WO2025005147A1 - ヌクレオチドモノマー、及び核酸オリゴマーの製造方法 - Google Patents

ヌクレオチドモノマー、及び核酸オリゴマーの製造方法 Download PDF

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WO2025005147A1
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WO
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nucleic acid
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acid oligomer
represented
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猛 和田
一樹 佐藤
聖 赫多
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Tokyo University of Science
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Tokyo University of Science
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    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nucleotide monomer and a nucleic acid oligomer.
  • Antisense molecules which have a base sequence complementary to that of a target nucleic acid, can form a complementary double strand with the target nucleic acid and inhibit protein production from the target nucleic acid.
  • antisense molecules act directly on the disease-related gene, and are therefore attracting attention as an effective medicine for gene therapy.
  • antisense molecules are primarily required to have cell membrane permeability, nuclease resistance, chemical stability within the body (e.g., in an environment of pH 7.4), and the ability to form stable double strands only with specific base sequences.
  • nucleic acid oligomers obtained using boranophosphate compounds hereinafter referred to as "boranophosphate-type nucleic acid oligomers" are known as antisense molecules.
  • a known method for chemically synthesizing nucleic acids is to use a monomer in which an acyl-based protecting group has been introduced into the amino group of the nucleic acid base portion, and obtain an oligomer by subjecting it to appropriate chemical modification via a phosphite triester intermediate as shown in the formula on the left below.
  • this phosphite triester intermediate can be borated by reacting it with a boranoating agent to obtain a boranophosphate-type nucleic acid oligomer as shown in the formula on the right below.
  • DMTr represents a 4,4'-dimethoxytrityl group
  • a circle represents a solid phase support
  • B PRO and B PRO* represent nucleic acid bases represented by the following formula.
  • Ph represents a phenyl group.
  • the acyl-based protecting groups that protect the amino groups of adenine, cytosine, and guanine are reduced by the boranolyzing agent and cannot be deprotected, so the above-mentioned method can only be used when the nucleic acid base is thymine or uracil.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 use a nucleotide monomer represented by the following formula on the left and a nucleotide monomer represented by the following formula on the right, respectively.
  • a monomer having a cyclic structure as shown below, side reactions with the amino group are suppressed even under mild acidic conditions, and it is possible to obtain an oligomer even if the base moiety is unprotected.
  • DMTr and Ph are as described above, and B NH2 represents a nucleic acid base selected from the group consisting of adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil, and the amino groups in the adenine, guanine, cytosine, and 5-methylcytosine are not substituted.
  • nucleotide monomers have extremely small steric hindrance around the phosphorus atom, making them too highly reactive to hydrolysis and quickly hydrolyzing under condensation conditions, which tends to reduce the effective concentration of the nucleotide monomer.
  • the objective of the present invention is to provide a novel nucleotide monomer that has a nucleic acid base with an unsubstituted amino group and that gives a nucleic acid oligomer in high yield, and a method for producing a nucleic acid oligomer in high yield.
  • R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trihydrocarbylsilyloxy group, an alkoxyalkoxy group, a haloalkoxyalkoxy group, or a halogenyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom; or R 1 and R 2 are bonded to each other to form a 5-membered or greater ring which may or may not have a substituent and which may or may not have a heteroatom
  • R 3 represents a hydrogen atom or a protecting group for a hydroxyl group
  • R 4 represents an aryl group which may or may not have a substituent
  • R 5 represents a hydrogen atom, a halogenyl group, or an alkyl group which may or may not have a substituent
  • R 6 represents a hydrogen atom, a halogenyl group, or
  • ⁇ 2> The nucleotide monomer according to ⁇ 1>, wherein the alkyl group represented by R 6 is branched.
  • ⁇ 3> The nucleotide monomer according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the alkyl group represented by R 6 has 6 to 14 carbon atoms.
  • R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trihydrocarbylsilyloxy group, an alkoxyalkoxy group, a haloalkoxyalkoxy group, or a halogenyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 1 and R 2 are bonded to each other to form a divalent group represented by the following general formula (2):
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or are bonded to each other to form a ring; * and ** represent a bond, the bond represented by * being bonded to the carbon atom to which R 1 is directly bonded in general formula (1), and the bond represented by ** being bonded to the carbon atom to which R 2 is directly bonded in general formula (1)
  • ⁇ 5> A nucleotide monomer according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, in which the stereochemistry of the phosphorus atom in the nucleotide monomer is controlled.
  • R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trihydrocarbylsilyloxy group, an alkoxyalkoxy group, a haloalkoxyalkoxy group, or a halogenyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom; or R 1 and R 2 are bonded to each other to form a 5-membered or greater ring which may or may not have a substituent and which may or may not have a heteroatom
  • R 3a represents a protecting group for a hydroxyl group
  • R 4 represents an aryl group which may or may not have a substituent
  • R 5 represents a hydrogen atom, a halogenyl group, or an alkyl group which may or may not have a substituent
  • R 6 represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms which may or may not have a substituent and which may or may not have a heteroatom in the
  • R 1 , R 2 , R 3a , R 4 to R 6 , and B NH2 are as defined above.
  • R 1 , R 2 , R 3a , R 4 to R 6 , and B NH2 are as defined above.
  • R 1 , R 2 , and R 4 to R 6 are as defined above.
  • R 9 represents a protecting group for a hydroxyl group
  • R 10 represents a protecting group for an amino group
  • Bs represents a nucleic acid base selected from the group consisting of adenine, guanine, cytosine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil, and the amino groups in the adenine, guanine, cytosine, and 5-methylcytosine are substituted with protecting groups for the amino groups
  • R9 and R10 represent a hydrogen atom
  • Bs represents BNH2 .
  • R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkoxy group, an alkenyloxy group, an acyloxy group, a trihydrocarbylsilyloxy group, an alkoxyalkoxy group, a haloalkoxyalkoxy group, or a halogenyl group
  • R 2 represents a hydrogen atom, or R 1 and R 2 are bonded to each other to form a divalent group represented by the following general formula (2):
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or are bonded to each other to form a ring; * and ** represent a bond, the bond represented by * being bonded to the carbon atom to which R 1 is directly bonded in general formula (1a), and the bond represented by ** being bonded to the carbon atom to which R 2 is directly bonded in general formula (1a).
  • ⁇ 10> The method according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 9>, in which the stereochemistry of the phosphorus atom in the nucleotide monomer and the nucleotide unit is controlled.
  • the present invention provides a novel nucleotide monomer that has a nucleic acid base with an unsubstituted amino group and that gives a nucleic acid oligomer in high yield, and a method for producing a nucleic acid oligomer in high yield.
  • 1(a) and 1(b) are diagrams showing reverse-phase HPLC charts performed in Comparative Synthesis Example 1 and Synthesis Example 1, entry 3, respectively.
  • 2(a) to 2(c) are diagrams showing reverse-phase HPLC charts performed in Synthesis Example 2, Entries 2 and 6 and Comparative Synthesis Example 2, respectively.
  • 3(a) and 3(b) are diagrams showing reversed-phase HPLC charts performed in Comparative Synthesis Example 3 and Synthesis Example 3, respectively.
  • 4(a) and 4(b) are diagrams showing reversed-phase HPLC charts performed in Comparative Synthesis Example 4 and Synthesis Example 4, respectively.
  • 5(a) to 5(c) are diagrams showing reverse-phase HPLC charts performed in Comparative Synthesis Examples 5 and 6, and Synthesis Example 5, respectively.
  • the term "process” includes not only an independent process, but also a process that cannot be clearly distinguished from other processes, as long as the intended purpose of the process is achieved.
  • ⁇ indicates a range that includes the numerical values written before and after it as the minimum and maximum values, respectively.
  • the amount of each component in the composition means the total amount of the multiple substances present in the composition, unless otherwise specified.
  • the nucleotide monomer according to this embodiment is represented by the above general formula (1).
  • R 4 represents an aryl group with or without a substituent
  • R 6 represents an alkyl group with 3 or more carbon atoms with or without a substituent and with or without a heteroatom in the molecular chain, or R 6 is bonded to R 5 to form a ring with 5 or more members that has a branched chain, has or has no substituents other than the branched chain, and has or has no heteroatoms.
  • the nucleotide monomer represented by the general formula (1) has a nucleic acid base with an unsubstituted amino group, but has low polarity, so that purification by silica gel column chromatography is easy and can be obtained with high purity, and thus a nucleic acid oligomer can be obtained with a high yield. Furthermore, the nucleotide monomer is provided with an appropriate steric hindrance around the phosphorus atom, which suppresses hydrolysis, and the effective concentration can be kept high during the condensation reaction, thereby improving the condensation efficiency.
  • the alkoxy group represented by R 1 is preferably an alkoxy group having 1 to 12 carbon atoms, more preferably an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, and examples thereof include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an i-propoxy group, an n-butoxy group, a sec-butoxy group, a tert-butoxy group, and an n-pentyloxy group.
  • Examples of the alkenyloxy group represented by R 1 include a vinyloxy group, an allyloxy group, a 1-propenyloxy group, an isopropenyloxy group, a 2-methyl-1-propenyloxy group, a 2-methylallyloxy group, and a 2-butenyloxy group.
  • Examples of the acyloxy group represented by R 1 include alkyl-carbonyloxy groups having 1 to 6 carbon atoms (eg, methylcarbonyloxy group, ethylcarbonyloxy group, etc.) and aryl-carbonyloxy groups having 6 to 10 carbon atoms (eg, benzoyloxy group).
  • Examples of the trihydrocarbylsilyloxy group represented by R 1 include trialkylsilyloxy groups such as trimethylsilyloxy group, triethylsilyloxy group, triisopropylsilyloxy group, and t-butyldimethylsilyloxy group, and alkyldiarylsilyloxy groups such as t-butyldiphenylsilyloxy group.
  • Examples of the alkoxyalkoxy group represented by R 1 include a methoxymethoxy group, a methoxyethoxy group, an ethoxymethoxy group, an ethoxyethoxy group, and a (2-cyanoethoxy)methoxy group.
  • haloalkoxyalkoxy group represented by R 1 examples include a (2-fluoro)ethoxymethoxy group, a (2,2-difluoro)ethoxymethoxy group, a (2-chloro)methoxyethoxy group, and a (2,2-dichloro)ethoxymethoxy group.
  • halogenyl group represented by R 1 examples include a fluoro group, a chloro group, and a bromo group, with a fluoro group being preferred.
  • R 1 is preferably a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkoxy group, a trialkylsilyloxy group, an alkoxyalkoxy group, a haloalkoxyalkoxy group, and a halogenyl group from the viewpoint of double-strand formation ability.
  • R 1 and R 2 may be bonded to each other to form a ring of 5 or more members, which may or may not have a substituent and may or may not have a heteroatom.
  • alkyl group include a methyl group, an ethyl group, etc.
  • examples of the substituent include a halogenyl group such as a fluoro group, a chloro group, or a bromo group, an amino group, an imino group, etc.
  • heteroatom include an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, etc.
  • the number of members of the ring is preferably 5 to 10 members, more preferably 5 to 8 members, and even more preferably 5 to 7 members.
  • R 1 and R 2 are bonded to each other to form a divalent group represented by the following general formula (2).
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or are bonded to each other to form a ring, and * and ** represent a bond, where the bond represented by * is bonded to the carbon atom to which R 1 is directly bonded in general formula (1), and the bond represented by ** is bonded to the carbon atom to which R 2 is directly bonded in general formula (1).
  • Examples of the alkyl group represented by R7 or R8 include linear or branched alkyl groups having 1 to 10 carbon atoms, and specific examples thereof include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a t-butyl group, an n-hexyl group, and an n-octyl group.
  • specific examples of the ring include a cyclopropane ring, a cyclobutane ring, and a cyclohexane ring.
  • R1 and R2 are bonded to each other to form a ring having 5 or more members which may or may not have a substituent and may or may not have a heteroatom
  • specific examples of the ring include rings represented by the following formulas. (In the formula, BNH2 is as defined above.)
  • Examples of the hydroxyl-protecting group represented by R3 include an acetyl group, a phenylacetyl group, a phenoxyacetyl group, a chloroacetyl group, a pivaloyl group, a benzyl group, a 4-methoxybenzyl group, a benzoyl group, a 4-methoxybenzoyl group, a triphenylmethyl group, a 4,4'-dimethoxytrityl (DMTr) group, a 4-methoxytrityl (MMTr) group, a 9-phenylxanthenyl group, a t-butoxycarbonyl group, a trimethylsilyl group, a t-butyldimethylsilyl group, a t-butyldiphenylsilyl group, a cyanomethoxymethyl group, a 2-(cyanoethoxy)ethyl group, a cyanoethoxymethyl group
  • R 4 represents an aryl group having or without a substituent, and in terms of ease of synthesis, reactivity, ease of deprotection of the phosphoric acid moiety during oligomer formation, and high stereoselectivity during condensation when stereochemistry is controlled, it is preferable to represent an aryl group having 6 to 20 carbon atoms having or without a substituent, more preferably an aryl group having 6 to 14 carbon atoms having or without a substituent, and even more preferably an aryl group having 6 to 10 carbon atoms having or without a substituent.
  • the substituent include an alkyl group having or without a substituent, a hydroxyl group, an amino group, an alkoxy group, a halogenyl group, and the like.
  • Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, and the like.
  • substituent include a hydroxyl group, an amino group, an alkoxy group, an imino group, a halogenyl group, and the like.
  • alkoxy group include a methoxy group, an ethoxy group, and the like.
  • halogenyl group include a fluoro group, a chloro group, and a bromo group.
  • Examples of R4 include a phenyl group and a naphthyl group, and from the standpoint of ease of synthesis, reactivity, etc., a phenyl group is preferred.
  • halogenyl group represented by R 5 examples include a fluoro group, a chloro group, and a bromo group, with a fluoro group being preferred.
  • the alkyl group represented by R5 which may or may not have a substituent, is preferably an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, which may or may not have a substituent, and more preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, which may or may not have a substituent.
  • substituent include a hydroxyl group, an amino group, an alkoxy group, an imino group, and a halogenyl group.
  • Examples of the alkoxy group include a methoxy group and an ethoxy group.
  • the halogenyl group include a fluoro group, a chloro group, and a bromo group.
  • Examples of the alkyl group represented by R5 which may or may not have a substituent, include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, and an n-pentyl group.
  • R5 is preferably a hydrogen atom.
  • R 6 represents an alkyl group having 3 or more carbon atoms, with or without a substituent, and with or without a heteroatom in the molecular chain.
  • the alkyl group represented by R 6 preferably has 3 to 20 carbon atoms, more preferably has 6 to 14 carbon atoms, and even more preferably has 8 to 12 carbon atoms, in terms of the yield and purity of the monomer, and the ease of improving the yield of the resulting nucleic acid oligomer.
  • the substituent include a hydroxyl group, an amino group, an alkoxy group, an imino group, and a halogenyl group.
  • Examples of the alkoxy group include a methoxy group and an ethoxy group.
  • halogenyl group examples include a fluoro group, a chloro group, and a bromo group.
  • heteroatom examples include an oxygen atom, a nitrogen atom, and a sulfur atom.
  • the alkyl group represented by R 6 is preferably branched in terms of the yield and purity of the monomer, and the ease of improving the yield of the resulting nucleic acid oligomer.
  • R6 examples include an i-propyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, a neopentyl group, an i-pentyl group, a sec-pentyl group, a 3-pentyl group, a tert-pentyl group, an i-hexyl group, a 2-ethylhexyl group, a 1-methylheptyl group, a 3-methyloctyl group, and a tetrahydrogeranyl group (i.e., a 3,7-dimethyloctyl group), with a tetrahydrogeranyl group being preferred.
  • a tetrahydrogeranyl group i.e., a 3,7-dimethyloctyl group
  • R 5 and R 6 may be bonded to each other to form a ring of 5 or more members having a branched chain, having or not having a substituent other than the branched chain, and having or not having a heteroatom.
  • the number of members of the ring is preferably 5 to 10 members, more preferably 5 to 8 members, and even more preferably 5 to 7 members.
  • the substituent include an alkyl group, a hydroxyl group, an amino group, an alkoxy group, an imino group, a halogenyl group, and the like, which may or may not have a substituent.
  • the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, and the like.
  • examples of the substituent include a hydroxyl group, an amino group, an alkoxy group, an imino group, a halogenyl group, and the like.
  • examples of the alkoxy group include a methoxy group, an ethoxy group, and the like.
  • examples of the halogenyl group include a fluoro group, a chloro group, a bromo group, and the like.
  • examples of the heteroatom include an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, and the like.
  • Examples of the branched chain include an alkyl group, which may or may not have a substituent, and which may or may not have a heteroatom in the molecular chain.
