WO2025018367A1 - 細胞剥離方法及び細胞剥離装置 - Google Patents

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transmission medium
acoustic transmission
cell detachment
culture substrate
cells
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研治郎 竹村
佑太 倉科
哉裕 今城
圭一郎 椿
貴昭 古井
雄一郎 大口
和範 野口
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Canon Inc
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • This disclosure relates to a cell detachment method and a cell detachment device.
  • cell culture has become popular for culturing cells used in regenerative medicine and cells used in the production of biopharmaceuticals.
  • Cell culture is broadly divided into adhesion culture and suspension culture, of which adhesion culture is a culture method suitable for various cell types and is widely used.
  • adhesion culture is a culture method suitable for various cell types and is widely used.
  • enzyme treatment is required to detach the cells, and depending on the treatment method, the cells may be damaged.
  • cell detachment by enzyme treatment is also a cause of variation in cell quality. For this reason, detachment conditions that allow recovery with a high detachment rate without damaging the cells are being investigated.
  • water is generally used as the acoustic transmission medium. In this case, there is a strong concern that water may cause the growth of bacteria, and so it tends to be avoided, especially in medical settings.
  • Patent Document 1 proposes a patterning device that arranges cells at specific positions via a medium that transmits acoustic radiation pressure to a culture substrate. Silicone rubber is given as an example of an acoustic transmission medium, but when acoustic radiation pressure is transmitted to a culture substrate using this material, the cell detachment performance is insufficient compared to water, and there is a demand for further improvement in cell detachment performance and reduction in variability.
  • Patent Document 2 proposes a medical ultrasonic transmission tool composed of a sealed body. Although it is used for acoustic coupling between an ultrasonic probe and a target site, there is no mention of using this ultrasonic transmission means to transmit ultrasonic vibrations and detach cells.
  • the present disclosure has been made to address the above-mentioned issues, and provides a cell detachment method that enables vibration design tailored to the target cells and can detach adherent cells with a high detachment rate.
  • the present disclosure provides a cell detachment method for detaching cells attached to a culture surface of a culture substrate from the culture surface, comprising: a cell detachment method for detaching the cells from the culture surface by vibrating a vibrator while disposing an acoustic transmission medium between the culture substrate and the vibrator;
  • the acoustic transmission medium includes a first acoustic transmission medium and a second acoustic transmission medium, the first acoustic transmission medium is a solid having elasticity at room temperature;
  • the second acoustic transmission medium is contained within the first acoustic transmission medium, and is liquid at room temperature, or has a larger tan ⁇ than the tan ⁇ of the first acoustic transmission medium when vibration of a frequency of 0.1 Hz is applied to the second acoustic transmission medium at room temperature.
  • the present disclosure also provides a cell detachment device that detaches cells by transmitting vibrations generated by a vibrator to cells provided on a culture surface of a culture substrate, Vibration body,
  • the apparatus includes an acoustic transmission medium, and a culture substrate mounting portion in this order.
  • the vibration of the vibrator is transmitted to the culture substrate via the acoustic transmission medium
  • the acoustic transmission medium includes a first acoustic transmission medium and a second acoustic transmission medium
  • the first acoustic transmission medium is a solid having elasticity at room temperature
  • the second acoustic transmission medium is contained within the first acoustic transmission medium, and is liquid at room temperature, or has a larger tan ⁇ than the tan ⁇ of the first acoustic transmission medium when vibrations of a frequency of 0.1 Hz are applied to the second acoustic transmission medium at room temperature.
  • the present disclosure makes it possible to design vibrations to suit the target cells, and provides a cell detachment method that can detach adherent cells with a high detachment rate.
  • 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a first embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a first embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a first embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • 11 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a second embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • FIG. 11 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a second embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • FIG. 11 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a second embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • FIG. 13 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a third embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • FIG. 13 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a third embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • FIG. 13 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a third embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • FIG. 13 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a fourth embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • FIG. 13 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a fourth embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • FIG. 13 is a schematic cross-sectional view showing an example of the configuration of a fourth embodiment of a cell peeling device according to the present disclosure.
  • FIG. Specific examples of steps of the cell detachment method of the present disclosure are shown below. 1 illustrates an example of an apparatus of the present disclosure. An example of the placement step of the method of the present disclosure will now be described. An example of the placement step of the method of the present disclosure will now be described. An example of the pressurizing step of the method of the present disclosure will now be described. An example of the peeling step of the method of the present disclosure will now be described.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an example of a culture substrate according to the present disclosure.
  • 1A and 1B are a cross-sectional view and a top view illustrating an example of an acoustic transmission medium according to the present disclosure.
  • 1A and 1B are a cross-sectional view and a top view illustrating an example of an acoustic transmission medium according to the present disclosure.
  • 1A and 1B are a cross-sectional view and a top view illustrating an example of an acoustic transmission medium according to the present disclosure.
  • 1A and 1B are a cross-sectional view and a top view illustrating an example of an acoustic transmission medium according to the present disclosure.
  • FIG. 2 is a schematic diagram illustrating an example of a piezoelectric body according to the present disclosure.
  • the cell detachment method of the present disclosure includes the steps of: A cell detachment method for detaching cells attached to a culture surface of a culture substrate from the culture surface, comprising: a cell detachment method for detaching the cells from the culture surface by vibrating a vibrator while disposing an acoustic transmission medium between the culture substrate and the vibrator;
  • the acoustic transmission medium includes a first acoustic transmission medium and a second acoustic transmission medium, the first acoustic transmission medium is a solid having elasticity at room temperature;
  • This is a cell detachment method, characterized in that the second acoustic transmission medium is contained within the first acoustic transmission medium and is liquid at room temperature, or has a larger tan ⁇ than the tan ⁇ of the first acoustic transmission medium when vibrations of a frequency of 0.1 Hz are applied to the second acoustic transmission medium at room temperature.
  • FIG. 7A shows a step of placing the acoustic transmission medium 13. Note that the acoustic transmission medium 13 may be placed in advance, and this step is not essential to the cell detachment method of the present disclosure.
  • FIG. 7A the acoustic transmission medium 13 is placed on the vibrator 101.
  • FIG. 7B the culture substrate 21 is placed on the placed acoustic transmission medium 13.
  • FIG. 7C shows a pressurizing step, in which pressure is applied from above the culture substrate 21. Note that the pressurizing step is not essential to the peeling method of the present disclosure.
  • FIG. 7D shows a peeling step.
  • FIG. 7A shows a step of placing the acoustic transmission medium 13. Note that the acoustic transmission medium 13 may be placed in advance, and this step is not essential to the cell detachment method of the present disclosure.
  • FIG. 7A the acoustic transmission medium 13 is placed on the vibrator 101.
  • FIG. 7B the culture substrate 21 is placed on the
  • the vibrator 101 is driven while applying pressure from above the culture substrate 21 to apply ultrasonic vibration to peel off the cells.
  • the pressurizing step makes it easier for the first acoustic transmission medium to match the culture substrate or the vibrator, and even in the peeling step, the first acoustic transmission medium can transmit vibration in a state where it is matched to the culture substrate or the vibrator.
  • the first acoustic transmission medium is matched with the culture substrate or the vibrator means that the first acoustic transmission medium is in sufficient contact with the culture substrate or the vibrator so that the vibration of the vibrator is sufficiently transmitted to the culture substrate through the first acoustic transmission medium or the second acoustic transmission medium, but an extremely small gap or an extremely small amount of material may be present between the first acoustic transmission medium and the culture substrate or the vibrator to a degree that can solve the problem of the present invention. For example, even if a few molecules of water are present between the first acoustic transmission medium and the culture substrate, the first acoustic transmission medium and the culture substrate can be considered to be in contact with each other.
  • the acoustic transmission medium includes a first acoustic transmission medium that is elastic and solid at room temperature, and a second acoustic transmission medium that is liquid at room temperature or has a larger tan ⁇ when a vibration of a frequency of 0.1 Hz is applied to the second acoustic transmission medium at room temperature than the tan ⁇ of the first acoustic transmission medium (tan ⁇ when a vibration of a frequency of 0.1 Hz is applied to the first acoustic transmission medium at room temperature).
  • the vibrating body which is a vibration generating unit, includes a piezoelectric body and a vibration plate, and the vibration mechanism generates bending vibrations that are amplified by the combination of the hardness of the piezoelectric body, which expands and contracts, and the vibration plate to which it is attached.
  • the resonance due to the structural factors of the vibrating body is utilized, and a large vibration can be obtained at the resonance frequency.
  • an acoustic transmission medium is used to match the vibrating body that generates vibrations with the culture substrate to which the vibrations are transmitted.
  • mechanical matching such as adhesion is also important for matching. It is preferable that mechanical matching and physical matching are achieved between the acoustic transmission medium and the culture substrate or the vibrating body, thereby achieving a configuration that can solve the problems of the present invention.
  • the acoustic transmission medium can also be referred to as an acoustic transmission material.
  • the physical matching between the vibrator and the culture substrate can be defined by a physical quantity called "acoustic impedance Z.”
  • acoustic impedance Z (density of acoustic transmission medium)
  • x speed of sound in the acoustic transmission medium
  • Z1 and Z2 are the acoustic impedances of the first and second materials that transmit the sound wave.
  • the vibration waveform of the vibrator is formed on the cell culture surface of the culture substrate, so mechanical matching that allows for close contact over a wide area is important.
  • the culture substrate When using a commercially available dish-type container as the culture substrate, and using water or a low molecular weight material such as glycerin, which is easily deformed under low load as the acoustic transmission medium, when the culture substrate is placed on the vibrator, the protrusions of the culture substrate come into direct contact with the vibrator, resulting in multiple vibration transmission paths, which can make the generated vibrations complex and difficult to control.
  • the cell detachment method disclosed herein performs subjective vibration control. In other words, by bringing the vibrator and culture substrate into close solid contact, the vibration transmission path is kept constant, making vibration control easier.
  • the solid material is preferably a polymeric material having elasticity such as rubber or gel, and specific examples include silicone resin, urethane resin, diallyl dylate resin, unsaturated polyester, epoxy resin, phenol resin, urea resin, melamine resin, and natural rubber.
  • silicone rubber is preferred because it has physical properties with little attenuation in the frequency band of the drive frequency (vibration frequency), resulting in high transmission efficiency, and further because heat generation by the acoustic transmission medium itself can be suppressed.
  • the first acoustic transmission medium is made of a solid material having elasticity at room temperature.
  • room temperature is from 20° C. to 30° C., and preferably 25° C.
  • Examples of solid materials having elasticity include polymeric materials such as rubber and gel.
  • Examples of polymeric rubber materials include rubber containing at least one resin selected from the group consisting of silicone resin, urethane resin, diallyl dylate resin, unsaturated polyester, epoxy resin, phenol resin, urea resin, and melamine resin, natural rubber, etc. More specifically, examples of the rubber material include silicone rubber, urethane rubber, butyl rubber, nitrile rubber, butadiene rubber, and latex rubber.
  • polymer gel materials include hydrogels and polymer gels.
  • hydrogels include hydrogels obtained by combining hydrophilic polymer materials such as polyvinyl alcohol and polyacrylic acid with corresponding crosslinking agents.
  • crosslinking agents include inorganic crosslinking agents such as borax and layered clay minerals (clay), and organic crosslinking agents such as multifunctional polymer materials such as dendritic polymers.
  • polymer gels include polymer gels obtained by combining polymer materials such as acrylic resins and urethane resins with corresponding multifunctional compounds as crosslinking agents.
  • the first acoustic transmission medium may have a tan ⁇ of less than 1.0 when vibration of 1 Hz frequency is applied to the first acoustic transmission medium, as measured by dynamic viscoelasticity at room temperature.
  • the second acoustic transmission medium is solid at room temperature, it is preferable that tan ⁇ of the first acoustic transmission medium and tan ⁇ of the second acoustic transmission medium when vibration of 0.1 Hz frequency is applied to the second acoustic transmission medium, as measured by dynamic viscoelasticity at room temperature, satisfy tan ⁇ i ⁇ tan ⁇ ii and /or tan ⁇ i ⁇ 1.
  • the surface of the first acoustic transmission medium facing the culture substrate or the vibrator may be subjected to a surface treatment such as a fluorine coating.
  • a surface treatment such as a fluorine coating.
  • the acoustic transmission medium is preferably transparent to light in the visible light wavelength range.
  • the first acoustic transmission medium is too thick, ultrasonic waves are more likely to be reflected at the interface during ultrasonic vibration transmission, and vibration attenuation cannot be ignored. If it is too thin, the durability of the film containing the second acoustic transmission medium decreases, and it may tear or develop holes, allowing the contained material to escape. Therefore, it is preferable that the total thickness of the first acoustic transmission medium is 5 mm or less when vibrating the vibrator.
  • the second acoustic transmission medium is liquid at room temperature, or has a larger tan ⁇ than the first acoustic transmission medium when vibration at a frequency of 0.1 Hz is applied to the second acoustic transmission medium at room temperature.
  • Being liquid at room temperature means being liquid at 20°C or higher and 30°C or lower, and in particular, the intrinsic viscosity [ ⁇ ] at room temperature of 25°C or the complex viscosity ⁇ * obtained by dynamic viscoelasticity measurement at room temperature of 25°C when subjected to vibration at a frequency of 1 Hz, or the viscosity ⁇ measured by changing the shear rate using a B-type viscometer or rheometer, can be small.
  • the second acoustic transmission medium when it is a solid at room temperature, it has a larger tan ⁇ than the first acoustic transmission medium when vibration of 0.1 Hz frequency is applied at room temperature.
  • the second acoustic transmission medium is a solid such that tan ⁇ obtained by dynamic viscoelasticity measurement at room temperature when vibration of 0.1 Hz frequency is applied is 1 or more.
  • the second acoustic transmission medium is a solid
  • vibration of 0.1 Hz frequency when vibration of 0.1 Hz frequency is applied and tan ⁇ of the first acoustic transmission medium and the second acoustic transmission medium obtained by dynamic viscoelasticity measurement at room temperature are tan ⁇ i and tan ⁇ ii , respectively, tan ⁇ i ⁇ tan ⁇ ii is satisfied and/or tan ⁇ i ⁇ 1 is satisfied.
