WO2025009296A1 - ヒストン脱アセチル化酵素４異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤 - Google Patents

ヒストン脱アセチル化酵素４異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤 Download PDF

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貴之 青井
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Definitions

  • the present invention relates to a preventive and/or therapeutic agent for skin disorders associated with histone deacetylase 4 abnormalities.
  • Pigment cells originate from the neural crest during development and are cells that produce melanin.
  • melanocytes are mainly found in the basal layer of the epidermis and supply melanin to the surrounding keratinocytes.
  • Melanocytes protect against ultraviolet rays by producing melanin, but UV-induced DNA damage also occurs in melanocytes.
  • XP xeroderma pigmentosum
  • the target organ where symptoms are most severe is the skin, and pigmentation abnormalities are inevitable, so analyzing the UV response of patients' melanocytes is of utmost importance in elucidating the pathology of XP.
  • XP is an autosomal recessive inherited hereditary photosensitivity disease, and is a hereditary DNA repair disorder that results in severe photosensitivity and neurological symptoms. Because the skin of XP patients is congenitally deficient in the ability to repair DNA damage caused by UV rays, severe photosensitivity to sunlight and UV rays (abnormal sunburn, pigmentation abnormalities, skin cancer in exposed areas, etc.) occurs to various degrees depending on the type of disease.
  • XP is classified into eight genetically distinct disease types, namely, groups A to G (genetic complementation group) and variant (V) type.
  • group A xeroderma pigmentosum group A: XP-A
  • type V which only has skin symptoms, accounts for approximately 25%.
  • XP-A patients which are common among Japanese people, have severe photosensitivity symptoms, and show severe sunburn symptoms immediately after birth. They also show significantly accelerated photoaging even with low levels of UV rays, i.e., severe sunburn reactions, freckle-like pigmented spots of various sizes and tones, and skin cancer in exposed areas at a young age.
  • XP-A XP-A
  • neurological symptoms such as hearing loss, slurred speech, and loss of balance become apparent from around age 6, and from around age 10, neurological symptoms such as a tendency to fall gradually begin to appear, and language function also declines as the hearing loss and intellectual disability progress.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 melanocytes and fibroblasts differ in their resistance to ultraviolet light and their response to DNA damage, so it is important to use melanocytes in XP research (Non-Patent Documents 3 to 5).
  • Histone modification is a representative molecular mechanism responsible for epigenetics. Histone modification involves histone acetyltransferase (HAT) and histone deacetylase (HDAC). HAT increases gene expression by acetylating lysine residues in histones. On the other hand, HDAC suppresses gene expression by deacetylating histones. In this way, HAT and HDAC play important roles in controlling gene transcription, and histone acetylation modification is regulated by the antagonistic actions of HAT and HDAC.
  • HAT histone acetyltransferase
  • HDAC histone deacetylase
  • HDACs There are 18 types of human HDACs, classified into four classes, class I to class IV, each with its own characteristics.
  • Class I and class II HDACs are hydrolases that have zinc in the enzymatic active site, and are characterized in terms of intracellular localization, with class I localized in the nucleus and class II localized in both the nucleus and cytoplasm.
  • HDAC4 belongs to class II.
  • the objective of the present invention is to provide a preventive and/or therapeutic agent for skin disorders associated with abnormalities in histone deacetylase 4 (HDAC4).
  • HDAC4 histone deacetylase 4
  • histone acetyltransferase inhibitors are effective in preventing and/or treating skin disorders associated with histone deacetylase 4 abnormalities, and thus completed the present invention.
  • the present invention comprises the following. 1. A preventive and/or therapeutic agent for skin disorders associated with histone deacetylase 4 abnormality, comprising a histone acetyltransferase inhibitor as an active ingredient. 2. The preventive and/or therapeutic agent for a skin disorder according to the preceding item 1, wherein the skin disorder is a skin disorder associated with histone deacetylase 4 abnormality in melanocytes caused by exposure to light. 3. The preventive and/or therapeutic agent for a skin disorder according to the preceding item 1, wherein the skin disorder is a skin disorder caused by photoaging. 4. The preventive and/or therapeutic agent for a skin disorder according to the preceding item 1, wherein the skin disorder is a skin disorder caused by xeroderma pigmentosum. 5.
  • a method for screening a preventive and/or therapeutic agent for skin disorders which comprises adding a candidate substance to a culture system of melanocytes and selecting a substance that ameliorates cytotoxicity of the melanocytes. 8.
  • the screening method according to the preceding item 7, wherein the substance that ameliorates cytotoxicity of melanocytes is obtained by detecting histone deacetylase 4 and/or a factor associated with cellular senescence-associated secretory phenomenon.
  • the screening method according to the preceding item 7, wherein the substance that ameliorates cytotoxicity of melanocytes is obtained by evaluating the viability of melanocytes.
  • the screening method according to the preceding item 7, wherein the substance that ameliorates cytotoxicity of melanocytes is obtained by evaluating the cell migration ability of melanocytes.
  • the melanocytes are melanocytes derived from pluripotent stem cells. 12.
  • the method for testing a skin disorder according to the preceding item 15, wherein the detection of abnormalities in histone deacetylase 4 and/or cellular senescence-associated secretory factor is carried out using the following 1) or 2): 1) a nucleic acid probe or a nucleic acid primer capable of specifically detecting a transcription product of the histone deacetylase 4 gene and/or the cellular senescence-associated secretory phenomenon factor gene; 2) An antibody that specifically recognizes histone deacetylase 4 and/or senescence-associated secretory factor.
  • a skin disorder testing kit comprising a substance capable of detecting abnormalities in histone deacetylase 4 and/or cellular senescence-associated secretory factor.
  • the preventive and/or therapeutic agent for skin disorders associated with histone deacetylase 4 abnormalities which contains the histone acetyltransferase inhibitor of the present invention as an active ingredient, can be used to prevent and/or treat skin disorders associated with histone deacetylase 4 abnormalities.
  • the figures show melanocytes (HC-iMC) differentiated from iPS cells derived from normal fibroblasts from human skin and melanocytes (XP-A-iMC) differentiated from iPS cells derived from fibroblasts from an XP-A patient (Reference Example 1). The expression of MC markers SOX10, MITF, and TYR in each melanocyte is shown.
  • Figure 3A shows the mutations in XP-A-iMC and HC-iMC by genomic sequencing.
  • Figure 3B shows that XP-A-iMC does not express XPA protein.
  • Example 1 This shows that XP-A-iMC has the properties of XP-A.
  • Figure 4A shows the results of the flow cytometry-based NER method.
  • Figure 4B shows the results of the MTT method.
  • Figure 5A shows the protocol for UV irradiation of XP-A-iMC and HC-iMC.
  • Figure 5B shows the difference in genes between XP-A-iMC and HC-iMC affected by UV.
  • Figure 5C shows the probes that increase or decrease after high-dose UV-B irradiation of XP-A-iMC and HC-iMC.
  • Example 3 The results of GO analysis to elucidate the molecular mechanisms related to the cellular response of XP-A-iMCs to ultraviolet light are shown in Example 3.
  • FIG. 3 The results of GO analysis to elucidate the molecular mechanisms related to the cellular response of XP-A-iMCs to ultraviolet light are shown in Example 3.
  • FIG. 4 shows changes in HDAC4 expression in XP-A-iMCs after UV irradiation (Example 4).
  • 1 shows the results of HDAC4 expression in XP-A-iMC after ultraviolet irradiation (Example 4).
  • FIG. 1 shows the results of a phase contrast microscope scan of a scratch assay in XP-A-iMC after UV irradiation (Example 5).
  • FIG. 5 shows the results of cell migration ability by scratch assay in XP-A-iMC after ultraviolet irradiation (Example 5).
  • a method for observing cell migration in XP-A-iMC after UV irradiation using digital holographic microscopy is shown (Example 5).
  • Example 5 shows the distance traveled by cells in XP-A-iMCs after UV irradiation, as measured by digital holographic microscopy (Example 5). This shows the speed of cell migration measured by digital holographic microscopy in XP-A-iMCs after ultraviolet irradiation (Example 5).
  • 1 shows the results of examining cellular aging of XP-A-iMC after ultraviolet irradiation (Example 6).
  • Example 6 shows the results of expression of SASP factors by PCR in XP-A-iMCs after UV irradiation (Example 6).
  • 1 shows the results of expression of SASP factors in XP-A-iMCs after UV irradiation, as determined by Western blotting (Example 6).
  • Example 7 shows the results of HDAC4 expression in NHEM after ultraviolet irradiation (Example 7).
  • Example 8 shows the effect of curcumin on XP-A-iMC after UV irradiation.
  • the effect of C-646 on XP-A-iMC after UV irradiation is shown in Example 9.
  • the present invention relates to a preventive and/or therapeutic agent for skin disorders associated with abnormalities in histone deacetylase 4 (HDAC4), which contains a histone acetyltransferase (HAT) inhibitor as an active ingredient.
  • HDAC4 histone deacetylase 4
  • HAT histone acetyltransferase
  • the inventors explored the response of melanocytes to light exposure, comprehensively analyzed molecules that could serve as therapeutic target seeds for skin disorders, and identified HDAC4 as a gene that epigenetically controls melanocytes. Furthermore, they used immunofluorescence antibody techniques to reveal that cellular senescence occurs in melanocytes after light exposure. Furthermore, melanocytes that have undergone cellular senescence are thought to affect the senescence-associated secretory phenotype (SASP) factor group, and in fact, they confirmed increased expression of many SASP factor groups. In other words, light exposure reduces HDAC4 expression in the skin, which in turn causes relative acetylation of histones, and this in turn increases the expression of SASP-related genes, which is thought to lead to various skin disorders.
  • SASP senescence-associated secretory phenotype
  • senescence-associated secretory phenomenon (SASP) factors include, for example, MMP-1, MMP-3, TNF ⁇ , IL-6, etc.
  • HDAC4 abnormality refers to a quantitative abnormality in histone deacetylase 4 (HDAC4), and in particular refers to a decrease in HDAC4 expression after light exposure compared to before light exposure. “Expression” may be at the gene level or the protein level.
  • the preventive and/or therapeutic agent of the present invention is characterized by having an effect of improving abnormality in HDAC4 expression.
  • skin disorder particularly refers to skin disorders associated with HDAC4 abnormalities, including, for example, skin disorders associated with HDAC4 abnormalities in melanocytes caused by light exposure, skin disorders caused by photoaging, and skin disorders caused by xeroderma pigmentosum.
