CN114689864A - 膜性肾病抗体检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了膜性肾病抗体检测试剂，该试剂包括载片试剂、荧光标记的二抗、磷酸盐缓冲液，其特征在于所述的载片试剂包括表达标记荧光蛋白的PLA2R和/或THSD7A转染细胞和表达标记荧光蛋白的空白载体转染细胞；荧光标记的二抗与表达荧光蛋白的转染细胞中的所述的荧光为不同色系的荧光。通过不同色系的荧光及荧光组合，应用于判定样本中是否含有目标抗体。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测领域，具体涉及膜性肾病抗体检测试剂。
背景技术
特发性膜性肾病（IMN）的患者大多数以肾病综合征起病，但仍有少部分患者存在非肾病范围、无症状的蛋白尿。目前，明确诊断IMN仍依赖于肾穿刺活检术后的组织病理检查。尽管肾穿刺可以明确诊断IMN，但是一些一般情况较差的高龄患者或合并危及生命的并发症的患者（如血栓栓塞）仍存在肾穿刺相对或者绝对禁忌症。近年来随着足细胞固有靶抗原和自身抗体的逐步发现，应用血清学标志物诊断IMN成为可能，其中70%的IMN患者血清中存在抗PLA2R抗体。对于IMN患者，抗PLA2R抗体不仅有一定的诊断价值，对其预后评估也有一定的帮助。抗THSD7A抗体是继抗PLA2R抗体之后的另一个具有诊断意义的血清学标志物。
目前特发性膜性肾病抗体检测判读时采用单色荧光，单色荧光在检测时容易导致假阳性，准确性较低。
发明内容
为解决上述检测中存在的问题，提高特发性膜性肾病抗体检测的准确性，本发明提供了膜性肾病抗体检测试剂。通过不同色系的荧光及荧光组合，判定不同色系的荧光斑点是否叠加以及荧光特征是否一致，应用于判定样本中是否含有目标抗体，从而提高了抗体检测的准确性，同时可对特发性膜性肾病抗体进行定性或半定量。
膜性肾病抗体检测试剂，该试剂包括载片试剂、荧光标记的二抗、磷酸盐缓冲液（PBS），其特征在于所述的孔板试剂包括表达标记荧光蛋白的PLA2R和/或THSD7A转染细胞和表达标记荧光蛋白的空白载体转染细胞；荧光标记的二抗与表达荧光蛋白的转染细胞中的所述的荧光为不同色系的荧光。
进一步的，所述的表达标记荧光蛋白的PLA2R和/或THSD7A转染细胞和表达标记荧光蛋白的空白载体转染细胞分别固定在载片的同一面上不同区域。
进一步的，所述的荧光标记的二抗选自山羊抗人IgG、小鼠抗人IgG、兔抗人IgG、驴抗人IgG、马抗人IgG或鸡抗人IgG。
进一步的，所述的荧光标记的二抗中的使用的荧光物选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸盐、Texas Red、藻红蛋白、碘化丙啶、Alexa Fluor系列、Dylight系列、iFluor、PE或Cy系列。
膜性肾病抗体检测试剂的制备方法包括：
1）在平板基质上分别培养表达标记荧光蛋白的PLA2R和/或THSD7A转染细胞和表达标记荧光蛋白的空白载体转染细胞；
2）将培养好的细胞去除培养基，使用磷酸盐缓冲液清洗；
3）加入固定液将细胞固定；
4）将固定好的细胞使用封片液封片，干燥；
5）将干燥后的载有细胞的平板基质转移至载片上，用无影胶固定。
进一步的，所述的荧光蛋白选自红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白。
进一步的，所述的固定液选自醛类、甲醇、乙醇、丙酮、四氧化锇、苦味酸、氯仿、铬酸、升汞、重铬酸中的一种或或多种制备成的溶液。
进一步的，所述的封片液选自聚乙二醇类、BSA、SlowFade Diamond、SlowFadeGold、甘油、石蜡、明胶、芦荟凝胶、防淬灭剂、矿物油中的一种或多种。
膜性肾病抗体检测试剂的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：
1）准备血清或血浆样本，取稀释后样本加入载片反应区内；
2）37℃温育或者4℃过夜；
3）用PBS洗涤；
4）将PBS充分沥干，取荧光标记二抗加入载片反应区内，37℃温育；
5）用PBS洗涤；
6）向反应区内加入PBS；
7）将载片置于荧光显微镜下镜检。
进一步的，利用荧光显微镜观察荧光斑点及荧光斑点组合，通过判定荧光斑点的位置能否重叠以及荧光特征是否一致，判定样本中是否含有抗NMDAR抗体。