  • a solid that can serve as the second acoustic transmission medium is a flexible gel.
  • flexible gels include hydrogels that combine hydrophilic polymer materials such as polyvinyl alcohol and polyacrylic acid with cross-linking components such as borax, layered clay minerals (clay), and multi-branched polymer materials such as dendritic polymers, and polymer gels that combine polymer materials such as acrylic resins and urethane resins with corresponding multi-functional compounds that serve as cross-linking agents.
  • G represents the shear modulus
  • G' represents the storage shear modulus
  • G" represents the loss shear modulus.
  • the second acoustic transmission medium may be a liquid at room temperature. In this case, there are cases where tan ⁇ cannot be measured.
  • the second acoustic transmission medium is a liquid, it may have a high viscosity as long as it does not impair acoustic transmission.
  • the viscosity can be measured at room temperature, more preferably at 25° C., using a B-type viscometer or a rheometer.
  • an appropriate torque value may not be obtained under the above conditions. In that case, it is possible to measure by changing the plate diameter, gap, etc., so that the shear rate is approximately the same.
  • Liquids include low-viscosity liquids such as water, saline, ethanol, and diluted ethanol, mixtures of these, and high-viscosity liquids and gel materials such as glycerin, silicone oil, and polymer solutions, as well as mixtures of these.
  • Polymer solutions in which gel is dispersed and swollen in liquids such as water are also acceptable, and more specifically, ultrasound gels in which viscoelasticity is adjusted by adding additives such as thickeners such as PVA gel to liquids such as glycerin are also preferred.
  • Gel materials may be classified as solids or liquids. Gels as solids have a high content of crosslinking components, while gels as liquids have a low content of crosslinking components.
  • solids are those for which tan ⁇ can be measured using the measurement method used by the inventors, and liquids are those for which it is not. This is thought to be related to the repulsion of the elastic body.
  • PVA is a flexible gel as a solid
  • ultrasound gel is a gel as a liquid.
  • the second acoustic transmission medium be a solid having a tan ⁇ of 1.0 or more when subjected to vibrations of a frequency of 0.1 Hz at room temperature.
  • the second acoustic transmission medium may contain various additives for the purpose of controlling physical properties such as viscosity, affinity with the first acoustic transmission medium, acoustic impedance, surface tension, storage stability, and antibacterial action.
  • additives include the following: Additives for adjusting the surface tension include anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate and sodium lauryl sulfate. Examples of cationic surfactants include ethyltrimethylammonium bromide, benzalkonium chloride, and dimethylaminopropylamide stearate. Examples of nonionic surfactants include Contaminon (registered trademark), Contaminon (registered trademark) US, Pluronic (registered trademark) F-68, Tween (registered trademark) 20, Tween (registered trademark) 80, and the like. Examples of amphoteric surfactants include CHAPS and CHAPSO.
  • the storage stabilizer examples include light stabilizers such as hindered amine, benzophenone, and benzotriazole, and antioxidants such as amine-based, phenol-based, sulfur-based, and phosphorus-based antioxidants.
  • Those that exhibit antibacterial activity include benzalkonium chloride, sodium azide, and antibiotics such as ampicillin, penicillin, and streptomycin.
  • the acoustic transmission medium used in the cell detachment method of the present disclosure has a configuration in which a second acoustic transmission medium is enclosed within a first acoustic transmission medium.
  • the term "encapsulation" refers to the presence of a second acoustic transmission medium inside the first acoustic transmission medium between the vibrator and the culture substrate.
  • the second acoustic transmission medium may be sealed inside a bag-shaped first acoustic transmission medium, or the bag-shaped first acoustic transmission medium may be provided with a circulation tube through which the second acoustic transmission medium can be supplied and circulated so as not to impair vibration transmission.
  • the second acoustic transmission medium can be circulated inside the first acoustic transmission medium, it is preferable to encapsulate the second acoustic transmission medium in the first acoustic transmission medium in the arrangement step described below, and then use a valve or the like to prevent circulation in the pressurization and peeling steps.
  • a bag-shaped first acoustic transmission medium is prepared, the second acoustic transmission medium is injected into it, and the injection port is then sealed.
  • Sealing methods include a method of melting and sealing with heat, a method of crimping with pressure, a method of sealing by reaction with an adhesive or a raw material compound of the first acoustic transmission medium, and a method of physically clamping and sealing.
  • Another method of encapsulation is to prepare sheets of the first acoustic transmission medium on the upper and lower surfaces, and then seal the upper and lower surfaces by closely contacting them while encapsulating the second acoustic transmission medium.
  • the cell exfoliation method of the present disclosure can include an encapsulation step of encapsulating the second acoustic transmission medium in the first acoustic transmission medium as the encapsulation step.
  • the first acoustic transmission medium can have at least one protrusion that is convex in the direction facing the second acoustic transmission medium.
  • the protrusion preferably has a shape that, when pressurized in the pressurizing step, is in physical contact with the first acoustic transmission medium on the opposite surface facing it, and can be, for example, cylindrical, hemispherical, conical, or a structure combining a cylindrical or conical shape with a hemisphere.
  • the protrusion is preferably made of the same material as the first acoustic transmission medium.
  • the position of the protrusion is preferably a position that corresponds to the abdomen (area with large amplitude value) of the ultrasonic vibration pattern to be applied where vibration is strong, but it may also include areas where vibration is weak or where there is no vibration.
  • the number of protrusions also needs to be at least one, and for example, in order to accommodate multiple vibration patterns, multiple protrusions may be placed at positions that correspond to the abdomen of each vibration pattern.
  • the first acoustically transmitting medium may have at least one post extending across said second acoustically transmitting medium.
  • the surface facing the vibrator can have a higher Young's modulus than the surface facing the culture substrate.
  • a high Young's modulus is synonymous with a high elastic modulus, and the Young's modulus can be increased, for example, by increasing the thickness of the first acoustic transmission medium or by increasing the amount of branched components during the manufacture of the first acoustic transmission medium.
  • the difference in acoustic impedance between the first acoustic transmission medium and the second acoustic transmission medium is small.
  • the acoustic transmission medium does not contain air, and therefore, when the second acoustic transmission medium is contained within the first acoustic transmission medium, it is preferable to contain it in such a way that no air is contained.
  • the thickness of the acoustic transmission medium of the present disclosure is preferably 10 mm or less from the viewpoint of reducing vibration attenuation and preventing ultrasonic waves from being reflected at the interface, and is preferably 5 mm or less when vibration is generated in the vibrating body.
  • the aspect ratio (thickness/diagonal size) of the acoustic transmission medium is 0.3 or less.
  • a ratio of 0.3 or less increases stability during installation.
  • a liquid such as water may be applied before use.
  • the liquid is preferably one with low surface tension.
  • the surface facing the vibrating body may be fully or partially adhered to the vibrating body using an adhesive or pressure-sensitive adhesive to improve compatibility.
  • an adhesive or pressure-sensitive adhesive to improve compatibility.
  • Known adhesives, pressure-sensitive adhesives, double-sided tape, etc. may be used as the adhesive or pressure-sensitive adhesive.
  • the cell detachment method of the present disclosure is to detach cells attached to the culture surface of a culture substrate from the culture substrate.
  • the adhesion of cells includes not only adhesion of adhesive cells, but also the presence of cells in contact. That is, the adhesion of cells to a culture substrate includes not only adhesion of adhesive cells, but also the presence of cells in contact. That is, the adhesion of cells to a culture substrate includes, but is not limited to adhesion, the adhesion of cells to the culture substrate via an adhesion factor, and includes the cells remaining by weak interaction with the culture substrate, or the cells remaining simply by external forces such as gravity.
  • the culture substrate of the present disclosure is a substrate used for cell culture, and refers to any substrate that includes a surface to which cells adhere.
  • the culture substrate includes, for example, a container for cell culture or a part thereof.
  • Examples of cell containers include dishes (also called petri dishes), flasks, plates, tubes, etc. All of these are used as general-purpose disposable containers, such as products from Corning, Thermo Fisher Scientific, and AGC Techno Glass.
  • a dish is a typical example of the culture substrate of the present disclosure.
  • Culture substrates with removable lids are widely used.
  • the culture substrate may or may not include a part such as a lid.
  • An example of the shape of a dish is as shown in the schematic diagram of Figure 8.
  • the bottom warp height 300 varies greatly depending on the model number of each manufacturer, the lot, and even within the lot.
  • mechanical alignment is made easier by using the first acoustic transmission medium and the second acoustic transmission medium of the present disclosure in combination.
  • protrusion As shown in the schematic diagram of Figure 8, commercially available culture substrates have a protrusion on the outer periphery of their bottom surface.
  • the main roles of the protrusion are thought to be to prevent damage to the bottom surface of the substrate, to allow containers to be stacked on top of each other, and to prevent the temperature of the workbench from being directly transmitted to the bottom surface of the substrate when placed on the workbench.
  • the alignment can be performed by avoiding this protrusion, or by covering the protrusion.
  • the material of the substrate may be any material that is chemically stable and capable of culturing the desired cells, such as polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyvinyl chloride, nylon, polyurethane, polyurea, polylactic acid, polyglycolic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, poly(meth)acrylic acid, poly(meth)acrylic acid derivatives, polyacrylonitrile, poly(meth)acrylamide, poly(meth)acrylamide derivatives, polysulfone, cellulose, cellulose derivatives, polysilicone, polymethylpentene, glass, and metal.
  • polystyrene is preferred.
  • the vibrating body of the present disclosure can be any material that generates vibration, and may be, for example, a piezoelectric body bonded to a vibration plate.
  • the vibration plate is preferably made of glass, SUS, or quartz. By making the vibration plate out of glass, SUS, or quartz, it is possible to output a large amplitude at a relatively high driving frequency (vibration frequency) in the ultrasonic range without breaking the vibrating body.
  • the vibrating body may include an ultrasonic transducer.
  • the outer diameter of the diaphragm is equal to the outer diameter of the piezoelectric body.
  • the thickness of the diaphragm is preferably such that when the piezoelectric body and the diaphragm are bonded together and the diaphragm flexes and vibrates, the midpoint of the thickness direction of the flexure, i.e., the neutral plane that is neither stretched nor compressed when the diaphragm flexes, is on the diaphragm side, in order to efficiently utilize the distortion of the piezoelectric body for flexure.
  • the piezoelectric body used in the vibrator of the present disclosure is preferably a ring-shaped piezoelectric body, but the shape of the piezoelectric body that deflects the vibrator may be a circular ring shape or a disk shape. In order to directly observe the cell detachment state, a circular ring shape is preferable because it ensures a field of view below the culture substrate.
  • Piezoelectric bodies exhibit piezoelectric properties by being polarized, and the polarity of polarization can be changed according to the electrode pattern, as shown in FIG. 10. The polarized piezoelectric body can excite the standing wave mode and traveling wave mode vibration modes by controlling the phase of the input AC voltage for each electrode pattern.
  • Standing waves are generated by applying an AC voltage with a phase difference of 180 degrees to a negatively polarized electrode relative to a positively polarized electrode.
  • a two-phase driven traveling wave is generated when an AC voltage with a phase difference of 90 degrees between phases A and B is applied.
  • GND refers to ground and is used to ground the electrodes arranged on the back side.
  • An example of the electrode pattern is one in which Ag is formed by printing, but the electrode material can be other than Ag, such as noble metals as Au, Pt, Pd, etc., or base metals such as Cu.
  • the formation method can be printing, plating, or sputtering.
  • the material composition of the piezoelectric body used for the vibrator is PbZrTiO 3 (PZT), but in consideration of environmental regulations, it is preferable to use a lead-free piezoelectric material that does not substantially contain Pb.
  • lead-free piezoelectric materials include BaTiO 3 (BT), NaNbO 3 , BiNaTiO 3 , and BiFeO 3 as the main components, and they may be combined or may have metal elements added to the main components.
  • BaTiO 3 (BT)-based materials have been confirmed to have vibration performance equivalent to that of PbZrTiO 3 (PZT).
  • materials other than ceramics may also be single crystal materials and polymer-based piezoelectric materials.
  • the thickness of the piezoelectric material in the vibrating body is determined by the relationship between the hardness of the piezoelectric material and the diaphragm, and is calculated based on the relationship between the hardness of the piezoelectric material and the hardness of the diaphragm. It is preferable that the midpoint of the thickness of the bending, that is, the neutral plane that is neither tensile nor compressed when bending, is on the diaphragm side in order to efficiently utilize the distortion of the piezoelectric element for bending.
  • the cell detachment method of the present disclosure may include the following steps.
  • Placement process A step of placing an acoustic transmission medium on the vibrator, and if necessary, supplying a second acoustic transmission medium so that the second acoustic transmission medium is contained in the first acoustic transmission medium, and further placing a culture substrate.
  • Pressurizing step A step of applying pressure from the culture substrate or the vibrator side so that the culture substrate and the vibrator are in contact with the acoustic transmission medium.
  • a peeling step A step of vibrating the vibrator while the culture substrate and the vibrator are in contact with an acoustic transmission medium.
  • a first acoustic transmission medium is placed on a vibrating body (step S210).
  • a second acoustic transmission medium is supplied so as to be encapsulated in the first acoustic transmission medium (step S220).
  • a culture substrate is placed on the acoustic transmission medium (step S230).
  • pressure is applied from the upper surface of the culture substrate with a weight or the like (step S240).
  • ultrasonic wave application conditions are set (step S250).
  • application of ultrasonic waves is started (step S260).
  • the detached cells are collected (step S270).
  • supplying the second acoustic transmission medium so that it is encapsulated in the first acoustic transmission medium is not an essential process for the cell detachment method of the present disclosure, and the supply may be performed separately, or an acoustic transmission medium in which the second acoustic transmission medium is encapsulated in the first acoustic transmission medium in advance may be used.
  • applying pressure i.e., the pressurization process, is not an essential process for the cell detachment method of the present disclosure.
