WO2025014332A1 - 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물, 이의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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WO2025014332A1
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이광호
송진숙
김성환
안선주
채종학
두기랄라크리시나바부
이유진
지상희
장지윤
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Korea Research Institute of Chemical Technology KRICT
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Korea Research Institute of Chemical Technology KRICT
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the present invention relates to a novel triazole compound having a ring structure, a method for preparing the same, and a use thereof.
  • Apoptosis signal-regulating kinase 1 is a member of the c-Jun N-terminal protein kinase (JNK) and stress-responsive mitogen-activated protein kinase (MAP3K) family, also known as MAP3K5.
  • JNK c-Jun N-terminal protein kinase
  • MAP3K stress-responsive mitogen-activated protein kinase
  • ASK1 is a central regulator of apoptosis and is known to participate in several stress-induced and receptor-mediated cell death pathways induced by various forms of stress, including oxidative stress, reactive oxygen species (ROS), endoplasmic reticulum (ER) stress, and unfolded protein response (UPR), and mitochondrial stress.
  • ROS reactive oxygen species
  • ER endoplasmic reticulum
  • URR unfolded protein response
  • ASK1 plays an essential role in inflammatory and innate immune responses, including cytokine responses and cell differentiation, as well as in the apoptotic pathway. Phosphorylation of ASK1 protein can induce apoptosis or other cellular responses depending on the cell type.
  • ASK1 activation and signaling have been reported to play an important role in a wide range of diseases, including neurodegenerative, cardiovascular, inflammatory, autoimmune, and metabolic diseases.
  • ASK1 is known to be involved in mediating organ damage following ischemia and reperfusion in the heart, brain, and kidney (Zhang et al. J Clin Invest.2003; 111(12): 1933-1943.).
  • Parkinson's disease is a neurodegenerative disease that mainly occurs in the elderly. Parkinson's disease is caused by the death of dopaminergic neurons in the substantia nigra, which is located in the middle of the brain, causing behavioral disorders.
  • Lewy bodies which are formed by the deposition of alpha-synuclein proteins in various parts of the brain and peripheral nerves, are the main neuropathological characteristic of Parkinson's disease patients. Representative symptoms of Parkinson's disease include bradykinesia, which is abnormally slowed body movements, tremor, which causes hands and feet to tremble, and rigidity, which causes muscles and joints to stiffen, and non-motor symptoms include mental disorders and autonomic dysfunction.
  • ASK1 inhibition as a treatment for Parkinson's disease is being raised from various angles.
  • PFF alpha-synuclein pre-formed fibrils
  • p-alpha-synuclein phosphorylated alpha-synuclein
  • neuroinflammation was also alleviated, which led to behavioral improvement.
  • p-ASK1 activation was observed to be more than four times higher in neurons in the substantia nigra of the cerebral cortex of Parkinson's disease patients compared to normal people.
  • the inventors of the present invention completed the present invention by confirming, in the course of studying ASK1 derivatives, that a novel triazole compound has excellent ASK1 inhibitory activity while protecting nerve cells, easily permeates cell membranes, and is not an efflux transporter.
  • One object of the present invention is to provide a trihazol compound having a novel ring structure.
  • One object of the present invention is to provide a method for producing a novel triazole compound having a ring structure.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing a novel triazole compound having a ring structure as an active ingredient.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating ASK1-related diseases, which contains a novel triazole compound having a ring structure as an active ingredient.
  • One object of the present invention is to provide a method for preventing or treating an ASK1-related disease, which comprises administering to a subject a triazole compound having a novel ring structure.
  • One object of the present invention is to provide a novel cyclic structure triazole compound for use in the prevention or treatment of ASK1-related diseases.
  • One object of the present invention is to provide a use of a novel triazole compound having a ring structure for preparing a medicament for the prevention or treatment of ASK1-related diseases.
  • a compound represented by the following chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is provided:
  • Each of the above substituted phenyl and substituted C 3-8 cycloalkenyl is independently substituted with C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy or halogen;
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently H, C 1-6 alkyl, halogen, C 3-6 cycloalkyl or haloC 1-6 alkyl.
  • a method for producing a compound represented by chemical formula 1 of claim 1 comprises the step of producing a compound represented by chemical formula 1 by reacting a compound represented by chemical formula 2 with a compound represented by chemical formula 3, as shown in the following reaction scheme 1:
  • R 1 , R 2 , and R 3 are as defined in the chemical formula 1.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating an ASK1-related disease which contains a compound represented by the chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a method for preventing or treating an ASK1-related disease comprising a step of administering to a subject a pharmaceutical composition containing a compound represented by the chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition containing a compound represented by the above chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in the prevention or treatment of an ASK1-related disease.
  • a pharmaceutical composition containing a compound represented by the above chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preparing a medicament for preventing or treating an ASK1-related disease.
  • the novel triazole compound having a ring structure of the present invention exhibits a high inhibitory effect on ASK1 and suppresses the death of nerve cells, and therefore can be used for the prevention or treatment of ASK1-related diseases including neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases, and autoimmune diseases.
  • ASK1-related diseases including neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases, and autoimmune diseases.
  • the compound of the present invention can effectively prevent or treat Parkinson's disease by improving behavioral defects or errors and neurological disorder symptoms due to Parkinson's disease, significantly improving dopaminergic neurodegeneration, and reducing microglia.
  • the compound of the present invention can effectively prevent or treat amyotrophic lateral sclerosis by improving neurological disorders or disease symptoms and decreased grip strength due to amyotrophic lateral sclerosis and increasing the survival rate.
  • the compound of the present invention can effectively prevent or treat fibromyalgia by improving pain due to fibromyalgia.
  • the compound of the present invention can effectively prevent or treat nonalcoholic steatohepatitis by improving liver fibrosis due to nonalcoholic steatohepatitis.
  • Figure 1 shows the cell protection effect (% of control) by evaluating the neuroprotection assay.
  • Figure 2 shows the cell viability (%) and TNF- ⁇ ELISA results of LPS-treated cells.
  • Figure 3 is a schematic diagram of an experiment to confirm the efficacy of the drug in an MPTP-induced PD mouse model.
  • Figure 4 is a graph showing the results of behavioral defect evaluation (pole test) by group according to drug administration in the MPTP-induced PD mouse model.
  • a, b, and c represent the rotation time at the top, the pole descent time, and the total time, respectively.
  • Figure 5a is a graph showing the degree of TH staining in the striatum by group according to drug treatment in the MPTP-induced PD mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 5b is an image showing the degree of TH staining in the striatum by group according to drug treatment in the MPTP-induced PD mouse model.
  • Figure 6a is a graph showing the degree of TH staining in the substantia nigra by group according to drug treatment in the MPTP-induced PD mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 6b is an image showing the degree of TH staining in the substantia nigra by group according to drug treatment in the MPTP-induced PD mouse model.
  • Figure 7 is a graph showing the dopamine concentrations in the striatum and substantia nigra of the MPTP-induced PD mouse model according to drug treatment by group. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 8 is a schematic diagram of an experiment to confirm the efficacy of a drug in an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model.
  • Figure 9 is a graph showing the change in body weight by group according to drug treatment in an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 10 is a graph of the neurological behavior scores by group according to drug treatment in an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 11 is a graph showing the results of gait error evaluation by group according to drug treatment in an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 12a is a graph showing the results of the evaluation of the efficacy of improving dopaminergic neurodegeneration by group according to drug treatment in an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 12b is an immunofluorescence analysis image showing the results of evaluating the efficacy of improving dopaminergic neurodegeneration by group according to drug treatment in an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model.
  • Figure 13a is a graph showing the results of evaluating the efficacy of reducing microglial cells by group according to drug treatment in an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 13b is an immunofluorescence analysis image showing the results of evaluating the efficacy of drug treatment on reducing microglial cells by group in an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model.
  • Figure 14 is a schematic diagram of an experiment to confirm the efficacy of a drug in a SOD1 G93A transgenic ALS mouse model.
  • Figure 15 is a graph of body weight changes by group according to drug treatment in the SOD1 G93A transgenic ALS mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001.
  • Figure 16 is a graph of the neurological scores by group according to drug treatment in the SOD1 G93A transgenic ALS animal model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 17 is a graph of the changes in disease scores by group according to drug treatment in the SOD1 G93A transgenic ALS mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 18 is a graph of changes in grip strength by group according to drug treatment in the SOD1 G93A transgenic ALS mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 19 is a graph of the survival rate by group according to drug treatment in the SOD1 G93A transgenic ALS mouse model.
  • Figure 20 is a schematic diagram of an experiment to confirm the efficacy of a drug in a reserpine-induced fibromyalgia rat model.
  • Figure 21 is a graph showing the results of the evaluation of pain improvement efficacy according to drug treatment in a reserpine-induced fibromyalgia rat model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 22 is a schematic diagram of an experiment to confirm the efficacy of a drug in a CDAHFD-induced nonalcoholic steatohepatitis mouse model.
  • Figure 23a is a graph of the ratio of areas of Picrosirius red staining in the liver according to drug treatment in a CDAHFD-induced nonalcoholic steatohepatitis mouse model. Significance level compared to G1 - *: p ⁇ 0.05, **: p ⁇ 0.01, ***: p ⁇ 0.001 / Significance level compared to G2 - #: p ⁇ 0.05, ##: p ⁇ 0.01, ###: p ⁇ 0.001.
  • Figure 23b is an image of the Picrosirius red staining area ratio in the liver according to drug treatment in a CDAHFD-induced nonalcoholic steatohepatitis mouse model.
  • One aspect of the present invention provides a compound represented by the following chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Each of the above substituted phenyl and substituted C 3-8 cycloalkenyl is independently substituted with C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy or halogen;
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently H, C 1-6 alkyl, halogen, C 3-6 cycloalkyl or haloC 1-6 alkyl.
  • Each of the above substituted phenyl and substituted C 3-8 cycloalkenyl is independently substituted with C 1-3 alkyl, C 1-3 alkoxy or halogen;
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently H, C 1-3 alkyl, halogen, C 3-6 cycloalkyl or haloC 1-3 alkyl.
  • R 1 is C 3-6 cycloalkyl
  • R 2 is C 1-3 alkyl
  • R 3 is a halogen
  • R 1 is cyclopropyl
  • R 2 is methyl
  • R 3 is fluoro
  • cycloalkenyl as used herein includes any stable cyclic hydrocarbon group, which hydrocarbon group contains one or more unsaturated carbon-carbon double bonds at any position of the ring, which may be mono- or polysubstituted, and which may be monovalent, divalent, or polyvalent. In the present specification, it is divalent fused to triazole.
  • Embodiments containing one double bond of such cycloalkenyl groups may include cyclopentenyl groups, cyclohexenyl groups, cycloheptenyl groups, and cyclooctenyl groups.
  • alkyl represents a straight-chain or branched-chain fully saturated hydrocarbon group, and examples of alkyl include methyl (Me), ethyl (Et), propyl (e.g., n-propyl and isopropyl groups, butyl (e.g., n-butyl, isobutyl, s-butyl, t-butyl), pentyl (e.g., n-pentyl, isopentyl group, neopentyl group), and the like.
  • Me methyl
  • Et ethyl
  • propyl e.g., n-propyl and isopropyl groups
  • butyl e.g., n-butyl, isobutyl, s-butyl, t-butyl
  • pentyl e.g., n-pentyl, isopentyl group, neopentyl group
  • haloalkyl refers to alkyl substituted with one or more halogens, including both monosubstituted (e.g., -CH 2 F) and polysubstituted (e.g., -CF 3 ).
  • Examples of compounds represented by the chemical formula 1 according to the present invention include the following compounds:
  • One aspect of the present invention provides a method for producing a compound represented by Chemical Formula 1, comprising the step of reacting a compound represented by Chemical Formula 2 with a compound represented by Chemical Formula 3 to produce a compound represented by Chemical Formula 1, as shown in the following Reaction Scheme 1:
  • R 1 , R 2 , and R 3 are as defined in the chemical formula 1.
  • the above reaction can be performed under organic solvent conditions such as DMF (dimethylformamide) and NMP (N-methyl-2-pyrrolidone), and at this time, a catalyst material such as DMAP (4-dimethylaminopyridine) can be used.
  • organic solvent conditions such as DMF (dimethylformamide) and NMP (N-methyl-2-pyrrolidone)
  • DMAP dimethylaminopyridine
  • coupling agents such as HATU (hexafluorophosphate azabenzotriazole tetramethyluronium) and T 3 P (propanephosphonic anhydride) can be used.
  • the above reaction can be carried out at 0°C to 50°C.
  • the reaction can be carried out at 0°C to 40°C, 0°C to 30°C, 10°C to 50°C, 10°C to 40°C, 10°C to 30°C, 20°C to 50°C, 20°C to 40°C or 20°C to 30°C.
  • the above reaction can be carried out for 0.1 hour to 48 hours.
  • the above reaction can be carried out for 0.1 hour to 36 hours, 0.1 hour to 24 hours, 0.5 hour to 48 hours, 0.5 hour to 36 hours, 0.5 hour to 24 hours, 1 hour to 48 hours, 1 hour to 36 hours, 1 hour to 24 hours, 2 hours to 48 hours, 2 hours to 36 hours, 2 hours to 24 hours, 3 hours to 48 hours, 3 hours to 36 hours, 3 hours to 24 hours, 4 hours to 48 hours, 4 hours to 36 hours, 4 hours to 24 hours, 6 hours to 48 hours, 6 hours to 36 hours or 6 hours to 24 hours.
  • the compound represented by the chemical formula 1 of the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and as the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful.
  • the acid addition salt is obtained from inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid, phosphorous acid, and the like; non-toxic organic acids such as aliphatic mono- and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanedioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids; and organic acids such as trifluoroacetic acid, acetate, benzoic acid, citric acid, lactic acid, maleic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, 4-toluenesulfonic acid, tartaric acid, fumaric acid, and the like.
  • these pharmaceutically non-toxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, iodide, fluoride, acetate, propionate, decanoate, caprylate, acrylate, formate, isobutyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, suberate, sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitrobenzoate, hydroxybenzoate, methoxybenzoate, Includes phthalate, terephthalate, benzenesulfonate, toluenesulf
  • the acid addition salt according to the present invention can be prepared by a conventional method, for example, by dissolving the derivative of chemical formula 1 in an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, methylene chloride, acetonitrile, etc., adding an organic acid or inorganic acid, filtering and drying the resulting precipitate, or by distilling the solvent and an excess acid under reduced pressure, drying, and crystallizing in the presence of an organic solvent.
  • an organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, methylene chloride, acetonitrile, etc.
  • a pharmaceutically acceptable metal salt can be prepared using a base.
  • An alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of an alkali metal hydroxide or an alkaline earth metal hydroxide solution, filtering off the undissolved compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is pharmaceutically suitable to prepare a sodium, potassium or calcium salt as a metal salt.
  • the corresponding salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable anion salt (e.g., silver nitrate).
  • the present invention includes not only the compound represented by the chemical formula 1 and a pharmaceutically acceptable salt thereof, but also solvates, stereoisomers, hydrates, etc. that can be prepared therefrom.
  • hydrate as used herein means a compound of the present invention or a salt thereof, which contains a stoichiometric or non-stoichiometric amount of water bound by non-covalent intermolecular forces.
  • the hydrate of the compound represented by the chemical formula 1 of the present invention may contain a stoichiometric or non-stoichiometric amount of water bound by non-covalent intermolecular forces.
  • the hydrate may contain at least 1 equivalent, preferably, 1 to 5 equivalents of water.
  • Such a hydrate can be prepared by crystallizing a compound represented by the chemical formula 1 of the present invention, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, from water or a solvent containing water.
  • solvate means a compound of the present invention or a salt thereof which contains a stoichiometric or non-stoichiometric amount of a solvent bound by non-covalent intermolecular forces.
  • Preferred solvents therefor include those which are volatile, non-toxic, and/or suitable for administration to humans.
  • isomers as used herein means a compound of the present invention or a salt thereof having the same chemical formula or molecular formula but structurally or sterically different.
  • Such isomers include structural isomers including tautomers, and stereoisomers, and stereoisomers include optical isomers (enatiomers) and diastereomers that appear by having one or more asymmetric carbon centers, as well as geometric isomers (trans, cis). All of these isomers and mixtures thereof are also included in the scope of the present invention.
  • the compound, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof can inhibit ASK1.
  • the compound, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof can inhibit neuronal cell death.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an ASK1-related disease, comprising a compound represented by the chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-mentioned active ingredient.
  • the above ASK1-related diseases include neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases, autoimmune diseases, and liver diseases.
  • the above neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, hippocampal sclerosis, frontotemporal dementia (FTD), frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Huntington's disease, corticobasal degeneration, amyotrophic lateral sclerosis, spinal muscular atrophy, motor neuron disease, inclusion body myositis, Parkinson's disease, Lewy body dementia, Lewy body disease, multiple system atrophy, progressive supranuclear palsy, Pick's disease, prion disease, traumatic brain injury, ischemic and hemorrhagic stroke, cerebral ischemia, hypoxia, and glutamate neurotoxicity.
  • FDD frontotemporal dementia
  • FTLD frontotemporal lobar degeneration
  • Huntington's disease corticobasal degeneration
  • corticobasal degeneration amyotrophic lateral sclerosis
  • spinal muscular atrophy motor neuron disease
  • inclusion body myositis Parkinson's disease
  • Lewy body dementia Lewy body disease
  • multiple system atrophy
  • cardiovascular diseases include heart failure, ischemia, recurrent ischemia, myocardial infarction, arrhythmia, acute coronary syndrome, diabetes, atherosclerosis and intermittent claudication.
  • autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, fibromyalgia, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, diabetes, systemic sclerosis, Graves' disease, Guillain-Barré syndrome, myasthenia gravis, psoriasis, Crohn's disease, ulcerative colitis, optic neuritis, and Sjogren's syndrome.
  • liver diseases include nonalcoholic fatty liver disease (NASH), alcoholic fatty liver disease, liver fibrosis, liver cancer, hepatotoxicity, cholestasis, cirrhosis, hepatic ischemia, liver abscess, hepatic coma, and hepatic atrophy.