进一步的，通过样本血清或血浆的稀释倍数及斑点的强度，可对样本中抗PLA2R和/或THSD7A抗体进行定性或半定量检测分析。
例如，所述的红色荧光蛋白选自mCherry、mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、或mStrawberry。
本发明至少具有以下有益效果：
1）通过本发明制备抗体检测试剂能够检测样本中抗PLA2R和/或THSD7A抗体，该检测试剂的特异性强、灵敏度高、实验结果重复性好，能够进行推广应用，这在临床上具有极其重要的意义。2）此外，本发明针对现有技术在荧光信号较低的情况下容易导致误判的问题，本发明通过将细胞表达荧光蛋白，再加入荧光标记的二抗，通过观察不同色系发出荧光的细胞的位置能否重叠以及荧光特征，从而降低在荧光信号较低的情况仅通过一种荧光下容易导致误判的问题。
附图说明
图1-图2：样本用膜性肾病抗体检测试剂检测在显微镜下荧光图（样本中含有抗PLA2R抗体）
图3-图4：样本用膜性肾病抗体检测试剂检测在显微镜下荧光图（样本中不含有抗PLA2R抗体）
具体实施方式
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本发明实施例通过制备特发性膜性肾病抗体检测试剂，以及利用该检测试剂检测体内抗PLA2R和/或THSD7A抗体，从而判定体内是否含有抗PLA2R和/或THSD7A抗体，为临床医生诊断特发性膜性肾病提供依据。
其中实施例中采用红色色系的荧光和绿色色系的荧光，其中所述的mCherry发出红色荧光，Dylight 488发出绿色荧光。选择不同色系荧光时保证二者荧光色差肉眼容易区别开即可。
实施例1：膜性肾病抗体检测试剂的制备
1）在平板基质上分别培养表达标记mCherry的PLA2R转染细胞和表达标记mCherry的空白载体转染细胞，在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞涨至近100%；
2）去除培养基，使用1×PBS清洗；
3）加入50µl的4%多聚甲醛固定液将细胞固定60min，弃去固定液，加入50µl的1×PBS洗涤2次；
4）加入50µl的5%BSA封片液封闭20min，弃去封片液，加入50µl的1×PBS洗涤2次，干燥；
5）将干燥后的载有细胞的平板基质转移至载片上，用无影胶固定。
实施例2：膜性肾病抗体检测试剂的制备
1）在平板基质上分别培养表达标记mCherry的PLA2R和THSD7A转染细胞和表达标记mCherry的空白载体转染细胞，在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞涨至近100%；
2）去除培养基，使用1×PBS清洗；
3）加入50µl的4%多聚甲醛固定液将细胞固定60min，弃去固定液，加入50µl的1×PBS洗涤2次；
4）加入50µl的5%BSA封片液封闭20min，弃去封片液，加入50µl的1×PBS洗涤2次，干燥；
5）将干燥后的载有细胞的平板基质转移至载片上，用无影胶固定。
实施例3：膜性肾病抗体检测试剂用于血清中抗PLA2R抗体的检测
实施例1中制备得到的试剂用于抗PLA2R抗体检测的方法如下：
1）准备血清样本，取稀释后样本30µl-50µl加入载片反应区内，避光保湿；
2）37℃温育1小时或者4℃过夜；
3）1×PBS洗涤3次，每次3分钟；
4）将1×PBS充分沥干，取30µl-50µl荧光Dylight 488标记的山羊抗人二抗加入载片反应区内，37℃温育30分钟，避光保湿；
5）1×PBS洗涤3次，每次3分钟；
6）向反应区内加入30µl-50µl的1×PBS，避光保湿；
7）将载片置于荧光显微镜下镜检。
实施例4：应用显微镜判读样本中的抗PLA2R抗体
实施例1中制备得到的试剂用于抗PLA2R抗体判读的方法如下：
1）利用荧光显微镜分别在518nm波长、610nm波长下观察发出的荧光斑点，通过观察是否发出绿色荧光斑点或红色荧光斑点；
2）将发出绿色荧光斑点的位置、特征与发出红色荧光斑点的位置进行比对是否重叠；
3）如果发出绿色荧光斑点的位置与发出红色荧光斑点的位置能够重叠，并且特征基本一致，可以判定样本中含有抗PLA2R抗体；