  • photoaging refers to changes in the appearance and function of the skin observed as a result of repeated light exposure, and broadly includes skin disorders that can occur due to light exposure.
  • Specific skin disorders are not limited to skin disorders that can occur in the skin of XP patients, but also include skin disorders that can occur due to light exposure in people who are not XP patients.
  • skin disorders include pigmented lesions with a mixture of pigmented and depigmented spots, dry and atrophic skin, reduced skin elasticity, formation of wrinkles and sagging skin, skin cancer occurring at a young age, formation of freckles, pigmentation, darkening of the skin, increased yellowing, reduced skin barrier function, reduced stratum corneum function, etc., but are not limited to these.
  • xeroderma pigmentosum refers to a hereditary photosensitive disease that is inherited in an autosomal recessive manner, as explained in the Background Art section.
  • XP is used as a concept that includes all eight disease types, including genetically distinct groups A to G (genetic complementation group) and variant (V) type. It is particularly suitable for use with group A (XP-A), which is the most severe type in terms of both cutaneous and neurological symptoms.
  • group A XP-A
  • pigmentation abnormalities are inevitable in XP, research into melanocytes is important in advancing the elucidation of the disease's pathology.
  • light exposure is not limited to normal light exposure in daily life or light exposure exceeding this (e.g., sunburn), but also includes slight light exposure that may cause skin damage in XP patients.
  • light is not particularly limited as long as it is “light” that contains ultraviolet rays, and examples thereof include sunlight, ultraviolet rays (e.g., UV-B, UV-C, UV-A), and illumination light, and particularly refers to sunlight and ultraviolet rays.
  • the wavelength of light is not particularly limited, but is, for example, 0 to 3000 nm, preferably 10 to 400 nm, more preferably 200 to 380 nm, and particularly preferably 280 to 315 nm.
  • the dose is not particularly limited, but is, for example, 10 J/m 2 to 500 J/m 2 , preferably 30 to 200 J/m 2 , and more preferably 150 J/m 2 .
  • HAT inhibitor literally refers to a substance that inhibits or suppresses the enzymatic activity of histone acetyltransferase (HAT). By inhibiting or suppressing the enzymatic activity of HAT, a relative balance between HDAC4 and HAT is achieved, and abnormalities in HDAC4 are improved.
  • HAT inhibitors include one or more selected from the group consisting of curcumin, C-646, A-485, anacardic acid, butyrolactone, CTPB, and garcinol.
  • the preventive and/or therapeutic agent of the present invention contains a HAT inhibitor as an active ingredient.
  • the HAT inhibitor contained as an active ingredient may be a compound such as curcumin, C-646, A-485, anacardic acid, butyrolactone, CTPB, and garcinol, as well as a derivative of the compound, a pharma- ceutical acceptable salt of the compound or a derivative of the compound, or a hydrate.
  • curcumin, C-646, and A-485 are preferred.
  • Curcumin (UPAC name: (1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione) is a fat-soluble polyphenol that is found in high concentrations in turmeric, as well as in cardamom, cloves, cumin, pepper, coriander, paprika, mace, etc.
  • Potential medical uses of curcumin include antitumor, antioxidant, antiamyloid, and anti-inflammatory effects, and it has been actively researched in recent years.
  • the preventive and/or therapeutic agent of the present invention is used as a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition means a composition suitable for administration in medical applications, and may contain one or more pharma- ceutical acceptable carriers and/or pharma-ceutical acceptable excipients in addition to the HAT inhibitor as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition as the preventive and/or therapeutic agent of the present invention can be prepared by a commonly used method using pharmaceutical carriers, excipients, etc. commonly used in the art.
  • the administration may be in the form of oral administration using tablets, pills, capsules, granules, powders, liquids, etc., or parenteral administration using intra-articular, intravenous, intramuscular injections, suppositories, eye drops, eye ointments, transdermal liquids, ointments, transdermal patches, transmucosal liquids, transmucosal patches, inhalants, etc.
  • solid compositions for oral administration according to the present invention tablets, powders, granules, sustained release agents, etc. are used. In such solid compositions, one or more active ingredients are mixed with at least one pharma- ceutically acceptable carrier and/or pharma-ceutically acceptable excipient.
  • the pharma- ceutically acceptable carriers in this specification include various organic or inorganic carrier substances commonly used as formulation materials, such as excipients, lubricants, binders, and disintegrants in solid preparations, or solvents, solubilizers, suspending agents, isotonicity agents, and buffers in liquid preparations.
  • conventional additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners, adsorbents, and wetting agents can also be used in appropriate amounts as needed.
  • the pharma- ceutically acceptable excipients in this specification include, for example, isotonicity agents, bulking agents, preservatives/bactericides, binders, antioxidants, solubilizers, solubilizers, suspending agents, fillers, pH regulators, stabilizers, absorption promoters, release rate control agents, colorants, plasticizers, adhesives, etc.
  • Specific examples include lactose, sucrose, D-mannitol, starch, corn starch, crystalline cellulose, light anhydrous silicic acid, etc.
  • Lubricants include, for example, magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica, etc.
  • Binders include, for example, crystalline cellulose, white sugar, D-mannitol, dextrin, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, starch, sucrose, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, etc.
  • Disintegrants include, for example, starch, carboxymethylcellulose, calcium carboxymethylcellulose, croscarmellose sodium, sodium carboxymethylstarch, L-hydroxypropylcellulose, etc.
  • Solvents include, for example, water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil, olive oil, etc.
  • solubilizing agents include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, and sodium citrate.
  • Suspending agents include, for example, surfactants such as stearyl triethanolamine, sodium lauryl sulfate, lauryl aminopropionic acid, lecithin, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate; and hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose.
  • surfactants such as stearyl triethanolamine, sodium lauryl sulfate, lauryl aminopropionic acid, lecithin, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate
  • hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose.
  • Isotonicity agents include, for example, glucose, D-sorbitol, sodium chloride, glycerin, D-mannitol, etc.
  • buffering agents include buffer solutions such as phosphates, acetates, carbonates, and citrates.
  • preservatives include paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, and sorbic acid.
  • antioxidants examples include sulfites, ascorbic acid, and ⁇ -tocopherol.
  • the dosage of the HAT inhibitor as an active ingredient varies depending on the subject, administration route, symptoms, body weight, age, etc., and can be selected appropriately.
  • the HAT inhibitor as an active ingredient may be administered in combination with other drugs as appropriate.
  • the present invention also encompasses a method for screening for preventive and/or therapeutic agents for skin disorders.
  • the screening method can be characterized by adding a candidate substance to a melanocyte culture system and selecting a substance that improves cytotoxicity of the melanocytes.
  • Melanocytes also called pigment cells or melanocytes
  • pigment cells are cells that have tyrosinase activity and produce melanin. They have intracellular organelles (melanosomes) for melanin synthesis, and are morphologically dendritic cells whose dendrite shape changes depending on the environment.
  • Melanocytes can be prepared, for example, from pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells include induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), embryonic tumor cells (EC cells), and embryonic germ stem cells (EG cells), with iPS cells being preferred.
  • the method of inducing differentiation from pluripotent stem cells to melanocytes can be any method known per se or any method to be developed in the future. Specifically, the method described in the Examples and the method described in Patent No. 6624916 can be applied.
  • Pluripotent stem cells may be prepared using iPS cells that have already been established, or by any method known per se or any method to be developed in the future, specifically, for example, the method described in the Examples, Cell, 131(5): 861-872 (2007), Cell,126(4):663-676(2006), the method described in Non-Patent Document 6, and the like.
  • Pluripotent stem cells can be prepared, for example, from cells derived from XP patients.
  • the method of preparing pluripotent stem cells derived from XP patients can be any method known per se or any method to be developed in the future. Specifically, the method described in the Examples and the method described in JP 2021-17405 A can be applied.
  • the culture environment may be any known environment and is not particularly limited, but generally, cells can be cultured under conditions of 37 ⁇ 1° C. and 5 ⁇ 1% CO 2 .
  • the "cytodamage to melanocytes” is preferably cytodamage caused by, for example, light exposure.
  • Melanocytes are responsible for protection from light by producing melanin, but melanocytes themselves also suffer DNA damage due to ultraviolet rays, and abnormal expression of the gene HDAC4, which controls DNA acetylation, occurs.
  • the "cytodamage caused by light exposure” is preferably skin damage associated with HDAC4 abnormality.
  • a substance that improves cytodamage to melanocytes can be selected by a method known per se or any method that will be developed in the future.
  • a substance that improves cytodamage to melanocytes can be selected by a method such as detection of HDAC4 and/or SASP factors, evaluation of the viability of melanocytes, or evaluation of the cell migration ability of melanocytes. These selection methods can select a substance that improves cytodamage to melanocytes by comparing with and without light exposure.
  • the candidate substance to be subjected to the screening method of the present invention may be a polymeric compound or a low molecular weight compound.
  • polymeric compounds are not particularly limited, but include, for example, proteins and nucleic acid substances, specifically, antibodies, antibody fragments, peptides, such as siRNA or shRNA.
  • low molecular weight compounds are not particularly limited. It may also be a substance that contains a low molecular weight compound and a high molecular weight compound.
  • the present invention also relates to a method for testing skin disorders, which includes a step of detecting abnormalities in HDAC4 and/or SASP factors in skin taken from a subject.
  • the step of detecting an abnormality in HDAC4 and/or SASP factors is not particularly limited as long as it is a step of detecting an abnormality in HDAC4 and/or SASP factors by a method capable of detecting the abnormality in HDAC4 and/or SASP factors.
  • a method capable of detecting the abnormality in HDAC4 and/or SASP factors for example, the step of preparing an RNA (e.g., total RNA, mRNA) fraction from the skin of a subject and detecting a transcription product of the HDAC4 gene and/or SASP factor gene contained in the fraction, the step of detecting by an immunological method using an antibody that specifically recognizes HDAC4 and/or SASP factors, the step of detecting by mass spectrometry, etc.
  • RNA e.g., total RNA, mRNA
  • the detection of an abnormality in HDAC4 and/or SASP factors can be performed using the following 1) or 2). 1) a nucleic acid probe or nucleic acid primer capable of specifically detecting a transcription product of the HDAC4 gene and/or the SASP factor gene; 2) An antibody capable of specifically recognizing HDAC4 and/or SASP factors.
