WO2025138299A1 - 用于提升时空芯片h＆e染色图像质量的方法、试剂组合、试剂盒和装置 - Google Patents

用于提升时空芯片h＆e染色图像质量的方法、试剂组合、试剂盒和装置 Download PDF

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WO2025138299A1
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polyethylene glycol
tissue
sealing
staining
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范国祯
廖莎
郭晶
朱娜
陈秋玲
刘樱钿
章文蔚
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BGI Shenzhen Co Ltd
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BGI Shenzhen Co Ltd
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q

Definitions

  • the additives include, but are not limited to, RNase inhibitors or glycerol.
  • the polyethylene glycol includes but is not limited to a combination of one or more of polyethylene glycol 400, polyethylene glycol 6000 or polyethylene glycol 8000.
  • the polyethylene glycol composition includes but is not limited to any of the following:
  • the additives include, but are not limited to, RNase inhibitors or glycerol.
  • the polyethylene glycol includes but is not limited to a combination of one or more of polyethylene glycol 400, polyethylene glycol 6000 aqueous solution or polyethylene glycol 8000 aqueous solution.
  • the mass volume ratio of polyethylene glycol 6000 to water in the polyethylene glycol 6000 aqueous solution includes but is not limited to 1:2; the mass volume ratio of polyethylene glycol 8000 to water includes but is not limited to 1:2.
  • the present invention also provides cleaning agents, including but not limited to low-salt solutions;
  • the low salt solution is used as a cleaning agent for any of the following items:
  • VII cell typing or tissue typing
  • the cleaning agent is the cleaning agent.
  • the present invention also provides a kit, including but not limited to:
  • VII cell typing or tissue typing
  • Step 2 using the cleaning agent, the cleaning agent in the reagent combination, or the cleaning agent in the kit to contact the stained tissue chip, washing away residual dye, and drying;
  • Figure 2 shows the comparison of chip staining pictures and glass slide staining pictures of different sealing agents; among them, 1-H&E staining results of mouse stomach slices on glass slides; 2-Photographing results of chip staining polyethylene glycol 400 sealing chip; 3-Photographing results of chip staining glycerol sealing;
  • FIG9 shows a comparison of the spatiotemporal capture results of the H&E staining process using different mounting media; wherein, 1-glycerol mounting, original cleaning process, bin50; 2-polyethylene glycol (PEG400, 100%) mounting, original cleaning process, bin50; 3-polyethylene glycol (PEG400, 100%) mounting, optimized cleaning process, bin50;
  • Figure 18 shows the clarity comparison of the track line; 1-glycerol mounting, the effect of the original cleaning process; 2-H&E mounting medium mounting, the effect of the optimized cleaning process; 3-H&E image QC pass rate statistics (46 cases before optimization, 50 cases after optimization).
  • the polyethylene glycol (PEG400, PEG6000, PEG8000) sealing of the present invention has better performance on H&E stained fresh frozen embedded tissue sections and longer retention time.
  • the polyethylene glycol sealing can effectively alleviate the eosin blurring problem on the tissue and improve the color vividness and nuclear-cytoplasmic contrast of the image after H&E staining.
  • the polyethylene glycol sealing can effectively improve the clarity of the track line under incident (reflected) bright field illumination.
  • the present invention uses a camera reagent produced by BGI, which can effectively avoid the eosin blurring on the tissue after H&E staining without affecting the spatiotemporal transcriptome capture, and provide a clearer track line.
  • BGI a camera reagent produced by BGI
  • polyethylene glycol is used to seal the slices and take photos;
  • the present invention adopts the method of polyethylene glycol sealing and photographing to obtain H&E staining images. Under the protection of polyethylene glycol, the eosin staining on the tissue is less likely to blur.
  • polyethylene glycol sealing can maintain tissue staining for a longer time, allowing experimenters to take photos multiple times, increasing the error tolerance of H&E image photography.
  • analytes can be located in subcellular locations, including, for example, organelles, such as mitochondria, Golgi bodies, endoplasmic reticulum, chloroplasts, endocytic vesicles, secretory vesicles, vacuoles, lysosomes, etc.
  • Analytes can also be peptides or proteins, including but not limited to antibodies and enzymes.
  • Analytes can also be detected indirectly, such as by detecting intermediates, such as connection products or analyte capture agents (e.g., oligonucleotide-conjugated antibodies).
  • Chip preparation and sequencing were performed according to the standard procedures of MGI DNB make and sequencing reagent preparation, and data analysis was performed using the BGI spatiotemporal omics visualization system.
  • the experimental materials were prepared into tissue sections.
  • Tissue fixation After attaching a tissue section with a thickness of 10 ⁇ m to a chip with a single-stranded DNA probe (the chip comes from the Space-Time Kit, specifically: Stereo-seq Transcriptome Reagent Kit (Vector Edition), specification: 4RXN, item number: 201ST114), the tissue is baked dry and fixed with an organic solvent.
  • the Space-Time Kit specifically: Stereo-seq Transcriptome Reagent Kit (Vector Edition), specification: 4RXN, item number: 201ST114
  • DAPI staining add DAPI dye (Thermo 62248) on the chip surface (100 ⁇ L per 1 cm2 of each chip) and incubate for 5 minutes in the dark.
  • Staining and cleaning After hematoxylin staining, use 0.1 ⁇ SSC solution (prepared with 20 ⁇ SSC buffer solution and nuclease-free water) to clean the chip surface 3 times. After blue staining, use 0.1 ⁇ SSC solution to clean the chip surface once. After pouring off the low-salt solution on the tissue for the last time, quickly (wind speed 5m/s ⁇ 10m/s) use a gas cylinder to blow dry the chip and the low-salt solution on the chip surface to minimize the residual low-salt solution on the chip. This step is the key to determining the quality of the track line imaging on the chip.
  • Chip preparation and sequencing were performed according to the standard procedures of MGI DNB make and sequencing reagent preparation, and data analysis was performed using the BGI spatiotemporal omics visualization system.
  • Control group 1 Mouse stomach was used as the experimental material, and glycerol sealing was performed according to the instructions for use of the BGI-Stereo-seq transcriptome reagent kit (compatible with H&E) (A0), kit set 201SP118 (8RXNs);
  • Control group 2 Mouse testes were used as experimental materials, and glycerol sealing was performed according to the instructions for use of the BGI-Stereo-seq transcriptome reagent kit (compatible with H&E) (A0), kit set 201SP118 (8RXNs);
  • Test group 1 using mouse stomach as the experimental material, tissue seals were prepared using polyethylene glycol 400 as the sealant according to the experimental method described in Example 1 and photographed;
  • Test group 4 Mouse hemibrain was used as the experimental material. Tissue coverslips were prepared using polyethylene glycol 6000 as the mounting medium according to the experimental method described in Example 2 and photographed.
  • FIG6 1 and 2 in FIG6 are photographic results of coronal sections of mouse hemibrain after H&E staining on the chip and then sealed with polyethylene glycol 6000 (test group 4) and glycerol (control group 3).
  • test group 4 polyethylene glycol 6000
  • glycerol control group 3
  • the tissue boundary of polyethylene glycol 6000 sealing is clearer and the image color is more vivid; the tissue edge of glycerol sealing has obvious bleaching, and obvious eosin bleaching can also be observed in the tissue cavity.
  • polyethylene glycol (PEG400, PEG6000, PEG8000) sealing has better performance on H&E stained fresh frozen embedded tissue sections.
  • Polyethylene glycol sealing can effectively alleviate the eosin blurring problem on the tissue and improve the color vividness and nuclear-cytoplasmic contrast of the image after H&E staining.
  • polyethylene glycol sealing can effectively improve the clarity of the track line under epi-illumination (reflected) bright field illumination.
  • mice small intestine mouse small intestine, tumor samples, 100% methanol (Sigma-Aldrich), polyethylene glycol 400 (SangonBiotech), alcohol-soluble eosin (SangonBiotech), hematoxylin stain (Sigma), blue stain (Agilent), 0.1 ⁇ SSC, cover glass (Shitai), 100% glycerol (Diomand).
  • Control group Mouse small intestine was used as the experimental material, and glycerol sealing was performed according to the instructions of BGI-Stereo-seq Transcriptome Reagent Kit (Compatible with H&E) (A0), kit set 201SP118 (8RXNs);
  • Test group 1 Tumor samples were used as experimental materials. Tissue seals were prepared using PEG400 as a sealant according to the experimental method described in Example 1 and photographed.
  • Test group 2 Mouse small intestine was used as the experimental material, and PEG400 was used as the sealing agent according to the experimental method described in Example 1 Prepare tissue slides and take photos.
  • the H&E staining images of the tumor samples can be retained for a longer time after being sealed with polyethylene glycol 400 (test group 1), with clear tissue edges and uniform staining, and no eosin blurring 31 minutes after sealing (as shown in Figure 7);
  • H&E staining images of the mouse small intestine after polyethylene glycol 400 mounting can be retained for a longer time. If the subsequent capture amount is not considered, the image quality is still good after three days.
  • Example 13 Polyethylene glycol sealing, comparison of spatiotemporal capture results of different cleaning processes
  • mice mouse heart, 100% methanol (Sigma-Aldrich), QubitTM ssDNA Reagent (Invitrogen), 5 ⁇ SSC, 0.1 ⁇ SSC, coverslip (Shitai), 100% PEG400 (Sigma), 100% glycerol (Diomand), STOmics Gene Expression Kit-S1, STOmics Library Preparation Kit-S1 (BGI), Seq2000 Sequencing Kit PE100 (MGI);
  • FIG. 9 shows polyethylene glycol (PEG400, 100%) sealing, original cleaning process (test group 1), bin 50;
  • the optimized cleaning process can significantly improve the spatiotemporal capture.
  • the capture amount (Bin200 Median Gene Type and Median MID) is improved to varying degrees compared with the original cleaning schemes of glycerol sealing and polyethylene glycol sealing.
  • Example 14 Comparison of spatiotemporal capture results of polyethylene glycol-sealed tissue and glycerol-sealed tissue
  • mice testis 100% methanol (Sigma-Aldrich), QubitTM ssDNA Reagent (Invitrogen), 5 ⁇ SSC, 0.1 ⁇ SSC, coverslip (Shitai), 100% PEG400 (Sangon Biotech), 50% PEG8000 (Sigma), 100% glycerol (Diomand), STOmics Gene Expression Kit-S1, STOmics Library Preparation Kit-S1 (BGI), Seq2000 Sequencing Kit PE100 (MGI).
  • mice thymus 100% methanol (Sigma-Aldrich), QubitTM ssDNA Reagent (Invitrogen), 5 ⁇ SSC, 0.1 ⁇ SSC, coverslip (Sita), 100% PEG400 (Sigma), 50% PEG6000 (Sigma), 100% glycerol (Diomand), STOmics Gene Expression Kit-S1, STOmics Library Preparation Kit-S1 (BGI), Seq2000 Sequencing Kit PE100 (MGI);
  • control group followed the instructions for use of the BGI-Stereo-seq transcriptome reagent set (compatible with H&E).
  • the experimenters used the same tissue for H&E staining and obtained the mRNA capture results according to the standard process in the instructions; among them, control group 1 did not perform sealing operations, and control group 2 used glycerol for sealing.
  • Test group 1 H&E staining, PEG400 sealing: using mouse thymus as the experimental material, the spatiotemporal capture results were obtained according to the experimental method described in Example 5.
  • Test group 2 H&E staining, PEG6000 sealing: using mouse thymus as the experimental material, the spatiotemporal capture results were obtained according to the experimental method described in Example 6.
