WO2025005689A1 - Ph 조절을 이용한 l-발린 결정 및/또는 과립 제조 방법 - Google Patents

Ph 조절을 이용한 l-발린 결정 및/또는 과립 제조 방법 Download PDF

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강지훈
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    • C07C229/08—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to hydrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/13—Crystalline forms, e.g. polymorphs

Definitions

  • the present application relates to a method for producing valine crystals and granules, which can reduce the amount of steam required during the production of valine granules and improve the production efficiency of valine granules by forming valine crystals and mixed granules having a low moisture content.
  • products with high amino acid content are not required, and it may be more appropriate to produce granular products with high content (over 70%) that include other nutritionally valuable components contained in the fermentation solution without generating waste during the purification step.
  • valine has low solubility, crystals are formed even when the solid content in the fermentation solution is as low as about 12 to 15% (moisture content of 85 to 88%), and therefore the moisture content of the fermentation solution cannot be reduced to prevent crystal formation. Therefore, a large amount of water must be evaporated during the drying process, so a large amount of energy is consumed during drying.
  • Patent Document 1 US 7514111 B2
  • Patent Document 2 US 10072278 B2
  • the present application aims to provide a method for producing valine crystals, comprising the steps of: preparing a fermentation solution containing valine; adjusting the pH of the fermentation solution; concentrating the fermentation solution to prepare a concentrated fermentation solution; and separating valine crystals containing water from the concentrated fermentation solution.
  • the present application aims to provide a method for producing valine granules, including the steps of preparing a fermentation solution containing valine; adjusting the pH of the fermentation solution; concentrating the fermentation solution to prepare a concentrated fermentation solution; separating valine crystals containing moisture from the concentrated fermentation solution; mixing the valine crystals with seeds to produce valine mixed granules; and drying the valine mixed granules.
  • the present application provides a method for producing valine crystals, comprising the steps of: preparing a fermentation solution containing valine; adjusting the pH of the fermentation solution; concentrating the fermentation solution to prepare a concentrated fermentation solution; and separating valine crystals containing water from the concentrated fermentation solution.
  • the present application provides a method for producing valine granules, comprising: a step of preparing a fermentation solution containing valine; a step of controlling the pH of the fermentation solution; a step of concentrating the fermentation solution to prepare a concentrated fermentation solution; a step of separating valine crystals containing moisture from the concentrated fermentation solution; a step of mixing the valine crystals with seeds to produce valine mixed granules; and a step of drying the valine mixed granules.
  • a fermentation solution containing valine can be concentrated to separate valine moisture, and the separated valine moisture and seeds can be mixed to produce valine mixed granules having a large size and low moisture content.
  • the valine mixed granules having a low moisture content have the advantage of requiring less energy for drying.
  • the moisture content in the valine mixed granules can be further reduced by adjusting the pH of the fermentation solution and/or controlling the concentration speed.
  • the term “about” may be presented before a specific numerical value.
  • the term “about” as used in this application includes not only the exact number described after the term, but also a range that is or is nearly that number. Whether the number is or is nearly the specific number referred to can be determined based on the context in which it is presented. As an example, the term “about” may refer to a range of -10% to +10% of a numerical value. As another example, the term “about” may refer to a range of -5% to +5% of a given numerical value. However, the present invention is not limited thereto.
  • the present application relates to a method and a manufacturing device for valine granules, wherein valine mixed granules in which valine moisture and seeds are mixed are formed and dried, thereby reducing the amount of steam consumed in the process of manufacturing valine, an amino acid with low solubility, and increasing the efficiency of manufacturing valine granules.
  • the method for manufacturing valine crystals comprises the steps of preparing a fermentation solution containing valine; adjusting the pH of the fermentation solution; concentrating the fermentation solution to prepare a concentrated fermentation solution; and separating valine crystals containing water from the concentrated fermentation solution. Each step will be described in detail below.
  • the step of preparing a fermentation solution is a step of preparing a fermentation solution containing valine.
  • Valine contained in the fermentation solution is an amino acid with low solubility in water. In this case, low solubility does not mean that the solubility is below a certain standard.
  • the fermentation solution prepared in the step of preparing a fermentation solution may be a fermentation product prepared by the metabolism of a strain.
  • the term "fermentation product" in the present application may mean a result of enzymatic or metabolic decomposition of an organic substance using a microorganism, for example, a microorganism that produces valine.
  • the fermentation product may include a culture obtained by culturing a microorganism in a culture medium, or a concentrate, dried product, or lyophilized product of the culture obtained by removing a strain therefrom.
  • the fermentation solution may include the entire fermentation product containing valine, or may be a fermentation product containing valine from which impurities have been removed.
  • the fermentation solution contains valine as a main component, but may further contain other components.
  • valine in addition to valine, other amino acids, organic acids, and inorganic substances may be provided in the fermentation solution, and these may be dissolved in water.
  • the concentration of valine in the fermentation solution may be from about 1 g/L to about 200 g/L.
  • concentration of valine described above is merely exemplary, and a fermentation solution having a concentration outside the above-described range may also be used in the method for producing a valine crystal according to one embodiment of the present application.
  • the "microorganism producing valine” or “microorganism having valine-producing ability” used in the step of preparing the fermentation solution of the present application includes both a wild-type microorganism naturally having valine-producing ability or a microorganism in which valine-producing ability is imparted to a parent strain without valine-producing ability through natural or artificial genetic modification, and may be a microorganism whose specific mechanism is weakened or strengthened due to causes such as the insertion of an external gene or the strengthening or inactivation of the activity of an endogenous gene, and may be a microorganism including genetic modification for the production of the target amino acid, i.e., valine.
  • the microorganism producing valine or the microorganism having valine-producing ability in the present application may be a microorganism in which some of the genes in the biosynthetic pathway of valine, which is the target product, are strengthened or weakened, or some of the genes in the valine decomposition pathway are strengthened or weakened.
  • the "strengthening" or “increasing" of the valine-producing ability of the microorganism of the present application means that the valine-producing ability of the microorganism of the present application is improved compared to other microorganisms other than the microorganism of the present application, the parent strain, or an unmodified microorganism.
  • the valine productivity of the microorganism of the present invention may be improved by about 1%, 10%, 100%, 200%, 500%, 1000%, 1100%, 1200%, or 1300% or more compared to the valine productivity of other microorganisms, and may be improved by about 1.01 times, 2 times, 5 times, 10 times, 11 times, 12 times, or 13 times, but is not limited thereto.
  • the term "about” includes all of ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, and the like, and includes all numerical values in a range equal to or similar to the numerical value following the term "about", but is not limited thereto.
  • the above-described microorganism used in the step of preparing the fermentation solution of the present application may be at least one selected from the group consisting of the yeast Candida famata , the ascomycetes Eremothecium ashbyii and Ashbyagossypii , the bacteria Bacillus subtilis , and the microorganism of the genus Corynebacterium sp.