  • RNA fraction can be prepared using known methods such as guanidine-CsCl ultracentrifugation and AGPC, but highly pure total RNA can be prepared quickly and easily from a small amount of sample using a commercially available RNA extraction kit (e.g., RNeasy Mini Kit; manufactured by QIAGEN, etc.).
  • Methods for detecting the transcription products of the HDAC4 gene and/or SASP factor gene in the RNA fraction include, for example, PCR (RT-PCR, competitive PCR, real-time PCR, etc.) and hybridization (Northern blot, dot blot, DNA chip analysis, etc.).
  • Immunological methods include, for example, Western blotting, ELISA, FIA, RIA, etc.
  • antibodies include natural antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (mAbs), chimeric antibodies that can be produced using genetic recombination techniques, humanized antibodies, single-chain antibodies, and binding fragments thereof, but are not limited to these.
  • the antibodies are polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, or binding fragments thereof.
  • the binding fragment means a partial region of the above-mentioned antibody having specific binding activity, and specific examples thereof include F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv, dsFv, sdAb, etc. (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol. 6, No. 5, p. 441-456, 1996).
  • the class of the antibody is not particularly limited, and includes antibodies having any isotype such as IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE. IgG or IgM is preferable, and IgG is more preferable in consideration of ease of purification, etc.
  • the testing method of the present invention may also include a step of 3) determining that there is or is a high possibility of a skin disorder if HDAC4 is detected in a subject at a lower level compared to the control, or if SASP factors are detected at a higher level compared to the control.
  • the term "subject" includes individuals who are unknown or suspected of having a skin disorder, as well as individuals who are unknown or suspected of having XP.
  • the present invention also encompasses a skin disorder testing kit containing a substance capable of detecting abnormalities in HDAC4 and/or SASP factors.
  • substances capable of detecting abnormalities in HDAC4 and/or SASP factors include nucleic acid probes or nucleic acid primers capable of specifically detecting transcription factors of HDAC4 genes and/or SASP factor genes, and antibodies capable of specifically recognizing HDAC4 and/or SASP factors.
  • "primers or probes, etc.” may be modified as long as their functions are not significantly impaired. Examples of modifications include labels, fluorescent dyes, enzymes, proteins, radioisotopes, chemiluminescent substances, biotin, etc. Primers or probes, etc. may be immobilized on any solid phase for use.
  • the "solid phase” is not particularly limited as long as it is capable of immobilizing polynucleotides, and examples of such include glass plates, nylon membranes, microbeads, silicon chips, capillaries, and other substrates.
  • the kit of the present invention may further include a reaction buffer, dNTPs, a heat-stable DNA polymerase, a competitor nucleic acid, a fluorescent reagent, a competitor antibody, a labeled secondary antibody, a blocking solution, etc.
  • Reference Example 1 Preparation of iPS-derived melanocytes
  • XP disease-specific melanocyte stem cells were prepared and then differentiated into melanocytes (MCs), thereby preparing iPS-derived melanocytes.
  • XP3OS XP3OS cells
  • JCRB0303 XP3OS cells
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Non-Patent Document 6 Human iPS cell lines were established from these two fibroblast cell lines using the CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (ID Pharma Co., Ltd.) (Non-Patent Document 6). Human iPS cells were then seeded onto non-adherent culture dishes (50-200 cells/ml) and cultured in primate ES/iPS cell medium for 2 weeks to form embryoid bodies.
  • the embryoid bodies were then seeded onto fibronectin-coated adherent culture dishes and cultured in Human Melanocyte Maintenance Medium (Medium 254 medium (Invitrogen)) supplemented with 3 ⁇ M CHIR99021 (Stemgent), 50 ng/ml SCF (R&D), 100 nM ET-3 (American Peptide Company), 500 ⁇ M dbcAMP (Sigma), 50 nM TPA (12-tetradecanoylphorbol 13-acetate (Sigma), 4 ng/ml bFGF (Wako), 100 ⁇ M L-ascorbic acid (Sigma), 0.05 ⁇ M dexamethasone (Sigma), 1 mg/ml linoleic acid-bovine serum (Sigma), and 1X insulin-transferrin-sodium selenite (Sigma).
  • Human Melanocyte Maintenance Medium Medium 254 medium (Invitrogen)
  • 3 ⁇ M CHIR99021 Steml
  • SCF serum
  • the cells were cultured in a medium supplemented with Human Melanocyte Growth Supplement (HMGS) (Invitrogen) and induced to differentiate into melanocytes. During this period, the medium was changed every 2-3 days. 14 days after differentiation induction, spindle-shaped cells containing dark brown granules were observed under a microscope, so differentiation induction was stopped and the cells were cultured in a melanocyte maintenance medium that did not contain differentiation inducers. Seven days after differentiation induction was stopped, melanocyte stem cells were observed in the medium.
  • HMGS Human Melanocyte Growth Supplement
  • XP-A-iMCs cells differentiated into melanocytes from fibroblast-derived iPS cells derived from XP-A patients
  • HC-iMCs cells differentiated into melanocytes from normal fibroblast-derived iPS cells derived from human skin
  • XP-A-iMCs and HC-iMCs were observed under a phase-contrast microscope. Similar to normal human epidermal melanocytes (NHEM), XP-A-iMCs and HC-iMCs had a long, spindle-shaped morphology with dendrites ( Figure 1). In addition to visual observation of cell morphology, to ensure greater accuracy, pellets obtained by centrifugation were observed and immunohistochemically stained. The pellets obtained by centrifugation were black to the naked eye, indicating that they had differentiated into MCs. Immunohistochemical staining confirmed that the cells had the properties of MCs, based on the expression of MC markers SOX10, MITF, and TYR ( Figure 2).
  • Example 1 Confirmation of Mutation by Genomic Sequencing
  • confirmation was performed as to whether XP-A-iMC correctly contained the Japanese founder mutation (c.390-1G>C: g.15148G>C).
  • Genomic DNA was isolated from XP-A-iMCs using the Gentra Puregene Cell Kit (Qiagen, Hilden). To confirm the presence or absence of the Japanese XP-A founder mutation g.15148G>C in the XPA gene (c.390-1 G>C), the region containing this mutation was amplified with the following PCR primers: 5'-GCTGTGTGCCTAAGTT-3' (forward) (SEQ ID NO: 1) 5'-TGCAAAACTAGGAAAAGTTT-3' (reverse) (SEQ ID NO: 2) Ex-Taq (Takara Bio)
  • PCR products were resolved using an agarose gel, purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), and sequenced using the same forward primer on an Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) ( Figure 3A). Furthermore, Western blotting confirmed that XP-A-iMCs did not express the XPA protein ( Figure 3B).
  • Example 2 Confirmation that XP-A-iMCs have the properties of XPA
  • the flow cytometry-based NER method is a DNA repair test that is also used in clinical diagnosis, and is a method that involves analysis by flow cytometry using a monoclonal antibody against (6-4)PP after UV-C irradiation.
  • Flow cytometry-based NER method We evaluated DNA lesion repair in XP-A-iMCs and HC-iMCs by flow cytometry-based NER. Specifically, XP-A-iMCs and HC-iMCs were seeded on a 10 cm dish and irradiated with 30 J/m on the following day. The iMCs were irradiated with UV-C at 200 nm and collected immediately or 6 hours after irradiation. Then, the iMCs were incubated with a mouse primary monoclonal antibody against (6-4)PP (1:1,000, Cosmo BioCo.
  • the cells were stained with AlexaFluor 488 antibody (1:200, Thermo Fisher Scientific) at 22°C for 1.5 h, resuspended in PBS-TB containing AlexaFluor 488 antibody (1:200, Thermo Fisher Scientific) at 22°C for 1 h, and then stained with 5 ⁇ g/ml propidium iodide (Thermo Fisher Scientific) at 22°C for 1 h.
  • the XP-A-iMCs and HC-iMCs were stained by resuspending in PBS containing 0.1% ethanol and analyzed using a FACSVerse flow cytometer (BD Biosciences). All data were analyzed using FlowJo software (BD Life Sciences).
  • the percentage of DNA lesions removed was calculated based on the mean fluorescence intensity.
  • the fluorescence of XP-A-iMCs and HC-iMCs without UV irradiation was The intensity was taken as background, and the fluorescence intensity of the cells immediately after UV irradiation was taken as 100%. The decrease in fluorescence intensity was measured after 6 hours.
  • MTT method Cell viability was confirmed by the MTT assay. Specifically, XP-A-iMCs, HC-iMCs, and NHEMs were evaluated 24 hours after UV-B irradiation using the CellProliferationKit I (MTT assay) (Roche) according to the manufacturer's protocol. The medium was replaced with phenol red-free medium (Lifeline CellTechnology) immediately before reaction with the MTT reagent. The final product was then transferred to a 96-well plate and measured at absorbances of 595 nm and 650 nm using an Emax precision microplate reader (MolecularDevices). Cell viability was expressed relative to that of non-UV-irradiated cells.
  • Figure 4A shows representative histograms of (6-4)PP relative signal intensities in unexposed, immediately after UV-C irradiation, and 6 hours after UV-C irradiation.
  • HC-iMC and XP-A-iMC showed that 96.5% and 6.1% of (6-4)PP were restored within 6 hours after UV-C irradiation, respectively. Similar results were obtained from three independent experiments.
  • the results of the MTT assay are shown in Figure 4B.
  • the cell viability was evaluated 24 hours after irradiation at low doses (10 J/ m2 , 20 J/ m2 ) or high doses (100 J/ m2 , 200 J/ m2 ) ( Figure 4B).
  • the viability of commercially available NHEM was also evaluated (Gaddameedhi S et al 2010).
  • the viability of HC-iMC was almost the same as that of NHEM, and was significantly decreased from the baseline at 200 J/ m2 but not at 100 J/ m2 .
  • the viability of XP-A-iMC was significantly decreased at ⁇ 20 J/ m2 UV-B irradiation.
  • Example 3 Research into elucidating the pathology of XP using XP-A-iMCs
  • XP-A-iMCs we analyzed the UV response of XP-A-iMCs and comprehensively explored the response of melanocytes to UV stimulation to identify molecules (drug discovery target molecules) that are directly involved in the pathogenesis of XP and may serve as therapeutic target seeds.
  • XP-A-iMCs and HC-iMCs were seeded on 10 cm dishes and irradiated with low (30 J/ m2 ) or high (150 J/ m2 ) doses of UV-B, respectively, and then incubated at 37°C for 4 or 12 hours (Fig. 5A) before comprehensive transcriptional profiling.
