KR20080093395A - 세포 기반의 항체 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 기반의 항체 검출 및 정량 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 및 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질감염(transfection)된 숙주세포를 이용하여 상기 항원의 항체를 검출 및 정량하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 벡터는 항원 단백질을 형질감염된 세포의 표면에 또는 형질감염된 세포 내에 발현시킬 수 있으며, 항원 유전자를 사용하기 때문에 항원 단백질의 분리, 정제 없이도 유도된 항체를 매우 효율적으로 확인 및 정량할 수 있는 효과가 있다.

세포, 항체, 검출, 정량

Description

세포 기반의 항체 검출 방법{Cell-based antibody detection method}

본 발명은 세포 기반의 항체 검출 및 정량 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 및 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질감염(transfection)된 숙주세포를 이용하여 상기 항원의 항체를 검출 및 정량하는 방법에 관한 것이다.

기존에는 단백질 백신을 이용한 면역 접종 후 동물에서 유도된 항체를 검출 및 정량하기 위하여, 면역 접종에 사용한 항원 단백질이 이용되어 왔다. 상기 항원 단백질은 단클론 항체를 얻기 위한 하이브리도마(hybridoma) 선별(screening) 단계의 면역 접종에도 사용되었다. 따라서, 기존의 항체관련 기술개발에 있어서 상기 항원 단백질의 생산과 정제가 선행되어야 했고, 순도 높은 단백질을 필요량 이상 정제하지 못하면 항체의 제작과 검출이 불가능하였다. 그러나, 항원 단백질의 정제에 있어 다중통과 막통과 단백질(multipass transmembrane protein)처럼 정제가 힘들거나 가능하지 않은 경우가 많은 실정이다. 또한, 현재 통용되고 있는 대 장균을 이용한 단백질 발현과 정제 방법을 이용하더라도, 실제 동물 세포의 단백질(native protein) 발현시 작동하는 것과 같은 다양한 단백질 생성 후 수식(modification) 작용을 수행하지 않기 때문에, 항원 단백질을 수득할 수 있더라도 실제 단백질의 구조와 다른 구조를 가질 가능성이 큰 문제점이 있다. 실제로, 대장균에서 발현 및 정제된 단백질을 사용하여 유도된 항체들의 많은 경우는 실제 동물 세포에서 발현되는 단백질을 잘 인식하지 못하는 경우가 있다.

상기 문제점들을 해결하기 위해 DNA 백신 같은 유전자 백신을 이용하여 항체 반응을 유도하는 시도들을 하고 있다. 그러나, 이 경우 단백질이 없기 때문에, 면역 접종에 의해 유도된 항체를 확인 및 정량하고 나아가 단클론 항체 제작을 위한 하이브리도마 스크리닝을 수행할 수 없는 문제가 있다. 이와 같이, DNA 백신과 같은 유전자 백신은 진단과 치료 목적에 적합한 항체 생산에 큰 장점을 가지고 있음에도 불구하고, 항체 확인 단계에 제약이 따르기 때문에 지금까지는 소량의 단백질이라도 생산할 수 있는 경우에만 유전자 백신을 이용한 방법이 적용되어 왔었다.

이와 같이 단백질의 분리, 정제가 힘들어 유전자 백신을 이용하여 항체를 유도한 경우 항체를 확인 및 정량할 수 없었던 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 단백질의 정제 없이도 항체를 확인, 정량할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 항원 단백질과 리포터 단백질을 세포 표면 또는 세포 내에 발현하도록 유도하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질감염된 동물세포를 제조하여, 상기 항원을 발현하도록 제작된 DNA 백신으로 접종된 마우스의 혈청과 직접 접촉시킴으로써 항원-항체 반응을 유도하고, FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)를 이용하여 상기의 반응을 검출 및 정량하여 항원 단백질의 정제 없이 항체를 검출 및 정량할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 정제를 통한 수득이 어려운 항원에 대한 항체를 신속하고 간편하며 정확하게 검출할 수 있도록, 상기 항원을 동물 세포의 표면 또는 세포 내에서 발현하도록 제작된 재조합 벡터로 형질감염된 숙주세포를 이용하여 항체를 검출 및 정량하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 양태로,

1) 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위하여, 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 및 리포터(reporter) 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질감염(transfection)시키는 단계;

2) 상기 형질감염된 숙주세포를 배양하는 단계;

3) 배양된 숙주세포를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및

4) 항원-항체 결합 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 기반의 항체 검출 및 정량 방법을 제공한다.

구체적으로, 단계 1)에서 상기 항원은 면역반응을 유도하는 모든 항원을 제한없이 포함하며, 동물, 식물, 곤충 또는 미생물 기원의 항원일 수 있다. 바람직하게는 정제를 통한 수득이 어렵거나 단백질 번역 후 수식이 배제됨으로써 비특이적 항원-항체 반응의 결과를 나타내는 항원에 유용하다. 더욱 바람직하게는 검출하고자 하는 항체의 항원은 DNA 백신 투여 후 항체 검출을 위해 요구되는 항원과 동일한 항원을 대상으로 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 항원으로서 HA(Haemagglutinin), Tie2(Receptor protein tyrosine kinase), 갠키린(Gankyrin), KIF14(kinesin family member 14), TM7SF3(transmembrane 7 superfamily member 3) 및 KIAA0152(KIAA 0152 gene product) 단백질을 이용하였으나, 본 발명은 이에 제한되지 않고, 상술한 바와 같이, 그 정제가 어렵거나 DNA 백신으로 투여 후 항체 검출을 위해 요구되는 항원 등 어떠한 종류의 항원에 대해서도 적용할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

상기 리포터(reporter) 단백질은 항원이 숙주세포의 세포표면 또는 세포 내에서 발현된 것을 확인하기 위한 것으로, 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 항원을 코딩하는 뉴클레오티드와 동시에 전사되어 단백질로 발현되는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 하나의 재조합 발현 벡터 내에서 항원 코딩 뉴클레오티드와 리포터 단백질 코팅 뉴클레오티드가 내부 리보솜 부착 부위(Internal Ribosome Entry Site; 이하, IRES)를 통하여 연결되어 항원과 리포터 단백질이 동시에 발현되도록 하였다. 그러나 본 발명은 이에 제한되지 않고, 당해 분야의 기술자에게 알려진 다양한 방법으로부터 용이하게 선택하여 사용할 수 있다. 상기 IRES는 두 개의 유전자에 대해 전사는 한번 일어나지만 단백질의 번역은 두 번 이상 일어날 수 있도록 하는 염기서열로, 두 유전자 사이에 삽입함으로써 하나의 프로모터에 의해 여러 유전자를 동시에 발현시키도록 한다(도 2 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 리포터 단백질로 녹색형광단백질(Enhanced green fluorescence protein; 이하, EGFP)을 사용하였으나, 본 발명은 이에 제한되지 않고, 당해 분야의 기술자에게 알려진 다양한 리포터 단백질을 용이하게 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들면, EGFP(Enhanced green fluorescence protein), ERFP(Enhanced red fluorescence protein), EBFP(Enhanced blue fluorescence protein), EYFP(Enhanced yellow fluorescence protein), ECFP(Enhanced cyan fluorescence protein), GFP(Green fluorescence protein), RFP(Red fluorescence protein), BFP(Blue fluorescence protein), YFP(Yellow fluorescence protein) 및 CFP(cyan fluorescence protein) 등이 가능하다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게 마커 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 예컨대 네오마이신 저항성 유전자(neomycine-resistance gene; 이하, neo)를 포함할 수 있다. 상기 neo를 포함하는 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 아미노글라이코사이드(aminoglycoside) 계열 항생제에 대한 저항성을 가짐으로써, 배지 내에 G418과 같은 항생제를 처리함으로써 보다 안정적으로 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 본 발명의 재조합 벡터는 항원 단백질을 형질감염된 숙주세포의 표면에 또는 형질감염된 숙주세포 내에 발현시킬 수 있다.

항원이 숙주세포 표면에서 발현되도록 하는 경우에는, 상기 항원 및 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드가 신호서열 및/또는 T 세포 수용체인 CD4의 막통과영역(transmembrane domain; 이하, TM)을 코딩하는 뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 한다(도 2A 참조). 구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 항원의 세포 표면에서의 발현을 유도하기 위한 신호서열을 더 포함할 수 있는데, 이 경우, 상기 신호서열은 뉴클레오티드 상에서 항원을 코딩하는 뉴클레오티드의 5' 말단 쪽에 위치하여 항원이 숙주세포의 표면에서 발현할 수 있도록 유도하는 역할을 수행한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 이러한 신호서열로서 tpa(tissue plasminogen activator) 유래 신호서열을 사용하였으나, 이 외에도 포유동물 세포 발현에서, 동일 또는 관련 종의 분비 폴리펩티드의 신호 서열 및 바이러스성 분비 리더와 같은 포유동물 신호서열을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 신호서열과 함께 CD4의 막통과영역(CD4 transmembrane domain; 이하, CD4ΔTM)을 코딩하는 뉴클레오티드를 항원 코딩 뉴클레오티드의 3' 말단 쪽에 위치하는 뉴클레오티드를 제조하였다. 구체적으로, 본 발명의 실시예에서는 항원의 세포 표면 발현용 뉴클레오티드로서 tpa-myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP의 형태로 구성된 서열번호 1의 뉴클레오티드를 제작하였다. 이와 같이 항원 단백질이 숙주세포 표면에 발현되는 경우, 배양된 숙주세포에 대한 별도의 처리 없이, 숙주세포를 항 체를 포함할 것으로 추정되는 생물학적 시료와 직접 접촉시켜 항체 검출을 수행할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에 신호서열과 CD4ΔTM이 추가되지 않으면, 숙주세포는 항원과 리포터 단백질을 세포 내에 발현하게 된다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 항원의 세포 내 발현용 뉴클레오티드로서 myc-MCS-IRES-EGFP의 형태로 구성된 서열번호 2의 뉴클레오티드를 제작하였다(도 2 참조). 이들 뉴클레오티드에서 myc는 태그(tag) 서열이고 MCS는 다중클로닝 부위로서, 검출하고자 하는 항체의 항원을 코딩하는 뉴클레오티드는 상기한 MCS 부위에 클로닝 될 수 있다. 상기 태그는 S 태그 또는 His 태그 등의 당해 분야의 기술자에게 알려진 다양한 태그를 용이하게 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 숙주세포는 항원 단백질을 발현하는 세포로서, 이전의 대장균을 이용한 항원의 발현시 동물세포 내에서 실제 단백질의 발현시 작동하는 수식(modification) 작용이 배제되어 실제 단백질의 항체에 대한 특이성이 낮은 것을 극복하기 위해, 바람직하게는 동물세포를 사용함으로써 항원의 발현 시 수식을 유도하는 특징으로 한다. 본 발명에 따른 숙주세포로 사용가능한 동물세포로는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포, HeLa 세포, Cos 세포 및 BHK 세포 등이 있으며, 이 중 특히 바람직한 것으로는 본 발명의 구체적인 실시예에서 사용한 Cos 세포 등을 들 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니다.

