) 아자이드(N3) 또는 사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기가 결합된 알부민(albumin) 용액을 준비하는 단계; (2) 상기 단계 (1)에서 제조된 용액에 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 작용기 또는 아자이드(N3) 작용기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액을 혼합하여 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계; 및 (3) 전달물질이 결합된 알부민 용액에 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 작용기 또는 아자이드(N3) 작용기가 결합된 마스킹물질을 포함하는 용액을 혼합하여 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계에 의해 제조될 수 있다.
이 때, 상기 단계 (1)에서 알부민 단량체에 아자이드(N3)기가 결합된 용액을 이용할 경우 상기 단계 (2) 및 (3)에서는 사이클로옥테인(Cyclooctyne)기가 결합된 전달물질 및 마스킹물질을 포함하는 용액과 반응시키는 것이 바람직하고, 상기 단계 (1)에서 알부민 단량체에 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 작용기가 결합된 용액을 이용할 경우 상기 단계 (2) 및 (3)에서는 아자이드(N3) 작용기가 결합된 전달물질 및 마스킹물질을 포함하는 용액과 반응시키는 것이 바람직하다.
상기 (3) 단계에서 전달물질이 결합된 알부민 및 마스킹물질은 1:10 내지 1:100의 몰비율, 바람직하게는 1:20 내지 1:60의 몰비율로 혼합할 수 있다. 이는 알부민 표면에 결합된 클릭반응 작용기 중에서 전달물질이 결합되지 않은 작용기의 수에 따라 조절할 수 있으며, 가급적 모든 클릭반응 작용기를 불활성화시킨다는 의미에서 과량의 마스킹물질을 사용하는 것이 좋다. 예를 들어, 알부민 및 마스킹물질의 몰비율은 1:30 내지 1:50일 수 있다. 상기 몰비율 범위로 알부민 및 마스킹물질을 반응시킬 경우, 2 내지 6시간의 빠른 속도로 알부민 표면의 전달물질이 결합되지 않은 모든 클릭반응 작용기를 불활성화시킬 수 있다.
상기 (3) 단계 반응은 알부민 안정성을 유지하기 위해 pH 6 내지 7 조건에서 수행될 수 있다. 상기 pH 범위보다 높을 경우 알부민의 열변성이 나타날 수 있고, 상기 pH 범위보다 낮을 경우, 산성화에 따른 분해 및 산화적 손상이 나타날 수 있다.
또한, (3) 단계의 반응 온도는 0 내지 60℃에서 수행될 수 있으나, 알부민의 안정성을 유지시키면서 보다 신속한 클릭반응 작용기와 마스킹물질의 결합 반응을 유도하기 위해서는 상온에서 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 알부민 나노플랫폼은 다수의 클릭반응 작용기를 가지기 때문에 당화합물 외에도 다양한 전달물질을 추가로 결합시킬 수 있다.
알부민 나노플랫폼에 결합된 전달물질이 2개 이상 물질의 조합일 경우에는 2개 이상의 물질의 조합을 동시에 알부민 나노플랫폼에 결합시키거나, 각 물질을 순차적으로 결합시킬 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 당화합물 외에 추가로 결합 가능한 전달물질은 표적 분자, 활성물질, 방사성 동위원소, 형광물질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 용어, "표적 분자"는 생체 내 특정 환경을 표적하는 분자를 의미하며, 구체적으로 생체 내 특정 환경에 존재하는 물질을 표적하여 본 발명의 알부민 나노플랫폼의 해당하는 특정 환경으로 유도하는 분자를 의미한다. 본 발명의 표적분자는 본 발명의 알부민 나노플랫폼을 특정 환경으로 유도하거나, 특정 환경의 유무, 특정 환경의 위치, 특정 환경의 정도 등을 확인할 수 있다. 본 발명에서 표적 분자가 표적하는 생체 내 특정 환경은 조직 특이적 특정 환경이거나 질환 특이적 특정 환경일 수 있다. 즉, 표적 분자는 조직 특이적으로 존재하는 물질을 표적하거나, 질환 특이적으로 존재하는 물질을 표적하는 것일 수 있다. 조직 특이적으로 존재하는 물질이란 조직 특이적으로 존재하는 단백질, RNA, 축적되거나 생성되는 화합물 등일 수 있고, 질환 특이적으로 존재하는 물질이란 질환 종류에 따라 존재하는 단백질, RNA, 축적되거나 생성되는 화합물 등일 수 있다.