  • Gene transcriptional profiling was performed using GeneChip TM Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix) according to the manufacturer's protocol. Data were analyzed using the Robust Multichip Average (RMA) method with GeneSpring13.1.1software (Agilent Technologies, Inc.). Differences in genes affected by UV-B between XP-A-iMCs and HC-iMCs were revealed.
  • RMA Robust Multichip Average
  • HDAC4 Histone Deacetylase 4
  • HDAC4 behavior was decreased in all MCs 4 hours after UV-B irradiation and recovered in NHEM and HC-iMCs 12 hours after, but in XP-A-iMC, HDAC4 expression tended not to recover and continued to decrease 12 hours after UV irradiation ( Figure 7).
  • HDAC4 expression in XP-A-iMC was confirmed from multiple angles using RT-PCR and Western blotting ( Figures 8A and 8B).
  • Example 5 Examination of cell migration ability of XP-A-iMC
  • the cell migration ability of XP-A-iMC after ultraviolet light irradiation was examined using a scratch assay and digital holographic microscopy.
  • XP-A-iMCs and HC-iMCs reduced migration ability by scratch assay and digital holographic microscopy.
  • XP-A-iMCs and HC-iMCs were seeded on a 60 mm dish, and when they reached confluence, they were irradiated with a high dose of UV-B (150 J/ m2 ) and then scratched with a small scraper to create a gap. The gap was then filled by cell migration and observed daily under a phase-contrast microscope (Fig. 9). The results of the cell migration ability by scratch assay are shown in Fig. 10. It was found that cell migration was significantly impaired in XP-A-iMCs with reduced HDAC4 compared to HC-iMCs.
  • FIG. 11 Cell migration was also examined using a digital holographic microscope ( Figure 11).
  • a HoloMonitor (R) M4 microscope Phase Holographic ImagingAB ) was used to image and track the movement of XP-A-iMCs and HC-iMCs after high-dose (150 J/ m2 ) UV-B irradiation.
  • XP-A-iMCs and HC-iMCs 1x104 cells were seeded in a 6-well plate, and migration was tracked for 72 hours after high-dose (150 J/m2) UV-B irradiation.
  • Figure 12 shows the distance traveled by the cells
  • Figure 13 shows the speed of cell migration.
  • Example 2 showed that the survival rate of XP-A-iMC decreased due to light exposure, it may be possible to obtain a substance that improves cytotoxicity in melanocytes by adding a candidate substance to a melanocyte culture system and evaluating the survival rate and migration ability of melanocytes.
  • Example 6 Examination of cellular senescence in XP-A-iMC
  • the occurrence of cellular senescence in XP-A-iMC after ultraviolet irradiation was examined using an immunofluorescence antibody technique.
  • XP-A-iMCs and HC-iMCs were seeded on 60 mm dishes, and when they reached approximately 70% confluence, they were irradiated with high-dose (150 J/ m2 ) UV-B. 24 hours later, the expression of ⁇ H2AX, an indicator of DNA damage and an indicator of cellular senescence, was examined. A significant increase in ⁇ H2AX expression was confirmed in XP-A-iMCs compared to HC-iMCs using the fluorescent antibody method, indicating that cellular senescence was promoted (Figure 14).
  • SASP senescence-associated secretory phenotype
  • Example 7 Decreased expression of HDAC4 in NHEM
  • HDAC4 expression in NHEM was confirmed.
  • NHEM were seeded in 60 mm dishes and irradiated with a very high dose of UV-B (500 J/ cm2 ), and 24 hours later, HDAC4 expression was confirmed using RT-PCR ( Figure 17). It was also confirmed that the pathological condition in which HDAC4 expression is significantly decreased by UV irradiation was also observed in melanocytes from healthy subjects when the amount of UV light was significantly increased, suggesting that the decrease in HDAC4 may be generally important in photoaging.
  • Example 8 Improvement of HDAC4 expression by curcumin XP-A-iMCs were seeded on a 60 mm dish, and when they reached approximately 70% confluence, they were irradiated with high doses of UV-B (150 J/ m2 ). Curcumin was then added to the cell culture medium and cultured for 24 hours, after which the expression of HDAC4 was confirmed using RT-PCR. Dimethyl sulfoxide (DMSO), a solvent for curcumin, was used as a control. It was found that the expression of HDAC4, which had been reduced by irradiation with high doses of UV-B (150 J/ m2 ), was significantly restored ( Figure 18). It was also confirmed that the effect was curcumin concentration-dependent.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Example 9 Improvement of HDAC4 expression by C-646 XP-iMCs were seeded on a 60 mm dish, and when they reached approximately 70% confluence, they were irradiated with high doses of UV-B (150 J/ m2 ). C-646 was added to the cell culture medium and cultured for 24 hours, after which the expression of HDAC4 was confirmed using RT-PCR ( Figure 19). Dimethyl sulfoxide (DMSO), the solvent for C-646, was used as a control. It was found that the expression of HDAC4, which had been reduced by irradiation with high doses of UV-B (150 J/ m2 ), was significantly restored.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the preventive and/or therapeutic agent for skin disorders associated with histone deacetylase 4 abnormalities of the present invention which contains the histone acetyltransferase inhibitor as an active ingredient, can prevent and/or treat skin disorders associated with histone deacetylase 4 abnormalities, and is highly useful not only for XP patients but also for many skin disorders, such as those caused by photoaging. It is particularly useful for XP patients, for whom effective treatment methods have not yet been established. It is also possible to screen for new preventive and/or therapeutic agents for skin disorders that focus on HDAC4 and melanocytes.

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Abstract

ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤を提供する。 ヒストンアセチル基転移酵素阻害剤を有効成分として含む、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤による。前記予防及び／又は治療剤によれば、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療を行うことができる。