  • NASH nonalcoholic fatty liver disease
  • alcoholic fatty liver disease liver fibrosis
  • liver cancer hepatotoxicity
  • cholestasis cirrhosis
  • hepatic ischemia hepatic ischemia
  • liver abscess liver abscess
  • hepatic coma hepatic atrophy
  • the compound represented by the above chemical formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be administered in various oral and parenteral dosage forms during clinical administration.
  • it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations are prepared by mixing one or more compounds with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups, and in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, flavoring agents, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, and emulsions.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • a pharmaceutical composition containing the compound represented by the above chemical formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient can be administered parenterally, and parenteral administration is by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.
  • the compound represented by the above chemical formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is mixed with a stabilizer or buffer in water to prepare a solution or suspension, which can be prepared in an ampoule or vial unit dosage form.
  • the composition may be sterilized and/or contain auxiliary agents such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifying promoters, salts for regulating osmotic pressure and/or buffers, and other therapeutically useful substances, and may be formulated according to conventional methods such as mixing, granulating, or coating.
  • Oral dosage forms include, for example, tablets, pills, hard/soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, elixirs, and troches, and these dosage forms contain, in addition to the active ingredient, diluents (for example, lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose, and/or glycine), lubricants (for example, silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts, and/or polyethylene glycol).
  • diluents for example, lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose, and/or glycine
  • lubricants for example, silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts, and/or polyethylene glycol.
  • Tablets may contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and/or polyvinylpyrrolidine, and, if desired, disintegrating agents or effervescent mixtures such as starch, agar, alginic acid or its sodium salt, and/or absorbents, coloring agents, flavoring agents, and sweetening agents.
  • binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and/or polyvinylpyrrolidine
  • disintegrating agents or effervescent mixtures such as starch, agar, alginic acid or its sodium salt, and/or absorbents, coloring agents, flavoring agents, and sweetening agents.
  • the compound represented by the above chemical formula 1 of the present invention, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutical composition comprising the same, is administered in a “pharmaceutically effective amount.”
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or improvement, and the effective dosage level can be determined according to factors including the type and severity of the individual, age, sex, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, treatment period, concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • an effective amount of 0.001 mg/kg to 1000 mg/kg, 0.01 mg/kg to 100 mg/kg, or 0.1 to 20 mg/kg, or 0.1 to 500 mg/kg is included.
  • the amount of the compound or pharmaceutical composition of the present invention can be selected and implemented within an appropriate range by a person skilled in the art.
  • One aspect of the present invention provides a health functional food for preventing or improving ASK1-related diseases, containing a compound represented by the chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an effective ingredient.
  • the compound represented by chemical formula 1 according to the present invention exhibits high ASK1 inhibitory activity, and thus can be manufactured as a pharmaceutical composition for a health functional food composition for preventing or improving ASK1-related diseases, or can be added to health functional food supplements such as foods and beverages.
  • the compound represented by the above chemical formula 1 according to the present invention can be added to food as it is or used together with other food or food ingredients, and can be used appropriately according to a conventional method.
  • the amount of the effective ingredient can be appropriately determined depending on its purpose of use (prevention or improvement).
  • the amount of the compound in the health food can be added in an amount of 0.1 to 90 parts by weight of the total food weight.
  • the amount can be below the above range, and since there is no problem in terms of safety, the effective ingredient can also be used in an amount above the above range.
  • One aspect of the present invention provides a method for preventing or treating an ASK1-related disease, comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition containing a compound represented by the chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the above administration may be oral or parenteral.
  • the active ingredient may be administered in an amount of 0.01 to 1000 mg, more specifically 0.1 to 300 mg per kg of body weight per day, and in the case of parenteral administration, the active ingredient may be administered in an amount of 0.01 to 100 mg, more specifically 0.1 to 50 mg per kg of body weight per day, and may be administered once or in several divided doses.
  • the dosage for a specific individual or patient should be determined in light of various related factors such as the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, and severity of the disease, and may be appropriately increased or decreased by a specialist.
  • the term "subject” means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, a mammal such as a human or non-human primate, mouse, dog, cat, horse, and cow.
  • One aspect of the present invention provides a use of a compound represented by Chemical Formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in the prevention or treatment of an ASK1-related disease.
  • One aspect of the present invention provides a use of a compound represented by the above chemical formula 1, a stereoisomer thereof, a solvate thereof, a hydrate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for preparing a medicament for preventing or treating an ASK1-related disease.
  • Step 3 6-(5,6-dihydrocyclopenta[ d ][1,2,3]triazole-1(4 H )-1)pyridin-2-amine
  • the above intermediate 3 can also be prepared according to the following reaction scheme.
  • the aqueous layer was extracted twice more with dichloromethane and the combined organic extracts were washed with brine, dried over MgSO 4 and concentrated.
  • the product was purified by flash column chromatography using silica gel (hexane/ethyl acetate 100/0->50/50) to obtain 6-(4,5,6,7-tetrahydro-1 H -benzo[ d ][1,2,3]triazol-1-yl)pyridin-2-amine (intermediate 3, 3.0 g, 43%).
  • the obtained material was purified by flash column chromatography using silica gel (ethyl acetate/methanol 100/0->90/10) and C18-reverse phase HPLC (using % TFA in H 2 O and 0.1% TFA in ACN as buffer solvent) to obtain N -(6-(1 H -benzo[ d ][1,2,3]triazol-1-yl)pyridin-2-yl)-5-(4-cyclopropyl-1 H -imidazol-1-yl)-2-fluoro-4-methylbenzamide (1, 35 mg, 23%).
  • the reaction mixture was quenched with ice-cold water and basified (pH 7-8) with saturated NaHCO 3 aqueous solution.
  • the obtained solid was filtered, washed with water, and dried.
  • the solid was purified by permeation with ethyl acetate to obtain the desired 5-(4-cyclopropyl-1H-imidazol-1-yl)-N-(6-(5,6-dihydrocyclopenta[d][1,2,3]triazol-1(4H)-yl)pyridin-2-yl)-2-fluoro-4-methylbenzamide compound as a pure white solid (0.3 g, 68%).
  • the reaction mixture was quenched with ice-cold water and basified (pH 7-8) with saturated NaHCO 3 aqueous solution.
  • the obtained solid was filtered, washed with water, and dried.
  • the solid was permeated with methanol to obtain the desired 5-(4-cyclopropyl-1H-imidazol-1-yl)-2-fluoro-4-methyl-N-(6-(4,5,6,7-tetrahydro-1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-yl)pyridin-2-yl)benzamide compound as a white solid (5.0 g, 94%).
  • Recombinant human ASK1 protein was initiated by adding a mixture of Mg/ATP to the reaction solution (8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 0.33 mg/mL myelin basic protein, 10 mM Mg Acetate, and [gamma-33P]-ATP), and the reaction was terminated by adding 0.5% phosphoric acid after 40 minutes at room temperature. After that, 10 uL of the reaction solution was dropped onto a P30 droplet filter, washed four times in 0.425% phosphoric acid for 4 minutes, dried in methanol, and measured for the activity of ASK1 by scintillation counting. The activity value from the group without the compound was set as 100%, and the degree of ASK2 inhibition by the compound was converted and the ASK1 inhibitory activity of the example compounds is summarized in Table 2 below.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 according to the present invention is a substance having ASK1 inhibitory activity. Therefore, the compound of the present invention can be usefully used as a composition for preventing or treating neurodegenerative brain diseases caused by ASK1.
  • SH-SY5Y cells were purchased from ATCC and cultured in RPMI medium containing 10% FBS and 1% penicillin and streptomycin at 37°C, 5% CO2.
  • MPP+ was purchased from Sigma Aldrich and cytotoxicity was induced by treatment with 5 mM.
  • Cell viability was measured by measuring the absorbance at 540 nm 1-3 hours after treatment with CCK-8 reagent, and the results are shown in Table 3 below.
  • the compounds of the present invention exhibited excellent cytoprotective effects in SH-SY5Y cells, and in particular, Examples 2 and 3 showed better EC 50 values than Comparative Example 1 (BGsertib).
  • BV2 cells were seeded at 2 ⁇ 10 4 per well in a 96-well plate and cultured for one day. Then, the cells were treated with compounds at concentrations of 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, and 1 ⁇ M, and cultured for 72 h at 37°C in 5% CO 2. Cell viability was quantified using the absorbance measured at a wavelength of 565 nm using a Hidex sense microplate reader (Hidex, Turku, Finland) after adding Cell Counting Kit-8 (CCK-8; LPS solution, Seoul, Korea) to the cells after culture.
  • Hidex sense microplate reader Hidex sense microplate reader
  • the example compound according to the present invention showed a cell viability rate at a similar level to that of Comparative Example 1 (selonsertib).
  • BV2 cells (2 ⁇ 10 4 cells per well) were cultured in 96-well culture plates for 24 h. Then, the cells were treated with the example compounds at concentrations of 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, and 1 ⁇ M for 1 h, and then 100 pg/ml of LPS was added and cultured for 24 h. After culture, the conditioned medium (CM) was harvested and centrifuged at 2000 rpm. After centrifugation, the supernatant was separated, and TNF- ⁇ secreted from the cell culture medium in the supernatant was measured using the corresponding ELISA kit (LABISKOMA, Seoul, Korea).
  • CM conditioned medium
  • Example 3 was confirmed to have excellent anti-inflammatory efficacy by reducing TNF- ⁇ secretion at all concentrations compared to selonsertib.
  • 6-OHDA 6-hydroxydopamine hydrobromide
  • MPP + (1-methyl-4-phenylpyridinium
  • PC12 cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 per well in a 96-well plate and cultured for 1 day. The cells were pretreated with each concentration of the example compounds for 1 hour. Then, 40 ⁇ M 6-OHDA and 2 mM MPP + were added, respectively, and cultured for 24 hours. Cell viability was then measured using MTT (Invitrogen, MA, USA).
  • the compound of the present invention showed a superior cell viability rate than Comparative Example 1 (selonsertib), confirming that it had an excellent neuroprotective effect in the PC-12 cell line.
  • Example 1 Group control 6-OHDA Comparative Example 1 ( ⁇ M) (Rhythmsertib) Example 3 ( ⁇ M) Example 2 ( ⁇ M) (40 ⁇ M) 0.1 0.3 1 0.1 0.3 1 0.1 0.3 1 AVE 100 81.51 87.91 89.18 84.09 89.95 91.98 92.77 88.85 91.49 96.78 STDEV 0.9 1.83 0.92 1.12 2.31 1.37 1.02 2.85 2.33 1.42 1.28
  • triglyceride (TG) measurement human hepatoma HepG2 cells were seeded at 2x104 cells per well in a 96-well plate and cultured for 24 hours. The cultured cells were pretreated with the example compounds at various concentrations for 2 hours, and then 1 mM of free fatty acid (FFA) containing a 1:2 ratio of Palmitic acid (PA, sigma, #P9767) and Oleic acid (OA, sigma, #O7501) was added, and the cells were cultured for 48 hours. After culture, the supernatant was separated and measured at an absorbance of 570 nm using a Triglyceride Quantification Kit (sigma, #MAK266).
  • FFA free fatty acid
  • MDCK-MDR1 cells 5 ⁇ 10 5 cells/mL were cultured in 24-transwell plates (Corning, NY, USA) for 4 days. The medium was replaced with fresh medium every other day, and the transepithelial electrical resistance (TEER) value was measured using a Millicell® ERS-2 Volohmmeter (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). After confirming that the value was 300 Ohm.cm 2 or higher, a cell membrane permeability test was performed.
  • TEER transepithelial electrical resistance
  • HBSS Hanks' Balanced Salt Solution
  • HEPES Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid
  • Efflux ratio (ER) (Papp (Basolateral to Apical))/(Papp (Apical to Basolateral))
  • Example Papp (X 10 -6 cm/sec) Efflux ratio A to B B to A 2 93.2 ⁇ 11.2 99.1 ⁇ 16.8 1.06 3 67.3 ⁇ 12.8 74.8 ⁇ 12.3 1.13 4 57.3 ⁇ 4.23 87.4 ⁇ 3.39 1.53 Comparative Example 1 (BGsertib) 3.82 ⁇ 0.66 102 ⁇ 2.97 27
  • Comparative Example 1 compound (BGsertib) was confirmed to be a substrate for an efflux transporter by showing an efflux coefficient of 27 due to a large difference in the apparent coefficients in the absorption and efflux directions, whereas the example compounds according to the present invention showed very high apparent multiple values and an efflux ratio close to 1 in both the absorption and efflux directions, confirming that they easily permeate the cell membrane and are not substrates for efflux transporters.
  • the blood-brain barrier permeability in ICR mice was determined by oral administration of 10 mg/kg of the test substance.
  • Male C57BL/6 mice were fasted for 15 h before administration.
  • the test substance was administered at a dose of 10 mg/kg and a volume of 5 mL/kg, and the administration solvent composition was prepared by mixing N-Methyl-2-pyrrolidone (NMP), polyethylene glycol 400 (PEG 400), and distilled water (D.W) in a volume ratio of 10:40:50 (%), respectively.
  • NMP N-Methyl-2-pyrrolidone
  • PEG 400 polyethylene glycol 400
  • D.W distilled water
  • mice were sacrificed by carbon dioxide inhalation at time points corresponding to 1, 4, and 8 h, and blood and brain tissue samples were collected.
  • Whole blood was collected from the iliac vein, and brain samples were collected after systemic perfusion with saline to remove as much blood as possible.
  • the distribution ratio in mouse plasma and brain was calculated by calculating the AUC after quantifying the concentration in each tissue.
  • Example 3 according to the present invention had relatively higher plasma and brain concentrations and Kp values than Comparative Example 1 (BGsertib), confirming that it has excellent pharmacodynamic properties for treating brain diseases.
  • mice Six-week-old C57BL/6 male mice were purchased from Koatech (Korea). Mice were housed in groups of up to four per cage, under a normal light-dark cycle (08:00-20:00) in a temperature-controlled (22 ⁇ 1°C) and humidity-controlled (30–50%) environment, and food and water were provided ad libitum. Mice were allowed to acclimate for 1 week before the start of the experiment.
  • test drugs were administered to normal mice and a Parkinson's disease (PD) mouse model induced by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), and their efficacy was evaluated.
  • PD Parkinson's disease
  • MPTP 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine
  • the test drugs were prepared using 10% NMP, 40% PEG 400, and 50% D.W. (distilled water) as vehicles.
  • Figure 3 is a schematic diagram of the efficacy experiment for the MPTP-induced PD mouse model.
  • mice Seven-week-old mice were divided into seven groups as shown in Table 9 below to generate an acute MPTP model and administer drugs: Control group + vehicle (G1), MPTP + vehicle (G2), MPTP + Nilotinib 40 mg/kg (G3), MPTP + Example 3 2 mg/kg (G4), MPTP + Example 3 10 mg/kg (G5), MPTP + Example 3 50 mg/kg (G6), and MPTP + Example 2 50 mg/kg (G7).
  • the test drugs were orally (PO) administered 10 ml/kg once daily (QD) from day 1 to day 7. Except for the control group, all groups for the acute MPTP model were administered MPTP . HCl (free base 20 mg/kg) intraperitoneally (IP) four times at 2-hour intervals on day 0. The control group was administered the same amount of 0.9% saline.
  • the pole test was performed on day 4 (after training on days 2 and 3). All mice were euthanized on day 7 and their brains were collected.
  • mice During the study period, the body weight was measured daily and the condition of the mice was examined for any abnormalities. If the overall health of the mice significantly deteriorated, the mice were euthanized and excluded from the study.
  • a vertical wooden pole (0.8 to 1 cm in diameter to provide a grip for the mouse, 80 cm in length) was placed on the floor of the cage and tested.
  • the mice were trained on two consecutive days (days 2 and 3), and each training session consisted of three trials.
  • day 3 day 4, the actual test day
  • the mice were placed at the end of the pole, and the total time it took for the mice to turn around the top and reach the bottom of the pole was measured.
  • the turn down time taken for the mouse to turn its head down
  • climb down time taken from the point where the mouse lowered its head to reaching the floor
  • the total time to reach the floor were recorded separately, and the graph in Fig. 4 was obtained.
  • Figure 4 is a graph showing the results of a behavioral defect evaluation (pole test) for the MPTP-induced PD mouse model.
  • pole test it was confirmed that the group (G2) treated with MPTP took significantly longer to rotate (a in Figure 4), descend (b in Figure 4), and reach the ground (c in Figure 4) than the control group (G1).
  • the groups (G4 to G7) treated with MPTP and the example compound showed a significant decrease in the time required to rotate compared to group G2. In particular, the rotation, descending, and ground reaching times were significantly decreased in groups G4 and G5. Through this, it was confirmed that the example compound significantly improved the behavioral defects.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • OCT optical cutting temperature
  • Tyrosine hydroxylase is a catalytic enzyme that converts the amino acid L-tyrosine into L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), and is one of the most important factors in the biosynthesis of catecholamines, including dopamine (DA). Changes in the expression or activity of TH have a significant impact on DA production, and are therefore very important in the pathogenesis of Parkinson's disease.
  • the slides were washed with phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.3% Triton X-100 and peroxidase block for 15 minutes at room temperature.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the slides were washed three times with PBS containing 0.3% Triton X-100 and then blocked in a solution containing PBS, 5% normal goat serum, and 0.3% Triton X-100 for 1 hour at RT.
  • Tyrosine hydroxylase antibody was diluted 1:1000 and incubated overnight at 4°C.
  • the slides were washed with PBS solution and incubated with secondary antibody for 1 hour at RT.
  • the slides were washed with PBS solution, and the sections were placed in the solution to perform DAB (diaminobenzidine) reaction.
  • TH staining images were visualized using an Olympus microscope (Olympus, SZ61, BX51). The optical density (OD) values of positive TH staining were measured in the striatum and substantia nigra and analyzed using Image J software.
  • FIGS. 5A and 5B show the results of immunohistochemical analysis of TH staining for the striatum
  • FIGS. 6A and 6B show the results of immunohistochemical analysis of TH staining for the substantia nigra.
  • the TH level in the striatum and substantia nigra of the group treated with MPTP (G2) was significantly lower than that in the control group (G1).
  • the TH level in the striatum of the group treated with nilotinib (G3) was significantly higher than that in G2.
  • the TH levels in both the striatum and substantia nigra were significantly increased in the groups treated with Example 3 or Example 2 compared to G2.