특히, 본 발명에서 표적 분자는 암조직에 다수 존재하는 엽산 수용체를 표적하는 엽산(folate) 또는 이의 유도체, 또는 RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid) 또는 이의 유도체 일 수 있다.
본 발명에서, 상기 전달물질로서 엽산을 결합시킬 수 있다.
엽산은 비타민의 일종으로, 비타민 B9 또는 비타민 M이라고도 불린다. 엽산은 엽산 수용체와 특이적 결합을 이룬다. 엽산 수용체는 종양 관련된 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커 단백질로서, 결합된 엽산 또는 엽산 결합된 물질이 수용체-매개 엔도사이토시스를 통하여 섭취되도록 한다.
본 발명에서, 전달물질로서 RGD는 3개의 아미노산, 즉 아르기닌(L-arginine), 글라이신(glycine), 및 아스파르트산(L-aspartic acid)으로 구성된 트리펩티드로서 파이브로넥틴(fibronectin)의 세포부착부위에서 최초로 발견되었다. 이들은 종양 혈관의 내피세포층에 주로 발현되고 있는 인테그린 수용체(integrin receptor)에 강한 친화력을 가지고 있기 때문에 약물 표적형 치료와 간단한 시약과 같은 연구에 보편적 수단으로 많이 쓰이고 있다.
본 발명의 용어, "활성물질"이란 천연물, 비타민, 활성 약제, 생물제, 화합물, 아미노산, 단백질, 펩티드, 뉴클레오티드, 핵산, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 이들의 유사체, 동족체 및 유도체일 수 있으며, 특히 항비만 약물, 중추신경계 자극제, 카로티노이드, 코르티코스테로이드, 엘라스타제저해제, 항진균제, 종양 치료제, 항구토제, 진통제, 심혈관제, 항염증제, 구충제, 항부정맥제, 항생제, 항응고제, 항우울제, 항당뇨제, 항간질제, 항히스타민제, 항고혈압제, 항무스카린제, 항미코박테리아제, 면역억제제, 항갑상선제, 항바이러스제, 항불안제, 진정제, 수렴제, 알파-아드레날린성 수용체 차단제, 베타-아드레날린성 수용체 차단제, 혈액 제제, 심장수축촉진제, 조영매, 기침 억제제, 진단 시약, 진단 영상화제, 이뇨제, 도파민작동제, 지혈제, 면역반응제, 지질조절제, 근육이완제, 부교감신경흥분제, 항알러지제, 식욕억제제, 교감신경흥분제, 갑상샘제, 혈관확장제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서, 전달물질로서 방사성 동위원소는 킬레이트제에 의해 표시될 수 있다.
방사성 동위원소는 원자번호가 같지만 원자량이 다른 원소를 말하고, 동위원소 중 방사능이 있는 것을 방사성 동위원소라 한다. 이러한 방사성 동위원소는 감마선이나 다른 아원자입자를 방출하여 방사성을 감쇠하는 특성을 이용하여 질병을 진단하거나 약물동력학을 확인하는 데 중요한 표지자로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 표지자로 사용할 수 있는 방사성 동위원소는 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용 가능하며, 3H,　11C,　18F,　14Cl,　32P,　35S,　36Cl,　45Ca,　51Cr,　57Co,　58Co,　59F,　64Cu, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 90Y,　99Mo,　99mTc,　111In,　131I,　125I,　124I,　123I,　186Re,　188Re, 225Ac, 212Pb, 117mSn, 및　177Lu로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 11C,　18F,　64Cu,　67Ga,　68Ga,　89Zr,　99mTc,　111In 및　123I 등일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
킬레이트제는 방사성 동위원소를 알부민에 연결하는 역할을 하는 것으로, 예를 들어, NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DFO (3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea), DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), N2S2 (diaminedithiol), p-SCN-Bn-NOTA (2-(4'-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), p-SCN-Bn-DOTA (2-(4'-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), TETA (1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid), p-SCN-Bn-DTPA (2-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaacetic acid), p-SCN-Bn-DFO (1-(4-Isothiocyanatophenyl)-3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[Nacetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea) 및 HYNIC (hydrazinonicotinic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 전달물질은 형광물질을 더 포함할 수 있다.