Description

ヒストン脱アセチル化酵素４異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤
　本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2023-109275号優先権を請求する。
　色素細胞（メラノサイト）は、発生過程において神経堤に由来し、メラニンを産生する細胞である。メラノサイトは、皮膚においては主に表皮の基底層に存在し、周囲ケラチノサイトにメラニンを供給する。メラノサイトは、メラニン産生により紫外線からの防御を担うが、メラノサイトも紫外線によってDNA損傷を生じる。
　色素性乾皮症（xeroderma pigmentosum：以下、単に「（XP）」ともいう。）では、症状が最も強く発現する標的臓器は皮膚であり、特に色素異常が必発であることから、患者のメラノサイトの紫外線応答を解析することが、XP病態解明において最重要である。XPは、常染色体潜性形式で遺伝する遺伝性光線過敏性疾患であり、重度の光線過敏と神経症状を来す遺伝性DNA修復異常症である。XP患者皮膚は紫外線によって引き起こされるDNA損傷を修復する能力を先天性に欠損するため、日光や紫外線に対する重度の光線過敏（異常な日焼け、色素異常、露光部の皮膚がん等）が病型によって様々な程度に起こる。このため、全生活空間に遮光環境を作る必要があり、XP患者及びその家族のQOLは著しく低下する。適切な遮光を怠れば重篤な光線過敏症状、雀卵斑様の色素異常が進行し、若年齢にもかかわらず高頻度に皮膚がんが発症する。さらに、半数以上のXP患者では原因不明の進行性の脳・神経変性症状を伴い、この重症度が患者予後に影響する。これより、XPの病態の解明と治療薬の確立が強く望まれており、治療薬の確立は、世界中のXP患者の為に急務である。
　XPは、遺伝的に異なるA～G群（遺伝的相補性群）とバリアント（V）型の8つの病型に分類される。日本のXPでは皮膚症状、神経症状ともに最重症型であるA群（xeroderma pigmentosum group A：XP-A）が約55％を占め、皮膚症状のみのV型が約25％といわれている。日本人に多いXP-A患者では光線過敏症状が重く、生直後から激しい日焼け症状が現れ、低紫外線量でも著明に促進された光老化が見られ、すなわち重度の日焼け反応、大きさも色調も様々なそばかす様色素斑、若年での露光部の皮膚がん等の皮膚症状がみられるが、XP-Aの病態は未だ解明されていない。またXP-A患者では聴力低下、言葉が不明瞭になる、体のバランスが取れなくなる、といった神経症状も6歳ころから顕在化し、10歳を過ぎたころから次第に転びやすい等の神経症状が出始め、聴力低下や知的障害の進行とともに言語機能も低下する。
　XPでは、症状が最も強く発現する標的臓器は皮膚であり、特に色素異常が必発であることから、メラノサイトでの研究が病態解明を進めていくうえで重要である。しかしながら、XP患者皮膚組織からメラノサイトの単離培養が困難であるため、線維芽細胞（ファイブロブラスト）を用いて解析が行われてきた（非特許文献１、２）。一方、メラノサイトとファイブロブラストでは、紫外線に対する耐性やDNA損傷に対する反応が異なるため、XPにおいてメラノサイトを用いて研究することが重要である（非特許文献３～５）。しかしながら、メラノサイトが関与する露光部で色素斑と脱色素斑が入り混じるXPの早発する光老化の病態を、XP患者由来のメラノサイトを用いて解析した報告はこれまでにない。そこで、本発明者らは、多能性幹細胞から色素幹細胞を作製し、及び当該色素幹細胞からメラノサイトを樹立する方法を見出した（特許文献１、非特許文献６）。
　エピジェネティクスを担う代表的な分子機構としてヒストン修飾が挙げられる。ヒストン修飾には、ヒストンアセチル基転移酵素（histone acetyltransferase：HAT）と、ヒストン脱アセチル化酵素（Histone Deacetylase：HDAC）が関与している。HATはヒストンのリジン残基をアセチル化することにより、遺伝子発現を増加させる役割を担っている。一方、HDACはヒストンの脱アセチル化することにより、遺伝子発現を抑制させる役割を担っている。このようにHATとHDACは、遺伝子の転写制御において重要な役割を果たしており、ヒストンのアセチル化修飾は、HATとHDACの拮抗した作用により調節されている。
　ヒトのHDACには18種類あり、 classIからclassIVまでの４つのクラスに分類され、それぞれに特徴がある。classIとclassIIのHDACは亜鉛を酵素活性部位に持つ加水分解酵素であり、細胞内局在としては、classIは核に、classIIは核と細胞質に局在するという特徴がある。HDAC4は、classIIに属する。
特許第6624916号公報
Bowden et al. Int.J.Mol.Sci.2015,15985-15996 Herman et al. Environ MolMutagen.2014June;55(5): 375-384 Fukumoto et al. GenesCells.2016,Feb;21(2):185-99 Cho-TH et al.PhotodermatolPhotoimmunolPhotomed. 2008 Jun;24(3):110-4. Emri G et al. J Invest Dermatol.2000Sep;115(3):435-40 Hosaka et al. Pigemnt Cell &MelanomaResearch, 2019, 32(5):623-633
　本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素4（HistoneDeacetylase4：HDAC4）異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ヒストンアセチル基転移酵素阻害剤が、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療に有効であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下よりなる。
１．ヒストンアセチル基転移酵素阻害剤を有効成分として含む、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤。 
２．皮膚障害が、光曝露によって生じるメラノサイトにおけるヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害である、前項１に記載の皮膚障害の予防及び／又は治療剤。
３．皮膚障害が、光老化による皮膚障害である、前項１に記載の皮膚障害の予防及び／又は治療剤。
４．皮膚障害が、色素性乾皮症による皮膚障害である、前項１に記載の皮膚障害の予防及び／又は治療剤。
５．ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤が、ヒストン脱アセチル化酵素4の発現異常を改善する作用を有する、前項１に記載の皮膚障害の予防及び／又は治療剤。
６．ヒストンアセチル基転移酵素阻害剤が、クルクミン、C-646、A-485、アナカルジン酸、ブチロラクトン、CTPB及びガルシノールからなる群から選択される１種又は複数種である、前項１に記載の皮膚障害の予防及び／又は治療剤。
７．メラノサイトの培養系に候補物質を添加し、前記メラノサイトの細胞傷害を改善する物質を選別することを特徴とする皮膚障害の予防及び／又治療剤のスクリーニング方法。
８．メラノサイトの細胞傷害を改善する物質は、ヒストン脱アセチル化酵素4及び／又は細胞老化随伴分泌現象因子を検出することにより得られる、前項７に記載のスクリーニング方法。
９．メラノサイトの細胞傷害を改善する物質は、メラノサイトの生存率を評価することにより得られる、前項７に記載のスクリーニング方法。
１０．メラノサイトの細胞傷害を改善する物質は、メラノサイトの細胞遊走能を評価することにより得られる、前項７に記載のスクリーニング方法。
１１．メラノサイトが多能性幹細胞由来のメラノサイトである、前項７に記載のスクリーニング方法。
１２．多能性幹細胞由来のメラノサイトが、色素性乾皮症の患者由来の多能性幹細胞から作製された多能性幹細胞由来のメラノサイトである、前項１１に記載のスクリーニング方法。
１３．メラノサイトの細胞傷害が、光曝露による細胞傷害である前項７に記載のスクリーニング方法。
１４．光曝露による細胞傷害が、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害である、前項１３に記載のスクリーニング方法。
１５．被検者から採取した皮膚について、ヒストン脱アセチル化酵素4及び／又は細胞老化随伴分泌現象因子の異常を検出する工程を含む、皮膚障害の検査方法。
１６．細胞老化随伴分泌現象因子が、MMP-1、MMP-3、TNFα及びIL-6から選択される、１種又は複数種である、前項１５に記載の皮膚障害の検査方法。
１７．ヒストン脱アセチル化酵素4及び／又は細胞老化随伴分泌現象因子異常の検出が、以下の１）又は２）を用いて行われる、前項１５に記載の皮膚障害の検査方法；
１）ヒストン脱アセチル化酵素4遺伝子及び／若しくは細胞老化随伴分泌現象因子遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー；
２）ヒストン脱アセチル化酵素4及び／又は細胞老化随伴分泌現象因子を特異的に認識する抗体。
１８．ヒストン脱アセチル化酵素4及び／又は細胞老化随伴分泌現象因子の異常を検出し得る物質を含む、皮膚障害検査用キット。
　本発明のヒストンアセチル基転移酵素阻害剤を有効成分として含む、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤を用いて、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療を行うことができる。 
ヒト皮膚由来の正常線維芽細胞由来iPS細胞から分化させたメラノサイト（HC-iMC）及びXP-A患者由来の線維芽細胞由来iPS細胞から分化させたメラノサイト（XP-A-iMC）を示す。（参考例１） 各々のメラノサイトにおいて、MCマーカーであるSOX10、MITF、TYRの発現を示す。（参考例１） 図３Ａは、XP-A-iMC及びHC-iMCにおいて、ゲノミックシークエンスによる変異を示す。図３Ｂは、XP-A-iMCがXPAタンパク質を発現していないことを示す。（実施例１） XP-A-iMCがXP-Aの性質を有していることを示す。図４Ａは、Flow cytometry-basedNER 法における結果を示す。図４ＢはMTT法における結果を示す。（実施例２） 図５ＡはXP-A-iMCとHC-iMCへの紫外線照射のプロトコールを示す。図５Ｂは紫外線によって影響を受けるXP-A-iMCとHC-iMCの遺伝子における違いを示す。図５ＣはXP-A-iMC及びHC-iMCに高線量UV-Bを照射した後に上昇又は低下するプローブを示す。（実施例３） XP-A-iMCの紫外線に対する細胞応答に関連する分子機構を解明するためのGO解析の結果を示す。（実施例３） 紫外線照射後のXP-A-iMCのHDAC4発現の変化を示す。（実施例４） 紫外線照射後のXP-A-iMCのHDAC4発現結果を示す。（実施例４） 紫外線照射後のXP-A-iMCにおいて、scrachアッセイによる位相差顕微鏡の結果を示す。（実施例５） 紫外線照射後のXP-A-iMCにおいて、scrachアッセイによる細胞遊走能の結果を示す。（実施例５） 紫外線照射後のXP-A-iMCにおいて、Digitalholographicmicroscopyによる細胞遊走の観察方法を示す。（実施例５） 紫外線照射後のXP-A-iMCにおいて、Digitalholographicmicroscopyにより測定した細胞が遊走した距離を示す。（実施例５） 紫外線照射後のXP-A-iMCにおいて、Digitalholographicmicroscopyにより測定した細胞遊走のスピードを示す。（実施例５） 紫外線照射後のXP-A-iMCの細胞老化の検討結果を示す。（実施例６） 紫外線照射後のXP-A-iMCにおいてPCR法によるSASP因子群の発現結果を示す。（実施例６） 紫外線を照射後のXP-A-iMCにおいてウエスタンブロッティング法によるSASP因子群の発現結果を示す。（実施例６） 紫外線照射後のNHEMのHDAC4発現結果を示す。（実施例７） 紫外線を照射後のXP-A-iMCにおいてクルクミンの効果を示す。（実施例８） 紫外線を照射後のXP-A-iMCにおいてC-646の効果を示す。（実施例９）
　本発明は、ヒストンアセチル基転移酵素（HAT）阻害剤を有効成分として含む、ヒストン脱アセチル化酵素4（HDAC4）異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤に関する。
　本発明者らは、メラノサイトにおける光曝露に対する反応を探索し、皮膚障害に関する治療標的シーズとなり得る分子を網羅的に解析し、メラノサイトをエピジェネティックに制御する遺伝子としてHDAC4を特定した。さらに、光曝露後のメラノサイトにおいて、免疫蛍光抗体法を用いて細胞老化が起きていることを明らかにした。さらに、細胞老化を起こしたメラノサイトは、細胞老化随伴分泌現象（Senescence-Associated Secretory Phenotype：SASP）因子群に影響を及ぼすと考えられ、実際に多数のSASP因子群の発現上昇を確認した。即ち、光曝露によって皮膚におけるHDAC4の発現が低下し、相対的にヒストンのアセチル化が起きることから、これに伴いSASP関連遺伝子の発現が上昇することにより、様々な皮膚障害が生じると考えられる。