4）如果不能发出绿色荧光斑点；或发出绿色荧光斑点的位置与发出红色荧光斑点的位置不能重叠；或发出绿色荧光斑点的位置与发出红色荧光斑点的位置能够重叠，但是特征差别较大；可以判定样本中不含有抗PLA2R抗体。
图1红色荧光斑点与图2绿色荧光斑点的位置重叠而且特征基本一致，说明样本中含有抗PLA2R抗体；图3红色荧光斑点的位置在图4中没有荧光斑点，说明样本中不含有抗PLA2R抗体。
同理采用实施例2制备的检测试剂对样本中抗PLA2R抗体和抗THSD7A抗体进行联合检测、判读。
本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本发明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本发明中很容易清楚本发明的关键特征，在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可对本发明进行修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
Claims (10)
1.膜性肾病抗体检测试剂，该试剂包括载片试剂、荧光标记的二抗、磷酸盐缓冲液，其特征在于所述的载片试剂包括表达标记荧光蛋白的PLA2R和/或THSD7A转染细胞和表达标记荧光蛋白的空白载体转染细胞；荧光标记的二抗与表达荧光蛋白的转染细胞中的所述的荧光为不同色系的荧光。
2.如权利要求1所述的膜性肾病抗体检测试剂，所述的表达标记荧光蛋白的PLA2R和/或THSD7A转染细胞和表达标记荧光蛋白的空白载体转染细胞分别固定在载片的同一面上不同区域。
3.如权利要求1所述的膜性肾病抗体检测试剂，其特征在于所述的荧光标记的二抗选自山羊抗人IgG、小鼠抗人IgG、兔抗人IgG、驴抗人IgG、马抗人IgG或鸡抗人IgG。
4.如权利要求1所述的膜性肾病抗体检测试剂，其特征在于所述的荧光标记的二抗中的使用的荧光物选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明异硫氰酸盐、Texas Red、藻红蛋白、碘化丙啶、Alexa Fluor系列、Dylight系列、iFluor、PE或Cy系列。
5.如权利要求1所述的膜性肾病抗体检测试剂，其特征在于所述的荧光蛋白选自红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白。
6.如权利要求1-5任一项所述的膜性肾病抗体检测试剂的制备方法包括：
1）在平板基质上分别培养表达标记荧光蛋白的PLA2R和/或THSD7A转染细胞和表达标记荧光蛋白的空白载体转染细胞；
2）将培养好的细胞去除培养基，使用磷酸盐缓冲液清洗；
3）加入固定液将细胞固定；
4）将固定好的细胞使用封片液封片，干燥；
5）将干燥后的载有细胞的平板基质转移至载片上，用无影胶固定。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的固定液选自醛类、甲醇、乙醇、丙酮、四氧化锇、苦味酸、氯仿、铬酸、升汞、重铬酸中的一种或或多种制备成的溶液；所述的封闭液选自聚乙二醇类、BSA、SlowFade Diamond、SlowFade Gold、甘油、石蜡、明胶、芦荟凝胶、防淬灭剂、矿物油中的一种或多种。
8.如权利要求1-5任一项所述的膜性肾病抗体检测试剂的检测方法包括如下步骤：
1）准备血清或血浆样本，取稀释后样本加入载片反应区内；
2）37℃温育或者4℃过夜；
3）用PBS洗涤；
4）将PBS充分沥干，取荧光标记二抗加入载片反应区内，37℃温育；
5）用PBS洗涤；
6）向反应区内加入PBS；
7）将载片置于荧光显微镜下镜检。
9.如权利要求8所述的膜性肾病抗体检测试剂的检测方法，其特征在于利用荧光显微镜观察荧光斑点及荧光斑点组合，通过判定荧光斑点的位置能否重叠以及荧光特征是否一致，判定样本中是否含有抗PLA2R和/或THSD7A抗体；通过样本的稀释倍数及斑点的强度，可对样本中抗PLA2R和/或THSD7A抗体进行定性或半定量检测分析。
10.一种如权利要求1-5任一项所述的检测试剂在制备膜性肾病自身抗体检测试剂的应用。
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