형광물질은 특정 파장에 대하여 특정 가시광선의 파장을 발하는 물질을 말하며, 본 발명에서는 알부민 기반 마크로파지 타겟팅용 나노플랫폼에 결합하여 나노플랫폼의 위치를 확인하는데 사용될 수 있는 형광물질을 모두 포함한다.
구체적으로 본 발명에서 표지자로 사용할 수 있는 형광물질은 당업계에 공지된 것이라면 제한 없이 사용 가능하며, 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA) 등을 포함하는 로다민계; 플루오세인, FITC(fluorescein isothiocyanate) 및 FAM(fluorescein amidite) 등을 포함하는 플루오세인계(fluorescein); 보디피계(bodipy, boron-dipyrromethene); 알렉사플로어계(alexa fluor); 및 Cy3, Cy5, Cy7, 인도시아닌그린을 포함하는 시아닌계(cyanine) 등의 형광물질을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼은 다양한 조합의 당화합물을 결합시켜 특정 마크로파지에 대한 결합 특이성을 증가시켰으며, 당화합물이 결합되지 않은 클릭화학반응 작용기를 마스킹함으로써, 체내 반감기를 증가시켰기 때문에 표적 분자 및/또는 활성 물질을 장기간 체내에 유지하도록 하고 체내 off-target 효과를 줄여 높은 표적 섭취를 가능하게 하여 질환의 진단 또는 치료를 위한 조성물로서 활용될 수 있다.
상기 질환은 본 발명의 알부민 나노플랫폼에 결합되는 전달물질에 의해 타켓팅, 진단 또는 치료될 수 있는 어떠한 질환이든 제한되지 않으며, 특히 마크로파지 관련 질환일 수 있다. 예를 들어, 상기 질환은 급성신장염, 치주염, 근감소증 등과 같은 염증성 질환 또는 췌장암, 두경부암, 자궁내막암, 골암, 유방암, 중추/말초 신경계 암, 소화기암, 생식세포암, 선암, 혈액암, 신장-요로 암, 간암, 폐/흉막암, 전립선암, 육종, 피부암 등의 암일 수 있다.
이와 같이 본 발명의 방법으로 제조된 알부민 나노플랫폼은 다양한 조합의 당화합물을 결합시켜 표적 마크로파지에 대한 결합 특이성을 증가시켰으며, 알부민 표면에 당화합물이 결합되지 않은 클릭작용기를 비활성화시킴으로써, 알부민에 과량의 클릭작용기와 다양한 전달물질을 결합시키더라도 세망내피계에 의한 섭취를 감소시킬 수 있으며, 체내 off-target 효과를 줄여 표적 조직 또는 세포에 타겟 분자 또는 활성물질을 표적 마크로파지에 효과적으로 전달하여 우수한 치료 및 진단 효과를 얻을 수 있다.
실시예
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 구성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 복합당화 알부민 나노플랫폼 제조
1-1. ADIBO 작용기가 도입된 알부민 제조
인간혈청알부민(HSA)을 5mg/0.5mL 농도로 PBS에 용해시키고 Ependorf(EP) 튜브에 알부민 0.5mL를 분주한 후 DMSO에 용해시킨 ADIBO-NHS를 1:14의 몰비율로 첨가하고 vortexing하여 빠르게 분산시켰다. 이후 1분간 초음파 처리한 후 실온에서 4시간 동안 교반하여 반응시키고, 30kDa 원심분리 필터를 이용하여 정제하였다.
정제된 알부민을 새로운 EP 튜브에 0.5mL씩 옮긴 후 UV-Vis spectrophotometric 방법(A280, A310)과 MALDI-TOF로 HSA-ADIBO에 도입된 ADIBO 작용기의 개수를 정량한 결과, 약 11개의 ADIBO가 결합한 것을 확인하였다.
1-2. 복합 당화 알부민 제조
HSA-ADIBO를 PBS에 용해시키고, Man-N3 (1-O-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)-alpha-D-mannopyranoside)를 1:4 및 1:8의 HSA-ADIBO:Man-N3 몰비로 혼합한 후, 37℃에서 1시간 반응시킨 후 원심분리 필터 튜브로 정제하고, 각각 Man이 도입된 알부민의 분자량에 AD(11)-Alb의 분자량을 빼고, Man-N3의 분자량으로 나누어 알부민 당 도입된 개수를 정량한 결과, 만노실기가 각각 3.6 및 6.3 개가 결합된 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같이 준비된 만노실기 알부민에 글루코실기(Glc)-N3 및 갈락토실기(Gal)-N3을 각각 1:4 내지 1:8 몰비로 반응시켜 복합 당화 알부민을 제조하였다.