  • the alkyl group preferably has 1 to 15 carbon atoms, more preferably has 2 to 10 carbon atoms, and even more preferably has 3 to 8 carbon atoms.
  • the substituent in the branched chain include a hydroxyl group, an amino group, an alkoxy group, an imino group, and a halogenyl group.
  • the alkoxy group include a methoxy group and an ethoxy group.
  • Examples of the halogenyl group include a fluoro group, a chloro group, and a bromo group.
  • Examples of the heteroatom in the branched chain include an oxygen atom, a nitrogen atom, and a sulfur atom.
  • Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an i-propyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, and an n-pentyl group.
  • the stereochemistry of the phosphorus atom is controlled in the nucleotide monomer.
  • the nucleotide monomer in which the stereochemistry of the phosphorus atom is controlled include the Sp form represented by the formula on the left below and the Rp form represented by the formula on the right below.
  • R 1 to R 6 and B NH2 are as defined above.
  • the nucleotide monomer of this embodiment can be produced, for example, in a manner similar to that shown in the Examples.
  • the method for producing a nucleic acid oligomer according to the present embodiment includes a chain elongation step in which a combination of the condensation step, the boranoylation step or the oxidation step, and the deprotection step is carried out once or repeated two or more times, and the nucleic acid oligomer production step.
  • This production method allows the production of a nucleic acid oligomer in high yield.
  • a hydroxyl group bonded to the 5' carbon atom of a ribose structure in a nucleoside structure supported on a solid support or in a nucleoside structure of a nucleic acid oligomer is condensed with a phosphorous moiety of a nucleotide monomer represented by the above general formula (1a).
  • the hydroxyl-protecting group represented by R3a is the same as the hydroxyl-protecting group represented by R3 .
  • an acidic activator can be used.
  • the acidic activator include 1-phenylimidazolium triflate, N-cyanomethylpyrrolidium triflate, and N-cyanomethyldimethylammonium triflate.
  • the acidic activator may be used alone or in combination of two or more.
  • the condensation reaction in the condensation step can be carried out, for example, under ice cooling (0°C) or higher and room temperature (25°C) or lower, preferably in the range of 20°C or higher and 25°C or lower, for example, for 1 minute to several hours or less, preferably 2 minutes to 1 hour or less.
  • the reaction solvent include inert solvents. Examples of the inert solvent include acetonitrile and isobutyronitrile. The reaction solvent may be used alone or in combination of two or more.
  • a boronization agent can be used.
  • the boronization agent include borane compounds such as borane/tetrahydrofuran complex and dimethylsulfide borane.
  • the boronization agent may be used alone or in combination of two or more.
  • the boronization reaction in the boronization step can be carried out, for example, under ice cooling (0°C) or higher and room temperature (25°C) or lower, preferably in the range of 20°C or higher and 25°C or lower, for example, for 30 seconds or longer and several hours or shorter, preferably 1 minute or longer and 1 hour or shorter.
  • the reaction solvent include inert solvents. Examples of the inert solvent include acetonitrile, tetrahydrofuran, toluene, etc. The reaction solvent may be used alone or in combination of two or more.
  • an oxidizing agent can be used.
  • the oxidizing agent include peroxides such as t-butyl hydroperoxide, m-chloroperbenzoic acid, (2R,8aS)-(+)-(camphorylsulfonyl)oxaziridine, and (1S)-(+)-(8,8-dichlorocamphorylsulfonyl)oxaziridine.
  • the oxidizing agent may be used alone or in combination of two or more.
  • the oxidation reaction in the oxidation step may be carried out, for example, under ice cooling (0°C) or higher and room temperature (25°C) or lower, preferably in the range of 20°C or higher and 25°C or lower, for example, for 1 minute to several hours or less, preferably 2 minutes to 1 hour or less.
  • the reaction solvent include inert solvents.
  • the inert solvent include acetonitrile, toluene, and decane.
  • the reaction solvent may be used alone or in combination of two or more.
  • a deprotecting agent can be used.
  • the deprotecting agent include carboxylic acid and halogenated alkyl carboxylic acid.
  • the carboxylic acid include acetic acid.
  • the halogenated alkyl carboxylic acid include trifluoroacetic acid, trichloroacetic acid, and dichloroacetic acid.
  • the deprotecting agent may be used alone or in combination of two or more.
  • the protecting group R 3a of the hydroxyl group bonded to the carbon atom at the 5' position is a trityl-based protecting group such as a triphenylmethyl group, a 4,4'-dimethoxytrityl (DMTr) group, or a 4-methoxytrityl (MMTr) group
  • the precursor nucleic acid oligomer further has a borano group
  • the cation trapping agent include triethylsilane.
  • the cation trapping agent may be used alone or in combination of two or more.
  • a combination of the condensation step, the boranolation step or the oxidation step, and the deprotection step is performed once or repeatedly performed two or more times. This results in the formation of a precursor nucleic acid oligomer having dimers or more. Specifically, by performing the above combination once, a precursor nucleic acid oligomer having dimers can be obtained, and by performing the above combination n times (n is an integer of 2 or more), a precursor nucleic acid oligomer having (n+1)mers can be obtained.
  • the phosphate protecting group represented by the general formula (7) can be removed using a phosphate protecting group removal agent.
  • the phosphate protecting group removal agent include bases such as diazabicycloundecene, 1,8-(dimethylamino)naphthalene, and aqueous ammonia.
  • the phosphate protecting group removal agent may be used alone or in combination of two or more.
  • the phosphate protecting group removal reaction may be carried out, for example, under ice cooling (0°C) or higher and room temperature (25°C) or lower, preferably 20°C or higher and 25°C or lower, for example, for 15 minutes to 24 hours or lower, preferably 30 minutes to 20 hours or lower.
  • the reaction solvent include inert solvents. Examples of the inert solvent include acetonitrile and ethanol. The reaction solvent may be used alone or in combination of two or more.
  • examples of the hydroxyl-protecting group represented by R 9 include an acetyl group, a phenylacetyl group, a phenoxyacetyl group, a 4-tert-butylphenoxyacetyl group, a 4-isopropylphenoxyacetyl group, a chloroacetyl group, a trifluoroacetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a pivaloyl group, a benzyl group, a 4-methoxybenzyl group, a benzoyl group, a 4-methoxybenzoyl group, a triphenylmethyl group, a 4,4'-dimethoxytrityl (DMTr) group, a 4-methoxytrityl (MMTr) group, a 9-phenylxanthenyl group, a 9-fluor
  • examples of the protective group for the amino group represented by R 10 and the protective group for the amino group in Bs representing adenine, guanine, cytosine, or 5-methylcytosine include an acetyl group, a phenylacetyl group, a phenoxyacetyl group, a 4-tert-butylphenoxyacetyl group, a 4-isopropylphenoxyacetyl group, a chloroacetyl group, a trifluoroacetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a pivaloyl group, a benzyl group, a 4-methoxybenzyl group, a benzoyl group, a 4-methylphenylacetyl ...
  • methoxybenzoyl group triphenylmethyl group, 4,4'-dimethoxytrityl (DMTr) group, 4-methoxytrityl (MMTr) group, 9-phenylxanthenyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, t-butoxycarbonyl group, trimethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group, t-butyldiphenylsilyl group, cyanomethoxymethyl group, 2-(cyanoethoxy)ethyl group, cyanoethoxymethyl group, (dimethylamino)methyl group, and the like.
  • DMTr 4,4'-dimethoxytrityl
  • MMTr 4-methoxytrityl
  • 9-phenylxanthenyl group 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group
  • t-butoxycarbonyl group trimethylsilyl group
  • Capping of the 5'-hydroxyl group and amino group with a protecting group and removal of the protecting group can be carried out by known methods.
  • Examples of the counter cation represented by X + include ammonium ion, cations derived from organic amine compounds, and metal cations.
  • the counter cations may be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of the cation derived from an organic amine compound include, from the viewpoint of solubility in an organic solvent and volatility of the counter cation, cations derived from tertiary alkylamine compounds and cations derived from quaternary ammonium compounds.
  • Examples of the cation derived from a tertiary alkylamine compound include the cation HNEt 3 + (Et represents an ethyl group) derived from triethylamine and a cation derived from 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undecene.
  • Examples of the cation derived from a quaternary ammonium compound include tetrabutylammonium ion.
  • Examples of the metal cation include Na + , Li + , and K + .
  • At least the condensation step through the nucleic acid oligomer production step are preferably carried out by a reaction using a solid phase support (solid phase method).
  • a monomer containing a base at the 3' end of the nucleic acid oligomer can be bound to the solid phase support, for example, via an oxygen atom bound to the 3' carbon atom of the ribose structure.
  • a linker may be present between the monomer and the solid phase support, if necessary.
  • the type of the solid phase carrier is not particularly limited, and examples thereof include pore glass, oxalyl-pore glass, TentaGel support-amino polyethylene glycol derivatized support, highly cross-linked aminomethyl polystyrene, Pros-polystyrene/divinylbenzene copolymer, etc.
  • the amino group on the solid phase carrier can be used to link the solid phase carrier to the monomer. Examples of the amino group on the solid phase carrier include 3-aminopropyl group, long chain alkylamino group (LCAA), etc.
  • a linker may be present between the solid phase carrier and the monomer. Examples of the linker include succinyl group, sarkosyl group, succinylsarkosyl group, oxalyl group, etc.
  • the nucleic acid oligomer obtained as described above can be appropriately excised from the solid phase carrier.
  • the nucleic acid oligomer can be excised from the solid phase carrier by, for example, treating the solid phase carrier to which the nucleic acid oligomer is bound with ammonia water.
  • Examples of the ammonia water used in excising the nucleic acid oligomer from the solid phase carrier include 25% ammonia water by mass or a mixed solution of 25% ammonia water and ethanol (3:1, v/v).
  • the nucleic acid oligomer can be excised from the solid phase carrier by, for example, simultaneously with the removal of the protecting group for the 5'-hydroxyl group or the removal of the phosphate protecting group described above.
  • the resulting nucleic acid oligomer can be purified by known purification methods such as reverse phase high performance liquid chromatography (reverse phase HPLC), ion exchange HPLC, column chromatography, and recrystallization.
  • reverse phase HPLC reverse phase high performance liquid chromatography
  • ion exchange HPLC ion exchange HPLC
  • column chromatography e.g., chromatography, chromatography, and recrystallization.
  • the stereochemistry of the phosphorus atom of the nucleotide monomer when the stereochemistry of the phosphorus atom of the nucleotide monomer is controlled, the stereochemistry of the phosphorus atom is controlled in the nucleotide unit.
  • the nucleic acid oligomer can be stereoselectively synthesized, and it is easy to effectively improve, for example, the efficacy and safety as an antisense molecule.
  • the stereochemical purity is preferably 90% or more, and more preferably 95% or more.
  • nucleic acid oligomer obtained by the method for producing a nucleic acid oligomer according to this embodiment contains at least one selected from the group consisting of nucleotide units represented by the above general formula (7) and nucleotide units represented by the above general formula (8).
  • the nucleotide units represented by the above general formula (7) may be used alone or in combination of two or more.
  • the nucleotide units represented by the above general formula (8) may be used alone or in combination of two or more.
  • Nucleic acid oligomers containing nucleotide units represented by general formula (7) tend to have excellent affinity with target RNA and RNase H induction activity, and are particularly resistant to degradative enzymes, and are unlikely to be highly toxic.
  • Nucleic acid oligomers containing nucleotide units represented by general formula (8) tend to have excellent affinity with target RNA and RNase H induction activity, and are unlikely to be highly toxic, but are likely to be less resistant to degradative enzymes.
  • nucleic acid oligomer contains nucleotide units represented by general formula (7) and nucleotide units represented by general formula (8), it is expected that the above nucleic acid oligomers will maintain high affinity with target RNA, RNase H induction activity, and resistance to degradative enzymes, while keeping toxicity low.
  • the length (base length) of the nucleic acid oligomer is not particularly limited as long as the nucleic acid oligomer has two or more bases, and a desired length can be appropriately selected depending on the type, length, etc. of the target nucleic acid.
  • the length of the nucleic acid oligomer is not particularly limited, and from the viewpoint of application to antisense medicines, it is preferably 8 to 50 bases, more preferably 10 to 30 bases, and even more preferably 10 to 21 bases.
  • the base sequence of the nucleic acid oligomer is set based on the base sequence of the target nucleic acid. From the viewpoint of double-strand formation ability, the base sequence of the nucleic acid oligomer is appropriately selected so as to be a base sequence complementary to the base sequence of the target nucleic acid, but in some cases, the base sequence may contain one or more different bases. Furthermore, in the nucleic acid oligomer, the ratio of the nucleotide unit represented by general formula (7) and the nucleotide unit represented by general formula (8) is appropriately selected so as to maintain high affinity with the target RNA, RNase H inducing activity, resistance to degradative enzymes, and blood retention.
  • the nucleic acid oligomer according to this embodiment may be a nucleic acid oligomer having nucleotide units other than the nucleotide units represented by general formula (7) and the nucleotide units represented by general formula (8).
  • the total ratio of the nucleotide units represented by general formula (7) and the nucleotide units represented by general formula (8) is not particularly limited, and from the viewpoint of double-strand formation ability, it is preferably 40 to 100 mol %, more preferably 50 to 100 mol %, even more preferably 60 to 100 mol %, and particularly preferably 70 to 100 mol %, relative to the total nucleotide units in the nucleic acid oligomer.
  • the 5' end may be a hydroxyl group or a protecting group for a hydroxyl group
  • the 3' end may be a hydroxyl group or a protecting group for a hydroxyl group.
  • Specific examples of the protecting group for a hydroxyl group are as described above.
  • the amino alcohol derivative 1 (11.33 g, 83 mmol) shown on the left side of the above scheme was dried azeotropically with pyridine (10 mL x 3 times) and toluene (10 mL x 3 times) under an argon atmosphere and dissolved in tetrahydrofuran (500 mL).
  • the resulting tetrahydrofuran solution was stirred while adding triethylamine (TEA, 17.5 mL, 124.5 mmol) and chlorotrimethylsilane (TMSC1, 15.7 mL, 124.5 mmol), and stirred for 2 hours.
  • methanol 5.5 mL was added to stop the reaction, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Aminoalcohol derivative 2 (32.4 g, 70.0 mmol) was dissolved in dimethylformamide (350 mL) under an argon atmosphere.
  • 18-crown-6 (35.0 g, 140 mmol), potassium carbonate (37.0 g, 280 mmol), and 4-mercaptobenzoic acid (19.0 g, 140 mmol) were added in sequence, and the mixture was heated to 40°C and stirred for 12 hours. After that, about half of the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Aminoalcohol derivatives 3i, 3t, or 3r (3i: 0.67 g, 3.8 mmol; 3t: 13.9 g, 50 mmol; 3r: 1.4 g, 5.0 mmol) were dried azeotropically with toluene (5 mL x 3 times) under an argon atmosphere, and toluene (3i: 3.7 mL; 3t: 40.0 mL; 3r: 3.3 mL) and N-methylmorpholine (3i: 0.9 mL, 7.9 mmol; 3t: 11.5 mL, 105 mmol; 3r: 1.15 mL, 10.5 mmol) were added.
  • the mixed solution was added to a solution of phosphorus trichloride (3i: 0.3 mL, 3.9 mmol; 3t: 11.5 mL, 105 mmol; 3r: 0.5 mL, 5.3 mmol) in toluene (3i: 2.5 mL; 3t: 40 mL; 3r: 3.0 mL) at 0°C over 10 min.
  • phosphorus trichloride 3i: 0.3 mL, 3.9 mmol; 3t: 11.5 mL, 105 mmol; 3r: 0.5 mL, 5.3 mmol
  • toluene 3i: 2.5 mL; 3t: 40 mL; 3r: 3.0 mL
  • B NH2 is Ad NH2 , Cy NH2 , Gu NH2 , or Th
  • Ad NH2 represents adenine with an unsubstituted amino group
  • Cy NH2 represents cytosine with an unsubstituted amino group
  • Gu NH2 represents guanine with an unsubstituted amino group
  • Th represents thymine
  • Oxazaphospholidine monomers 6a, 6c, 6g, 6t, 6l, 6r, and 6i were synthesized with reference to a known method (J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 47, pp.16031-16037).
  • Nucleoside derivatives 5a, 5c, 5g, 5t, or 5l (A: 2.2 g, 4.0 mmol; C: 3.2 g, 6.0 mmol; G: 2.6 g, 4.5 mmol; T: 1.4 g, 2.5 mmol; LNAT: 1.7 g, 3.0 mmol) shown on the left side of the above scheme were azeotropically dried with pyridine, toluene, and THF, 1 mL each, three times under an argon atmosphere, and THF (A: 10 mL; C: 15 mL; G: 10.3 mL; T: 10 mL; LNAT: 7.5 mL) and triethylamine (A: 3.9 mL, 28 mmol; C: 5.8 mL, 42 mmol; G: 4.4 mL, 31.5 mmol; T: 3.9 mL, 28 mmol; LNAT: 2.9 mL, 21 mmol) were added.