  • the TH levels in the striatum in G5 (MPTP + 10 mg/kg Example 3) and G6 (MPTP + 50 mg/kg Example 3) and the TH levels in the substantia nigra in G5, G6, and G7 (MPTP + 50 mg/kg Example 2) were significantly higher than that in the control group (G1).
  • the amount of dopamine in the striatum and substantia nigra of the extracted brain tissue was measured by LC-MS/MS analysis using Agilent 1290 (LC) and SCIEX QTARP 6500 + (QQQ).
  • Figure 7 is a graph of the dopamine levels by group in the striatum and substantia nigra of the MPTP-induced PD mouse model.
  • the dopamine concentration significantly increased in both the striatum and substantia nigra in the 50 mg/kg administration group of Example 2, and in the substantia nigra in the 2 and 10 mg/kg administration groups of Example 3, compared to the MPTP alone administration group. Through this, it was confirmed that the example compound significantly increases the dopamine level.
  • mice All mice were housed in a temperature-controlled (22 ⁇ 1°C) and humidity-controlled (30–50%) environment under a normal light–dark cycle (08:00–20:00), and food and water were provided ad libitum. Ears were marked at 15–21 days of age, and ear or tail samples were collected for PCR (polymerase chain reaction) analysis for genotyping. Tail samples were also collected at the end point for genotyping if necessary.
  • PCR polymerase chain reaction
  • test drugs were administered to normal mice and ⁇ -Syn (alpha-synuclein) transgenic Parkinson's disease mouse models, and their efficacy was evaluated.
  • the test drugs were prepared using 10% NMP, 40% PEG 400, and 50% D.W. as carriers.
  • Figure 8 is a schematic diagram of an efficacy experiment on an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model.
  • mice aged 4 months were divided into 7 groups as shown in Table 10 below.
  • the test drugs were administered orally (PO) once daily (QD) as a 5 mL/kg solution for 5 months from 4 months to 9 months of age.
  • Motor behavior tests (beam test) and neurological scores (modified Irwin test) were performed at 4 months (before administration), 7 months, and 9 months.
  • Tissue samples were collected after the final behavioral test. Body weights were measured on the same day of the week once a week from 4 months of age until the end of the study. Mice with significantly worse overall health were excluded from the study.
  • Figure 9 is a graph of group body weight changes in the ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model.
  • the body weight of the WT mouse G1 increased over time, whereas the body weight increase of the TG group (G2-7) stagnated.
  • the difference in body weight between the WT and TG mice became apparent after about 21 to 22 weeks of age, and it was confirmed that drug administration did not have a significant effect on the body weight of the TG mice.
  • mice were observed for 1 to 2 minutes per mouse for the neurological deficits listed in Table 11 below at 4 months of age (baseline, before dosing), 7 months, and 9 months of age.
  • Neurological behavioral deficits excluding the startle reflex, tail pinch, and righting reflex, were scored by direct observation of the mice in the cage.
  • a small remote control was used to produce a loud noise and detect behaviors such as jumping, freezing, and rapid eye blinking.
  • For the righting reflex each mouse was removed from the cage and placed with its back facing the floor, allowing the mouse to right itself.
  • the tail pinch reflex was tested by gently grasping the tip of the tail with forceps.
  • a score of 0 was given for normal features such as motor activity or no abnormal features, 1 point for mild abnormalities, and 2 to 3 points for severe abnormalities.
  • the scores for all observed behaviors were added for each mouse, and the average of the added scores for each group was calculated.
  • Figure 10 is a graph of the neurological behavior scores by group of ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse models.
  • the neurological scores (TG + transmitter) of G2 were significantly lower than those of G1 at 4 and 7 months after birth.
  • the groups administered Example 3 or Example 2 showed a significant decrease in the neurological scores of TG mice compared to G2.
  • the neurological scores of groups G4 to G7 remained very low overall throughout the study period, confirming that there was no neurological toxicity due to the drug.
  • the beam test (Beam test, Challenging Beam Traversal) was adopted according to the procedure described by Fleming et al. (J Neurosci, 24:9434-40, 2004). Motor ability was measured by a new beam test that was modified from the existing beam walking test.
  • the beam was made of Plexiglas and consisted of four sections (each 25 cm, total length 1 m) with different widths. The beam was designed to start at a width of 3.5 cm and gradually narrow to 0.5 cm ⁇ 1 cm. A 1-cm-wide shelf was placed 1.0 cm below the upper surface of the beam.
  • mice were trained to traverse the length of the beam, starting from the widest section to the narrowest and most difficult section.
  • the narrow end of the beam was designed to connect directly to the mouse’s home cage.
  • Mice were trained for 2 days prior to testing, all training sessions without the mesh grid. On the first day, mice were placed on the beam and the home cage was placed close to the mouse, which encouraged them to move forward along the beam. After two assisted training sessions, mice were able to traverse the entire length of the beam without assistance. On the first day of training, all mice completed five unassisted runs across the entire length of the beam. On the second day of training, mice were tested five times.
  • a mesh grid (1 cm square) of the appropriate width was placed on the beam surface to increase the difficulty, leaving approximately 1 cm of space between the grid and the beam surface.
  • a shelf below provided support for the mice when their limbs slipped on the grid, and allowed them to assess the ability to use compensatory motor strategies to complete the test without having to use compensatory motor strategies.
  • a video was taken of a mouse crossing a grid-patterned beam five times in total.
  • Videotape analysis was performed by a researcher blinded to mouse genotype/group to check for slow motion errors, and the number of steps taken and the time taken to cross the beam for each mouse across five trials.
  • An error was counted when a limb (forelimb or hindlimb) crossed the grid while moving forward and was visible between the grid and the beam surface.
  • Individual mice were allowed to slip up to four times per step. Errors were scored individually for each limb slip. For example, a mouse that slipped three limbs across the grid in a single step was scored as having an error score of 3, whereas a mouse that slipped only one limb across the grid in a single step was scored as having an error score of 1 for that step. Slips were not counted if the mouse did not move forward or if its head was turned to the left or right of the beam. The number of step errors and the time taken to cross the beam were measured across all five trials and averaged.
  • Figure 11 is a graph showing the results of the evaluation of gait errors by group in the ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model.
  • Group G2 made significantly more errors while crossing in the beam test than Group G1.
  • the memantine (G3), Example 3 (G4 to G6), or Example 2 (G7) administered groups showed a significant decrease in the number of gait errors compared to Group G2 at 7 and 9 months. Through this, it was confirmed that the Example compound improved behavioral errors.
  • mice were anesthetized and the experiment was terminated by cardiac puncture according to IACUC guidelines.
  • tissue staining mice were transcardially perfused with 0.9% saline and then perfused with 4% paraformaldehyde until the mice were fixed.
  • Brains were isolated and fixed in 4% paraformaldehyde at 4°C for 24 h and then stored in 30% sucrose in PBS containing 0.02% sodium azide at 4°C for 3 days.
  • Brain samples embedded in OCT compound were sectioned at 20 ⁇ m thickness using a Leica CM1950 (Leica Microsystems, Germany). The sections were stored in preservative solution at 4°C until staining with antibodies.
  • DAPI mounting solution VECTASHIELD, #H1500
  • TH-stained brain tissues were imaged using an Olympus immunofluorescence microscope (Olympus, BZ21). Fluorescence intensity in the striatum was analyzed using Image J software.
  • FIGS. 12A and 12B are graphs and immunofluorescence analysis images showing the results of the evaluation of the efficacy of improving dopaminergic neurodegeneration by group in an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model.
  • the TH staining intensity of the striatum of group G2 tended to be lower than that of group G1.
  • the TH staining intensity of group G7 (TG + Example 2) was also significantly higher than that of group G2. This confirmed that the example compound could significantly improve dopaminergic neurodegeneration.
  • Iba-1 stained brain tissue from Experimental Example 10.5 was imaged using an Olympus immunofluorescence microscope (Olympus, BZ21). For Iba1 quantification, each marker was manually counted.
  • Figures 13a and 13b are graphs and immunofluorescence analysis images showing the results of evaluating the efficacy of reducing microglial cells by group in an ⁇ -Syn transgenic Parkinson's disease mouse model.
  • the number of Iba-1 positive cells in the cerebral cortex was significantly reduced in the memantine (G3), 2 mg/kg and 10 mg/kg of Example 3 (G4 and G5), and 2 mg/kg of Example 2 (G7) administration groups. Through this, it was confirmed that the example compound significantly reduced microglial cells.
  • mice were generated by crossing male G93A SOD1 (high-copy SOD1-G93A, 25 TG copies of G1H, stock no. 002726) from the Jackson Laboratory with females on the B6SJL strain background (non-carrier, WT). All mice were housed in a temperature- (22 ⁇ 1°C) and humidity-controlled (30–50%) environment with a normal light-dark cycle (08:00–20:00) and provided with food and water ad libitum. Ears were marked at 15–21 days of age, and ear or tail samples were collected for PCR analysis for genotyping. Tail samples were also collected at the end point for genotyping if necessary.
  • test drugs were administered to normal mice and SOD1 G93A transgenic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mouse models, and their efficacy was evaluated.
  • the test drugs were prepared using 10% NMP, 40% PEG 400, and 50% D.W. as carriers.
  • Figure 14 is a schematic diagram of an efficacy experiment on a SOD1 G93A transgenic ALS mouse model.
  • mice Eight-week-old mice were divided into three groups as shown in Table 13 below.
  • the test drugs were administered orally (PO) once daily (QD) as a 5 mL/kg solution from 8 weeks of age until death. Body weights were measured weekly, and disease scores were measured daily from 8 weeks until the animals died. Motor behavior tests (grip strength) and neurological score tests (modified Irwin test) were performed at 9, 11, 13, 15, 17, 19, and 21 weeks, respectively. The survival of the mice was monitored daily. If the overall health of the mice significantly deteriorated, they were excluded from the study.
  • Figure 15 is a graph of the group body weight changes of the SOD1 G93A transgenic ALS mouse model. Referring to Figure 15, the body weight of the Tg group (G2) was significantly lower than that of the WT group (G1). On the other hand, there was no significant difference between the TG (G2) and drug treatment group (G3), and it was confirmed that the example compound did not significantly reduce body weight.
  • Fig. 16 is a graph of the neurological scores by group of the SOD1 G93A transgenic ALS animal model.
  • the neurological score of the WT group (G1) was very low, less than 1, throughout the study period. From the 13th week onwards, the neurological score of the TG group was significantly higher than that of the G1 group. From the 19th week after birth, the group (G3) treated with Example 3 showed a significant decrease in the neurological score compared to G2. Through this, it was confirmed that the Example compound significantly improved neurological behavior.
  • mice From 8 weeks of age, the disease symptoms of mice were evaluated using a neurological scoring system developed by the ALSTDI (ALS Therapy Development Institute) method. Scoring was performed for both hind limbs according to the criteria in Table 14 below.
  • ALSTDI ALS Therapy Development Institute
  • Figure 17 is a graph of group-wise disease score changes in the SOD1 G93A transgenic ALS mouse model.
  • the disease onset scores of the TG groups (G2 and G3) significantly increased compared to the WT group (G1), and the difference became prominent at approximately 15 weeks of age.
  • the group (G3) treated with Example 3 showed a lower disease symptom score compared to G2 during the observation period, and significantly decreased at 20 weeks. Through this, it was confirmed that the Example compound significantly improved disease symptoms.
  • mice Grip strength was measured on mice at 9, 11, 13, 15, 17, 19, and 21 weeks of age. Mice were placed on a grip strength measuring device (San Diego Instruments, San Diego, USA) with the forepaws grasping a small mesh handle. The mouse was lowered onto the platform and the handle was slowly pulled with the tail until the mouse released the handle. The device automatically measured the strength of the mouse's grip in grams. Five scores were recorded continuously per mouse per session.
  • a grip strength measuring device San Diego Instruments, San Diego, USA
  • Figure 18 is a graph of changes in grip strength by group of the SOD1 G93A transgenic ALS mouse model. Referring to Figure 18, the grip strength of the TG group generally decreased over time and was significantly lower than that of group G1.
  • the group (G3) treated with Example 3 showed a tendency for grip strength to increase compared to group G2, and grip strength significantly increased from the 19th week. This confirmed that the Example compound significantly improved grip strength.
  • mice The survival of mice was monitored daily. The survival ages of the mice were recorded and displayed as Kaplan Meier survival plots.
  • Figure 19 is a graph of the survival rates by group of the SOD1 G93A transgenic ALS mouse model. Referring to Figure 19, the survival rate of the TG group began to decrease from about 110 to 120 days after birth, and the group (G3) treated with Example 3 showed a tendency for the survival rate to improve, although not significantly, compared to group G2. This confirmed that the Example compound improved the survival rate.
  • SD rats Six-week-old male Sprague Dawley (SD) rats were used. All rats were housed in a temperature-controlled (22 ⁇ 1°C) and humidity-controlled (30–50%) environment under a normal light–dark cycle (08:00–20:00), and food and water were provided ad libitum.
  • test drugs were administered to normal rats and a Reserpine-induced fibromyalgia rat model, and their efficacy was evaluated.
  • the test drugs were prepared using 10% NMP, 40% PEG 400, and 50% D.W. as carriers.
  • Figure 20 is a schematic diagram of an efficacy experiment on a reserpine-induced fibromyalgia rat model.
  • control group G1
  • reserpine + vehicle G2
  • reserpine + gabapentin 50 mg/kg G3
  • reserpine + Example 2 3 mg/kg
  • reserpine + Example 2 3 mg/kg
  • 10 mg/kg G5
  • 30 mg/kg G6
  • reserpine Sigma-aldrich, 1 mg/kg
  • acetic acid 0.5% acetic acid was administered subcutaneously once for 3 days starting from 3 days before the start of the experiment. From day 1, the vehicle, gabapentin, and Example 2 were administered intraperitoneally (IP) or orally (PO) 2 hours before the experiment once daily (QD).
  • the right hind paw tactile response test (von Frey test) was performed five times (before fibromyalgia model creation, and on days 1, 2, 4, and 6 after model creation). The rats were allowed to acclimate to the environment for 30 min before all behavioral tests, and all experimenters performing the behavioral tests were blinded to any drug administration information.
  • the von Frey test was performed on all rats before model creation to perform baseline measurements. The rats were placed on a wired mesh and placed in a transparent plastic box (20 ⁇ 20 ⁇ 14 cm), and von Frey filaments (ascending weights: 0.4, 0.6, 1.4, 2, 4, 6, 8, and 15 g, North Coast) were applied to the center of the right hind paw to evaluate mechanical allodynia, and the paw withdrawal threshold was measured.
  • Fig. 21 is a graph showing the results of pain improvement efficacy evaluation for a reserpine-induced fibromyalgia rat model.
  • the reserpine treatment group (G2) showed high sensitivity, and it was confirmed that the sensitivity of the gabapentin treatment group (G3) and the Example 2 treatment groups (G4 to G6) gradually improved over time after model generation.
  • Example 2 showed a tendency to recover in a dose-dependent manner, and showed significant efficacy at 30 mg/kg. Through this, it was confirmed that the compound of the example significantly improved pain.
  • mice Three-week-old C57BL/6 male mice (Koatech, Korea) were purchased. Mice were housed in groups of up to five per cage, under a normal light-dark cycle (08:00-20:00) in a temperature-controlled (22 ⁇ 1°C) and humidity-controlled (30–50%) environment, and food and water were provided ad libitum. Mice were allowed to acclimate for 1 week before the start of the experiment.
  • test drugs were administered to normal mice and CDAHFD (A choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet: choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet)-induced nonalcoholic steatohepatitis (NASH) mouse models, and their efficacy was evaluated.
  • CDAHFD A choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet: choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • CDAHFD is a high-fat diet containing 0.1% methionine and 60 kcal% fat, and is deficient in choline. C57BL/6J mice fed CDAHFD rapidly develop steatohepatitis with fibrosis in a short period of time.
  • Figure 22 is a schematic diagram of an efficacy experiment on a CDAHFD-induced nonalcoholic steatohepatitis mouse model.
  • the generation of the CDAHFD-induced NASH model and drug administration were performed by dividing 3-week-old C57BL/6 male mice into 7 groups as shown in Table 16 below.
  • the control group (G1) was fed a standard diet and water.
  • Groups G2 to G7 were fed a CDAHFD (Research Diet Inc, #A06071302) diet for 4 and 8 weeks.
  • Each group, except for the control group, was orally administered the carrier, selonsultib 30 mg/kg, Example 3 10 mg/kg, Example 3 30 mg/kg, Example 2 10 mg/kg, and Example 2 30 mg/kg once daily (QD) from 5 weeks of age.
  • Picrosirius red staining was used for histological visualization of collagen fibers. The efficacy in improving liver fibrosis was evaluated through histopathological analysis.
  • liver sections fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) were prepared as paraffin blocks.
  • the paraffin blocks were sectioned at 5 ⁇ m thickness (Histocore AUTOCUT R, Leica Microsystems, Germany), and the sections were mounted on silane-coated slides (MUTO, JPN) and stored until staining.
  • Paraffin was removed from the slides using xylene, and the slides were rehydrated and washed.
  • the slides were stained with picrosirius red solution (ab150681, Abcam, UK) and washed with acetic acid solution.
  • the slides were dehydrated and washed using alcohol and xylene, and then mounted. For each section, two images of different areas were taken using a microscope (Axioscan7, Zeiss, Germany). The fibrotic area was measured as the area of fibrosis relative to the total area using Image J software.
  • FIGS. 23a and 23b are graphs and images for the relative area ratio of Picrosirius red staining in the liver of a CDAHFD-induced non-alcoholic steatohepatitis mouse model.
  • the CDAHFD group had a significantly higher relative area stained with Picrosirius red compared to group G1, indicating that the NASH model was properly formed.
  • the Picrosirius red staining area significantly decreased in the comparative drug Rhythmsultib (G3) and Examples 3 (G4 and G5) and Example 2 (G6 and G7), and the most improved efficacy was confirmed in the Example 2 30 mg/kg administration group after 4 weeks of CDAHFD diet. This confirmed that the Example compound significantly improved liver fibrosis.