  • the placement step involves placing an acoustic transmission medium on the vibrator, and if necessary, supplying a second acoustic transmission medium so that it is contained within the first acoustic transmission medium, and then placing the culture substrate.
  • the acoustic transmission medium has a structure capable of supplying and circulating the second acoustic transmission medium
  • the second acoustic transmission medium is supplied and circulated in this process, and the valve is closed to stop the supply and circulation during the subsequent pressurizing and peeling processes.
  • the amount of the second acoustic transmission medium in the acoustic transmission medium can be controlled, and appropriate contact can be achieved according to the type and shape of the culture substrate, and the temperature of the acoustic transmission medium can also be controlled by circulating the second acoustic transmission medium.
  • the pressurizing process in this embodiment may be a process of applying pressure so as to bring the culture substrate and the vibrating body closer together, and may involve displacing the culture substrate to bring it closer to the vibrating body, or displacing the vibrating body to bring it closer to the culture substrate, or displacing both the culture substrate and the vibrating body to bring them closer together.
  • pressure is applied from the culture substrate side or the vibrator side so as to mechanically match the culture substrate and the acoustic transmission medium with the culture substrate and the vibrator in contact with the acoustic transmission medium.
  • Examples of pressure applying means for carrying out the pressure applying step include placing a weight on the lid of the culture substrate, applying a uniform load from above using a loading method such as a spring or leaf spring on the lid of the culture substrate container to fix the top of the culture substrate lid so that it does not move from above, and applying a load from below upward to the vibrating body.
  • a weight is preferable in consideration of the insulation of vibration, but other loading methods can be selected as long as they do not impede vibration.
  • a constant force spring can be used as the pressure applying means.
  • the weight placed on the lid of the culture substrate is preferably in the shape of a ring, for example, so that the cells in the container can be easily observed.
  • the load to be applied varies depending on the size of the culture substrate and the vibration pattern to be applied, but for example, in the case of a 35 mm dish, it is preferably between 10 g and 300 g, and in the case of a 60 mm dish, it is preferably between 100 g and 600 g.
  • the load may be a weight or the weight of the culture vessel itself. If the weight is too heavy, it will not only suppress and inhibit the vibration itself, but also cause the culture substrate itself to bend, making the vibration transmission state uneven, which will be a factor in reducing the detachment rate.
  • the vibrator is vibrated in a state where the culture substrate or the vibrator is in contact with the acoustic transmission medium to detach the cells. Further, the detachment step can include a step of exciting the vibrator to vibration in the ultrasonic band.
  • the vibration of the vibrating body has not yet begun, but begins in the peeling process.
  • the vibrating body is driven to generate the desired ultrasonic vibration mode by supplying a voltage of a resonant frequency to the vibrating body.
  • the vibrating body is driven to generate the desired ultrasonic vibration mode by supplying a voltage of a resonant frequency to the vibrating body.
  • the power source that applies the above voltage is not shown in FIG. 6.
  • the vibration pattern can be freely selected depending on the cell type and the detachment result.
  • these vibration patterns can be used alone in the detachment process, or can be input by changing them periodically.
  • the vibration waveform is preferably one that can vibrate the cell culture surface of the culture substrate with a certain amplitude, for example, an amplitude of 1 ⁇ m.
  • a certain amplitude for example, an amplitude of 1 ⁇ m.
  • the frequency is swept from low to high frequencies, for example from 20 kHz to 150 kHz in the ultrasonic range, resonating vibrations can be detected, but the vibrations detected on the low frequency side have a large amplitude but a small acceleration.
  • the vibrations detected on the high frequency side have a small amplitude but a large acceleration.
  • the conditions for applying a force that weakens the adhesive force of the cultured cells to the culture substrate depend largely on the adhesive force of the cells and the size and shape of the cells.
  • the flow generated in the detachment solution also differs depending on the amplitude and acceleration, so there are various combinations.
  • simply using a large amplitude and a large acceleration may not be preferable because it promotes the occurrence of cavitation, which is a factor in reducing the survival rate of cells.
  • the vibration waveform can be in a standing wave mode, which is formed as a pattern with orders in the circumferential direction or concentric circles from the center of the circular diaphragm, or in a traveling wave mode, which forms a radial vibration waveform on the diaphragm by vibrating the piezoelectric body with a phase change in the radial direction.
  • a vibration waveform can be formed by applying a voltage at the resonant frequency to the vibrating body, and the resonant frequency and vibration waveform shape can be calculated by structural calculations using the shape of the vibrating body and the material properties such as hardness and density.
  • the resonant frequency shifts to the lower frequency side due to heat generation from the piezoelectric body itself, so if the frequency is fixed and the drive is continued, the amplitude will become smaller. For this reason, sufficient amplitude can be obtained by driving the vibrator using a drive method that oscillates for a certain period of time, then provides a rest period to suppress temperature rise due to self-heating, or by repeatedly sweeping from high frequency to low frequency in a certain frequency range, so that the resonant frequency is always passed even if heat is generated.
  • the vibration waveform of the diaphragm can be measured by a laser Doppler vibrometer (Graphtec AT7200). The measurement method will be described using the cell detachment device shown in FIG. 6 as an example.
  • the vibration waveform of the diaphragm 11 can be constructed three-dimensionally, and the positions of the antinodes with large amplitude of vibration during driving and the nodes that do not vibrate can be dynamically grasped.
  • the vibration of the cell culture surface of the culture substrate 21 can also be measured using a similar configuration. It is preferable to place the acoustic transmission medium 13 on the diaphragm 11, and form a film of metal, for example Ag, on the inner surface of the culture substrate 21 by vapor deposition so that the laser is reflected by the culture substrate 21, and to place the medium in such a way that no air layer is created between the culture substrate 21 and the acoustic transmission medium 13. Note that in Figure 6, the first acoustic transmission medium and the second acoustic transmission medium are collectively shown as the acoustic transmission medium 13.
  • the amplitude of the center of the culture substrate 21 is swept near the desired resonance frequency, and the entire cell culture surface of the culture substrate 21 is scanned two-dimensionally at the frequency with the largest amplitude, thereby making it possible to grasp the vibration waveform generated on the cell culture surface of the culture substrate 21 in three dimensions.
  • the cell detachment method of the present disclosure can be applied to all kinds of cells without limitation.
  • Examples include various cultured cell lines such as Chinese hamster ovary-derived CHO cells, mouse connective tissue L929 cells, mouse skeletal muscle myoblasts (C2C12 cells), human fetal lung-derived normal diploid fibroblasts (TIG-3 cells), human fetal kidney-derived cells (HEK293 cells), human alveolar basal epithelial adenocarcinoma-derived A549 cells, human cervical cancer-derived HeLa cells, and insect-derived cell lines, epithelial cells and endothelial cells that constitute various tissues and organs in the body, skeletal muscle cells that exhibit contractility, Examples of such cells include smooth muscle cells, cardiac muscle cells, neuron cells that constitute the nervous system, glial cells, fibroblasts, hepatic parenchymal cells involved in the metabolism of the living body, primary cultured cells such as non-parenchymal liver cells and adipocytes, induced pluripot
  • the cell culture conditions can be appropriately selected according to the cells to be cultured.
  • an appropriate medium is added to the culture substrate 21, and cells are seeded therein at about 1.0 ⁇ 10 1 cells/cm 2 to 5.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 and cultured in an environment of 37° C. and 5% CO 2 concentration.
  • the culture medium (culture medium) for the cultured cells can be replaced with a cell detachment solution in the cell detachment step.
  • the detachment solution contains a protease.
  • the protease include trypsin, accutase, collagenase, natural protease, chymotrypsin, elastase, papain, pronase, or recombinant forms thereof.
  • protease dissolves cells, there is concern that it may have a negative effect on cells.
  • the cell detachment method of the present disclosure does not use protease, or even if it does, a very small amount of protease is used to achieve the same effect, thereby suppressing the negative effect on cells.
  • the cell detachment solution is a solution used when detaching cells, and may have the effect of reducing the adhesive strength of the cells.
  • the pH of the cell detachment solution is preferably in the neutral range. This is because the neutral range is suitable for cell culture and allows the cell viability to be stably maintained at a high level.
  • the pH can be appropriately adjusted with hydrochloric acid, sodium hydroxide, or the like.
  • various buffer solutions are preferably used to keep the pH stable.
  • the detachment solution may also be a culture medium.
  • the viscosity of the cell detachment solution can be appropriately adjusted by adding polymers or sugars.
  • a solution containing a metal ion chelating agent (hereinafter, sometimes referred to as a chelating agent) is particularly preferable, because the adhesive force of cells can be effectively reduced by using a cell detachment solution containing a chelating agent.
  • the chelating agent is not particularly limited, but examples thereof include ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter sometimes referred to as EDTA), ethylenediamine, ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid, glycol ether diamine tetraacetic acid, nitrilotriacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, iminodiacetic acid, dihydroxyethylglycine, dicarboxymethyl glutamic acid, ethylenediamine disuccinic acid, etidronic acid, citric acid, gluconic acid, phosphonobutane triacetic acid, etc.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • ethylenediamine ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid
  • glycol ether diamine tetraacetic acid glycol ether diamine tetraacetic acid
  • nitrilotriacetic acid diethylenetriaminepentaacetic acid
  • chelating agents that form chelates with divalent cations are preferred, chelating agents that form chelates with Ca2+ and Mg2+ are particularly preferred, and ethylenediaminetetraacetic acid is the most preferred.
  • the pH of the cell detachment solution is preferably 7.0 or more and 8.0 or less. This is because the higher pH in the neutral region that can maintain a high cell viability can enhance the chelating ability of ethylenediaminetetraacetic acid, and the efficiency of reducing the adhesive force of cells can be increased.
  • the chelating agents may be used alone or in combination of two or more kinds.
  • the content of the chelating agent is preferably 0.01 mM or more and 5.0 mM or less. Within this range, the chelating effect can be reliably obtained, and a decrease in activity due to the presence of an excess chelating agent can be suppressed.
  • the cell detachment solution may contain a hydrophilic polymer that contains a polyalkylene glycol structure.
  • a hydrophilic polymer that contains a polyalkylene glycol structure is polyethylene glycol.
  • the hydrophilic polymer preferably has a peak molecular weight Mp of 800 or more and 50,000 or less, and more preferably 1,200 or more and 20,000 or less, as measured by gel permeation chromatography. This is because the polymer has little effect on cells and the thickening effect of the polymer can be suppressed.
  • a detachment test can be performed to evaluate the cell detachment method of the present disclosure.
  • the detachment test can be performed, for example, as follows.
  • the cells are cultured, and the substrate in which the culture medium (culture medium) is replaced with the detachment liquid as necessary is subjected to the placement process, and the vibrator can be driven while being maintained at a constant temperature, for example, 25° C., in an incubator as necessary.
  • the drive time is long enough for cell detachment. After driving, the detached cells are collected with a dropper, and the cells that could not be collected and are still attached to the culture substrate 21 are collected by pipetting.
  • the detachment rate used below is the ratio of the number of cells detached by vibration to the total number of cells detached by vibration and pipetting method, expressed as a percentage.
  • the residual cells remaining on the bottom surface of the substrate after cell detachment can be observed using scattered light from a backlight.
  • the cell detachment device of the present disclosure is a cell detachment device that detaches cells by transmitting vibrations generated by a vibrator to cells provided on a culture surface of a culture substrate, the cell detachment device having a vibrator, an acoustic transmission medium, and a culture substrate mounting section, in that order, and configured such that vibrations of the vibrator are transmitted to the culture substrate via the acoustic transmission medium, the acoustic transmission medium including a first acoustic transmission medium and a second acoustic transmission medium, the first acoustic transmission medium being an elastic solid at room temperature, and the second acoustic transmission medium being encapsulated in the first acoustic transmission medium and being liquid at room temperature, or the second acoustic transmission medium having a larger tan ⁇ than the first acoustic transmission medium when a vibration of a frequency of 0.1 Hz is applied to the second acoustic transmission medium at room
  • the cell detachment device of the present disclosure includes a vibrating body 101 and an acoustic transmission medium 13.
  • the culture substrate installation section only needs to be able to recognize that a user will place a culture vessel thereon, and in the example of Fig. 6, an opening formed by the vibrating body 101, upper cover 15, and cushioning material 16 is suitable for placing a general-purpose dish, and so this opening corresponds to the culture substrate installation section.
  • a piezoelectric body 12 and a vibration plate 11 are provided as a vibration generating unit, i.e., a vibration body 101 provided with a piezoelectric body 12 and a vibration plate 11, generates bending vibrations in which the vibration is amplified by a combination of the hardness of the piezoelectric body 12, which expands and contracts, and the vibration plate 11 to which it is adhered.
  • the vibration body can include a transducer such as an ultrasonic transducer. The above-mentioned expansion and contraction is caused by applying a voltage to the piezoelectric body 12 using a power source (not shown).
  • a ring-type transducer is shown as a representative transducer 101, but a Langevin transducer or a rectangular transducer capable of obtaining a large amplitude may also be used.
  • an acoustic transmission medium 13 is interposed between the diaphragm 11 and the culture substrate 21. If the culture substrate 21 is placed directly on the diaphragm 11, the contact area will be a point contact, and energy other than vibration will be consumed, such as noise and heat generation, which will cause a decrease in efficiency. Basically, it is preferable to place the acoustic transmission medium 13 with an area that sufficiently covers the area of the cells attached to the culture substrate 21 to be peeled off. In order to fix the vibrating body 101, the ends of the vibrating body 101 are sandwiched between the upper cover 15, lower cover 17, cushioning material 16, and bolts 18 shown in FIG.
  • a vibrator is provided above the culture substrate, and a weight 14 is provided below the vibrator as a pressurizing means for the pressurizing step. Pressurization and depressurization are possible by moving the weight 14 up and down.
  • the vibrator By supplying a voltage at a resonant frequency, the vibrator is driven to generate a desired ultrasonic vibration mode.
  • the vibrator can be driven by applying a voltage at a frequency of a vibration mode that can form a desired vibration waveform on the cell culture surface of the culture substrate and at a desired amplitude to drive the cell detachment device using an AC power source that supplies a voltage at a resonant frequency.