  • the obtained THF solution was stirred at a predetermined temperature (A, C, T, LNAT: -78°C; G: -40°C), while 0.6M compound 4t/tetrahydrofuran solution (A: 3.4g, 10mmol; C: 5.1g, 15mmol; G: 3.8g, 11.3mmol; T: 2.1g, 6.25mmol; LNAT: 2.6g, 7.7mmol) was added over 5 minutes. Then, only the thymidine derivative was heated to room temperature, and the other derivatives were stirred for 2 hours while maintaining the predetermined temperature. After dilution with 280mL of chloroform, it was washed with a saturated aqueous sodium bicarbonate solution (50mL x 3 times).
  • the aqueous layer was back-extracted with chloroform (50mL x 3 times).
  • the organic layer was collected and the moisture was removed with sodium sulfate, and the solvent of the organic layer was distilled off under reduced pressure, and the obtained residue was azeotropically dried with toluene (1mL x 3 times) under an argon atmosphere. It was separated and purified by amino silica gel column chromatography. Only for 6 g of oxazaphospholidine monomer, a portion of the residue was then separated and purified by reverse phase HPLC. The specific procedure for separation and purification is as follows.
  • the target compound (oxazaphosphoridine monomer 6a, 6c, 6g, 6t, or 6l) was obtained by distilling off the solvent from the isolated and purified product under reduced pressure. Yield: A: 0.82 g, 0.95 mmol, 34%; C: 0.80 g, 0.96 mmol, 39%; G: 0.61 g, 0.70 mmol, 30%; T: 1.02 g, 1.20 mmol, 55%; LNAT: 0.82 g, 0.93 mmol, 31%
  • Nucleoside derivative 5c (1.1 g, 2.0 mmol) shown on the left side of the above scheme was azeotropically dried with pyridine, toluene, and THF 1 mL x 3 times under an argon atmosphere, and THF (5.0 mL) and triethylamine (1.9 mL, 14.0 mmol) were added. While stirring the obtained THF solution at -78°C, 0.6 M compound 4r/tetrahydrofuran solution (1.7 g, 5.0 mmol) was added over 5 minutes. Then, the mixture was stirred for 2 hours while maintaining the temperature at -78°C.
  • the target compound (oxazaphosphoridine monomer 6r) was obtained by distilling off the solvent from the isolated and purified product under reduced pressure. Yield 6r: 0.86 g, 1.02 mmol, 51%
  • Nucleoside derivative 5c (0.8 g, 1.5 mmol) shown on the left side of the above scheme was azeotropically dried with pyridine, toluene, and THF 1 mL x 3 times under an argon atmosphere, and THF (3.8 mL) and triethylamine (1.5 mL, 10.5 mmol) were added. While stirring the obtained THF solution at -78°C, 0.6 M compound 4i/tetrahydrofuran solution (0.9 g, 3.8 mmol) was added over 5 minutes. Then, the mixture was stirred for 2 hours while maintaining the temperature at -78°C.
  • the target compound (oxazaphosphoridine monomer 6i) was obtained by distilling off the solvent from the isolated and purified product under reduced pressure. Yield 6i: 0.30 g, 0.41 mmol, 27%
  • [N-Thg,Ph]-type oxazaphosphoridine monomers 6a, 6c, 6g, or 6t (A: 25.8 mg (60 equivalents, 30 ⁇ mol); C: 25.0 mg (60 equivalents, 30 ⁇ mol); G: 26.3 mg (60 equivalents, 30 ⁇ mol); T: 25.5 mg (60 equivalents, 30 ⁇ mol)) were added.
  • the solid support was then washed with dried dichloromethane (1 mL x 3 times) and acetonitrile (1 mL x 3 times), and dried for 5 minutes.
  • the free 5'-hydroxyl group was acetylated for 1 minute by adding 10 mg of 4-dimethylaminopyridine, 450 ⁇ L of 2,6-lutidine, and 50 ⁇ L of acetic anhydride.
  • the solid support was washed with dried dichloromethane (1 mL x 3 times) and acetonitrile (1 mL x 3 times), and dried for 5 minutes.
  • the free 5'-hydroxyl group was acetylated by sequentially adding 300 ⁇ L of a 36% N-methylimidazole/tetrahydrofuran solution and 250 ⁇ L of a 22% acetic anhydride/tetrahydrofuran solution that had been prepared in advance, and stirring for 30 seconds.
  • the solid support was then washed with dried acetonitrile, and dried.
  • the protecting group at the phosphoric acid site was removed by reacting with a 4% diazabicycloundecene/acetonitrile solution for one and a half hours.
  • the product was then cut out from the solid support by reacting with a 25% aqueous ammonia solution for 17 hours, and a mixture containing the target product was obtained.
  • the mixture was analyzed by HPLC. The results are shown in Table 1.
  • Figures 1(a) and 1(b) show the results of reversed-phase HPLC analysis in Comparative Synthesis Example 1 and Entry 3 of Synthesis Example 1, respectively.
  • a large amount of unreacted thymidine was observed in the area with a short elution time, and a large amount of by-products was observed in the area with a long elution time.
  • Entry 3 of Synthesis Example 1 the amount of unreacted substances and by-products was significantly smaller.
  • the ratio (%) of the target product to all products was 19% higher in Entry 3 of Synthesis Example 1.
  • the solid support was dried for 5 min, and then oxazaphospholidine monomer 6a, 6c, 6g, 6t, 6l, or 6i (A: 25.8 mg (60 equivalents, 30 ⁇ mol); C(Thg): 25.0 mg (60 equivalents, 30 ⁇ mol); G: 26.3 mg (60 equivalents, 30 ⁇ mol); T: 25.5 mg (60 equivalents, 30 ⁇ mol); LNAT: 26.3 mg (60 equivalents, 30 ⁇ mol); C(iPr): 22.1 mg (60 equivalents, 30 ⁇ mol)) was added.
  • the solid phase carrier was then washed with dried dichloromethane (1 mL x 3 times) and acetonitrile (1 mL x 3 times), and then reacted with 25% aqueous ammonia/ethanol (3:1, v/v, 5 mL) solution at room temperature for 3 hours to remove the protecting group of the phosphoric acid moiety and to cut it out from the solid phase carrier.
  • the reaction solution was filtered and washed with acetonitrile.
  • the solvent was distilled off under reduced pressure, and the crude product was analyzed by reverse phase HPLC in the same manner as described above. The results are shown in Table 2.
  • Figures 2(a) to 2(c) show the results of reversed-phase HPLC analysis of entries 2 and 6 of Synthesis Example 2 and Comparative Synthesis Example 2.
  • Comparative Synthesis Example 2 unreacted thymidine was observed, whereas in entries 2 and 6 of Synthesis Example 2, unreacted thymidine was not observed compared to Comparative Synthesis Example 2, and the HPLC yield of the target product was 2% higher in each case.
  • a dimer was synthesized, but since the number of condensations increases when synthesizing oligomers, it is preferable to use a monomer with high condensation efficiency. It was confirmed that a monomer having a branched alkyl group with 3 or more carbon atoms is more suitable for synthesizing nucleic acid oligomers.
  • the free 5'-hydroxyl group was acetylated by sequentially adding 300 ⁇ L of a 36% N-methylimidazole/tetrahydrofuran solution and 250 ⁇ L of a 22% acetic anhydride/tetrahydrofuran solution, which had been prepared in advance, and stirring for 30 seconds.
  • the solid support was then washed with dried acetonitrile, and dried.
  • the protecting group at the phosphoric acid site was removed by reacting with a 4% diazabicycloundecene/acetonitrile solution for one and a half hours.
  • the solid support was then washed with dried acetonitrile, dried, and then reacted with a 25% ammonia aqueous solution for one hour to cut out the product from the solid support, and a mixture containing the target product was obtained.
  • the mixture was analyzed by HPLC. The results are shown in Table 3.
  • the solid support was washed with dried acetonitrile and dichloromethane. After drying the solid support, boronization was performed under an argon atmosphere with a 0.05 M borane/tetrahydrofuran complex tetrahydrofuran solution for 2 minutes. The solid support was washed with dichloromethane. The dimethoxytrityl group was deprotected with a 3% dichloroacetic acid/dichloromethane-triethylsilane (1:1, v/v) solution. The solid support was then washed with dried dichloromethane and acetonitrile, and dried.
  • the free 5'-hydroxyl group was acetylated by adding 10 mg of 4-dimethylaminopyridine, 450 ⁇ L of 2,6-lutidine, and 50 ⁇ L of acetic anhydride and stirring for 60 seconds.
  • the solid support was then washed with dried acetonitrile, and dried.
  • the protecting group at the phosphoric acid site was removed by reacting with a 10% diazabicycloundecene/acetonitrile solution for 1 hour.
  • the solid support was then washed with dried acetonitrile, dried, and then reacted with 25% aqueous ammonia-ethanol (3:1, v/v) for 17 hours to cut out the target product from the solid support, and the mixture containing the target product was obtained.
  • the mixture was analyzed by HPLC. The results are shown in Table 3.
  • the stereochemical purity was calculated from the area ratio of the Sp- CPB T to the Rp- CPB T in the HPLC results.
  • the HPLC yield was calculated from the area ratio (Rp) -CPB T/(T+(Rp) -CPB T) in the HPLC results.
  • FIGS 3(a) and 3(b) show the results of reversed-phase HPLC analysis in Comparative Synthesis Example 3 and Synthesis Example 3, respectively.
  • Synthesis Example 3 had a higher yield and stereochemical purity of the target product. From these results, it is believed that epimerization is prominent under condensation reaction conditions in the [N-Me,Ph]-type, whereas stereochemical purity is maintained in the [N-Thg,Ph]-type due to sufficient steric hindrance around the nitrogen atom. Therefore, it was confirmed that the [N-Thg,Ph]-type is more suitable for synthesis with controlled stereochemistry.
  • the solid phase carrier was washed with dried dichloromethane and acetonitrile, and dried. 10 mg of 4-dimethylaminopyridine, 450 ⁇ L of 2,6-lutidine, and 50 ⁇ L of acetic anhydride were added to the free 5'-hydroxyl group, and acetylation was performed for 60 seconds.
  • the solid phase carrier was washed with dried dichloromethane and acetonitrile, and dried. A previously prepared 4% diazabicycloundecene/acetonitrile solution was added, and the protecting group of the phosphoric acid site was removed for 17 hours.
  • the solid phase carrier was then washed with dried acetonitrile and dried. The solid phase carrier was reacted with 25% aqueous ammonia for 1 hour, and cut out from the solid phase alone, to obtain a mixture containing the target product. The mixture was analyzed by HPLC. The results are shown in Table 4.
  • the solid phase carrier was washed with dried dichloromethane and acetonitrile, and dried. 10 mg of 4-dimethylaminopyridine, 450 ⁇ L of 2,6-lutidine, and 50 ⁇ L of acetic anhydride were added to the free 5'-hydroxyl group, and acetylation was performed for 60 seconds.
  • the solid phase carrier was washed with dried dichloromethane and acetonitrile, and dried.
  • a previously prepared 10% diazabicycloundecene/acetonitrile solution was added and the protecting group of the phosphoric acid site was removed for 1 hour.
  • the solid phase carrier was then washed with dried acetonitrile and dried.
  • the product was cut out from the solid phase carrier by reaction with 25% aqueous ammonia-ethanol (3:1, v/v) for 17 hours, and a mixture containing the target product was obtained. The mixture was analyzed by HPLC. The results are shown in Table 4.
  • the HPLC yield was calculated from the area ratio T PB T PB T/(T+T PB T+T PB T PB T) in the HPLC results.
  • Figures 4(a) and 4(b) show the results of reversed-phase HPLC analysis in Comparative Synthesis Example 4 and Synthesis Example 4, respectively.
  • Comparative Synthesis Example 4 a large amount of dimers was observed, whereas in Synthesis Example 4, the proportion of dimers was smaller than in Comparative Synthesis Example 4, and the HPLC yield of the target product was 15% higher.
  • a trimer was synthesized, but in oligomer synthesis, the number of condensations increases, so it is preferable to use a monomer with high condensation efficiency, and it was confirmed that the [N-Thg,Ph]-type is more suitable for synthesizing nucleic acid oligomers.
  • the solid phase carrier was then washed with dried dichloromethane and acetonitrile, and dried.
  • the solid phase carrier was reacted with 25% aqueous ammonia at room temperature for 1 hour to perform cleavage from the solid phase carrier and deprotection of the phosphoric acid moiety, thereby obtaining a mixture containing the target product T PO T PO T.
  • the mixture was analyzed by HPLC. The results are shown in Table 5.
  • the solid phase carrier was then washed with dried dichloromethane and acetonitrile, and dried. It was then reacted with 25% aqueous ammonia-ethanol (3:1, v/v) at room temperature for 3 hours to effect cleavage from the solid phase carrier and deprotection of the phosphoric acid moiety, yielding a mixture containing the target compound A PO G PO C PO T. The mixture was analyzed by HPLC. The results are shown in Table 5.
  • the percentages in Table 5 indicate the progress rate of phosphodiester deprotection, and were calculated from the area ratio in the HPLC analysis results: phosphodiester derivative (completely deprotected after the deprotection reaction) / (phosphodiester derivative (incompletely deprotected before the deprotection reaction) + phosphodiester derivative (completely deprotected after the deprotection reaction)).
  • Figures 5(a) to 5(c) show the results of reversed-phase HPLC analysis in Comparative Synthesis Examples 5 and 6 and Synthesis Example 5.
  • Comparative Synthesis Example 5 only 4% of the deprotection proceeded after 1 hour of ammonia treatment, suggesting that the deprotection reaction was extremely slow.
  • Comparative Synthesis Example 6 in order to achieve a 100% rate of deprotection of the phosphodiester, it was necessary to increase the reaction temperature to 55°C and extend the reaction time to 12 hours.
  • Synthesis Example 5 deprotection was completed in 3 hours at room temperature, and the reaction proceeded rapidly under mild conditions.
  • Example 1 Synthesis of PB Nucleic Acid Oligomer (Tetramer) and PB/PO Chimeric Nucleic Acid Oligomer (Tetramer) 5'-O-Dimethoxytritylthymidine (0.5 ⁇ mol) supported on a solid phase carrier via a succinyl linker was detritylated by adding a 3% dichloroacetic acid/dichloromethane solution (5 times x 12 s, 1 mL/time), and the solid phase carrier was washed with acetonitrile and dichloromethane that had been dried using molecular sieves, and then vacuum-dried. Next, a chain elongation reaction of the oligomer was carried out by repeating a combination of the following steps (i), (ii), and (iii) three times.
  • step (iii) The solid phase carrier after step (ii) was reacted with 3% dichloroacetic acid/dichloromethane-triethylsilane (1:1, v/v) solution (1 mL) for 12 seconds. After repeating the same operation five times, the solid phase carrier was washed three times with dichloromethane (1 mL) and three times with acetonitrile (1 mL), and then vacuum dried.
  • the washed solid phase carrier was treated with 25% aqueous ammonia-ethanol (3:1, v/v) at room temperature for 3 hours and at 50°C for 17 hours to deprotect the nucleic acid base moiety, cleave the coordinate bond between the nitrogen atom of the nucleic acid base moiety and borane, and cut out the nucleic acid oligomer from the solid phase carrier.
  • the solid phase carrier was filtered, the filtrate was collected, and the solvent was removed under reduced pressure.
  • Reverse-phase HPLC was performed using a linear gradient of 0-60% acetonitrile in 0.1 M TEAA buffer (pH 7) for 60 minutes at 30° C. and a flow rate of 0.5 mL/min. In this manner, PB nucleic acid oligomer C PB A PB G PB T and PB/PO chimeric nucleic acid oligomer C PB A PO G PB T were obtained.
  • Example 2 Synthesis of PB/PO chimeric nucleic acid oligomer (12-mer) An oligomer was synthesized under the same conditions as in [Example 1], except that the combination of steps (i), (ii), and (iii) was repeated 11 times.
  • PB/PO chimeric nucleic acid oligomer (12-mer) was separated and purified by reversed-phase HPLC. Reverse-phase HPLC and separation and purification were carried out at 60° C. for 20 minutes at a flow rate of 0.5 mL/min using a 0.1 M hexafluoroisopropanol-0.008 M triethylamine buffer solution of 5-40% methanol as the mobile phase.