  • the microorganism used in the step of preparing the fermentation solution of the present application is a microorganism of the genus Corynebacterium
  • the microorganism is specifically Corynebacterium glutamicum , Corynebacterium crudilactis , Corynebacterium deserti , Corynebacterium efficiens , Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis , Corynebacterium singulare , Corynebacterium halotolerans , Corynebacterium striatum , Corynebacterium It may be Corynebacterium ammoniagenes , Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans , Corynebacterium testudinoris, Corynebacterium crenatum , or Corynebacterium flavescens , and more specifically, Corynebacterium glutamicum , but is not limited there
  • Microorganisms of the genus Corynebacterium are gram-positive microorganisms that are widely used in the production of L-amino acids and other useful substances.
  • various studies are being conducted to develop highly efficient producing microorganisms and fermentation process technologies.
  • target substance-specific approaches such as increasing the expression of a gene encoding an enzyme involved in the biosynthesis of L-valine or removing a gene unnecessary for biosynthesis are mainly used.
  • a fermentation solution containing an amino acid can be prepared using a strain of the genus Corynebacterium.
  • the Corynebacterium glutamicum utilized for preparing a fermentation solution containing valine may be, but is not limited to, an L-valine biosynthesis overexpressing strain transformed with Corynebacterium glutamicum ATCC13032 in which the L-valine biosynthesis regulatory region is inactivated.
  • Corynebacterium glutamicum may be a strain transformed with the pDZDvalL, pDZDvalP, or pDZDvalS vector using the chromosome of Corynebacterium glutamicum KCCM11201P, Corynebacterium glutamicum KCCM11336P, Corynebacterium glutamicum KCCM11337P, Corynebacterium glutamicum KCCM11338P, or Corynebacterium glutamicum KCCM11201P_DvalA as a template.
  • the Corynebacterium glutamicum can be, but is not limited to, a Corynebacterium glutamicum ATCC13032_DvalL, Corynebacterium glutamicum ATCC13032_DvalP, or Corynebacterium glutamicum ATCC13032_DvalS strain, and includes, without limitation, a microorganism capable of producing a fermentation broth comprising valine (US 10072278 B2).
  • the step of preparing the fermentation solution may further include a step of cultivating a "microorganism producing valine.”
  • the cultivation of the microorganism may be performed according to a suitable medium and culture conditions known in the art. This culture process may be easily adjusted and used by a person skilled in the art according to the selected strain. Specifically, the culture may be batch, continuous, and fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” means a material containing nutrients as main components necessary for culturing the microorganism, and supplies nutrients and growth factors, including water essential for survival and growth.
  • the medium and other culture conditions used for culturing the microorganism of the present application may be any medium used for culturing general microorganisms without particular limitation, but the microorganism of the present application may be cultured in a general medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, phosphorus, inorganic compound, amino acid, and/or vitamin, etc., under aerobic conditions while controlling temperature, pH, etc.
  • the pH of the fermentation solution can be adjusted to about 3.0 or more and less than 6.0.
  • the pH of the fermentation solution can be adjusted to about 3.5 to less than 6.0, about 4.0 to less than 6.0, about 4.5 to less than 6.0, about 5.0 to less than 6.0, about 5.5 to less than 6.0, greater than about 3.0 to 5.5, about 3.5 to 5.5, about 4.0 to 5.5, about 4.5 to 5.5, about 5.0 to 5.5, greater than about 3.0 to 5.0, about 3.5 to 5.0, about 4.0 to 5.0, about 4.5 to 5.0, greater than about 3.0 to 4.5, about 3.5 to 4.5, about 4.0 to 4.5, greater than about 3.0 to 4.0, about 3.5 to 4.0 or greater than about 3.0 to 3.5.
  • the size and hardness of the valine crystals formed in the subsequent concentration step can be controlled. Specifically, when the pH of the fermentation solution is adjusted to the above-described range and then concentration is performed, large and hard valine crystals can be formed, and thus the moisture content of the separated valine crystals can be reduced. If the pH of the fermentation solution is outside the above-described range, the crystal size of the valine crystals precipitated after concentration is small, making it difficult to separate the valine crystals from the fermentation solution mother liquor. In addition, since a relatively large amount of moisture is separated together with the valine crystals, a lot of energy is required for subsequent drying.
  • the pH adjustment can be performed using a conventional acidic substance or basic substance.
  • the substance added to the fermentation solution for pH adjustment can be determined as long as it does not affect the physical properties or chemical structure of valine contained in the fermentation solution.
  • an edible acidic substance or basic substance can be added.
  • a procedure such as heating the fermentation solution may be performed to completely dissolve valine that may have precipitated in the fermentation solution, if necessary.
  • the fermentation solution may be heated to about 60°C to about 90°C.
  • a step of concentrating the prepared fermentation liquid to prepare a concentrated fermentation liquid is performed.
  • concentration step water in the fermentation solution is removed to precipitate valine in the form of crystals.
  • Concentration can be carried out in various ways. Concentration can be carried out in a conventional concentrator (e.g., a paddle dryer, a slurry dryer, a vacuum concentrator, a forced circulation concentrator, a thin film concentrator, or a rotary concentrator, etc.) according to the selection of a person skilled in the art.
  • a conventional concentrator e.g., a paddle dryer, a slurry dryer, a vacuum concentrator, a forced circulation concentrator, a thin film concentrator, or a rotary concentrator, etc.
  • concentration can be performed by removing moisture in the fermentation broth at a rate of 60 g/L/hr to 150 g/L/hr (meaning that 60 g to 150 g of moisture per liter of fermentation broth is removed for 1 hour). In some cases, concentration can be performed by removing moisture in the fermentation broth at a rate of 90 g/L/hr to 150 g/L/hr, 120 g/L/hr to 150 g/L/hr, 60 g/L/hr to 120 g/L/hr, 90 g/L/hr to 120 g/L/hr or 60 g/L/hr to 90 g/L/hr.
  • the concentration rate is a factor affecting the size of valine crystals.
  • the valine crystals When concentrated at the above-described rate, relatively large-sized valine crystals are formed, and the valine crystals can be easily separated from the fermentation broth mother liquor. In addition, moisture in the valine crystals is reduced accordingly.
  • a separation step is performed to separate the valine crystals precipitated by the concentration step from the mother liquor.
  • a solid-liquid separator such as a pressure-reducing membrane filtration device, a pressure-reducing membrane filtration device, or a centrifugal separator can be used.
  • a pressure-reducing membrane filtration device such as a pressure-reducing membrane filtration device, a pressure-reducing membrane filtration device, or a centrifugal separator.
  • the above-described means are exemplary, and the means for performing the separation step are not limited to the above-described examples.
  • the remaining mother liquor after separation of valine crystals can be used again for concentration. Accordingly, valine that did not form a wet crystal in the concentration step or valine that was precipitated as crystals smaller than a certain size and remained in the mother liquor without being separated in the valine crystal separation step can be recycled.
  • an additional process such as heating the fermentation liquor can be performed to re-dissolve valine that was precipitated in the form of fine crystals in the fermentation liquor, if necessary.