  • the voltage of the S phase which is the sensor phase provided in the vibrator
  • the voltage generated by the distortion of the vibrator itself can be directly monitored, and the vibrator can be driven while checking its vibration state.
  • a thermocouple that can measure the temperature during the cell detachment process at a location that does not affect the vibration, it can be driven while monitoring.
  • An infrared temperature measuring instrument may be used to measure the temperature.
  • acoustic transmission media Examples of acoustic transmission media that can be used in the cell detachment method of the present disclosure are shown in Figures 1A to 1C, 2A to 2C, 3A to 3C, 4A to 4C, and 9A to 9D.
  • FIGS. 1A to 1C and 9A The configuration diagrams of a first example of an acoustic transmission medium are shown in FIGS. 1A to 1C and 9A.
  • a second acoustic transmission medium is contained within a first acoustic transmission medium.
  • FIG. 1A shows a configuration in which the bottom surface is in contact with a flat culture substrate and a vibrating body.
  • FIG. 1B shows a configuration in which the bottom surface is in contact with a warped culture substrate and a vibrator.
  • FIG. 1C further shows that the acoustic transmission medium conforms to the shape of the bottom surface of the culture substrate by applying pressure from the culture substrate or the diaphragm.
  • FIG. 9A illustrates a top view and a cross-sectional view of a first example acoustic transmission medium.
  • FIGS. 2A to 2C and 9B The configuration diagram of a second example of the acoustic transmission medium is shown in FIGS. 2A to 2C and 9B.
  • a second acoustic transmission medium is contained within a first acoustic transmission medium, and the first acoustic transmission medium has a protrusion that is convex in a direction facing the second acoustic transmission medium.
  • FIG. 2A shows a configuration in which a first acoustic transmission medium having a protrusion on the upper surface side thereof is in contact with a culture substrate having a flat bottom surface and a vibrator.
  • 2B shows a configuration in which a first acoustic transmission medium having a protrusion on the upper surface side thereof is in contact with a culture substrate having a curved bottom surface and a vibrator.
  • 2C further shows that the acoustic transmission medium of the present disclosure conforms to the shape of the bottom surface of the culture substrate by applying pressure from the culture substrate or the diaphragm.
  • the protrusion is structured to contact the facing first acoustic transmission medium in a pressurized state.
  • 9B shows a top view and a cross-sectional view of the acoustic transmission medium of the second example.
  • 207 indicates the projection diameter
  • 208 indicates the projection height.
  • FIGS. 3A to 3C and 9C The configuration diagram of a third example of the acoustic transmission medium is shown in FIGS. 3A to 3C and 9C.
  • a third example of the acoustic transmission medium is a second acoustic transmission medium that is contained within a first acoustic transmission medium, and the first acoustic transmission medium has a post portion that crosses and connects to the second acoustic transmission medium.
  • FIG. 3A shows a configuration in which a first acoustic transmission medium having a column portion connected across a second acoustic transmission medium is in contact with a culture substrate having a flat bottom surface and a vibrating body.
  • FIG. 3B shows a configuration in which a first acoustic transmission medium having a column portion connected across a second acoustic transmission medium is in contact with a culture substrate having a curved bottom surface and a vibrating body.
  • FIG. 3C further illustrates how the acoustic transmission medium of the present disclosure conforms to the shape of the bottom surface of the culture substrate when pressure is applied from the culture substrate or the diaphragm.
  • 9C illustrates a top view and a cross-sectional view of the third example of the acoustic transmission medium. In the figure, 209 indicates the diameter of the pillar.
  • FIGS. 4A to 4C and 9D A configuration diagram of a fourth example of the acoustic transmission medium is shown in FIGS. 4A to 4C and 9D.
  • the fourth example of the acoustic transmission medium has a second acoustic transmission medium supply pipe 133 for containing the second acoustic transmission medium in the first acoustic transmission medium.
  • FIG. 4A shows a configuration in which an acoustic transmission medium having a second acoustic transmission medium supply pipe 133 is in contact with a culture substrate having a flat bottom surface and a vibrator.
  • FIG. 4A shows a configuration in which an acoustic transmission medium having a second acoustic transmission medium supply pipe 133 is in contact with a culture substrate having a flat bottom surface and a vibrator.
  • FIG. 9D illustrates a top view and a cross-sectional view of a fourth example acoustic transmission medium.
  • Example 1 In the following examples, an example using the first example of the acoustic transmission medium shown in the schematic diagram of FIG. 1A is shown.
  • a Thermo Fisher Scientific Nunc (registered trademark) ⁇ 35 mm dish was used as the culture substrate.
  • the vibration plate of the cell detachment device was made of glass with an outer diameter of 70 mm and a thickness of 4 mm.
  • the material composition of the piezoelectric body was PZT, the outer diameter was the same as the vibration plate, 70 mm, the inner diameter was 57 mm, and the thickness was 2 mm considering that the neutral surface was on the vibration plate side.
  • the cell detachment device was assembled as shown in FIG.
  • the method for producing the sound transmission medium was to prepare a mold corresponding to the upper and lower surface shapes of the sound transmission medium, prepare and pour silicone rubber raw material (product name: KE-1950-10; manufactured by Shin-Etsu Chemical) into it, heat it to harden, and obtain silicone rubber for the upper and lower surfaces, which became the first sound transmission medium. Next, both sides of the rubber were bonded together with an adhesive, and water was injected into it through an injection port as the second sound transmission medium, and the injection port was sealed with an adhesive. The excess injection port was cut off to obtain the sound transmission medium.
  • silicone rubber raw material product name: KE-1950-10; manufactured by Shin-Etsu Chemical
  • the obtained acoustic transmission medium was placed so that its center was aligned with the diaphragm, and then the center of a Thermo Fisher Scientific Nunc (registered trademark) ⁇ 35 mm dish, which is a culture substrate on which cells were cultured, was aligned with the center of the diaphragm and slowly placed on the acoustic transmission medium.
  • the schematic diagram showing the configuration at this time is shown in FIG. 1B.
  • a 100 g weight was placed on the lid of the culture substrate to apply pressure.
  • the schematic diagram showing the configuration of the acoustic transmission medium after pressure was shown in FIG. 1C.
  • the cells were cultured as follows. CHO (Chinese Hamster Ovary) cells were seeded on a Thermo Fisher Scientific Nunc (registered trademark) ⁇ 35 mm dish at a density of 10,000 cells/ cm2 and cultured under an environment of 37°C and 5% CO2 concentration.
  • the medium used was Ham's F12 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10,000 U/ml, Thermo Fisher Scientific).
  • the culture was carried out for 48 hours, and the state of the cells was observed under a phase contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation.
  • the cell occupancy rate of the dish was about 80%.