　そこで、本発明者らは、HDAC4発現異常を改善することにより、皮膚障害を予防及び／又は治療に適用し得る可能性を初めて見出した。本明細書において、細胞老化随伴分泌現象（SASP）因子とは、例えばMMP-1、MMP-3、TNFα、IL-6等が挙げられる。
　本明細書において、「HDAC4異常」とは、ヒストン脱アセチル化酵素4（HDAC4）の量的異常のこといい、特に光曝露前に比べ、光曝露後にHDAC4発現が低下することをいう。「発現」とは遺伝子レベルであってもよいし、タンパク質レベルであってもよい。本発明の予防及び／又は治療剤は、HDAC4の発現異常を改善する作用を有することを特徴とする。
　本明細書において「皮膚障害」とは、HDAC4異常に伴う皮膚障害が特に適用され、例えば、光曝露によって生じるメラノサイトにおけるHDAC4異常に伴う皮膚障害、光老化による皮膚障害、色素性乾皮症による皮膚障害等が挙げられる。ここで、「光老化」とは光曝露が繰り返された結果として認められる皮膚の外見及び機能の変化を意味し、広く光曝露によって起こり得る皮膚障害等が含まれる。具体的な皮膚障害としては、XP患者皮膚に起こり得る皮膚障害に限定されず、XP患者でない者が光曝露によって起こり得る皮膚障害も含まれる。例えば皮膚障害は、色素斑と脱色素斑が混在する色素病変、皮膚の乾燥や萎縮、皮膚の弾力性の低下、しわ・たるみの形成、若年齢から発生する皮膚がん、そばかすの形成、色素沈着、皮膚の黒化、黄ばみの増加、皮膚バリア機能の低下、角層機能の低下等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において「色素性乾皮症（XP）」とは、背景技術の欄でも説明したごとく、常染色体潜性形式で遺伝する遺伝性光線過敏性疾患である。本明細書において、XPは遺伝的に異なるA～G群（遺伝的相補性群）とバリアント（V）型の8病型すべてを含む概念で使用される。特に好適には皮膚症状、神経症状ともに最重症型であるA群（XP-A）に適用される。XPは、特に色素異常が必発であることからメラノサイトでの研究が病態解明を進めていくうえで重要である。 
　本明細書において、「光曝露」とは、日常生活における通常の光曝露又はこれを超える光曝露（例えば、日焼け）に限定されず、XP患者にとって皮膚障害が起こり得るわずかな光曝露も含まれる。本明細書において「光」とは、紫外線が含まれる「光」であれば特に限定されないが、例えば日光、紫外線（例えばUV-B、UV-C、UV-A）、照明光等が挙げられ、特に日光、紫外線をいう。光の波長としては、特に限定されないが、例えば0～3000 nm、好ましくは10～400 nm、より好ましくは200～380nm、特に好ましくは280～315 nmである。線量としては、特に限定されないが、例えば10 J/m2～500 J/m2、好ましくは30～200 J/m2、より好ましくは150 J/m2である。
　本明細書において、「HAT阻害剤」とは文言通りヒストンアセチル基転移酵素（HAT）の酵素活性を阻害又は抑制する物質をいう。HATの酵素活性を阻害又は抑制することで相対的にHDAC4とHATの均衡が得られ、HDAC4の異常が改善されるものである。HAT阻害剤は、例えばクルクミン、C-646、A-485、アナカルジン酸、ブチロラクトン、CTPB及びガルシノールからなる群から選択される１種又は複数種等が挙げられる。本発明の予防及び／又は治療剤は、HAT阻害剤を有効成分として含有する。本明細書において、有効成分として含有するHAT阻害剤としては、クルクミン、C-646、A-485、アナカルジン酸、ブチロラクトン、CTPB及びガルシノール等の化合物の他、当該化合物の誘導体や、当該化合物若しくは当該化合物の誘導体の薬学的に許容される塩であってもよいし、水和物でもよい。特にクルクミン、C-646、A-485が好適である。クルクミン（UPAC名：(1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione）は、主にウコンに高含有され、カルダモン、クローブ、クミン、胡椒、コリアンダー、パプリカ、メース等にも含まれる脂溶性のポリフェノールである。クルクミンの医学的利用の可能性として、抗腫瘍作用、抗酸化作用、抗アミロイド作用、抗炎症作用等が知られており、近年盛んに研究されている。
　本発明の予防及び／又は治療剤は、医薬組成物として使用される。医薬組成物とは、医学的用途における投与に適した組成物を意味し、有効成分としてのHAT阻害剤の他１種又は複数種の製薬学的に許容される担体及び／又は製薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。本発明の予防及び／又は治療剤としての医薬組成物は、当分野において通常用いられている薬剤用担体、賦形剤等を用いて通常使用されている方法によって調製することができる。投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。本発明による経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤、徐放剤等が用いられる。このような固体組成物においては、1種又は2種以上の有効成分を、少なくとも1種の製薬学的に許容される担体及び／又は製薬学的に許容される賦形剤と混合される。
　本明細書の製薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機又は無機担体物質が挙げられ、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、又は液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤及び緩衝剤等が挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤等の添加物を適宜、適量用いることもできる。
　本明細書の製薬学的に許容される賦形剤としては、例えば等張化剤、増量剤、防腐・殺菌剤、結合剤、酸化防止剤、溶解剤、溶解補助剤、懸濁化剤、充填剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、吸収促進剤、放出速度制御剤、着色剤、可塑剤、粘着剤等が挙げられる。具体的には、例えば乳糖、白糖、D-マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等が挙げられる。
　滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられる。結合剤としては、例えば結晶セルロース、白糖、D-マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等が挙げられる。
　崩壊剤としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ－ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
　溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
　溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
　懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
　等張化剤としては、例えばブドウ糖、D-ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール等が挙げられる。
　緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
　防腐剤としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
　抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α－トコフェロール等が挙げられる。
　有効成分としてのHAT阻害剤の投与量は、投与対象、投与ルート、症状、体重、年齢等によっても異なり、適宜選択することができる。有効成分としてのHAT阻害剤は、適宜他の薬剤とともに併用して投与してもよい。
　本発明は皮膚障害の予防及び／又は治療剤のスクリーニング方法にも及ぶ。スクリーニング方法としては、メラノサイトの培養系に候補物質を添加し、前記メラノサイトの細胞傷害を改善する物質を選別することを特徴とすることができる。
　「メラノサイト」（色素細胞やメラニン細胞とも呼ばれる。）とは、チロシナーゼ活性があり、メラニンを産生する細胞であって、メラニン合成のための細胞内小器官（メラノソーム）を有する、形態学的には樹枝状の細胞でその樹状突起の形状は環境によって変化する細胞を意味する。
　メラノサイトは、例えば多能性幹細胞から作製することができる。多能性幹細胞細胞として、例えば人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）等が挙げられるが、iPS細胞が好ましい。多能性幹細胞からメラノサイトへの分化誘導方法は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。具体的には実施例に記載の方法や特許6624916号に記載の方法を適用することができる。多能性幹細胞は、既に樹立されたiPS細胞を用いてもよいし、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法により作製することもでき、具体的には例えば実施例に記載の方法、Cell, 131(5): 861-872 (2007)、Cell,126(4):663-676(2006)、非特許文献６に記載の方法等が挙げられる。多能性幹細胞は、例えばXP患者由来の細胞から作製することができる。XP患者由来の多能性幹細胞の作製方法は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。具体的には、実施例に記載の方法や特開2021-17405号に記載の方法を適用することができる。培養する環境は、自体公知の環境であればよく、特に制限されるものではないが、一般的には細胞を37±1℃、5±1％CO2条件下で培養することができる。
　本明細書において、「メラノサイトの細胞傷害」は、例えば光曝露による細胞傷害であることが好適である。メラノサイトはメラニン産生により、光からの防御を担うが、メラノサイト自身も紫外線によってDNA損傷が生じ、DNAのアセチル化を制御する遺伝子HDAC4の発現異常が起こる。「光曝露による細胞傷害」は、HDAC4異常に伴う皮膚障害が好適である。本発明のスクリーニング方法において、メラノサイトの細胞傷害を改善する物質は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法により選別することができる。例えば、HDAC4及び／又はSASP因子の検出、メラノサイトの生存率の評価、又はメラノサイトの細胞遊走能の評価等の方法により、メラノサイトの細胞傷害を改善する物質を選別することができる。これらの選別方法は、光曝露の有無によって比較することによりメラノサイトの細胞傷害を改善する物質を選別することができる。本発明のスクリーニング方法に供される候補物質としては、高分子化合物であってもよいし低分子化合物であってもよい。高分子化合物の例としては、特に限定されないが、例えばタンパク質、核酸物質が挙げられ、具体的には抗体、抗体断片、ペプチド、例えばsiRNA又はshRNA等が挙げられる。低分子化合物の例としては、特に限定されない。また、低分子化合物と高分子化合物を含む物質であってもよい。
　本発明は、被検者から採取した皮膚について、HDAC4及び／又はSASP因子の異常を検出する工程を含む、皮膚障害の検査方法にも及ぶ。
　HDAC4及び／又はSASP因子の異常を検出する工程は、HDAC4及び／又はSASP因子の異常を検出可能な方法で検出する工程であれば特に限定されない。例えば、被検者の皮膚からRNA（例：全RNA、mRNA）画分を調製し、該画分中に含まれるHDAC4遺伝子及び／又はSASP因子遺伝子の転写産物を検出する工程、HDAC4及び／又はSASP因子を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的手法により検出する工程、質量分析法により検出する工程等が挙げられる。具体的には、本発明の検査方法においてHDAC4及び／又はSASP因子の異常の検出は、以下の１）又は２）を用いて行うことができる。
１）HDAC4遺伝子及び／若しくはSASP因子遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、
２）HDAC4及び／又はSASP因子を特異的に認識し得る抗体。