  • valine crystals having a low moisture content and being easy to separate can be obtained by controlling the pH of a fermentation solution containing valine and concentrating the fermentation solution at an appropriate speed.
  • the valine crystals manufactured according to one embodiment of the present application may have a viscosity of more than 0 cp and less than 80 cp.
  • the viscosity of the valine crystal is more than 10 cp and less than 80 cp, more than 15 cp and less than 80 cp, more than 20 cp and less than 80 cp, more than 30 cp and less than 80 cp, more than 40 cp and less than 80 cp, more than 50 cp and less than 80 cp, more than 60 cp and less than 80 cp, more than 0 cp and less than 70 cp, more than 10 cp and less than 70 cp, more than 15 cp and less than 70 cp, more than 20 cp and less than 70 cp, more than 30 cp and less than 70 cp, more than 40 cp and less than 70 cp, more than 50 cp and less than 70 cp, more than 60 cp
  • the valine crystals manufactured according to one embodiment of the present application can contain 10 wt % to 55 wt % of moisture.
  • the valine crystals can contain 20 wt % to 55 wt %, 30 wt % to 55 wt %, 40 wt % to 55 wt %, 50 wt % to 55 wt %, 10 wt % to 50 wt %, 20 wt % to 50 wt %, 30 wt % to 50 wt %, 40 wt % to 50 wt %, 10 wt % to 40 wt %, 20 wt % to 40 wt %, 30 wt % to 40 wt %, 10 wt % to 30 wt %, 20 wt % to 30 wt %, or 10 wt % to 20 wt % of moisture. Since the valine crystals having the moisture content described above have
  • a method for manufacturing valine granules comprises the steps of: preparing a fermentation solution containing valine; adjusting the pH of the fermentation solution; concentrating the fermentation solution to prepare a concentrated fermentation solution; separating valine crystals containing water from the concentrated fermentation solution; mixing the valine crystals with seeds to prepare valine mixed granules; and drying the valine mixed granules.
  • the steps of preparing a fermentation solution, adjusting the pH of the fermentation solution, concentrating the fermentation solution, and separating valine crystals can be performed in the same manner as in the method for manufacturing valine crystals described above.
  • the steps of mixing valine crystals with seeds to manufacture mixed granules; and the steps of drying the mixed granules will be mainly described.
  • the valine crystals obtained in the valine crystal separation step are mixed with seeds for manufacturing valine granules.
  • the seed used in the mixed granule manufacturing step is also called a seed crystal or seed crystal, and may refer to a substance used as a catalyst for crystallization or granulation of a liquid.
  • the seed in the present application may be a valine crystal.
  • the seeds used in the mixed granule manufacturing step may have an average particle size of 150 to 300 ⁇ m. Specifically, seeds having an average particle size of 150 to 250 ⁇ m, 200 to 300 ⁇ m, or 200 to 250 ⁇ m may be used, but are not limited thereto.
  • the particle size of the seeds used may ultimately affect the productivity of manufacturing granules according to the present application, and may be appropriately selected by those skilled in the art in consideration of the desired moisture content, etc.
  • a mixed granulator can be used in the mixed granule manufacturing step.
  • the mixed granulator can obtain granules by injecting seeds into the mixed granulator through a feeder at a constant rate while simultaneously supplying valine crystals obtained in the previous separation step.
  • the mixed granulator can each include a feeder for supplying seeds therein and a member for supplying valine crystals.
  • a gas nozzle for generating air flow inside a chamber, a paddle for mixing the seeds and valine crystals provided in the chamber, etc. can be provided inside the mixed granulator.
  • amino acid mixed granules having a low moisture content and a large crystal size can be manufactured by mixing the seed and the amino acid moisture content.
  • valine crystals having a large crystal size are precipitated, and since the valine crystals having a large crystal size can be easily separated from the fermentation liquid, the moisture content in the valine crystals is relatively low.
  • the valine crystals having a low moisture content and the seed are granulated in a mixed granulator in the mixed granule manufacturing step, the manufactured valine mixed granules also have a low moisture content and a large size.
  • granules are macroscopic particles which are permanent aggregates of larger particles such as powders, and may have an average particle diameter of 50 ⁇ m to 5 mm, 75 ⁇ m to 4 mm or 100 ⁇ m to 3 mm.
  • the valine mixed granules obtained in the mixed granule manufacturing step may contain 10 wt% to 50 wt% of moisture.
  • the valine mixed granules may contain 20 wt% to 50 wt%, 30 wt% to 50 wt%, 40 wt% to 50 wt%, 10 wt% to 40 wt%, 20 wt% to 40 wt%, 30 wt% to 40 wt%, 10 wt% to 30 wt%, 20 wt% to 30 wt% or 10 wt% to 20 wt% of moisture.
  • This is a low moisture content compared to amino acid granules obtained according to the prior art. Therefore, the amount of energy required to dry the valine mixed granules obtained according to the present application can be reduced.
  • a drying step is performed to dry the valerian mixed granules to obtain an amino acid product.
  • valine product in the present application means a product in which valine contained in a fermentation solution is manufactured into various formulations.
  • the valine product may mean a valine-containing mixture in the form of granules.
  • the formulation of the valine product may be changed as long as it does not change the invention of the present application.
  • a subsequent process may be further performed to implement various formulations of valine products.
  • the above-described valine product can be used as an additive for animal feed, etc., and there is no limitation on the use.
  • a fermentation solution containing amino acids can be concentrated to separate amino acid moisture, and the separated amino acid moisture can be mixed with seeds to produce amino acid mixed granules having a large size and low moisture content.
  • Amino acid mixed granules having low moisture content have the advantage of requiring less energy for drying.
  • the moisture content in the amino acid mixed granules can be further reduced by adjusting the pH of the fermentation solution or controlling the concentration speed.
  • Corynebacterium glutamicum KCCM11338P (US 10072278 B2), one of the strains producing L-valine, was cultured in a medium containing 5% glucose, 2% ammonium sulfate, 0.1% monobasic potassium phosphate, 0.05% magnesium sulfate (7-hydrate), 2.0% CSL (corn steep liquor), 200 ⁇ g/L biotin, and pH 7.2 at about 30°C for 72 hours to obtain a fermentation broth having the following composition.
  • the fermentation broth contains the cultured medium and microorganisms, and the moisture content and composition were analyzed therefrom.
  • Table 2 shows the results of the analysis of the composition of the valine fermentation broth.
  • the fermentation solution having an L-valine concentration of 80 g/L prepared in Experimental Example 1 was divided into 2 L portions, and sulfuric acid was added to prepare process solutions according to pH (7.5 to 3.0).
  • a vacuum concentrator was used to concentrate the process solution at a rate of 60 g/L/hr under a vacuum of 120 torr until the valine concentration of the process solution became 200 g/L.
  • the concentrated crystal slurry containing valine crystals was subjected to solid-liquid separation using a basket separator to obtain L-valine crystals and a mother liquor.
  • the LOD moisture measurement results confirmed that the moisture content in the valine crystals was low when the pH of the fermentation solution was over 3.0 and under 6.0.