  • Cell Detachment The medium in the dish was removed, and the cells were washed with PBS(-) and then immersed in a detachment solution of PBS(-) for 3 minutes.
  • the culture substrate was then placed in a cell detachment device at an ambient temperature of 25°C, and cells were detached at an ambient temperature of 25°C for 2 minutes in standing wave mode using frequency sweep vibration (frequency 22-27 kHz, frequency sweep period 1 s, voltage 90 V).
  • frequency sweep vibration frequency 22-27 kHz, frequency sweep period 1 s, voltage 90 V.
  • the total number of detached cells was calculated by adding up the number of cells detached by ultrasound and the number of cells detached by the cell scraper thereafter, and the ratio of the number of ultrasonically detached cells to the total number of detached cells was defined as the detachment rate and calculated.
  • the evaluation results showed that the peeling rate was 95.4%, and the variation was rated A.
  • Example 2 was carried out under the same conditions as Example 1, except that the type of the second acoustic transmission medium was changed as follows. That is, in this example, ultrasonic gel (Projelly for ultrasonic testing, normal type; manufactured by Gex Co., Ltd.) was used as the second acoustic transmission medium. The evaluation results showed that the peeling rate was 96.1%, and the variation was rated A.
  • ultrasonic gel Projelly for ultrasonic testing, normal type; manufactured by Gex Co., Ltd.
  • Example 3 In Example 3, the experiment was carried out under the same conditions as in Example 1, except that the type of the second sound transmission medium was changed as follows: That is, PVA gel was used as the second sound transmission medium.
  • the PVA gel was prepared by the following method. Denka Poval (registered trademark) K-24E (manufactured by Denka Co., Ltd.) was weighed out to 3.7% by mass, and pure water was added to prepare a total of 80 mL. The PVA was completely dissolved by stirring while applying heat in a thermostatic bath, and a PVA aqueous solution was obtained.
  • borax special grade sodium tetraborate (decahydrate); manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.
  • pure water was added to prepare a total of 1.0% by mass, and a total of 16 mL was obtained.
  • the borax aqueous solution was gradually added dropwise, and the PVA gel was obtained by stirring until it became uniform.
  • the evaluation results showed that the peeling rate was 93.0%, and the variation was rated A.
  • Comparative Example 1 In Comparative Example 1, the study was carried out under the same conditions as in Example 1, except that silicone rubber was used as the acoustic transmission medium. Silicone rubber with a thickness of 2.0 mm and a hardness of 30° was used as the acoustic transmission medium. The evaluation results showed that the peeling rate was 80.1%, and the variation was rated D.
  • Table 1 shows the results of summarizing the configurations of the above-mentioned Examples and Comparative Examples.
  • Vibration plate 12 Piezoelectric body 13: Acoustic transmission medium 131: First acoustic transmission medium 132: Second acoustic transmission medium 14: Weight 15: Upper cover 16: Cushioning material 17: Lower cover 18: Bolt 21: Culture substrate 22: Culture substrate upper cover 101: Vibration body

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Abstract

培養基材と振動体とを機械的に整合することで、対象細胞に合わせた振動設計を可能とし、高い剥離率で接着細胞を剥離可能な細胞剥離方法及び細胞剥離装置を提供する。培養基材の培養面に付着した細胞を前記培養面から剥離する細胞剥離方法であって、前記培養基材と振動体との間に音響伝達媒体を配置した状態で、前記振動体を振動させて、前記培養面から前記細胞を剥離する細胞剥離方法、ただし、前記音響伝達媒体は、第一の音響伝達媒体及び第二の音響伝達媒体を含み、前記第一の音響伝達媒体は室温において弾性を有する固体であり、前記第二の音響伝達媒体は前記第一の音響伝達媒体に内包され、室温において液体であるか、または室温で前記第二の音響伝達媒体に周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが、前記第一の音響伝達媒体のｔａｎδよりも大きいことを特徴とする、細胞剥離方法。

Description

細胞剥離方法及び細胞剥離装置
　本開示は、細胞剥離方法及び細胞剥離装置に関する。
　近年、再生医療で用いられる細胞や、バイオ医薬品などの製造に用いられる細胞を培養する細胞培養が盛んに行われている。細胞培養は、接着培養と浮遊培養に大別され、そのうち接着培養は様々な細胞種に適した培養方法であり、広く用いられている。しかしながら、細胞を回収する際は、細胞を剥離するために、酵素処理を行う必要があり、処理方法によっては細胞にダメージを与える場合がある。そのため、酵素処理による細胞の剥離は細胞品質のバラツキを生じる原因ともなっている。それ故に、細胞にダメージを与えずに、高い剥離率で回収する剥離条件の検討がなされている。
　超音波や音響放射圧を利用した細胞剥離技術の場合、音響伝達媒体として一般的に水を用いられる場合が多く、この場合、水が雑菌繁殖の懸念が強く、医療現場においては特に忌避されている傾向が高い。
　特許文献１に、培養基材に音響放射圧を伝達する媒体を介して細胞を特定の位置に配列するパターニング装置が提案されている。音響伝達媒体の例示として、シリコーンゴムが記載されているが、この材料で培養基材に音響放射圧を伝達させたところ、水に比べて細胞剥離性能が十分ではなく、さらなる細胞剥離性能の向上、及びバラツキ低減が求められている。また、特許文献２に密閉体で構成される医療用超音波伝達用具が提案されている。超音波探触子と対象部位との間の音響結合に用いられているものの、この超音波伝達手段を用いて超音波振動を伝達させ、細胞を剥離する記載がない。
特開２０１８－４２５３４号公報 特許第６３２５３６３号公報
　本開示は上述の課題に対処するためになされたもので、対象細胞に合わせた振動設計を可能とし、高い剥離率で接着細胞を剥離可能な細胞剥離方法を提供するものである。
　本開示は、培養基材の培養面に付着した細胞を前記培養面から剥離する細胞剥離方法であって、
　前記培養基材と振動体との間に音響伝達媒体を配置した状態で、前記振動体を振動させて、前記培養面から前記細胞を剥離する細胞剥離方法、
　ただし、前記音響伝達媒体は、第一の音響伝達媒体及び第二の音響伝達媒体を含み、
　前記第一の音響伝達媒体は室温において弾性を有する固体であり、
　前記第二の音響伝達媒体は前記第一の音響伝達媒体に内包され、室温において液体であるか、または室温で前記第二の音響伝達媒体に周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが、前記第一の音響伝達媒体のtanδよりも大きいことを特徴とする、細胞剥離方法を提供する。
　また、本開示は、培養基材の培養面に設けられた細胞に振動体が発生した振動を伝達することで、前記細胞を剥離する細胞剥離装置であって、
　振動体、
　音響伝達媒体、及び
　培養基材設置部を、この順に有し、
　前記振動体の振動が前記音響伝達媒体を経由して前記培養基材に伝達されるように構成され、
　前記音響伝達媒体は、第一の音響伝達媒体及び第二の音響伝達媒体を含み、
　前記第一の音響伝達媒体は室温において弾性を有する固体であり、
　前記第二の音響伝達媒体は前記第一の音響伝達媒体に内包され、室温において液体であるか、または室温で前記第二の音響伝達媒体に周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが、前記第一の音響伝達媒体のtanδよりも大きいことを特徴とする細胞剥離装置を提供する。
　本開示によれば、対象細胞に合わせた振動設計を可能とし、高い剥離率で接着細胞を剥離可能な細胞剥離方法を提供することができる。
本開示の細胞剥離装置の第一の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第一の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第一の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第二の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第二の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第二の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第三の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第三の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第三の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第四の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第四の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離装置の第四の実施形態の構成の一例を示す断面概略図である。 本開示の細胞剥離方法の工程の具体例を示す。 本開示の装置の一例を示す。 本開示の方法の配置工程の一例を説明する。 本開示の方法の配置工程の一例を説明する。 本開示の方法の加圧工程一例を説明する。 本開示の方法の剥離工程一例を説明する。 本開示の培養基材の一例について概略図を示す。 本開示の音響伝達媒体の一例を説明する断面図と上面図である。 本開示の音響伝達媒体の一例を説明する断面図と上面図である。 本開示の音響伝達媒体の一例を説明する断面図と上面図である。 本開示の音響伝達媒体の一例を説明する断面図と上面図である。 本開示の圧電体の一例を説明する概略図である。
　以下に実施例を挙げて、本開示の細胞剥離方法を説明するが、本開示は、以下の実施例により限定されるものではない。
（基本構成）
　本開示の細胞の剥離方法は、
　培養基材の培養面に付着した細胞を前記培養面から剥離する細胞剥離方法であって、
　前記培養基材と振動体との間に音響伝達媒体を配置した状態で、前記振動体を振動させて、前記培養面から前記細胞を剥離する細胞剥離方法、
　ただし、前記音響伝達媒体は、第一の音響伝達媒体及び第二の音響伝達媒体を含み、
　前記第一の音響伝達媒体は室温において弾性を有する固体であり、
　前記第二の音響伝達媒体は前記第一の音響伝達媒体に内包され、室温において液体であるか、または室温で前記第二の音響伝達媒体に周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが、前記第一の音響伝達媒体のｔａｎδよりも大きいことを特徴とする、細胞剥離方法である。
　本開示の細胞剥離方法の概念図を図７Ａから図７Ｄに示す。
　図７Ａは音響伝達媒体１３を配置する工程を示す。なお、音響伝達媒体１３は、あらかじめ配置されていてもよく、本工程は本開示の細胞剥離方法に必須の工程ではない。
　図７Ａでは、音響伝達媒体１３を振動体１０１の上に配置している。図７Ｂでは、配置された音響伝達媒体１３上に、培養基材２１を配置している。図７Ｃは加圧工程を示し、培養基材２１上から加圧している。なお、加圧工程は本開示の剥離方法に必須ではない。図７Ｄは、剥離工程を示す。図７Ｄでは、培養基材２１上から加圧しながら振動体１０１を駆動させて超音波振動を付与して細胞を剥離している。加圧工程によって、第一の音響伝達媒体が培養基材や振動体に整合させやすくなるとともに、剥離行程においても、第一の音響伝達媒体が培養基材や振動体に整合した状態で振動を伝達することができる。ここで、第一の音響伝達媒体と、培養基材や振動体とが整合しているとは、第一の音響伝達媒体や第二の音響伝達媒体を介して、振動体の振動を培養基材に十分に伝達するように十分に接触しているが、第一の音響伝達媒体と、培養基材や振動体との間に、本発明の課題を解決できる程度のきわめて微小な隙間や、きわめて微量な物質が介在していてもよいことを意味する。例えば、第一の音響伝達媒体と培養基材との間に数分子程度の水が介在していても、第一の音響伝達媒体と培養基材とが接触しているとみなすことができる。
　本開示の細胞剥離方法において、振動体の振動を培養基材に伝達する際に、これらの間に音響伝達媒体を設ける。音響伝達媒体は、室温で、弾性を有し、かつ固体である第一の音響伝達媒体が、室温において液体であるか、または室温で第二の音響伝達媒体に周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが、前記第一の音響伝達媒体のｔａｎδ（室温で第一の音響伝達媒体に周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδ）よりも大きい第二の音響伝達媒体を内包している。振動発生部である振動体は、圧電体、振動板を備え、その振動機構は、自身が伸縮する圧電体と接着された振動板との硬さの組み合わせによって振動を増幅させた屈曲振動を発生させるものであり、本開示では振動体の構造要因による共振を利用するもので、共振周波数で大きな振動を得ることができる。
（音響伝達媒体）
　本開示の細胞剥離方法において、振動を発生する振動体と振動を伝える対象の培養基材との整合に、音響伝達媒体が用いられる。整合には音響インピーダンスなどの物性的な整合の他、密着性などの機械的な整合も重要である。音響伝達媒体と、培養基材や振動体との間で、機械的な整合や物性的な整合がとれて、本発明の課題を解決できている構成となっているとよい。なお、本実施形態において音響伝達媒体は音響伝達材料と言い換えることもできる。