  • the PB/PO chimeric nucleic acid oligomer C PB A PO G PB T PO C PB A PO G PB T PO C PB A PO G PB T (SEQ ID NO: 1) was obtained. Yield: 3% HRMS (ESI-TOF): Calcd for [M-4H] 4- , 907.2133; found, 907.2129
  • Example 3 Synthesis of PO nucleic acid oligomer (12-mer) An oligomer was synthesized under the same conditions as in [Example 1], except that the combination of steps (i), (ii), and (iii) was repeated 11 times, and step (IV) was not performed.
  • the obtained PO nucleic acid oligomer (12-mer) was separated and purified by reversed-phase HPLC. Reverse-phase HPLC and separation and purification were carried out at 50° C. for 10 minutes at a flow rate of 0.5 mL/min using a 0.4 M hexafluoroisopropanol-0.016 M triethylamine buffer solution of 5-25% methanol as the mobile phase. In this way, the PO nucleic acid oligomer C PO A PO G PO T PO C PO A PO G PO T PO C PO A PO G PO T (SEQ ID NO: 2) was obtained. Yield: 14% HRMS (ESI-TOF): Calcd for [M-4H] 4- , 910.1530; found, 910.1565

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  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

アミノ基が置換されていない核酸塩基を有し、かつ、高い収率で核酸オリゴマーを与える新規なヌクレオチドモノマー、及び収率の高い核酸オリゴマーの製造方法を提供する。　本発明に係るヌクレオチドモノマーは一般式（１）で表される。式中、Ｒ１は水素原子等、Ｒ２は水素原子を表し、又は、Ｒ１及びＲ２は互いに結合して所定の５員以上の環を形成し、Ｒ３は水素原子又は水酸基の保護基、Ｒ４は置換基を有し又は有しないアリール基、Ｒ５は水素原子等、Ｒ６は置換基を有し又は有せず、かつ、分子鎖中にヘテロ原子を有し又は有しない炭素原子数３以上のアルキル基を表し、又は、Ｒ５及びＲ６は互いに結合して、分岐鎖を有する所定の５員以上の環を形成し、ＢＮＨ２はアデニンＡ、グアニンＧ、シトシンＣ、５－メチルシトシンｍＣ、チミン、又はウラシルである核酸塩基を表し、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びｍＣ中のアミノ基は置換されていない。

Description

ヌクレオチドモノマー、及び核酸オリゴマーの製造方法
　本発明は、ヌクレオチドモノマー、及び核酸オリゴマーの製造方法に関する。
　標的核酸と相補的な塩基配列を有するアンチセンス分子は、標的核酸と相補的な二重鎖を形成し、標的核酸からのタンパク質生成を阻害することができる。標的核酸として疾病関連遺伝子を選択した場合には、アンチセンス分子は、疾病関連遺伝子に直接働きかけるため、遺伝子治療に有効な医薬として注目されている。
　アンチセンス分子（核酸オリゴマー）は、標的となるタンパク質の生成を効率よく阻害する観点から主として、細胞膜透過性、ヌクレアーゼ耐性、体内（例えば、ｐＨ７．４の環境下）での化学的安定性、及び特定の塩基配列とのみ安定な二重鎖を形成する性質を有することが求められる。アンチセンス分子としては、例えば、ボラノホスフェート化合物を用いて得られる核酸オリゴマー（以下、「ボラノホスフェート型核酸オリゴマー」と称する）が知られている。
　核酸の化学合成法としては、核酸塩基部のアミノ基にアシル系の保護基を導入したモノマーを用い、下記左式で表されるようなホスファイトトリエステル中間体を経由して、適切な化学修飾を施すことよってオリゴマーを得る方法が公知である。原理的には、このホスファイトトリエステル中間体とボラノ化剤とを反応させることによりボラノ化して、下記右式で表されるようなボラノホスフェート型核酸オリゴマーを得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （上記左式及び上記右式において、ＤＭＴｒは、４，４’－ジメトキシトリチル基を表し、丸印は、固相担体を表し、ＢＰＲＯ及びＢＰＲＯ＊は、下記式で表される核酸塩基を表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （上記式において、Ｐｈは、フェニル基を表す。）
　しかし、上記ボラノ化の過程で、アデニン、シトシン、及びグアニンのアミノ基を保護するアシル系の保護基がボラノ化剤により還元されて脱保護することができなくなるため、上記方法は、核酸塩基がチミン又はウラシルである場合にしか用いることができない。
　そこで、アミノ基が保護されていない核酸塩基を有するヌクレオチドモノマーを用いて、ボラノホスフェート型核酸オリゴマーを包含する核酸オリゴマーを得る方法が公知である（非特許文献１及び２）。ヌクレオチドモノマーとして、非特許文献１及び２では、それぞれ、下記左式で表されるヌクレオチドモノマー及び下記右式で表されるヌクレオチドモノマーが用いられる。下記のような環状構造を有するモノマーを用いることで、穏和な酸性条件下でもアミノ基との副反応が抑制され、塩基部が無保護でもオリゴマーを得ることが可能となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （上記式において、ＤＭＴｒ及びＰｈは、前述の通りであり、ＢＮＨ２は、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン、及びウラシルからなる群より選ばれる核酸塩基を表し、該アデニン、該グアニン、該シトシン、及び該５－メチルシトシン中のアミノ基は、置換されていない。）
Ｎｕｃｌ．　Ｎｕｃｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　２０１０，　Ｖｏｌ．２９，　ｐｐ．１４４－１５４ Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌｅｔｔ．，　２００６，　Ｖｏｌ．１６，　ｐｐ．３１１１－３１１４
　しかし、本発明者らの検討によれば、非特許文献１又は２に開示されているような従来のヌクレオチドモノマーを用いた場合、得られる核酸オリゴマーの鎖長に限界がある。この原因は、以下の通りである。上記ヌクレオチドモノマーは、アミノ基が無保護であることで、極性が高いため、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製時に、シリカゲルとの親和性が極端に高く、よって、精製が困難となりやすい。このことで、ヌクレオチドモノマーの純度が低下しやすいため、核酸オリゴマーの合成効率が低下し、結果として、核酸オリゴマーの鎖長が長くなりにくい。更に、上記ヌクレオチドモノマーは、リン原子周辺の立体障害が極端に小さいために、加水分解に対する反応性が高すぎ、縮合条件下、速やかに加水分解してしまうことで、上記ヌクレオチドモノマーの実効濃度が低下しやすいことも原因として挙げられる。
　本発明は、アミノ基が置換されていない核酸塩基を有し、かつ、高い収率で核酸オリゴマーを与える新規なヌクレオチドモノマー、及び収率の高い核酸オリゴマーの製造方法を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞　下記一般式（１）で表されるヌクレオチドモノマー。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （一般式（１）中、Ｒ１は、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリヒドロカルビルシリルオキシ基、アルコキシアルコキシ基、ハロアルコキシアルコキシ基、又はハロゲニル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表し、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成し、Ｒ３は、水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｒ４は、置換基を有し又は有しないアリール基を表し、Ｒ５は、水素原子、ハロゲニル基、又は置換基を有し若しくは有しないアルキル基を表し、Ｒ６は、置換基を有し又は有せず、かつ、分子鎖中にヘテロ原子を有し又は有しない炭素原子数３以上のアルキル基を表し、又は、Ｒ５及びＲ６は、互いに結合して、分岐鎖を有し、かつ、前記分岐鎖以外に置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成し、ＢＮＨ２は、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン、及びウラシルからなる群より選ばれる核酸塩基を表し、該アデニン、該グアニン、該シトシン、及び該５－メチルシトシン中のアミノ基は、置換されていない。）
＜２＞　前記Ｒ６が表すアルキル基は、分岐状である＜１＞に記載のヌクレオチドモノマー。
＜３＞　前記Ｒ６が表すアルキル基は、炭素原子数が６以上１４以下である＜１＞又は＜２＞に記載のヌクレオチドモノマー。
＜４＞　Ｒ１は、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリヒドロカルビルシリルオキシ基、アルコキシアルコキシ基、ハロアルコキシアルコキシ基、又はハロゲニル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表し、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、下記一般式（２）で表される二価の基を形成する＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のヌクレオチドモノマー。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （一般式（２）中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～１０のアルキル基を表し、又は、互いに結合して環を形成し、＊及び＊＊は、結合手を表し、＊で表される結合手は、一般式（１）において、Ｒ１が直結する炭素原子に結合し、＊＊で表される結合手は、一般式（１）において、Ｒ２が直結する炭素原子に結合する。）
＜５＞　前記ヌクレオチドモノマーにおいてリン原子の立体化学は制御されている＜１＞～＜４＞のいずれかに記載のヌクレオチドモノマー。
＜６＞　下記一般式（１ａ）で表されるヌクレオチドモノマーを縮合させて、下記一般式（３ａ）で表されるヌクレオチド単位を含む第一の前駆体核酸オリゴマーを得る縮合工程と、
　前記第一の前駆体核酸オリゴマーをボラノ化剤によりボラノ化して、下記一般式（４ａ）で表されるヌクレオチド単位を含む第二の前駆体核酸オリゴマーを得るボラノ化工程、又は
　前記第一の前駆体核酸オリゴマーを酸化剤により酸化して、下記一般式（５ａ）で表されるヌクレオチド単位を含む第三の前駆体核酸オリゴマーを得る酸化工程と、
　前記第二の前駆体核酸オリゴマー又は前記第三の前駆体核酸オリゴマーから、Ｒ３ａで表される保護基を脱離させて、下記一般式（４ｂ）で表されるヌクレオチド単位を含む第四の前駆体核酸オリゴマー、又は下記一般式（５ｂ）で表されるヌクレオチド単位を含む第五の前駆体核酸オリゴマーを得る脱保護工程と、
の組み合わせを１回実行し又は２回以上繰り返し実行する鎖長伸長工程、並びに
　前記第四の前駆体核酸オリゴマー又は前記第五の前駆体核酸オリゴマーにおいて、５’－水酸基及びアミノ基に対し保護基によるキャッピングを行って又は行わないで、下記一般式（４ｃ）で表されるヌクレオチド単位を含む第六の前駆体核酸オリゴマー又は下記一般式（５ｃ）で表されるヌクレオチド単位を含む第七の前駆体核酸オリゴマーから、下記一般式（６）で表されるリン酸保護基を脱離させて、更に、前記キャッピングを行った場合には前記保護基を脱離させて、下記一般式（７）で表されるヌクレオチド単位及び下記一般式（８）で表されるヌクレオチド単位からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む核酸オリゴマーを得る核酸オリゴマー生成工程
を含む核酸オリゴマーの製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （一般式（１ａ）中、Ｒ１は、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリヒドロカルビルシリルオキシ基、アルコキシアルコキシ基、ハロアルコキシアルコキシ基、又はハロゲニル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表し、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成し、Ｒ３ａは、水酸基の保護基を表し、Ｒ４は、置換基を有し又は有しないアリール基を表し、Ｒ５は、水素原子、ハロゲニル基、又は置換基を有し若しくは有しないアルキル基を表し、Ｒ６は、置換基を有し又は有せず、かつ、分子鎖中にヘテロ原子を有し又は有しない炭素原子数３以上のアルキル基を表し、又は、Ｒ５及びＲ６は、互いに結合して、分岐鎖を有し、かつ、前記分岐鎖以外に置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成し、ＢＮＨ２は、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン、及びウラシルからなる群より選ばれる核酸塩基を表し、該アデニン、該グアニン、該シトシン、及び該５－メチルシトシン中のアミノ基は、置換されていない。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （一般式（３ａ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ４～Ｒ６、及びＢＮＨ２は、前記の通りである。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （一般式（４ａ）、（５ａ）、（４ｂ）、及び（５ｂ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ４～Ｒ６、及びＢＮＨ２は、前記の通りである。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （一般式（４ｃ）及び（５ｃ）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４～Ｒ６は、前記の通りであり、
前記キャッピングを行った場合、Ｒ９は、水酸基の保護基を表し、Ｒ１０は、アミノ基の保護基を表し、Ｂｓは、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン、及びウラシルからなる群より選ばれる核酸塩基を表し、該アデニン、該グアニン、該シトシン、及び該５－メチルシトシン中のアミノ基は、アミノ基の保護基で置換されており、
前記キャッピングを行わなかった場合、Ｒ９及びＲ１０は、水素原子を表し、Ｂｓは、ＢＮＨ２を表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （一般式（６）中、Ｒ４～Ｒ６及びＲ１０は、前記の通りである。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （一般式（７）及び（８）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＢＮＨ２は、前記の通りであり、Ｘ＋は、カウンターカチオンを表す。）
＜７＞　前記Ｒ６が表すアルキル基は、分岐状である＜６＞に記載の製造方法。
＜８＞　前記Ｒ６が表すアルキル基は、炭素原子数が６以上１４以下である＜６＞又は＜７＞に記載の製造方法。
＜９＞　Ｒ１は、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリヒドロカルビルシリルオキシ基、アルコキシアルコキシ基、ハロアルコキシアルコキシ基、又はハロゲニル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表し、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、下記一般式（２）で表される二価の基を形成する＜６＞～＜８＞のいずれかに記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （一般式（２）中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～１０のアルキル基を表し、又は、互いに結合して環を形成し、＊及び＊＊は、結合手を表し、＊で表される結合手は、一般式（１ａ）において、Ｒ１が直結する炭素原子に結合し、＊＊で表される結合手は、一般式（１ａ）において、Ｒ２が直結する炭素原子に結合する。）
＜１０＞　前記ヌクレオチドモノマー及び前記ヌクレオチド単位においてリン原子の立体化学は制御されている＜６＞～＜９＞のいずれかに記載の製造方法。
　本発明によれば、アミノ基が置換されていない核酸塩基を有し、かつ、高い収率で核酸オリゴマーを与える新規なヌクレオチドモノマー、及び収率の高い核酸オリゴマーの製造方法を提供することができる。
図１（ａ）及び図１（ｂ）は、それぞれ、比較合成例１及び合成例１エントリー３において行った逆相ＨＰＬＣのチャートを示す図である。 図２（ａ）～図２（ｃ）は、それぞれ、合成例２エントリー２及び６並びに比較合成例２において行った逆相ＨＰＬＣのチャートを示す図である。 図３（ａ）及び図３（ｂ）は、それぞれ、比較合成例３及び合成例３において行った逆相ＨＰＬＣのチャートを示す図である。 図４（ａ）及び図４（ｂ）は、それぞれ、比較合成例４及び合成例４において行った逆相ＨＰＬＣのチャートを示す図である。 図５（ａ）～図５（ｃ）は、それぞれ、比較合成例５及び６並びに合成例５において行った逆相ＨＰＬＣのチャートを示す図である。
　以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また、本明細書において「～」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示すものとする。更に、本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
＜ヌクレオチドモノマー＞
　本実施形態に係るヌクレオチドモノマーは、上記一般式（１）で表される。一般式（１）で表されるヌクレオチドモノマーにおいて、Ｒ４は、置換基を有し又は有しないアリール基を表し、Ｒ６は、置換基を有し又は有せず、かつ、分子鎖中にヘテロ原子を有し又は有しない炭素原子数３以上のアルキル基を表し、又は、Ｒ６は、Ｒ５と結合して、分岐鎖を有し、かつ、前記分岐鎖以外に置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成する。これにより、一般式（１）で表されるヌクレオチドモノマーは、アミノ基が置換されていない核酸塩基を有しつつも、極性が低くなるために、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製が容易となり、高い純度で得ることができ、よって、高い収率で核酸オリゴマーを与えることができる。更に、上記ヌクレオチドモノマーは、リン原子周辺に適切な立体障害が付与されることで、加水分解が抑制され、縮合反応時に実効濃度を高く保つことができ、縮合効率を向上させることが可能である。