단계 2)에서 형질감염된 숙주세포가 neo를 포함하는 재조합 발현 벡터에 의해 형질감염된 경우, 세포배양액에서 회복된 후 G418과 같은 아미노글라이코사이드(aminoglycoside) 계열 항생제를 함유하는 세포배양액에서 추가적으로 배양될 수 있다. 상기 형질감염된 숙주세포를 아미노글라이코사이드(aminoglycoside) 계열 항생제를 포함하는 세포배양액에서 추가적으로 배양함으로써, 항원과 리포터 단백질을 발현하는 것이 안정화된 세포주를 수득할 수 있다.

단계 3)의 생물학적 시료는 상기 항원에 대한 항체를 포함할 수 있는 시료로서, 혈청, 혈액, 뇨, 타액, 췌장액, 뇌척수액 또는 정액 등의 생물학적 시료 중 상기 항원에 대한 항체가 존재하는지를 검정하는 것과 관계가 있지만, 어떠한 생물학적 시료(예, 조직 또는 생검 추출액, 대변 추출액, 가래 등)라도 본 발명의 방법에서 동일하게 이용될 수 있다. 생물학적 시료로 가장 적당한 것으로는 혈청일 것이다. 이때 상기 항체는 1차 항체를 의미하며 혈청, 정제된 다클론 항체, 정제된 단클론 항체 및 하이브리도마(hybridoma)의 배양 상등액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

단계 2)의 배양을 통해 항원과 리포터 단백질은 숙주세포에서 발현될 수 있다. 이때, 상기한 바와 같이 단계 1)의 뉴클레오티드에 신호서열과 CD4ΔTM이 추가되는 경우, 상기 항원과 리포터 단백질은 숙주세포의 표면에서 발현할 수 있으며, 신호서열이 없는 경우에는 상기 항원과 리포터 단백질은 숙주세포 내에서 발현 할 수 있다. 단계 1)의 뉴클레오티드에 신호서열의 추가 여부에 따라 단계 3)의 배양된 숙주세포와 생물학적 시료의 접촉을 위한 과정이 달라질 수 있다(도 3 참조).

구체적으로, 단계 1)의 뉴클레오티드에 신호서열과 CD4ΔTM이 추가되면, 숙주세포는 항원과 리포터 단백질을 세포표면에 발현하게 된다. 숙주세포의 세포표면에 발현된 항원은 별도의 처리과정이 없이 생물학적 시료의 항체와 접촉가능하므로, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 완충액으로 배지를 세척한 후, 곧바로 생물학적 시료를 접촉시킴으로써 항원-항체 반응을 유도하였다.

단계 1)의 뉴클레오티드에 신호서열과 CD4ΔTM이 추가되지 않으면, 숙주세포는 항원과 리포터 단백질을 세포 내에 발현하게 된다. 숙주세포의 세포 내에 발현된 항원이 생물학적 시료의 항체와 접촉할 수 있도록 하기 위해서는, 숙주세포의 세포막을 용해시켜 세포 내에서 발현된 항원이 항체에 노출될 수 있도록 해야 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 FACS 용해(Fluorescence Activated Cell Sorter Lysing; FACS Lysing) 용액으로 숙주세포의 세포막을 용해시키고 Perm/wash 완충액으로 세포막을 투과시킴으로서 생물학적 시료가 세포막을 투과하여 세포 내에 발현된 항원과 접촉하도록 하였다.

단계 4)의 항원-항체 결합 반응을 측정하는 단계는 2차 항체와의 결합을 더 포함할 수 있다. 상기 2차 항체는 FACS 분석용 염료 또는 바이오틴(Biotin) 등의 당해 분야에서 공지된 임의의 염료와 연결된 것을 특징으로 하고, 바이오틴과 결합 한 2차 항체는 FACS 분석용 염료(스트렙타비딘 염료)와의 결합과정을 더 포함할 수 있다. 단계 4)의 항원-항체 결합 반응의 측정은 FACS에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 항원-항체 결합 반응을 측정하는 공지의 방법을 모두 사용할 수 있다. 항체의 정량을 위해서는 항원을 발현하는 DNA 백신에 접종된 마우스의 혈청과 비-관련 단백질에 대한 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청을 일정 비율로 연속희석하여 준비한 혈청을 항원을 코딩하는 뉴클레오티드로 형질감염된 (transfected) Cos7과 반응시킨 뒤 그 반응성을 FACS로 확인함으로써 항원 특이 항체를 정량할 수 있다.

한편, 단계 4)의 항원-항체 결합 반응의 측정과 동시에 리포터 단백질에 의한 형광 발색 여부의 측정을 더 포함할 수 있다. 예컨대, FACS를 통해 EGFP에 의한 형광을 발색하는 세포를 분리 수집(gating)하고, 동시에 항원-항체 결합 반응을 2차 항체에 의한 형광을 발색하는 세포를 분리 수집(gating)함으로써 항원-항체 결합 반응을 측정할 수 있다. 본 발명의 일 실시예서와 같이, EGFP는 EGFP와 동시에 발현하도록 제작된 항원의 발현을 확인하기 위한 것이나, 단계 4)에서 FACS를 이용하여 EGFP에 의한 형광을 발색하는 세포를 분리 수집하여 항원의 발현을 확인한 후, 2차 항체에 의한 형광을 발색하는 세포의 분리 수집을 통해 생물학적 시료내의 항체를 검출할 수 있다.

본 발명의 방법으로 정제된 항원을 필요로 하지 않는 항체 검출 및 정량을 수행하기 위해, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 DNA 백신(도 1 참조)에 접종된 마우스로부터 수득한 혈청과, 본 발명의 방법으로 상기 DNA 백신에 의해 발현하도록 하는 항원과 동일 항원을 코딩하는 뉴클레오티드로 형질감염된 동물세포를 직접 접촉시킴으로써 항원-항체 반응을 유도하고, FACS를 이용하여 상기의 반응을 검출 및 정량하여 보았다.

우선, HA(H5N1, A/213/03)를 세포표면에 발현하도록 형질감염된 Cos7 세포를, 별도의 용해 과정 없이, 1) HA를 발현하도록 제작된 DNA 백신에 접종된 마우스의 혈청, 2) HA 비-관련 단백질에 대한 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청 및 3) 대조군으로서 백신 접종되지 않은 미반응(naive) 마우스의 혈청과 접촉시켜 항원-항체 반응을 측정한 결과, HA를 발현하도록 제작된 DNA 백신에 접종된 마우스의 혈청은 HA(H5N1)를 세포 표면 발현하는 Cos7에 반응성을 보이는 것을 알 수 있었다(도 4 참조).

그리고 1) HA를 발현하도록 제작된 DNA 백신에 접종된 마우스의 혈청과 2) HA 비-관련 단백질에 대한 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청을 10배씩 연속희석하여 준비한 혈청을 HA(H5N1)를 세포 표면 발현하는 Cos7과 반응시킨 뒤 그 반응성을 FACS로 확인함으로써 혈청 내의 HA 특이 항체를 정량할 수 있었다(도 9 참조).

또한, Tie2(Receptor protein tyrosine kinase)를 세포 내에 발현하도록 형질감염된 Cos7 세포를 FACS 용해 용액으로 용해시킨 후, 이를 1) Tie2를 발현하도록 제작된 DNA 백신에 접종된 마우스로부터 수득한 혈청과 접촉시킨 후 이를, 2) Tie2 비-관련 단백질을 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청에 의한 배경 수준(background level)과 비교한 결과, 차이를 보이는 항원 특이적인 반응성을 보이 는 것을 알 수 있었다(도 5 참조).

또한, 갠키린(Gankyrin)을 세포표면에 발현하도록 형질감염된 Cos7 세포를, 별도의 용해 과정 없이, 1) 갠키린을 발현하도록 제작된 DNA 백신에 접종된 마우스의 혈청, 2) 갠키린 비-관련 단백질에 대한 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청 및 3) 대조군으로서 백신 접종하지 않은 미반응(naive) 마우스의 혈청과 접촉시켜 항원-항체 반응을 측정한 결과, 갠키린을 발현하도록 제작된 DNA 백신에 접종된 마우스의 혈청은 갠키린을 세포 표면 발현하는 Cos7에 반응성을 보이는 것을 알 수 있었다(도6-A).