　振動体と培養基材との物性的な整合に関しては、「音響インピーダンスＺ」と呼ばれる物理量によって規定することができる。
　具体的には、音響伝達媒体の音響インピーダンスＺは、
　　Ｚ＝（音響伝達媒体の密度）×（音響伝達媒体内での音速）
で定義される。
　また、２つの物質の境界に音波が到達した時、音波の透過率は、
　　透過率＝（４×Ｚ１×Ｚ２）／（Ｚ１＋Ｚ２）＾２
で定まる。なお、Ｚ１，Ｚ２は、音波を伝達する１つ目及び２つ目の物質の音響インピーダンスである。
　例えば、水と空気とにおける透過率、及びシリコーンゴムと空気とにおける透過率は、それぞれ、
　水の音響インピーダンスＺ１＝１．５×１０＾６［ｋｇ／ｍ＾２／ｓ］
　空気の音響インピーダンスＺ２＝４．０８×１０＾２［ｋｇ／ｍ＾２／ｓ］
　シリコーンゴムの音響インピーダンスＺ３＝１．０×１０＾６［ｋｇ／ｍ＾２／ｓ］
である。上述の透過率の式に水と空気のインピーダンスを代入すると、透過率はほぼゼロとなる。
　即ち、水と空気、シリコーンゴムと空気との間では、音波の透過率はほぼゼロであり、全反射することとなる。
　培養基材の材料によく用いられるポリスチレンの音響インピーダンスは、Ｚ４＝２．４×１０＾６［ｋｇ／ｍ＾２／ｓ］である。したがって、本開示の音響伝達媒体における、振動体と培養基材との物性的な整合に関しては、上記の値に近い音響インピーダンスをもつ材料を第一、第二の音響伝達媒体とすることが好ましい。
　振動体と培養基材との機械的な整合に関しては、固体を介して密着している状態が好ましい。特に本開示では、振動体の振動波形を培養基材の細胞培養面に形成するため、広い面積で密着できるような機械的な整合が重要である。
　培養基材として、市販のディッシュ型の容器を用いた場合、音響伝達媒体として水や低荷重で容易に変形するグリセリンなどの低分子材料では、培養基材を振動体上に載置したとき、培養基材の突出部が直接振動体に接触し、振動伝達経路が複数存在することになり、発生した振動が複雑化し、制御が困難となる場合がある。本開示の細胞剥離方法は、主体的な振動の制御を行う。すなわち、振動体と培養基材とを固体で密着させることで振動伝達経路を一定に保ち、振動制御が容易にする。
　本開示の音響伝達媒体で振動体と培養基材とを機械的に整合する場合、固体材料としては高分子材料であるゴムやゲルのように弾性を有する材料であることが好ましく、具体的には、シリコーン樹脂、ウレタン樹脂、ジアリル二レート樹脂、不飽和ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、メラニン樹脂、天然ゴムなどが挙げられる。これらの中でも、駆動周波数（振動周波数）の周波数帯域での減衰の少ない物性であることで伝達効率が高く、さらに音響伝達媒体自身の発熱が抑制できることから、シリコーンゴムが好ましい。
（第一の音響伝達媒体）
　第一の音響伝達媒体は室温において弾性を有する固体材料からなる。なお、本明細書中で、室温とは、２０℃以上３０℃以下であり、好ましくは２５℃である。
　弾性を有する固体材料の例としては高分子材料であるゴムやゲルを挙げることができる。
　高分子のゴム材料としては、例えばシリコーン樹脂、ウレタン樹脂、ジアリル二レート樹脂、不飽和ポリエステル、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、及びメラニン樹脂で構成される群から選択される少なくとも一種の樹脂を含むゴム、天然ゴム、などが挙げられる。より具体的には、シリコーンゴム、ウレタンゴム、ブチルゴム、ニトリルゴム、ブタジエンゴム、ラテックスゴムが挙げられる。
　高分子のゲル材料としてはハイドロゲルや高分子ゲルが挙げられる。ハイドロゲルとして、例えばポリビニルアルコールやポリアクリル酸などの親水性高分子材料とこれらに対応する架橋剤とを組み合わせて得られるハイドロゲルが挙げられる。架橋剤として例えば、無機系の架橋剤であるホウ砂や層状粘土鉱物（クレイ）などや、有機系の架橋剤である樹状デンドリティック高分子などの多官能の高分子材料などが挙げられる。高分子ゲルとして例えば、アクリル樹脂やウレタン樹脂などの高分子材料と、これらに対応する架橋剤である多官能化合物とを組み合わせて得られる高分子ゲルなどが挙げられる。
　第一の音響伝達媒体は、周波数１Ｈｚの振動を付与した場合であって、室温における動的粘弾性測定で得られるｔａｎδが１．０未満であるものを用いることができる。また、第二の音響伝達媒体が、室温で固体である場合、周波数０．１Ｈｚの振動を付与した場合であって、室温における動的粘弾性測定で得られる第一音響伝達媒体及び第二音響伝達媒体のｔａｎδをそれぞれｔａｎδi、ｔａｎδiiとしたとき、ｔａｎδi＜ｔａｎδiiを満たす、及び／またはｔａｎδi≧１であることが好ましい。
　第一の音響伝達媒体は、シリコーンゴム、天然ゴム、ウレタンゲル、及びゲル材料からなる群から選択される少なくとも一種を含むことが好ましく、中でも、シリコーンゴムを含むことは好ましい。シリコーンゴムは、駆動周波数の周波数帯域での減衰の少ない物性であることで伝達効率が高く、さらに音響伝達媒体自身の発熱が抑制できる。
　また、取り外しを容易にする目的で、第一の音響伝達媒体の培養基材あるいは振動体に対向する面に例えばフッ素コートのような表面処理を施しても構わない。
　また、音響伝達媒体は、細胞剥離状況を直接観察するためには、可視光の波長領域の光に対して透明であることが好ましい。
　第一の音響伝達媒体には、粘度、第二の音響伝達媒体との親和性、第二の音響伝達媒体との音響インピーダンス、保存安定性、抗菌作用などの物性値を制御する目的で各種添加剤を加えてもよい。なお、第二の音響伝達媒体との親和性とは、例えば、第一の音響伝達媒体と第二の音響伝達媒体に関する接触角や濡れ性のような特性をいう。
　第一の音響伝達媒体の厚みについては、厚すぎると超音波振動伝達において界面で超音波を反射しやすくなり、また、振動減衰が無視できなくなる。薄すぎると第二の音響伝達媒体を内包する膜としての耐久性が悪くなり、また、破れたり、穴が開いて内包物が外に出てしまう。従って第一の音響伝達媒体の厚みの合計としては振動体を振動させる際に５ｍｍ以下であることが好ましい。
（第二の音響伝達媒体）
　第二の音響伝達媒体は室温において液体であるか、または室温で前記第二の音響伝達媒体に周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが、前記第一の音響伝達媒体よりも大きい。
　室温で液体であるとは、２０℃以上３０℃以下で液体であることを指し、特に、室温２５℃における固有粘度［η］または周波数１Ｈｚの振動が付与された場合であって、室温２５℃における動的粘弾性測定で得られる複素粘度η*、またはＢ型粘度計やレオメーターによってせん断速度を変化させることで測定される粘度ηが小さいものとすることができる。
　また、室温で固体である場合、室温で周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが、前記第一の音響伝達媒体よりも大きい。好ましくは、周波数０．１Ｈｚ振動が付与された場合であって、室温における動的粘弾性測定で得られるｔａｎδが１以上となる固体である。すなわち、第二の音響伝達媒体が固体である場合、周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合であって、室温における動的粘弾性測定で得られる第一音響伝達媒体及び第二音響伝達媒体のｔａｎδをそれぞれｔａｎδi、ｔａｎδiiとしたとき、ｔａｎδi＜ｔａｎδiiを満たす、及び／またはｔａｎδi≧１であることが好ましい。
　第二の音響伝達媒体となり得る固体として、可撓性のあるゲルを挙げられる。可撓性のあるゲルは、第一の音響伝達媒体として例示したゲルと同じく、例えばポリビニルアルコールやポリアクリル酸などの親水性高分子材料と、架橋成分であるホウ砂や層状粘土鉱物（クレイ）、樹状デンドリティック高分子などの多分岐高分子材料などを組み合わせたハイドロゲルや、アクリル樹脂やウレタン樹脂などの高分子材料と対応する架橋剤である多官能化合物とを組み合わせた高分子ゲル、などが挙げられる。
　ｔａｎδは、音響伝達媒体で振動体と培養基材とを機械的に整合する際の温度、時間スケールにおける値を使用することが好ましい。すなわち、ｔａｎδの測定は、室温、より好ましくは２５℃で、周波数１（Ｈｚ）あるいは０．１（Ｈｚ）の振動を付与したときの動的粘弾性Ｇ’及びＧ”をレオメーターなどで測定し、ｔａｎδ＝Ｇ”／Ｇ’の関係式を用いて計算することでｔａｎδを算出することができる。ここでＧはせん断弾性率を表し、Ｇ’は貯蔵剪断弾性率、Ｇ”は損失剪断弾性率を表す。ただし、第二の音響伝達媒体について、ｔａｎδが測定される場合に以上を満たせばよく、第二の音響伝達媒体については、ｔａｎδが測定できない場合もある。第二の音響伝達媒体は室温で液体であってもよい。この場合ｔａｎδは測定できない場合もある。
　第二の音響伝達媒体が液体である場合、音響伝達を損なわない程度に粘度が高くても構わない。
　粘度は、室温、より好ましくは２５℃でＢ型粘度計やレオメーターで粘度測定することができる。さらには、２５ｍｍのパラレルプレートを使用し、ギャップ１．０ｍｍで測定する場合のせん断速度が１．０（１/ｓ）における粘度の値を採用することが好ましい。液体の粘度によっては前記条件では適切なトルク値が得られない場合があるが、その際は同程度のせん断速度となるよう、プレートの径やギャップなどの値を変更することで測定することが可能である。
　液体としては水、生理食塩水、エタノール、希釈エタノールなどの低粘度液体や、これらの混合物、さらにグリセリンやシリコーンオイル、高分子溶液などの高粘性液体やゲル材料、さらにはこれらの混合物などが挙げられる。ゲルを水などの液体に分散、膨潤させたポリマー溶液などでもよく、より具体的には、グリセリンなどの液体にＰＶＡゲルなどの増粘剤などの添加剤を添加して粘弾性を調整した超音波ジェルも好ましい。なお、ゲル材料は固体と分類される場合と液体と分類される場合がある。固体としてのゲルは架橋成分の含有比率が高く、液体としてのゲルは架橋成分の含有比率が低い。本明細書においては、発明者らが行った測定方法においてｔａｎδが測定可能であったものを固体、そうでないものを液体としている。これは、弾性体としての反発と関係していると考えられる。以下の実施例においては、ＰＶＡは固体としての可撓性のあるゲルであり、超音波ジェルは液体としてのゲルである。
　第二の音響伝達媒体を内包している第一の音響伝達媒体に傷がついた際に中身が漏れ出ることを防ぐために、第二の音響伝達媒体は、室温で周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが１．０以上の固体であることが好ましい。
　第二の音響伝達媒体は、粘度や第一の音響伝達媒体との親和性や音響インピーダンス、表面張力や保存安定性、抗菌作用などの物性値を制御する目的で各種添加剤を含んでもよい。
　添加剤の例として、以下を挙げることができる。
　表面張力の調整のための添加剤として、アニオン性界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどを挙げられる。
　カチオン性界面活性剤として、エチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ベンザルコニウム塩化物、ステアリン酸ジメチルアミノプロピルアミドなどを挙げられる。
　非イオン性界面活性剤として、コンタミノン（登録商標）、コンタミノン（登録商標）ＵＳ、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０などを挙げられる。
　両性界面活性剤として、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯなどを挙げられる。
　保存安定剤として、ヒンダードアミン、ベンゾフェノン、ベンゾトリアゾールなどの光安定剤、アミン系、フェノール系、硫黄系、リン系などの酸化防止剤を挙げられる。
　抗菌作用を示すものとして、ベンザルコニウム塩化物、アジ化ナトリウム、及びアンピシリン、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質、などが挙げられる。
（音響伝達媒体の内包）
　本開示の細胞剥離方法に用いられる音響伝達媒体は、第一の音響伝達媒体によって第二の音響伝達媒体が内包された構成となる。
　内包とは振動体と培養基材との間で第一の音響伝達媒体の内側に第二の音響伝達媒体が存在していればよい。例えば袋状の第一の音響伝達媒体の中に第二の音響伝達媒体が密閉された形態や、振動伝達を損なわないように、袋状の第一の音響伝達媒体に循環用の管がついていて、その中を通して第二の音響伝達媒体を供給し、循環できるような形態であってもよい。第一の音響伝達媒体の中で第二の音響伝達媒体が循環できるような形態である場合、後述の配置工程で第二の音響伝達媒体を第一の音響伝達媒体に内包させたのち、加圧、剥離工程においては弁などで循環しないような状態にすることが好ましい。
　内包させる方法については、例えば、袋状の第一の音響伝達媒体を作製しておき、中に第二の音響伝達媒体を注入後、注入口を封じる方法が挙げられる。封じる方法としては、熱で溶融させて封じる方法、圧力で圧着する方法、接着剤や第一の音響伝達媒体の原材料化合物などで反応させて封じる方法、物理的にクランプして封じる方法などが挙げられる。
　その他の内包する方法として、上面、下面の第一の音響伝達媒体のシートを作製しておき、第二の音響伝達媒体を内包させながら上下面を密着させて封じる方法が挙げられる。本開示の細胞剥離方法は、内包工程として、第二の音響伝達媒体を第一の音響伝達媒体に内包させる内包工程を含むことができる。
　第一の音響伝達媒体は第二の音響伝達媒体と対向する方向に凸となる突起部を少なくとも１つ有することができる。突起部は加圧工程で加圧した際に、向かい合う反対側の面にある第一の音響伝達媒体と物理的に密着する形状であることが好ましく、例えば円柱状、半球状、円錐状、円柱または円錐と半球を組み合わせた構造、などとすることができる。突起部は第一の音響伝達媒体と同じ材料であることが好ましい。
　突起部の位置については付与する超音波振動パターンの振動の強い腹部（振幅値の大きい領域）に相当する位置が好ましいが、振動の強くない部分や、振動しない部分を含んでいてもよい。突起部の数についても、少なくとも一つであれば良く、例えば、複数の振動パターンに対応するため、各振動パターンの腹部に相当する位置に複数個の突起部が配置されていてもよい。
　第一の音響伝達媒体は前記第二の音響伝達媒体を横切ってつながっている柱部を少なくとも１つ有することができる。
　本開示の音響伝達媒体のうち、振動体と対向する面は培養基材と対向する面よりもヤング率が高いことができる。ヤング率が高いということは、弾性率が高いことと同義であり、例えば、第一の音響伝達媒体の厚みが大きい、または第一の音響伝達媒体の製造時の分岐成分量を多くすることなどで、ヤング率を高くすることができる。
　第一の音響伝達媒体と第二の音響伝達媒体の音響インピーダンス差が少ない方が好ましい。また、音響伝達媒体は空気を内包しないことが好ましく、したがって、第二の音響伝達媒体を第一の音響伝達媒体に内包させる時は空気が含まれないように内包することが好ましい。
　本開示の音響伝達媒体の厚みは振動減衰を低減し、また、界面で超音波を反射しないようにするという観点から、１０ｍｍ以下であることが好ましく、振動体に振動を発生させる際には５ｍｍ以下であることが好ましい。
　また、音響伝達媒体のアスペクト比（厚み／対角線の大きさ）は０．３以下であることが好ましい。０．３以下となることで設置時の安定性が高まる。
　本開示の音響伝達媒体の振動体と培養基材と対向する面に、整合性を高めるために、水などの液体を付与してから使用してもよい。液体としては好ましくは表面張力の低い液体である。
　本開示の音響伝達媒体のうち、振動体と対向する面には整合性を高めるために、接着剤や粘着剤などを用いて振動体と全面、または部分的に接着させてもよい。接着剤や粘着剤については公知の接着剤や粘着剤、両面テープなどが用いられる。
（培養基材）
　本開示の細胞剥離方法は培養基材の培養面に付着した細胞を培養基材から剥離するものである。細胞が付着するとは、接着性の細胞が接着することのみでなく、細胞が接触して存在することを含む。すなわち、細胞が培養基材に付着するとは、接着性の細胞が接着することのみでなく、細胞が接触して存在することを含む。すなわち、細胞が培養基材に細胞が接着因子を介して接着することを含むが、接着に限定されず、細胞が培養基材との弱い相互作用によって留まっていること、あるいは、細胞が重力などの外力によって単に留まっていることを含む。
　本開示の培養基材とは、細胞培養に用いる基材であり、細胞が付着する面を含むあらゆる基材を指す。培養基材は例えば、細胞培養用途の容器あるいはその一部を含む。細胞容器の例として、ディッシュ（シャーレともいう）、フラスコ、プレート、チューブなどを挙げられる。これらはいずれも、例えばコーニング社、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ＡＧＣテクノガラス社などの製品が汎用のディスポーザブル容器として用いられる。中でも本開示の培養基材の例として、ディッシュは典型的である。培養基材は取り外し可能な蓋がついているものが汎用される。本明細書中で培養基材は、蓋のような部品を含んでもよいし、含まなくてもよい。ディッシュの形状の例は図８の概略図の通りである。この中で特に底面反り高さ３００はメーカーごとの型番違いや、ロット違い、さらにはロット内でもバラツキが大きい。培養基材を音響伝達媒体と機械的に整合するためには底面反り高さのバラツキを考慮する必要があるが、本開示の第一の音響伝達媒体と第二の音響伝達媒体とを併用することで機械的な整合が容易となる。