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Abstract

본 발명은 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물은 ASK1에 대하여 높은 억제능을 나타내고, 신경세포의 사멸을 억제하고 있으므로, 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환, 자가면역질환 및 간 질환을 포함하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

Description

신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물, 이의 제조방법 및 이의 용도
본 발명은 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
ASK1(Apoptosis signal-regulating kinase 1; ASK1)은 c-Jun N-말단 단백질 키나제(JNK) 및 스트레스에 반응하는 미토겐-활성화 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinase; MAP3K) 계열의 구성원으로, MAP3K5라고도 알려져 있다. ASK1은 세포 사멸의 중심 조절인자이고, 산화 스트레스, 활성 산소 종(ROS), 소포체(ER) 스트레스 및 미접힘 단백질 반응(UPR), 미토콘드리아 스트레스 등 다양한 형태의 스트레스에 의해 유발되는 여러 스트레스-유발 및 수용체-매개 세포 사멸 경로에 참여하는 것으로 알려져 있다.
또한, ASK1은 세포 사멸 경로 뿐만 아니라 사이토카인 반응 및 세포 분화를 포함한 염증 및 선천 면역 반응에서도 필수적인 역할을 한다. ASK1 단백질의 인산화는 세포 유형에 따라 세포자연사(apoptosis) 또는 기타 세포 반응을 유발할 수 있다. 특히, ASK1 활성화 및 시그널링은 신경퇴행성, 심혈관, 염증성, 자가면역 및 대사 질환을 포함한 광범위한 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 또한, ASK1은 심장, 뇌 및 신장의 허혈 및 재관류에 따른 장기 손상을 중재하는데 관련이 있다고 알려져 있다(Zhang et al. J Clin Invest.2003; 111(12): 1933-1943.).
한편, 파킨슨병은 주로 노년층에서 발생하는 신경퇴행성 질환이다. 파킨슨병은 뇌의 중간에 존재하는 뇌흑질의 도파민성 신경세포가 사멸하여 행동에 장애를 일으킨다. 또한, 뇌와 말초신경의 여러 부위에 알파 시누클레인 단백질이 침착되어 생긴 루이소체가 파킨슨병 환자의 신경병리학적 주된 특징이다. 파킨슨병의 대표적인 증상으로 몸의 움직임이 비정상적으로 느려지는 서동, 손이나 발이 떨리는 진전 및 근육과 관절이 뻣뻣해지는 경직이 있으며, 비운동성 증상으로 정신장애, 자율신경 기능 장애 등이 나타난다.
이때, 과도한 양의 ASK1은 심장질환, 염증질환, 간질환, 감염병 및 퇴행성 뇌질환과 밀접하게 연관되어 있음이 보고되고 있으며, ASK1 저해 기반 파킨슨병 치료제로서의 가능성이 다각도로 제기되고 있다. 알파 시누클레인 PFF(alpha-synuclein pre-formed fibrils)에 의한 파킨슨병 유발 시, ASK1 결손 마우스에서는 선조체와 대뇌피질에서 인산화된 알파 시누클레인(p-alpha-synuclein)의 축적이 감소하였다. 나아가 신경염증도 완화되었으며, 이는 행동학적 개선으로도 이어졌다. 또한, 파킨슨병의 환자의 대뇌 흑질 부분의 신경세포에서 정상인 대비 4배 이상의 p-ASK1의 활성화가 관찰되었다.
이에 따라, 본 발명자들은 ASK1 유도체를 연구하던 과정에서, 신규한 트리아졸 화합물이 우수한 ASK1 저해능을 가지면서 신경세포를 보호하고 세포막투과가 용이하며 유출수송체가 아님을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적은 신규한 고리 구조의 트리하졸 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물을 유효성분으로 함유하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적은 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약을 제조하기 위한 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 제공된다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000001
상기 화학식 1에서,
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000002
는 비치환 또는 치환된 페닐 또는 비치환 또는 치환된 C3-8 사이클로알케닐이고,
상기 치환된 페닐 및 치환된 C3-8 사이클로알케닐 각각은 독립적으로 C1-6알킬, C1-6알콕시 또는 할로젠으로 치환되고;
R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, C1-6알킬, 할로겐, C3-6사이클로알킬 또는 할로C1-6알킬이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법이 제공된다:
[반응식 1]
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000003
상기 반응식 1에서
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000004
, R1, R2, 및 R3는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용으로 사용하기 위한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 약학적 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약을 제조하기 위한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 약학적 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 신규한 고리 구조의 트리아졸 화합물은 ASK1에 대하여 높은 억제능을 나타내고, 신경세포의 사멸을 억제하고 있으므로, 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환, 및 자가면역질환을 포함하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 파킨슨병에 따른 행동 결함 또는 오류, 및 신경학적 장애 증상을 개선시키고, 유의미하게 도파민성 신경퇴화를 개선시키고 미세아교세포를 감소시킴으로써, 파킨슨병을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 근위축성 측삭경화증에 따른 신경학적 장애 또는 질병 증상 및 악력 저하를 개선시키고 생존율을 증가시킴으로써, 근위축성 측삭경화증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 그리고, 본 발명의 화합물은 섬유근육통에 따른 통증을 개선시켜 섬유근육통을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 비알코올성 지방간염에 따른 간 섬유화를 개선시켜 비알코올성 지방간염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 신경세포 보호 효능(Neuroprotection assay)을 평가하여 세포 보호 효과(% of control)를 나타낸 것이다.
도 2는 LPS 처리한 세포의 세포 생존율(cell viability, %) 및 TNF-α ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 MPTP-유도 PD 마우스 모델에서 약물의 효능을 확인하기 위한 실험의 모식도이다.
도 4는 MPTP-유도 PD 마우스 모델에서 약물 투여에 따른 그룹별 행동 결함 평가(폴 테스트) 결과를 나타내는 그래프이다. 이때, a, b 및 c는 각각 꼭대기에서의 회전 시간, 기둥 하강 시간 및 총 소요 시간을 나타낸다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 5a는 MPTP-유도 PD 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 선조체의 TH 염색 정도를 나타낸 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 5b는 MPTP-유도 PD 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 선조체의 TH 염색 정도를 나타낸 이미지이다.
도 6a는 MPTP-유도 PD 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 흑질의 TH 염색 정도를 나타낸 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 6b는 MPTP-유도 PD 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 흑질의 TH 염색 정도를 나타낸 이미지이다.
도 7은 MPTP-유도 PD 마우스 모델의 선조체(striatum)와 흑질(substantia nigra)에서의 약물 처리에 따른 그룹별 도파민 농도를 확인한 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 8은 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에서 약물의 효능을 확인하기 위한 실험 모식도이다.
도 9는 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 체중 변화를 나타낸 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 10은 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 신경학적 행동 점수에 대한 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 11은 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 걸음 오류 평가 결과를 나타내는 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 12a는 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 도파민성 신경퇴화 개선 효능 평가 결과를 나타내는 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 12b는 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 도파민성 신경퇴화 개선 효능 평가 결과를 나타내는 면역형광분석 이미지이다.
도 13a는 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 미세아교세포 감소 효능 평가 결과를 나타내는 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 13b는 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 미세아교세포 감소 효능 평가 결과를 나타내는 면역형광분석 이미지이다.
도 14는 SOD1 G93A 형질전환 ALS 마우스 모델에서 약물의 효능을 확인하기 위한 실험의 모식도이다.
도 15는 SOD1 G93A 형질전환 ALS 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 체중 변화에 대한 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001.
도 16은 SOD1 G93A 형질전환 ALS 동물 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 신경학적 점수에 대한 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 17은 SOD1 G93A 형질전환 ALS 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 질병 점수 변화에 대한 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 18은 SOD1 G93A 형질전환 ALS 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 악력 변화에 대한 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 19는 SOD1 G93A 형질전환 ALS 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 그룹별 생존율에 대한 그래프이다.
도 20은 Reserpine 유도 섬유근육통 랫트 모델에서 약물의 효능을 확인하기 위한 실험의 모식도이다.
도 21은 Reserpine 유도 섬유근육통 랫트 모델에서 약물 처리에 따른 통증 개선 효능 평가 결과 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 22는 CDAHFD 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 약물의 효능을 확인하기 위한 실험의 모식도이다.
도 23a는 CDAHFD 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 간에서의 Picrosirius red 염색 면적비에 대한 그래프이다. G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 / G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001.
도 23b는 CDAHFD 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 약물 처리에 따른 간에서의 Picrosirius red 염색 면적비에 대한 이미지이다.
본 발명의 일 측면은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000005
상기 화학식 1에서,
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000006
는 비치환 또는 치환된 페닐 또는 비치환 또는 치환된 C3-8 사이클로알케닐이고,
상기 치환된 페닐 및 치환된 C3-8 사이클로알케닐 각각은 독립적으로 C1-6알킬, C1-6알콕시 또는 할로젠으로 치환되고;
R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, C1-6알킬, 할로겐, C3-6사이클로알킬 또는 할로C1-6알킬이다.
또한, 상기 화학식 1에서,
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000007
는 비치환 또는 치환된 페닐 또는 비치환 또는 치환된 C5-8 사이클로알케닐이고,
상기 치환된 페닐 및 치환된 C3-8 사이클로알케닐 각각은 독립적으로 C1-3알킬, C1-3알콕시 또는 할로젠으로 치환되고;
R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, C1-3알킬, 할로겐, C3-6사이클로알킬 또는 할로C1-3알킬이다.
또한, 상기 화학식 1에서,
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000008
는 페닐 또는 이중결합을 1개 포함하는 C5-8사이클로알케닐이고;
R1은 C3-6사이클로알킬이고,
R2는 C1-3알킬이고,
R3은 할로젠이다.
또한, 상기 화학식 1에서,
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000009
는 페닐 또는 이중결합을 1개 포함하는 C5-8사이클로알케닐이고;
R1은 사이클로프로필이고,
R2는 메틸이고,
R3은 플루오로이다.
본 명세서에서 사용된 용어, “사이클로알케닐”은 임의의 안정적인 고리형 탄화수소기를 포함하고, 상기 탄화 수소기는 고리의 임의의 위치에 하나 또는 다수의 불포화의 탄소-탄소 이중결합을 함유하며, 단일치환 또는 다 중 치환될 수 있고, 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 본 명세서에 있어서는 트리아졸에 융합되는 2가이다. 이러한 사이클로알케닐기의 이중결합을 1개 포함하는 구현예로 사이클로펜테닐기, 사이클로헥세닐기, 사이클로헵테닐기, 사이클로옥테닐기가 있을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알킬"은 직쇄 또는 분지쇄의 완전포화탄화수소기를 나타내고, 알킬의 예로 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(예를 들어, n-프로필 및 이소프로필기, 부틸(예를 들어, n-부틸, 이소부틸, s-부틸, t-부틸), 펜틸(예를 들어, n-펜틸, 이소펜틸(Isopentyl group), 네오펜틸(neopentyl group)) 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “할로알킬”은 1 이상의 할로젠으로 치환된 알킬로, 단일치환(예를 들어 -CH2F) 또는 다중 치환(예를 들어 -CF3)된 것을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 예로는 하기의 화합물을 들 수 있다:
<1> N-(6-(1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)-5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸벤즈아미드;
<2> 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-N-(6-(5,6-디하이드로사이클로펜타[d][1,2,3]트리아졸-1(4H)-일)피리딘-2-일)-2-플루오로-4- 메틸벤즈아미드;
<3> 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸-N-(6-(4,5,6,7-테트라하이드로-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)메틸벤즈아미드;
<4> 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸-N-(6-(5,6,7,8-테트라하이드로사이클로헵타[d][1,2,3]트리아졸-1(4H)-일)피리딘-2-일)벤즈아미드; 및
<5> 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-N-(6-(4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-사이클로옥타[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)-4-메틸벤즈아미드.
본 발명의 일 측면은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다:
[반응식 1]
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000010
상기 반응식 1에서
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000011
, R1, R2, 및 R3는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
상기 반응은 DMF(디메틸포름아미드), NMP(N-메틸-2-피롤리돈) 등의 유기 용매 조건 하에서 수행될 수 있으며, 이 때, DMAP(4-디메틸아미노피리딘) 등의 촉매 물질이 이용될 수 있다.
상기 반응에는 HATU(헥사플루오로포스페이트 아자벤조트리아졸 테트라메틸 우로늄), T3P(프로판포스폰산 무수물) 등의 커플링제가 이용될 수 있다.
상기 반응은 0℃ 내지 50℃에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 반응은 0℃ 내지 40℃, 0℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 50℃, 10℃ 내지 40℃, 10℃ 내지 30℃, 20℃ 내지 50℃, 20℃ 내지 40℃ 또는 20℃ 내지 30℃에서 수행될 수 있다.
상기 반응은 0.1 시간 내지 48 시간 동안 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 반응은 0.1 시간 내지 36 시간, 0.1 시간 내지 24 시간, 0.5 시간 내지 48 시간, 0.5 시간 내지 36 시간, 0.5 시간 내지 24 시간, 1 시간 내지 48 시간, 1 시간 내지 36 시간, 1 시간 내지 24 시간, 2 시간 내지 48 시간, 2 시간 내지 36 시간, 2 시간 내지 24 시간, 3 시간 내지 48 시간, 3 시간 내지 36 시간, 3 시간 내지 24 시간, 4 시간 내지 48 시간, 4 시간 내지 36 시간, 4 시간 내지 24 시간, 6 시간 내지 48 시간, 6 시간 내지 36 시간 또는 6 시간 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 트리플루오로아세트산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 입체이성질체, 수화물 등을 모두 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "수화물(hydrate)"은 비공유적 분자간력(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric) 량의 물을 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 수화물은 비공유적 분자간 힘으로 결합되는 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 물을 포함할 수 있다. 상기 수화물은 1당량 이상, 바람직하게는, 1 당량 내지 5당량의 물을 함유할 수 있다. 이러한 수화물은 물 또는 물을 함유하는 용매로부터 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 결정화시켜 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "용매화물(solvate)"은 비공유적 분자간력에 의해 결합된 화학양론적 또는 비화학양론적 양의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "이성질체(isomer)"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 구조적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 이러한 이성질체에는 호변이성질체(tautomer)까지 포함하는 구조이성질체와, 입체이성질체(stereoisomer)가 포함되며, 입체이성질체에는 비대칭 탄소 중심을 1개 이상 가짐으로써 나타나는 광학이성질체(enatiomer) 및 부분입체이성질체, 그리고 기하이성질체(트랜스, 시스)가 모두 포함된다. 이들 모든 이성체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 상기 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 ASK1을 억제할 수 있다.
또한, 상기 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 신경세포의 사멸을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 측면은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
약학적 조성물은, 상기 유효성분 외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 ASK1 관련 질환은 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환, 자가면역 질환, 및 간 질환을 포함한다.
상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 해마 경화증, 전두측두엽 치매 (FTD), 전두측두엽 변성 (FTLD), 헌팅턴병, 피질기저핵 변성, 근위축성 측삭경화증, 척수성 근위축, 운동 뉴런 질환, 봉입체 근염, 파킨슨병, 루이소체 치매, 루이소체 질환, 다계통 위축, 진행성 핵상 마비, 피크병, 프라이온병, 외상성 뇌 손상, 허혈성 및 출혈성 뇌졸중, 대뇌 허혈, 저산소증, 및 글루타메이트 신경독성을 포함한다.
상기 심혈관 질환은 심부전, 허혈, 재발성 허혈, 심근경색, 부정맥, 급성 관상동맥 증후군, 당뇨병, 죽상경화증 및 간헐적 파행을 포함한다.
상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 섬유근육통, 전신홍반루푸스, 다발성 경화증, 당뇨병, 전신경화증, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 중증근무력증, 건선, 크론병, 궤양성 대장염, 시신경염, 및 쇼그렌 증후군을 포함한다.
상기 간 질환은 비알코올성 지방간(NASH), 알코올성 지방간, 간 섬유화, 간암, 간독성, 담즙울체, 간경변, 간허혈, 간 농양, 간성 혼수, 및 간 위축증을 포함한다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등 이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 “약학적으로 유효한 양”으로 투여된다. 본 명세서에 있어서, 용어 “약학적으로 유효한 양”이란, 의학적 치료 또는 개선에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 0.001 mg/kg 내지 1000 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 0.1 내지 20 mg/kg 또는 0.1 내지 500 mg/kg의 유효한 양이 포함된다. 본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물의 양은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 일 측면은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은, 높은 ASK1 억제능을 나타냄으로써, ASK1 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로 약학적 조성물에 준하여 제조되거나, 식품, 음료 등의 건강기능보조 식품에 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 투여는 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 경구 투여시는 활성성분을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 0.01 내지 1000 mg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 300 mg의 양으로 투여되도록, 비경구 투여시는 활성성분을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 0.01 내지 100 mg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 50 mg의 양으로 투여되도록 1회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 개체 또는 환자에 대한 투여 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것이고 전문가에 의해 적절하 가감될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 일 측면은, ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 측면은, ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약을 제조하기 위한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 6-(1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민(중간체 1)
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000012
상기 반응식에 따라, 중간체 1을 얻었다.
DMSO (6 mL) 내에서 6-플루오로피리딘-2-아민 (200 mg, 1.78 mmol), 벤조트리아졸 (255 mg, 2.14 mmol) 및 K2CO3 (740 mg, 5.34 mmol)의 혼합물을 12시간 동안 180℃에서 가열하였다. 상온에서 냉각 후, 1 M Na2CO3 용액을 추가하였다. 생성된 고체는 여과하고 감압하에 건조하여, 6-(1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민을 수득하였다(중간체 1, 230 mg, 61%). 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.72 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.59 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.44 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 8.2 Hz, 1H); LCMS: 212.4 [M+H+].
제조예 2. 6-(5,6-디하이드로사이클로펜타[ d ][1,2,3]트리아졸-1(4 H )-일)피리딘-2-아민(중간체 2)
하기 반응식에 따라 중간체 2를 얻었다.