  • FIG 12, 3 shows the visualization of PEG400 sealing film (polyethylene glycol 400), Bin50
  • FIG 12, 4 shows the visualization of PEG6000 sealing film (polyethylene glycol 6000), Bin50
  • brackets are the comparison of the amount of Genetype and MID data when the dup value is adjusted to a unified value.
  • the three sealing agents can effectively improve the uniformity of tissue capture, and the visualization results are basically consistent with the H&E staining results (as shown in Figure 13), while the uneven capture can be clearly seen without sealing.
  • the three sealing agents can effectively improve the coverage of mRNA capture (MID_UT/Unique Reads, the higher the coverage, the better the in situ capture), and there is no obvious difference in the capture amount compared with no sealing.
  • the test group followed the experimental method described in Example 8, and 3.5 ⁇ L of the mixture of PEG400 (100%), PEG6000 (50%), and PEG8000 (50%) in a ratio of 1:1:1 was used to seal the slide to obtain the mRNA capture results.
  • the brand of PEG8000 was RIGAKU, and the preparation method of 50% (w/v) was as follows: PEG8000 powder was diluted with ASTM I water, The concentration is 50%. PEG6000 powder is diluted with NF ⁇ H 2 O to a concentration of 50%.
  • brackets are the comparison of the amount of Genetype and MID data when the dup value is adjusted to a unified value.
  • Test group 1 H&E staining, PEG400 mounting: using mouse testis as experimental material, the spatiotemporal capture results were obtained according to the experimental method described in Example 5;
  • Control group 2 followed the instructions for use of the BGI-Stereo-seq transcriptome reagent set (compatible with H&E).
  • the experimenters used the same tissue for H&E staining and obtained the mRNA capture results according to the standard process in the instructions. Among them, control group 1 did not perform sealing operations, and control group 2 used glycerol for sealing.
  • Test group 4 H&E staining, PEG6000 sealing: using mouse thymus as the experimental material, the spatiotemporal capture results were obtained according to the experimental method described in Example 6.
  • Control group 3 was a group in which the experimenters used the same tissue for H&E staining and glycerol sealing, and obtained mRNA according to the standard procedure in the instruction manual Capture results;
  • Test Group 5 followed the experimental method described in Example 8, and obtained the mRNA capture result by mixing PEG400 (100%), PEG6000 (50%), and PEG8000 (50%) in a ratio of 1:1:1, taking 3.5 ⁇ L of the reagent for sealing, wherein the brand of PEG8000 is RIGAKU, and the preparation method of 50% (w/v) is as follows: PEG8000 powder is diluted with ASTM Class I water to a concentration of 50%, and PEG6000 powder is diluted with NF ⁇ H2O to a concentration of 50%.
  • Control group 5 (using Glycerol as sealing agent): Mouse lymph nodes were used as experimental materials. The operation was carried out according to the instruction manual of BGI-Stereo-seq transcriptome reagent kit (compatible with H&E). The experimenters used the same tissue for H&E staining and obtained the mRNA capture results according to the standard process in the instruction manual.
  • polyethylene glycol (PEG400, PEG6000, PEG8000) sealing has better performance on H&E stained fresh frozen embedded tissue sections.
  • These three polyethylene glycol reagents as sealing agents can play a role similar to glycerol in improving in situ capture while not affecting the spatiotemporal capture amount of the processed samples.
  • mice stomach 100% methanol (Sigma-Aldrich), DAPI stain (Thermo, 62248), 5 ⁇ SSC, 0.1 ⁇ SSC, coverslip (Shitai), 100% PEG400 (Sigma), 100% glycerol (Diomand), STOmics gene expression kit-S1, STOmics library preparation kit-S1 (BGI), Seq2000 sequencing kit PE100 (MGI).
  • control group (DAPI staining, glycerol mounting) is the mRNA capture result of the experimenter using the same tissue and performing the conventional transcriptome standard process according to the instruction manual;
  • test group (DAPI staining, PEG400 mounting) was obtained by the experimental method described in Example 9 to obtain the spatiotemporal capture results;
  • FIG. 16 shows polyethylene glycol (PEG400, 100%) sealing, bin 50;
  • control group is the mRNA capture result of the experimenter using the same tissue and performing the conventional transcriptome standard process according to the instructions (using ssDNA staining and glycerol sealing);
  • Test group ssDNA staining, PEG400 sealing obtained spatiotemporal capture results according to the experimental method described in Example 10;
  • PEG sealing has no obvious effect on capture and coverage compared to glycerol sealing, and can be used as a substitute for glycerol.
  • the samples were commercially available OCT-embedded fresh frozen samples.
  • a Leica slicer was used to select target locations for slices, with each slice being 10 ⁇ m thick.
  • Control group follows the instructions of BGI-Stereo-seq Transcriptome Reagent Kit (compatible with H&E) (A0), kit 201SP118 (8RXNs), perform glycerol sealing, and select non-tissue areas for photography.
  • Test group According to the experimental method described in Example 1, PEG400 was used as a sealing agent to prepare tissue sealing slides and non-tissue areas were selected for photography.