제조된 알부민을 새로운 EP 튜브에 0.5mL씩 옮긴 후 UV-Vis spectrophotometric 방법(A280, A310)으로 확인한 결과, 도 1a 및 도 1b와 같이 검은색 그래프인 AD(11)-Alb의 경우 280과 310에서 각각 알부민과 ADIBO 특성화 peak를 확인하였다. 또한, 도 1a에서는 3개의 Man로 구성 후 Gal과 Glu를 각각 6개씩 도입한 경우(Man(3)Gal(6) 및 Man(3)Glu(6)), 상기 특성화 peak 가 낮아지는 것을 확인할 수 있으며, 도입된 당화 개수가 같을 경우, 구성과 상관없이 UV 그래프가 매우 일치하는 것을 확인하였다.
다음으로 복합 당화 알부민에 형광을 결합하여 UV-Vis spectrophotometric 방법으로 복합 당화 여부를 확인하기 위해 N3-FNR648(10nmol/1μL, DMSO에 용해)을 Man(3)Gal(6) 및 Man(3)Glu(6)(30nmol/500μL)에 첨가하고 4℃에서 30분간 배양한 후 원심여과관으로 정제하고, UV-Vis spectrophotometric 방법을 수행하고 UV 스펙트럼을 도 1a에 나타내었으며, 648 영역에서 형광 흡광을 나타내는 peak를 확인할 수 있었다.
또한, 6개의 Man로 구성한 후 Gal과 Glc를 각각 3개씩 도입한 알부민((Man(6)Gal(3) 및 Man(6)Glu(3))의 UV 스펙트럼을 나타낸 도 1b에서도 상기 도 1a와 같은 경향성을 나타내는 확인할 수 있었다.
제조예 2: 복합 당화 알부민 나노플랫폼 마스킹
제조예 1-2와 같이 준비된 복합 당화 알부민 나노플랫폼을 N3-NH2로 마스킹(masking)하였다.
증류수에 100mg/88μL 농도로 용해시킨 3-아지도-1-프로판아민(3-Azido-1-propanamine) 50μL를 3 및 6개의 Man을 결합시킨 후 Gal 또는 Glc를 3 내지 6개씩 결합시켜 복합 당화한 Alb-ADIBO(2mg/0.8ml)에 첨가한 후 4℃에서 blocking하고 10000rpm으로 4℃에서 3분간 원심분리하여 마스킹된 복합 당화 알부민을 얻었다.
다음으로, UV-Vis spectrophotometric 방법(A280 및 A310)을 수행하여 마스킹된 복합 당화 알부민 피크를 도 2와 같이 확인하였다.
도 2를 참고하면, 각각 구성이 다른 당화합물이 효과적으로 도입된 것을 확인할 수 있었으며, 마스킹 후의 물질 상태(물리적성질)가 모두 동일한 것을 확인할 수 있었다. 또한, ADIBO의 특성피크인 310 영역의 UV가 모두 사라진 것이 확인됨에 따라, 균일하고 효과적으로 마스킹된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 1: 다양한 구성의 복합당화 알부민의 타겟능 확인
복합 당화된 알부민 나노플랫폼의 당 개수가 알부민 나노플랫폼의 uptake에 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 다양한 구성으로 복합 당화된 알부민을 마스킹한 후 M1, M2 및 TAM 세포에 처리하여 uptake 양상을 확인하였다.
구체적으로, 7일동안 m-csf로 분화시킨 골수 유래 마크로파지(BMDM)에 24시간 동안 LPS, IL-4 및 4T1 암세포 배양 배지를 처리하여 각각 M1, M2 및 TAM으로 분화시켰다.
제조예에서 제조한 6개의 만노스가 결합된 알부민(Man(6)), 6개의 갈락토오스가 결합된 알부민(Gal(6)), 6개의 글루코오스가 결합된 알부민(Glc(6)), 6개의 만노스 및 3개의 갈락토오스가 결합된 알부민(Man(6)Gal(3)), 6개의 만노스 및 3개의 글루코오스가 결합된 알부민(Man(6)Glc(3)) 및 9개의 만노스가 결합된 알부민(Man(9))에 형광을 결합한 후 분화시킨 M1, M2 및 TAM의 상층액에 각각 1nmol씩 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 상층액을 제거하고 PBS로 2회 세척하였다.