그리고, 상용화된 항체에서도 작용하는지를 알아보기 위해 갠키린을 세포표면에 발현하도록 형질감염된 Cos7 세포를, 별도의 용해 과정 없이, 1) 상용화된 항-갠키린 항체 및 2) 비관련 항원의 상용화된 항체를 접촉시켜 항원-항체 반응을 측정한 결과, 상용화된 항-갠키린 항체는 갠키린을 세포 표면 발현하는 Cos7에 반응성을 보이나 약하게 반응하는 것을 알 수 있었다(도 6-B).

KIF14 (kinesin family member14)를 세포표면에 발현하도록 형질감염된 Cos7 세포를, 별도의 용해 과정 없이, 1) KIF14를 발현하도록 제작된 DNA 백신에 접종된 마우스의 혈청, 2) KIF14 비-관련 단백질에 대한 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청 및 3) 대조군으로서 백신 접종하지 않은 미반응(naive) 마우스의 혈청과 접촉시켜 항원-항체 반응을 측정한 결과, KIF14를 발현하도록 제작된 DNA 백신에 접종된 마우스의 혈청은 KIF14를 세포 표면 발현하는 Cos7에 반응성을 보이는 것을 알 수 있었다(도 7-A).

또한, 상용화된 항체에서도 작용하는지를 알아보기 위해 KIF14를 세포표면에 발현하도록 형질감염된 Cos7 세포를, 별도의 용해 과정 없이, 1) 상용화된 항-KIF14 항체 및 2) 비관련 항원의 상용화된 항체를 접촉시켜 항원-항체 반응을 측정한 결과, 상용화된 항-KIF14 항체는 KIF14를 세포 표면 발현하는 Cos7에 반응성을 보이나 약하게 반응하는 것을 알 수 있었다(도 7-B).

또한, TM7SF3 또는 KIAA0152를 세포표면에 발현하도록 형질감염된 Cos7 세포를 별도의 용해 과정 없이, 1) TM7SF3 또는 KIAA0152를 발현하도록 제작된 DNA 백신에 접종된 마우스의 혈청, 및 2) 대조군으로서 백신 접종하지 않은 미반응(naive) 마우스의 혈청과 접촉시켜 항원-항체 반응을 측정한 결과, TM7SF3 또는 KIAA0152를 발현하도록 제작된 DNA 백신에 접종된 마우스의 혈청은 TM7SF3 또는 KIAA0152를 세포 표면 발현하는 Cos7에 반응성을 보이는 것을 알 수 있었다(도 8).

따라서, 본 발명에 따른 방법은 기존의 항원 단백질의 발현 및 분리, 정제 과정을 거치지 않고, 바로 항원이 발현된 동물세포를 이용하여 항체를 용이하게 검출할 수 있음을 알 수 있고, 기존의 상용화된 항체를 사용하여서도 항원-항체 반응을 분석할 수 있음을 알 수 있다. 나아가, 본 발명의 방법은 FACS를 이용함으로써 항원-항체 반응의 분석 및 정량을 가능하게 하였다.

본 발명에 의한 항체 검출 방법은 항원 단백질과 리포터 단백질을 세포 표면 또는 세포 내에 발현하도록 유도하는 재조합 벡터로 형질감염된 동물세포를 이용하므로, 항원 단백질이 없는 경우에도 항원 유전자를 이용하여 정제를 통한 수득이 어려운 항원에 대한 항체를 신속하고 간편하며 정확하게 검출할 수 있는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 항체 검출 방법은 항원 및 항체의 기원이나 종류에 상관 없이 모든 항원 및 항체에 대해 일반적으로 적용될 수 있다는 점에 큰 의의가 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예로 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 항체 생산용 DNA 백신의 제작 및 접종

항원을 표면 발현하도록 형질감염(transfection)된 동물세포 기반 항체 검출을 위한 개체내 항체 생산용 DNA 백신을 제작하였다.

서열번호 4의 합성된 tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecd^co 뉴클레오티드와, pGX10 벡터(한국공개특허 제2002-58712호)를 제한효소 KpnI과 XbaI로 자른 후, 리가아제로 연결함으로써 항체 생산용 벡터 pGX10-tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecd^co 를 제작하였다. 상기 ILZ(Isoleucine Zipper)는 강제적 삼량화 집행 영역(trimerizaion-enforcing domain)으로 융합 단백질을 삼량화하여 항체 반응 증가 시키고자 하였다. 또한, 상기 mCD40Lecd^co (murine CD40 Ligand extracellular domain)는 뮤린 CD40 리간드의 세포외 영역으로 마우스에서의 체액성 항체반응을 증가시키는 역할을 수행할 수 있다. 상기 벡터의 MCS(multicloning site; 다중클로닝 부위)에 HA(H5N1, A/213/03)의 아미노산 24 내지 532에 해당하는 뉴클레오티드(서열번호 5)를 NotI과 AscI으로 제한한 뒤 연결함으로써 DNA 백신을 수득하였다. 갠키린(Gankyrin, 서열번호 6), KIF14(서열번호 8), TM7SF3(서열번호 10) 또는 KIAA0152(서열번호 12) 유전자의 세포외 영역에 해당하는 뉴클레오티드를 NotI과 AscI으로 제한한 뒤 연결함으로써 DNA 백신을 수득하였다(도 1).

항원을 세포 내에서 발현하도록 형질감염(transfection)된 동물세포를 이용한 항체 검출을 위한 개체내 항체 생산용 DNA 백신을 제작하고자 하였다.

위에서 제시한 방법으로 제조한 pGX10-tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecd^co 벡터에 Tie2(Receptor protein tyrosine kinase, BAC45250) 유전자(NCBI accession No. AB086825)를 NotI과 AscI으로 제한한 뒤 연결함으로써 DNA 백신을 수득하였다(도 1).

위에서 제시한 방법으로 제작된 50 내지 100 ㎍의 항원을 발현하는 DNA 백신은 액체역학 주사법(hydrodynamic injection; Zhang et al., Hum. Gene Ther. 10: 1735-1737, 1999)에 의해 1 내지 2주 간격으로 3 내지 5회 수행하였다. 마지막 접종 후, 1 내지 2주에 마우스의 안구혈관에서 미세모세관 튜브(microcapillary tube)를 이용하여 혈액을 채취하고, 혈액의 응고 후 혈청만을 회수하였다.

<실시예 2> 세포 표면 항원의 검출 방법

<2-1> 세포 표면 항원 발현 벡터의 제작

항체의 검출 및 정량을 위한 항원을 표면 발현하여 세포 기반 항체 검출 및 정량에 이용할 수 있는 벡터를 제조하고자 하였다.

구체적으로, 서열번호 1의 tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM(aa 372-457)-IRES-EGFP 뉴클레오티드를 합성하고, KpnI과 XbaI 제한 효소를 이용하여 pGX10 벡터(한국공개특허 제2002-58712호)에 상기 뉴클레오티드를 삽입하였다. 상기의 방법으로 수득한 pGX10-tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP 벡터에 HindIII 제한 효소를 처리하여 점착성(cohesive) 말단을 만들고, Klenow 효소로 점착성(cohesive) 말단을 평활성(blunt) 말단 형태로 만들었다. 이어서, XbaI 제한효소를 처리함으로써 tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP를 포함하는 뉴클레오티드를 수득하였다. 또한, 네오마이신-저항성 유전자(neomycin-resistance gene; neo)을 포함하는 pCI-neo(Cat #: E1841, Promega, USA) 벡터를 제한효소 SalI과 NotI으로 처리한 뒤, Klenow 효소를 이용하여 점착성 말단을 평활성 말단 형태로 만들고, 이를 다시 리가아제(ligase)를 이용하여 연결하였다. 상기의 방법으로 처리한 pCI-neo를 제한 효소 XhoI으로 절단하고 Klenow 효소를 이용하여 점착성 말단을 평활성 말단 형태로 만든 후, 다시 XbaI을 처리하였다. 상기의 방법으로 처리한 pCIN 벡터와 상기에서 수득한 tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP에 리가아제를 처리하여, 항체의 검출 및 정량을 위한 항원을 표면 발현하는 벡터 pCIN-tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP(도 1)를 수득 하였다.

서열번호 5의 HA(H5N1), 서열번호 6의 갠키린(Gankyrin), 서열번호 8의 KIF14, 서열번호 10의 TM7SF3(transmembrane 7 superfamily member 3) 또는 서열번호 12의 KIAA0152(KIAA 0152 gene product)의 세포외 영역(extracellular domain;)을 코딩하는 뉴클레오티드 각각을 실시예 1의 벡터의 MCS 위치에 NotI과 AscI의 제한 효소로 처리하여 삽입함으로써, HA, 갠키린, KIF14, TM7SF3 또는 KIAA 0152 단백질(항원)을 세포 표면에 발현하도록 하는 각각의 발현용 벡터를 수득하였다.

<2-2> 세포 표면 항원 발현 벡터의 형질감염( transfection )

항원을 세포 표면에 발현하는 동물세포를 수득하고자 하였다.

구체적으로, 실시예 1의 방법으로 수득한 HA, 갠키린(Gankyrin), KIF14, TM7SF3 또는 KIAA 0152의 세포 표면 발현용 벡터를 Cos7 세포(한국세포주 은행)에 형질감염(transfection)함으로써 수득하였다. 구체적으로, 5×10⁶의 Cos7 세포를 300 ㎕의 세포배양액(10%의 Bovine serum을 가진 DMEM)에 준비하고, 실시예 2-1의 HA, 갠키린, KIF14, TM7SF3 또는 KIAA 0152 발현용 벡터 20 ㎍을 섞은 후, 전기청공(Electroporation)용 큐벳(Cat #: 165-2588, Bio-Rad, USA)에 옮겨서 240 V에서 전기자극을 주어 Cos7 세포 내로 발현 벡터를 전달하였다. 전기자극을 받은 Cos7 세포는 세포 배양액을 이용하여 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 36 내지 48 시간 배양하였다.