　図８の概略図のように市販の培養基材底面には、外周部に突出部がある。突出部の主な役割は、基材底面を傷つけないこと、容器同士を重ねることを可能とすること、作業台上に置いた際、直接基材底面に作業台の温度が伝わらないことなどが考えられる。培養基材と音響伝達媒体とを機械的に整合する際には、この突出部を避けて整合させてもよいし、突出部を覆う形で整合させてもよい。
　基材の材質は、化学的に安定であり、所望の細胞を培養可能な材質であればよく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリウレタン、ポリウレア、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸誘導体、ポリアクリロニトリル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリルアミド誘導体、ポリスルホン、セルロース、セルロース誘導体、ポリシリコーン、ポリメチルペンテン、ガラス、金属などが挙げられる。この中でもポリスチレンが好ましい。
（振動体）
　本開示の振動体は振動を発生するものであれば、限定されることなく用いられるが、例えば圧電体と振動板とを接着したものが挙げられる。圧電体が円形型の場合は振動板はガラス、ＳＵＳ、石英であることが好ましい。振動板をガラス、ＳＵＳ、石英にすることで、振動体として破損することなく超音波領域の比較的高い駆動周波数（振動周波数）で大きい振幅を出力することができる。振動体は超音波振動子を含むことができる。
　リング形状の圧電体の場合、振動板の外径寸法は圧電体の外径寸法と等しいことが好ましい。
　振動板の厚みは、圧電体と振動板とが接着され、撓み振動した際に撓みの厚さ方向の中点、つまり撓みの際、引っ張り、圧縮のどちらもならない中立面が振動板側にあることが、圧電体の歪を効率良く撓みに利用するために好ましい。
（圧電体）
　本開示の振動体に用いられる圧電体はリング形状の圧電体が好ましいが、振動体を撓ませる圧電体の形状は、円環形状、円板形状であっても構わない。細胞剥離状況を直接観察するためには、培養基材下部の視野を確保できる円環形状が好ましい。
　圧電体は、分極処理を施すことで圧電特性を発揮するが、図１０の通り、電極パターンに応じて分極の極性を変えて構わない。分極処理した圧電体は、入力した交流電圧の位相を電極パターン毎に制御することで、定在波モード、進行波モードの振動モードを励振することができる。プラスに分極した電極に対して、マイナスに分極した電極に１８０度の位相差を付けた交流電圧を印加することで定在波が発生する。これに対し、図１０の様に、左右にＡ相、Ｂ相と電極を分けたとき、Ａ相とＢ相の位相差を９０度にした交流電圧を印加すると、２相駆動の進行波が発生する。図１０でＧＮＤはグランドを指し、裏面に配置された電極の接地に用いる。
　電極パターンは、Ａｇを印刷法で形成する例を挙げられるが、電極材料にはＡｇの他、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄなどの貴金属やＣｕなどの卑金属でも構わない。形成方法は印刷法、メッキ法、スパッタ法であっても構わない。
　振動体に用いた圧電体の材料組成はＰｂＺｒＴｉＯ３（ＰＺＴ）を用いたが、環境規制を考慮して実質的にＰｂを用いない非鉛圧電材料であることが好ましい。非鉛圧電材料には、主成分がＢａＴｉＯ３（ＢＴ）、ＮａＮｂＯ３、ＢｉＮａＴｉＯ３、ＢｉＦｅＯ３などが挙げられ、それぞれの組み合わせや、主成分に金属元素が添加されていても構わない。特に、ＢａＴｉＯ３（ＢＴ）系材料で、ＰｂＺｒＴｉＯ３（ＰＺＴ）と同等の振動性能を確認した。また、セラミックス以外の材料として、単結晶材料、高分子系圧電材料でも構わない。
　振動体の圧電体の厚みは、接着し、積層された圧電体と振動板が、撓み振動した際に、撓みの厚さ方向の中点、つまり、撓みの際、引っ張り、圧縮のどちらともならない中立面が振動板側にあることが、圧電体素子の歪を効率良く撓みに利用するために好ましいため、圧電体と振動板の厚さの組み合わせは、圧電体の硬さと振動板の硬さの関係で算出した。
（工程）
　本開示の細胞剥離方法は以下の工程を有することができる。
配置工程：
　振動体上に音響伝達媒体を設置し、必要に応じて、第二の音響伝達媒体が第一の音響伝達媒体に内包されるよう供給し、さらに培養基材を設置する工程
加圧工程：
　培養基材及び振動体が音響伝達媒体に接するように、培養基材または振動体側から加圧する工程
剥離工程：
　培養基材と振動体が音響伝達媒体に接している状態で振動体を振動させる工程。
　本開示の細胞剥離方法の具体例の一形態を図５に示す。
　まず、配置工程として第一の音響伝達媒体を振動体上に設置する（ステップＳ２１０）。
　その後、第二の音響伝達媒体が第一の音響伝達媒体に内包されるよう供給する（ステップＳ２２０）。
　さらにその後、音響伝達媒体上に培養基材を設置する（ステップＳ２３０）。
　次いで、加圧工程として、培養基材上面より重りなどで加圧する（ステップＳ２４０）。
　剥離工程として、超音波付与条件を設定する（ステップＳ２５０）。
　次いで、超音波付与を開始する（ステップＳ２６０）。
　最後に、剥離された細胞を回収する（ステップＳ２７０）。
　なお、第二の音響伝達媒体が第一の音響伝達媒体に内包されるよう供給すること、すなわち、内包工程は本開示の細胞剥離方法に必須の工程ではなく、供給は別途行われていてもよく、あるいは、あらかじめ、第二の音響伝達媒体が第一の音響伝達媒体に内包された音響伝達媒体を用いてもよい。また、加圧すること、すなわち加圧工程も本開示の細胞剥離方法に必須の工程ではない。
（配置工程）
　配置工程では、振動体の上に音響伝達媒体を設置し、必要に応じて、第二の音響伝達媒体が第一の音響伝達媒体に内包されるよう供給し、培養基材を設置する工程となる。
　音響伝達媒体が第二の音響伝達媒体を供給して循環できる構造の場合、本工程において供給、循環させておき、この後の加圧工程、剥離工程の際に弁を閉じて供給、循環をストップさせる。供給、循環させることで音響伝達媒体中の第二の音響伝達媒体の量を制御でき、培養基材の種類や形状に応じて適切に接触させることができ、さらに循環させることで音響伝達媒体の温度も制御可能となる。
（加圧工程）
　本実施形態における加圧工程は、培養基材と振動体とが近づくように加圧する工程であればよく、培養基材を変位させて振動体に近づけても、振動体を変位させて培養基材に近づけても良く、培養基材と振動体の両方を変位させて両者が近づくようにしても良い。
　加圧工程では、培養基材と振動体が音響伝達媒体に接触した状態で、培養基材と音響伝達媒体とを機械的に整合するように、培養基材側または振動体側から加圧する。
　加圧工程を実行するための加圧手段としては、例えば培養基材の蓋上に重りを設置する、培養基材の容器の蓋上からバネや板バネなどといった荷重方法で均一に上からの荷重をかけて培養基材の蓋上部を上部から動かないよう固定しておき、振動体ごと下から上方向への荷重をかける、などの方法が挙げられる。
　加圧手段については振動の絶縁性を考慮すると重りによる荷重が好ましいが、振動を阻害しない程度に他の荷重方法を選択することができる。加圧手段として例えば定荷重ばねを用いることができる。
　培養基材の蓋上に設置する重りの形状としては、例えば容器内の細胞を観察しやすいように円環形状の重りであることが好ましい。
　加える荷重としては、培養基材の大きさや、付与する振動パターンによって変化するが、例えば３５ｍｍディッシュの場合、１０ｇから３００ｇの間であることが好ましく、６０ｍｍディッシュの場合、１００ｇから６００ｇであることが好ましい。荷重は重りを使用しても良いし、培養容器自体の重量としても良い。
　重りが重過ぎると振動そのものを押さえつけ、阻害することの他に、培養基材自体が撓んでしまうことで振動伝達状態が不均一になり、剥離率低下の要因となる。
（剥離工程）
　剥離工程においては、培養基材または振動体が音響伝達媒体に接している状態で振動体を振動させて、細胞を剥離する。さらに、剥離工程は振動体に超音波帯域の振動を励起させる工程を含むことができる。
　配置工程においては、振動体の振動は開始しておらず、剥離工程で振動体の振動を開始する。例えば、図６に示す装置の例においては、共振周波数の電圧を供給することで、振動体を駆動させて所望の超音波振動モードを発生させる。この場合、剥離工程において、振動体に共振周波数の電圧を供給することで、振動体を駆動させて所望の超音波振動モードを発生させる。なお、上記電圧を付与する電源は図６において不図示である。
　振動パターンは、細胞種や剥離結果に応じて自由に選択することができる。また、剥離工程においてこれらの振動パターンを単一で用いてもよいし、周期的に変化させて入力させてもよい。
　振動波形は培養基材の細胞培養面を一定の振幅、例えば１μｍの振幅で振動することができるものが好ましい。基本的に、低周波から高周波まで、例えば超音波領域では２０ｋＨｚから１５０ｋＨｚまで周波数掃引した際に、共振する振動が検出できるが、低周波側で検出した振動は振幅が大きいが加速度は小さい。これに対し、高周波側で検出した振動は、振幅が小さいが加速度は大きい。このことから、培養基材に対する培養細胞の接着力を弱める力を付与する条件は、細胞の接着力、細胞のサイズや形状によるところが大きい。さらに、剥離液に生じる流動についても振幅、加速度によって異なるため、様々な組み合わせが存在する。また、単純に大きな振幅、大きな加速度では、細胞の生存率を低下の要因となるキャビテーションの発生を促進することから好ましくないことがある。
　振動波形は、円板状の振動板の中心から同心円状、または円周方向に次数を持つようなパターンとして形成される定在波モードと、圧電体を径方向に位相を変えて振動させることで、振動板上に径方向の振動波形を形成する進行波モードとすることができる。それぞれ振動体に共振周波数で電圧を印加することで振動波形が形成でき、その共振周波数、振動波形形状は振動体の形状と硬さ、密度などの材料物性値を用いた構造計算で算出できる。
　また、振動体を連続駆動すると圧電体自身の発熱から共振周波数が低周波側にシフトするため、周波数を固定して駆動し続けると振幅が小さくなる。このため、一定時間振幅させた後、休止時間を設け、自己発熱による温度上昇を抑制する駆動方法か、あるいは、一定の周波数幅で高周波側から低周波側へ掃引を繰り返し、たとえ発熱しても必ず共振周波数を経る駆動方法を用いて駆動させることで十分な振幅を得ることができる。
（振動評価）
　振動板の振動波形はレーザードップラー振動計（グラフテック社ＡＴ７２００）で計測することができる。図６に示す細胞剥離装置を例に、計測手法を説明する。所望の共振周波数、電圧で細胞剥離装置を駆動し、振動板１１の表面をレーザーでＸＹ方向の２次元的にスキャンすると、各点の振動速度が得られ、計算よりＺ方向の振幅を算出することができる。この結果、振動板１１の振動波形を３次元的に構成することができ、駆動時の振動の振幅の大きい腹と振動しない節の位置を動的に把握することができる。
　培養基材２１の細胞培養面の振動計測も同様の構成で計測することができる。振動板１１上に音響伝達媒体１３を設置し、培養基材２１をレーザーが反射するように金属、例えばＡｇを蒸着法で培養基材２１内面に成膜し、培養基材２１と音響伝達媒体１３との間に空気層が入らないようにし、設置することが好ましい。なお、図６では、第一の音響伝達媒体および第二の音響伝達媒体をまとめて音響伝達媒体１３として示している。
　音響伝達媒体１３上に設置した培養基材２１を細胞剥離装置で、駆動させる目的の共振が同心円に振幅する定在波モードの場合、培養基材２１の中央部の振幅を目的の共振周波数付近で掃引し、その時、最も振幅の大きいときの周波数で培養基材２１の細胞培養面全体を２次元的にスキャンすることで、培養基材２１の細胞培養面に発生した振動波形を３次元的に把握することができる。
（細胞）
　本開示の細胞剥離方法は、限定なくあらゆる種類の細胞に適用することができる。例として、チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９細胞、マウス骨格筋筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）、ヒト胎児肺由来正常二倍体線維芽細胞（ＴＩＧ－３細胞）、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト肺胞基底上皮腺癌由来Ａ５４９細胞やヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞、昆虫由来の細胞株、などの種々の培養細胞株、生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞などの初代培養細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌（ＥＣ）細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞などの各種幹細胞、または各組織の前駆細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞などが挙げられる。
　細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。一般的には、培養基材２１内に適切な培地を添加し、そこに１．０×１０１ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２～５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度の細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養する。この際、培養基材２１中の細胞占有面積率が７割～８割程度、いわゆるサブコンフルエントの状態になるまで培養するのが好ましい。
　培養した細胞の培養液（培地）は、細胞剥離工程では細胞剥離液に置換することができる。
　一般的には、剥離液には、タンパク質分解酵素を含有している。タンパク質分解酵素には、例えばトリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、もしくはそれらの組み換え体などが挙げられる。しかし、タンパク質分解酵素は、細胞を溶かしてしまうことから細胞への悪影響が懸念されるものである。これに対し、本開示の細胞剥離手法では、タンパク質分解酵素を用いない、用いても極少量で同様の効果を発揮することから細胞への悪影響を抑制する効果がある。
　細胞剥離液は、細胞の剥離時に用いる液であり、細胞の接着力を低下させる作用があってもよい。
　細胞剥離液のｐＨは中性領域であることが好ましい。中性領域は細胞培養に適しており、細胞の生存率を安定的に高く保つことができるためである。ｐＨは塩酸や水酸化ナトリウム等で適宜調整可能である。また、ｐＨを安定的に保つために各種緩衝液が好適に用いられる。また、剥離液は培地であっても構わない。
　細胞剥離液の粘度はポリマーや糖類の添加などによって適宜調整可能である。
　細胞剥離液として、金属イオンキレート剤（以後、キレート剤と呼ぶことがある）を含む溶液が、特に好ましい。キレート剤を含む細胞剥離液を用いることによって、細胞の接着力を効果的に低下させることが出来るからである。
　キレート剤としては、特に限定はないが、例えば、エチレンジアミン四酢酸（以後、ＥＤＴＡと呼ぶことがある）、エチレンジアミン、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、イミノ二酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミンジコハク酸、エチドロン酸、クエン酸、グルコン酸、ホスホノブタン三酢酸等を挙げることができる。この中でも二価の陽イオンとキレートを形成するキレート剤が好ましく、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋とキレートを形成するキレート剤が特に好ましく、エチレンジアミン四酢酸が最も好ましい。キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸を用いた場合、細胞剥離液のｐＨは７．０以上８．０以下であることが好ましい。これは細胞生存率を高く保つことができる中性領域の中でも高めのｐＨであることにより、エチレンジアミン四酢酸のキレート能を高めることができ、細胞の接着力の低下効率をより高くすることが可能であるためである。なおキレート剤は単独で用いても、或いは２種類以上を複合して用いてもよい。
　キレート剤の含有量としては０．０１ｍＭ以上５．０ｍＭ以下であることが好ましい。
　この範囲であることにより、キレート効果を確実に得ることができ、過剰なキレート剤の存在による活性低下も抑えることができる。
　細胞剥離液として、ポリアルキレングリコール構造を含む親水性ポリマーを含んでいてもよい。ポリアルキレングリコール構造を含む親水性ポリマーの例として、ポリエチレングリコールがあげられる。親水性ポリマーは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定されるピーク分子量Ｍｐが８００以上５００００以下であることが好ましく、１２００以上２００００以下であることがさらに好ましい。これは、ポリマーの細胞への影響が少なく、かつ、ポリマーによる増粘効果が抑制できるためである。
（剥離試験）
　本開示の細胞剥離方法を評価するために剥離試験を行うことができる。剥離試験は例えば次のように行うことができる。
　細胞を培養し、必要に応じ、培養液（培地）を剥離液に交換した基材に対し、配置工程を行い、必要に応じ、保温機内で一定温度、例えば２５℃で保持した状態で振動体を駆動することもできる。駆動時間は細胞剥離に十分な時間で駆動する。駆動後、スポイトで剥離した細胞を回収し、回収できず培養基材２１にまだ貼り付いている細胞をピペッティング法で回収する。