　Ｒ１が表すアルコキシ基としては、炭素原子数１～１２のアルコキシ基が好ましく、炭素原子数１～６のアルコキシ基がより好ましく、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、ｉ－プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基等を挙げることができる。
　Ｒ１が表すアルケニルオキシ基としては、例えば、ビニルオキシ基、アリルオキシ基、１－プロペニルオキシ基、イソプロペニルオキシ基、２－メチル－１－プロペニルオキシ基、２－メチルアリルオキシ基、２－ブテニルオキシ基等を挙げることができる。
　Ｒ１が表すアシルオキシ基としては、例えば、炭素原子数１から６のアルキル－カルボニルオキシ基（例えば、メチルカルボニルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基等）、炭素原子数６から１０のアリール－カルボニルオキシ（例えば、ベンゾイルオキシ基）等が挙げられる。
　Ｒ１が表すトリヒドロカルビルシリルオキシ基としては、例えば、トリメチルシリルオキシ基、トリエチルシリルオキシ基、トリイソプロピルシリルオキシ基、ｔ－ブチルジメチルシリルオキシ基等のトリアルキルシリルオキシ基、ｔ－ブチルジフェニルシリルオキシ基等のアルキルジアリールシリルオキシ基等を挙げることができる。
　Ｒ１が表すアルコキシアルコキシ基としては、例えば、メトキシメトキシ基、メトキシエトキシ基、エトキシメトキシ基、エトキシエトキシ基、（２－シアノエトキシ）メトキシ基等を挙げることができる。
　Ｒ１が表すハロアルコキシアルコキシ基としては、例えば、（２－フルオロ）エトキシメトキシ基、（２，２－ジフルオロ）エトキシメトキシ基、（２－クロロ）メトキシエトキシ基、（２，２－ジクロロ）エトキシメトキシ基等を挙げることができる。
　Ｒ１が表すハロゲニル基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等を挙げることができ、フルオロ基が好ましい。
　Ｒ１としては、二重鎖形成能の点から、上記の中でも、水素原子、水酸基、アルコキシ基、トリアルキルシリルオキシ基、アルコキシアルコキシ基、ハロアルコキシアルコキシ基、及びハロゲニル基が好ましい。
　Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成してもよい。前記置換基としては、例えば、前記環を形成している原子に結合した置換基が挙げられ、具体的には、置換基を有し又は有しないアルキル基、オキソ基（＝Ｏ）等が挙げられる。前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基等が挙げられる。該アルキル基が置換基を有する場合、当該置換基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等のハロゲニル基、アミノ基、イミノ基等が挙げられる。ヘテロ原子としては、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。前記環の員数は、好ましくは５～１０員、より好ましくは５～８員、更により好ましくは５～７員である。
　二重鎖形成能の点から、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、下記一般式（２）で表される二価の基を形成することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　一般式（２）中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～１０のアルキル基を表し、又は、互いに結合して環を形成し、＊及び＊＊は、結合手を表し、＊で表される結合手は、一般式（１）において、Ｒ１が直結する炭素原子に結合し、＊＊で表される結合手は、一般式（１）において、Ｒ２が直結する炭素原子に結合する。
　Ｒ７又はＲ８が表すアルキル基としては、例えば、直鎖状又は分岐鎖状の炭素原子数１～１０のアルキル基を挙げることができ、具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、及びｎ－オクチル基等が挙げられる。Ｒ７及びＲ８が互いに結合して環を形成する場合、当該環として、具体的には、例えば、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロヘキサン環等が挙げられる。
　Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成した場合、該環の具体例としては、下記式で示す環が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 （式中、ＢＮＨ２は、前記の通りである。）
　Ｒ３が表す水酸基の保護基としては、例えば、アセチル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、クロロアセチル基、ピバロイル基、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、トリフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、４－メトキシトリチル（ＭＭＴｒ）基、９－フェニルキサンテニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、トリメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、シアノメトキシメチル基、２－（シアノエトキシ）エチル基、シアノエトキシメチル基等を挙げることができる。中でも、酸性条件下で容易に除去可能であり、固相合成における鎖長伸長に適している点で、４，４’－ジメトキシトリチル基が好ましい。
　Ｒ４は、置換基を有し又は有しないアリール基を表し、合成の容易さ、反応性、オリゴマー生成時のリン酸部位の脱保護の容易さ、立体化学を制御する場合は縮合時の立体選択性の高さ等の点で、置換基を有し又は有しない炭素原子数６～２０のアリール基を表すことが好ましく、置換基を有し又は有しない炭素原子数６～１４のアリール基を表すことがより好ましく、置換基を有し又は有しない炭素原子数６～１０のアリール基を表すことが更により好ましい。前記置換基としては、例えば、置換基を有し又は有しないアルキル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、ハロゲニル基等が挙げられる。前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基等が挙げられる。該アルキル基が置換基を有する場合、当該置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、イミノ基、ハロゲニル基等が挙げられる。前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。前記ハロゲニル基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等が挙げられる。Ｒ４としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられ、合成の容易さ、反応性等の点で、フェニル基が好ましい。
　Ｒ５が表すハロゲニル基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等を挙げることができ、フルオロ基が好ましい。
　Ｒ５が表す置換基を有し若しくは有しないアルキル基としては、置換基を有し若しくは有しない炭素原子数１～１２のアルキル基が好ましく、置換基を有し若しくは有しない炭素原子数１～６のアルキル基がより好ましい。前記置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、イミノ基、ハロゲニル基等が挙げられる。前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。前記ハロゲニル基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等が挙げられる。Ｒ５が表す置換基を有し若しくは有しないアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基等が挙げられる。
　Ｒ５としては、合成の容易さ等の点から、水素原子が好ましい。
　Ｒ６は、置換基を有し又は有せず、かつ、分子鎖中にヘテロ原子を有し又は有しない炭素原子数３以上のアルキル基を表す。Ｒ６が表すアルキル基は、モノマーの収率及び純度、得られる核酸オリゴマーの収率の向上しやすさ等の点で、炭素原子数が３以上２０以下であることが好ましく、炭素原子数が６以上１４以下であることがより好ましく、炭素原子数が８以上１２以下であることが更により好ましい。前記置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、イミノ基、ハロゲニル基等が挙げられる。前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。前記ハロゲニル基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等が挙げられる。ヘテロ原子としては、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。Ｒ６が表すアルキル基は、モノマーの収率及び純度、得られる核酸オリゴマーの収率の向上しやすさ等の点で、分岐状であることが好ましい。Ｒ６としては、例えば、ｉ－プロピル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ネオペンチル基、ｉ－ペンチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、３－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ｉ－ヘキシル基、２－エチルヘキシル基、１－メチルヘプチル基、３－メチルオクチル基、テトラヒドロゲラニル基（即ち、３，７－ジメチルオクチル基）等が挙げられ、テトラヒドロゲラニル基が好ましい。
　Ｒ５及びＲ６は、互いに結合して、分岐鎖を有し、かつ、前記分岐鎖以外に置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成してもよい。前記環の員数は、好ましくは５～１０員、より好ましくは５～８員、更により好ましくは５～７員である。前記置換基としては、例えば、置換基を有し又は有しないアルキル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、イミノ基、ハロゲニル基等が挙げられる。前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基等が挙げられる。該アルキル基が置換基を有する場合、当該置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、イミノ基、ハロゲニル基等が挙げられる。前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。前記ハロゲニル基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等が挙げられる。ヘテロ原子としては、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。前記分岐鎖としては、例えば、置換基を有し又は有せず、かつ、分子鎖中にヘテロ原子を有し又は有しないアルキル基が挙げられる。該アルキル基は、得られる核酸オリゴマーの収率、得られる核酸オリゴマー中のヌクレオチド単位におけるリン原子の立体化学の制御のしやすさ等の点で、炭素原子数が１以上１５以下であることが好ましく、炭素原子数が２以上１０以下であることがより好ましく、炭素原子数が３以上８以下であることが更により好ましい。前記分岐鎖中の置換基としては、例えば、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、イミノ基、ハロゲニル基等が挙げられる。前記アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。前記ハロゲニル基としては、例えば、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等が挙げられる。前記分岐鎖中のヘテロ原子としては、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。前記アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基等が挙げられる。
　得られる核酸オリゴマー中のヌクレオチド単位におけるリン原子の立体化学の制御のしやすさ等の点で、前記ヌクレオチドモノマーにおいてリン原子の立体化学は制御されていることが好ましい。リン原子の立体化学が制御されている前記ヌクレオチドモノマーとしては、例えば、下記左式で表されるＳｐ体、下記右式で表されるＲｐ体が挙げられる。下記左式及び下記右式において、Ｒ１～Ｒ６、及びＢＮＨ２は、前記の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　本実施形態に係るヌクレオチドモノマーは、例えば、実施例に示す方法と同様にして製造することができる。
＜核酸オリゴマーの製造方法＞
　本実施形態に係る核酸オリゴマーの製造方法は、上記縮合工程と、上記ボラノ化工程又は上記酸化工程と、上記脱保護工程と、の組み合わせを１回実行し又は２回以上繰り返し実行する鎖長伸長工程、並びに上記核酸オリゴマー生成工程を含む。この製造方法により、高い収率で核酸オリゴマーを得ることができる。
　前記縮合工程では、固相担体に担持されたヌクレオシド構造中や核酸オリゴマーのヌクレオシド構造中のリボース構造の５’位の炭素原子に結合する水酸基と上記一般式（１ａ）で表されるヌクレオチドモノマーの亜リン酸部とが縮合する。Ｒ３ａが表す水酸基の保護基は、Ｒ３が表す水酸基の保護基と同様である。
　前記縮合工程では、酸性活性化剤を用いることができる。酸性活性化剤としては、例えば、１－フェニルイミダゾリウムトリフラート、Ｎ－シアノメチルピロリジウムトリフラート、Ｎ－シアノメチルジメチルアンモニウムトリフラート等が挙げられる。酸性活性化剤は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。前記縮合工程における縮合反応は、例えば、氷冷下（０℃）以上室温（２５℃）以下、好ましくは２０℃以上２５℃以下の範囲で、例えば、１分以上数時間以下、好ましくは２分以上１時間以下の範囲で行うことができる。反応溶媒としては、例えば、不活性溶媒等を挙げることができる。不活性溶媒としては、例えば、アセトニトリル、イソブチロニトリル等を挙げることができる。反応溶媒は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　前記ボラノ化工程では、ボラノ化剤を用いることができる。ボラノ化剤としては、例えば、ボラン／テトラヒドロフラン錯体、ジメチルスルフィドボラン等のボラン化合物等が挙げられる。ボラノ化剤は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。前記ボラノ化工程におけるボラノ化反応は、例えば、氷冷下（０℃）以上室温（２５℃）以下、好ましくは２０℃以上２５℃以下の範囲で、例えば、３０秒以上数時間以下、好ましくは１分以上１時間以下の範囲で行うことができる。反応溶媒としては、例えば、不活性溶媒等を挙げることができる。不活性溶媒としては、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、トルエン等を挙げることができる。反応溶媒は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　前記酸化工程では、酸化剤を用いることができる。酸化剤としては、例えば、ｔ－ブチルヒドロペルオキシド、ｍ－クロロ過安息香酸、（２Ｒ，８ａＳ）－（＋）－（カンファリルスルホニル）オキサジリジン、（１Ｓ）－（＋）－（８，８－ジクロロカンファリルスルホニル）オキサジリジン等の過酸化物等が挙げられる。酸化剤は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。前記酸化工程における酸化反応は、例えば、氷冷下（０℃）以上室温（２５℃）以下、好ましくは２０℃以上２５℃以下の範囲で、例えば、１分以上数時間以下、好ましくは２分以上１時間以下の範囲で行うことができる。反応溶媒としては、例えば、不活性溶媒等を挙げることができる。不活性溶媒としては、例えば、アセトニトリル、トルエン、デカン等を挙げることができる。反応溶媒は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　前記脱保護工程では、脱保護剤を用いることができる。脱保護剤としては、例えば、カルボン酸、ハロゲン化アルキルカルボン酸等を挙げることができる。カルボン酸としては、酢酸等を挙げることができる。ハロゲン化アルキルカルボン酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸等を挙げることができる。脱保護剤は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。脱保護される前駆体核酸オリゴマーにおいて、５’位の炭素原子に結合する水酸基が有する保護基Ｒ３ａがトリフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、４－メトキシトリチル（ＭＭＴｒ）基等のトリチル系の保護基であり、更に、該前駆体核酸オリゴマーがボラノ基を有する場合、脱保護工程において生じるトリチルカチオンとボラノ基との副反応を避けるために、カチオン捕捉剤を添加することが望ましい。カチオン捕捉剤としては、例えば、トリエチルシランが挙げられる。カチオン捕捉剤は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　鎖長伸長工程では、上記縮合工程と、上記ボラノ化工程又は上記酸化工程と、上記脱保護工程と、の組み合わせを１回実行し又は２回以上繰り返し実行する。これにより、２量体以上の前駆体核酸オリゴマーが形成される。具体的には、上記組み合わせを１回実行することにより、２量体の前駆体核酸オリゴマーを得ることができ、上記組み合わせをｎ回（ｎは２以上の整数）繰り返し実行することにより、（ｎ＋１）量体の前駆体核酸オリゴマーを得ることができる。
　核酸オリゴマー生成工程では、リン酸保護基脱離剤を用いて、一般式（７）で表されるリン酸保護基を脱離させることができる。リン酸保護基脱離剤としては、例えば、ジアザビシクロウンデセン、１，８－（ジメチルアミノ）ナフタレン、アンモニア水等の塩基等が挙げられる。リン酸保護基脱離剤は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。リン酸保護基脱離反応は、例えば、氷冷下（０℃）以上室温（２５℃）以下、好ましくは２０℃以上２５℃以下の範囲で、例えば、１５分以上２４時間以下、好ましくは３０分以上２０時間以下の範囲で行うことができる。反応溶媒としては、例えば、不活性溶媒等を挙げることができる。不活性溶媒としては、例えば、アセトニトリル、エタノール等を挙げることができる。反応溶媒は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　５’－水酸基に対し保護基によるキャッピングを行う場合、Ｒ９が表す水酸基の保護基としては、例えば、アセチル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、クロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ピバロイル基、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、トリフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、４－メトキシトリチル（ＭＭＴｒ）基、９－フェニルキサンテニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、トリメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、シアノメトキシメチル基、２－（シアノエトキシ）エチル基、シアノエトキシメチル基、（ジメチルアミノ）メチル基等が挙げられる。