<2-3> 형질 감염된 Cos7 세포를 이용한 세포 표면 항원 검출 방법

실시예 1의 방법으로 수득한 항원을 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청에서 항원에 대한 항체 반응의 생성 유무를 항원 표면 발현 세포를 기반으로 확인하고자 하였다.

구체적으로, 실시예 2-2의 방법으로 형질감염(transfection)되고 36 내지 48 시간 동안 배양한 Cos7 세포를 FACS 완충액(0.5% FBS, 0.09% Sodium azide의 PBS)로 세척한 뒤, i) 실시예 1의 방법으로 수득한 항원을 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청, ii) 항원 비-관련 단백질을 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청 및 iii) DNA 백신을 접종하지 않은 대조군 마우스(naive mouse) 혈청을 FACS 완충액에 1:100으로 희석하여 반응시켰다. 결합하지 않은 항체는 FACS 완충액으로 씻어낸 후, FACS 분석용 염료가 연결된 항-마우스(anti-mouse) Ig-APC 2차 항체와 결합시키고 마지막 세척 후, FACS 분석을 수행하였다. 형질감염된 Cos7의 경우 항원뿐 아니라 EGFP도 발현하므로 FACS 분석 시, EGFP-양성 Cos7을 분리 수집(gating)하고, 상기 수집된 Cos7에 대한 각 항체의 반응성을 비교하였다.

그 결과, 비-관련 단백질에 대한 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청은 대조군 마우스(naive mouse)의 혈청과 같이 EGFP-양성 Cos7에 대해 반응성을 보이지 않았다. 그러나, 항원를 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청은 EGFP-양성 Cos7 즉, HA(H5N1), 갠키린, KIF14, TM7SF3 또는 KIAA 0152를 세포 표면 발현하는 Cos7에 반응성을 보이고 있다(도 4, 도 6-A, 도 7-A, 도 8-A, 도 8-B).

<2-4> 안정화된 세포주를 이용한 세포 기반 항체 검출

실시예 2-2의 방법으로 수득한 Cos7세포를 추가적으로 G418(400 ㎍/㎖)이 포함된 세포배양액에서 2주간 배양함으로써, HA(H5N1)과 EGFP를 발현하고 G418에 저항성을 가지는 안정한(stable) 세포주를 제조하였다. 상기 2주간 3일 간격으로 G418(400 ㎍/㎖)이 포함된 새 세포배양액으로 교체하여 계대 배양하였다.

상기의 방법으로 수득한 HA(H5N1)과 EGFP를 발현하고 G418에 저항성을 가지는 안정한(stable) 세포주를 기반으로 하여, HA(H5N1)를 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청에서 HA(H5N1)에 대한 항체 반응의 생성 유무를 확인하고자 하였다. 실시예 2-3과 같은 방법으로 항체 검출을 수행하였을 때, 2-3과 동등한 결과를 얻었다.

<실시예 3> 세포 내 항원의 검출 방법

<3-1> 세포 내 항원 발현 벡터의 제작

항체의 검출 및 정량을 위한 항원을 세포 내에 발현하여 세포 기반 항체 검출 및 정량에 이용할 수 있는 벡터를 제조하고자 하였다.

실시예 2-1의 방법으로 수득한 pCIN-tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM-IRES-EGFP 벡터를 제한효소 NheI과 EcoRI을 처리하여 tpa-Myc-MCS-CD4ΔTM부분을 제거하고, 서열번호 3으로 합성한 뉴클레오티드 Myc-MCS를 NheI과 EcoRI의 제한 효소로 처리하여 상기 tpa 서열 등이 제거되고 남은 벡터 내에 삽입함으로써, 항체의 검출 및 정량을 위 한 항원을 세포 내에 발현하는 pCIN-Myc-MCS-IRES-EGFP 벡터(도 2B)를 수득하였다.

Tie2(Receptor protein tyrosine kinase, BAC45250) 유전자(NCBI accession No. AB086825)를 코딩하는 뉴클레오티드를 위에서 제시한 방법으로 제작한 세포 내 발현용 벡터의 MCS 위치에 NotI과 AscI으로 처리하여 삽입함으로써, Tie2 단백질(항원)을 세포 내에 발현하도록 하는 발현용 벡터를 수득하였다.

<3-2> 세포 내 항원 발현 벡터의 형질감염( transfection )

Tie2를 세포 내 발현하는 동물세포를 수득하고자 하였다.

구체적으로, 실시예 3-1의 방법으로 수득한 Tie2의 세포 내 발현용 벡터를 Cos7 세포(한국세포주은행)에 형질감염(transfection)함으로써 수득하였다. Tie 발현용 벡터 20 ㎍을 이용하여 실시예 2-2에서와 같은 방법으로 Cos7 세포를 형질감염(transfection) 시키고 배양하였다.

<3-3> 형질 감염된 Cos7 세포를 이용한 세포 내 항원 검출 방법

실시예 1의 방법으로 수득한 Tie2를 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청에서 Tie2에 대한 항체 반응의 생성 유무를 Tie2 세포 내 발현 세포를 기반으로 확인하고자 하였다.

구체적으로, 실시예 3-2의 방법으로 형질감염(transfection)되고 36 내지 48시간 동안 배양한 Cos7 세포를 모아서 FACS 완충액으로 세척하고, 이에 1X FACS 용해 용액(Cat# 349202, BD, USA)을 30분간 처리하였다. 상기 세포를 Perm/wash 완 충액(0.5% Saponin[Cat# S7900, Sigma, USA]의 FACS 완충액)을 이용하여 10분간 세포막을 투과시킴으로써 항체 검출을 위한 항원을 세포 내에 발현하는 세포를 준비하였다. 상기의 방법으로 수득한 세포를 Perm/wash 완충액으로 세척 후, 실시예 1의 방법으로 수득한 Tie2를 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청 및 Tie2 비-관련 단백질을 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청을 FACS 완충액에 1:100으로 희석하여 반응시켰다. 결합하지 않은 항체를 세척한 후, FACS 분석용 염료가 결합된 항-마우스(anti-mouse) Ig-APC 2차 항체를 결합시키고 Perm/wash 완충액으로 세척 후, 마지막으로 FACS 완충액으로 한 번 더 세척하고 FACS 분석을 수행하였다. 형질감염된 Cos7의 경우 Tie2뿐 아니라 EGFP도 발현하므로 FACS 분석 시, EGFP-양성 Cos7을 분리 수집(gating)하고, 상기 수집된 Cos7에 대한 각 항체의 반응성을 비교하였다.

그 결과, Tie2를 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청은 비-관련 단백질을 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청에 의한 배경 수준(background level)과는 차이를 보이는 항원 특이적인 반응성을 보이고 있다(도 5).

< 실시예 4> 세포 기반의 항체 검출법에 의한 항체의 정량 분석

세포 기반의 항체 검출법을 이용하여 혈청에 존재하는 항원 특이적인 항체를 정량하고자 하였다.

구체적으로, HA(H5N1) 발현 DNA 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청과 HA 비-관련 단백질 발현 DNA 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청을 10배씩 연속희 석(serial dilution)하였다. 실시예 1과 같은 방법으로 희석하여 준비한 혈청을 HA(H5N1) 표면 발현 Cos7과 반응시킨 뒤 HA(H5N1)에 대한 항체를 확인하였다.

그 결과, 혈청을 10⁴ 희석배율까지는 미반응 혈청에 의한 배경 수준(background level)보다 HA(H5N1) 발현 DNA 백신에 접종한 마우스에서 얻은 혈청에서 확실히 높은 반응성을 보였다. 그러나, 10⁵ 희석배율에서는 배경 수준과 거의 비슷한 반응성을 보였다. 그러므로, 본 실시예의 혈청 내에는 약 10⁴ 내지 10⁵의 HA(H5N1) 특이 항체가 존재하는 것을 알 수가 있다(도 9).

< 실시예 5> 세포 기반의 항체 검출법의 비교 분석

세포 기반의 항체 검출법을 이용하여 DNA 백신 접종에 의해 얻어진 항체뿐만 아니라 상용화된 항체를 이용하여 분석 하였다.

구체적으로, 실시예 2-2의 방법으로 형질감염되고 36-48시간 동안 배양한 Cos7 세포를 FACS 완충액으로 세척한 뒤 실시예 1의 방법으로 수득한 갠키린 및 KIF14를 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청과 갠키린 및 KIF14 비-관련 단백질 발현 DNA 백신을 접종한 마우스에서 얻은 혈청 및 DNA 백신을 접종하지 않은 대조군 마우스(naive mouse) 혈청을 FACS 완충액에 1:100으로 희석하여 반응시켰다. 결합하지 않은 항체는 FACS 완충액으로 씻어낸 후, FACS 분석용 염료가 연결된 항-마우스(anti-mouse) Ig-APC 2차 항체와 결합시키고 마지막 세척 후, FACS 분석을 수행하였다.

상용화된 항체에서 비교하기 위해서 실시예 2-2의 방법으로 형질감염되고 36-48시간 동안 배양한 Cos7 세포를 FACS 완충액으로 세척한 뒤 상용화된 갠키린(Gankyrin; cat # SC-8991, Santa Cruz Biotechnology) 및 KIF14(cat# ab3746, abcam) 항체와 갠키린 및 KIF14 비-관련 항체를 FACS 완충액에 1:50으로 희석하여 반응시켰다. 결합하지 않은 항체는 FACS 완충액으로 씻어낸 후, FACS 분석용 염료가 연결된 항-래빗(anti-rabbit) IgG-PE 2차 항체와 결합시키고 마지막 세척 후, FACS 분석을 수행하였다.