　以下で用いた剥離率は、振動による剥離細胞数とピペッティング法による剥離細胞数との合算数に対する、振動による剥離細胞数の割合を％表記したものである。バラツキはｎ＝１０で剥離率を求め、剥離率の標準偏差を５％未満がＡ、５％以上７．５％未満がＢ、７．５％以上１０％未満がＣ、１０％以上がＤ評価とした。
　細胞剥離後の基材の底面に残った残細胞をバックライトによる散乱光を用いて観察することができる。
（細胞剥離装置）
　本開示の細胞剥離装置は培養基材の培養面に設けられた細胞に振動体が発生した振動を伝達することで、前記細胞を剥離する細胞剥離装置であって、振動体、音響伝達媒体、及び培養基材設置部を、この順に有し、前記振動体の振動が前記音響伝達媒体を経由して前記培養基材に伝達されるように構成され、前記音響伝達媒体は、第一の音響伝達媒体及び第二の音響伝達媒体を含み、前記第一の音響伝達媒体は室温において弾性を有する固体であり、前記第二の音響伝達媒体は前記第一の音響伝達媒体に内包され、室温において液体であるか、または室温で前記第二の音響伝達媒体に周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが、前記第一の音響伝達媒体よりも大きいことを特徴とする細胞剥離装置である。
　本開示の装置の構成を図６に示す。
　図６に示すように、本開示の細胞剥離装置は、振動体１０１、音響伝達媒体１３を含む。培養基材設置部は、使用者が培養容器を置くことが認識できればよく、図６の例では、振動体１０１と上カバー１５、緩衝材１６で形成される開口が、汎用されるディッシュを設置するのに適しているため、この開口が培養基材設置部に相当する。
　図６の細胞剥離装置には、振動発生部である振動体１０１として、圧電体１２、振動板１１を備える例を示す。圧電体１２、振動板１１を備える振動体１０１は、自身が伸縮する圧電体１２と、接着された振動板１１との硬さの組み合わせによって振動を増幅させた屈曲振動を発生する。この例では振動体１０１の構造要因による共振を利用するもので、共振周波数で大きな振動を得ることができる。振動体は超音波振動子などの振動子を含むことができる。なお、圧電体１２に不図示の電源を用いて電圧を印加することで、上記伸縮をさせる。
　図６では、代表的な振動体１０１として、円環型振動子を記しているが、大振幅が得られるランジュバン振動子、矩形型振動子であっても構わない。
　共振によって振動板に形成した振動を、細胞を培養させた培養基材２１に効率的に伝達するために、音響伝達媒体１３を振動板１１と培養基材２１の間に介在させる。直接、振動板１１に培養基材２１を設置すると、接触部が点接触となり、鳴き、発熱の発生など振動以外のエネルギーとして消費されるため効率悪化の要因となる。音響伝達媒体１３の設置は、基本的には培養基材２１に付着した細胞の、剥離する面積を十分に満たす面積で設置されていることが好ましい。
　振動体１０１を固定するために、図６の上カバー１５、下カバー１７、緩衝材１６、ボルト１８によって、振動体１０１の端部を挟み込む構造をとるが、端部の挟み込む圧力は振動板に発生する振動を阻害しない程度に締め付ける。
　培養基材の上部には振動体の下部には加圧工程用の加圧手段である重り１４を備えた例を示す。重り１４が上下することで加圧、除圧が可能となる。
　共振周波数の電圧を供給することで、振動体を駆動させて所望の超音波振動モードを発生させる。
　振動体の駆動には、共振周波数の電圧を供給する交流電源を用いて、培養基材の細胞培養面に所望の振動波形が形成できる振動モードの周波数で、かつ、所望の振幅が得られる電圧を印可することで細胞剥離装置を駆動させることができる。この時、振動体に備えるセンサ相であるＳ相の電圧をオシロスコープで計測すると、振動体自身が歪むことで発生させた電圧を直接モニタすることができ、振動体の振動状態を確認しながら駆動することができる。また、細胞剥離工程中の温度を計測できる熱電対を振動に影響ない箇所に設置することで、モニタしながら駆動させることができる。温度測定には赤外線温度計測器であっても構わない。
　本開示の細胞剥離方法に用いられる音響伝達媒体の例を図１Ａから図１Ｃ、図２Ａから図２Ｃ、図３Ａから図３Ｃ、図４Ａから図４Ｃ、及び図９Ａから図９Ｄに示す。
（第一例）
　音響伝達媒体の第一例の構成図を図１Ａから図１Ｃ、及び図９Ａに示す。
　音響伝達媒体の第一例は、第二の音響伝達媒体が、第一の音響伝達媒体に内包されている。
　図１Ａは、底面が平面の培養基材及び振動体と接している構成を示す。
　図１Ｂは、底面が反った形状の培養基材及び振動体と接している構成を示す。
　図１Ｃは、さらに、培養基材または振動板から加圧することで培養基材の底面の形状などに音響伝達媒体が追従しているところを示す。
　図９Ａは第一例の音響伝達媒体の上面図と断面図を例示する。
（第二例）
　音響伝達媒体の第二例の構成図を図２Ａから図２Ｃ、及び図９Ｂに示す。
　音響伝達媒体の第二例は、第二の音響伝達媒体が、第一の音響伝達媒体に内包され、かつ、第一の音響伝達媒体が第二の音響伝達媒体と対向する方向に凸となる突起部を有する。
　図２Ａにおいては、第一の音響伝達媒体側の上面側に突起部を有する音響伝達媒体が、底面が平面の培養基材及び振動体と接している構成を示す。
　図２Ｂにおいては、第一の音響伝達媒体側の上面側に突起部を有する音響伝達媒体が、底面が反った形状の培養基材及び振動体と接している構成を示す。
　図２Ｃは、さらに、培養基材または振動板から加圧することで培養基材の底面の形状などに本開示の音響伝達媒体が追従しているところを示す。図示するように、突起部は加圧された状態で対面の第一の音響伝達媒体に接する構造となることが好ましい。
　図９Ｂは第二例の音響伝達媒体の上面図と断面図を例示する。図中の２０７は突起径を、２０８は突起高さを示す。
（第三例）
　音響伝達媒体の第三例の構成図を図３Ａから図３Ｃ、及び図９Ｃに示す。
　音響伝達媒体の第三例は、第二の音響伝達媒体が、第一の音響伝達媒体に内包され、かつ、第一の音響伝達媒体は前記第二の音響伝達媒体を横切ってつながっている柱部を有する。
　図３Ａにおいては、第一の音響伝達媒体が第二の音響伝達媒体を横切ってつながっている柱部を有する音響伝達媒体が、底面が平面の培養基材及び振動体と接している構成を示す。
　図３Ｂにおいては、第一の音響伝達媒体が第二の音響伝達媒体を横切ってつながっている柱部を有する音響伝達媒体が、底面が反った形状の培養基材及び振動体と接している構成を示す。
　図３Ｃは、さらに、培養基材または振動板から加圧することで培養基材の底面の形状などに本開示の音響伝達媒体が追従しているところを示す。
　図９Ｃは第三例の音響伝達媒体の上面図と断面図を例示する。図中の２０９は柱径を示す。
（第四例）
　音響伝達媒体の第四例の構成図を図４Ａから図４Ｃ、及び図９Ｄに示す。
　音響伝達媒体の第四例は、第二の音響伝達媒体を第一の音響伝達媒体に内包するための第二の音響伝達媒体供給管１３３を有する。
　図４Ａにおいては、第二の音響伝達媒体供給管１３３を有する音響伝達媒体が、底面が平面の培養基材及び振動体と接している構成を示す。
　図４Ｂにおいては、第二の音響伝達媒体供給管１３３を有する音響伝達媒体が、底面が反った形状の培養基材及び振動体と接している構成を示す。
　図４Ｃは、さらに、培養基材または振動板から加圧することで培養基材の底面の形状などに本開示の音響伝達媒体が追従しているところを示す。この状態においては、第二の音響伝達媒体供給管１３３の弁が閉じている状態が好ましい。
　図９Ｄは第四例の音響伝達媒体の上面図と断面図を例示する。
（実施例１）
　以下の実施例では、図１Ａの概略図で示す音響伝達媒体の第一の例の構成を用いた例を示す。培養基材には、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製Ｎｕｎｃ（登録商標）Φ３５ｍｍディッシュを用いた。細胞剥離装置の振動板は、外径７０ｍｍ、厚さ４ｍｍのガラスを用いた。圧電体の材料組成はＰＺＴ、外径は振動板と同じ７０ｍｍ、内径は５７ｍｍ、厚さは中立面が振動板側にあることを考慮し、２ｍｍとした。図６のように細胞剥離装置を組立て、振動板上には、音響伝達媒体は、図９Ａの概略図で示す、高さ（２０５）＝２．０ｍｍ、上面高さ（２０４）＝１．０ｍｍ、下面高さ（２０６）＝１．０ｍｍ、上面厚み（２０１）＝０．２ｍｍ、下面厚み（２０２）＝０．２直径（２０３）＝３０ｍｍの形状で中に水を封止したものを使用した。
　音響伝達媒体の作製方法は音響伝達媒体の上面形状、下面形状に相当する金型を用意し、そこにシリコーンゴム原料（製品名：ＫＥ－１９５０－１０；信越化学製）を調製して流し込み、加熱硬化させて上下面のシリコーンゴムを得、これを第一の音響伝達媒体とした。次いで、両面のゴムを接着剤で貼り合わせ、中に第二の音響伝達媒体として水を注入口より注入し、注入口を接着剤で封止した。余分な注入口を切除して音響伝達媒体を得た。
　得られた音響伝達媒体を振動板と中心が合うように設置し、次いで、細胞を培養した培養基材のサーモフィッシャーサイエンティフィック社製Ｎｕｎｃ（登録商標）Φ３５ｍｍディッシュの中心を振動板の中心に合わせてゆっくりと音響伝達媒体上に設置した。このときの構成を表す概略図は図１Ｂであった。その後、培養基材の蓋上に１００ｇの重りを設置して加圧した。加圧後の音響伝達媒体の構成を表す概略図は図１Ｃであった。
　細胞の培養は以下のように行った。ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞をサーモフィッシャーサイエンティフィック社製Ｎｕｎｃ（登録商標）Φ３５ｍｍディッシュに１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＨａｍ’ｓ　Ｆ１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。
（細胞の剥離）
　ディッシュ内の培地を除去し、ＰＢＳ（－）で細胞を洗浄後、ＰＢＳ（－）剥離液に３分間浸漬させた。
　その後、培養基材を環境温度２５℃下で細胞剥離装置に設置し、環境温度２５℃において定在波モードで２分間周波数掃引振動（周波数２２－２７ｋＨｚ、周波数掃引周期１ｓ、電圧９０Ｖ）で細胞の剥離を行った。
　剥離した細胞を回収した後、超音波剥離後のディッシュに対して、セルスクレーパーを用いて超音波で剥離できなかった細胞を剥離した。剥離した細胞の数を血球計算盤測定した。超音波で剥離した細胞数とその後セルスクレーパーで剥離した細胞数を合わせて総剥離細胞数とし、総剥離細胞数に対する超音波剥離細胞数の割合を剥離率と定義し、算出した。バラツキについてはｎ＝１０で剥離率を求め、剥離率の標準偏差を５％未満がＡ、５％以上７．５％未満がＢ、７．５％以上１０％未満がＣ、１０％以上がＤとして評価した。
　評価結果は、剥離率は９５．４％、バラツキはＡ評価であった。
（実施例２）
　実施例２では第二の音響伝達媒体の種類を以下のように変更した以外は、実施例１と同様の条件で行った。すなわち、本実施例では、第二の音響伝達媒体として超音波ジェル（超音波検査用プロゼリー　ノーマルタイプ；ジェクス社製）を使用した。
　評価結果は、剥離率は９６．１％、バラツキはＡ評価であった。
（実施例３）
　実施例３では第二の音響伝達媒体の種類を以下のように変更した以外は、実施例１と同様の条件で行った。すなわち、第二の音響伝達媒体としてＰＶＡゲルを使用した。
　ＰＶＡゲルは以下の方法で作製した。デンカポバール（登録商標）Ｋ－２４Ｅ（デンカ株式会社製）を３．７質量％となるよう秤量し、純水を加えて調製し、合計８０ｍＬとした。恒温槽で熱を加えながら攪拌し、ＰＶＡを完全に溶解させ、ＰＶＡ水溶液を得た。次いで、ホウ砂（特級四ほう酸ナトリウム（１０水和物）；キシダ化学製）を秤量し、純水を加えて１．０質量％となるように調製し、合計１６ｍＬとした。ＰＶＡ水溶液を攪拌しながら、徐々に前記ホウ砂水溶液を滴下し、均一になるまで攪拌することでＰＶＡゲルを得た。
　評価結果は、剥離率は９３．０％、バラツキはＡ評価であった。
（実施例４）
　実施例４では第一の音響伝達媒体の形状を以下のように変更した以外は、実施例１と同様の条件で行った。すなわち、音響伝達媒体として、図９Ａの概略図で示す、高さ（２０５）＝２．０ｍｍ、上面高さ（２０４）＝１．０ｍｍ、下面高さ（２０６）＝１．０ｍｍ、上面厚み（２０１）＝０．２ｍｍ、下面厚み（２０２）＝０．４ｍｍ、直径（２０３）＝３０ｍｍの形状のものを使用した。
　評価結果は、剥離率は９４．６％、バラツキはＡ評価であった。
（比較例１）
　比較例１では音響伝達媒体として、シリコーンゴムを使用した以外は実施例１と同様の条件で検討を行った。
　音響伝達媒体として、厚さ２．０ｍｍ、硬度３０°のシリコーンゴムを使用した。
　評価結果は、剥離率は８０．１％、バラツキはＤ評価であった。
（まとめ）
　上記実施例、及び比較例の各構成をまとめた結果を表１に示す。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０２３年７月２０日提出の日本国特許出願特願２０２３－１１８５８４を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。
１１：振動板
１２：圧電体
１３：音響伝達媒体
１３１：　第一の音響伝達媒体
１３２：　第二の音響伝達媒体
１４：重り
１５：上カバー
１６：緩衝材
１７：下カバー
１８：ボルト
２１：培養基材
２２：培養基材上蓋
１０１：振動体

Claims (15)

  1. 　培養基材の培養面に付着した細胞を前記培養面から剥離する細胞剥離方法であって、
    　前記培養基材と振動体との間に音響伝達媒体を配置した状態で、前記振動体を振動させて、前記培養面から前記細胞を剥離する細胞剥離方法、
    　ただし、前記音響伝達媒体は、第一の音響伝達媒体及び第二の音響伝達媒体を含み、
    　前記第一の音響伝達媒体は室温において弾性を有する固体であり、
    　前記第二の音響伝達媒体は前記第一の音響伝達媒体に内包され、室温において液体であるか、または室温で前記第二の音響伝達媒体に周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが、前記第一の音響伝達媒体のｔａｎδよりも大きいことを特徴とする、細胞剥離方法。
  2. 　前記第一の音響伝達媒体は前記第二の音響伝達媒体と対向する方向に凸となる突起部を少なくとも１つ有することを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  3. 　前記第一の音響伝達媒体は前記第二の音響伝達媒体を横切ってつながっている柱部を少なくとも１つ有することを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  4. 　前記第一の音響伝達媒体は、シリコーンゴム、天然ゴム、ウレタンゲル、及びゲル材料からなる群から選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  5. 　前記第二の音響伝達媒体は、室温で、周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが１．０以上の固体であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  6. 　前記第二の音響伝達媒体は、室温で、液体であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  7. 　前記第二の音響伝達媒体は、液体、ポリマー溶液、ゲル材料からなる群から選択される少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  8. 　前記第一の音響伝達媒体がシリコーンゴムを含み、前記第二の音響伝達媒体が水を含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  9. 　前記音響伝達媒体の、前記振動体と対向する面は、前記音響伝達媒体の、前記培養基材と対向する面よりもヤング率が高いことを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  10. 　前記第二の音響伝達媒体を前記第一の音響伝達媒体に内包させる内包工程を含むことを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  11. 　前記振動体に超音波帯域の振動を発生させることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  12. 　前記培養基材と前記振動体を近づけるように加圧する加圧工程を有することを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
  13. 　培養基材の培養面に設けられた細胞に振動体が発生した振動を伝達することで、前記細胞を剥離する細胞剥離装置であって、
    　振動体、
    　音響伝達媒体、及び
    　培養基材設置部を、この順に有し、
    　前記振動体の振動が前記音響伝達媒体を経由して前記培養基材に伝達されるように構成され、
    　前記音響伝達媒体は、第一の音響伝達媒体及び第二の音響伝達媒体を含み、
    　前記第一の音響伝達媒体は室温において弾性を有する固体であり、
    　前記第二の音響伝達媒体は前記第一の音響伝達媒体に内包され、室温において液体であるか、または室温で前記第二の音響伝達媒体に周波数０．１Ｈｚの振動が付与された場合におけるｔａｎδが、前記第一の音響伝達媒体のｔａｎδよりも大きいことを特徴とする細胞剥離装置。
  14. 　前記振動体は超音波振動子を含むことを特徴とする請求項１３に記載の細胞剥離装置。
  15. 　前記培養基材と前記振動体を近づけるように加圧する加圧手段を有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の細胞剥離装置。
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