  • the viscosity of the concentrated slurry was analyzed, it was confirmed that the viscosity of the concentrated slurry was low when the pH of the fermentation solution was over 3.0 and under 6.0.
  • the low viscosity of the concentrated slurry means that the size of the valine crystals contained in the concentrated slurry is large, and not many fine crystals were formed.
  • the fermentation solution with a pH of 7.0 where the viscosity of the concentrated slurry was high, it was analyzed that many fine valine crystals were formed, resulting in a high slurry viscosity.
  • the pH of the fermentation solution affects the formation of valine crystals. Specifically, it was confirmed that large valine crystals were formed in a specific pH range, which resulted in a low viscosity of the concentrated slurry and low moisture in the separated crystals.
  • Example 1 the fermentation broth with an L-valine concentration of 80 g/L was divided into 5 L portions, and sulfuric acid was added to adjust the pH of the fermentation broth to 3.8.
  • a vacuum evaporator was used to concentrate the mixture at a vacuum of 120 torr until the concentration reached 200 g/L.
  • the concentration rate was varied from 18 g/L/hr to 120 g/L/hr for each batch, and the properties of the concentrated crystal slurries obtained at different concentration rates were compared.
  • the concentration rate was calculated by expressing the concentration of valine (g/L) concentrated per hour based on the time taken for moisture to be removed from the initial valine concentration of 80 g/L of the fermentation broth until the valine concentration reached 200 g/L. The volume of condensate and the time required for this were measured to calculate the concentration rate.
  • the concentrated crystal slurry containing valine crystals was subjected to solid-liquid separation using a basket separator to obtain L-valine crystals and mother liquor.
  • the moisture content in the valine crystals according to the concentration rate was compared.
  • the moisture content in the valine crystals according to the fermentation broth concentration rate was compared through LOD analysis.
  • Sulfuric acid was added to 10 L of the fermentation broth containing 80 g/L of L-valine to adjust the pH of the fermentation broth to 3.8.
  • a vacuum evaporator was used to concentrate the broth at a rate of 60 g/L/hr under a vacuum of 120 torr until the concentration of the fermentation broth became 200 g/L.
  • the concentrated crystal slurry was separated into solid and liquid using a decanter to obtain 840 g of L-valine solid and 2850 mL of supernatant. At this time, the moisture content of the valine crystal was confirmed to be 37 wt%, and the valine crystal yield was 80.0% based on the fermentation solution.
  • Valine crystals were manufactured using the same method as in Experimental Example 4, and the separated valine crystals and pre-dried valine seeds (valine content 75 w/w%) were mixed to manufacture crystals having a moisture content of 15% to 47%, respectively, and then valine mixed granule crystals were manufactured using a mixing granulator.
  • mixed granules could be manufactured using a mixed granulator for all crystals with a moisture content of 15% to 47%.

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Abstract

본 출원은 pH 조절을 이용한 발린 결정 및/또는 발린 과립 제조 방법에 관한 것이다.

Description

PH 조절을 이용한 L-발린 결정 및/또는 과립 제조 방법
본 출원은 수분 함량이 적은 발린 결정 및 혼합과립을 형성함으로써 발린 과립 생성 중 필요한 스팀의 양을 줄이고, 발린 과립 생성 효율을 향상시킬 수 있는, 발린 결정 및 과립 제조방법에 관한 것이다.
발효를 통해 고순도 아미노산을 수득하기 위해서는 발효 공정 단계 이후 부산물을 제거하기 위한 아미노산의 분리 또는 정제 단계가 필수적으로 필요하다.
하지만 사료용 아미노산 제품에서는 아미노산 고함량(98% 이상) 제품이 필요하지 않으며 발효액 내 포함된 기타 영양상 가치 있는 성분을 포함하면서 정제단계에서 폐기물이 발생하지 않고도 높은 함량(70% 이상)을 갖는 과립제품을 만드는 것이 더 적절할 수 있다.
기존 기술(US 7514111 B2)에서는 사료첨가제용 아미노산 과립제품을 제조하기 위해 발효액 내 많은 수분을 증발시킨 후 유동층 과립기(fluidized bed granulator)를 사용하여 과립을 제조한다. 용해도가 높은 아미노산의 경우 고형분 함량 약 60~65%(수분 함량 35~40%)까지 수분을 증발시켜도 결정이 생성되지 않으므로 노즐(nozzle)을 통해 발효액이 분사되는 유동층 과립방법으로 과립화가 가능하다. 그러나, 발린은 용해도가 낮아 발효액 내 고형분 함량이 약 12~15%(수분 함량 85~88%) 수준으로 낮은 경우에도 결정이 생성되므로, 결정 생성을 방지하기 위해 발효액의 수분 함량을 낮출 수 없다. 따라서 건조 과정에서 많은 양의 물을 증발시켜야 하므로 건조시 많은 양의 에너지 소모가 필요하다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) US 7514111 B2
(특허문헌 2) US 10072278 B2
본 출원은 발린을 포함하는 발효액을 준비하는 단계; 상기 발효액의 pH를 조절하는 단계; 상기 발효액을 농축하여 농축 발효액을 준비하는 단계; 및 상기 농축 발효액에서 수분을 포함하는 발린 결정을 분리하는 단계를 포함하는, 발린 결정 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 출원은 발린을 포함하는 발효액을 준비하는 단계; 상기 발효액의 pH를 조절하는 단계; 상기 발효액을 농축하여 농축 발효액을 준비하는 단계; 상기 농축 발효액에서 수분을 포함하는 발린 결정을 분리하는 단계; 상기 발린 결정을 시드와 혼합하여 발린 혼합과립을 제조하는 단계; 및 상기 발린 혼합과립을 건조하는 단계를 포함하는, 발린 과립 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원은 발린을 포함하는 발효액을 준비하는 단계; 상기 발효액의 pH를 조절하는 단계; 상기 발효액을 농축하여 농축 발효액을 준비하는 단계; 및 상기 농축 발효액에서 수분을 포함하는 발린 결정을 분리하는 단계를 포함하는, 발린 결정 제조방법을 제공한다.
또한, 본 출원은 발린을 포함하는 발효액을 준비하는 단계; 상기 발효액의 pH를 조절하는 단계; 상기 발효액을 농축하여 농축 발효액을 준비하는 단계; 상기 농축 발효액에서 수분을 포함하는 발린 결정을 분리하는 단계; 상기 발린 결정을 시드와 혼합하여 발린 혼합과립을 제조하는 단계; 및 상기 발린 혼합과립을 건조하는 단계를 포함하는, 발린 과립 제조 방법을 제공한다.