　RNA画分の調製は、グアニジン－CsCl超遠心法、AGPC法等公知の手法を用いて行うことができるが、市販のRNA抽出用キット（例：RNeasy Mini Kit；QIAGEN製等）を用いて、微量検体から迅速且つ簡便に高純度の全RNAを調製することができる。RNA画分中のHDAC4遺伝子及び／又はSASP因子遺伝子の転写産物を検出する方法としては、例えば、PCR（RT－PCR、競合PCR、リアルタイムPCR等）、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、DNAチップ解析等）を用いる方法等が挙げられる。免疫学的手法として、例えばウエスタンブロッティング法、ELISA、FIA、RIA等が挙げられる。本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、及びこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF（ab’）２、Fab’、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等が挙げられる（Exp.Opin.Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、IgG又はIgMであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。また、本発明においては、HDAC4及び／又はSASP因子を特異的に認識する抗体として、市販の抗HDAC4抗体、抗SASP因子抗体、又は抗HDAC4抗体、抗SASP因子抗体を含むキットを使用することも好ましい。
　本発明の検査方法において、被検者においてHDAC4が、対照に比べて低値で検出された場合又はSASP因子が対照に比べて高値で検出された場合には、上記のような皮膚障害の可能性が高いと判断することができる。従って、本発明の検査方法は、上記１）、２）の工程に加えて、３）被検者においてHDAC4が対照に比べて低値で検出又はSASP因子が対照に比べて高値で検出された場合には、皮膚障害である又はその可能性が高いと判断する工程を含んでもよい。
　本発明の検査方法において、「被検者」とは皮膚障害か不明の者、皮膚障害と疑われる者等のほか、XPに罹患しているか不明の者、XPと疑われる者等が含まれる。
　本発明は、さらにHDAC4及び／又はSASP因子の異常を検出し得る物質を含む、皮膚障害検査用キットにも及ぶ。HDAC4及び／又はSASP因子の異常を検出し得る物質として、例えばHDAC4遺伝子及び／若しくはSASP因子遺伝子の転写因子を特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー、HDAC4及び／又はSASP因子を特異的に認識し得る抗体等が挙げられる。本明細書において、「プライマー又はプローブ等」は、その機能が著しく損なわない限りにおいて、修飾することもできる。修飾としては、例えば標識物、蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が挙げられる。プライマー又はプローブ等は、任意の固相に固定化して使用することもできる。本明細書において、「固相」は、ポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に限定されず、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリー又はその他の基板等が挙げられる。本発明のキットは、さらに反応緩衝液、dNTPs、耐熱性DNAポリメラーゼ、competitor核酸、蛍光試薬、competitor抗体、標識された二次抗体、ブロッキング液等を含んでもよい。
　本発明の理解を助けるために、以下に参考例及び実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものでないことはいうまでもない。なお、「参考例」では本発明の完成に至る実験内容を示す。
（参考例１）iPS由来のメラノサイトの作製
　本参考例では、XP疾患特異的色素幹細胞を作製した後、メラノサイト（MC）へ分化させ、iPS由来のメラノサイトを作製した。
（XP疾患特異的色素幹細胞の作製）
　ヒトiPS細胞株の樹立には、ヒト皮膚由来の正常線維芽細胞（TIG-120細胞；JCRB0542）及びXP-A患者由来の線維芽細胞（XP3OS）を使用した。XP3OS細胞（JCRB0303）は、XPAの日本人創始者変異（c.390-1G>C：g.15148G>C）を持つことが知られている細胞である。これらの細胞株は、JCRB生物資源バンク（日本）から入手し、ダルベッコ改変イーグル培地Dulbecco'smodified Eagle's medium (DMEM)（ナカライ）に、 10%ウシ胎児血清及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン（LifeTechnologies）を加えた培地で培養した。ヒトiPS細胞株は、これらの2つの線維芽細胞株から、CytoTune-iPS 2.0SendaiReprogramming Kit（ID Pharma Co., Ltd.）を用いて確立した（非特許文献６）。その後、ヒトiPS細胞を非接着培養皿上に播種し（50～200細胞/ml）、霊長類ES/iPS細胞用培地中で２週間培養することで、胚様体を形成させた。その後胚様体をフィブロネクチンでコートした接着培養皿上に播種し、3μM CHIR99021（Stemgent）、50 ng/ml SCF（R＆D）、100 nM ET-3（American Peptide Company）、500μM dbcAMP（Sigma）、50nMTPA(12-テトラデカノイルホルボール 13-アセタート（Sigma）、4ng/ml bFGF（Wako）、100μM L-アスコルビン酸（Sigma）、0.05 μM デキサメタゾン（Sigma）、1 mg/ml リノール酸-ウシ血清（Sigma）、及び1Xインスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム（Sigma）を加えたメラノサイト維持培地（Medium 254培地（Invitrogen）にHumanMelanocyte GrowthSupplement（HMGS）（Invitrogen）を添加した培地）で培養し、メラノサイトへの分化を誘導した。この間、2～3日に一度培地を交換した。分化誘導をしてから14日後に、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が顕微鏡観察により認められたため分化誘導を中止し、分化誘導因子を含んでいないメラノサイト維持培地に切り替えて細胞を培養した。分化誘導を中止してから7日後に、培地中に色素幹細胞が認められた。
（XP疾患特異的メラノサイトへの分化誘導）
　上述した色素幹細胞は、2日ごとに3μM CHIR99021を添加した後、約1週間後にMCに分化した。以下、XP-A患者由来の線維芽細胞由来iPS細胞からメラノサイトへ分化させた細胞をXP-A-iMC、ヒト皮膚由来の正常繊維芽細胞由来iPS細胞からメラノサイトへ分化させた細胞をHC-iMCとする。
　XP-A-iMC及びHC-iMCを位相差顕微鏡にて観察した。この結果、正常ヒト表皮メラノサイト（NHEM）と同様に、XP-A-iMC及びHC-iMCにおいて、樹状突起をもつ細長い紡錘形状の形態を有していた（図１）。目視による細胞形態の観察に加えて、より正確を期すために、遠心分離によるペレットの観察と免疫組織化学染色を行った。遠心分離によるペレットは、目視で黒色調であったためMCへ分化していることが示された。免疫組織化学染色において、MCマーカーであるSOX10、MITF、TYRの発現によってMCの性質を持つ事を確認した（図２）。
（実施例１）ゲノミックシークエンスによる変異の確認
　本実施例では、XP-A-iMCが正しく日本人創始者変異（c.390-1G>C：g.15148G>C）を有しているかの確認を行った。
　ゲノムDNAは、Gentra PuregeneCellKit(Qiagen, Hilden)を用いてXP-A-iMCから分離した。XPA遺伝子の日本人XP-A創始者変異g.15148G>Cの有無を確認するため（c.390-1 G>C）、この変異を含む領域を以下のPCRプライマーで増幅した。
5′-GCTGTGTGCCTAAGTT-3′（フォワード）（配列番号１）
5′-TGCAAAACTAGGAAAAGTTT-3′（リバース）（配列番号２）
Ex-Taq（タカラバイオ）
　PCR産物をアガロースゲルを用いて分解し、QIAquickGelExtraction Kit（Qiagen）を用いて精製し、AppliedBiosystems 3500Genetic Analyzer（AppliedBiosystems）を用いて同じフォワードプライマーで配列決定した（図３Ａ）。さらにウエスタンブロッティング法によって、XP-A-iMCは、XPAタンパク質を発現していないことも確認した（図３Ｂ）。
（実施例２）XP-A-iMCがXPAの性質を有していることの確認
　本実施例では、XPの性質としてDNA修復が障害されているため紫外線に脆弱である性質を有することを、Flow cytometry-based NER 法（Nakano etal,2018,J Invest Dermatol, 138:467-47）及びMTT（増殖/生存）法で検討した。Flow cytometry-based NER 法は臨床診断でも用いられているDNA修復試験であり、UV-C照射後の(6-4)PPに対するモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーで解析することによる方法である。
（Flow cytometry-based NER 法）
　Flow cytometry-based NER 法によりXP-A-iMC及びHC-iMCのDNA病変修復を評価した。具体的にはXP-A-iMC及びHC-iMCを10cmディッシュに播種し、翌日に30 J/m2のUV-Cを照射し、照射直後又は照射6時間後にXP-A-iMC及びHC-iMCを採取した。その後、（6-4）PPに対するマウス一次モノクローナル抗体（1：1,000、Cosmo BioCo.,Ltd.）で22℃で1.5時間染色し、AlexaFluor 488抗体（1：200、Thermo FisherScientific）を含むPBS-TBに22℃で1時間再懸濁し、さらに5μg/mlヨード化プロピジウム（Thermo Fisher）を含むPBSに再懸濁し、XP-A-iMC及びHC-iMCを染色した。染色後、FACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて分析した。すべてのデータは、FlowJoソフトウェア（BDLife Sciences）を用いて解析した。DNA病変の除去率は、平均蛍光強度に基づいて算出した。UVを照射していないXP-A-iMC及びHC-iMCの蛍光強度をバックグラウンドとし、UV照射直後の細胞の蛍光強度を100％とした。蛍光強度の減少は、6時間後に測定した。
（MTT法）
　MTT法により細胞生存率を確認した。具体的には、CellProliferationKit I (MTT assay)(Roche)を用いて、製造元のプロトコールに従ってUV-B照射後24時間後のXP-A-iMC、HC-iMC及びNHEMを評価した。培地は、MTT試薬との反応直前にフェノールレッドフリー培地（Lifeline CellTechnology）に交換した。そして、最終産物を96ウェルプレートに移し、Emax precision microplate reader（MolecularDevices）を用いて595nmと650nmの吸光度で測定した。細胞生存率は、UVを照射してないものとの相対値で表した。
　Flow cytometry-based NER 法における結果を図４Ａに示す。図４Ａは、未照射、UV-C照射直後及びUV-C照射6時間後の（6-4）PP相対シグナル強度を示す代表的ヒストグラムを示す。HC-iMCとXP-A-iMCでは、UV-C照射後6時間以内に（6-4）PPがそれぞれ96.5％と6.1％修復されることが示された。同様の結果が、3回の独立した実験から得られた。
　MTT法における結果を図４Ｂに示す。照射後24時間の細胞生存率を、低線量（10 J/m2, 20 J/m2）又は高線量（100 J/m2, 200 J/m2）でそれぞれ評価した（図４Ｂ）。参考データとして、市販のNHEMの生存率も評価した（Gaddameedhi S et al 2010）。HC-iMCの生存率は、NHEMの生存率とほぼ同様であり、200 J/m2ではベースライン時より有意に低下したが、100J/m2では低下しなかった。一方、XP-A-iMCでは≧20 J/m2 UV-B照射で有意に低下した。
（実施例３）XP-A-iMCを用いたXPの病態解明研究
　本実施例では、XP-A-iMCの紫外線応答を解析し、メラノサイトにおける紫外線刺激に対する反応を網羅的に探索し、XPの病態形成に直接的に関与し治療標的シーズとなりうる分子（創薬標的分子）の特定を検討した。
　XP-A-iMCとHC-iMCを10cmディッシュに播種し、それぞれ低線量（30 J/m2）又は高線量（150 J/m2）のUV-Bを照射した後、37℃で4時間又は12時間インキュベート（図５Ａ）してから網羅的に転写プロファイル解析を行った。遺伝子転写プロファイリングは、GeneChipTM Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix)を用いて、製造元のプロトコールに従って実施した。データは、Robust Multichip Average (RMA) 法を使用してGeneSpring13.1.1software(Agilent Technologies, Inc.)を用いて解析した。UV-Bによって影響を受けるXP-A-iMCとHC-iMCの遺伝子における違いを明らかにした。