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000013
단계 1: 1-아지도-4-니트로벤젠
4-니트로아닐린 (1.00 g, 7.24 mmol)은 무수 아세토니트릴 (20 mL)에 용해된 후, 아이스 배스에서 0℃로 냉각시켰다. 교반 용액에, 터트-부틸 니트라이트(1.03 mL, 8.69 mmol)를 첨가하였고, 생성된 혼합물은 20분 동안 교반시켰다. 그 다음, 아지도트리메틸시레인 (1.44 mL, 10.86 mmol)을 10분동안, 한 방울씩 첨가하였고, 갈색의 최종 용액을 12시간 동안 상온에서 교반시켰다. 용매는 감압 하에서 제거하였다. 잔여물은 실리카겔을 이용한 플래시 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography) (헥산/에틸 아세테이트 100/0->80/20)을 이용하여 정제하여, 1-아지도-4-니트로벤젠을 수득하였다(1.16 g, 97%).
1H NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ 8.30 - 8.25 (m, 2H), 7.30 - 7.25 (m, 2H); LCMS: 165.5 [M+H+].
단계 2: 1,4,5,6-테트라하이드로사이클로펜타[ d ][1,2,3]트리아졸
사이클로펜탄온 (1.08 mL, 12.2 mmol), NH4OAc (4.69 g, 60.9 mmol), 및 1-아지도-4-니트로벤젠을 마그네틱 교반바를 장착한 스크류-캡이 있는 반응 튜브에 첨가하였다. 생성된 혼합물은 DMF (20 mL)에서 용해시켰고 12시간 동안 80℃에서 교반하였다. 완료시 감압 하에서 DMF를 제거하였고, 실리카겔을 이용한 플래시 컬럼 크로마토그래피 (DCM 100% 후, 헥산/에틸 아세테이트 100/0->50/50)을 이용하여 정제하여, 1,4,5,6-테트라하이드로사이클로펜타[d][1,2,3]트리아졸을 수득하였다(164 mg, 61%).
1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 10.03 (s, 1H), 2.88 - 2.78 (m, 4H), 2.66 - 2.54 (m, 2H).
단계 3: 6-(5,6-디하이드로사이클로펜타[ d ][1,2,3]트리아졸-1(4 H )-일)피리딘-2-아민
DMSO (20 mL) 내에서 6-플루오로피리딘-2-아민 (940 mg, 8.32 mmol), 1,4,5,6-테트라하이드로사이클로펜타[d][1,2,3]트리아졸 (1.00 g, 9.16 mmol) 및 K2CO3 (3.44 g, 25.0 mmol)의 혼합물을 12시간 동안 160℃에서 가열하였다. 상온에서 냉각 후, 혼합물은 물로 희석되었고 아세틸 아세테이트로 두 번 추출되었다. 혼합된 유기층은 염수로 세척되었고, MgSO4로 건조시킨 후, 여과하고 농축하였다. 잔여물은 실리카겔을 이용한 플래시 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트 100/0->60/40)을 이용하여 정제하여, 6-(5,6-디하이드로사이클로펜타[d][1,2,3]트리아졸-1(4H)-일)피리딘-2-아민(중간체 2, 700 mg, 42%)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 7.59 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.41 (dd, J = 7.8, 0.7 Hz, 1H), 6.45 (dd, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 3.18 - 3.05 (m, 2H), 2.88 - 2.76 (m, 2H), 2.73 - 2.59 (m, 2H); LCMS: 202.6 [M+H+].
제조예 3. 6-(4,5,6,7-테트라하이드로-1 H -벤조[ d ][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민(중간체 3)
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000014
제조예 2와 동일한 방법을 수행하여 6-(4,5,6,7-테트라하이드로-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민(중간체 3, 39%)을 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, Chloroform-d) δ 7.60 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 7.8, 0.7 Hz, 1H), 6.48 (dd, J = 8.2, 0.7 Hz, 1H), 3.13 - 3.03 (m, 2H), 2.86 - 2.75 (m, 2H), 1.90 - 1.78 (m, 4H); LCMS: 216.6 [M+H+].
제조예 4. 6-(5,6,7,8-테트라하이드로사이클로헵타[ d ][1,2,3]트리아졸-1(4 H )-일)피리딘-2-아민(중간체 4)
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000015
제조예 2와 동일한 방법을 수행하여 6-(5,6,7,8-테트라하이드로사이클로헵타[d][1,2,3]트리아졸-1(4H)-일)피리딘-2-아민(중간체 4, 22%)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, Methanol-d 4) δ 7.65 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.07 - 2.97 (m, 2H), 2.95 - 2.86 (m, 2H), 1.96 - 1.85 (m, 2H), 1.81 - 1.69 (m, 4H); LCMS: 230.6 [M+H+].
제조예 5. 6-(4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1 H -사이클로옥타[ d ][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민(중간체 5)
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000016
제조예 2와 동일한 방법을 수행하여 6-(4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-사이클로옥타[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민을 수득하였다(중간체 5, 23%).
1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 7.65 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.20 - 7.10 (m, 1H), 6.74 - 6.63 (m, 1H), 3.17 - 3.09 (m, 2H), 3.06 - 2.99 (m, 2H), 1.94 - 1.87 (m, 2H), 1.85 - 1.76 (m, 2H), 1.57 - 1.45 (m, 4H); LCMS: 244.6 [M+H+].
제조예 6. 6-(4,5,6,7-테트라하이드로-1 H -벤조[ d ][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민(중간체 3의 대안적 제조 방법)
상기 중간체 3은 하기 반응식에 따라서도 제조될 수 있다.
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000017
단계 1. 2,2-디메톡시사이클로헥산-1-온
메탄올 (500 ml) 내에 트리메틸실일 클로라이드 (7.0 ml, 58.9 mmol) 용액에 메탄올 (50 ml) 내에 사이클로엑산-1,2-디온 (6.0 g, 53.5 mmol)의 용액을 천천히 추가하였고, 생성된 혼합물은 16시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응 혼합물은 물에 붓고, 디에틸 에테르로 추출하였다. 유기층은 포화된 암모늄 카보네이트용액 및 물, 염수로 세척하였다. MgSO4로 건조 후, 용매는 감압하에 제거하여, 2,2-디메톡시사이클로헥산-1-온을 수득하였다(quantitative yield).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 3.14 (s, 6H), 2.39 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.85 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.77 - 1.68 (m, 2H), 1.68 - 1.60 (m, 2H).
단계 2. 6-(4,5,6,7-테트라하이드로-1 H -벤조[ d ][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민
이소프로판올 (100 ml) 내에 2,2-디메톡시사이클로헥산-1-온 (5.6 g, 35.4 mmol)의 용액에 4-메틸벤젠설포노하이드라지드 (6.0 g, 32.2 mmol)을 첨가하였고, 30분 동안 상온에서 교반하였다(이 단계에서, 4-메틸벤젠설포노하이드라지드의 소모가 관찰되었다). 혼합물에 피리딘-2,6-디아민 (3.86 g, 35.4 mmol) 및 트리에틸아민 (4.9 ml, 35.4 mmol)을 첨가하였다. 140℃에서 3시간 후, 상온으로 냉각한 후, 반응 혼합물은 디클로로메탄 및 물 사이에서 나누어졌고, 그 다음 유기층이 분리되었다. 수층은 디클로로메탄으로 두 번 더 추출되었고, 혼합된 유기 추출물은 염수로 세척하고 MgSO4로 건조하고 농축되었다. 생성물은 실리카겔을 이용한 플래시 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트 100/0->50/50)을 이용하여 정제하여, 6-(4,5,6,7-테트라하이드로-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민(중간체 3, 3.0 g, 43%)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.59 (t, J = 7.9 Hz, 1 H), 6.99 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 6.48 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 6.33 (s, 2 H), 3.03 (d, J = 3.2 Hz, 2 H), 2.68 (s, 2 H), 1.84 - 1.72 (m, 4 H); LCMS [M+H]; 216.27.
실시예 1. N -(6-(1 H -벤조[ d ][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)-5-(4-사이클로프로필-1 H -이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸벤즈아미드
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000018
상기 반응식에 따라서 실시예 1 화합물을 제조하였다.
DMF (3 mL) 중 6-(1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민 (중간체 1, 70 mg, 0.33 mmol), DMAP (400 mg, 3.30 mmol) 및 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸벤조익 산 (130 mg, 0.50 mmol) [purchased from AA blocks (5 g), Labnetwork (10 g), Chemscene; reference: WO 2013/112741]의 교반된 용액에, HATU (1.25 g, 3.30 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 12시간 동안 상온에서 교반한 후, 에틸 아세테이트 및 포화 NaHCO3 수용액으로 희석하였다. 분리된 유기층은 염수로 세척하고, 무수 MgSO4로 건조시킨 후, 여과하였다. 유기 여과액은 감압 하에서 증발시켰다. 수득한 물질은 실리카겔을 이용한 플래시 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography) (에틸 아세테이트/메탄올 100/0->90/10) 및 C18-역상 HPLC (완충 용매로 H2O 중 % TFA 및 ACN 중 0.1% TFA 이용)을 이용하여 정제하여, N-(6-(1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)-5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸벤즈아미드를 수득하였다(1, 35 mg, 23%).
1H NMR (300 MHz, Methanol-d 4) δ 9.07 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.84 (dd, J = 8.4, 1.0 Hz, 1H), 8.29 (dd, J = 7.6, 1.3 Hz, 1H), 8.18 - 8.04 (m, 3H), 7.97 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.70 - 7.63 (m, 1H), 7.60 - 7.56 (m, 1H), 7.56 - 7.50 (m, 1H), 7.47 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.12 - 2.01 (m, 1H), 1.19 - 1.10 (m, 2H), 0.91 (dt, J = 7.0, 4.7 Hz, 2H); LCMS: 454.6 [M+H+].
실시예 2. 5-(4-사이클로프로필-1 H -이미다졸-1-일)- N -(6-(5,6-디하이드로사이클로펜타[ d ][1,2,3]트리아졸-1(4 H )-일)피리딘-2-일)-2-플루오로-4- 메틸벤즈아미드
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000019
시판되는 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸벤조산(0.38g, 1.3mmol)의 교반 용액을 포함하고 있는 NMP(3.0ml)에 DMAP(0.36g, 3.0mmol)를 가한 후 실온에서 T3P(50% 에틸 아세테이트)(1.27ml, 2.0mmol)를 천천히 가하였다. 결과 혼합물을 10분간 교반하고 6-(5,6-디하이드로사이클로펜타[d][1,2,3]트리아졸-1(4H)-일)피리딘-2-아민(0.2g, 1.0mmol)을 첨가하고 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 냉수로 퀀칭하고 포화 NaHCO3 수용액으로 염기화(pH 7-8)하였다. 얻어진 고체를 여과하고 물로 세척하고 건조시켰다. 고체를 에틸 아세테이트로 삼투시켜 원하는 5-(4-시클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-N-(6-(5,6-디하이드로사이클로펜타[d][1,2,3]트리아졸-1(4H)-일)피리딘-2-일)-2-플루오로-4-메틸벤자마이드 화합물을 순수한 백색 고체(0.3g, 68%)로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.96 (s, 1 H), 8.19 - 8.08 (m, 2 H), 7.78 (dd, J = 7.6, 1.0 Hz, 1 H), 7.69 (d, J = 1.4 Hz, 1 H), 7.63 (d, J = 6.6 Hz, 1 H), 7.48 (d, J = 10.8 Hz, 1 H), 7.18 (d, J = 1.4 Hz, 1 H), 3.14 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 2.78 - 2.70 (m, 2 H), 2.67 - 2.57 (m, 2 H), 2.25 (s, 3 H), 1.85 (td, J = 8.3, 4.1 Hz, 1 H), 0.83 - 0.77 (m, 2 H), 0.73 - 0.67 (m, 2 H): LCMS; [M+H]+ 444.6.
실시예 3. 5-(4-사이클로프로필-1 H - 이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸- N -(6-(4,5,6,7-테트라하이드로-1 H -벤조[ d ][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)메틸벤즈아미드
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000020
시판되는 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸벤조산(3.93 g, 15.1 mmol)의 교반 용액을 포함하고 있는 NMP(30 ml)에 DMAP(4.25 g, 34.8 mmol)를 가한 후 실온에서 T3P(50% 에틸 아세테이트)(14.7 g, 23.2 mmol)를 천천히 가하였다. 결과 혼합물을 10분간 교반하고 6-(4,5,6,7-테트라하이드로-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-아민(2.5g, 11.6mmol)을 첨가하고 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 냉수로 퀀칭하고 포화 NaHCO3 수용액으로 염기화(pH 7-8)하였다. 얻어진 고체를 여과하고 물로 세척하고 건조시켰다. 고체를 메탄올로 삼투시켜 원하는 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸-N-(6-(4,5,6,7-테트라하이드로-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)벤자미드 화합물을 백색 고체(5.0g, 94%)로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.03 (s, 1 H), 8.19 (dd, J = 8.3, 0.9 Hz, 1 H), 8.12 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.75 (dd, J = 7.8, 0.8 Hz, 1 H), 7.70 (d, J = 1.5 Hz, 1 H), 7.63 (d, J = 6.5 Hz, 1 H), 7.48 (d, J = 10.7 Hz, 1 H), 7.18 (d, J = 1.4 Hz, 1 H), 3.11 (d, J = 5.3 Hz, 2 H), 2.70 (d, J = 4.6 Hz, 2 H), 2.25 (s, 3 H), 1.90 - 1.82 (m, 1 H), 1.81 - 1.75 (m, 4 H), 0.84 - 0.78 (m, 2 H), 0.73 - 0.67 (m, 2 H). LCMS [M+H]; 458.57.
실시예 4. 5-(4-사이클로프로필-1 H -이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸- N -(6-(5,6,7,8-테트라하이드로사이클로헵타[ d ][1,2,3]트리아졸-1(4 H )-일)피리딘-2-일)벤즈아미드
중간체 1 대신 중간체 4를 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸-N-(6-(5,6,7,8-테트라하이드로사이클로헵타[d][1,2,3]트리아졸-1(4H)-일)피리딘-2-일)벤즈아미드를 수득하였다(13%).
1H NMR (400 MHz, Methanol-d 4) δ 9.03 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.11 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.57 - 7.52 (m, 1H), 7.46 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 3.18 - 3.12 (m, 2H), 2.94 - 2.89 (m, 2H), 2.32 (s, 3H), 2.08 - 2.01 (m, 1H), 1.96 - 1.88 (m, 2H), 1.82 - 1.73 (m, 4H), 1.16 - 1.10 (m, 2H), 0.92 - 0.87 (m, 2H); LCMS: 472.5 [M+H+].
실시예 5. 5-(4- 사이클로프로필-1 H -이미다졸-1-일)-2-플루오로 - N -(6-(4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1 H -사이클로옥타[ d ][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)-4-메틸벤즈아미드
실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-N-(6-(4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-사이클로옥타[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)-4-메틸벤즈아미드를 수득하였다(4%).
1H NMR (500 MHz, Methanol-d 4) δ 9.10 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.38 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 8.11 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.58 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 3.25 - 3.20 (m, 2H), 2.97 - 2.92 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.08 - 2.02 (m, 1H), 1.96 - 1.89 (m, 2H), 1.82 - 1.75 (m, 2H), 1.59 - 1.54 (m, 2H), 1.54 - 1.48 (m, 2H), 1.18 - 1.11 (m, 2H), 0.94 - 0.88 (m, 2H); LCMS: 486.5 [M+H+].
하기 표 1에 실시예 1 내지 5에서 제조한 화합물의 구조식을 정리하여 나타내었다.
[표 1]
Figure PCTKR2024010056-appb-img-000021
실험예 1. ASK1 저해 활성 확인
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 ASK1 활성 억제능을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
재조합 인간 ASK1 단백질은 반응액 (8 mM MOPS pH 7.0, 0.2 mM EDTA, 0.33 mg/mL myelin basic protein, 10 mM Mg Acetate and [gamma-33P]-ATP)에서 Mg/ATP 혼합액을 첨가함에 의해 반응을 개시하고, 실온에서 40분간 반응한 후 0.5% phosphoric acid를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 이후 P30 점적필터에 10uL의 반응액을 떨어뜨린 후 0.425% phosphoric acid에서 4분간, 총 4회 세척하여 methanol에 넣어 말리고 신틸레이션 계수(scintillation counting)을 통해 ASK1의 활성을 측정하였다. 화합물이 포함되지 않은 군에서 나온 활성 값을 100%로 정하여 화합물에 의한 ASK2 저해 정도를 환산하고 하기 표 2에 실시예 화합물의 ASK1 저해 활성을 정리하였다.
실시예 Remaining kinase activity (%) at 0.5uM IC50 (nM)
1 14 235
2 2 37
3 7 73
4 - 92
5 - 198
비교예1(Selonsertib) 0 107
상기 표 2를 살펴보면, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 ASK1 저해 활성을 가지는 물질임을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 화합물은 ASK1으로부터 유발되는 신경퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 2. MPP+ 유도된 인간 신경세포에서의 세포보호효과 평가
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물에 대해 도파민성 신경세포의 손상을 보호하는 효과를 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
SH-SY5Y 세포를 ATCC에서 구입하였으며, 10% FBS 및 1% 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 RPMI 배지에서 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. MPP+는 sigma aldrich에서 구입하였으며, 5 mM로 처리하여 세포독성을 유발하였다. 세포생존율은 CCK-8 시약을 처리하고 1-3시간 후 540nm에서의 흡광도를 측정하여, 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.
실시예 SH-SY5Y에서의 EC50 (nM)
2 64
3 23
비교예 1 (Selonsertib) 89
상기의 표 3 및 도 1에 나타난 바와 같이, SH-SY5Y 세포에서 본 발명의 실시예 화합물은 우수한 세포 보호 효과를 나타내었으며, 특히 실시예 2 및 3은 비교예 1(Selonsertib) 보다 우수한 EC50 값을 보였다.
실험예 3. 세포 생존율 평가
화합물 처리시 세포 생존율을 평가하기 위해 BV2세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 2x104개씩 시딩(seeding)하고 하루 동안 배양한 후, 화합물을 각각 0.1 μM, 0.3 μM 및 1 μM로 처리 후 37℃의 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다. 세포 생존율을 배양이 끝난 세포에 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; LPS solution, Seoul, Korea)을 첨가한 후 Hidex sense microplate reader (Hidex, Turku, Finland)를 사용해 565 nm 파장에서 측정된 흡광도를 사용해 정량화 하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 화합물은 비교예 1(selonsertib)과 유사한 수준의 세포 생존율을 보였다.