본 출원에 따르면, 발린을 포함하는 발효액을 농축하여 발린 습정을 분리하고, 분리된 발린 습정과 시드를 혼합하여 크기가 크고 수분 함량이 적은 발린 혼합과립을 제조할 수 있다. 수분 함량이 적은 발린 혼합과립은 건조에 필요한 에너지량이 적다는 장점이 있다. 특히, 본 출원에 따르면, 발효액의 pH를 조정 및/또는 농축 속도를 조절하여 발린 혼합과립 내 수분 함량을 더욱 낮출 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 관사("a", "an", 및 "the")에는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수의 참조대상이 포함된다. 문맥상 달리 언급되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하고 복수형 용어는 단수형을 포함한다. 본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 달리 언급되지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 출원은 발린 과립 제조 방법 및 제조 장치에 관한 것으로, 발린 습정과 시드가 혼합된 발린 혼합과립을 형성하고 건조함으로써, 용해도가 낮은 아미노산인 발린 제조 과정에서 소모되는 스팀 양을 줄이고, 발린 과립 제조 효율을 높일 수 있다.
본 출원에 따른 발린 결정 제조방법은 발린을 포함하는 발효액을 준비하는 단계; 상기 발효액의 pH를 조절하는 단계; 상기 발효액을 농축하여 농축 발효액을 준비하는 단계; 및 상기 농축 발효액에서 수분을 포함하는 발린 결정을 분리하는 단계를 포함한다. 이하 각 단계에 대하여 자세히 살펴본다.
발효액을 준비하는 단계는 발린을 포함하는 발효액을 준비하는 단계이다. 발효액에 포함된 발린은 물에 대한 용해도가 낮은 아미노산이다. 이때 용해도가 낮다는 것은 용해도가 특정 기준 이하인 것을 의미하지는 않는다. 발효액을 준비하는 단계에서 준비되는 발효액은 균주의 대사에 의해 준비된 발효물일 수 있다. 본 출원에서 용어 "발효물"은 미생물, 예컨대, 발린을 생산하는 미생물을 이용한 유기물질의 효소적 또는 대사적 분해의 결과물을 의미할 수 있다. 예를 들면, 발효물은 미생물을 배양배지에 배양하여 수득된 배양물 자체, 또는 이로부터 균주를 제거하여 수득된 배양물의 농축물, 건조물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다. 아울러, 이 경우에 발효액은 발린을 포함하는 발효물 전체를 포함하거나 발린을 포함하는 발효물로부터 불순물이 제거된 것일 수 있다.
발효액은 발린을 주요 성분으로 하되 기타 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 발효액 내에는 발린 외 다른 아미노산, 유기산 및 무기물이 더 제공될 수 있으며, 이들은 물(water)에 용해된 상태일 수 있다. 발효액 내 발린의 농도는 약 1 g/L 내지 약 200 g/L일 수 있다. 다만, 상술한 발린의 농도는 예시적인 것에 불과하며 상술한 범위의 농도 외 농도의 발효액도 본 출원의 일 양태에 따른 발린 결정 제조 방법에 이용할 수 있다.
본 출원의 발효액을 준비하는 단계에서 이용되는 "발린을 생산하는 미생물" 또는 "발린 생산능을 갖는 미생물"은 자연적으로 발린 생산능을 가지고 있는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난, 발린 생산능이 없는 모균주에 발린 생산능이 부여된 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 아미노산 즉, 발린의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 발린을 생산하는 미생물, 또는 발린 생산능을 갖는 미생물은, 목적산물인 발린의 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, 발린 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물 일 수 있다. 본 출원 미생물의 발린 생산능이 "강화" 또는 "증가"한다는 것은, 본 출원 미생물 이외의 다른 미생물, 모균주 또는 비변형 미생물과 비교하여 본 출원 미생물의 발린 생산능이 향상된 것을 의미한다. 일 예로, 본 출원 미생물은 다른 미생물의 발린 생산능에 비하여 약 1% 이상, 10% 이상, 100% 이상 200% 이상 500% 이상 1000% 이상, 1100% 이상, 1200% 이상, 1300% 이상 향상된 것일 수 있으며, 약 1.01배 이상, 2배 이상, 5배 이상, 10배이상, 11배 이상, 12배 이상, 13배 이상 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 발효액을 준비하는 단계에서 사용되는 상술한 미생물은 효모인 캔디다 파마타(Candida famata), 자낭균류인 에레모테시움 에쉬비(Eremothecium ashbyii)와 에쉬비아 고시피(Ashbyagossypii), 세균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.) 미생물로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
예컨대, 본 출원의 발효액을 준비하는 단계에서 사용되는 미생물이 코리네박테리움 속 미생물인 경우, 상기 미생물은 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 코리네박테리움 크레나툼(Corynebacterium crenatum), 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
코리네박테리움 속(the genus Corynebacterium) 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 상기 L-아미노산 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, L-발린의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다. 본 출원에서도 코리네박테리움 속의 균주를 이용하여 아미노산을 포함하는 발효액을 준비할 수 있다.
본 출원의 일 구체예에 따르면, 발린을 포함하는 발효액을 준비하는데 활용되는 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 형질전환시켜, L-발린 생합성 조절부위가 불활성화된 L-발린 생합성 과발현 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11336P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11337P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11338P, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P_DvalA의 염색체를 주형으로 하여 pDZDvalL, pDZDvalP, pDZDvalS 벡터로 형질전환된 균주일 수 있다. 다른 예시에 따르면, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalL, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalP, 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032_DvalS 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 발린을 포함하는 발효액을 생산할 수 있는 미생물을 제한없이 포함한다(US 10072278 B2).
발효액을 준비하는 단계는 "발린을 생산하는 미생물"을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
다음으로, 발효액의 pH를 조절하는 단계가 수행된다. 여기에서 발효액의 pH는 약 3.0 초과 내지 6.0 미만으로 조절될 수 있다. 경우에 따라, 발효액의 pH는 약 3.5 내지 6.0 미만, 약 4.0 내지 6.0 미만, 약 4.5 내지 6.0 미만, 약 5.0 내지 6.0 미만, 약 5.5 내지 6.0 미만, 약 3.0 초과 내지 5.5, 약 3.5 내지 5.5, 약 4.0 내지 5.5, 약 4.5 내지 5.5, 약 5.0 내지 5.5, 약 3.0 초과 내지 5.0, 약 3.5 내지 5.0, 약 4.0 내지 5.0, 약 4.5 내지 5.0, 약 3.0 초과 내지 4.5, 약 3.5 내지 4.5, 약 4.0 내지 4.5, 약 3.0 초과 내지 4.0, 약 3.5 내지 4.0 또는 약 3.0 초과 내지 3.5로 조절될 수 있다.
발효액의 pH를 조정함으로써 이어지는 농축 단계에서 형성되는 발린 결정의 크기와 경도를 조절할 수 있다. 구체적으로, 상술한 범위로 발효액의 pH를 조정한 후 농축을 수행했을 때 크고 단단한 발린 결정이 형성될 수 있으며, 이에 따라 분리된 발린 결정의 수분 함량을 낮출 수 있다. 발효액의 pH가 상술한 범위 밖에 있을 경우, 농축 후 석출되는 발린 결정의 결정 크기가 작아 발효액 모액으로부터 발린 결정을 분리하기 어려울 수 있다. 또한, 발린 결정과 함께 상대적으로 많은 양의 수분이 함께 분리되기 때문에 이후 건조에 많은 에너지가 필요하다.