  • FIG18 shows glycerol sealing and the original cleaning process
  • FIG. 18 shows sealing with PEG400 sealing agent, a new process
  • FIG. 18(3) shows the statistical H&E image QC pass rate (46 cases before optimization, 50 cases after optimization).
  • the H&E sealing process can effectively improve the clarity of the track line and greatly improve the pass rate of the automatic registration process QC.
  • the H&E automatic process registration pass rate increased from 15% to 64%.
  • the QC pass rate reaches 90%.

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于提升时空芯片H&E染色图像质量的方法、试剂组合、试剂盒和装置。本发明提供了一类新的封片剂，使用简单的试剂和相应的流程设计，在可以达到甘油封片同样的mRNA原位捕获、全面改善mRNA扩散的效果的同时，有效解决组织染色后掉色和颜色晕散的问题。对华大时空芯片的H&E图像与时空表达矩阵的配准，实现高精度亚细胞级别的组学分析提供可能性。

Description

用于提升时空芯片H＆E染色图像质量的方法、试剂组合、试剂盒和装置 技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于提升时空芯片H&E染色图像质量的方法、试剂组合、试剂盒和装置。
背景技术
空间转录组是一种致力于将空间位置对应的转录信息量化的技术。它将在传统的转录组测序基础上带来详细的空间信息，帮助研究者辨别组织内部转录的位置，精确到细胞级别甚至更高的分辨率，这将促进研究者们对单个细胞和整个组织内细胞群体的认识和解读。
H&E(hematoxylin-eosin staining)染色是一种较为成熟的实验技术，应用广泛，可以明确细胞和组织的结构、性质、分布及数量，对于肿瘤病理诊断、发病机制研究及治疗方案的制定起到重要作用。
ssDNA染色或者DAPI染色是目前时空转录组的常规染色方案，通过拍摄对组织细胞核染色后的荧光图像，结合时空转录组的表达矩阵，可以实现单细胞水平的组学分析。相比于时空转录组结合常规染色方案，时空芯片上的H&E染色，可以帮助我们更清晰地观察到组织形态学信息，辅助病理研究与应用中更准确地判断组织分型及获取特定组织区域的表达信息，针对选定区域进行下游差异分析和富集分析。
常规的H&E染色流程可以简化为苏木素染色、返蓝和伊红染色这三个步骤，但是在时空转录组芯片上对组织进行H&E染色，需要兼顾H&E的图像质量和时空转录组捕获。
目前适配时空转录组的H&E染色流程，在苏木素和返蓝染色后，都使用5×SSC溶液清洗掉多余染料，之后缓慢轻轻吹干，使用的组织封片剂为100％甘油。其中5×SSC溶液清洗后吹干，仍然会有一些盐渍残留，会影响芯片Track线在显微镜下对呈现。而使用甘油作为封片剂虽然可以有效的解决ssDNA图像拍照不清晰、捕获不均衡、组织内RNA扩散等问题，但是在H&E染色后的组织封片效果较差。由于目前H&E染色所使用的伊红易溶于水，而甘油具有较强的吸水性，在封片以后伊红很快由于接触水相而晕开，图像很难以较好的质量保存较长的时间。此外，甘油封片后的时空芯片也很难在显微镜下拍到较为清晰的track线，没有track线的图像无法与时空表达矩阵进行配准，手动配准的精度很难保障后续的单细胞圈定及后续的cellbin分析。
使用当前的方法，可以得到符合病理诊断要求的H&E图像，但是也存在一定的问题：
(1)染色后的组织颜色偏暗，核质对比不够鲜明；
(2)由于甘油吸水性较强，封片后伊红容易晕散，H&E图像很难维持较长时间，对实验操作的要求和拍照时间的要求较高；
(3)无法稳定拍清芯片上的track线，无法完成图像的自动配准和后续分析。
发明内容
有鉴于此，本发明提供用于提升时空芯片H&E染色图像质量的方法、试剂组合、试剂盒和装置。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了聚乙二醇或聚乙二醇的组合物作为封片剂和/或低盐溶液作为清洗剂在如下任意项中的应用；
(I)、组织染色后的封片；和/或
(II)、避免染色后细胞或组织掉色或染色晕散；和/或
(III)、提高时空芯片的图像质量；和/或
(IV)、提高时空芯片track线呈像清晰度；和/或
(V)、提高染色后细胞的核质比；和/或
(VI)、延长染色图像的保存时间；和/或
(VII)、细胞分型或组织分型；和/或
(VIII)、cellbin表达分析；和/或
(IX)、提升染色图像与时空表达矩阵的配准精度；和/或
(X)、不影响或提升时空捕获率和/或覆盖率；和/或
(XI)、提高获取mRNA和/或蛋白表达信息的准确度；
所述低盐溶液包括但不限于0.1×SSC。
在本发明的一些具体实施方案中，所述染色包括但不限于空间组学的H&E染色、空间组学ssDNA染色、DAPI染色中的一种或多种的组合。
在本发明的一些具体实施方案中，所述聚乙二醇的组合物包括但不限于如下任意项：
(I)、不同分子量的聚乙二醇的组合物；和/或
(II)、水和/或添加剂与聚乙二醇的组合物；和/或
所述添加剂包括但不限于RNA酶抑制剂或甘油。
在本发明的一些具体实施方案中，所述聚乙二醇包括但不限于聚乙二醇400、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000中的一种或多种的组合。
本发明还提供了封片剂，包括聚乙二醇或聚乙二醇的组合物；
所述聚乙二醇或聚乙二醇的组合物作为封片剂用于如下任意项；
(I)、组织染色后的封片；和/或
(II)、避免染色后细胞或组织掉色或染色晕散；和/或
(III)、提高时空芯片的图像质量；和/或
(IV)、提高时空芯片track线呈像清晰度；和/或
(V)、提高染色后细胞的核质比；和/或
(VI)、延长染色图像的保存时间；和/或
(VII)、细胞分型或组织分型；和/或
(VIII)、cellbin表达分析；和/或
(IX)、提升染色图像与时空表达矩阵的配准精度；和/或
(X)、不影响或提升时空捕获率和/或覆盖率；和/或
(XI)、提高获取mRNA和/或蛋白表达信息的准确度。
在本发明的一些具体实施方案中，所述聚乙二醇的组合物包括但不限于如下任意项：
(I)、不同分子量的聚乙二醇的组合物；和/或
(II)、水和/或添加剂与聚乙二醇的组合物；和/或
所述添加剂包括但不限于RNA酶抑制剂或甘油。
在本发明的一些具体实施方案中，所述聚乙二醇包括但不限于聚乙二醇400、聚乙二醇6000水溶液或聚乙二醇8000水溶液中的一种或多种的组合。
在本发明的一些具体实施方案中，以g/mL计，所述聚乙二醇6000水溶液中聚乙二醇6000和水的质量体积比包括但不限于1:2；所述聚乙二醇8000和水的质量体积比包括但不限于1:2。
在本发明的一些具体实施方案中，所述聚乙二醇400、所述聚乙二醇6000水溶液和所述聚乙二醇8000水溶液的体积比包括但不限于1:1:1。
本发明还提供了清洗剂，包括但不限于低盐溶液；
所述低盐溶液包括但不限于0.1×SSC；
所述低盐溶液作为清洗剂用于如下任意项；
(I)、组织染色后的封片；和/或
(II)、避免染色后细胞或组织掉色或染色晕散；和/或
(III)、提高时空芯片的图像质量；和/或
(IV)、提高时空芯片track线呈像清晰度；和/或
(V)、提高染色后细胞的核质比；和/或
(VI)、延长染色图像的保存时间；和/或
(VII)、细胞分型或组织分型；和/或
(VIII)、cellbin表达分析；和/或
(IX)、提升染色图像与时空表达矩阵的配准精度；和/或
(X)、不影响或提升时空捕获率和/或覆盖率；和/或
(XI)、提高获取mRNA和/或蛋白表达信息的准确度。
在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗剂用于如下任一项：
(i)、清洗染色组织上多余的苏木素和/或返蓝染料；和/或
(ii)、采用聚乙二醇或聚乙二醇的组合物作为封片剂封片、拍照后，经所述清洗剂去除所述封片剂。
本发明还提供了试剂组合，包括但不限于：
所述封片剂；和
所述清洗剂。
本发明还提供了试剂盒，包括但不限于：
(I)、所述封片剂；和/或
(II)、所述清洗剂；和/或
(III)、所述试剂组合。
本发明还提供了所述试剂组合或所述试剂盒在如下任意项中的应用；
(I)、组织染色后的封片；和/或
(II)、避免染色后细胞或组织掉色或染色晕散；和/或
(III)、提高时空芯片的图像质量；和/或
(IV)、提高时空芯片track线呈像清晰度；和/或
(V)、提高染色后细胞的核质比；和/或
(VI)、延长染色图像的保存时间；和/或
(VII)、细胞分型或组织分型；和/或
(VIII)、cellbin表达分析；和/或
(IX)、提升染色图像与时空表达矩阵的配准精度；和/或
(X)、不影响或提升时空捕获率和/或覆盖率；和/或
(XI)、提高获取mRNA和/或蛋白表达信息的准确度。
本发明还提供了组织切片的处理方法，采用所述清洗剂、所述试剂组合中的所述清洗剂或所述试剂盒中的所述清洗剂与染色后的组织切片接触，清洗染色组织上多余的苏木素和/或返蓝染料，吹干，再经所述封片剂、所述试剂组合中的所述封片剂或所述试剂盒中的所述封片剂封片。
在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗剂的清洗次数不少于1次，优选1次或3次。
在本发明的一些具体实施方案中，苏木素染色后需要用0.1×SSC溶液清洗芯片表面3次，返蓝染色后需要用0.1×SSC溶液清洗芯片表面1次。
在本发明的一些具体实施方案中，所述吹干的速率包括但不限于：5m/s～10m/s。
本发明还提供了所述处理方法制备获得的组织切片。
本发明还提供了提高时空芯片的图像质量和/或提高时空芯片track线呈像清晰度的方法，
取组织切片固载于具有探针的芯片，烤干、固定、染色、弃染料，获得染色后的组织芯片；
采用所述清洗剂、所述试剂组合中的所述清洗剂或所述试剂盒中的所述清洗剂与所述染色后的组织芯片接触，清洗染色组织上多余的苏木素和/或返蓝染料，吹干，再经所述封片剂、所述试剂组合中的所述封片剂或所述试剂盒中的所述封片剂封片。
在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗剂的清洗次数不少于1次，优选1次或3次。
在本发明的一些具体实施方案中，苏木素染色后需要用0.1×SSC溶液清洗芯片表面3次， 返蓝染色后需要用0.1×SSC溶液清洗芯片表面1次。
在本发明的一些具体实施方案中，所述吹干的速率包括但不限于：5m/s～10m/s。
本发明还提供了所述方法制备获得的时空芯片。
本发明还提供了提高获取mRNA和/或蛋白表达信息的准确度的方法，包括如下步骤：
步骤1：取组织切片固载于具有探针的芯片，烤干、固定、染色、弃染料，获得染色后的组织芯片；
步骤2：采用所述清洗剂、所述试剂组合中的所述清洗剂或所述试剂盒中的所述清洗剂与所述染色后的组织芯片接触，洗去残留的染料，吹干；
步骤3：再经所述封片剂、所述试剂组合中的所述封片剂或所述试剂盒中的所述封片剂封片，拍照；
步骤4：采用所述清洗剂、所述试剂组合中的所述清洗剂或所述试剂盒中的所述清洗剂去除所述封片剂，调节pH值，透化，mRNA逆转录，获得cDNA；
步骤5：再经酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，建库、测序，获得mRNA和/或蛋白表达信息。
在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗剂的清洗次数不少于1次，优选1次或3次。
在本发明的一些具体实施方案中，苏木素染色后需要用0.1×SSC溶液清洗芯片表面3次，返蓝染色后需要用0.1×SSC溶液清洗芯片表面1次。