세척 후 각 웰에 트립신 100μL를 처리하고 37℃에서 3분간 인큐베이션 후 스크랩퍼를 이용하여 세포를 플레이트로부터 떼어내고 Flow cytometry(FACS)를 수행하여 얻은 형광값을 도 3에 나타내었으며, 형광값을 확인하여 마크로파지(macrophage)가 각 종류의 당화 알부민을 얼마나 uptake했는지 확인하였다.
도 3를 참고하면, 6개의 만노스가 결합된 Man(6)군에서 가장 높은 uptake 비율을 확인할 수 있었으며, 9개의 만노스가 결합된 Man(9)군보다 6개의 만노스가 결합된 Man(6)군에서 더 높은 uptake 비율이 나타남에 따라, 우수한 uptake 효율을 위한 최적의 당 결합 조건이 있을 것으로 예상되었다.
실험예 2: 복합당화 알부민의 선택적 타겟능을 위한 당 조건 확인
앞선 실험예 1에서 확인된 만노스 6개가 결합된 알부민(Man(6))의 높은 TAM 선택능이 만노스에 의한 것인지 혹은 작용기 개수가 6개일 때 효율이 높은 것인지를 확인하기 위해, TAM에서 Man(6)군의 uptake 수준을 Man(3)Gal(3) 및 Man(3)Glc(3)의 uptake 수준과 비교하였다.
또한, 마스킹 여부가 복합당화 알부민의 선택적 타겟능에 미치는 영향을 확인하기 위해 각 실험군을 마스킹한 후 비마스킹 실험군과 비교하였다.
7일 동안 m-csf로 분화시킨 골수 유래 마크로파지(BMDM)에 24시간 동안 4T1 암세포 배양 배지를 처리하여 TAM으로 분화시키고, Man(6), Man(3)Gal(3) 및 Man(3)Glc(3) 알부민에 형광 표지 후 세포에 1nmol씩 처리하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 Flow cytometry(FACS)를 수행하여 얻은 형광값을 도 4에 나타내었으며, 형광값을 통하여 TAM에 uptake된 Man(6), Man(3)Gal(3) 및 Man(3)Glc(3) 알부민의 수준을 확인하였다.
도 4를 참고하면, 6개의 만노스를 결합한 알부민(Man(6)) 실험군이 만노스 3개에 3개의 갈락토오스 또는 글루코오스가 결합된 알부민(Man(3)Gal(3) 및 Man(3)Glc(3))보다 TAM에서 높은 uptake 수준을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 3: 마스킹 여부에 따른 당화 알부민 나노플랫폼의 타겟능 확인
실험예 2에서 예상한 바와 같이 마스킹이 복합당화 알부민의 표적 세포에 대한 선택성을 증가시킬 수 있는 지를 확인하기 위해, 실험군 수를 증가시켜 uptake 수준을 확인하는 실험을 수행하였다(n=4).
구체적으로, 알부민과 6개의 만노스가 결합된 알부민(Man(6))을 마스킹하고 TAM에 처리한 후, Flow cytometry(FACS)를 수행하여 얻은 uptake 수준을 도 5에 나타내고, 비마스킹군과 비교하였다.
도 5를 참고하면, TAM에서 ABIDO 작용기가 표면에 노출되어 있는 비마스킹 알부민군에 비해 마스킹된 알부민군의 uptake가 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 마스킹이 마크로파지에 대한 복합당화 알부민의 비특이적 선택성을 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 마스킹된 알부민에 비해 마스킹된 Man(6)군의 uptake가 증가한 것을 확인하였으며, 이는 만노스가 마크로파지 중 TAM 타입을 특이적으로 인식하여 uptake되는 것임을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 마스킹이 복합 당화 알부민의 비특이적 uptake를 감소시킬 수 있으며, 이를 통해 복합 당화 알부민의 표적 세포에 대한 선택성을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
실험예 4: 마스킹된 복합 당화 알부민의 마크로파지 타입별 선택성 확인
복합 당화 후 마스킹 여부에 따라 알부민 나노플랫폼의 염증세포별 섭취 양상 변화를 확인하였다. 앞선 실험예 1과 같은 방법으로 마스킹된 복합 당화 알부민을 M1, M2 및 TAM으로 분화된 마크로파지에 처리하여 배양한 후 FACS를 수행하여 각 세포에 uptake된 복합 당화 알부민 수준을 확인하였다.