발효액의 pH를 조절하는 단계에서 pH 조정은 통상적인 산성 물질 또는 염기성 물질을 이용하여 수행할 수 있다. 다만, pH 조정을 위해 발효액에 첨가되는 물질은 발효액에 포함된 발린의 물성 또는 화학적 구조에 영향을 미치지 않는 한에서 결정할 수 있다. 또한, 식품 또는 사료용으로 발린 제품이 사용될 것을 고려하여, 식용 가능한 산성 물질 또는 염기성 물질을 첨가할 수도 있다.
상술한 pH 조정 후 필요에 따라 발효액 내 석출되어 있을 수 있는 발린을 완전히 용해하기 위해 발효액을 가열하는 등의 절차가 수행될 수 있다. 예를 들어, 발효액은 약 60℃ 내지 약 90℃로 가열될 수 있다.
발효액의 pH를 조절하는 단계 수행 후 준비된 발효액을 농축하여 농축 발효액을 준비하는 단계가 수행된다.
농축 단계에서는 발효액 내 수분을 제거하여 발린을 결정 형태로 석출시킨다. 농축은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 농축은 당업자의 적의 선택에 의하여 통상의 농축기(예컨대, 패들 건조기(paddle dryer), 슬러리(slurry) 건조설비, 감압농축기, 강제순환농축기, 박막농축기, 또는 로타리 농축기 등) 내에서 수행될 수 있다.
농축 단계에서 농축은 상기 발효액 내 수분을 60 g/L/hr 내지 150 g/L/hr의 속도로 제거하여 수행될 수 있다(발효액 1 리터 당 수분 60 g 내지 150 g을 1시간 동안 제거한다는 의미). 경우에 따라, 농축은 발효액 내 수분을 90 g/L/hr 내지 150 g/L/hr, 120 g/L/hr 내지 150 g/L/hr, 60 g/L/hr 내지 120 g/L/hr, 90 g/L/hr 내지 120 g/L/hr 또는 60 g/L/hr 내지 90 g/L/hr의 속도로 제거하여 수행될 수 있다. 본 출원에서 농축 속도는 발린 결정 크기에 영향을 미치는 인자이다. 상술한 속도로 농축했을 때 상대적으로 큰 크기의 발린 결정이 형성되며, 발효액 모액으로부터 발린 결정을 쉽게 분리할 수 있다. 또한, 이에 따라 발린 결정 내 수분이 줄어든다.
다음으로, 농축 단계에서 농축에 따라 석출된 발린 결정을 모액으로부터 분리하는 분리 단계가 수행된다.
분리 단계에서는 농축 발효액으로부터 수분을 포함하는 발린 결정을 분리하는데, 이때 감압 막여과 장치, 가압 막여과 장치, 원심분리 장치 등의 고액분리기를 사용할 수 있다. 다만, 상술한 수단들은 예시적인 것이며, 분리 단계를 수행하는 수단은 상술한 예시로 제한되지는 않는다.
분리 단계에서 발린 결정 분리 후 남은 모액을 다시 농축에 활용할 수 있다. 이에 따라, 농축 단계에서 습정을 형성하지 못한 발린 또는 일정 크기 이하의 결정으로 석출되어 발린 결정 분리 단계에서 분리되지 않고 모액에 남아있는 발린이 재활용될 수 있다. 또한, 모액 순환 후에는 필요에 따라 미립 결정 형태로 석출된 발린을 다시 발효액 내에 용해하기 위해 발효액을 가열하는 등의 공정이 추가로 수행될 수 있다.
상술한 본 출원의 일 양태에 따른 발린 결정 제조방법에 따르면, 발린을 포함하는 발효액의 pH를 조절하고 적절한 속도로 발효액을 농축함으로써 수분 함량이 적고 분리가 용이한 발린 결정을 수득할 수 있다.
본 출원의 일 양태에 따라 제조된 발린 결정은 점도가 0 cp 초과 내지 80 cp 미만일 수 있다. 경우에 따라, 발린 결정의 점도는 10 cp 초과 내지 80 cp 미만, 15 cp 초과 내지 80 cp 미만, 20 cp 초과 내지 80 cp, 30 cp 초과 내지 80 cp 미만, 40 cp 초과 내지 80 cp, 50 cp 초과 내지 80 cp 미만, 60 cp 초과 내지 80 cp 미만, 0 cp 초과 내지 70 cp 미만, 10 cp 초과 내지 70 cp 미만, 15 cp 초과 내지 70 cp 미만, 20 cp 초과 내지 70 cp 미만, 30 cp 초과 내지 70 cp 미만, 40 cp 초과 내지 70 cp 미만, 50 cp 초과 내지 70 cp 미만, 60 cp 초과 내지 70 cp 미만, 0 cp 초과 내지 50 cp 미만, 10 cp 초과 내지 50 cp 미만, 15 cp 초과 내지 50 cp 미만, 20 cp 초과 내지 50 cp 미만, 30 cp 초과 내지 50 cp 미만, 40 cp 초과 내지 50 cp 미만, 0 cp 초과 내지 30 cp 미만, 10 cp 초과 내지 30 cp 미만, 15 cp 초과 내지 30 cp 미만, 20 cp 초과 내지 30 cp 미만, 0 cp 초과 내지 25 cp 미만, 10 cp 초과 내지 25 cp 미만, 15 cp 초과 내지 25 cp 미만, 20 cp 초과 내지 25 cp 미만, 0 cp 초과 내지 20 cp 미만, 10 cp 초과 내지 20 cp 미만, 10 cp 초과 내지 20 cp 미만, 0 cp 초과 내지 15 cp 미만, 10 cp 초과 내지 15 cp 미만, 또는 0 cp 초과 내지 10 cp 미만일 수 있다. 상술한 범위의 점도를 갖는 발린 결정은 수분 함량이 적고 적절한 크기를 갖기 때문에 모액으로부터 용이하게 분리할 수 있다.
본 출원의 일 양태에 따라 제조된 발린 결정은 10 중량% 내지 55 중량%의 수분을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 발린 결정은 20 중량% 내지 55 중량%, 30 중량% 내지 55 중량%, 40 중량% 내지 55 중량%, 50 중량% 내지 55 중량%, 10 중량% 내지 50 중량%, 20 중량% 내지 50 중량%, 30 중량% 내지 50 중량%, 40 중량% 내지 50 중량%, 10 중량% 내지 40 중량%, 20 중량% 내지 40 중량%, 30 중량% 내지 40 중량%, 10 중량% 내지 30 중량%, 20 중량% 내지 30 중량%, 또는 10 중량% 내지 20 중량%의 수분을 포함할 수 있다. 상술한 함량의 수분을 갖는 발린 결정은 수분 함량이 상대적으로 적기 때문에 별도의 건조 단계 없이 바로 사용할 수 있거나 약간의 건조만을 거쳐 사용할 수 있기 때문에, 공정에 소요되는 에너지를 절감할 수 있다.