在本发明的一些具体实施方案中，所述吹干的速率包括但不限于：5m/s～10m/s。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4所述去除所述封片剂采用0.1×SSC浸泡3～5s；
步骤4所述调节pH值采用pH为2的盐酸溶液。
本发明还提供了时空转录组捕获的方法，包括如下步骤：
步骤1：取组织切片固载于具有探针的芯片，烤干、固定、染色、弃染料，获得染色后的组织芯片；
步骤2：采用所述清洗剂、所述试剂组合中的所述清洗剂或所述试剂盒中的所述清洗剂与所述染色后的组织芯片接触，洗去残留的染料，吹干；
步骤3：再经所述封片剂、所述试剂组合中的所述封片剂或所述试剂盒中的所述封片剂封片，拍照；
步骤4：采用所述清洗剂、所述试剂组合中的所述清洗剂或所述试剂盒中的所述清洗剂去除所述封片剂，调节pH值，透化，mRNA逆转录，获得cDNA；
步骤5：再经酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，建库、测序，获得捕获信息。
在本发明的一些具体实施方案中，所述清洗剂的清洗次数不少于1次，优选1次或3次。
在本发明的一些具体实施方案中，苏木素染色后需要用0.1×SSC溶液清洗芯片表面3次，返蓝染色后需要用0.1×SSC溶液清洗芯片表面1次。
在本发明的一些具体实施方案中，所述吹干的速率包括但不限于：5m/s～10m/s。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4所述去除所述封片剂采用0.1×SSC浸泡3～5s；
步骤4所述调节pH值采用pH为2的盐酸溶液。
本发明还提供了装置，包括所述的组织切片或所述的时空芯片。
本发明还提供了存储介质，所述存储介质中存储有计算机可读指令，所述计算机可读指令被一个或多个处理器执行时，使得一个或多个处理器执行所述时空转录组捕获的方法的步骤。
本发明还提供了计算机设备，包括：一个或多个处理器，以及存储器；所述存储器中存储有计算机可读指令，所述计算机可读指令被所述一个或多个处理器执行时，执行所述时空转录组捕获的方法的步骤。
本发明包括但不限于取得了如下有益效果：
本发明提供的样本处理方法是一种时空组学中能实现较长时间维持芯片上的组织切片H&E染色状态且在落射明场下可以获得较为清晰track线呈像的样本处理方法。使用一种工业常用且成 本低廉的原材料聚乙二醇(PEG400、PEG6000、PEG8000)，通过简约的流程设计，系统地解决了细胞、组织H&E染色晕散、维持时间短、无法实现自动配准等问题，提升了H&E图像与时空表达矩阵的配准精度；同时使用聚乙二醇替换甘油，并不会影响后续的时空捕获，甚至在一些样本上的捕获效果更佳。
该方法成本低，操作简便，效果显著，适用于各种类型的新鲜、PFA样本，具有较为广阔的应用前景，考虑到动物个体发育、病理诊断的市场需求，预计可以带来较高的经济收益。
附图说明
图1示H&E+转录组流程；
图2示不同封片剂的芯片染色图片与玻片染色图片对比；其中，1-小鼠胃切片在玻片上的H&E染色结果；2-芯片染色聚乙二醇400封芯片的拍照结果；3-芯片染色甘油封片的拍照结果；
图3示不同封片剂组织区域和空白区域细节对比；其中，1-H&E芯片，聚乙二醇400封片的组织区域的拍照结果；2-H&E芯片，甘油封片的组织区域的拍照结果；3-H&E芯片，聚乙二醇400封片的空白区域的拍照结果；4-H&E芯片，甘油封片的空白区域的拍照结果；
图4示不同封片剂的芯片染色图片对比；其中，1-小鼠睾丸切片在芯片上的H&E染色后使用聚乙二醇400封芯片的拍照结果；2-小鼠睾丸切片在芯片上的H&E染色后使用聚乙二醇8000封芯片的拍照结果；3-小鼠睾丸切片在芯片上的H&E染色后使用甘油封片的拍照结果；
图5示不同封片剂组织边缘和组织内空腔区域细节对比；其中，1-H&E芯片，聚乙二醇400封片的组织边缘的拍照结果；2-H&E芯片，甘油封片的组织边缘的拍照结果；3-H&E芯片，聚乙二醇400封片的组织内空腔的拍照结果；4-H&E芯片，甘油封片的组织内空腔的拍照结果；
图6示不同封片剂的芯片染色图片对比；其中，1-小鼠半脑冠状面切片在芯片上的H&E染色后使用聚乙二醇6000封芯片的拍照结果；2-小鼠半脑冠状面切片在芯片上的H&E染色后使用甘油封片的拍照结果；
图7示聚乙二醇封片后多次拍照对比；
图8示不同封片剂封片第一天和第三天拍照对比；
图9示使用不同封片剂的H&E染色流程的时空捕获结果对比；其中，1-甘油封片，原清洗流程，bin50；2-聚乙二醇(PEG400,100％)封片，原清洗流程，bin50；3-聚乙二醇(PEG400,100％)封片，优化后清洗流程，bin50；
图10示使用不同封片剂的H&E染色流程的时空捕获结果对比；其中，1-甘油封片可视化，Bin50；2-PEG400封片(聚乙二醇400)可视化，Bin50；3-PEG8000封片(聚乙二醇8000)可视化，Bin50；
图11示不同封片剂的芯片染色图片对比；其中，1-H&E芯片，甘油封片的H&E染色结果；2-H&E芯片，聚乙二醇400封片的H&E染色结果；3-H&E芯片，聚乙二醇8000封片的H&E染色结果；
图12示使用不同封片剂的H&E染色流程的时空捕获结果对比；其中，1-不做封片，Bin50；2-甘油封片可视化，Bin50；3-PEG400封片(聚乙二醇400)可视化，Bin50；4-PEG6000封片(聚乙二醇8000)可视化，Bin50；
图13示不同封片剂的芯片染色图片对比；其中，1-甘油封片的芯片H&E染色图像；2-PEG400封片的芯片H&E染色图像；3-PEG6000封片的芯片H&E染色图像；
图14示不同封片剂的H&E染色图片对比；其中，1-甘油封片的H&E染色图像；2-聚乙二醇(混合)封片的H&E染色图像；
图15示使用不同封片剂的H&E染色流程的时空捕获结果对比；其中，1-甘油封片的时空组学分析结果；2-聚乙二醇(混合)封片，bin50的时空组学分析结果；
图16示使用不同封片剂的DAPI染色流程的时空捕获结果对比；其中，1-甘油封片，bin50；2-聚乙二醇(PEG400,100％)封片，bin50；
图17示使用不同封片剂的ssDNA染色流程的时空捕获结果对比；其中，1-甘油封片，bin50；2-聚乙二醇(PEG400,100％)封片，bin50；
图18示track线的清晰程度对比；其中，1-甘油封片，原清洗流程的效果；2-H&E封片剂封片，优化后清洗流程的效果；3-H&E图像QC通过率统计(优化前46例，优化后50例)。
具体实施方式
本发明公开了用于提升时空芯片H&E染色图像质量的方法、试剂组合、试剂盒和装置，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
相比甘油封片，本发明采用聚乙二醇(PEG400、PEG6000、PEG8000)封片均在H&E染色的新鲜冷冻包埋的组织切片上有更好的表现，且留存时间更长，聚乙二醇封片可以有效缓解组织上的伊红晕散问题，提升H&E染色后的图像色彩鲜艳程度和核质对比情况。对于华大时空芯片，聚乙二醇封片可以有效提升落射(反射)明场光照下track线的清晰程度。
本发明使用一种华大基因自产的拍照试剂，可以在不影响时空转录组捕获的前提下有效地避免H&E染色后组织上的伊红晕散，并且提供较为清晰的track线。我们根据精确配准的H&E图像，可以对组织进行单细胞圈定、组织区域划分，后期可以进行cellbin表达分析；所述拍照试剂包括聚乙二醇。
本发明涉及一种新型的对贴有生物组织的蛋白质芯片的处理方法，利用气瓶快速吹走芯片及生物组织切片表面的低盐溶液以减少盐渍对芯片上未经修饰的空白区域的遮挡，提升蛋白质芯片上track线的成像质量，实现落射明场图像与时空表达矩阵的自动配准。同时使用一类具有一定吸水作用的聚乙二醇对染色后的组织封片，有效缓解组织上的染料因接触水相而出现的晕散情况，从而获得核质对比鲜明的符合病理诊断需求的H&E图像。使用该流程，可以提升track线的质检通过率，使得H&E图像可以与时空表达矩阵实现自动配准；相比手动配准而言提升了配准精度，能够很好地根据H&E图像进行mRNA聚类分析，实现细胞准确分型，辅助病理研究与应用中更准确地判断组织分型及获取特定组织区域的表达信息，针对选定区域进行下游差异分析和富集分析。
该流程的特点在于，将具有一定厚度的组织切片贴附于具有单链DNA探针的芯片上后，对组织进行烤干、有机溶剂固定、H&E染色，在弃去苏木素和返蓝试剂后，使用低盐溶液对芯片进行清洗，快速吹干组织和芯片表面的低盐溶液，尽可能减少盐渍在芯片的残留，再在芯片上滴加聚乙二醇，盖上盖玻片，待聚乙二醇完全浸润组织，即可对芯片拍照。(操作：将PEG滴在芯片的组织中央，然后按照标准的盖玻片封片的操作进行封片即可；加液量：1cm*1cm尺寸的芯片滴加3.5μL，不同尺寸芯片根据此比例调整加液量；不同分子量的PEG稀释比例；PEG8000的品牌为RIGAKU，50％(w/v)，PEG6000粉末用NF·H2O稀释，浓度为50％)拍照时可以较为清晰地看清track线，并且可以放置较长时间，在此期间内组织上的染料可以保持稳定且较长时间不晕散。之后使用低盐溶液浸泡洗去聚乙二醇，用PH2的盐酸预洗芯片调节芯片的酸碱度，加透化试剂对组织进行透化及后续的mRNA逆转录反应，获得cDNA后，对芯片进行酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，对该cDNA进行后续建库、测序等一系列操作。获得带有位置信息的mRNA的序列信息，再对数据进行分析获得mRNA或蛋白的原位表达信息，其中：
1)用低盐溶液(0.1×SSC)清洗组织上多余的苏木素和返蓝染料，用气瓶快速吹走芯片表面的低盐溶液，尽量减少盐渍残留在芯片；
2)尽可能吹干芯片上的组织，避免染色后的组织在封片时出现伊红晕散；
3)在对芯片上染色后的组织及细胞进行拍照时采用聚乙二醇进行封片拍照；
4)使用聚乙二醇封片，可以获得帮助获得符合病理判断要求的H&E染色图像和满足配准要 求的较为清晰的track线，帮助进行自动配准和细胞抠图；
5)拍照后用低盐溶液(0.1×SSC)短暂浸泡，用0.01N盐酸预洗以后随即进行透化反应；
6)通过全流程的设计，帮助实现H&E图像的自动配准，为后续的cellbin分析提供数据基础。
具体流程如图1所示。
本发明解决的技术问题如下：
1)解决组织上的伊红染液晕散问题。本发明采用聚乙二醇封片拍照的方法获得H&E染色图像，在聚乙二醇的保护下，组织上着色的伊红更不容易晕开。
2)相比于甘油封片，使用聚乙二醇封片可以维持组织保持着色时间更长，允许实验者多次拍照，增加了H&E图像拍照的容错率。
3)解决染色后的核质对比不够清晰的问题。相比于使用甘油封片，使用聚乙二醇400获得的H&E图像拥有更明显的核质对比和更鲜艳的色彩；
4)解决封片后芯片上track线成像不够清晰的问题。更低浓度(0.1×SSC)的盐渍残留可以有效提升时空芯片track线的成像清晰度；相比于使用甘油封片，使用聚乙二醇400封片可以获得更清晰的track线成像；
5)结合上述所有改善结果，较大程度提升H&E图像质量和track线质检通过率，实现H&E图像与时空表达矩阵自动配准，为后续实现对组织cellbin级别的mRNA分析提供可能性。
本发明提供的用于提升时空芯片H&E染色图像质量的方法、试剂组合、试剂盒和装置中所用原料及试剂均可由市场购得。
术语解释
待分析物可广义地分为两组的一者：核酸分析物和非核酸分析物。非核酸分析物的实例包括但不限于脂质、碳水化合物、肽、蛋白质、糖蛋白(N-连接或O-连接)、脂蛋白、磷蛋白、蛋白质的特定磷酸化或乙酰化变体、蛋白质的酰胺化变体、蛋白质的羟基化变体、蛋白质的甲基化变体、蛋白质的泛素化变体、蛋白质的硫酸化变体、病毒蛋白(例如，病毒衣壳、病毒包膜、病毒外壳、病毒辅助蛋白、病毒糖蛋白、病毒刺突等)、胞外和胞内蛋白、抗体和抗原结合片段。此外，待分析物可位于亚细胞位置，包括例如细胞器，例如线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、胞吞小泡、胞泌小泡、液泡、溶酶体等。待分析物还可以是肽或蛋白质，包括但不限于抗体和酶。还可以间接检测待分析物，如通过检测中间剂，例如连接产物或分析物捕获剂(例如，寡核苷酸缀合抗体)。
“生物样品”通常从受试者获得，以使用多种技术中的任何一种进行分析，所述多种技术包括但不限于活检、外科手术和激光捕获显微镜法(LCM)，并通常包括来自受试者的细胞和/或其他生物材料。在一些实施方案中，生物样品可以是组织切片。在一些实施方案中，生物样品可以是固定和/或染色的生物样品(例如，固定和/或染色的组织切片)。染色剂的非限制性实例包括组织学染色剂(例如，苏木精和/或曙红)和免疫学染色剂(例如，荧光染色剂)。在一些实施方案中，可对生物样品(例如，固定和/或染色的生物样品)成像。