갠키린 및 KIF14 형질감염된 Cos7의 경우 항원뿐 아니라 EGFP도 발현하므로 FACS 분석 시, EGFP-양성 Cos7을 분리 수집(gating)하고, 상기 수집된 Cos7에 대한 각 항체의 반응성을 비교하였다.

그 결과, 비-관련 단백질에 대한 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청은 대조군 마우스(naive mouse)의 혈청과 같이 EGFP-양성 Cos7에 대해 반응성을 보이지 않았다. 그러나, 갠키린이나 KIF14를 발현하는 DNA 백신을 접종한 마우스의 혈청은 EGFP-양성 Cos7 즉, 갠키린 및 KIF14를 세포 표면 발현하는 cos7에 반응성을 보이고 있다(도 6-A, 도 7-A).

또한, 비-관련 항원의 항체에 대해서는 EGFP-양성 Cos7에 대해 반응성을 보이지 않았지만, 상용화된 항- Gankyrin 이나 항-KIF14 항체를 사용하였을 경우에는 EGFP-양성 Cos7 즉, 갠키린 및 KIF14를 세포 표면 발현하는 Cos7에 반응성을 보이고 있다(도 6-B, 도 7-B). 그러므로 기존의 상용화된 항체를 이용하여서도 항원-항체 반응을 분석할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에 의한 항체 검출 방법은 항원 단백질의 정제를 필요로 하지 않아, 정제를 통한 수득이 어려운 항원에 대한 항체의 신속하고 정확한 검출 및 정량에 효율적으로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 항원발현용 DNA 백신의 모식도이다.

도 2는 동물세포에서 항원을 발현하기 위한 벡터의 모식도로서,

도 2-A는 항원을 세포표면에서 발현하기 위한 뉴클레오티드를 포함하는 항체 측정용 벡터의 모식도이고,

도 2-B는 항원을 세포 내에서 발현하기 위한 뉴클레오티드를 포함하는 항체 측정용 벡터의 모식도이다.

도 3는 본 발명에 따른 세포 기반의 항체 검출 방법을 설명하는 모식도로서,

도 3-A는 세포표면에서 발현된 항원에 대한 항체 검출 방법을 나타내며,

도 3-B는 세포 내에서 발현된 항원에 대한 항체 검출 방법을 나타낸다.

도 4는 본 발명의 실시예에 따라 세포표면에 HA(Haemagglutinin) 항원을 발현시킨 세포와 DNA 백신 투여에 의해 제조된 시료를 반응시킨 후, FACS를 이용하여 항원-항체 반응을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5는 본 발명의 실시예에 따라 세포 내에 Tie2(Receptor protein tyrosine kinase) 항원을 발현시킨 세포와 DNA 백신 투여에 의해 제조된 시료를 반응시킨 후, FACS를 이용하여 항원-항체 반응을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6-A는 본 발명의 실시예에 따라 세포표면에 갠키린(Gankyrin) 항원을 발현시킨 세포와 DNA 백신 투여에 의해 제조된 시료를 반응시킨 후, FACS를 이용하여 항원-항체 반응을 측정한 결과를 나타내는 도면이며,

도 6-B는 본 발명의 실시예에 따라 세포표면에 갠키린 항원을 발현시킨 세포 와 상용화된 항체를 반응시킨 후, FACS를 이용하여 항원-항체 반응을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 7-A는 본 발명의 실시예에 따라 세포표면에 KIF14(Kinesin family member14) 항원을 발현시킨 세포와 DNA 백신 투여에 의해 제조된 시료를 반응시킨 후, FACS를 이용하여 항원-항체 반응을 측정한 결과를 나타내는 도면이며,

도 7-B는 본 발명의 실시예에 따라 세포표면에 KIF14(Kinesin family member14) 항원을 발현시킨 세포와 상용화된 항체를 반응시킨 후, FACS를 이용하여 항원-항체 반응을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 8-A는 본 발명의 실시예에 따라 세포표면에 TM7SF3(transmembrane 7 superfamily member 3) 항원을 발현시킨 세포와 DNA 백신 투여에 의해 제조된 시료를 반응시킨 후, FACS를 이용하여 항원-항체 반응을 측정한 결과를 나타내는 도면이며,

도 8-B는 본 발명의 실시예에 따라 세포표면에 KIAA0152(KIAA0152 gene product) 항원을 발현시킨 세포와 DNA 백신 투여에 의해 제조된 시료를 반응시킨 후, FACS를 이용하여 항원-항체 반응을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 9는 본 발명의 실시예에 따른 세포 표면에 HA 항원을 발현시킨 세포를 이용한 세포 기반 항체 정량 시, FACS를 이용하여 항원-항체 반응을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