　アミノ基に対し保護基によるキャッピングを行う場合、Ｒ１０が表すアミノ基の保護基、及び、アデニン、グアニン、シトシン、又は５－メチルシトシンを表すＢｓ中のアミノ基の保護基としては、例えば、アセチル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、クロロアセチル基、トリフルオロアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ピバロイル基、ベンジル基、４－メトキシベンジル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、トリフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基、４－メトキシトリチル（ＭＭＴｒ）基、９－フェニルキサンテニル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、トリメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジフェニルシリル基、シアノメトキシメチル基、２－（シアノエトキシ）エチル基、シアノエトキシメチル基、（ジメチルアミノ）メチル基等が挙げられる。
　５’－水酸基及びアミノ基に対する保護基によるキャッピング及び前記保護基の脱離は、公知の方法で行うことができる。
　Ｘ＋が表すカウンターカチオンとしては、例えば、アンモニウムイオン、有機アミン化合物由来のカチオン、又は金属カチオン等を挙げることができる。カウンターカチオンは、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。有機アミン化合物由来のカチオンとしては、有機溶媒への溶解度、及びカウンターカチオンの揮発性の観点から、例えば、三級アルキルアミン化合物由来のカチオン、又は第四級アンモニウム化合物由来のカチオンを挙げることができる。三級アルキルアミン化合物由来のカチオンとしては、例えば、トリエチルアミン由来のカチオンＨＮＥｔ３ ＋（Ｅｔはエチル基を表す。）、及び１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン由来のカチオンを挙げることができる。第四級アンモニウム化合物由来のカチオンとしては、例えば、テトラブチルアンモニウムイオンを挙げることができる。金属カチオンとしては、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋等が挙げられる。
　本実施形態に係る核酸オリゴマーの製造方法では、少なくとも前記縮合工程から前記核酸オリゴマー生成工程までを、固相担体を用いた反応により行うことが好ましい（固相法）。固相反応により核酸オリゴマーを製造する場合、核酸オリゴマーの３’末端の塩基を含むモノマーは、例えば、リボース構造の３’位の炭素原子に結合する酸素原子を介して、固相担体と結合することができる。この場合、モノマーと固相担体との間には、必要に応じてリンカーが存在してもよい。
　前記固相担体の種類は特に限定されず、例えば、定孔ガラス、オキサリル化－定孔ガラス、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体－アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体、高架橋アミノメチルポリスチレン、Ｐｒｏｓ－ポリスチレン／ジビニルベンゼンの共重合体等を挙げることができる。前記固相担体とモノマーとの連結には、固相担体上のアミノ基を利用することができる。前記固相担体上のアミノ基としては、３－アミノプロピル基、長鎖アルキルアミノ基（ＬＣＡＡ）等を挙げることができる。前記固相担体とモノマーとの間には、リンカーが存在してもよい。前記リンカーとしては、スクニシル基、サルコシル基、スクシニルサルコシル基、オキサリル基等を挙げることができる。
　上述の通りにして得られた核酸オリゴマーは、適宜、固相担体から切り出すことができる。固相担体からの核酸オリゴマーの切り出しは、例えば、前記核酸オリゴマーが結合した固相担体をアンモニア水で処理することで行うことができる。固相担体からの核酸オリゴマーの切り出しで用いられるアンモニア水としては、例えば、２５質量％アンモニア水又は２５質量％アンモニア水－エタノール混合溶液（３：１、ｖ／ｖ）が挙げられる。固相担体からの核酸オリゴマーの切り出しは、例えば、前述した５’－水酸基に対する保護基の脱離又は前述したリン酸保護基の脱離と同時に行ってもよい。
　得られた核酸オリゴマーは、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）、イオン交換ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、再結晶等の公知の精製方法により精製することができる。
　本実施形態に係る核酸オリゴマーの製造方法では、前記ヌクレオチドモノマーのリン原子の立体化学が制御されていた場合、前記ヌクレオチド単位においてリン原子の立体化学は制御される。これにより、本実施形態に係る核酸オリゴマーの製造方法では、核酸オリゴマーを立体選択的に合成することができ、例えば、アンチセンス分子としての有効性、安全性等を効果的に向上させることが容易である。立体化学純度は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
・核酸オリゴマー
　本実施形態に係る核酸オリゴマーの製造方法で得られた核酸オリゴマーは、上記一般式（７）で表されるヌクレオチド単位及び上記一般式（８）で表されるヌクレオチド単位からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む。上記一般式（７）で表されるヌクレオチド単位は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記一般式（８）で表されるヌクレオチド単位は、１種単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　一般式（７）で表されるヌクレオチド単位を含む核酸オリゴマーは、標的ＲＮＡとの親和性及びＲＮａｓｅ　Ｈ誘導活性に優れ、分解酵素耐性に特に優れる傾向にあり、毒性は高くなりにくい。一般式（８）で表されるヌクレオチド単位を含む核酸オリゴマーは、標的ＲＮＡとの親和性及びＲＮａｓｅ　Ｈ誘導活性に特に優れる傾向にあり、毒性は高くなりにくいものの、分解酵素耐性は低くなりやすい。上記核酸オリゴマーは、一般式（７）で表されるヌクレオチド単位及び一般式（８）で表されるヌクレオチド単位を含むと、標的ＲＮＡとの親和性、ＲＮａｓｅ　Ｈ誘導活性、及び分解酵素耐性を高く維持しつつ、毒性が低く抑えられていることが期待される。
　上記核酸オリゴマーの長さ（塩基長）としては、当該核酸オリゴマーが２つ以上の塩基を有する限り特に制限はなく、標的核酸の種類、長さ等に応じて所望の長さを適宜選択できる。当該核酸オリゴマーの長さは、特に限定されず、アンチセンス医薬への応用の観点から、８～５０塩基であることが好ましく、１０～３０塩基であることがより好ましく、１０～２１塩基であることが更により好ましい。
　核酸オリゴマーの塩基配列は、標的核酸の塩基配列に基づいて設定される。二重鎖形成能の観点から、核酸オリゴマーの塩基配列は、標的核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列となるように適宜選択されるが、場合によって、異なる塩基を１つ以上含む塩基配列であってもよい。また、核酸オリゴマーにおいて、一般式（７）で表されるヌクレオチド単位及び一般式（８）で表されるヌクレオチド単位の割合は、標的ＲＮＡとの親和性、ＲＮａｓｅ　Ｈ誘導活性、分解酵素耐性、及び血中滞留性が高く維持されるよう、適宜選択される。
　本実施形態に係る核酸オリゴマーは、一般式（７）で表されるヌクレオチド単位及び一般式（８）で表されるヌクレオチド単位以外のヌクレオチド単位を有する核酸オリゴマーであってもよい。当該核酸オリゴマーにおいて、一般式（７）で表されるヌクレオチド単位及び一般式（８）で表されるヌクレオチド単位の合計の割合は、特に限定されず、二重鎖形成能の観点から、核酸オリゴマー中の全ヌクレオチド単位に対し、４０～１００モル％であることが好ましく、５０～１００モル％であることがより好ましく、６０～１００モル％であることが更により好ましく、７０～１００モル％であることが特に好ましい。
　本実施形態に係る核酸オリゴマーにおいて、５’末端は、水酸基又は水酸基の保護基であってよく、３’末端は、水酸基又は水酸基の保護基であってよい。水酸基の保護基の具体例は、前述の通りである。
　以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
　各種分析器は以下に示した機種を用いた。
１Ｈ－核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ－ＮＭＲ）：ＪＥＯＬ　ＪＮＭ－ＥＣＺ４００Ｓ（４００ＭＨｚ）
３１Ｐ－核磁気共鳴スペクトル（３１Ｐ－ＮＭＲ）：ＪＥＯＬ　ＪＮＭ－ＥＣＺ４００Ｓ（１６２ＭＨｚ）
　なお、１Ｈ－ＮＭＲにはテトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として用い、３１Ｐ－ＮＭＲには８５％Ｈ３ＰＯ４を外部標準として用いた。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：Ｓｃｉｅｘ　Ｘ５００Ｒ　ＱＴＯＦ
カラムクロマトグラフィーに充填するシリカゲルには、ＫＡＮＴＯ　ＣＨＥＭＩＣＡＬのＳｉｌｉｃａ　Ｇｅｌ　６０ＮとＦＵＪＩ　ＳＩＬＹＳＩＡ　ＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＬＴＤ．のＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ　ＮＨ－ＤＭ１０２０とを用いた。
逆相ＨＰＬＣに使用したカラム（精製）：Ｊａｐａｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　ＪＡＩＧＥＬ－ＯＤＳ，　ＡＰ－ＳＰ－１２０－１５
逆相ＨＰＬＣに使用したカラム（分析）：ｗａｔｅｒｓ　μ－ＢＯＵＮＤＡＳＰＨＥＲＥ，Ｃ１８　５μｍ，１００Å，３．９ｍｍ×１５９ｍｍ
　なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。実施例中、ＤＭＴｒは４，４’－ジメトキシトリチルを示し、その他の略号は上記説明中のものと同義である。
＜アミノアルコールの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　上記スキーム左端に記載のアミノアルコール誘導体１（１１．３３ｇ，８３ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下でピリジン（１０ｍＬ×３回），トルエン（１０ｍＬ×３回）で共沸乾燥し、テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）に溶解した。得られたテトラヒドロフラン溶液を攪拌しつつ，トリエチルアミン（ＴＥＡ，１７．５ｍＬ，１２４．５ｍｍｏｌ），クロロトリメチルシラン（ＴＭＳＣｌ，１５．７ｍＬ，１２４．５ｍｍｏｌ）を加え，２時間攪拌した。その後，メタノール（５．５ｍＬ）を加え、反応を停止し、溶媒を減圧留去した。得られた無色結晶の混合物をジクロロメタン（１６０ｍＬ）に溶解し、その溶液を０℃に冷却した後、トリエチルアミン（ＴＥＡ，２９．０ｍＬ，１６６ｍｍｏｌ）を加え、２－ニトロベンゼンスルホニルクロリド（ＮｓＣｌ，１９．３１ｇ，８７．１５ｍｍｏｌ）を１０回に分けて加え、３時間攪拌した。メタノール（５ｍＬ）を加えて反応を停止し、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、飽和重曹水（３００ｍＬ×３回）で洗浄した。水層をジクロロメタン（１００ｍＬ×２回）で逆抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、溶媒を減圧留去し、無色結晶の混合物を得た。
　得られた混合物をＴＨＦ（２６０ｍＬ）に溶解させ、テトラヒドロゲラニオール（２２．３ｍＬ，１１６ｍｍｏｌ），トリフェニルホスフィン（４４．０ｇ，１６６ｍｍｏｌ）加え、０℃に冷却した。ここにアゾジカルボン酸ジイソプロピル／テトラヒドロフラン溶液（ＤＩＡＤ，３３．０ｍＬ，１６６ｍｍｏｌ／１５０ｍＬ）を加え、室温まで昇温して２４時間攪拌した。メタノール（７ｍＬ）を加え、反応を停止し、溶媒を減圧留去した。得られた混合物にヘキサン－酢酸エチル（６：１，ｖ／ｖ）を３５０ｍＬ加え０℃まで冷却し、析出してきた結晶をろ別し得られた溶液を減圧留去した。この操作を３回繰り返し、得られた混合物に酢酸エチル（５００ｍＬ）を加え、飽和食塩水（２００ｍＬ×３回）で洗浄した。水層を酢酸エチル（２００ｍＬ×２回）で逆抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、溶媒を減圧留去し、淡黄色のオイル状の混合物を得た。
　得られた混合物にメタノール（４１．５ｍＬ）と３％トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン溶液（３６０ｍＬ）を順次加え、終夜攪拌した。その後、有機層を飽和重曹水（２００ｍＬ×３回）で洗浄し、水層をジクロロメタン（２００ｍＬ×３回）で逆抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒　クロロホルム－ヘキサン（１：１，ｖ／ｖ）→クロロホルム）で分離精製することで目的化合物２を得た（淡黄色のオイル状）。収量：３２．４ｇ，７０ｍｍｏｌ，収率：８４％。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０５－８．０２（ｍ，１Ｈ），７．７２－７．６０（ｍ，３Ｈ），７．３６－７．２６（ｍ，５Ｈ），４．９０（ｄｔ，Ｊ＝８．５，３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．５６－３．２９（ｍ，４Ｈ），２．７６（ｄｄ，Ｊ＝８．７，３．２Ｈｚ，１Ｈ），１．６０－１．０３（ｍ，１０Ｈ），０．９０－０．８１（ｍ，９Ｈ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　［Ｍ＋１Ｈ］１＋，４６３．２２６２；ｆｏｕｎｄ，４６３．２２６２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　アミノアルコール誘導体２（３２．４ｇ，７０．０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下でジメチルホルムアミド（３５０ｍＬ）に溶解した。ここに１８－クラウン－６（３５．０ｇ，１４０ｍｍｏｌ），炭酸カリウム（３７．０ｇ，２８０ｍｍｏｌ），４－メルカプト安息香酸（１９．０ｇ，１４０ｍｍｏｌ）を順次加え、４０℃に昇温して１２時間攪拌した。その後、溶媒を半分ほど減圧留去した。酢酸エチル－ヘキサン（１：４，ｖ／ｖ，３００ｍＬ）で希釈後、水酸化ナトリウム水溶液（３００ｍＬ×５回）で洗浄し、酢酸エチル－ヘキサン（１：４，ｖ／ｖ，３００ｍＬ×１回）で逆抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒，クロロホルム－メタノール（１００：０－９７：３，ｖ／ｖ））で分離精製することで目的物化合物３を得た（淡黄色のオイル状）。収量：１２．９９ｇ，４６．８ｍｍｏｌ，収率：６７％。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．３９－７．２５（ｍ，５Ｈ），４．７５（ｄｄ，Ｊ＝９．１，３．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９３（ｄｔ，Ｊ＝１１．９，３．２Ｈｚ，１Ｈ），２．７８－２．６０（ｍ，３Ｈ），２．０８－２．５８（ｂｒ，２Ｈ），１．５８－１．０７（ｍ，１０Ｈ），０．８７（ｑ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，９Ｈ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　［Ｍ＋１Ｈ］＋，２７８．２４７９；ｆｏｕｎｄ，２７８．２４７４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　アミノアルコール誘導体３ｉ、３ｔ、又は３ｒ（３ｉ：０．６７ｇ，３．８ｍｍｏｌ；３ｔ：１３．９ｇ，５０ｍｍｏｌ；３ｒ：１．４ｇ，５．０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、トルエン（５ｍＬ×３回）で共沸乾燥し、トルエン（３ｉ：３．７ｍＬ；３ｔ：４０．０ｍＬ；３ｒ：３．３ｍＬ）、Ｎ－メチルモルホリン（３ｉ：０．９ｍＬ，７．９ｍｍｏｌ；３ｔ：１１．５ｍＬ，１０５ｍｍｏｌ；３ｒ：１．１５ｍＬ，１０．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合溶液を三塩化リン（３ｉ：０．３ｍＬ，３．９ｍｍｏｌ；３ｔ：１１．５ｍＬ，１０５ｍｍｏｌ；３ｒ：０．５ｍＬ，５．３ｍｍｏｌ）のトルエン（３ｉ：２．５ｍＬ；３ｔ：４０ｍＬ；３ｒ：３．０ｍＬ）溶液に対し、０℃で１０分かけて加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌後、生じた塩をアルゴン雰囲気下、－７８℃でろ別し、溶媒を減圧留去して目的化合物４ｉ、４ｔ、及び４ｒを得た（４ｉ：淡黄色のオイル状，１.１８ｇ；４ｔ：淡黄色のオイル状，１８．２ｇ；４ｒ：淡黄色のオイル状，２．０ｇ）。これ以上の精製は行わず、次の反応に用いた。
＜モノマーの合成＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　上記式中、ＢＮＨ２は、ＡｄＮＨ２、ＣｙＮＨ２、ＧｕＮＨ２、又はＴｈであり、ＡｄＮＨ２は、アミノ基が置換されていないアデニンを表し、ＣｙＮＨ２は、アミノ基が置換されていないシトシンを表し、ＧｕＮＨ２は、アミノ基が置換されていないグアニンを表し、Ｔｈは、チミンを表す。
（オキサザホスホリジンモノマーの合成）
　オキサザホスホリジンモノマー６ａ、６ｃ、６ｇ、６ｔ、６ｌ、６ｒ、及び６ｉは既知の方法を参考に合成した（Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　２００８，　１３０，　４７，　ｐｐ．１６０３１－１６０３７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　上記スキーム左端に記載のヌクレオシド誘導体５ａ、５ｃ、５ｇ、５ｔ、又は５ｌ（Ａ：２．２ｇ，４．０ｍｍｏｌ；Ｃ：３．２ｇ，６．０ｍｍｏｌ；Ｇ：２．６ｇ，４．５ｍｍｏｌ；Ｔ：１．４ｇ，２．５ｍｍｏｌ；ＬＮＡＴ：１．７ｇ，３．０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で、ピリジン、トルエン，ＴＨＦで１ｍＬ×３回ずつ共沸乾燥しＴＨＦ（Ａ：１０ｍＬ；Ｃ：１５ｍＬ；Ｇ：１０．３ｍＬ；Ｔ：１０ｍＬ；ＬＮＡＴ：７．５　ｍＬ）とトリエチルアミン（Ａ：３．９ｍＬ，２８ｍｍｏｌ；Ｃ：５．８ｍＬ，４２ｍｍｏｌ；Ｇ：４．４ｍＬ，３１．５ｍｍｏｌ；Ｔ：３．９ｍＬ，２８ｍｍｏｌ；ＬＮＡＴ：２．９ｍＬ，２１ｍｍｏｌ）を加えた。得られたＴＨＦ溶液を所定温度（Ａ，Ｃ，Ｔ，ＬＮＡＴ：－７８℃；Ｇ：－４０℃）にて攪拌しつつ，０．６Ｍの化合物４ｔ／テトラヒドロフラン溶液（Ａ：３．４ｇ，１０ｍｍｏｌ；Ｃ：５．１ｇ，１５ｍｍｏｌ；Ｇ：３．８ｇ，１１．３ｍｍｏｌ；Ｔ：２．１ｇ，６．２５ｍｍｏｌ；ＬＮＡＴ：２．６ｇ，７．７ｍｍｏｌ）を５分かけて加えた。その後、チミジン誘導体のみ室温まで昇温し、それ以外の誘導体は前記所定温度を保って２時間攪拌した。クロロホルム２８０ｍＬで希釈した後、飽和重曹水溶液で洗浄した（５０ｍＬ×３回）。水層をクロロホルムにより逆抽出した（５０ｍＬ×３回）。有機層を集めて硫酸ナトリウムにより水分を除去した後に、有機層の溶媒を減圧留去して、得られた残渣をアルゴン雰囲気下で、トルエンで１ｍＬ×３回共沸乾燥した。アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製した。オキサザホスホリジンモノマー６ｇについてのみ、その後、一部の残渣を逆相ＨＰＬＣにより分離精製した。分離精製の具体的な手順は、以下の通りである。