生物样品可以用一种或多种透化试剂透化。例如，生物样品的透化可促进分析物捕获。
基于阵列的空间分析方法涉及将一种或多种待分析物从生物样品转移至基底上的特征阵列，其中每个特征与阵列上的唯一空间位置相关联。转移的分析物的后续分析包括确定分析物的身份和分析物在生物样品内的空间位置。待分析物在生物样品内的空间位置基于分析物在阵列上结合(例如，直接地或间接地)的特征以及该特征在阵列内的相对空间位置来确定。
“捕获探针”是指能够捕获(直接地或间接地)和/或标记生物样品中的分析物(例如，目的分析物)的任何分子。在一些实施方案中，捕获探针为核酸或多肽。捕获探针可包括切割结构域和/或功能结构域(例如，引物结合位点，如用于下一代测序(NGS))。捕获探针的生成可通过任何适宜的方法实现，本发明在此不做限定。
在一些实施方案中，可使用一种或多种待分析物捕获剂来进行一种或多种分析物(例如，蛋白质分析物)的检测。
空间信息可提供具有生物学和/或医学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可允许：鉴定疾病或病症的一种或多种生物标志物(例如，诊断生物标志物、预后生物标志物和/或用于确定治疗功效的生物标志物)；鉴定用于治疗疾病或病症的候选药物靶标；鉴定(例如，诊断)受试者患有某疾病或病症；鉴定受试者的疾病或病症的阶段和/或预后；鉴定受试者具有增加的发生某疾病或病症的可能性；监测受试者的疾病或病症的进展；确定受试者的疾病或病症的治疗功效；鉴定治疗对于疾病或病症有效的患者亚群；改进患有某疾病或病症的受试者的治疗；选择参与临床试验的受试者；和/或选择针对患有某疾病或病症的受试者的治疗。
空间信息可提供具有生物学重要性的信息。例如，本文描述的方法和组合物可允许：鉴定转录组和/或蛋白质组表达谱(例如，在健康和/或患病组织中)；鉴定紧邻的多种分析物类型(例如，最近邻分析)；确定患病组织中的上调和/或下调基因和/或蛋白质；表征肿瘤微环境；表征肿瘤免疫反应；表征细胞类型及其在组织中的共定位；和鉴定组织内的遗传变体(例如，基于与特定疾病或病症生物标志物相关联的基因和/或蛋白质表达谱)。
通常，对于基于空间阵列的方法，基底起到捕获探针与阵列的特征的直接或间接附接的支撑物的作用。“特征”为充当空间分析中使用的各种分子实体的支撑物或储库的实体。在一些实施方案中，阵列中的一些或全部特征被功能化以便分析物捕获。
通常，当使生物样品与包括捕获探针的基底(例如，捕获探针嵌入、点状分布、印刷、制造在基底上的基底，或具有包括捕获探针的特征(例如，珠、孔)的基底)接触时，分析物和/或中间剂(或其部分)可被捕获。如本文所用，生物样品与基底“接触(contact/contacted/contacting)”是指任何接触(例如，直接或间接)使得捕获探针可与来自生物样品的分析物相互作用(例如，共价结合或非共价结合(例如，杂交))。捕获可主动地(例如，使用电泳)或被动地(例如，使用扩散)实现。
在空间信息的分析过程中，获得与分析物相关联的序列信息，并且该序列信息可用于提供关于生物样品中分析物的空间分布的信息。可使用各种方法来获得空间信息。在一些实施方案中，特定的捕获探针和它们捕获的分析物与基底上特征的阵列中的特定位置相关联。
当在空间信息的分析期间获得关于捕获探针和/或分析物的序列信息时，可通过参考唯一地关联每个空间与阵列特征位置的存储信息来确定捕获探针和/或分析物的位置。这样，特定的捕获探针和所捕获的分析物与特征的阵列中的特定位置相关联。每个阵列特征位置代表相对于阵列的坐标参考点(例如，阵列位置、基准标记)的位置。因此，每个特征位置在阵列的坐标空间中具有“地址”或位置。
在一些实施方案中，可使用专用硬件和/或软件来进行空间分析。
用于进行空间分析的合适系统可包括部件如用于容纳生物样品的腔室(例如，流动池或可密封的、不透流体的腔室)。生物样品可例如安装在生物样品保持器中。一个或多个流体腔室可经由流体导管连接到腔室和/或样品保持器，并且流体可经由流体泵、真空源或联接至流体导管的其他装置递送到腔室和/或样品保持器中，所述其他装置产生压力梯度以驱动流体流。还可将一个或多个阀连接到流体导管以调节试剂从储存器向腔室和/或样品保持器的流动。
系统可任选地包括控制单元(其包括一个或多个电子处理器)、输入接口、输出接口(如显示器)和存储单元(例如，固态存储介质，如但不限于磁性、光学或其他固态、持久性、可写入和/或可重写存储介质)。控制单元可任选地经由网络连接到一个或多个远程装置。控制单元(及其部件)通常可执行任何本文描述的步骤和功能。在系统连接到远程装置的情况下，远程装置(或多个远程装置)可执行任何本文描述的步骤或特征。系统可任选地包括用于捕获图像的一个或多个检测器(例如，CCD、CMOS)。系统还可任选地包括用于照射样品的一个或多个光源(例如，基于LED的、基于二极管的、激光器)、具有特征的基底、捕获在基底上的来自生物样品的分析物以及各种控制和校准介质。
系统可任选地包括编码在一个或多个有形存储介质和硬件部件如专用集成电路中和/或在其中实现的软件指令。当由控制单元(特别地，电子处理器)或集成电路执行时，软件指令可使控 制单元、集成电路或执行软件指令的其他部件执行任何本文描述的方法步骤或功能。
在一些情况下，本文描述的系统可检测(例如，配准图像)阵列上的生物样品。
在将分析物从生物样品转移到基底上的特征阵列之前，可将生物样品与阵列对准。生物样品与包括捕获探针的特征的阵列的对准可便于空间分析，所述空间分析可用于检测生物样品中不同位置内分析物的存在和/或水平的差异。
在一些情况下，可使用一个或多个基准标记将分析物的存在和/或水平的地图与生物样品的图像对准，准标记可用作对准的参考点或测量标尺(例如，对准样品与阵列，对准两个基底，确定基底上样品或阵列相对于基准标记的位置)和/或用于尺寸和/或距离的定量测量。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1聚乙二醇(PEG400(100％))封片组织的制备
取实验材料制备成组织切片。
组织固定：将具有10μm厚度的组织切片贴附于具有单链DNA探针的芯片(芯片来源于时空试剂盒，具体为：Stereo-seq转录组试剂套装(载体版)，规格：4RXN，货号：201ST114)上后，对组织进行烤干、有机溶剂固定。
H&E染色：提前-20℃预冷1管30mL的无水甲醇(Sigma，34860-1L-R)和1管30mL的醇溶伊红(Eosin Y，Sangon No.A600190-0025，0.013g溶于25mL无水甲醇中，混合后备用),将贴好组织的芯片放入第一管甲醇中固定27min，再放入醇溶伊红中染色3min，随后放回第一管中漂洗1min，拿出来放在通风橱，待组织和芯片自然风干以后。将苏木素(Sigma，No.51275)滴加在芯片表面(加液量根据芯片面积，每1cm2滴加100μL)，染色7min以后用移液枪吸取表面液体，随后用0.1×SSC溶液(由20×SSC缓冲溶液和不含核酸酶的水配制而成)清洗1次(清洗方法，滴加在表面，然后用移液枪吸走，清洗加液量根据芯片面积，每1cm2滴加100μL)；清洗后准备返蓝(Bluing buffer.Dako,No.CS70230-2),将返蓝试剂滴加在芯片表面(加液量根据芯片面积，每1cm2滴加100μL)，随后用0.1XSSC清洗1次后(方法同上)用气瓶吹干，风速5m/s～10m/s，吹干后加上封片剂，即可准备染色清洗：苏木素染色后使用0.1×SSC溶液(由20×SSC缓冲溶液和不含核酸酶的水配制而成)清洗芯片表面3次，返蓝染色后使用0.1×SSC溶液清洗芯片表面1次，在最后一次倾倒掉组织上的低盐溶液之后，快速(风速5m/s～10m/s)用气瓶吹干芯片及芯片表面的低盐溶液，尽可能减少低盐溶液在芯片上的残留，这一步是决定芯片上track线呈像质量的关键。
封片：使用移液枪缓慢吸取适量聚乙二醇(PEG400(100％))，滴加在芯片中央，随后需要用盖玻片封片，待聚乙二醇完全覆盖芯片表面，即可准备拍照。(操作：将PEG滴在芯片的组织中央，然后按照标准的盖玻片封片的操作进行封片即可；加液量：1cm*1cm尺寸的芯片滴加3.5μL，不同尺寸芯片根据此比例调整加液量；拍照时可以较为清晰地看清track线，并且可以放置较长时间，在此期间内组织上的染料可以保持稳定且较长时间不晕散。
具体流程如图1所示。
实施例2聚乙二醇(PEG6000(50％))封片组织的制备
取实验材料制备成组织切片。
组织固定：将具有10μm厚度的组织切片贴附于具有单链DNA探针的芯片(芯片来源于时空试剂盒，具体为：Stereo-seq转录组试剂套装(载体版)，规格：4RXN，货号：201ST114)上后，对组织进行烤干、有机溶剂固定。
H&E染色和封片同实施例1记载的方法，区别在于封片剂采用聚乙二醇(PEG6000(50％)，其制备方法为：取PEG6000粉末用NF·H2O稀释，浓度为50％)。
具体流程如图1所示。
实施例3聚乙二醇(PEG8000(50％))封片组织的制备
取实验材料制备成组织切片。
组织固定：将具有10μm厚度的组织切片贴附于具有单链DNA探针的芯片(芯片来源于时空试剂盒，具体为：Stereo-seq转录组试剂套装(载体版)，规格：4RXN，货号：201ST114)上后，对组织进行烤干、有机溶剂固定。
H&E染色和封片同实施例1记载的方法，区别在于封片剂采用聚乙二醇(PEG8000(50％)，购自RIGAKU，其制备方法为：PEG8000粉末用ASTM I类水稀释，浓度为50％)。
具体流程如图1所示。
实施例4聚乙二醇(混合)封片组织的制备
取实验材料制备成组织切片。
组织固定：将具有10μm厚度的组织切片贴附于具有单链DNA探针的芯片(芯片来源于时空试剂盒，具体为：Stereo-seq转录组试剂套装(载体版)，规格：4RXN，货号：201ST114)上后，对组织进行烤干、有机溶剂固定。
H&E染色和封片同实施例1记载的方法，区别在于封片剂分别采用PEG400(100％)、PEG6000(50％)、PEG8000(50％)三种试剂以体积比为1:1:1的比例混合获得聚乙二醇混合液；
PEG8000的品牌为RIGAKU，50％(w/v)，其制备方法为：PEG8000粉末用ASTM I类水稀释，浓度为50％；PEG6000粉末用NF·H2O稀释，浓度为50％。
具体流程如图1所示。
实施例5聚乙二醇封片组织时空捕获
使用实施例1记载的实验方法制备组织封片并进行拍照，弃盖玻片，使用低盐溶液(0.1×SSC缓冲液)浸泡3～5s洗去聚乙二醇，清洗溶液浓度过高或者清洗次数过多都会不同程度地影响时空转录组的捕获。用PH2的盐酸(0.01N盐酸)预洗芯片调节芯片的酸碱度，加透化试剂(透化试剂来源于时空试剂盒)，操作步骤参照试剂盒说明书(Stereo-seq转录组试剂套装(载体版)，规格：4RXN，货号：201ST114，试剂盒版本V1.2)，具体为：
对组织进行透化及后续的mRNA逆转录反应，获得cDNA后，对芯片进行酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，对该cDNA进行后续建库、测序等一系列操作。获得带有位置信息的mRNA的序列信息，再对数据进行分析获得mRNA或蛋白的原位表达信息。
按照MGI DNB make和测序试剂配制操作标准流程进行芯片制备和上机测序，利用BGI时空组学可视化系统进行下机数据分析。
具体流程如图1所示。
实施例6聚乙二醇封片组织时空捕获
使用实施例2记载的实验方法制备组织封片并进行拍照，弃盖玻片，使用低盐溶液(0.1×SSC缓冲液)浸泡3～5s洗去聚乙二醇，清洗溶液浓度过高或者清洗次数过多都会不同程度地影响时空转录组的捕获。用PH2的盐酸(0.01N盐酸)预洗芯片调节芯片的酸碱度，加透化试剂(透化试剂来源于时空试剂盒)，操作步骤也参照试剂盒说明书(Stereo-seq转录组试剂套装(载体版)，规格：4RXN，货号：201ST114，试剂盒版本V1.2)，具体为：
对组织进行透化及后续的mRNA逆转录反应，获得cDNA后，对芯片进行酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，对该cDNA进行后续建库、测序等一系列操作。获得带有位置信息的mRNA的序列信息，再对数据进行分析获得mRNA或蛋白的原位表达信息。
按照MGI DNB make和测序试剂配制操作标准流程进行芯片制备和上机测序，利用BGI时空组学可视化系统进行下机数据分析。
具体流程如图1所示。
实施例7聚乙二醇封片组织时空捕获