<110> GENEXINE Co., Ltd <120> Cell-based antibody detection method <130> PA080151 <150> KR10-2007-0037116 <151> 2007-04-16 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1721 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tpa-Myc-MCS-CD4dTM-IRES-EGFP <220> <221> sig_peptide <222> (7)..(78) <223> tpa <220> <221> mat_peptide <222> (85)..(114) <223> Myc <220> <221> misc_recomb <222> (115)..(153) <223> MCS <220> <221> mat_peptide <222> (154)..(414) <223> CD4dTM <220> <221> misc_signal <222> (427)..(999) <223> IRES <220> <221> mat_peptide <222> (1000)..(1715) <223> EGFP <400> 1 ggtaccgcca ccatggatgc tatgaaacgg ggcctgtgct gcgtgctgct cctgtgcggc 60 gctgtgtttg tgagccctag cgctgagcag aaactcatct ctgaagagga tctggcggcc 120 gcacgatcga tgatatcgct agctaggcgc gccctgagtg aaggtgataa ggtcaagatg 180 gactccagga tccaggtttt atccagaggg gtgaaccaga cagtgttcct ggcttgcgtg 240 ctgggtggct ccttcggctt tctgggtttc cttgggctct gcatcctctg ctgtgtcagg 300 tgccggcacc aacagcgcca ggcagcacga atgtctcaga tcaagaggct cctcagtgag 360 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ccccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag 120 ccgcttggaa taaggccggt gtgtgtttgt ctatatgtga ttttccacca tattgccgtc 180 ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg 240 tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc 300 tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc 360 cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa 420 ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct 480 ctcctcaagc gtagtcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg 540 aatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaagc 600 tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg 660 tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg 720 acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca 780 agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg 840 tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc 900 acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca 960 aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 1020 accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc 1080 tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca 1140 tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc 1200 actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc 1260 tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc 1320 tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaatcta 1380 ga 1382 <210> 3 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc-MCS <220> <221> mat_peptide <222> (7)..(39) <223> Myc <220> <221> misc_recomb <222> (46)..(75) <223> MCS <400> 3 gctagcatgg agcagaaact catctctgaa gaggatctga gcgctgcggc cgcaataagg 60 cgcgcctagg aattc 75 <210> 4 <211> 901 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tpa-MCS-GS linker-ILZ-mCD40Lecdco <220> <221> sig_peptide <222> (13)..(78) <223> Tpa <220> <221> misc_recomb <222> (82)..(111) <223> MCS <220> <221> misc_structure <222> (112)..(159) <223> GS linker <220> <221> misc_structure <222> (160)..(267) <223> ILZ <220> <221> mat_peptide <222> (268)..(894) <223> mCD40Lecdco <400> 4 ggtaccgcca ccatggatgc tatgaaacgg ggcctgtgct gcgtgctgct cctgtgcggc 60 gctgtgtttg tgagccctag cgctgcggcc gcacgatcga tgatatcgct agctaggcgc 120 gccggcagcg gcagcggcag cggcagcggc agccgatcga gaatgaagca gatcgaggac 180 aaaattgagg aaatcctgtc caagatttac cacatcgaga acgagatcgc ccggattaag 240 aaactcattg gcgagaggag acgcgccaag gtggaggagg aggtgaacct gcatgaggac 300 ttcgtgttca tcaagaagct gaagaggtgc aacaagggcg agggcagcct gagcctgctg 360 aactgcgagg agatgaggag gcagttcgag gacctggtga aggacatcac cctgaacaag 420 gaggagaaga aggagaacag cttcgagatg cagaggggcg acgaggaccc ccagatcgcc 480 gcccatgtgg tgagcgaggc caacagcaac gccgccagcg tgctgcagtg ggccaagaag 540 ggctactaca ccatgaagag caacctggtg atgctggaga acggcaagca gctgaccgtg 600 aagagggagg gcctgtacta cgtgtacacc caggtgacct tctgcagcaa cagggagccc 660 agcagccaga ggcccttcat cgtgggcctg tggctgaagc ccagcagcgg cagcgagagg 720 atcctgctga aggccgccaa cacccatagc agcagccagc tgtgcgagca gcagagcgtg 780 catctgggcg gcgtgttcga gctgcaggcc ggcgccagcg tgttcgtgaa cgtgaccgag 840 gccagccagg tgatccatag ggtgggcttc agcagcttcg gcctgctgaa gctgctctag 900 a 901 <210> 5 <211> 568 <212> PRT <213> Influenza A virus <220> <221> DOMAIN <222> (24)..(532) <223> extracellular domain <400> 5 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Asn Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 355 360 365 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 385 390 395 400 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 405 410 415 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 435 440 445 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 450 455 460 Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495 Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510 Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525 Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 530 535 540 Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 545 550 555 560 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 6 <211> 678 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(678) <223> extracellular domain of Gankyrin <400> 6 atg gag ggg tgc gtt tct aac ctc atg gtg tgc aac ttg gca tat agt 48 Met Glu Gly Cys Val Ser Asn Leu Met Val Cys Asn Leu Ala Tyr Ser 1 5 10 15 ggc aag ctc gaa gag ttg aag gaa tct atc ctc gcg gat aag agt ctg 96 Gly Lys Leu Glu Glu Leu Lys Glu Ser Ile Leu Ala Asp Lys Ser Leu 20 25 30 gcc acc agg acc gat caa gat tca cgg acc gcc ctg cat tgg gca tgt 144 Ala Thr Arg Thr Asp Gln Asp Ser Arg Thr Ala Leu His Trp Ala Cys 35 40 45 tcc gcc ggc cac acc gag atc gtg gag ttc ctg ctg caa ctg ggt gta 192 Ser Ala Gly His Thr Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Gln Leu Gly Val 50 55 60 cca gtc aat gat aag gac gac gcg ggc tgg tca cca ctg cat atc gcc 240 Pro Val Asn Asp Lys Asp Asp Ala Gly Trp Ser Pro Leu His Ile Ala 65 70 75 80 gcc agc gca ggc aga gac gag atc gtc aaa gct ctc ctt gga aaa ggg 288 Ala Ser Ala Gly Arg Asp Glu Ile Val Lys Ala Leu Leu Gly Lys Gly 85 90 95 gca cag gtg aat gcc gtg aac cag aat ggc tgc aca cct ctg cac tat 336 Ala Gln Val Asn Ala Val Asn Gln Asn Gly Cys Thr Pro Leu His Tyr 100 105 110 gcc gcc agc aag aat cgg cac gaa att gct gtt atg ttg ctg gag ggt 384 Ala Ala Ser Lys Asn Arg His Glu Ile Ala Val Met Leu Leu Glu Gly 115 120 125 gga gca aac ccc gac gcc aaa gac cac tat gaa gcc act gca atg cat 432 Gly Ala Asn Pro Asp Ala Lys Asp His Tyr Glu Ala Thr Ala Met His 130 135 140 agg gct gct gct aaa ggc aac ctc aag atg att cac atc ctt ttg tac 480 Arg Ala Ala Ala Lys Gly Asn Leu Lys Met Ile His Ile Leu Leu Tyr 145 150 155 160 tac aaa gct tcc aca aac ata cag gac acg gag gga aat act cct ctt 528 Tyr Lys Ala Ser Thr Asn Ile Gln Asp Thr Glu Gly Asn Thr Pro Leu 165 170 175 cat ctt gcg tgt gat gaa gag aga gta gag gag gcc aaa ctg ctc gtg 576 His Leu Ala Cys Asp Glu Glu Arg Val Glu Glu Ala Lys Leu Leu Val 180 185 190 agc cag ggt gcc tcc ata tac att gaa aat aag gaa gaa aaa aca ccc 624 Ser Gln Gly Ala Ser Ile Tyr Ile Glu Asn Lys Glu Glu Lys Thr Pro 195 200 205 ctg cag gtc gct aag gga ggg ctg ggc ctg att ctg aag cgc atg gtg 672 Leu Gln Val Ala Lys Gly Gly Leu Gly Leu Ile Leu Lys Arg Met Val 210 215 220 gag ggg 678 Glu Gly 225 <210> 7 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Glu Gly Cys Val Ser Asn Leu Met Val Cys Asn Leu Ala Tyr Ser 1 5 10 15 Gly Lys Leu Glu Glu Leu Lys Glu Ser Ile Leu Ala Asp Lys Ser Leu 20 25 30 Ala Thr Arg Thr Asp Gln Asp Ser Arg Thr Ala Leu His Trp Ala Cys 35 40 45 Ser Ala Gly His Thr Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Gln Leu Gly Val 50 55 60 Pro Val Asn Asp Lys Asp Asp Ala Gly Trp Ser Pro Leu His Ile Ala 65 70 75 80 Ala Ser Ala Gly Arg Asp Glu Ile Val Lys Ala Leu Leu Gly Lys Gly 85 90 95 Ala Gln Val Asn Ala Val Asn Gln Asn Gly Cys Thr Pro Leu His Tyr 100 105 110 Ala Ala Ser Lys Asn Arg His Glu Ile Ala Val Met Leu Leu Glu Gly 115 120 125 Gly Ala Asn Pro Asp Ala Lys Asp His Tyr Glu Ala Thr Ala Met His 130 135 140 Arg Ala Ala Ala Lys Gly Asn Leu Lys Met Ile His Ile Leu Leu Tyr 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ser Thr Asn Ile Gln Asp Thr Glu Gly Asn Thr Pro Leu 165 170 175 His Leu Ala Cys Asp Glu Glu Arg Val Glu Glu Ala Lys Leu Leu Val 180 185 190 Ser Gln Gly Ala Ser Ile Tyr Ile Glu Asn Lys Glu Glu Lys Thr Pro 195 200 205 Leu Gln Val Ala Lys Gly Gly Leu Gly Leu Ile Leu Lys Arg Met Val 210 215 220 Glu Gly 225 <210> 8 <211> 1020 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1020) <223> extracelluar domain of KIF14 <400> 8 atg tct ttg cat agc act cac aac cgg aat aac tct ggt gac atc ctt 48 Met Ser Leu His Ser Thr His Asn Arg Asn Asn Ser Gly Asp Ile Leu 1 5 10 15 gat ata cca agc tcc caa aac agt agc tct ctg aat gca ctg acc cac 96 Asp Ile Pro Ser Ser Gln Asn Ser Ser Ser Leu Asn Ala Leu Thr His 20 25 30 tca tcc cgc ctg aaa ttg cac ctg aag agc gac atg tct gag tgt gaa 144 Ser Ser Arg Leu Lys Leu His Leu Lys Ser Asp Met Ser Glu Cys Glu 35 40 45 aat gat gac cca ctt ctc aga agt gcc ggg aaa gtg aga gac atc aac 192 Asn Asp Asp Pro Leu Leu Arg Ser Ala Gly Lys Val Arg Asp Ile Asn 50 55 60 aga act tat gtc atc tct gcg agt cga aag acc gct gac atg cca ctc 240 Arg Thr Tyr Val Ile Ser Ala Ser Arg Lys Thr Ala Asp Met Pro Leu 65 70 75 80 aca ccg aat ccc gtt ggg cgc ctg gct ctt caa agg aga act act cga 288 Thr Pro Asn Pro Val Gly Arg Leu Ala Leu Gln Arg Arg Thr Thr Arg 85 90 95 aac aag gag tca tcc ctt ctg gtg tcc gag ctt gaa gat acg acc gag 336 Asn Lys Glu Ser Ser Leu Leu Val Ser Glu Leu Glu Asp Thr Thr Glu 100 105 110 aag act gca gag aca aga ctc acc ctg cag cgc cgc gca aaa acc gac 384 Lys Thr Ala Glu Thr Arg Leu Thr Leu Gln Arg Arg Ala Lys Thr Asp 115 120 125 agc gcc gag aaa tgg aag act gct gag att gat tcc gta aaa atg act 432 Ser Ala Glu Lys Trp Lys Thr Ala Glu Ile Asp Ser Val Lys Met Thr 130 135 140 ctc aac gta gga ggc gag acg gag aac aac ggg gtg tcc aaa gag tcc 480 Leu Asn Val Gly Gly Glu Thr Glu Asn Asn Gly Val Ser Lys Glu Ser 145 150 155 160 cgg acc aac gtg cgg atc gtt aat aat gcc aag aac tct ttt gtt gca 528 Arg Thr Asn Val Arg Ile Val Asn Asn Ala Lys Asn Ser Phe Val Ala 165 170 175 agt tct gtg cca ctg gac gaa gat ccc cag gtg att gag atg atg gcc 576 Ser Ser Val Pro Leu Asp Glu Asp Pro Gln Val Ile Glu Met Met Ala 180 185 190 gat aaa aag tac aag gag aca ttt tct gct cca agc cgg gcc aat gaa 624 Asp Lys Lys Tyr Lys Glu Thr Phe Ser Ala Pro Ser Arg Ala Asn Glu 195 200 205 aat gtc gcc ctg aag tat agc agc aac agg cct ccc ata gca tca ctg 672 Asn Val Ala Leu Lys Tyr Ser Ser Asn Arg Pro Pro Ile Ala Ser Leu 210 215 220 tca caa acc gag gtg gtc agg agt gga cac ttg acc acg aaa ccc aca 720 Ser Gln Thr Glu Val Val Arg Ser Gly His Leu Thr Thr Lys Pro Thr 225 230 235 240 cag agc aag ctc gac atc aag gtc ctg ggc aca ggc aat ttg tac cat 768 Gln Ser Lys Leu Asp Ile Lys Val Leu Gly Thr Gly