Ａ：得られた残渣の７０％をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ＮＨ－シリカゲル，トルエン－酢酸エチル（１００：０－８０：２０，ｖ／ｖ），トリエチルアミン０．５％］で分離精製した。
Ｃ：得られた残渣の５１％をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ＮＨ－シリカゲル，トルエン→酢酸エチル－ｔＢｕＯＨ（９９：１，ｖ／ｖ），トリエチルアミン０．５％］で分離精製した。
Ｇ：得られた残渣の全量をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ＮＨ－シリカゲル，クロロホルム→クロロホルム－ｔＢｕＯＨ（９３：７，ｖ／ｖ），トリエチルアミン０．５％］で分離精製し，溶媒を減圧留去して得られた粗精製物の５１％を逆相ＨＰＬＣ（移動相：アセトニトリル－クロロホルム（８５：１５，ｖ／ｖ））で分離精製した。
Ｔ：得られた残渣の全量をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ＮＨ－シリカゲル，トルエン→トルエン－酢酸エチル（８０：２０，ｖ／ｖ），トリエチルアミン０．５％］で分離精製した。
ＬＮＡＴ：得られた残渣の９５％をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ＮＨ－シリカゲル，トルエン－酢酸エチル（１００：０－８０：２０，ｖ／ｖ），トリエチルアミン０．５％］で分離生成した。
　分離精製物から溶媒を減圧留去することで目的化合物（オキサザホスホリジンモノマー６ａ、６ｃ、６ｇ、６ｔ、又は６ｌ）を得た。収量　Ａ：０．８２ｇ，０．９５ｍｍｏｌ，３４％；Ｃ：０．８０ｇ，０．９６ｍｍｏｌ，３９％；Ｇ：０．６１ｇ，０．７０ｍｍｏｌ，３０％；Ｔ：１．０２ｇ，１．２０ｍｍｏｌ，５５％；ＬＮＡＴ：０．８２ｇ，０．９３ｍｍｏｌ，３１％
オキサザホスホリジンモノマー６ａ
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３１（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），７．４１－７．１６（ｍ，１４Ｈ），６．８０－６．７４（ｍ，４Ｈ），６．４８－６．４４（ｍ，１Ｈ），５．６７（ｂｒ，２Ｈ），５．５９－５．５４（ｍ，１Ｈ），５．０１（ｑｄ，Ｊ＝５．８，２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７７－３．７４（ｍ，６Ｈ），３．５８－３．３４（ｍ，３Ｈ），３．０９－２．９７（ｍ，２Ｈ），２．９５－２．８５（ｍ，２Ｈ），２．６１－２．５４（ｍ，１Ｈ），１．６２－１．０４（ｍ，１０Ｈ），０．８８－０．８２（ｍ，９Ｈ）
３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４２．７，１４２．１，１４２．０，１４１．５．
オキサザホスホリジンモノマー６ｃ
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９２（ｔｄ，Ｊ＝４．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４３－７．１７（ｍ，１４Ｈ），６．８４－６．７７（ｍ，４Ｈ），６．３３－６．２８（ｍ，１Ｈ），５．５１（ｑｄ，Ｊ＝７．３，２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４２－５．３４（ｍ，１Ｈ），４．９０－４．８１（ｍ，１Ｈ），３．７７－３．７１（ｍ，６Ｈ），３．５０－３．３６（ｍ，３Ｈ），３．０９－２．８４（ｍ，３Ｈ），２．６０－２．５３（ｍ，１Ｈ），２．３３－２．２１（ｍ，１Ｈ），１．５８－１．０２（ｍ，１０Ｈ），０．８８－０．８０（ｍ，９Ｈ）
３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４２．６，１４４．０，１４２．１，１４１．６．
オキサザホスホリジンモノマー６ｇ
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６４（ｓ，１Ｈ），７．４３－７．１５（ｍ，１４Ｈ），６．７８（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，８．７Ｈｚ，４Ｈ），６．２７－６．２０（ｍ，３Ｈ），５．５５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．９７（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．７４－３．７１（ｍ，６Ｈ），３．５５－３．３１（ｍ，３Ｈ），３．１３－２．９８（ｍ，２Ｈ），２．９６－２．８６（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｔｄ，Ｊ＝１３．６，７．９Ｈｚ，１Ｈ），２．５０－２．４６（ｍ，１Ｈ），１．６８－１．０５（ｍ，１０Ｈ），０．８８－０．８１（ｍ，９Ｈ）
３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４２．８，１４２．３，１４２．２，１４１．９．
オキサザホスホリジンモノマー６ｔ
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．４８（ｂｒ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４２－７．１９（ｍ，１４Ｈ），６．８５－６．７９（ｍ，４Ｈ），６．４２（ｄｄ，Ｊ＝７．５，６．２Ｈｚ，１Ｈ），５．５１－５．４５（ｍ，１Ｈ），４．９２－４．８６（ｍ，１Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｄｔ，Ｊ＝８．２，３．４Ｈｚ，６Ｈ），３．５３－３．３３（ｍ，３Ｈ），３．０７－２．９５（ｍ，２Ｈ），２．９２－２．８３（ｍ，１Ｈ），２．４７－２．２９（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．０１（ｍ，１３Ｈ），０．８８－０．８０（ｍ，９Ｈ）
３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４３．９，１４３．４，１４２．５，１４２．１．
オキサザホスホリジンモノマー６ｌ
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．９９（ｓ，１Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４８－７．４５（ｍ，２Ｈ），７．３７－７．１８（ｍ，１２Ｈ），６．８６－６．８１（ｍ，２Ｈ），６．７８－６．７３（ｍ，２Ｈ），５．６６（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄｔ，Ｊ＝５６．３，７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．６１－４．５８（ｍ，１Ｈ），４．５３－４．４７（ｍ，１Ｈ），３．８７－３．７０（ｍ，８Ｈ），３．６１－３．４９（ｍ，１Ｈ），３．４４－３．３４（ｍ，１Ｈ），３．１２－２．７９（ｍ，３Ｈ），１．５７－１．０２（ｍ，１３Ｈ），０．８８－０．７３（ｍ，９Ｈ）
３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４５．３，１４４．９，１４２．３，１４１．７．
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　上記スキーム左端に記載のヌクレオシド誘導体５ｃ（１．１ｇ，２．０ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で、ピリジン、トルエン，ＴＨＦで１ｍＬ×３回ずつ共沸乾燥しＴＨＦ（５．０ｍＬ）とトリエチルアミン（１．９ｍＬ，１４．０ｍｍｏｌ）を加えた。得られたＴＨＦ溶液を－７８℃にて攪拌しつつ，０．６Ｍの化合物４ｒ／テトラヒドロフラン溶液（１．７ｇ，５．０ｍｍｏｌ）を５分かけて加えた。その後、－７８℃を保って２時間攪拌した。クロロホルム２８０ｍＬで希釈した後、飽和重曹水溶液で洗浄した（５０ｍＬ×３回）。水層をクロロホルムにより逆抽出した（５０ｍＬ×３回）。有機層を集めて硫酸ナトリウムにより水分を除去した後に、有機層の溶媒を減圧留去して、得られた残渣をアルゴン雰囲気下で、トルエンで１ｍＬ×３回共沸乾燥した。アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製した。分離精製の具体的な手順は、以下の通りである。
　得られたすべての残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ＮＨ－シリカゲル，トルエン→酢酸エチル－ｔＢｕＯＨ（９９：１，ｖ／ｖ），トリエチルアミン０．５％］で分離精製した。
　分離精製物から溶媒を減圧留去することで目的化合物（オキサザホスホリジンモノマー６ｒ）を得た。収量　６ｒ：０．８６ｇ，１．０２ｍｍｏｌ，５１％
オキサザホスホリジンモノマー６ｒ
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９６（１Ｈ），７．４２－７．１７（１４Ｈ），６．８２－６．７３（４Ｈ），６．２５－６．３２（１Ｈ），５．５６－５．４８（１Ｈ），５．３５（１Ｈ），４．９１－４．８４（１Ｈ），４．０７－３．９８（１Ｈ），３．７５－３．７０（６Ｈ），３．４６－３．３９（３Ｈ），３．０９－２．８１（３Ｈ），２．５８（１Ｈ），２．４０－２．２８（１Ｈ），１．６０－１．０７（１０Ｈ），０．８９－０．８４（９Ｈ）
３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４４．７，１４４．２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　上記スキーム左端に記載のヌクレオシド誘導体５ｃ（０．８ｇ，１．５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で、ピリジン、トルエン，ＴＨＦで１ｍＬ×３回ずつ共沸乾燥しＴＨＦ（３．８ｍＬ）とトリエチルアミン（１．５ｍＬ，１０．５ｍｍｏｌ）を加えた。得られたＴＨＦ溶液を－７８℃にて攪拌しつつ，０．６Ｍの化合物４ｉ／テトラヒドロフラン溶液（０．９ｇ，３．８ｍｍｏｌ）を５分かけて加えた。その後、－７８℃を保って２時間攪拌した。クロロホルム２８０ｍＬで希釈した後、飽和重曹水溶液で洗浄した（５０ｍＬ×３回）。水層をクロロホルムにより逆抽出した（５０ｍＬ×３回）。有機層を集めて硫酸ナトリウムにより水分を除去した後に、有機層の溶媒を減圧留去して、得られた残渣をアルゴン雰囲気下で、トルエンで１ｍＬ×３回共沸乾燥した。アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離精製した。分離精製の具体的な手順は、以下の通りである。
　得られたすべての残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ＮＨ－シリカゲル，クロロホルム→クロロホルム－ｔＢｕＯＨ（８９：１１，ｖ／ｖ），トリエチルアミン０．５％］で分離精製した。
　分離精製物から溶媒を減圧留去することで目的化合物（オキサザホスホリジンモノマー６ｉ）を得た。収量　６ｉ：０．３０ｇ，０．４１ｍｍｏｌ，２７％
オキサザホスホリジンモノマー６ｉ
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９８－８．０７（１Ｈ），７．１４－７．４５（１４Ｈ），６．７２－６．８５（４Ｈ），６．２３－６．３２（１Ｈ），５．４２－５．５３（１Ｈ），５．２５－５．３５（１Ｈ），４．８０－４．９７（１Ｈ），３．９９－４．１１（１Ｈ），３．６９－３．７９（６Ｈ），３．２６－３．５６（４Ｈ），２．７９－２．９０（１Ｈ），２．５２－２．６８（１Ｈ），２．２２－２．３８（１Ｈ），１．１７－１．２４（３Ｈ），１．０９－１．１６（３Ｈ）
３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４４．１，１４１．８
＜固相法による核酸オリゴマーの合成＞
　以下、インターヌクレオチド結合のうち、ボラノホスフェート結合を下付きのＰＢにより、リン酸ジエステル結合を下付きのＰＯにより表現する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
（ｄＮＰＢＴの固相合成）
［合成例１］
　スクシニルリンカーを介して固相担体に担持された５’－Ｏ－ジメトキシトリチルチミジン（０．５μｍｏｌ）に対して３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液（５回×１２ｓ，１ｍＬ／回）を加えて、脱トリチル化した後に、モレキュラーシーブスによって乾燥させたアセトニトリルとジクロロメタンで固相担体の洗浄を行った。固相担体を５分間乾燥させたのちに［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマー６ａ、６ｃ、６ｇ、又は６ｔ（Ａ：２５．８ｍｇ（６０当量、３０μｍｏｌ）；Ｃ：２５．０ｍｇ（６０当量、３０μｍｏｌ）；Ｇ：２６．３ｍｇ（６０当量、３０μｍｏｌ）；Ｔ：２５．５ｍｇ（６０当量、３０μｍｏｌ））を加えた。固相担体を５分間乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で、酸性活性化剤として１－フェニルイミダゾリウムトリフラート（１．０Ｍ）を含むアセトニトリル－イソブチロニトリル（７：３，ｖ／ｖ，１５０μＬ）溶液を反応溶媒として加え、１０分間ボルテックスミキサーで撹拌することで縮合を行った。オキサザホスホリジンモノマーの縮合後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリル（１ｍＬ×３回）とジクロロメタン（１ｍＬ×３回）とで洗浄した。固相担体を５分間乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下でモレキュラーシーブスによって乾燥させたテトラヒドロフランを９５０μＬ，１．０Ｍボラン／テトラヒドロフラン錯体溶液を５０μＬ加え、２分間ボルテックスミキサーで撹拌することでボラノ化を行った。固相担体を、テトラヒドロフラン（１ｍＬ×３回）とジクロロメタン（１ｍＬ×３回）とで洗浄した。３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン－トリエチルシラン（１：１，ｖ／ｖ）溶液によりジメトキシトリチル基の脱保護を行った（５回×１２ｓ、１ｍＬ／回）。その後、固相担体を、乾燥させたジクロロメタン（１ｍＬ×３回）とアセトニトリル（１ｍＬ×３回）とで洗浄し、５分間乾燥させた。遊離となった５’－水酸基に対して４－ジメチルアミノピリジンを１０ｍｇ、２，６－ルチジンを４５０μＬ、無水酢酸を５０μＬ加えて１分間アセチル化を行った。固相担体を、乾燥させたジクロロメタン（１ｍＬ×３回）とアセトニトリル（１ｍＬ×３回）とで洗浄し、５分間乾燥させた。予め調製しておいた１０％ジアザビシクロウンデセン／アセトニトリル溶液を加えて６０分間リン酸部位の保護基の除去を行い、ボラノホスホジエステル結合へと変換させた。固相担体を、乾燥させたアセトニトリル（１ｍＬ×３回）で洗浄したのちに２５％アンモニア水／エタノール（３：１，ｖ／ｖ，５ｍＬ）溶液で後述する条件のもと反応を行い、核酸塩基部のアセチル基の脱保護、核酸塩基部の窒素原子とボランとの配位結合の切断と固相担体からの切り出しを行った（ｄＣＰＢＴ、ｄＧＰＢＴ、及びＴＰＢＴ：室温条件，１７時間；ｄＡＰＢＴ：室温条件，３時間、５０℃，１７時間）。反応後、反応溶液をろ過し、アセトニトリルを用いて洗浄を行った。溶媒を減圧留去し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣにて分析した。逆相ＨＰＬＣは、０．１Ｍ　ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７）中で、０～２０％アセトニトリルの直線濃度勾配を使用して、６０分間、３０℃にて、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで行った。結果を表１に示す。
［比較合成例１］
　スクシニルリンカーを介して固相担体に担持された５’－ヒドロキシチミジン（０．５μｍｏｌ）に対して［Ｎ－Ｍｅ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマー７ｇ（３０．０ｍｇ、８０当量、４０μｍｏｌ）を加えた。固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で、酸性活性化剤としてＮ－シアノメチルピロリジウムトリフラート（１．０Ｍ）を含むアセトニトリル溶液（２００μＬ）を反応溶媒として加え、３分間撹拌することで縮合を行った。オキサザホスホリジンモノマーの縮合後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルとジクロロメタンとで洗浄した。固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下でジクロロメタンを２００μＬ，ジメチルスルフィドボランを２０μＬ加え、５分間撹拌することでボラノ化を行った。固相担体をジクロロメタンで洗浄した。３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン－トリエチルシラン（１：１，ｖ／ｖ）溶液によりジメトキシトリチル基の脱保護を行った。その後、固相担体を、乾燥させたジクロロメタンとアセトニトリルとで洗浄し、乾燥させた。遊離となった５’－水酸基に対して予め調製しておいた３６％Ｎ－メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン溶液３００μＬと２２％無水酢酸／テトラヒドロフラン溶液２５０μＬを順次加え、３０秒間攪拌することでアセチル化を行なった。その後、固相担体を乾燥させたアセトニトリルで洗浄し、乾燥させた。４％ジアザビシクロウンデセン／アセトニトリル溶液で１時間半反応させることでリン酸部位の保護基の除去を行なった。２５％アンモニア水溶液で１７時間反応させ固相担体からの切り出しを行い、目的物を含む混合物を得た。混合物はＨＰＬＣにより分析を行なった。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　表１中の百分率は、ＨＰＬＣの分析結果における面積比：目的物／観測される全ての生成物より算出した。
　図１（ａ）及び図１（ｂ）に、それぞれ、比較合成例１及び合成例１エントリー３における逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す。比較合成例では、溶出時間の短い部分に未反応のチミジンが多く観測され、溶出時間の長い部分には、副生成物が多く観測された。一方、合成例１エントリー３では、未反応体や副生成物が顕著に少なかった。全ての生成物に対する目的物の割合（％）は合成例１エントリー３の方が１９％高い。これらの結果から、［Ｎ－Ｍｅ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマーでは、モノマーの加水分解や酸化が進行しやすく、副反応が起きやすいが、［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅでは、窒素原子周辺の立体障害が十分であるために、モノマーが安定であり、上記のような副反応が進行しづらいことによって、望みの縮合反応が効率的に進行したと考えられる。以上より、核酸オリゴマーを合成するためには、［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅの方が適していることが確認された。
（ＨＰＬＣの溶出条件）
合成例１：０－２０％ＣＨ３ＣＮ　ｉｎ　０．１　Ｍ　ＴＥＡＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　６０ｍｉｎ
比較合成例１：０－８％ＣＨ３ＣＮ　ｉｎ　０．１Ｍ　ＴＥＡＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　２０ｍｉｎ，　８％ＣＨ３ＣＮ　ｉｎ　０．１Ｍ　ＴＥＡＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　４０ｍｉｎ