使用实施例3记载的实验方法制备组织封片并进行拍照，弃盖玻片，使用低盐溶液(0.1×SSC缓冲液)浸泡3～5s洗去聚乙二醇，清洗溶液浓度过高或者清洗次数过多都会不同程度地影响时空转录组的捕获。用PH2的盐酸(0.01N盐酸)预洗芯片调节芯片的酸碱度，加透化试剂(透化试剂来源于时空试剂盒)，操作步骤也参照试剂盒说明书(Stereo-seq转录组试剂套装(载体版)，规格：4RXN，货号：201ST114，试剂盒版本V1.2)，具体为：
对组织进行透化及后续的mRNA逆转录反应，获得cDNA后，对芯片进行酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，对该cDNA进行后续建库、测序等一系列操作。获得带有位置信息的mRNA的序列信息，再对数据进行分析获得mRNA或蛋白的原位表达信息。
按照MGI DNB make和测序试剂配制操作标准流程进行芯片制备和上机测序，利用BGI时空组学可视化系统进行下机数据分析。
具体流程如图1所示。
实施例8聚乙二醇封片组织时空捕获
使用实施例4记载的实验方法制备组织封片并进行拍照，弃盖玻片，使用低盐溶液(0.1×SSC缓冲液)浸泡3～5s洗去聚乙二醇，清洗溶液浓度过高或者清洗次数过多都会不同程度地影响时空转录组的捕获。用PH2的盐酸(0.01N盐酸)预洗芯片调节芯片的酸碱度，加透化试剂(透化试剂来源于时空试剂盒)，操作步骤也参照试剂盒说明书(Stereo-seq转录组试剂套装(载体版)，规格：4RXN，货号：201ST114，试剂盒版本V1.2)，具体为：
对组织进行透化及后续的mRNA逆转录反应，获得cDNA后，对芯片进行酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，对该cDNA进行后续建库、测序等一系列操作。获得带有位置信息的mRNA的序列信息，再对数据进行分析获得mRNA或蛋白的原位表达信息。
按照MGI DNB make和测序试剂配制操作标准流程进行芯片制备和上机测序，利用BGI时空组学可视化系统进行下机数据分析。
具体流程如图1所示。
实施例9聚乙二醇封片组织时空捕获(DAPI染色时空捕获)
取实验材料制备成组织切片。
组织固定：将具有10μm厚度的组织切片贴附于具有单链DNA探针的芯片(芯片来源于时空试剂盒，具体为：Stereo-seq转录组试剂套装(载体版)，规格：4RXN，货号：201ST114)上后，对组织进行烤干、有机溶剂固定。
DAPI染色：用dapi染料(Thermo 62248)滴加在芯片表面(每张芯片1cm2滴加100μL)L)，避光孵育5分钟。
染色清洗：苏木素染色后使用0.1×SSC溶液(由20×SSC缓冲溶液和不含核酸酶的水配制而成)清洗芯片表面3次，返蓝染色后使用0.1×SSC溶液清洗芯片表面1次，在最后一次倾倒掉组织上的低盐溶液之后，快速(风速5m/s～10m/s)用气瓶吹干芯片及芯片表面的低盐溶液，尽可能减少低盐溶液在芯片上的残留，这一步是决定芯片上track线呈像质量的关键。
封片：使用移液枪缓慢吸取适量聚乙二醇(PEG400(100％))，滴加在芯片中央，随后需要用盖玻片封片，待聚乙二醇完全覆盖芯片表面，即可准备拍照。(操作：将PEG滴在芯片的组织中央，然后按照标准的盖玻片封片的操作进行封片即可；加液量：1cm*1cm尺寸的芯片滴加3.5μL，不同尺寸芯片根据此比例调整加液量；不同分子量的PEG稀释比例；PEG8000的品牌为RIGAKU，50％(w/v)，PEG6000粉末用NF·H2O稀释，浓度为50％)。
拍照后弃盖玻片，使用低盐溶液(0.1×SSC缓冲液)浸泡3～5s洗去聚乙二醇，清洗溶液浓度过高或者清洗次数过多都会不同程度地影响时空转录组的捕获。用PH2的盐酸(0.01N盐酸)预洗芯片调节芯片的酸碱度，加透化试剂对组织进行透化及后续的mRNA逆转录反应，获得cDNA后，对芯片进行酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，对该cDNA进行后续建库、测序等 一系列操作。获得带有位置信息的mRNA的序列信息，再对数据进行分析获得mRNA或蛋白的原位表达信息。
按照MGI DNB make和测序试剂配制操作标准流程进行芯片制备和上机测序，利用BGI时空组学可视化系统进行下机数据分析。
实施例10聚乙二醇封片组织时空捕获(ssDNA染色时空捕获)
取实验材料制备成组织切片。
组织固定：将具有10μm厚度的组织切片贴附于具有单链DNA探针的芯片(芯片来源于时空试剂盒，具体为：Stereo-seq转录组试剂套装(载体版)，规格：4RXN，货号：201ST114)上后，对组织进行烤干、有机溶剂固定。
ssDNA染色：用0.1XSSC稀释qubit ssDNA染色液(Qubit,货号Q10212)，稀释方法：0.5μLssDNA染色原液+99.5μL 0.1XSSC溶液，配制好后，滴在芯片表面，滴加量(每1cm2滴加100μL)，避光孵育5min。
染色清洗：苏木素染色后使用0.1×SSC溶液(由20×SSC缓冲溶液和不含核酸酶的水配制而成)清洗芯片表面3次，返蓝染色后使用0.1×SSC溶液清洗芯片表面1次，在最后一次倾倒掉组织上的低盐溶液之后，快速(风速5m/s～10m/s)用气瓶吹干芯片及芯片表面的低盐溶液，尽可能减少低盐溶液在芯片上的残留，这一步是决定芯片上track线呈像质量的关键。
封片：使用移液枪缓慢吸取适量聚乙二醇(PEG400(100％))，滴加在芯片中央，随后需要用盖玻片封片，待聚乙二醇完全覆盖芯片表面，即可准备拍照。(操作：将PEG滴在芯片的组织中央，然后按照标准的盖玻片封片的操作进行封片即可；加液量：1cm*1cm尺寸的芯片滴加3.5μL，不同尺寸芯片根据此比例调整加液量；不同分子量的PEG稀释比例；PEG8000的品牌为RIGAKU，50％(w/v)，PEG6000粉末用NF·H2O稀释，浓度为50％)。
拍照后弃盖玻片，使用低盐溶液(0.1×SSC缓冲液)浸泡3～5s洗去聚乙二醇，清洗溶液浓度过高或者清洗次数过多都会不同程度地影响时空转录组的捕获。用PH2的盐酸(0.01N盐酸)预洗芯片调节芯片的酸碱度，加透化试剂对组织进行透化及后续的mRNA逆转录反应，获得cDNA后，对芯片进行酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，对该cDNA进行后续建库、测序等一系列操作。获得带有位置信息的mRNA的序列信息，再对数据进行分析获得mRNA或蛋白的原位表达信息。
按照MGI DNB make和测序试剂配制操作标准流程进行芯片制备和上机测序，利用BGI时空组学可视化系统进行下机数据分析。
实施例11聚乙二醇(PEG400、PEG6000、PEG8000)封片与甘油封片的拍照结果对比
实验材料：小鼠胃、小鼠睾丸、小鼠半脑，100％甲醇(Sigma-Aldrich)，聚乙二醇400(SangonBiotech)，醇溶伊红(SangonBiotech)，苏木素染液(Sigma)，返蓝染液(Agilent)，0.1×SSC，盖玻片(世泰)，100％甘油(Diomand)。
实验器材：切片机(Leica)，压缩空气罐(CINE EDC GEAR)，显微镜(Motic PA53)。
实验分组：
H&E玻片组：以小鼠胃作为实验材料，将具有10μm厚度的组织切片贴附于载玻片上；H&E染色和封片同实施例1记载的方法；
对照组1：以小鼠胃作为实验材料，遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)(A0)，试剂盒套装201SP118(8RXNs)操作，进行甘油封片；
对照组2：以小鼠睾丸作为实验材料，遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)(A0)，试剂盒套装201SP118(8RXNs)操作，进行甘油封片；
对照组3：以小鼠半脑作为实验材料，遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)(A0)，试剂盒套装201SP118(8RXNs)操作，进行甘油封片；
测试组1：以小鼠胃作为实验材料，按照实施例1记载的实验方法以聚乙二醇400作为封片剂制备组织封片并拍照；
测试组2：以小鼠睾丸作为实验材料，按照实施例1记载的实验方法以聚乙二醇400作为封片剂制备组织封片并拍照；
测试组3：以小鼠睾丸作为实验材料，按照实施例3记载的实验方法以聚乙二醇8000作为封片剂制备组织封片并拍照；
测试组4：以小鼠半脑作为实验材料，按照实施例2记载的实验方法以聚乙二醇6000作为封片剂制备组织封片并拍照。
实验结果：
(1)小鼠胃的封片拍照结果如图2、图3所示：
图2中1、2、3分别为小鼠胃切片在玻片上的H&E染色、芯片染色聚乙二醇400封芯片(测试组1)、芯片染色甘油封片(对照组1)的拍照结果，2张芯片染色的图像整体染色效果比较接近玻片，但是可以看到H&E芯片染色，聚乙二醇400封片的组织边界更清晰，图像色彩更艳丽。
对比聚乙二醇400封片和甘油封片的组织区域和空白区域，我们可以发现聚乙二醇400封片的组织区域伊红的着色很均匀，无伊红晕散的情况，而甘油封片的图像中组织区域出现了明显的伊红晕散；相比于甘油封片，使用聚乙二醇400封片可以在芯片空白区域拍到更清晰的track线(如图3所示)。
(2)小鼠睾丸的封片拍照结果如图4、5所示：
图4中1、2、3分别为小鼠睾丸切片在芯片上的H&E染色后使用聚乙二醇400封芯片(测试组2)、聚乙二醇8000封芯片(测试组3)、甘油封片(对照组2)的拍照结果，相比甘油封片，聚乙二醇封片的两例H&E染色图像色彩更艳丽，且无伊红晕开的情况。
对比聚乙二醇封片和甘油封片的组织边缘区域和组织内空腔区域，我们可以发现聚乙二醇封片的组织区域边缘和组织空腔区域的组织边界非常清晰，伊红的着色很均匀，无伊红晕散的情况，而甘油封片的图像中组织边缘和组织内空腔区域均出现了明显的伊红晕散(如图5所示)。
(3)小鼠半脑的封片拍照结果如图6所示：
图6中1、2分别为小鼠半脑冠状面切片在芯片上的H&E染色后使用聚乙二醇6000封芯片(测试组4)、甘油封片(对照组3)的拍照结果，H&E芯片染色，聚乙二醇6000封片的组织边界更清晰，图像色彩更艳丽；甘油封片的组织边缘有明显的晕散情况，组织空腔也可以观察到明显的伊红晕散。
综上，可以看到相比甘油封片，聚乙二醇(PEG400、PEG6000、PEG8000)封片均在H&E染色的新鲜冷冻包埋的组织切片上有更好的表现，聚乙二醇封片可以有效缓解组织上的伊红晕散问题，提升H&E染色后的图像色彩鲜艳程度和核质对比情况。对于华大时空芯片，聚乙二醇封片可以有效提升落射(反射)明场光照下track线的清晰程度。
实施例12聚乙二醇(PEG400)封片后留存时间
实验材料：小鼠小肠、肿瘤样本，100％甲醇(Sigma-Aldrich)，聚乙二醇400(SangonBiotech)，醇溶伊红(SangonBiotech)，苏木素染液(Sigma)，返蓝染液(Agilent)，0.1×SSC，盖玻片(世泰)，100％甘油(Diomand)。
实验器材：切片机(Leica)，压缩空气罐(CINE EDC GEAR)，显微镜(Motic PA53)。
实验分组：
对照组：以小鼠小肠作为实验材料，遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)(A0)，试剂盒套装201SP118(8RXNs)操作，进行甘油封片；
测试组1：以肿瘤样本作为实验材料，按照实施例1记载的实验方法以PEG400作为封片剂制备组织封片并拍照。
测试组2：以小鼠小肠作为实验材料，按照实施例1记载的实验方法以PEG400作为封片剂 制备组织封片并拍照。
实验结果：
(1)肿瘤样本：
肿瘤样本在聚乙二醇400封片(测试组1)后H&E染色图像可以留存更长时间，组织边缘清晰，染色均匀，封片后31分钟也没有任何伊红晕散的情况(如图7所示)；
(2)小鼠小肠：
如图8所示，相比甘油封片(对照组)，小鼠小肠聚乙二醇400封片(测试组2)后H&E染色图像可以留存更长时间，如果不考虑后续捕获量，留存三天，仍然有较好的图像质量。
综上，可以看到相比甘油封片，聚乙二醇(PEG400)封片均在H&E染色的新鲜冷冻包埋的组织切片上有更好的表现，且留存时间更长，聚乙二醇封片可以有效缓解组织上的伊红晕散问题，提升H&E染色后的图像色彩鲜艳程度和核质对比情况。对于华大时空芯片，聚乙二醇封片可以有效提升落射(反射)明场光照下track线的清晰程度。
实施例13聚乙二醇封片，不同清洗流程时空捕获结果对比