Asn Leu Tyr His 245 250 255 agg agc atc ggc aag gaa att gcc aag acc tcc aac aaa ttc gga agc 816 Arg Ser Ile Gly Lys Glu Ile Ala Lys Thr Ser Asn Lys Phe Gly Ser 260 265 270 ttg gag aag cga aca cct aca aaa tgc act acc gaa cat aaa ttg aca 864 Leu Glu Lys Arg Thr Pro Thr Lys Cys Thr Thr Glu His Lys Leu Thr 275 280 285 acc aag tgc tca ctg cct cag ctg aag agt cct gct ccc agc att ctc 912 Thr Lys Cys Ser Leu Pro Gln Leu Lys Ser Pro Ala Pro Ser Ile Leu 290 295 300 aaa aat cgg atg agc aac ctg cag gtg aag cag agg ccc aag agc tcc 960 Lys Asn Arg Met Ser Asn Leu Gln Val Lys Gln Arg Pro Lys Ser Ser 305 310 315 320 ttc ttg gcg aat aaa cag gag cgg tca gcc gaa aac aca att ctc cct 1008 Phe Leu Ala Asn Lys Gln Glu Arg Ser Ala Glu Asn Thr Ile Leu Pro 325 330 335 gaa gaa gaa acc 1020 Glu Glu Glu Thr 340 <210> 9 <211> 340 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ser Leu His Ser Thr His Asn Arg Asn Asn Ser Gly Asp Ile Leu 1 5 10 15 Asp Ile Pro Ser Ser Gln Asn Ser Ser Ser Leu Asn Ala Leu Thr His 20 25 30 Ser Ser Arg Leu Lys Leu His Leu Lys Ser Asp Met Ser Glu Cys Glu 35 40 45 Asn Asp Asp Pro Leu Leu Arg Ser Ala Gly Lys Val Arg Asp Ile Asn 50 55 60 Arg Thr Tyr Val Ile Ser Ala Ser Arg Lys Thr Ala Asp Met Pro Leu 65 70 75 80 Thr Pro Asn Pro Val Gly Arg Leu Ala Leu Gln Arg Arg Thr Thr Arg 85 90 95 Asn Lys Glu Ser Ser Leu Leu Val Ser Glu Leu Glu Asp Thr Thr Glu 100 105 110 Lys Thr Ala Glu Thr Arg Leu Thr Leu Gln Arg Arg Ala Lys Thr Asp 115 120 125 Ser Ala Glu Lys Trp Lys Thr Ala Glu Ile Asp Ser Val Lys Met Thr 130 135 140 Leu Asn Val Gly Gly Glu Thr Glu Asn Asn Gly Val Ser Lys Glu Ser 145 150 155 160 Arg Thr Asn Val Arg Ile Val Asn Asn Ala Lys Asn Ser Phe Val Ala 165 170 175 Ser Ser Val Pro Leu Asp Glu Asp Pro Gln Val Ile Glu Met Met Ala 180 185 190 Asp Lys Lys Tyr Lys Glu Thr Phe Ser Ala Pro Ser Arg Ala Asn Glu 195 200 205 Asn Val Ala Leu Lys Tyr Ser Ser Asn Arg Pro Pro Ile Ala Ser Leu 210 215 220 Ser Gln Thr Glu Val Val Arg Ser Gly His Leu Thr Thr Lys Pro Thr 225 230 235 240 Gln Ser Lys Leu Asp Ile Lys Val Leu Gly Thr Gly Asn Leu Tyr His 245 250 255 Arg Ser Ile Gly Lys Glu Ile Ala Lys Thr Ser Asn Lys Phe Gly Ser 260 265 270 Leu Glu Lys Arg Thr Pro Thr Lys Cys Thr Thr Glu His Lys Leu Thr 275 280 285 Thr Lys Cys Ser Leu Pro Gln Leu Lys Ser Pro Ala Pro Ser Ile Leu 290 295 300 Lys Asn Arg Met Ser Asn Leu Gln Val Lys Gln Arg Pro Lys Ser Ser 305 310 315 320 Phe Leu Ala Asn Lys Gln Glu Arg Ser Ala Glu Asn Thr Ile Leu Pro 325 330 335 Glu Glu Glu Thr 340 <210> 10 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(981) <223> extracelluar domain of TM7SF3 <400> 10 gca gag gtc ttt ggc aac tct tcg gag gga tta att gag ttc tca gtt 48 Ala Glu Val Phe Gly Asn Ser Ser Glu Gly Leu Ile Glu Phe Ser Val 1 5 10 15 ggg aag ttc cgg tac ttc gaa ctg aac cgt cct ttc cca gag gaa gct 96 Gly Lys Phe Arg Tyr Phe Glu Leu Asn Arg Pro Phe Pro Glu Glu Ala 20 25 30 atc ctg cac gat atc agc tcc aat gtc aca ttc ctt atc ttc cag att 144 Ile Leu His Asp Ile Ser Ser Asn Val Thr Phe Leu Ile Phe Gln Ile 35 40 45 cac tcc caa tac caa aac aca act gtg tcc ttt tca ccc acg ctc ctt 192 His Ser Gln Tyr Gln Asn Thr Thr Val Ser Phe Ser Pro Thr Leu Leu 50 55 60 tct aac tcg agc gaa acg ggc aca gct tca gga ctg gtg ttt atc ttg 240 Ser Asn Ser Ser Glu Thr Gly Thr Ala Ser Gly Leu Val Phe Ile Leu 65 70 75 80 cgc cca gag cag tct aca tgc act tgg tac ctg gga aca agc ggc att 288 Arg Pro Glu Gln Ser Thr Cys Thr Trp Tyr Leu Gly Thr Ser Gly Ile 85 90 95 cag cca gtg cag aac atg gcg ata ttg ctg agt tat tct gaa aga gat 336 Gln Pro Val Gln Asn Met Ala Ile Leu Leu Ser Tyr Ser Glu Arg Asp 100 105 110 ccc gta cca ggt ggc tgc aac ttg gaa ttt gac ctg gac ata gat cct 384 Pro Val Pro Gly Gly Cys Asn Leu Glu Phe Asp Leu Asp Ile Asp Pro 115 120 125 aat atc tac cta gag tat aac ttt ttt gag act acc atc aaa ttt gct 432 Asn Ile Tyr Leu Glu Tyr Asn Phe Phe Glu Thr Thr Ile Lys Phe Ala 130 135 140 ccc gcg aat ctg ggg tac gca cgg gga gtt gat cct ccc ccg tgt gac 480 Pro Ala Asn Leu Gly Tyr Ala Arg Gly Val Asp Pro Pro Pro Cys Asp 145 150 155 160 gcc ggc aca gac caa gac agc cgg tgg cga ctg cag tat gac gtc tac 528 Ala Gly Thr Asp Gln Asp Ser Arg Trp Arg Leu Gln Tyr Asp Val Tyr 165 170 175 cag tat ttt ctc ccg gaa aat gac ctt acc gag gaa atg tta ctc aaa 576 Gln Tyr Phe Leu Pro Glu Asn Asp Leu Thr Glu Glu Met Leu Leu Lys 180 185 190 cat tta cag agg atg gtg agc gtg cca cag gtt aaa gca tct gcc ctg 624 His Leu Gln Arg Met Val Ser Val Pro Gln Val Lys Ala Ser Ala Leu 195 200 205 aag gtt gtg acc ttg acc gct aat gac aag acc agc gtg tct ttc tcc 672 Lys Val Val Thr Leu Thr Ala Asn Asp Lys Thr Ser Val Ser Phe Ser 210 215 220 agt ctc cct ggt cag ggg gtg atc tac aac gtc att gta tgg gat ccc 720 Ser Leu Pro Gly Gln Gly Val Ile Tyr Asn Val Ile Val Trp Asp Pro 225 230 235 240 ttc ctg aac aca agc gcc gcc tat att cca gca cat acc tat gcc tgt 768 Phe Leu Asn Thr Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Ala His Thr Tyr Ala Cys 245 250 255 agt ttc gag gcg ggc gaa gga agt tgc gca tcc ctg gga cgt gtg tct 816 Ser Phe Glu Ala Gly Glu Gly Ser Cys Ala Ser Leu Gly Arg Val Ser 260 265 270 tct aaa ggg tcc ggc agt ggg agc ggg agt ggg agt acc cct ctg gga 864 Ser Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Pro Leu Gly 275 280 285 aat cta aag ata ttc cat gat gac gga gtg ggc agc gga agc ggg agc 912 Asn Leu Lys Ile Phe His Asp Asp Gly Val Gly Ser Gly Ser Gly Ser 290 295 300 ggc tca ggc agc ctg aat gtc cta aag aga gca ctg aat aag gac ttc 960 Gly Ser Gly Ser Leu Asn Val Leu Lys Arg Ala Leu Asn Lys Asp Phe 305 310 315 320 cac cgg gcc ttc acc aat gtc 981 His Arg Ala Phe Thr Asn Val 325 <210> 11 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Glu Val Phe Gly Asn Ser Ser Glu Gly Leu Ile Glu Phe Ser Val 1 5 10 15 Gly Lys Phe Arg Tyr Phe Glu Leu Asn Arg Pro Phe Pro Glu Glu Ala 20 25 30 Ile Leu His Asp Ile Ser Ser Asn Val Thr Phe Leu Ile Phe Gln Ile 35 40 45 His Ser Gln Tyr Gln Asn Thr Thr Val Ser Phe Ser Pro Thr Leu Leu 50 55 60 Ser Asn Ser Ser Glu Thr Gly Thr Ala Ser Gly Leu Val Phe Ile Leu 65 70 75 80 Arg Pro Glu Gln Ser Thr Cys Thr Trp Tyr Leu Gly Thr Ser Gly Ile 85 90 95 Gln Pro Val Gln Asn Met Ala Ile Leu Leu Ser Tyr Ser Glu Arg Asp 100 105 110 Pro Val Pro Gly Gly Cys Asn Leu Glu Phe Asp Leu Asp Ile Asp Pro 115 120 125 Asn Ile Tyr Leu Glu Tyr Asn Phe Phe Glu Thr Thr Ile Lys Phe Ala 130 135 140 Pro Ala Asn Leu Gly Tyr Ala Arg Gly Val Asp Pro Pro Pro Cys Asp 145 150 155 160 Ala Gly Thr Asp Gln Asp Ser Arg Trp Arg Leu Gln Tyr Asp Val Tyr 165 170 175 Gln Tyr Phe Leu Pro Glu Asn Asp Leu Thr Glu Glu Met Leu Leu Lys 180 185 190 His Leu Gln Arg Met Val Ser Val Pro Gln Val Lys Ala Ser Ala Leu 195 200 205 Lys Val Val Thr Leu Thr Ala Asn Asp Lys Thr Ser Val Ser Phe Ser 210 215 220 Ser Leu Pro Gly Gln Gly Val Ile Tyr Asn Val Ile Val Trp Asp Pro 225 230 235 240 Phe Leu Asn Thr Ser Ala Ala Tyr Ile Pro Ala His Thr Tyr Ala Cys 245 250 255 Ser Phe Glu Ala Gly Glu Gly Ser Cys Ala Ser Leu Gly Arg Val Ser 260 265 270 Ser Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Pro Leu Gly 275 280 285 Asn Leu Lys Ile Phe His Asp Asp Gly Val Gly Ser Gly Ser Gly Ser 290 295 300 Gly Ser Gly Ser Leu Asn Val Leu Lys Arg Ala Leu Asn Lys Asp Phe 305 310 315 320 His Arg Ala Phe Thr Asn Val 325 <210> 12 <211> 726 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(726) <223> extracelluar domain of KIAA0152 <400> 12 cct gga cta ggc gtt gca gga gtt gca ggg gct gct gga gct ggt ctt 48 Pro Gly Leu Gly Val Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 cct gag agc gtg ata tgg gct gtt aac gcg ggg gga gag gcc cat gtg 96 Pro Glu Ser Val Ile Trp Ala Val Asn Ala Gly Gly Glu Ala His Val 20 25 30 gat gtg cac ggc atc cat ttt aga aaa gat cca ttg gag gga cga gtg 144 Asp Val His Gly Ile His Phe Arg Lys Asp Pro Leu Glu Gly Arg Val 35 40 45 ggt cgt gcc tct gat tac gga atg aaa ctg ccg ata ctc aga tca aac 192 Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Gly Met Lys Leu Pro Ile Leu Arg Ser Asn 50 55 60 cct gaa gac cag att ctc tac cag acc gaa cgc tac aat gag gaa acg 240 Pro Glu Asp Gln Ile Leu Tyr Gln Thr Glu Arg Tyr Asn Glu Glu Thr 65 70 75 80 ttc ggc tat gaa gtg cca atc aaa gaa gag ggt gac tat gtg ctg gtc 288 Phe Gly Tyr Glu Val Pro Ile Lys Glu Glu Gly Asp Tyr Val Leu Val 85 90 95 tta aaa ttc gcc gag gtt tat ttt gca cag agc cag cag aag gta ttc 336 Leu Lys Phe Ala Glu Val Tyr Phe Ala Gln Ser Gln Gln Lys Val Phe 100 105 110 gac gtc cgg ctc aat ggg cat gta gtc gtc aaa gac ctg gat att ttt 384 Asp Val Arg Leu Asn Gly His Val Val Val Lys Asp Leu Asp Ile Phe 115 120 125 gac cgg gtg ggc cac agc act gcc cac gac gaa ata att cca atg tcc 432 Asp Arg Val Gly His Ser Thr Ala His Asp Glu Ile Ile Pro Met Ser 130 135 140 atc agg aag ggg aag ttg tct gtg caa ggg gag gtt agt acc ttc act 480 Ile Arg Lys Gly Lys Leu Ser Val Gln Gly Glu Val Ser Thr Phe Thr 145 150 155 160 ggc aag ctt tac atc gaa ttt gta aaa ggt tac tat gat aac ccg aaa 528 Gly Lys Leu Tyr Ile Glu Phe Val Lys Gly Tyr Tyr Asp Asn Pro Lys 165 170 175 gtg tgc gcc tta tac atc atg gcc ggg aca gtc gac gac gtg ccc aag 576 Val Cys Ala Leu Tyr Ile Met Ala Gly Thr Val Asp Asp Val Pro Lys 180 185 190 ctg cag ccc cac ccc ggc ctg gag aaa aag gag gag gaa gag gaa gag 624 Leu Gln Pro His Pro Gly Leu Glu Lys Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu 195 200 205 gag gag tac gat gaa ggc tcc aat ttg aaa aag cag aca aac aag aac 672 Glu Glu Tyr Asp Glu Gly Ser Asn Leu Lys Lys Gln Thr Asn Lys Asn 210 215 220 cga gtg cag tca gga ccc aga aca ccc aat ccc tac gct tcc gat aac 720 Arg Val Gln Ser Gly Pro Arg Thr Pro Asn Pro Tyr Ala Ser Asp Asn 225 230 235 240 agt agc 726 Ser Ser <210> 13 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Pro Gly Leu Gly Val Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Leu 1 5 10 15 Pro Glu Ser Val Ile Trp Ala Val Asn Ala Gly Gly Glu Ala His Val 20 25 30 Asp Val His Gly Ile His Phe Arg Lys Asp Pro Leu Glu Gly Arg Val 35 40 45 Gly Arg Ala Ser Asp Tyr Gly Met Lys Leu Pro Ile Leu Arg Ser Asn 50 55 60 Pro Glu Asp Gln Ile Leu Tyr Gln Thr Glu Arg Tyr Asn Glu Glu Thr 65 70 75 80 Phe Gly Tyr Glu Val Pro Ile Lys Glu Glu Gly Asp Tyr Val Leu Val 85 90 95 Leu Lys Phe Ala Glu Val Tyr Phe Ala Gln Ser Gln Gln Lys Val Phe 100 105 110 Asp Val Arg Leu Asn Gly His Val Val Val Lys Asp Leu Asp Ile Phe 115 120 125 Asp Arg Val Gly His Ser Thr Ala His Asp Glu Ile Ile Pro Met Ser 130 135 140 Ile Arg Lys Gly Lys Leu Ser Val Gln Gly Glu Val Ser Thr Phe Thr 145 150 155 160 Gly Lys Leu Tyr Ile Glu Phe Val Lys Gly Tyr Tyr Asp Asn Pro Lys 165 170 175 Val Cys Ala Leu Tyr Ile Met Ala Gly Thr Val Asp Asp Val Pro Lys 180 185 190 Leu Gln Pro His Pro Gly Leu Glu Lys Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu 195 200 205 Glu Glu Tyr Asp Glu Gly Ser Asn Leu Lys Lys Gln Thr Asn Lys Asn 210 215 220 Arg Val Gln Ser Gly Pro Arg Thr Pro Asn Pro Tyr Ala Ser Asp Asn 225 230 235 240 Ser Ser