발린 과립 제조 방법은 발린을 포함하는 발효액을 준비하는 단계; 상기 발효액의 pH를 조절하는 단계; 상기 발효액을 농축하여 농축 발효액을 준비하는 단계; 상기 농축 발효액에서 수분을 포함하는 발린 결정을 분리하는 단계; 상기 발린 결정을 시드와 혼합하여 발린 혼합과립을 제조하는 단계; 및 상기 발린 혼합과립을 건조하는 단계를 포함한다.
여기서 발효액을 준비하는 단계, 발효액의 pH를 조절하는 단계, 발효액의 농축 단계 및 발린 결정 분리 단계는 앞서 설명한 발린 결정 제조방법에서와 동일하게 수행될 수 있는바, 이하에서는 설명의 중복을 피하기 위해 발린 결정을 시드와 혼합하여 혼합과립을 제조하는 단계; 및 혼합과립을 건조하는 단계를 중심으로 설명한다.
혼합과립 제조 단계에서 발린 결정 분리 단계에서 수득된 발린 결정은 발린 과립 제조를 위하여 시드와 혼합된다.
혼합과립 제조 단계에서 사용되는 시드(Seed)는 종결정 또는 종정으로도 불리우며, 액체의 결정화 또는 과립화를 위해 촉매제로 사용되는 물질을 의미할 수 있다. 본 출원에서의 시드는 발린 결정일 수 있다. 상기 시드는 발효액과 접촉시 발효액 내에 존재하는 고형 성분이 시드와 결합하면서 응집이 이루어짐으로써 과립을 형성할 수 있다.
혼합과립 제조 단계에서 사용되는 시드는 150 내지 300 μm의 평균 입도를 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 150 내지 250 μm, 200 내지 300 μm, 또는 200 내지 250 μm의 평균 입도를 갖는 시드를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 사용되는 시드의 입도는 결과적으로 본 출원에 따른 과립의 제조의 생산성에 영향을 줄 수 있는 바, 원하는 수분 함량 등을 고려하여 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
혼합과립 제조 단계에서 혼합형 과립기를 이용할 수 있다. 혼합형 과립기는 혼합형 과립기에 피더를 통해 시드를 일정한 속도로 주입하는 동시에 앞서 분리 단계에서 수득된 발린 결정을 공급함으로써 과립을 수득하는 것일 수 있다. 혼합형 과립기는 시드를 내부로 공급하는 피더와 발린 결정을 공급하는 부재를 각각 포함할 수 있다. 또한, 혼합형 과립기 내부에는 챔버 내부에 공기 유동을 발생시키기 위한 가스 노즐, 챔버 내 제공된 시드와 발린 결정을 혼합하기 위한 패들 등이 제공될 수 있다. 챔버 내 유입된 시드와 발린 결정이 서로 뭉치면서 아미노산 혼합과립이 형성될 수 있다.
본 출원의 일 양태에 따르면, 시드와 아미노산 습정의 혼합에 의해 수분 함량이 적고 결정 크기가 큰 아미노산 혼합과립이 제조될 수 있다. 앞서 검토한 것과 같이 본 출원에 따르면 결정의 크기가 큰 발린 결정이 석출되고, 결정 크기가 큰 발린 결정은 발효액으로부터 쉽게 분리할 수 있기 때문에, 발린 결정 내 수분 함량이 상대적으로 적다. 또한, 혼합과립 제조 단계에서 수분 함량이 적은 발린 결정과 시드를 혼합형 과립기에서 과립화함에 따라, 제조되는 발린 혼합과립 역시 수분 함량이 적고 크기가 크다.
여기서 "과립(granules)"은 분말(powder)과 같은 작은 입자들이 모여서 이루어진 보다 큰 크기의 영구적 응집체인 거시적 입자(macroscopic particles)로서, 평균 입자 직경이 50 μm 내지 5 mm, 75 μm 내지 4 mm 또는 100 μm 내지 3 mm 크기의 입자일 수 있다.
혼합과립 제조 단계에서 수득된 발린 혼합과립은 10 중량% 내지 50 중량%의 수분을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 발린 혼합과립은 20 중량% 내지 50 중량%, 30 중량% 내지 50 중량%, 40 중량% 내지 50 중량%, 10 중량% 내지 40 중량%, 20 중량% 내지 40 중량%, 30 중량% 내지 40 중량%, 10 중량% 내지 30 중량%, 20 중량% 내지 30 중량% 또는 10 중량% 내지 20 중량%의 수분을 포함할 수 있다. 이는 종래 기술에 따라 수득된 아미노산 과립과 비교했을 때 낮은 수분 함량이다. 따라서, 본 출원에 따라 수득된 발린 혼합과립을 건조하는데 필요한 에너지량을 절감할 수 있다.
다음으로, 발린 혼합과립을 건조하여 아미노산 제품을 수득하는 건조 단계가 수행된다.
건조 단계에서는 앞서 수득한 발린 혼합과립을 건조하는데, 건조 방법에는 제한이 없다. 건조 후에는 발린 제품을 수득할 수 있다. 본 출원의 용어, "발린 제품"은 발효액에 포함된 발린을 다양한 제형으로 제품화한 것을 의미한다. 예를 들어, 발린 제품은 과립(granule) 형태의 발린 함유 혼합물을 의미할 수 있다. 다만, 필요에 따라서는 발린 제품의 제형은 본 출원의 발명의 사상을 변경하지 않는 한에서 달리할 수 있다. 또한, 상술한 것과 같이 다양한 발린 제품의 제형을 구현하기 위해 후속 공정을 더 수행할 수 있다. 상술한 발린 제품은 동물 사료의 첨가제 등으로 이용될 수 있으며, 용도에는 제한이 없다.
본 출원에 따르면, 아미노산을 포함하는 발효액을 농축하여 아미노산 습정을 분리하고, 분리된 아미노산 습정과 시드를 혼합하여 크기가 크고 수분 함량이 적은 아미노산 혼합과립을 제조할 수 있다. 수분 함량이 적은 아미노산 혼합과립은 건조에 필요한 에너지량이 적다는 장점이 있다. 특히, 본 출원에 따르면, 발효액의 pH를 조정하거나 농축 속도를 조절하여 아미노산 혼합과립 내 수분 함량을 더욱 낮출 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실험예 1. 코리네박테리움 미생물 배양을 통한 발린 발효액의 제조
본 실험예에서 L-발린을 포함하는 과립을 제조하기 위하여, L-발린을 생산하는 균주 중 하나인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11338P(US 10072278 B2)를 포도당 5%, 황산암모늄 2%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.05%, CSL(옥수수 침지액) 2.0%, 비오틴 200 μg/L, pH 7.2 조성의 배지에서 약 30℃ 조건 하 72시간 배양하여 하기 조성을 갖는 발효액을 수득하였다. 상기 발효액은 배양된 배지 및 미생물을 포함하고 있으며, 이로부터 수분 측정 및 조성을 분석하였다. 표 2는 발린 발효액 조성 분석 결과이다.