实验材料：小鼠心脏，100％甲醇(Sigma-Aldrich)，QubitTM ssDNA Reagent(Invitrogen)，5×SSC，0.1×SSC，盖玻片(世泰)，100％PEG400(Sigma)，100％甘油(Diomand)，STOmics基因表达试剂盒-S1，STOmics文库制备试剂盒-S1(BGI)，Seq2000测序试剂盒PE100(MGI)；
实验器材：切片机(Leica)，压缩空气罐(CINE EDC GEAR)，显微镜(Mitoc PA53)，Seq2000测序仪(MGI)
实验方法：三组芯片遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)操作；
实验分组：
对照组为实验人员用同样组织做H&E染色后，按照说明书标准流程所得mRNA捕获结果，甘油封片，mRNA捕获结果；
测试组1：以小鼠心脏切片为实验材料，以聚乙二醇400进行封片，通过，按照说明书标准流程(原清洗流程进行清洗)获得时空捕获结果；
测试组2：以小鼠心脏切片为实验材料，以聚乙二醇400进行封片，通过，按照实施例5记载的实验方法(优化清洗流程进行清洗)获得时空捕获结果；
实验结果：
(1)时空组学分析结果如图9所示；
图9中1示甘油封片，原清洗流程，bin50(对照组)；
图9中2示聚乙二醇(PEG400,100％)封片，原清洗流程(测试组1)，bin50；
图9中3聚乙二醇(PEG400,100％)封片，优化后清洗流程(测试组2)，bin50；
(2)mRNA捕获结果如表1所示：
表1小鼠心脏不同封片剂不同清洗流程的mRNA捕获结果
从结果上来看，优化后的清洗流程，可以较为明显地提升时空捕获，在Dup更低的情况下，捕获量(Bin200 Median Gene Type和Median MID)均比甘油封片、聚乙二醇封片原清洗方案有了不同程度的提升。
实施例14聚乙二醇封片组织、甘油封片组织时空捕获结果对比
实验材料：小鼠睾丸，100％甲醇(Sigma-Aldrich)，QubitTM ssDNA Reagent(Invitrogen)，5×SSC，0.1×SSC，盖玻片(世泰)，100％PEG400(Sangon Biotech)，50％PEG8000(Sigma)，100％甘油(Diomand)，STOmics基因表达试剂盒-S1，STOmics文库制备试剂盒-S1(BGI)，Seq2000测序试剂盒PE100(MGI)。
实验器材：切片机(Leica)，压缩空气罐(CINE EDC GEAR)，显微镜(Mitoc PA53)，Seq2000测序仪(MGI)。
实验分组：
对照组(H&E染色，甘油封片)遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)操作，实验人员用同样组织做H&E染色后，按照华大时空转录组试剂盒标准流程所得mRNA捕获结果，甘油封片拍照，mRNA捕获结果；
测试组1(H&E染色，PEG400封片)：以小鼠睾丸为实验材料，按照实施例5记载的实验方法获得时空捕获结果；
测试组2(H&E染色，PEG8000封片)：以小鼠睾丸为实验材料，按照实施例7记载的实验方法获得时空捕获结果；
时空组学分析结果：
(1)可视化图像(Bin50)如图10所示；
(2)mRNA捕获结果如表2所示：
表2小鼠睾丸不同封片剂的mRNA捕获结果
注：括号为调整为统一dup数值下，Genetype和MID数据量的比较。
(3)H&E染色图像如图11所示：
从结果上来看，相比于甘油封片(对照组)，聚乙二醇(PEG400、PEG8000)(测试组1、测试组2)封片在有效提升图像质量(如图11所示)的情况下，覆盖率(MID_UT/Unique Reads)不变，在相同Dup下，捕获量(Bin200 Gene Type和MID)也不受影响。
实施例15聚乙二醇封片组织、甘油封片组织时空捕获结果对比
实验材料：小鼠胸腺，100％甲醇(Sigma-Aldrich)，QubitTM ssDNA Reagent(Invitrogen)，5×SSC，0.1×SSC，盖玻片(世泰)，100％PEG400(Sigma)，50％PEG6000(Sigma)，100％甘油(Diomand)，STOmics基因表达试剂盒-S1，STOmics文库制备试剂盒-S1(BGI)，Seq2000测序试剂盒PE100(MGI)；
实验器材：切片机(Leica)，压缩空气罐(CINE EDC GEAR)，显微镜(Mitoc PA53)，Seq2000测序仪(MGI)；
实验分组：
对照组遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)操作，实验人员用同样组织做H&E染色后，按照说明书标准流程所得mRNA捕获结果；其中，对照组1不进行封片操作，对照组2采用甘油进行封片。
测试组1(H&E染色，PEG400封片)：以小鼠胸腺为实验材料，按照实施例5记载的实验方法获得时空捕获结果。
测试组2(H&E染色，PEG6000封片)：以小鼠胸腺为实验材料，按照实施例6记载的实验方法获得时空捕获结果。
时空组学分析结果：
(1)可视化图像(Bin50)如图12所示；
图12中1示不做封片，Bin50
图12中2示甘油封片可视化，Bin50
图12中3示PEG400封片(聚乙二醇400)可视化，Bin50
图12中4示PEG6000封片(聚乙二醇6000)可视化，Bin50
(2)mRNA捕获结果如表3所示：
表3小鼠胸腺不同封片剂的mRNA捕获结果
注：括号为调整为统一dup数值下，Genetype和MID数据量的比较。
(3)H&E染色图像：(不封片处理未拍照)，拍照结果如图13所示：
结果上来看，相比不封片，三种封片剂都可以有效提升组织的捕获均匀度，可视化的结果和H&E的染色结果(如图13所示)基本一致，而不封片可以明显看到有捕获不均匀的情况；三种封片剂可以有效提升mRNA捕获的覆盖率(MID_UT/Unique Reads，覆盖率越高，代表原位捕获的情况越好)，且捕获量和不封片没有明显差异。
实施例16聚乙二醇(混合)封片时空捕获结果对比
实验材料：小鼠肝脏，100％甲醇(Sigma-Aldrich)，QubitTM ssDNA Reagent(Invitrogen)，5×SSC，0.1×SSC，盖玻片(世泰)，100％PEG400(Sigma)，50％PEG6000(Sigma)，50％PEG8000(Sigma)，100％甘油(Diomand)，STOmics基因表达试剂盒-S1，STOmics文库制备试剂盒-S1(BGI)，Seq2000测序试剂盒PE100(MGI)。
实验器材：切片机(Leica)，压缩空气罐(CINE EDC GEAR)，显微镜(Mitoc PA53)，Seq2000测序仪(MGI)。
实验方法：两组芯片遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)操作，
实验分组：
对照组为实验人员用同样组织做H&E染色后甘油封片，按照说明书标准流程所得mRNA捕获结果；
测试组按照实施例8记载的实验方法，以PEG400(100％)、PEG6000(50％)、PEG8000(50％)三种试剂以1:1:1的比例混合以后的试剂取3.5μL封片，获得mRNA捕获结果，其中，PEG8000的品牌为RIGAKU，50％(w/v)其制备方法为：PEG8000粉末用ASTM I类水稀释， 浓度为50％，PEG6000粉末用NF·H2O稀释，浓度为50％。
实验结果：
(1)H&E染色图像如图14所示；
(2)时空组学分析结果如图15所示；
图15中1示甘油封片，bin50；
图15中2示聚乙二醇(混合)封片，bin50；
(3)mRNA捕获结果如表4所示：
表4小鼠肝脏不同封片剂的mRNA捕获结果
注：括号为调整为统一dup数值下，Genetype和MID数据量的比较。
从结果上来看，混合后的聚乙二醇作为封片剂，也可以有效提升图像质量，缓解伊红晕散的问题，在Dup更低的情况下，捕获量(Bin200Median Gene Type和Median MID)比甘油封片有提升，相同dup52％，捕获提升134％。
实施例17聚乙二醇封片组织、甘油封片组织时空捕获结果对比
实验材料：小鼠半脑，小鼠淋巴结，100％甲醇(Sigma-Aldrich)，QubitTM ssDNA Reagent(Invitrogen)，5×SSC，0.1×SSC，盖玻片(世泰)，100％PEG400(Sigma)，50％PEG6000(Sigma)，50％PEG8000(Sigma)，100％甘油(Diomand)，STOmics基因表达试剂盒-S1，STOmics文库制备试剂盒-S1(BGI)，Seq2000测序试剂盒PE100(MGI)；
实验器材：切片机(Leica)，压缩空气罐(CINE EDC GEAR)，显微镜(Mitoc PA53)，Seq2000测序仪(MGI)
实验分组：
1、以小鼠睾丸为实验材料:
对照组1(H&E染色，甘油封片)遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)操作，实验人员用同样组织做H&E染色后，按照华大时空转录组试剂盒标准流程所得mRNA捕获结果，甘油封片拍照，mRNA捕获结果；
测试组1(H&E染色，PEG400封片)：以小鼠睾丸为实验材料，按照实施例5记载的实验方法获得时空捕获结果；
测试组2(H&E染色，PEG8000封片)：以小鼠睾丸为实验材料，按照实施例7记载的实验方法获得时空捕获结果；
2、以小鼠胸腺为实验材料:
对照组2遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)操作，实验人员用同样组织做H&E染色后，按照说明书标准流程所得mRNA捕获结果；其中，对照组1不进行封片操作，对照组2采用甘油进行封片。
测试组3(H&E染色，PEG400封片)：以小鼠胸腺为实验材料，按照实施例5记载的实验方法获得时空捕获结果。
测试组4(H&E染色，PEG6000封片)：以小鼠胸腺为实验材料，按照实施例6记载的实验方法获得时空捕获结果。
3、、以小鼠肝脏为实验材料:
对照组3为实验人员用同样组织做H&E染色后甘油封片，按照说明书标准流程所得mRNA 捕获结果；
测试组5按照实施例8记载的实验方法，以PEG400(100％)、PEG6000(50％)、PEG8000(50％)三种试剂以1:1:1的比例混合以后的试剂取3.5μL封片，获得mRNA捕获结果，其中，PEG8000的品牌为RIGAKU，50％(w/v)其制备方法为：PEG8000粉末用ASTM I类水稀释，浓度为50％，PEG6000粉末用NF·H2O稀释，浓度为50％。
4、以小鼠半脑为实验材料：
对照组4(以Glycerol为封片剂)：以小鼠半脑为实验材料，遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)操作，实验人员用同样组织做H&E染色后，按照说明书标准流程所得mRNA捕获结果；
测试组6(以PEG400为封片剂)：以小鼠半脑为实验材料，按照实施例5记载的实验方法获得mRNA捕获的结果；
测试组7(以PEG8000为封片剂)：以小鼠半脑为实验材料，按照实施例6记载的实验方法获得mRNA捕获的结果；
测试组8(以PEG6000为封片剂)：以小鼠半脑为实验材料，按照实施例7记载的实验方法获得mRNA捕获的结果；
5、以小鼠淋巴结为实验材料：
对照组5(以Glycerol为封片剂)：以小鼠淋巴结为实验材料，遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)操作，实验人员用同样组织做H&E染色后，按照说明书标准流程所得mRNA捕获结果；
测试组9(以PEG400为封片剂)：以小鼠淋巴结为实验材料，按照实施例5记载的实验方法获得mRNA捕获的结果。
实验结果如表5所示：
表5同一样本使用不同封片剂的捕获差异对比(相同dup)
综上，可以看到相比甘油封片，聚乙二醇(PEG400、PEG6000、PEG8000)封片均在H&E染色的新鲜冷冻包埋的组织切片上有更好的表现，这三种聚乙二醇试剂作为封片剂，可以起到类似甘油提升原位捕获的同时，处理过的样本在时空捕获量上也不受到影响。
实施例18聚乙二醇(PEG400)封片，DAPI染色时空捕获结果对比
实验材料：小鼠胃，100％甲醇(Sigma-Aldrich)，DAPI染液(Thermo,62248)，5×SSC，0.1×SSC，盖玻片(世泰)，100％PEG400(Sigma)，100％甘油(Diomand)，STOmics基因表达试剂盒-S1，STOmics文库制备试剂盒-S1(BGI)，Seq2000测序试剂盒PE100(MGI)。