　XP-A-iMCとHC-iMCの遺伝子発現量が大幅に変化した（10倍以上）プローブの数を図５Ｂに示す。発現量が大幅に変化した（10倍以上）プローブの数を検討してみると、HC-iMCに低用量UV-Bを照射した場合、27のプローブ（アップレギュレート15、ダウンレギュレート12）の発現量が変化することが解った。しかし、照射前と比較して照射4時間後に10倍以上変化するが、照射12時間後には、ほぼすべての遺伝子が照射前のレベルに戻ることが判明した。一方、XP-A-iMCに低線量UV-Bを照射すると、72のプローブ（34のアップレギュレートと38のダウンレギュレート）の発現レベルが照射4時間後に大きく変化し、これはHC-iMCで観察されたよりもかなり多い数であった。
　次に、HC-iMCに高線量UV-B（150 J/m2）を照射して4時間後に10倍以上発現が上昇又は低下する26又は55のプローブをピックアップした。これらのプローブのHC-iMC及びXP-A-iMCにおける照射4又は12時間後の遺伝子発現量を図５Ｃに示す。HC-iMCでは、すべての発現量が12時間後には元のレベルに戻っていた。一方、XP-A-iMCでは、ほぼ全てのプローブの発現レベルが12時間後でも基底レベルに戻らず、アップレギュレーション又はダウンレギュレーションしたままであることが分かった（図５Ｃ）。遺伝子の発現レベルが、照射後12時間経過しても照射前のレベルに戻らないことが、XP-A-iMCの特徴であることが判明した。（図５Ｃ）
　より詳細にXP-A-iMCのUV-Bに対する細胞応答に関連する分子機構を解明するためにGO解析（p<0.05）を実施した。高線量UV-B照射12時間後に、XP-A-iMCで特異的に発現が上昇した遺伝子（n=49）の結果から、細胞増殖と細胞死の制御がXP-A-iMCの主要なGO用語カテゴリであり、プログラム細胞死の制御（p=0.004）、アポトーシス過程の制御（p=0.004）、細胞増殖の制御（p=0.004）、刺激への応答（p=0.004）と細胞死の制御（p=0．007）であった。一方、132個の特異的に発現低下した遺伝子から示唆されたXP-A-iMCの主要GO用語カテゴリには、細胞分裂（p=3.15 x 10-10）、分裂期細胞周期（p=3.88x10-9）、染色体分離（p=8.64 x 10-8）、分裂期細胞周期過程（p=3.12 x 10-7） 及び細胞周期過程 （p=2.04x10-6）が含まれていた（図６）。
（実施例４）Histone Deacetylase 4(HDAC4)の特定
　本実施例では、XP-A-iMCで特異的に発現が低下した132の遺伝子プローブのうち、特徴的な挙動を強く示す遺伝子としてヒストン脱アセチル化酵素4（HDAC4）を特定した（図７）。HDAC4はヒストン修飾に重要な役割を果たし、細胞増殖、細胞周期進行、分化、発生に重要で、オートファジーやマイトファジーにも関与していることが過去の報告で知られていて、XPで観察される病態を確かに説明することもでき、メラノサイトをエピジェネティックに制御する遺伝子である可能性が考えられる。HDAC4の挙動としては、UV-B照射4時間後にいずれのMCでも低下し、12時間後にNHEMとHC-iMCで回復したが、XP-A-iMCではHDAC4の発現が回復しない傾向があり、UV照射12時間後に減少し続けた（図７）。RT-PCR法とウエスタンブロッティング法を用いてXP-A-iMCのHDAC4の発現を、多角的に確認した（図８Ａ、Ｂ）。
（実施例５）XP-A-iMCの細胞遊走能における検討
　本実施例では、紫外線照射後のXP-A-iMCの細胞遊走能を、scratchアッセイとDigital holographic microscopyを用いて検討した。
　移動能力が低下することを、scratchアッセイとDigitalholographicmicroscopyを用いた解析で明らかにした。具体的には、60 mmディッシュにXP-A-iMCとHC-iMCを播種し、コンフルエントになったところで、高線量（150 J/m2）のUV-Bを照射した後、小さなスクレーパーで掻破して裂隙を作成した。その後裂隙が細胞遊走によって埋まる様子を、位相差顕微鏡で連日観察した（図９）。scratchアッセイによる細胞遊走能の結果を図１０に示す。HDAC4の減少したXP-A-iMCではHC-iMCに比べて、有意に細胞遊走が障害されていることが判明した。
　デジタルホログラフィック顕微鏡でも細胞遊走を検証した（図１１）。高線量（150 J/m2）のUV-Bを照射後のXP-A-iMCとHC-iMCの動きのイメージングとトラッキングには、HoloMonitor(R) M4 microscope(Phase Holographic ImagingAB)を使用した。XP-A-iMCとHC-iMC（1×104個）を6ウェルプレートに播種し、高線量（150 J/m2）のUV-Bを照射後72時間の遊走をトラッキングした。図１２は細胞が遊走した距離を示し、図１３は細胞遊走のスピードを示す。UV-Bを照射後のHDAC4の低下したXP-A-iMCでは遊走能が低下していることが確認できた。これより、XP-A-iMCの表現型が、XP-A患者に特徴的な皮膚症状である色素沈着や色素脱失を引き起こす可能性が示唆された。また実施例２では、XP-A-iMCでは光照射により生存率が低下することが示されたことから、メラノサイトの培養系に候補物資を添加し、メラノサイトの生存率やメラノサイトの細胞遊走能を評価することにより、メラノサイトの細胞傷害を改善する物質が得られることが期待できる可能性もある。
（実施例６）XP-A-iMCの細胞老化における検討
　本実施例では、紫外線照射後のXP-A-iMCの細胞老化が起きているかを免疫蛍光抗体法を用いて検討した。
　60 mmディッシュにXP-A-iMCとHC-iMCを播種し、約70%コンフルエントになったところで、高線量（150 J/m2）のUV-Bを照射した後、24時間後にDNA損傷の指標であり、かつ細胞老化を評価する指標であるγH2AXの発現を検証した。XP-A-iMCではHC-iMCに比べ著明なγH2AXの発現上昇を蛍光抗体法で確認し、細胞老化が促進していることが判明した（図１４）。
　さらに、細胞老化を起こしたメラノサイトは、炎症を惹起する細胞老化随伴分泌現象（Senescence-AssociatedSecretoryPhenotype; SASP）因子群に変化があると考え、RT-PCR法を用いて、多数のSASP因子群の発現上昇を検証した。紫外線（150 J/m2）を照射後に、HDAC4の発現が低下したXP-A-iMCでは、多数のSASP因子群の発現上昇を確認した（図１５）。さらにウエスタンブロッティング法によりSASP因子群の発現を確認した（図１６）。発現上昇したSASP因子群が慢性の炎症を引き起こすことは他のがん種では報告されているが、XP-A患者においては、発現上昇したSASP因子群が慢性の炎症を引き起こすことで、特徴的な光発がんの発生増加を含めた光老化の著明な促進である皮膚症状の原因であると考えられる。そこでHDAC4の低下を抑制することで、XPの皮膚症状を総合的に抑制できることが示唆された。一方、NHEMでも、著しい高線量（500 J/m2）のUV-Bを照射した場合には、XP-A-iMCに紫外線（150 J/m2）を照射した際と同様に、SASP因子群の発現上昇を認めた（図１５）。
（実施例７）NHEMでのHDAC4の発現低下
　本実施例ではNHEMにおけるHDAC4発現を確認した。NHEMを60mmディッシュに播種し、著しい高線量（500 J/cm2）のUV-Bを照射した後、24時間後にRT-PCR法を用いてHDAC4の発現を確認した（図１７）。紫外線照射によって著明にHDAC4の発現が低下するという病態は、紫外線量を著しく増加させた場合では健常者からのメラノサイトでも同様であることも確認でき、HDAC4の低下は、光老化で一般的に重要な可能性が示唆された。
（実施例８）クルクミンによるHDAC4発現改善作用
　60 mmディッシュにXP-A-iMCを播種し、約70%コンフルエントになったところで、高線量（150 J/m2）のUV-Bを照射した後、クルクミンを細胞培地に加えて24時間培養した後に、RT-PCR法を用いてHDAC4の発現を確認した。対照にはクルクミンの溶媒であるジメチルスルホキシド（DMSO）を用いた。高線量（150 J/m2）のUV-Bを照射によって低下したHDAC4の発現が有意に回復していることを認めた（図１８）。またその効果は、クルクミン濃度依存性であることも確認出来た。
（実施例９）C-646によるHDAC4発現改善作用
　60 mmディッシュにXP-iMCを播種し、約70%コンフルエントになったところで、高線量（150 J/m2）のUV-Bを照射した後、C-646を細胞培地に加えて24時間培養した後に、RT-PCR法を用いてHDAC4の発現を確認した（図１９）。対照にはC-646の溶媒であるジメチルスルホキシド（DMSO）を用いた。高線量（150 J/m2）のUV-Bを照射によって低下したHDAC4の発現が有意に回復していることを認めた。
　本発明のヒストンアセチル基転移酵素阻害剤を有効成分として含む、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤によれば、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療を行うことができ、XP患者のみならず、例えば光老化による多く皮膚疾患に適用可能であり大変有用である。特にXP患者にとっては、効果的な治療方法が未確立であるため有用である。また、HDAC4とメラノサイトに着目した新規皮膚障害の予防及び／又は治療剤のスクリーニングをすることができる。

Claims (18)

  1. ヒストンアセチル基転移酵素阻害剤を有効成分として含む、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤。 
  2. 皮膚障害が、光曝露によって生じるメラノサイトにおけるヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害である、請求項１に記載の皮膚障害の予防及び／又は治療剤。
  3. 皮膚障害が、光老化による皮膚障害である、請求項１に記載の皮膚障害の予防及び／又は治療剤。
  4. 皮膚障害が、色素性乾皮症による皮膚障害である、請求項１に記載の皮膚障害の予防及び／又は治療剤。
  5. ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害の予防及び／又は治療剤が、ヒストン脱アセチル化酵素4の発現異常を改善する作用を有する、請求項１に記載の皮膚障害の予防及び／又は治療剤。
  6. ヒストンアセチル基転移酵素阻害剤が、クルクミン、C-646、A-485、アナカルジン酸、ブチロラクトン、CTPB及びガルシノールからなる群から選択される１種又は複数種である、請求項１に記載の皮膚障害の予防及び／又は治療剤。
  7. メラノサイトの培養系に候補物質を添加し、前記メラノサイトの細胞傷害を改善する物質を選別することを特徴とする皮膚障害の予防及び／又治療剤のスクリーニング方法。
  8. メラノサイトの細胞傷害を改善する物質は、ヒストン脱アセチル化酵素4及び／又は細胞老化随伴分泌現象因子を検出することにより得られる、請求項７に記載のスクリーニング方法。
  9. メラノサイトの細胞傷害を改善する物質は、メラノサイトの生存率を評価することにより得られる、請求項７に記載のスクリーニング方法。
  10. メラノサイトの細胞傷害を改善する物質は、メラノサイトの細胞遊走能を評価することにより得られる、請求項７に記載のスクリーニング方法。
  11. メラノサイトが多能性幹細胞由来のメラノサイトである、請求項７に記載のスクリーニング方法。
  12. 多能性幹細胞由来のメラノサイトが、色素性乾皮症の患者由来の多能性幹細胞から作製された多能性幹細胞由来のメラノサイトである、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
  13. メラノサイトの細胞傷害が、光曝露による細胞傷害である請求項７に記載のスクリーニング方法。
  14. 光曝露による細胞傷害が、ヒストン脱アセチル化酵素4異常に伴う皮膚障害である、請求項１３に記載のスクリーニング方法。
  15. 被検者から採取した皮膚について、ヒストン脱アセチル化酵素4及び／又は細胞老化随伴分泌現象因子の異常を検出する工程を含む、皮膚障害の検査方法。
  16. 細胞老化随伴分泌現象因子が、MMP-1、MMP-3、TNFα及びIL-6から選択される、１種又は複数種である、請求項１５に記載の皮膚障害の検査方法。
  17. ヒストン脱アセチル化酵素4及び／又は細胞老化随伴分泌現象因子異常の検出が、以下の１）又は２）を用いて行われる、請求項１５に記載の皮膚障害の検査方法；
    １）ヒストン脱アセチル化酵素4遺伝子及び／若しくは細胞老化随伴分泌現象因子遺伝子の転写産物を特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマー；
    ２）ヒストン脱アセチル化酵素4及び／又は細胞老化随伴分泌現象因子を特異的に認識する抗体。
  18. ヒストン脱アセチル化酵素4及び／又は細胞老化随伴分泌現象因子の異常を検出し得る物質を含む、皮膚障害検査用キット。
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