실험예 4. 항염증 효능 평가
BV2 세포(well 당 2 x 104 세포)를 96-well 배양 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 각각 0.1 μM, 0.3 μM 및 1 μM로 1시간 동안 실시예 화합물을 처리한 후 LPS 100 pg/ml을 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 conditioned medium (CM)을 수확하여 2000 rpm에서 원심분리 하였다. 원심분리가 끝난 용액의 상층액을 분리한 후 그 상층액에서 세포 배양 배지에서 분비되는 TNF-α는 해당 ELISA 키트(LABISKOMA, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 화합물은 selonsertib(비교예 1)과 유사한 수준으로 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인 TNF-α의 분비를 감소시켰다. 특히 실시예 3은 selonsertib과 비교하여 모든 농도에서 TNF-α 분비를 감소시키는 것을 확인하여, 우수한 항염증 효능을 가진다는 것을 확인하였다.
실험예 5. 신경세포 보호 효능 평가
신경세포 독성을 일으키는 물질인 6-OHDA(6-hydroxydopamine hydrobromide)와 MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium)은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA)에서 구매해 100 mM DMSO stock으로 만들어 사용하였다. PC12 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1x104개씩 시딩하고 하루 간 배양하였다. 세포를 각 농도의 실시예 화합물과 함께 1시간 동안 전처리하였다. 그 후, 각각 40 μM 6-OHDA와 2 mM의 MPP+를 첨가해 24시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT (Invitrogen, MA, USA)를 이용해 세포 생존율을 측정했다.
표 4 및 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 화합물은 비교예 1(selonsertib)보다 뛰어난 세포 생존율을 보였으므로, PC-12 cell line에서 뛰어난 신경세포 보호 효과가 있음을 확인하였다.
Group control 6-OHDA 비교예 1 (μM)
(Selonsertib)		 실시예 3 (μM) 실시예 2 (μM)
(40 μM) 0.1 0.3 1 0.1 0.3 1 0.1 0.3 1
AVE 100 81.51 87.91 89.18 84.09 89.95 91.98 92.77 88.85 91.49 96.78
STDEV 0.9 1.83 0.92 1.12 2.31 1.37 1.02 2.85 2.33 1.42 1.28
Group Control MPP 비교예 1 (μM)
(Selonsertib)		 실시예 3 (μM) 실시예 2 (μM)
(2 mM) 0.1 0.3 1 0.1 0.3 1 0.1 0.3 1
AVE 100 80.09 83.58 81.31 81.31 87.4 87.56 89.89 83.87 91.71 92.44
STDEV 1.74 2.37 2.39 1.94 1.40 3.72 1.02 1.55 2.98 0.23 2.07
실험예 6. TG 합성 억제 효과 평가
Triglyceride(TG) 측정은 인간 간암세포중인 HepG2 세포를 96-웰 플레이트에 각 웰 당 2x104 세포를 분주해 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 농도 별로 실시예 화합물을 2시간 전처리 한 후, Palmitic acid (PA, sigma, #P9767)와 Oleic acid (OA, sigma, #O7501)를 1:2 비율로 혼합한 Free fatty acid (FFA)를 1mM 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 상층액을 분리해 Triglyceride Quantification Kit(sigma, #MAK266)을 이용해 570nm의 흡광도에서 측정하였다.
하기 표 6에 나타낸 것과 같이, 항-NASH(비알콜성지방간염) 효능은 TG 합성 억제를 이용해 검증하였다. 실험 결과, 실시예 3 화합물은 처리 농도가 증가할수록 더 우수한 TG 합성 억제 효과를 나타내었다.
HepG2 FFA 1mM +
실시예 3 (0 μM)		 FFA 1mM +
실시예 3 (0.3 μM)		 FFA 1mM +
실시예 3 (1 μM)
Cell Viability (% of HepG2 control) 100 93.97 99.06 93.10
TG Level(% of HepG2 control) 100 125.86 117.38 * 106.59 *
실험예 7. MDR-MDCK 세포막 투과도 평가
MDR-MDCK 세포 단일층을 통한 투과도를 측정하기 위해 MDCK-MDR1 세포(5Х105 cells/mL)를 24-transwell plate(Corning, NY, USA)에 4일 동안 배양하였다. 배지는 이틀에 한 번 새 배지로 교체하였으며, 상피조직 간 전기저항(TEER) 값은 Millicell® ERS-2 Volohmmeter(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)를 이용하여 측정하여, 이 값이 300 Ohm.cm2 이상임을 확인한 후 세포막 투과도 시험을 수행하였다.
apical 및 basolateral chamber는 DPBS buffer, 10 mM Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid(HEPES)를 포함한 Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 순서로 각각 2번씩 세척하였으며, 마지막 세척 단계에서는 HBSS를 채워 37℃에서 30분 동안 안정 상태를 유지하였다. 30분 경과 후 시험물질을 각 chamber에 점적한 후 37℃에서 2시간 동안 방치하며 이동한 층의 배양액을 30분 간격으로 수거하였고, 수거한 양만큼 새 HBSS로 보충해 주었다.
겉보기 투과도 계수 (Papp, cm/sec)는 다음 공식을 사용하여 계산하였다:
[수학식 1]
Papp =dQ/dt Х 1/A Х 1/C_0
* Papp : 겉보기 투과 계수 (Apparent permeability)
* dQ/dt : 해당 약물의 투과도
* A : 세포가 깔리는 필터 막의 면적
* C_0 : 약물 초기 농도
또한, 유출 비율 (Efflux ratio)은 아래와 같이 계산하였다.
[수학식 2]
Efflux ratio (ER) = (Papp (Basolateral to Apical))/(Papp (Apical to Basolateral))
실시예
 Papp (X 10-6 cm/sec) Efflux ratio
A to B B to A
2 93.2 ± 11.2 99.1 ± 16.8 1.06
3 67.3 ± 12.8 74.8 ± 12.3 1.13
4 57.3 ± 4.23 87.4 ± 3.39 1.53
비교예1 (Selonsertib) 3.82 ± 0.66 102 ± 2.97 27
표 7에 나타난 바와 같이, 비교예 1 화합물(Selonsertib)은 흡수 방향과 유출방향의 겉보기 계수의 큰 차이로 인해 27의 유출계수를 나타내 유출 수송체의 기질임이 확인된 반면, 본 발명에 따른 실시예 화합물들은 흡수 및 유출방향 모두 매우 높은 겉보기 배수 값과 1에 가까운 유출 비율을 나타내어 세포막 투과가 용이하며, 유출수송체의 기질이 아님을 확인하였다.
실험예 8. 마우스 뇌 내 분포
ICR 마우스에서의 혈액-뇌 장벽 투과율은 10 mg/kg의 시험물질을 경구 투여하여 확인하였다. 수컷 C57BL/6 마우스는 투여 전 15시간 동안 절식시켰다. 시험물질은 10 mg/kg의 용량과 5 mL/kg의 부피로 투여되었으며, 투여 용매 조성은 N-Methyl-2-pyrrolidone, NMP), Polyethylene glycol 400(PEG 400), 3차 증류수 (Distilled water, D.W)를 각각 10:40:50 (%)의 부피비로 제조하였다. 투여 후에는 1, 4, 8시간에 해당하는 타임 포인트 별로 마우스를 이산화탄소 흡입법으로 희생시켜 혈액 및 뇌조직 샘플을 취하였다. 전혈은 복대정맥에서 채취되었으며, 식염수로 전신 관류를 시켜 혈액을 최대한 제거한 후 뇌 샘플을 수거하였다.
마우스 혈장 및 뇌에서의 분포 비율은 각 조직에서의 농도 정량 후 AUC를 산출하여 계산하였다.
[수학식 3]
Kp = (Total brain AUC)/(Total plasma AUC)
화합물
 AUCinf (ug*h.ml or ug*h.g) Kp
혈장 뇌
실시예 3 320 ± 74.8 6.61 ± 1.75 0.021
비교예1 (Selonsertib) 69.9 ± 3.48 0.26 ± 0.03 0.004
표 8에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 3은 비교예 1 (Selonsertib)에 비해 혈장 및 뇌 중 농도와 Kp 값이 상대적으로 매우 높았으므로, 뇌질환 치료를 위해 우수한 약동학적 특성을 가지고 있음을 확인하였다.
실험예 9. MPTP-유도 파킨슨병 마우스 모델에 대한 효능 평가
실험예 9.1. 실험 준비
본 명세서에 기재된 모든 동물 실험은 윤리위원회(IACUC)의 승인을 받아 식약처의 실험동물 관리 및 사용에 관한 지침에 따라 수행하였다.
코아텍(Koatech, 한국)에서 생후 6주령의 C57BL/6 수컷 마우스를 구입하였다. 마우스는 케이지당 최대 4마리씩 그룹을 지어 온도 (22±1℃)와 습도 (30~50%)가 조절된 환경에서 일반적인 명암 주기(08:00~20:00)로 사육했으며 음식과 물을 무제한(Ad libitum)으로 제공하였다. 실험 시작 전 1주일 동안 마우스가 적응할 수 있도록 하였다.
정상 마우스 및 MPTP(1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘)에 의해 유도된 파킨슨병(PD) 마우스 모델에 대하여 시험 약물을 투여하고 효능을 평가하였다. 실시예의 화합물에 대하여 10% NMP, 40% PEG 400 및 50% D.W.(증류수)를 전달체(vehicle)로 사용하여 시험 약물을 준비하였다.
평가 결과에서 모든 값은 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표시하였으며, LSD(Least Significant Difference: 최소 유의차) 사후 분석(post hoc)을 통한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 통계적으로 분석되었다. 평가 결과의 유의 수준(Significance level)은 하기 기준에 따라 책정하였다.
G1 대비 유의 수준 - *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001
G2 대비 유의 수준 - #: p < 0.05, ##: p < 0.01, ###: p < 0.001
실험예 9.2. 실험 설계
도 3은 MPTP-유도 PD 마우스 모델에 대한 효능 실험의 모식도이다.
생후 7주령의 마우스를 아래 표 9과 같이 7개군으로 나누어 급성 MPTP 모델 생성 및 약물 투여를 진행하였다: 대조군 + vehicle (G1), MPTP + vehicle (G2), MPTP + 닐로티닙 (Nilotinib) 40 mg/kg (G3), MPTP + 실시예3 2 mg/kg (G4), MPTP + 실시예3 10 mg/kg (G5), MPTP + 실시예3 50 mg/kg (G6) 및 MPTP + 실시예2 50 mg/kg (G7). 시험 약물을 1일차부터 7일차까지 1일 1회(QD) 10 ml/kg씩 경구 투여(PO)하였으며. 급성 MPTP 모델은 대조군을 제외한 모든 그룹은 0일차에 2시간 간격으로 MPTP.HCl (유리 염기 20 mg/kg)을 복강 내(IP) 주사로 4회 투여하였다. 대조군에는 동일한 양의 0.9% 식염수를 투여하였다. 폴 테스트(Pole test)는 4일차 (2일차 및 3일차 훈련 후)에 실시하였다. 7일차에 모든 마우스를 안락사시키고 뇌를 채취하였다.
연구 기간 동안 매일 체중을 측정하고 마우스의 상태에 이상이 없는지 검사하였다. 마우스의 전반적인 건강 상태가 현저히 악화되는 경우, 마우스를 안락사 시키고 연구 대상에서 제외하였다.
그룹 개체수 유형 투여 약물 투여 방법 투여량
G1 12 식염수 전달체 PO, QD -
G2 12 MPTP 전달체 PO, QD -
G3 11 MPTP Nilotinib PO, QD 40 mg/kg
G4 12 MPTP 실시예3 PO, QD 2 mg/kg
G5 12 MPTP 실시예3 PO, QD 10 mg/kg
G6 12 MPTP 실시예3 PO, QD 50 mg/kg
G7 11 MPTP 실시예2 PO, QD 50 mg/kg
실험예 9.3. 행동 결함 개선 효능 평가
케이지에 수직 나무 기둥(마우스에 그립감을 제공하는 직경 0.8 cm 내지 1 cm, 길이 80 cm)을 바닥에 놓고 테스트하였다. 마우스는 이틀 연속(2일차, 3일차) 훈련을 받았으며 각 훈련 세션은 세 번의 시험으로 구성하였다. 3일차 (실제 시험일인 4일차)에는 마우스를 기둥 끝부분에 놓고 꼭대기를 돌아 기둥 아래까지 도달하는 총 시간을 측정하되, 꼭대기에서 회전하기(turn down, 마우스가 고개를 아래로 돌리는 데 걸린 시간), 내려오기(climb down, 고개를 숙인 시점부터 바닥에 닿는 데 걸린 시간) 및 바닥에 닿는 데 걸린 총 시간(total time)을 구분하여 기록하고 도 4의 그래프를 얻었다.
도 4는 MPTP-유도 PD 마우스 모델에 대한 행동 결함 평가(폴 테스트) 결과 그래프이다. 폴 테스트에서 MPTP를 처리한 그룹(G2)은 대조군(G1)에 비해 회전(도 4의 a), 하강(도 4의 b) 및 지면에 도달하는 총 시간(도 4의 c)이 훨씬 더 많이 소요된 것이 확인되었다. MPTP와 실시예 화합물을 처리한 그룹(G4 내지 G7)은 그룹 G2에 비해 회전하는 데 필요한 시간이 현저히 감소하였다. 특히, 그룹 G4 및 G5에서 현저한 회전, 하강 및 지면 도달 시간이 감소하였다. 이를 통해, 실시예 화합물이 유의미하게 행동 결함을 개선시키는 것이 확인되었다.
실험예 9.4. TH 염색 정도 평가
조직학적 절편의 염색 및 분석을 위한 조직 샘플 수집을 위해 마우스를 졸레틸 투여로 안락사 시켰다. 마우스의 심장에서 혈액을 채취한 후 PBS(인산염 완충 식염수)로 잔여 혈액을 관류하였다. 절반의 마우스(n=6/그룹)에 대해 뇌를 선조체, 흑질 및 나머지 뇌로 절개하여 급속 냉동한 후 -80℃에서 보관하였다. 나머지 마우스(n=6/그룹)는 뇌를 분리하여 4% 파라포름알데히드에 4℃에서 24시간 동안 고정시킨 다음, 0.02% 소듐 아자이드(sodium azide)가 포함된 PBS(인산염 완충 식염수)에 30% 자당 (sucrose)을 넣고 4℃에서 3일 동안 보관하였다. OCT(Optimal cutting temperature) 화합물이 내장된 뇌 샘플에 대해 면역조직화학적 절편을 수행하였다. 샘플은 Leica CM1950(독일 라이카 마이크로시스템즈)을 사용하여 20μm 두께로 절편화하고, 항체로 염색할 때까지 보존액에 담아 4℃에서 보관하였다.
TH(티로신 하이드록실라제)는 아미노산인 L-티로신을 L-3,4-디하이드록시 페닐알라닌(L-DOPA)으로 전환하는 촉매 효소로서 도파민(DA)을 포함한 카테콜아민 생합성에서 가장 중요한 요소 중 하나이다. TH의 발현이나 활성의 변화는 DA 생성에 큰 영향을 미치므로 파킨슨병의 발병 기전에서 매우 중요하다.
뇌의 선조체와 흑질을 염색하고 현미경 슬라이드에 장착한 후, 슬라이드를 0.3% 트리톤 X-100과 퍼옥시다아제 블록을 함유한 PBS로 실온에서 15분 동안 세척하였다. 슬라이드를 0.3% 트리톤 X-100을 함유한 PBS로 3회 세척한 후 PBS, 5% 정상 염소 혈청 (normal goat serum) 및 0.3% 트리톤 X-100을 함유한 용액에서 1시간 동안 RT(실온)에서 블로킹하였다. 티로신 하이드록실라제 항체를 1:1000으로 희석하고 4℃에서 하룻밤동안 배양(incubation) 하였다. 슬라이드를 PBS 용액으로 세척하고 2차 항체와 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 슬라이드를 PBS 용액으로 세척하고 섹션을 용액에 넣어 DAB(디아미노벤지딘) 반응을 진행하였다.
현미경으로 2분 내지 3분 동안 DAB 반응을 모니터링하고 DAB 반응을 멈추기 위해 슬라이드를 PBS로 세척하고 탈수한 후 자일렌을 사용하여 마운팅하였다. 올림푸스 현미경(Olympus, SZ61, BX51)을 사용하여 TH 염색 이미지를 시각화하였다. 양성 TH 염색의 OD(optical density) 값을 선조체와 흑질에서 측정하고 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 5a 및 도 5b는 선조체에 대한 TH 염색 면역조직화학 분석 결과이며, 도 6a 및 도 6b는 흑질에 대한 TH 염색 면역조직화학 분석 결과이다. 선조체 및 흑질에서 MPTP를 처리한 그룹(G2)의 TH 수준은 대조군(G1)에 비해 유의하게 낮게 나타났다. 닐로티닙을 처리한 그룹(G3)의 선조체 TH 수준은 G2에 비해 유의하게 높게 나타났다. 실시예3 또는 실시예2을 처리한 그룹은 G2에 비해 선조체와 흑질 모두에서 TH 수준이 유의하게 증가하였다. 또한, G5 (MPTP + 10 mg/kg 실시예3) 및 G6 (MPTP + 50 mg/kg 실시예3)에서 선조체의 TH 수준과 G5, G6 및 G7 (MPTP + 50 mg/kg 실시예2)에서 흑질의 TH 수치는 대조군(G1)에 비해 유의하게 높게 나타났다.
실험예 9.6. 도파민 증가 효능 평가
적출한 뇌조직의 선조체와 흑질에 대하여 Agilent 1290 (LC)와 SCIEX QTARP 6500 + (QQQ)를 이용하여 LC-MS/MS 분석을 통해 도파민 양을 측정하였다.
도 7은 MPTP-유도 PD 마우스 모델의 선조체와 흑질에서의 그룹별 도파민 양 그래프이다. 도 7을 참고하면, 실시예2 50 mg/kg 투여군에서는 선조체와 흑질 모두에서, 실시예3 2 및 10 mg/kg 투여군에서는 흑질에서 MPTP 단독 투여군 대비 도파민 농도가 유의하게 증가하였다. 이를 통해, 실시예 화합물이 도파민 양을 유의미하게 증가시키는 것이 확인되었다.