먼저, 마스킹을 통해 불활성화를 진행하지 않은 복합 당화 알부민의 형광 발현 수준 및 강도를 나타낸 도 6a를 참고하면, 결합된 당의 개수에 따라 발현 강도가 점차적으로 낮아지는 경향을 나타내었다.
반면, 마스킹을 통해 불활성화를 진행한 복합 당화 알부민의 경우, 도 6b에서 확인 가능한바와 같이 당의 결합 개수가 증가하더라도 발현 강도가 감소되지 않고 유지되는 것을 확인하였다.
또한, 당 마다 각각 3개의 당을 결합하였을 때의 선택성을 살펴보면, 도 6b에서 만노실기 3개가 결합된 경우 M2에 대한 선택성이 높은 것으로 나타났다. 이는 도 3에서 만노실기가 6개인 경우 TAM에 대한 선택성이 높은 것과 대비된다. 즉, 결합되는 만노실기의 개수에 따라 마크로파지 타겟팅에 대한 선택성이 달라진다는 것을 확인하였다.
또한, 만노실기가 3개 결합되더라도 갈락토실기 또는 글루코실기가 3개 결합될 경우(즉, 전체 당화합물의 개수가 6개인 경우) TAM에 대한 높은 선택성을 나타내었지만, 만노실기, 갈락토실기 및 글루코실기가 모두 3개씩 결합되어 총 9개의 당화합물이 결합된 경우는 다시 M2에 대한 선택성을 나타낸다는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 종합하면 알부민 당화에 있어서, 다양한 종류의 당화합물로 알부민을 당화시키는 것보다 특정 타입별 염증세포에 가장 적합한 당화합물의 종류 및 조합이 존재하며, 최적의 당화합물 종류 및 조합으로 당화된 알부민은 표적 염증세포에 대한 선택능을 더욱 향상시킬 수 있다.
이상 본 발명의 일부 구현 형태에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 바와 같은 구현형태에 대해서만 한정되는 것이 아니라 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 수정 및 변형하여 실시할 수 있으며, 그러한 수정 및 변형이 가해진 형태 또한 본 발명의 기술적 사상에 속하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (19)

  1. 아자이드(N3) 또는 사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기가 결합된 알부민(albumin)과, 아자이드(N3) 또는 사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기가 결합된 전달물질의 클릭 화학(click chemistry) 반응에 의해 얻어지되,
    상기 알부민이 아자이드 작용기와 결합되는 경우, 상기 전달물질은 사이클로옥타인 작용기와 결합되고, 상기 알부민이 사이클로옥타인 작용기와 결합되는 경우, 상기 전달물질은 아자이드 작용기와 결합되며,
    상기 전달물질이 당화합물을 포함하고,
    상기 알부민에 결합된 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기 중 전달물질이 결합되지 않은 작용기의 하나 이상이 불활성화된, 알부민 나노플랫폼.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 알부민에 도입된 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기가 1 내지 30 개인, 알부민 나노플랫폼.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 불활성화가 아미노기(-NH2), 카르복실기(-COOH) 및 하이드록시기(-OH)로 이루어진 군에서 선택되는 치환기를 갖는 마스킹물질을 알부민에 결합된 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기에 결합시켜 수행되는, 알부민 나노플랫폼.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 마스킹물질이 라이신(lysine) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)인, 알부민 나노플랫폼.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 마스킹물질의 결합이 아자이드 또는 사이클로옥타인 작용기가 결합된 마스킹물질을 전달물질이 결합된 알부민과 클릭 화학 반응시켜 수행되는, 알부민 나노플랫폼.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 알부민이 아자이드 작용기와 결합되는 경우, 상기 마스킹물질은 사이클로옥타인 작용기와 결합되고, 상기 알부민이 사이클로옥타인 작용기와 결합되는 경우, 상기 마스킹물질은 아자이드 작용기와 결합되는, 알부민 나노플랫폼.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 당화합물이 글루코실기(glucosyl group), 만노실기(mannosyl group) 및 갈락토실기(galactosyl group)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 알부민 나노플랫폼.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 알부민 나노플랫폼이 M1 타입 마크로파지, M2 타입 마크로파지 및 종양관련 대식세포(tumor associated macrophage, TAM)로 이루어진 군에서 선택되는 마크로파지를 타겟팅하는, 알부민 나노플랫폼.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 당화합물이 총 1 내지 10개 결합되는 알부민 나노플랫폼.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 당화합물이 만노실기를 4 내지 8개 포함하고, TAM 마크로파지를 타겟팅하는, 알부민 나노플랫폼.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 당화합물이 만노실기, 갈락토실기 및 글루코실기를 포함하고, M2 마크로파지를 타겟팅하는, 알부민 나노플랫폼.