实验器材：切片机(Leica)，压缩空气罐(CINE EDC GEAR)，显微镜(Mitoc PA53)，Seq2000测序仪(MGI)。
实验方法：两组芯片遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书操作；
实验分组：
(1)对照组(DAPI染色，甘油封片)为实验人员用同样组织按照说明书做常规转录组标准流程所的mRNA捕获结果；
(2)测试组(DAPI染色，PEG400封片)为按照实施例9记载的实验方法获得时空捕获结果；
实验结果：
(1)时空组学分析结果如图16所示：
图16中1示甘油封片，bin50；
图16中2示聚乙二醇(PEG400,100％)封片，bin50；
(2)mRNA捕获结果如表6所示：
表6小鼠胃DAPI染色不同封片剂的mRNA捕获结果
从结果上来看，对于DAPI染色，PEG封片相比甘油封片，捕获提升20％，且覆盖率高于甘油封片的结果。
实施例19聚乙二醇(PEG400)封片，ssDNA染色时空捕获结果对比
实验材料：小鼠胃，100％甲醇(Sigma-Aldrich)，QubitTM ssDNA Reagent(Invitrogen)，5×SSC，0.1×SSC，盖玻片(世泰)，100％PEG400(Sigma)，100％甘油(Diomand)，STOmics基因表达试剂盒-S1，STOmics文库制备试剂盒-S1(BGI)，Seq2000测序试剂盒PE100(MGI)。
实验器材：切片机(Leica)，压缩空气罐(CINE EDC GEAR)，显微镜(Mitoc PA53)，Seq2000测序仪(MGI)。
实验方法：两组芯片遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书操作；
实验分组：
(1)对照组为实验人员用同样组织按照说明书做常规转录组标准流程所的mRNA捕获结果(采用ssDNA染色，甘油封片)；
(2)测试组(ssDNA染色，PEG400封片)按照实施例10记载的实验方法获得时空捕获结果；
实验结果：
(1)时空组学分析结果如图17所示：
图17中1示甘油封片，bin50；
图17中2示聚乙二醇(PEG400,100％)封片，bin50；
(2)mRNA捕获结果如表7所示：
表7小鼠胃染色不同封片剂的mRNA捕获结果
从结果上来看，对于ssDNA染色，PEG封片相比甘油封片，捕获和覆盖率无明显影响，可以作为甘油的平替。
实施例20 track线的清晰程度对比
实验材料：样本为市面上成品的OCT包埋新鲜冷冻样本；使用徕卡切片机，选取目标位置切片，每片厚度10μm。
实验方法：
对照组：遵照华大基因—Stereo-seq转录组试剂套装使用说明书(兼容H&E)(A0)，试剂盒套装201SP118(8RXNs)操作，进行甘油封片，并选取非组织区域进行拍照。
测试组：按照实施例1记载的实验方法以PEG400作为封片剂制备组织封片并选取非组织区域进行拍照。
试验结果：
图18中1示甘油封片，原清洗流程；
图18中2示PEG400封片剂封片，新流程；
图18中3示统计H&E图像QC通过率(优化前46例，优化后50例)。
相比于甘油封片，H&E封片流程可以有效提升track线的清晰程度，大大提升自动配准流程QC的通过率，经过优化，H&E自动流程配准通过率从15％提升至64％，流程稳定后，QC通过率达到90％。
以上对本发明所提供的用于提升时空芯片H&E染色图像质量的方法、试剂组合、试剂盒和装置进行了详细介绍。本文应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (20)

  1. 聚乙二醇或聚乙二醇的组合物作为封片剂和低盐溶液作为清洗剂在如下任意项中的应用；
    (I)、组织染色后的封片；和/或
    (II)、避免染色后细胞或组织掉色或染色晕散；和/或
    (III)、提高时空芯片的图像质量；和/或
    (IV)、提高时空芯片track线成像清晰度；和/或
    (V)、提高染色后细胞的核质比；和/或
    (VI)、延长染色图像的保存时间；和/或
    (VII)、细胞分型或组织分型；和/或
    (VIII)、cellbin表达分析；和/或
    (IX)、提升染色图像与时空表达矩阵的配准精度；和/或
    (X)、不影响或提升时空捕获率和/或覆盖率；和/或
    (XI)、提高获取mRNA和/或蛋白表达信息的准确度；
    所述低盐溶液包括但不限于0.1×SSC。
  2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述染色包括但不限于空间组学的H&E染色、空间组学ssDNA染色、DAPI染色中的一种或多种的组合；或
    所述聚乙二醇的组合物包括但不限于如下任意项：
    (I)、不同分子量的聚乙二醇的组合物；和/或
    (II)、水和/或添加剂与聚乙二醇的组合物；和/或
    所述添加剂包括但不限于RNA酶抑制剂或甘油。
  3. 如权利要求1或2任一项所述的应用，其特征在于，所述聚乙二醇包括但不限于聚乙二醇400、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000中的一种或多种的组合。
  4. 封片剂，其特征在于，包括聚乙二醇或聚乙二醇的组合物；
    所述聚乙二醇或聚乙二醇的组合物作为封片剂用于如下任意项；
    (I)、组织染色后的封片；和/或
    (II)、避免染色后细胞或组织掉色或染色晕散；和/或
    (III)、提高时空芯片的图像质量；和/或
    (IV)、提高时空芯片track线呈像清晰度；和/或
    (V)、提高染色后细胞的核质比；和/或
    (VI)、延长染色图像的保存时间；和/或
    (VII)、细胞分型或组织分型；和/或
    (VIII)、cellbin表达分析；和/或
    (IX)、提升染色图像与时空表达矩阵的配准精度；和/或
    (X)、不影响或提升时空捕获率和/或覆盖率；和/或
    (XI)、提高获取mRNA和/或蛋白表达信息的准确度；
    所述聚乙二醇的组合物包括但不限于如下任意项：
    (I)、不同分子量的聚乙二醇的组合物；和/或
    (II)、水和/或添加剂与聚乙二醇的组合物；和/或
    所述添加剂包括但不限于RNA酶抑制剂或甘油。
  5. 如权利要求4所述的封片剂，其特征在于，所述聚乙二醇包括但不限于聚乙二醇400、聚乙二醇6000水溶液或聚乙二醇8000水溶液中的一种或多种的组合。
  6. 如权利要求5所述的封片剂，其特征在于，以g/mL计，所述聚乙二醇6000水溶液中聚乙二醇6000和水的质量体积比包括但不限于1:2；所述聚乙二醇8000和水的质量体积比包括但不限于1:2；或
    所述聚乙二醇400、所述聚乙二醇6000水溶液和所述聚乙二醇8000水溶液的体积比包括但不限于1:1:1。
  7. 试剂组合，其特征在于，包括但不限于如权利要求4至6任一项所述的封片剂和清洗剂；
    所述清洗剂包括但不限于0.1×SSC。
  8. 试剂盒，其特征在于，包括但不限于：
    (I)、如权利要求4至6任一项所述的封片剂；和/或
    (II)、如权利要求7所述的试剂组合。
  9. 如权利要求7所述的试剂组合或如权利要求8所述的试剂盒在如下任意项中的应用；
    (I)、组织染色后的封片；和/或
    (II)、避免染色后细胞或组织掉色或染色晕散；和/或
    (III)、提高时空芯片的图像质量；和/或
    (IV)、提高时空芯片track线呈像清晰度；和/或
    (V)、提高染色后细胞的核质比；和/或
    (VI)、延长染色图像的保存时间；和/或
    (VII)、细胞分型或组织分型；和/或
    (VIII)、cellbin表达分析；和/或
    (IX)、提升染色图像与时空表达矩阵的配准精度；和/或
    (X)、不影响或提升时空捕获率和/或覆盖率；和/或
    (XI)、提高获取mRNA和/或蛋白表达信息的准确度。
  10. 组织切片的处理方法，其特征在于，采用如权利要求7所述试剂组合中的所述清洗剂或如权利要求8所述试剂盒中的所述清洗剂与染色后的组织切片接触，清洗染色组织上多余的苏木素和/或返蓝染料，吹干，再经如权利要求4至6任一项所述封片剂、如权利要求7所述试剂组合中的所述封片剂或如权利要求8所述试剂盒中的所述封片剂封片。
  11. 如权利要求10所述的处理方法，其特征在于，所述清洗剂的清洗次数不少于1次，优选1次或3次；或
    所述吹干的速率包括但不限于：5m/s～10m/s。
  12. 如权利要求10或11任一项所述处理方法制备获得的组织切片。
  13. 提高时空芯片的图像质量和/或提高时空芯片track线呈像清晰度的方法，其特征在于，
    取组织切片固载于具有探针的芯片，烤干、固定、染色、弃染料，获得染色后的组织芯片；
    采用如权利要求7所述试剂组合中的所述清洗剂或如权利要求8所述试剂盒中的所述清洗剂与所述染色后的组织芯片接触，清洗染色组织上多余的苏木素和/或返蓝染料，吹干，再经如权利要求4至6任一项所述封片剂、如权利要求7所述试剂组合中的所述封片剂或如权利要求8所述试剂盒中的所述封片剂封片。
  14. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述清洗剂的清洗次数不少于1次，优选1次或3次；或
    所述吹干的速率包括但不限于：5m/s～10m/s。
  15. 如权利要求13后14任一项所述方法制备获得的时空芯片。
  16. 提高获取mRNA和/或蛋白表达信息的准确度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
    步骤1：取组织切片固载于具有探针的芯片，烤干、固定、染色、弃染料，获得染色后的组织芯片；
    步骤2：采用如权利要求7所述试剂组合中的所述清洗剂或如权利要求8所述试剂盒中的所述清洗剂与所述染色后的组织芯片接触，洗去残留的染料，吹干；
    步骤3：再经如权利要求4至6任一项所述封片剂、如权利要求7所述试剂组合中的所述封片剂或如权利要求8所述试剂盒中的所述封片剂封片，拍照；
    步骤4：采用如权利要求7所述试剂组合中的所述清洗剂或如权利要求8所述试剂盒中的所 述清洗剂去除所述封片剂，调节pH值，透化，mRNA逆转录，获得cDNA；
    步骤5：再经酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，建库、测序，获得mRNA和/或蛋白表达信息。
  17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述清洗剂的清洗次数不少于1次，优选1次或3次；或
    所述吹干的速率包括但不限于：5m/s～10m/s；或
    步骤4所述去除所述封片剂采用0.1×SSC浸泡3～5s；
    步骤4所述调节pH值采用pH为2的盐酸溶液。
  18. 时空转录组捕获的方法，其特征在于，包括如下步骤：
    步骤1：取组织切片固载于具有探针的芯片，烤干、固定、染色、弃染料，获得染色后的组织芯片；
    步骤2：采用如权利要求7所述试剂组合中的所述清洗剂或如权利要求8所述试剂盒中的所述清洗剂与所述染色后的组织芯片接触，洗去残留的染料，吹干；
    步骤3：再经如权利要求4至6任一项所述封片剂、如权利要求7所述试剂组合中的所述封片剂或如权利要求8所述试剂盒中的所述封片剂封片，拍照；
    步骤4：采用如权利要求7所述试剂组合中的所述清洗剂或如权利要求8所述试剂盒中的所述清洗剂去除所述封片剂，调节pH值，透化，mRNA逆转录，获得cDNA；
    步骤5：再经酶切消化，获得带有位置探针信息的cDNA，建库、测序，获得捕获信息。
  19. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述清洗剂的清洗次数不少于1次，优选1次或3次；或
    所述吹干的速率包括但不限于：5m/s～10m/s；或
    步骤4所述去除所述封片剂采用0.1×SSC浸泡3～5s；
    步骤4所述调节pH值采用pH为2的盐酸溶液。
  20. 装置，其特征在于，包括如权利要求12所述的组织切片或如权利要求15所述的时空芯片。
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