실험예 10. α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에 대한 효능 평가
실험예 10.1. 실험 준비
미국 샌디에이고 UCSD(University of California San Diego)에서 획득한 mThy-1α-syn 형질전환 (α-syn TG; Line 61번) 암컷과 C57BI/6 X DBA/2 F1 WT (야생형)수컷을 교배하여 오송첨단의료산업진흥재단 (KBIOHealth) 동물센터에서 사육하였다.
모든 마우스는 온도(22±1℃)와 습도(30~50%)가 조절된 환경에서 일반적인 명암 주기(08:00~20:00)로 사육했으며 음식과 물을 무제한 (Ad libitum)으로 제공하였다. 생후 15일령 내지 21일령에 귀 표식을 하고 귀 또는 꼬리 샘플을 채취하여 유전자형 분석을 위한 PCR(polymerase chain reaction) 분석을 실시하였다. 또한 필요한 경우 유전자형 확인을 위해 종료 지점에서 꼬리 샘플을 수집하였다.
정상 마우스 및 α-Syn(알파-시누클레인) 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에 대하여 시험 약물을 투여하고 효능을 평가하였다. 실시예의 화합물에 대하여 10% NMP, 40% PEG 400 및 50% D.W.를 전달체로 사용하여 시험 약물을 준비하였다.
실험예 10.2. 실험 설계 및 마우스 체중 변화
도 8은 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에 대한 효능 실험의 모식도다.
생후 4개월 령의 마우스를 7개 그룹으로 아래 표 10과 같이 나누었다. 생후 4개월부터 생후 9개월까지 5개월 동안 5 mL/kg의 용액으로 경구 투여(PO)를 통해 1일 1회(QD) 시험 약물을 투여하였다. 운동 행동 테스트(빔 테스트) 및 신경학적 점수(modified Irwin test)는 4개월(투여 전), 7개월 및 9개월에 실시하였다. 최종 행동 테스트 후 조직 샘플을 채취하였다. 생후 4개월부터 연구가 끝날 때까지 일주일에 한 번 동일 요일에 체중을 측정하였다. 전반적인 건강 상태가 현저히 악화된 마우스는 연구에서 제외하였다.
그룹 개체수 유형 투여 약물 투여 방법 투여량
G1 8 WT - - -
G2 8 TG 전달체 PO, QD -
G3 8 TG Memantine PO, QD 10 mg/kg
G4 8 TG 실시예3 PO, QD 2 mg/kg
G5 8 TG 실시예3 PO, QD 10 mg/kg
G6 8 TG 실시예3 PO, QD 50 mg/kg
G7 8 TG 실시예2 PO, QD 2 mg/kg
도 9는 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델의 그룹별 체중 변화에 대한 그래프이다. 도 9를 참고하면, WT 마우스(G1)의 체중은 시간이 지남에 따라 증가한 반면, TG 그룹 (G2-7)의 체중 증가는 정체된 것이 확인되었다. WT 마우스와 TG 마우스 간의 체중 차이는 생후 약 21주 내지 22주 이후부터 뚜렷해졌으며, 약물투여는 TG 마우스의 체중에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
실험예 10.3. 신경학적 행동 개선 효과
생후 4개월 (투여 전, 기준선), 7개월 및 9개월에 마우스당 1분 내지 2분 동안 아래 표 11에 열거된 신경학적 장애 행동을 관찰하였다. 깜짝 놀람 반사 (startle reflex), 꼬리 꼬집기 반사 (tail pinch) 및 정위 반사 (righting reflex)를 제외한 신경학적 행동 장애에 대해 케이지에 있는 마우스를 직접 관찰하여 점수를 기록하였다. 깜짝 놀람 반사를 테스트하기 위해 작은 리모콘을 사용하여 큰 소리를 내고 점프, 정지, 빠른 눈 깜빡임 등의 행동을 확인하였다. 정위 반사의 경우, 각 마우스를 케이지에서 꺼내서 등이 바닥을 향하도록 놓고 마우스가 스스로 자세를 바로잡을 수 있도록 하였다. 꼬리 꼬집기 반사는 집게로 꼬리 끝을 부드럽게 쥐는 방법으로 테스트하였다.
운동 활동과 같은 정상적인 특징이 있거나 이상 특징이 없는 경우 0점, 경미한 이상이 관찰되면 1점, 심각한 이상이 관찰되면 2점 내지 3점을 부여하였다. 각 마우스에 대해 관찰된 모든 행동에 대한 점수를 더하고, 각 그룹에 대한 추가된 점수의 평균을 계산하였다.
# 신경학적 점수 지표 # 신경학적 점수 지표
1 두부 떨림(Head tremor) 16 발작(Seizure)
2 두부 경련(Head twitch) 17 소변 얼룩(Urine staining)
3 두부 까딱임(Head bobbing) 18 눈물흘림(Lacrimation)
4 두부 두리번거림(Head searching) 19 침흘림(Salivation)
5 몸체 떨림(Body tremor) 20 사지 벌림(Limb splay)
6 몸체 경련(Body twitch) 21 강직증(Catalepsy)
7 꼬리 떨림(Tail tremor) 22 비정상적 걸음걸이(Abnormal gait)
8 꼬리 경련(Tail twitch) 23 발끝으로 걸음(Tip toe walking)
9 꼬리 스트라우브 반응(Straub tail) 24 느리고 조심스러운 움직임(Slow, careful movements)
10 털세움(Piloerection) 25 과도한 그루밍(Excessive grooming)
11 얕은 호흡(Shallow respiration) 26 빙빙돌기, 냄새맡기(Circling, sniffing)
12 편평한 신체 자세(Flattened body posture) 27 씹기(Chewing)
13 부은 얼굴(Swollen face) 28 깜짝 놀람 반사 상실(점프, 얼어붙음, 눈 깜박임)(Loss of startle reflex (jumping, freezing, eye blinking))
14 눈꺼풀처짐(Ptosis) 29 정위반사 상실(Loss of righting reflex)
15 과민성(Irritability) 30 꼬리 꼬집기에 대한 반응 상실(Loss of response to tail pinch)
도 10은 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델의 그룹별 신경학적 행동 점수에 대한 그래프이다. 생후 4개월과 7개월에 G2의 신경학적 점수 (TG + 전달체)는 G1에 비해 유의하게 낮게 나타났다. 실시예3 또는 실시예2를 투여한 군은 G2에 비해 TG 마우스의 신경학적 점수가 유의하게 감소하였다. 그룹 G4 내지 G7의 신경학적 점수는 연구 기간 내내 전반적으로 매우 낮게 유지되었으며, 약물에 의한 신경학적 독성이 없는 것이 확인되었다.
실험예 10.4. 걸음 오류 개선 효능 평가(빔 테스트)
빔 테스트(Beam test, Challenging Beam Traversal)로 플레밍 등이 설명한 절차(J Neurosci, 24:9434-40, 2004)를 채택하였다. 운동 능력은 기존의 빔 워킹 테스트를 변형한 새로운 빔 테스트로 측정하였다. 빔은 플렉시글라스 (Plexiglas)로 제작되었으며, 각 섹션의 폭이 다른, 4개의 섹션(각 25 cm, 총 길이 1 m)으로 구성하였다. 빔은 3.5cm 너비에서 시작하여 0.5 cm × 1 cm 단위로 점차 좁아지도록 설계하였다. 빔의 상단 표면에서 1.0 cm 아래에 폭 1 cm의 선반을 배치하였다.
마우스를 가장 넓은 구간에서 시작하여 가장 좁고 어려운 구간까지 빔의 길이를 가로지르도록 훈련시켰다. 빔의 좁은 끝은 마우스의 집 케이지로 바로 연결되도록 설계하였다. 마우스를 테스트 전에 2일간 훈련시켰으며, 모든 훈련은 메쉬 그리드 없이 진행하였다. 첫날에는 마우스를 빔에 올려놓고 홈 케이지를 마우스와 가까운 곳에 배치하는 두 번의 보조 훈련을 수행하였다. 이를 통해 빔을 따라 앞으로 움직이도록 유도하였다. 두 번의 보조 훈련 후, 마우스가 빔의 전체 길이를 도움 없이 횡단할 수 있었다. 훈련 1일차에는 모든 마우스가 빔의 전체 길이에 걸쳐 5번의 보조 없이 달리기를 완료한 것을 확인하였다. 훈련 2일차에는 마우스가 5번의 시험을 수행하였다. 시험 당일에는 난이도를 높이기 위해 빔 표면 위에 해당 폭의 메쉬 격자(1 cm 정사각형)를 배치하고 격자와 빔 표면 사이에 약 1cm의 공간을 두었다. 아래 선반은 사지가 그리드에서 미끄러질 때 마우스가 사용할 수 있는 지지대로 제공했으며, 마우스가 테스트를 완료하기 위해 보상 운동 전략을 사용할 필요없이 평가할 수 있도록 하였다. 총 5회에 걸쳐 격자무늬 빔을 가로지르는 마우스의 모습을 비디오로 촬영하였다.
비디오 테이프 분석은 마우스 유전자형/그룹을 모르는 연구자가 오류에 대한 슬로모션을 확인하고, 각 마우스의 걸음 수, 5번의 실험에 걸친 횡단 시간을 평가하였다. 오류는 앞으로 이동하는 동안 사지(앞다리 또는 뒷다리)가 그리드를 통과하여 그리드와 빔 표면 사이에 보이는 경우 계수하였다. 개별 마우스는 한 걸음당 최대 4번까지 미끄러질 수 있었다. 각 사지 미끄러짐을 개별적으로 점수화하여 오류를 측정하였다. 예를 들어, 한 걸음에서 세 개의 팔다리가 그리드에서 미끄러진 마우스는 오류 점수 3점으로 평가하고, 한 걸음에서 한 개의 팔다리만 그리드에서 미끄러진 마우스는 해당 걸음에서 오류 점수 1점으로 평가하였다. 마우스가 앞으로 움직이지 않거나 마우스의 머리가 빔의 왼쪽이나 오른쪽을 향하는 경우 미끄러짐으로 계수하지 않았다. 걸음 오류의 수와 횡단하는 데 걸린 시간은 다섯 번의 실험 모두에서 측정하여 평균을 내었다.
도 11은 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델에서 그룹별 걸음 오류 평가 결과를 나타내는 그래프이다. 도 11을 참고하면, 그룹 G2는 빔 테스트에서 그룹 G1에 비해 횡단하는 동안 훨씬 더 많은 오류를 범하였다. 메만틴(G3), 실시예3(G4 내지 G6) 또는 실시예2(G7) 투여군은 7개월 및 9개월에 그룹 G2에 비해 걸음 오류 수가 현저히 감소하였다. 이를 통해, 실시예 화합물이 행동 오류를 개선시키는 것이 확인되었다.
실험예 10.5. 도파민성 신경퇴화 개선 효능 평가
생후 9개월에 측정 기간이 끝나고 마우스를 마취한 다음 IACUC 지침에 따라 심장 천자를 통해 실험을 종료하였다. 조직 염색을 위해 마우스에 0.9% 식염수를 경심 관류한 다음 4% 파라포름알데히드로 마우스가 고정될 때까지 관류하였다. 뇌를 분리하여 4% 파라포름알데히드에 4℃에서 24시간 동안 담가 고정시킨 다음, 0.02% 소듐 아자이드를 함유한 PBS에 30% 자당을 넣고 4℃에서 3일 동안 보관하였다. OCT 화합물에 내장된 뇌 샘플을 라이카 CM1950 (독일 라이카 마이크로시스템즈)을 사용하여 20μm 두께로 절편화하였다. 절편은 항체에 의해 염색될 때까지 보존액에 담아 4℃에서 보관하였다.
뇌 조직은 조직을 부드럽게 흔들면서 PBS로 10분씩 3회 세척하였다. 그 후 조직을 PBS, 10% 정상 염소 혈청 및 0.3% 트리톤 X-100을 함유한 차단 완충액에서 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 조직을 아래 표의 항체 및 희석률에 따라 1차 항체 (Iba-1, TH)와 함께 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 1차 항체 배양 후, 조직을 PBS 용액으로 세척하고 실온에서 1시간 동안 2차 항체와 반응시켰다. 그 후, 섹션을 PBS 용액으로 10분씩 3회 세척하고 슬라이드와 커버슬립에 DAPI 마운팅 용액 (VECTASHIELD, #H1500)를 사용하여 마운팅하였다.
항체 공급원 # cat 희석률
anti-tyrosine hydroxylase Abcam Ab112 1/1000
anti-Iba1 Abcam Ab283319 1/250
TH 염색된 뇌 조직은 올림푸스의 면역 형광 현미경(Olympus, BZ21)을 사용하여 이미지화하였다. 선조체의 형광 강도는 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 12a 및 도 12b는 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델의 그룹별 도파민성 신경퇴화 개선 효능 평가 결과를 나타내는 그래프 및 면역형광분석 이미지이다. 도 12a 및 도 12b를 참고하면, 그룹 G2 선조체의 TH 염색 강도는 그룹 G1에 비해 낮은 경향을 보였다. 메만틴이 아닌 실시예3 또는 실시예2 투여군(그룹 G4 내지 G7)의 TH 염색 강도는 그룹 G2에 비해 유의하게 높게 나타났다. 그룹 G7 (TG + 실시예2)의 TH 염색 강도 또한 그룹 G2에 비해 유의하게 높게 나타났다. 이로써, 실시예 화합물이 도파민성 신경퇴화를 유의미하게 개선시킬 수 있는 것이 확인되었다.
실험예 10.6. 미세아교세포 감소 효능 평가
피질의 미세아교세포증을 평가하기 위해 올림푸스의 면역 형광 현미경(Olympus, BZ21)을 사용하여 실험예 10.5.에서 Iba-1 염색된 뇌 조직을 이미지화하였다. Iba1 정량화를 하기 위해 각 마커를 수동으로 카운트하였다.
도 13a 및 도 13b는 α-Syn 형질전환 파킨슨병 마우스 모델의 그룹별 미세아교세포 감소 효능 평가 결과를 나타내는 그래프 및 면역형광분석 이미지이다. 도 13a 및 도 13b를 참고하면 대뇌 피질에서 Iba-1 양성 세포의 수는 메만틴(G3), 실시예3 2 mg/kg 및 10 mg/kg (G4 및 G5) 및 실시예2 2 mg/kg (G7) 투여 그룹에서 유의하게 감소하였다. 이를 통해, 실시예 화합물이 미세아교세포를 유의미하게 감소시키는 것이 확인되었다.
실험예 11. SOD1 G93A 형질전환 근위축성 측삭경화증 마우스 모델에 대한 효능 평가
실험예 11.1. 실험 준비
잭슨 연구소에서의 G93A SOD1 (high-copy SOD1-G93A, 25 TG 카피의 G1H, 재고번호 002726) 수컷과 B6SJL 균주 배경 (non-carrier, WT) 암컷을 교배하여 실험용 F1 마우스를 생성하였다. 모든 마우스는 온도(22±1℃)와 습도(30~50%)가 조절된 환경에서 일반적인 명암 주기(08:00~20:00)로 사육했으며 음식과 물을 무제한(Ad libitum)으로 제공하였다. 생후 15~21일령에 귀 표식을 하고 귀 또는 꼬리 샘플을 채취하여 유전자형 분석을 위한 PCR 분석을 실시하였다. 또한 필요한 경우 유전자형 확인을 위해 종료 지점에서 꼬리 샘플을 수집하였다.
정상 마우스 및 SOD1 G93A 형질전환 근위축성 측삭경화증(ALS: Amyotrophic Lateral Sclerosis) 마우스 모델에 대하여 시험 약물을 투여하고 효능을 평가하였다. 실시예의 화합물에 대하여 10% NMP, 40% PEG 400 및 50% D.W.를 전달체로 사용하여 시험 약물을 준비하였다.
실험예 11.2. 실험 설계
도 14는 SOD1 G93A 형질전환 ALS 마우스 모델에 대한 효능 실험의 모식도다.
생후 8주령의 마우스를 아래 표 13의 3개 그룹으로 나누었다. 생후 8주령에서 사망할 때까지 5 mL/kg의 용액으로 경구 투여(PO)를 통해 1일 1회(QD) 시험 약물을 투여하였다. 체중은 매주 측정하고, 질병 발병(disease score)는 8주부터 동물이 사망할 때까지 매일 측정하였다. 운동 행동 테스트(악력, grip strength) 및 신경학적 점수 테스트(modified Irwin test)는 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21주에 각각 실시하였다. 마우스의 생존 여부는 매일 모니터하였다. 마우스의 전반적인 건강 상태가 현저히 악화된 경우, 연구에서 제외시켰다.
그룹 N 유형 투여 약물 투여 방법 투여량
G1 12 WT - - -
G2 12 TG 전달체 PO, QD -
G3 12 TG 실시예3 PO, QD 30 mg/kg
도 15는 SOD1 G93A 형질전환 ALS 마우스 모델의 그룹별 체중 변화에 대한 그래프이다. 도 15를 참고하면, Tg 그룹(G2)의 체중은 WT 그룹(G1)보다 현저히 낮게 나타났다. 반면 TG (G2)와 약물 처리군 (G3)간의 유의미한 차이는 없었으며, 실시예 화합물이 체중을 유의미하게 감소시키지 않는 것이 확인되었다.
실험예 11.3. 신경학적 행동 개선 효능 평가
실험예 10.3.과 동일한 방법으로 생후 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21주령에 마우스 당 1분 내지 2분 동안 신경학적 장애 행동을 관찰하였다.
도 16은 SOD1 G93A 형질전환 ALS 동물 모델의 그룹별 신경학적 점수에 대한 그래프이다. 도 16을 참고하면, WT 그룹 (G1)의 신경학적 점수는 연구 기간 내내 1 미만으로 매우 낮게 나타났다. 13주 이후부터 TG 그룹의 신경학적 점수는 G1 그룹보다 유의하게 높게 나타났다. 생후 19주째 이후부터 실시예3을 처리한 그룹(G3)은 G2 대비 신경학적 점수가 유의하게 감소하였다. 이를 통해, 실시예 화합물이 유의미하게 신경학적 행동을 개선시키는 것이 확인되었다.
실험예 11.4. 질병 증상 개선 효능 평가
생후 8주부터 ALSTDI(ALS Therapy Development Institute) 방법으로 개발된 신경학적 점수 시스템을 사용하여 마우스의 질병 증상을 평가하였다. 양쪽 뒷다리에 대하여 아래 표 14의 기준으로 채점하였다.