조성 값(g/L)
발린 80.0
기타 아미노산 8.8
유기산 0.7
무기물 11.0
수분(%) 89.0
실험예 2. 발효액의 pH에 따른 아미노산 습정 내 수분 함량 비교 분석
앞서 실험예 1에서 준비한 L-발린 농도가 80 g/L인 발효액을 2 L씩 분할한 후 황산을 첨가하여 pH(7.5~3.0)별 공정액을 제조하였다. 제조된 공정액에서 발린 결정을 석출하기 위해서 감압농축기를 활용해서 공정액의 발린 농도가 200 g/L가 될 때까지 진공도 120 torr에서 시간당 60 g/L/hr 속도로 농축하였다. 발린 결정을 포함하는 농축 결정 슬러리를 바스켓 분리기로 고액 분리하여 L-발린 결정과 모액을 수득하였다.
발효액의 pH에 따른 발린 결정 내 수분 함량은 LOD분석을 통해 비교하였다.
발효액의 pH 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0
슬러리 점도(cp) 89 80 20.5 16.0 90
결정 내 수분함량(중량%) 45 40 32 30 39
LOD 수분측정 결과 발효액의 pH가 3.0 초과 내지 6.0 미만일 때 발린 결정 내 수분 함량이 낮음을 확인하였다. 또한, 농축 슬러리의 점도를 분석하였을 때에도 발효액의 pH가 3.0 초과 내지 6.0 미만일 때 농축 슬러리 점도가 낮은 것을 확인하였다. 농축 슬러리의 점도가 낮다는 것은 농축 슬러리 내 포함된 발린 결정의 크기가 크고, 미립 결정이 많이 형성되지 않은 것을 의미한다. 이에 비해 농축 슬러리 점도가 높게 나타난 pH 7.0인 발효액의 경우 발린 미립 결정이 다수 형성되어 슬러리 점도가 높게 나타난 것으로 분석된다.따라서, 발효액의 pH가 발린 결정 형성에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 구체적으로, 특정 pH 범위에서 크기가 큰 발린 결정이 형성되어 농축 슬러리 점도가 낮고, 분리 결정의 수분도 적은 것을 확인했다.
실험예 3. 발효액의 농축 속도(g/L/hr)에 따른 발린 결정 내 수분 함량 비교 분석
실험예 1에서 준비된 L-발린 농도가 80 g/L인 발효액을 5 L씩 분할한 후 황산을 첨가하여 발효액의 pH를 3.8로 조절하였다. 발린 결정을 석출하기 위해서 감압농축기를 활용해서 농도가 200 g/L가 될 때까지 진공도 120 torr에서 농축했다. 이때 각 배치에 대하여 농축 속도를 18 g/L/hr 내지 120 g/L/hr로 다르게 하였으며, 농축 속도 별 수득된 농축 결정 슬러리의 물성을 비교하였다. 농축 속도는 발효액의 초기 발린 농도 80 g/L에서 수분이 제거되어 발린 농도가 200 g/L가 될 때까지 걸리는 시간을 바탕으로 시간당 농축된 발린의 농도(g/L)를 산출한 것이다. 농축 속도 산출을 위해 응축수 부피와 여기에 소요된 시간을 측정하였다.
또한, 발린 결정을 포함하는 농축 결정 슬러리를 바스켓 분리기로 고액 분리하여 L-발린 결정과 모액을 수득하였다. 농축 속도 별 발린 결정 내 수분 함량을 비교하였다. 발효액 농축 속도에 따른 발린 결정 내 수분 함량은 LOD 분석을 통해 비교하였다.
농축속도(g/L/hr) 18 30 60 90 120
슬러리 점도(cp) 측정불가 99.7 16.0 8.3 6.7
결정 내 수분함량(중량%) 분리안됨 58 35 29 28
LOD 수분측정 결과 농축속도가 증가할수록 결정 내 수분 함량이 낮아져 농축 속도가 발린 결정 형성에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이에 비해 농축 속도가 18 g/L/hr일 때에는 결정이 젤(gel)과 같은 형태로 제조되어 유동 및 분리가 어려웠다.
실험예 4. 발린 발효액으로부터 발린 결정의 제조
L-발린 농도가 80 g/L인 발효액 10 L에 황산을 첨가하여 발효액의 pH를 3.8로 조절하였다. 발린 결정을 석출하기 위해서 감압농축기를 활용해서 발효액 농도가 200 g/L가 될 때까지 진공도는 120 torr에서 시간당 60 g/L/hr 속도로 농축하였다.
농축 결정 슬러리를 데칸터로 고액 분리하여 L-발린 고형분 840 g, 상등액 2850 mL를 수득하였다. 이때, 발린 결정 중 수분량은 37 중량%인 것으로 확인되었으며, 발린 결정 수율은 발효액 기준 80.0%이다.
실험예 5. 분리된 결정에서 발린 과립의 제조
실험예 4에서와 같은 방법으로 발린 결정을 제조하였으며, 분리된 발린 결정과 미리 건조된 발린 시드(발린 함량 75w/w%)를 혼합하여 각각 수분 15% 내지 47%의 결정을 제조한 후 혼합형 과립기를 통해 발린 혼합과립 결정을 제조하였다.
수분 함량이 15% 내지 47%인 결정에 대하여 모두 혼합형 과립기를 이용하여 혼합과립 제조가 가능함을 확인했다.
혼합수분(%) 15.0 24.0 30.0 35.0 47.0
설비 Type CVG Mixer
rpm 2000
혼합 과립유무 O O O O O
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 발린을 포함하는 발효액을 준비하는 단계;
    상기 발효액의 pH를 조절하는 단계;
    상기 발효액을 농축하여 농축 발효액을 준비하는 단계; 및
    상기 농축 발효액에서 수분을 포함하는 발린 결정을 분리하는 단계를 포함하는, 발린 결정 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발효액의 pH를 조절하는 단계에서 상기 발효액의 pH는 3.0 초과 내지 6.0 미만으로 조절되는, 발린 결정 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 발효액을 농축하여 농축 발효액을 준비하는 단계는 상기 발효액 내 수분을 60 g/L/hr 내지 150 g/L/hr의 속도로 제거하여 수행되는, 발린 결정 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 발린 결정은 점도가 O 초과 내지 80 cp 미만인, 발린 결정 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 발린 결정은 10 중량% 내지 55 중량%의 수분을 포함하는, 발린 결정 제조방법.
  6. 발린을 포함하는 발효액을 준비하는 단계;
    상기 발효액의 pH를 조절하는 단계;
    상기 발효액을 농축하여 농축 발효액을 준비하는 단계;
    상기 농축 발효액에서 수분을 포함하는 발린 결정을 분리하는 단계;
    상기 발린 결정을 시드와 혼합하여 발린 혼합과립을 제조하는 단계; 및
    상기 발린 혼합과립을 건조하는 단계를 포함하는, 발린 과립 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 혼합과립은 10 중량% 내지 50 중량%의 수분을 포함하는, 발린 과립 제조 방법.
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