Claims (25)

1) 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위하여, 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 및 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질감염(transfection)시키는 단계;

2) 상기 형질감염된 숙주세포를 배양하는 단계;

3) 배양된 숙주세포를 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및

4) 항원-항체 결합 반응을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 기반의 항체 검출 및 항체 정량 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)에서 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드는 검출하고자 하는 항체에 특이적으로 결합하는 항원의 유전자 서열을 포함하는 것인 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)에서 상기 항원은 동 DNA 백신 투여 후 항체 검출을 위해 요구되는 항원과 동일한 항원인 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)에서 상기 항원은 동물, 식물, 곤충 또는 미생물 기원의 항원인 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)에서 상기 항원은 HA(Haemagglutinin), Tie2(Receptor protein tyrosine kinase), 갠키린(Gankyrin), KIF14(kinesin family member 14), TM7SF3(transmembrane 7 superfamily member 3) 및 KIAA0152(KIAA 0152 gene product)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항원인 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)에서 상기 항원은 형질감염된 세포의 표면에서 발현하는 것인 방법.

제6항에 있어서, 단계 1)의 재조합 벡터는 신호서열 및 CD4 막통과 영역(CD4 transmembrane domain)을 코딩하는 뉴클레오티드를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제7항에 있어서, 상기 신호서열은 tpa(tissue plasminogen activator) 유래 신호서열인 것을 특징으로 하는 방법.

제6항에 있어서, 단계 1)의 재조합 벡터는 서열번호 1의 뉴클레오티드로 표시되는 핵산을 포함하는 것인 방법.

제6항에 있어서, 단계 1)의 재조합 벡터는 도 2A 의 개열지도로 표시되는 벡터인 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)에서 상기 항원은 형질감염된 세포 내에서 발현하는 것인 방법.

제11항에 있어서, 단계 1)의 재조합 벡터는 서열번호 2의 뉴클레오티드로 표시되는 핵산을 포함하는 것인 방법.

제11항에 있어서, 단계 1)의 재조합 벡터는 도 2B 의 개열지도로 표시되는 벡터인 방법.

제11항에 있어서, 단계 3)은 숙주세포를 생물학적 시료와 접촉시키기 전에 숙주세포의 세포막을 용해시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)의 재조합 벡터는 마커 유전자를 추가로 포함하는 방법.

제15항에 있어서, 상기 마커 유전자는 네오마이신 저항성 유전자(neo)인 방법.

제1항에 있어서, 단계 2)에서 형질감염된 숙주세포를 아미노글라이코사이드 계열 항생제를 함유하는 세포 배양액에서 추가적으로 배양하는 단계를 포함하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1)에서 상기 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 및 리포터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드가 IRES(Internal Ribosome Entry Site)에 의해 연결된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)의 재조합 발현 벡터가 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)의 상기 리포터 단백질은 EGFP(Enhanced green fluorescence protein), ERFP(Enhanced red fluorescence protein), EBFP(Enhanced blue fluorescence protein), EYFP(Enhanced yellow fluorescence protein), ECFP(Enhanced cyan fluorescence protein), GFP(Green fluorescence protein), RFP(Red fluorescence protein), BFP(Blue fluorescence protein), YFP(Yellow fluorescence protein) 및 CFP(cyan fluorescence protein)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1)의 상기 숙주세포는 동물세포, 식물세포 또는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 3)의 생물학적 시료는 혈청, 혈액, 뇨, 타액, 췌장액, 뇌척수액 및 정액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 방법.

제22항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈청, 정제된 다클론 항체, 정제된 단클론 항체 및 하이브리도마(hybridoma)의 배양 상등액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1차 항체를 포함하는 방법.

제1항에 있어서, 단계 4)의 항원-항체 결합 반응의 측정은 FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 4)의 항원-항체 결합 반응의 측정과 동시에 리포터 단백질에 의한 형광의 발색 여부의 측정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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