점수 기준
0 마우스를 꼬리로 매달 때 뒷다리가 측면 중앙선으로부터 멀어져 완전히 펴짐
1 꼬리로 매달 때 뒷다리가 떨림
2 꼬리로 매달 때 양 뒷발이 마주잡힘
3 걸을 때 비틀거리고 넘어짐
4 걸을 때 뒷다리 중 하나 또는 둘을 끔
5 걸을 수 없음 (마우스를 등이 바닥을 향하도록 놓을 때 30초 이내에 스스로 바로잡을 수 없음)
도 17은 SOD1 G93A 형질전환 ALS 마우스 모델의 그룹별 질병 점수 변화에 대한 그래프이다. 도 17을 참고하면, TG 그룹(G2 및 G3)의 질병 발병 점수는 WT 그룹(G1)보다 유의하게 증가하였으며 대략 15주령에 차이가 두드러지게 나타났다. 실시예3을 처리한 그룹(G3)은 G2 대비 질병 증상 점수가 관찰 기간동안 낮은 경향을 보였으며, 20주에 유의하게 감소하였다. 이를 통해, 실시예 화합물이 유의미하게 질병 증상을 개선시키는 것을 확인하였다.
실험예 11.5. 악력 개선 효능 평가
생후 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21주령의 마우스를 대상으로 악력 측정을 실시하였다. 마우스가 앞발로 작은 그물망 손잡이를 잡는 방식으로 마우스를 악력 측정 장치 (미국 샌디에이고, 샌디에이고 Instruments)에 올려놓았다. 마우스를 플랫폼으로 내려놓은 다음 마우스가 손잡이를 놓을 때까지 꼬리로 손잡이를 천천히 잡아당겼다. 장비는 자동으로 마우스의 악력 강도를 그램 단위로 측정하였다. 하루 세션에 마우스당 5개의 점수를 연속적으로 기록하였다.
도 18은 SOD1 G93A 형질전환 ALS 마우스 모델의 그룹별 악력 변화에 대한 그래프이다. 도 18을참고하면, TG 그룹의 악력은 일반적으로 시간이 지남에 따라 감소했으며 그룹 G1보다 유의하게 낮게 나타났다. 실시예3을 처리한 그룹(G3)은 그룹 G2 대비 악력이 증가하는 경향을 보이고 19주부터 유의하게 악력이 증가하였다. 이로써, 실시예 화합물이 유의미하게 악력을 개선시키는 것이 확인되었다.
실험예 11.1. 생존율 개선 효능 평가
매일 마우스의 생존 여부를 모니터링하였다. 마우스의 생존 연령을 기록하여 카플란 마이어 생존 플롯으로 표시하였다(Kaplan Meier survival plots).
도 19는 SOD1 G93A 형질전환 ALS 마우스 모델의 그룹별 생존율에 대한 그래프이다. 도 19를 참고하면, TG 그룹의 생존율은 생후 약 110일 내지 120일 사이부터 감소하기 시작하였으며, 실시예3을 처리한 그룹 (G3)은 그룹 G2 대비 유의성은 없으나 생존율이 개선되는 경향을 보였다. 이로써, 실시예 화합물이 생존율을 개선시키는 것이 확인되었다.
실험예 12. Reserpine 유도 섬유근육통 랫트 모델에 대한 효능 평가
실험예 12.1. 실험 준비
6주령 Sprague Dawley(SD) 수컷 랫트(rat)를 사용하였다. 모든 랫트는 온도(22±1℃)와 습도(30~50%)가 조절된 환경에서 일반적인 명암 주기(08:00~20:00)로 사육했으며 음식과 물을 무제한(Ad libitum)으로 제공하였다.
정상 랫트 및 Reserpine 유도 섬유근육통(Fibromyalgia) 랫트 모델에 대하여 시험 약물을 투여하고 효능을 평가하였다. 실시예의 화합물에 대하여 10% NMP, 40% PEG 400 및 50% D.W.를 전달체로 사용하여 시험 약물을 준비하였다.
실험예 12.2. 실험 설계
도 20은 Reserpine 유도 섬유근육통 랫트 모델에 대한 효능 실험의 모식도다.
Reserpine 유도 섬유근육통 모델 생성 및 약물 투여는 생후 6주령 수컷 SD 랫트를 아래 표 15와 같이 6개군으로 나누어 진행하였다: 대조군(G1), reserpine + 전달체(G2), reserpine + 가바펜틴(Gabapentin) 50 mg/kg(G3), reserpine + 실시예2 3 mg/kg(G4), 10 mg/kg(G5), 및 30 mg/kg(G6). 랫트 섬유근육통 모델을 만들기 위해, 0.5% 아세트산에 녹인 reserpine(Sigma-aldrich, 1mg/kg)을 실험 시작 3일 전부터 3일 동안 피하로 1회씩 투여하였다. 1일차부터 1일 1회(QD) 전달체, gabapentin 및 실시예2을 실험수행 2시간 전에 복강(IP) 또는 경구(PO) 투여하였다.
그룹 개체수 유형 투여 약물 투여 방법 투여량
G1 6 식염수 - - -
G2 6 Reserpine 전달체 PO, QD -
G3 6 Reserpine Gabapentin IP, QD 50 mg/kg
G4 6 Reserpine 실시예2 PO, QD 3 mg/kg
G5 6 Reserpine 실시예2 PO, QD 10 mg/kg
G6 6 Reserpine 실시예2 PO, QD 30 mg/kg
실험예 12.3. 통증 개선 효능 평가
오른쪽 뒷발 촉각 반응 테스트 (von Frey test)는 5회 (섬유근육통 모델 생성 전, 모델 생성 후 1일차, 2일차, 4일차 및 6일차) 실시하였다. 모든 행동 테스트 전에 30분 동안 랫트에게 환경에 익숙해지도록 하였고, 행동 테스트를 수행하는 모든 실험자는 약물 투여 정보를 알지 못하도록 진행하였다. 모델 생성 전에 모든 랫트에 대해 von Frey 테스트를 실시하여 기준선 측정을 수행하였다. 랫트를 유선 매쉬 위에 올려놓고 투명한 플라스틱 상자 (20 x 20 x 14cm)에 넣고, 기계적 이질통을 평가하기 위해 오른쪽 뒷발 중앙에 von Frey 필라멘트 (오름차순 무게: 0.4, 0.6, 1.4, 2, 4, 6, 8 및 15g, North Coast)를 적용하여 발 인출 역치를 측정하였다.
도 21은 Reserpine 유도 섬유근육통 랫트 모델에 대한 통증 개선 효능 평가 결과 그래프이다. 대조군 (G1)에 비해 reserpine 처리 그룹(G2)은 높은 민감도를 보였으며, 모델 생성 후 가바펜틴 처리 그룹(G3)과 실시예2 처리 그룹 (G4 내지 G6)은 시간이 지나면서 민감도가 점진적으로 개선된 것이 확인되었다. 실시예2은 용량 의존적으로 회복되는 경향을 보였으며, 30mg/kg에서 유의성 있는 효능을 나타내었다. 이를 통해, 실시예의 화합물이 유의미하게 통증을 개선시키는 것이 확인되었다.
실험예 13. CDAHFD 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델에 대한 효능 평가
실험예 13.1. 실험 준비
생후 3주령의 C57BL/6 수컷 마우스(Koatech, 한국)를 구입하였다. 마우스는 케이지당 최대 5마리씩 그룹을 지어 온도 (22±1℃)와 습도 (30~50%)가 조절된 환경에서 일반적인 명암 주기(08:00~20:00)로 사육했으며 음식과 물을 무제한 (Ad libitum)으로 제공하였다. 실험 시작 전 1주일 동안 마우스가 적응할 수 있도록 하였다.
정상 마우스 및 CDAHFD(A choline-deficient, L-amino acid-defined, high-fat diet: 콜린 결핍, L-아미노산 정의 고지방 식단)-유도 비알코올성 지방간염(NASH) 마우스 모델에 대하여 시험 약물을 투여하고 효능을 평가하였다. 실시예의 화합물에 대하여 10% NMP, 40% PEG 400 및 50% D.W.를 전달체로 사용하여 시험 약물을 준비하였다.
CDAHFD는 0.1% 메티오닌(methionine)과 60 kcal% 지방을 포함하고, 콜린(choline)이 결핍된 고지방 식단으로 제조하였다. CDAHFD를 먹인 C57BL/6J 마우스 모델은 짧은 기간에 섬유화를 동반한 지방간염이 빠르게 진행된다.
실험예 13.2. 실험 설계
도 22는 CDAHFD 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델에 대한 효능 실험의 모식도다.
CDAHFD 유도 NASH 모델 생성 및 약물 투여는 생후 3주령 C57BL/6 수컷 마우스를 아래 표 16과 같이 7개군으로 나누어 진행하였다. 대조군 (G1)은 표준 사료와 물을 먹였다. 그룹 G2 내지 그룹 G7은 CDAHFD (Research Diet Inc, #A06071302) 식이를 4주와 8주 동안 먹였다. 대조군을 제외한 각 그룹은 5주령부터 1일 1회씩 (QD) 전달체, 셀론설팁 30 mg/kg, 실시예3 10 mg/kg, 실시예3 30 mg/kg, 실시예2 10 mg/kg 및 실시예2 30 mg/kg을 경구 투여하였다.
그룹 개체수 식단 투여 약물 투여 방법 투여량
G1 10 표준 사료 - - -
G2 10 CDAHFD 전달체 PO, QD -
G3 10 CDAHFD Selonsertib PO, QD 30 mg/kg
G4 10 CDAHFD 실시예3 PO, QD 10 mg/kg
G5 10 CDAHFD 실시예3 PO, QD 30 mg/kg
G6 10 CDAHFD 실시예2 PO, QD 10 mg/kg
G7 10 CDAHFD 실시예2 PO, QD 30 mg/kg
실험예 13.3. 간 섬유화 개선 효능 평가
콜라겐 섬유의 조직학적 시각화를 위해 피크로시리우스 레드 염색(Picrosirius red staining)을 이용하였다. 조직병리학 분석을 통해 간 섬유화 개선 효능을 평가하였다.
각 군의 마우스에 대하여 4% PFA(파라포름알데히드)로 고정된 간 세 절편을 파라핀 블록으로 제작하였다. 파라핀 블록은 5μm 두께로 절편화하고(Histocore AUTOCUT R, 라이카 마이크로시스템즈, 독일), 섹션을 실란 코팅 슬라이드(MUTO, JPN)에 장착 후 염색할 때까지 보관하였다.
자일렌을 사용하여 슬라이드에서 파라핀을 제거하고 슬라이드에 수분을 공급하고 세척하였다. 슬라이드를 피크로시리우스 레드 용액 (ab150681, Abcam, 영국)으로 염색하고 아세트산 용액으로 씻어내었다. 슬라이드는 알코올과 자일렌을 사용하여 탈수 및 세척 후 장착하였다. 각 섹션에 대해 현미경(Axioscan7, 자이스, 독일)을 사용하여 서로 다른 영역의 이미지를 2장씩 촬영하였다. 섬유화 면적은 image J 소프트웨어를 사용하여 전체 면적 대비 섬유화 면적을 측정하였다.
도 23a 및 도 23b는 CDAHFD 유도 비알코올성 지방간염 마우스 모델의 간에서의 Picrosirius red 염색 면적비에 대한 그래프 및 이미지이다. 도 23a 및 도 23b를 참고하면, 그룹 G1에 비해 CDAHFD 군은 Picrosirius red 로 염색된 상대적 면적이 유의하게 높아 NASH 모델이 적절하게 형성된 것을 나타내었다. 비교약물 셀론설팁(G3)과 실시예3(G4 및 G5), 실시예2(G6 및 G7)에서 Picrosirius red 염색 면적이 유의하게 감소하였으며, CDAHFD 식이 4주 후, 실시예2 30mg/kg 투여군에서 가장 개선된 효능을 확인하였다. 이로써 실시예 화합물이 유의미하게 간 섬유화를 개선시키는 것이 확인되었다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2024010056-appb-img-000022
    상기 화학식 1에서,
    Figure PCTKR2024010056-appb-img-000023
    는 비치환 또는 치환된 페닐 또는 비치환 또는 치환된 C3-8 사이클로알케닐이고,
    상기 치환된 페닐 및 치환된 C3-8 사이클로알케닐 각각은 독립적으로 C1-6알킬, C1-6알콕시 또는 할로젠으로 치환되고;
    R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, C1-6알킬, 할로겐, C3-6사이클로알킬 또는 할로C1-6알킬이다.
  2. 제1항에 있어서,
    Figure PCTKR2024010056-appb-img-000024
    는 비치환 또는 치환된 페닐 또는 비치환 또는 치환된 C5-8 사이클로알케닐이고,
    상기 치환된 페닐 및 치환된 C3-8 사이클로알케닐 각각은 독립적으로 C1-3알킬, C1-3알콕시 또는 할로젠으로 치환되고;
    R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 H, C1-3알킬, 할로겐, C3-6사이클로알킬 또는 할로C1-3알킬인,
    화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    Figure PCTKR2024010056-appb-img-000025
    는 페닐 또는 이중결합을 1개 포함하는 C5-8사이클로알케닐이고;
    R1은 C3-6사이클로알킬이고,
    R2는 C1-3알킬이고,
    R3은 할로젠인,
    화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    Figure PCTKR2024010056-appb-img-000026
    는 페닐 또는 이중결합을 1개 포함하는 C5-8사이클로알케닐이고;
    R1은 사이클로프로필이고,
    R2는 메틸이고,
    R3은 플루오로인,
    화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는,
    화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    <1> N-(6-(1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)-5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸벤즈아미드;
    <2> 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-N-(6-(5,6-디하이드로사이클로펜타[d][1,2,3]트리아졸-1(4H)-일)피리딘-2-일)-2-플루오로-4- 메틸벤즈아미드;
    <3> 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸-N-(6-(4,5,6,7-테트라하이드로-1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)메틸벤즈아미드;
    <4> 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-4-메틸-N-(6-(5,6,7,8-테트라하이드로사이클로헵타[d][1,2,3]트리아졸-1(4H)-일)피리딘-2-일)벤즈아미드; 및
    <5> 5-(4-사이클로프로필-1H-이미다졸-1-일)-2-플루오로-N-(6-(4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-사이클로옥타[d][1,2,3]트리아졸-1-일)피리딘-2-일)-4-메틸벤즈아미드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 ASK1을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  7. 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
    화학식 2로 표시되는 화합물과 화학식 3으로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:
    [반응식 1]
    Figure PCTKR2024010056-appb-img-000027
    상기 반응식 1에서
    Figure PCTKR2024010056-appb-img-000028
    , R1, R2, 및 R3는 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다.
  8. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물.
  9. 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체, 이의 용매화물, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 ASK1 관련 질환은 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환, 자가면역 질환 또는 간 질환을 포함하는, 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 해마 경화증, 전두측두엽 치매 (FTD), 전두측두엽 변성 (FTLD), 헌팅턴병, 피질기저핵 변성, 근위축성 측삭경화증, 척수성 근위축, 운동 뉴런 질환, 봉입체 근염, 파킨슨병, 루이소체 치매, 루이소체 질환, 다계통 위축, 진행성 핵상 마비, 피크병, 프라이온병, 외상성 뇌 손상, 허혈성 및 출혈성 뇌졸중, 대뇌 허혈, 저산소증, 및 글루타메이트 신경독성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 심혈관 질환은 심부전, 허혈, 재발성 허혈, 심근경색, 부정맥, 급성 관상동맥 증후군, 당뇨병, 죽상경화증 및 간헐적 파행으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 섬유근육통, 전신홍반루푸스, 다발성 경화증, 당뇨병, 전신경화증, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 중증근무력증, 건선, 크론병, 궤양성 대장염, 시신경염, 및 쇼그렌 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 간 질환은 비알코올성 지방간(NASH), 알코올성 지방간, 간 섬유화, 간암, 간독성, 담즙울체, 간경변, 간허혈, 간 농양, 간성 혼수, 및 간 위축증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 용매화물, 입체이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료 방법.
  16. ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 이의 용매화물, 입체이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
  17. ASK1 관련 질환의 예방 또는 치료용 의약을 제조하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 이의 용매화물, 입체이성질체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013112741A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Gilead Sciences, Inc. Apoptosis signal-regulating kinase inhibitor
CN110698471A (zh) * 2018-07-10 2020-01-17 山东轩竹医药科技有限公司 Ask1抑制剂及其应用
WO2020015721A1 (zh) * 2018-07-20 2020-01-23 福建广生堂药业股份有限公司 作为ask1抑制剂的晶型及其制备方法和应用
WO2020030107A1 (zh) * 2018-08-10 2020-02-13 江苏豪森药业集团有限公司 一种含有酰胺类衍生物的药物组合物及其制备方法和应用
CN110922407A (zh) * 2018-09-19 2020-03-27 广东东阳光药业有限公司 苯甲酰氨基吡啶衍生物的晶型及其用途
CN113831323A (zh) * 2020-06-24 2021-12-24 武汉人福创新药物研发中心有限公司 芳杂环酰胺类化合物及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013112741A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Gilead Sciences, Inc. Apoptosis signal-regulating kinase inhibitor
CN110698471A (zh) * 2018-07-10 2020-01-17 山东轩竹医药科技有限公司 Ask1抑制剂及其应用
WO2020015721A1 (zh) * 2018-07-20 2020-01-23 福建广生堂药业股份有限公司 作为ask1抑制剂的晶型及其制备方法和应用
WO2020030107A1 (zh) * 2018-08-10 2020-02-13 江苏豪森药业集团有限公司 一种含有酰胺类衍生物的药物组合物及其制备方法和应用
CN110922407A (zh) * 2018-09-19 2020-03-27 广东东阳光药业有限公司 苯甲酰氨基吡啶衍生物的晶型及其用途
CN113831323A (zh) * 2020-06-24 2021-12-24 武汉人福创新药物研发中心有限公司 芳杂环酰胺类化合物及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FLEMING ET AL., J NEUROSCI, vol. 24, 2004, pages 9434 - 40
ZHANG ET AL., J CLIN INVEST., vol. 111, no. 12, 2003, pages 1933 - 1943

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