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 전달물질이 엽산 또는 이의 유도체, RGD(arginyl-glycyl-aspartic acid) 또는 이의 유도체, 활성물질, 방사성 동위원소 및 형광물질로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 알부민 나노플랫폼.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 방사성 동위원소가 3H,　11C,　18F,　14Cl,　32P,　35S,　36Cl,　45Ca,　51Cr,　57Co,　58Co,　59F,　64Cu, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 90Y,　99Mo,　99mTc,　111In,　131I,　125I,　124I,　123I,　186Re,　188Re, 225Ac, 212Pb, 117mSn, 및　177Lu로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 알부민 나노플랫폼.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 방사성 동위원소가 킬레이트제에 의해 표시되고, 상기 킬레이트제가 NOTA (1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DFO (3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[N-acetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea), DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), N2S2(diaminedithiol), p-SCN-Bn-NOTA (2-(4'-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA (1,4,7-triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), p-SCN-Bn-DOTA (2-(4'-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), TETA (1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid), p-SCN-Bn-DTPA (2-(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaacetic acid), p-SCN-Bn-DFO (1-(4-Isothiocyanatophenyl)-3-[6,17-dihyroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-[Nacetylhydroxylamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosane]thiourea) 및 HYNIC (hydrazinonicotinic acid)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 알부민 나노플랫폼.
  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 형광물질이 FNR(Ferrodoxin NADP(+) reductase), 시아닌(cyanine)계 형광 물질, TAMRA(tetramethylrhodamine-5-maleimide), Flamma® 형광 물질 및 ICG(indocyanine green)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 알부민 나노플랫폼.
  16. (1) 아자이드(N3) 또는 사이클로옥타인(cyclooctyne) 작용기가 결합된 알부민(albumin) 용액을 준비하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에서 제조된 용액에 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 작용기 또는 아자이드(N3) 작용기가 결합된 전달물질을 포함하는 용액을 혼합하여 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계; 및
    (3) 전달물질이 결합된 알부민 용액에 사이클로옥테인(Cyclooctyne) 작용기 또는 아자이드(N3) 작용기가 결합된 마스킹물질을 포함하는 용액을 혼합하여 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계
    를 포함하되,
    상기 전달물질이 당화합물을 포함하고,
    상기 알부민이 아자이드 작용기와 결합되는 경우, 상기 전달물질 및 마스킹물질은 사이클로옥타인 작용기와 결합되고, 상기 알부민이 사이클로옥타인 작용기와 결합되는 경우, 상기 전달물질 및 마스킹물질은 아자이드 작용기와 결합된,
    알부민 나노플랫폼의 제조방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서, 알부민 및 마스킹물질의 몰비가 1:10 내지 1:100인, 알부민 나노플랫폼의 제조방법.
  18. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 알부민 나노플랫폼을 포함하는 마크로파지 관련 질환의 진단 또는 치료용 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 마크로파지 관련 질환이 급성신장염, 치주염, 근감소증, 췌장암, 두경부암, 자궁내막암, 골암, 유방암, 중추 또는 말초 신경계 암, 소화기암, 생식세포암, 선암, 혈액암, 신장-요로 암, 간암, 폐암, 흉막암, 전립선암, 육종 및 피부암에서 선택되는, 질환의 진단 또는 치료용 조성물.
PCT/KR2025/004678 2024-04-05 2025-04-07 표면 최적화된 알부민 나노플랫폼 및 이를 포함하는 마크로파지 관련 질환의 타겟, 진단 또는 치료용 조성물 Pending WO2025211892A1 (ko)

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