（ｄＮＰＯＴの固相合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
［合成例２］
　スクシニルリンカーを介して固相担体に担持された５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－チミジン（０．５μｍｏｌ）に対して３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液（５回×１２ｓ，１ｍＬ／回）を加えて、脱トリチル化した後に、モレキュラーシーブスによって乾燥させたアセトニトリルとジクロロメタンで固相担体の洗浄を行った。固相担体を５分間乾燥させたのちにオキサザホスホリジンモノマー６ａ、６ｃ、６ｇ、６ｔ、６ｌ、又は６ｉ（Ａ：２５．８ｍｇ（６０当量、３０μｍｏｌ）；Ｃ（Ｔｈｇ）：２５．０ｍｇ（６０当量、３０μｍｏｌ）；Ｇ：２６．３ｍｇ（６０当量、３０μｍｏｌ）；Ｔ：２５．５ｍｇ（６０当量、３０μｍｏｌ）；ＬＮＡＴ：２６．３ｍｇ（６０当量、３０μｍｏｌ）；Ｃ（ｉＰｒ）：２２．１ｍｇ（６０当量、３０μｍｏｌ））を加えた。固相担体を５分間乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で、酸性活性化剤として１－フェニルイミダゾリウムトリフラート（１．０Ｍ）を含むアセトニトリル－イソブチロニトリル（７：３，ｖ／ｖ，１５０μＬ）溶液を反応溶媒として加え、１０分間ボルテックスミキサーで撹拌することで縮合を行った。オキサザホスホリジンモノマーの縮合後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリル（１ｍＬ×３回）とジクロロメタン（１ｍＬ×３回）とで洗浄した。固相担体を５分間乾燥させたのちに、予め調整しモレキュラーシーブスによって乾燥しておいた１．０Ｍ　ｔ－ブチルヒドロペルオキシド／トルエン溶液をアルゴン雰囲気下で５００μＬ加え、５分間ボルテックスで撹拌することで酸化を行った。固相担体を、ジクロロメタン（１ｍＬ×６回）で洗浄した。３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液によりジメトキシトリチル基の脱保護を行った（５回×１２ｓ、１ｍＬ／回）。その後、固相担体を、乾燥させたジクロロメタン（１ｍＬ×３回）とアセトニトリル（１ｍＬ×３回）とで洗浄したのちに２５％アンモニア水／エタノール（３：１，ｖ／ｖ，５ｍＬ）溶液を室温条件で３時間反応させ、リン酸部の保護基の除去と固相担体からの切り出しを行った反応後、反応溶液をろ過し、アセトニトリルを用いて洗浄を行った。溶媒を減圧留去し、粗生成物を逆相ＨＰＬＣにて前述と同様に分析した。結果を表２に示す。
［比較合成例２］
　モノマーとして、［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマー６の代わりに［Ｎ－Ｍｅ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマー７ｃを用いる以外は、［合成例２］と同様の条件で２量体を合成し、分析を行った。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　表２中、ＨＰＬＣ収率は、逆相ＨＰＬＣの結果におけるピーク面積比ｄＮＰＯＴ／（Ｔ＋ｄＮＰＯＴ）より算出した。
　図２（ａ）～図２（ｃ）に、合成例２エントリー２及び６並びに比較合成例２における逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す。比較合成例２では、未反応のチミジンが観測されているのに対して、合成例２エントリー２及び６では、比較合成例２と比較して未反応のチミジンが観測されておらず、それぞれ目的物のＨＰＬＣ収率は２％高かった。上記合成例２では、２量体を合成したが、オリゴマー合成時では、縮合回数が増えるため、縮合効率の高いモノマーを用いる方が望ましい。核酸オリゴマーを合成するためには、炭素原子数３以上で分岐状であるアルキル基を有している方が適していることが確認された。
（ＨＰＬＣの溶出条件）
０－２０％ＣＨ３ＣＮ　ｉｎ　０．１Ｍ　ＴＥＡＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　６０ｍｉｎ
（（Ｒｐ）－ＣＰＢＴの固相合成）
　リン原子の立体化学が制御されたモノマーを用いて、リン原子の立体化学が制御された（Ｒｐ）－ＣＰＢＴの固相合成を行なった。下記［Ｎ－Ｍｅ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマーは、非特許文献２に合成例が記載されている公知の化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
［比較合成例３］
　スクシニルリンカーを介して固相担体に担持された５’－ヒドロキシチミジン（０．５μｍｏｌ）に対して、立体制御した［Ｎ－Ｍｅ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマー（Ｒｐ）－７ｃ（３０．０ｍｇ、８０当量、４０μｍｏｌ）を加えた。固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で、酸性活性化剤としてＮ－シアノメチルピロリジウムトリフラート（１．０Ｍ）を含むアセトニトリル溶液（２００μＬ）を反応溶媒として加え、３分間撹拌することで縮合を行った。オキサザホスホリジンモノマーの縮合後、固相担体を乾燥させたアセトニトリルとジクロロメタンとで洗浄した。固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下でジクロロメタンを２００μＬ，ジメチルスルフィドボランを２０μＬ加え、５分間撹拌することでボラノ化を行った。固相担体を、ジクロロメタンで洗浄した。３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン－トリエチルシラン（１：１，ｖ／ｖ）溶液によりジメトキシトリチル基の脱保護を行った。その後、固相担体を、乾燥させたジクロロメタンとアセトニトリルとで洗浄し、乾燥させた。遊離となった５’－水酸基に対して予め調整しておいた３６％Ｎ－メチルイミダゾール／テトラヒドロフラン溶液３００μＬと２２％無水酢酸／テトラヒドロフラン溶液２５０μＬを順次加え、３０秒間攪拌することでアセチル化を行なった。その後、固相担体を乾燥させたアセトニトリルで洗浄し、乾燥させた。４％ジアザビシクロウンデセン／アセトニトリル溶液で１時間半反応させることでリン酸部位の保護基の除去を行なった。その後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルで洗浄し、乾燥させたのち２５％アンモニア水溶液で１時間反応させ固相担体からの切り出しを行い、目的物を含む混合物を得た。混合物はＨＰＬＣにより分析を行なった。結果を表３に示す。
［合成例３］
　スクシニルリンカーを介して固相担体に担持された５’－ヒドロキシチミジン（０．５μｍｏｌ）に対して、立体制御した［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマー（Ｒｐ）－６ｃ（１８．８ｍｇ，４５当量、２３μｍｏｌ）を加えた。固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で、酸性活性化剤としてＮ－シアノメチルピロリジウムトリフラート（１．０Ｍ）を含むアセトニトリル－イソブチロニトリル（７：３，ｖ／ｖ，１６０μＬ）溶液を反応溶媒として加え、５分間撹拌することで縮合を行った。オキサザホスホリジンモノマーの縮合後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルとジクロロメタンとで洗浄した。固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で０．０５Ｍボラン／テトラヒドロフラン錯体テトラヒドロフラン溶液で２分間の条件でボラノ化を行なった。固相担体を、ジクロロメタンで洗浄した。３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン－トリエチルシラン（１：１，ｖ／ｖ）溶液によりジメトキシトリチル基の脱保護を行った。その後、固相担体を乾燥させたジクロロメタンとアセトニトリルとで洗浄し、乾燥させた。遊離となった５’－水酸基に対して４－ジメチルアミノピリジン１０ｍｇ、２，６－ルチジン４５０μＬ、無水酢酸５０μＬを加えて６０秒間攪拌することでアセチル化を行った。その後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルで洗浄し、乾燥させた。１０％ジアザビシクロウンデセン／アセトニトリル溶液で１時間反応させることでリン酸部位の保護基の除去を行なった。その後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルで洗浄し、乾燥させたのち２５％アンモニア水－エタノール（３：１、ｖ／ｖ）１７時間反応させ固相担体からの切り出しを行い、目的物を含む混合物を得た。混合物はＨＰＬＣにより分析を行なった。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　表３中、立体化学純度は、ＨＰＬＣの結果において、Ｓｐ体ＣＰＢＴとＲｐ体ＣＰＢＴとの面積比より算出した。ＨＰＬＣ収率は、ＨＰＬＣの結果における面積比（Ｒｐ）－ＣＰＢＴ／（Ｔ＋（Ｒｐ）－ＣＰＢＴ）より算出した。
　図３（ａ）及び図３（ｂ）に、それぞれ、比較合成例３及び合成例３における逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す。比較合成例３と比較して、合成例３の方が目的物の収率及び立体化学純度が高い結果となった。これらの結果から、［Ｎ－Ｍｅ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅでは、縮合反応条件におけるエピメリ化が顕著であるのに対し、［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅでは、窒素原子の周辺の立体障害が十分であるために、立体化学純度が維持されると考えられる。よって、立体化学を制御した合成を行うためには、［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅの方が適していることが確認された。
（ＨＰＬＣの溶出条件）
比較合成例３：０－１５％ＣＨ３ＣＮ　ｉｎ　０．１Ｍ　ＴＥＡＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　４５ｍｉｎ
合成例３：５－２５％ＣＨ３ＣＮ　ｉｎ　０．１Ｍ　ＴＥＡＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　２０ｍｉｎ
（ＴＰＢＴＰＢＴの固相合成）
　オキサザホスホリジン環の窒素原子にテトラヒドロゲラニル基を有するチミジンモノマーを用いて、ＴＰＢＴＰＢＴの固相合成を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
［比較合成例４］
　スクシニルリンカーを介して固相担体に担持された５’－ヒドロキシチミジン（０．５　μｍｏｌ）に対して、以下の（ｉ）工程、（ｉｉ）工程、及び（ｉｉｉ）工程の組み合わせを２回繰り返すことで鎖長伸長反応を行った。
　（ｉ）工程：固相担体に［Ｎ－Ｍｅ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマー７ｔ（３０．０ｍｇ、８０当量、４０μｍｏｌ）を加えた。固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で、酸性活性化剤としてＮ－シアノメチルピロリジウムトリフラート（１．０Ｍ）を含むアセトニトリル溶液（２００μＬ）を反応溶媒として加え、３分間撹拌することで縮合を行った。オキサザホスホリジンモノマーの縮合後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルとジクロロメタンとで洗浄した。
　（ｉｉ）工程：固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下でジクロロメタンを２００μＬ，ジメチルスルフィドボランを２０μＬ加え、５分間撹拌することでボラノ化を行った。固相担体をジクロロメタンとメタノールで洗浄した。
　（ｉｉｉ）工程：前記（ｉｉ）工程後の固相担体について、３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン－トリエチルシラン（１：１，ｖ／ｖ）溶液によりジメトキシトリチル基の脱保護を行った。
　その後、固相担体を、乾燥させたジクロロメタンとアセトニトリルとで洗浄し、乾燥させた。遊離となった５’－水酸基に対して４－ジメチルアミノピリジン１０ｍｇ、２，６－ルチジン４５０μＬ、無水酢酸５０μＬを加えて６０秒間アセチル化を行った。固相担体を、乾燥させたジクロロメタンとアセトニトリルとで洗浄し、乾燥させた。予め調製しておいた４％ジアザビシクロウンデセン／アセトニトリル溶液を加えて１７時間リン酸部位の保護基の除去を行った。その後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルで洗浄し乾燥させた。２５％アンモニア水溶液で１時間反応させ固相単体からの切り出しを行い、目的物を含む混合物を得た。混合物はＨＰＬＣにより分析を行なった。結果を表４に示す。
［合成例４］
　スクシニルリンカーを介して固相担体に担持された５’－ヒドロキシチミジン（０．５μｍｏｌ）に対して、以下の（ｉ）工程、（ｉｉ）工程、及び（ｉｉｉ）工程の組み合わせを２回繰り返すことで鎖長伸長反応を行った。
　（ｉ）工程：固相担体に［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマー６ｔ（２５．５ｍｇ，６０当量、３０μｍｏｌ）を加えた。固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で、酸性活性化剤としてＮ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（１．０Ｍ）を含むアセトニトリル－イソブチロニトリル（７：３，ｖ／ｖ，２００μＬ）を反応溶媒として加え、１０分間撹拌することで縮合を行った。オキサザホスホリジンモノマーの縮合後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルとジクロロメタンとで洗浄した。
　（ｉｉ）工程：固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で１Ｍジメチルスルフィドボラン／トルエン溶液で１５分間ボラノ化を行った。固相担体をジクロロメタンとエタノールで洗浄した。
　（ｉｉｉ）工程：前記（ｉｉ）工程後の固相担体について、３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン－トリエチルシラン（１：１，ｖ／ｖ）溶液によりジメトキシトリチル基の脱保護を行った。
　その後、固相担体を、乾燥させたジクロロメタンとアセトニトリルとで洗浄し、乾燥させた。遊離となった５’－水酸基に対して４－ジメチルアミノピリジン１０ｍｇ、２，６－ルチジン４５０μＬ、無水酢酸５０μＬを加えて６０秒間アセチル化を行った。固相担体を、乾燥させたジクロロメタンとアセトニトリルとで洗浄し、乾燥させた。予め調製しておいた１０％ジアザビシクロウンデセン／アセトニトリル溶液を加えて１時間リン酸部位の保護基の除去を行った。その後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルで洗浄し乾燥させた。２５％アンモニア水－エタノール（３：１、ｖ／ｖ）で１７時間反応させ固相担体からの切り出しを行い、目的物含む混合物を得た。混合物はＨＰＬＣにより分析を行なった。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　表４中、ＨＰＬＣ収率は、ＨＰＬＣの結果における面積比ＴＰBＴＰBＴ／（Ｔ＋ＴＰBＴ＋ＴＰBＴＰBＴ）より算出した。
　図４（ａ）及び図４（ｂ）に、それぞれ、比較合成例４及び合成例４における逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す。比較合成例４では、２量体が多く観測されているのに対して、合成例４では、比較合成例４と比較して、２量体の割合が少なく、目的物のＨＰＬＣ収率は１５％高かった。上記合成例では、３量体を合成したが、オリゴマー合成時では、縮合回数が増えるため、縮合効率の高いモノマーを用いる方が望ましく、核酸オリゴマーを合成するためには、［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅの方が適していることが確認された。
（ＨＰＬＣの溶出条件）
比較合成例４：０－２５％ＣＨ３ＣＮ　ｉｎ　０．１Ｍ　ＴＥＡＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　７０ｍｉｎ
合成例４：０－３０％ＣＨ３ＣＮ　ｉｎ　０．１Ｍ　ＴＥＡＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　６０ｍｉｎ
（ホスホトリエステル３量体又は４量体中間体における、リン酸部位の保護基の除去条件の比較検討）
　オキサザホスホリジン環にＰｈ基を有するモノマーを用いて、酸化体の３量体又は４量体の固相合成を行なった。下記［Ｎ－Ｍｅ，Ｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマーは、非特許文献１に合成例が記載されている公知の化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
［比較合成例５］
　スクシニルリンカーを介して固相担体に担持された５’－ヒドロキシチミジン（０．５μｍｏｌ）に対して、以下の（ｉ）工程、（ｉｉ）工程、及び（ｉｉｉ）工程の組み合わせを２回繰り返すことで鎖長伸長反応を行った。
　（ｉ）工程：固相担体に［Ｎ－Ｍｅ，Ｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマー８ｔ（１３．０ｍｇ、４０当量、２０μｍｏｌ）を加えた。固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で、酸性活性化剤として１Ｈ－テトラゾール（０．４５Ｍ）を含むアセトニトリル溶液（２００μＬ）を反応溶媒として加え、３分間撹拌することで縮合を行った。オキサザホスホリジンモノマーの縮合後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルとジクロロメタンとで洗浄した。
　（ｉｉ）工程：固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で１Ｍ　ｔ－ブチルヒドロペルオキシドを２００μＬ加え、３分間撹拌することで酸化を行った。固相担体をジクロロメタンで洗浄した。
　（ｉｉｉ）工程：前記（ｉｉ）工程後の固相担体について、３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液によりジメトキシトリチル基の脱保護を行った。
　その後、固相担体を、乾燥させたジクロロメタンとアセトニトリルとで洗浄し、乾燥させた。室温下、２５％アンモニア水溶液で１時間反応させ固相担体からの切り出しとリン酸部位の脱保護を行い、目的物ＴＰＯＴＰＯＴを含む混合物を得た。混合物はＨＰＬＣにより分析を行なった。結果を表５に示す。
［比較合成例６］
　アンモニア処理を、室温下で１時間行う代わりに５５℃で１７時間行なった以外は、［比較合成例４］と同様の操作で目的物ＴＰＯＴＰＯＴを得た。混合物はＨＰＬＣにより分析を行なった。結果を表５に示す。
［合成例５］
　スクシニルリンカーを介して固相担体に担持された５’－ヒドロキシチミジン（０．５μｍｏｌ）に対して、以下の（ｉ）工程、（ｉｉ）工程、及び（ｉｉｉ）工程の組み合わせを３回繰り返すことで鎖長伸長反応を行った。
　（ｉ）工程：固相担体に［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのオキサザホスホリジンモノマー６ａ、６ｃ、又は６ｇ（６０当量、３０μｍｏｌ）を加えた。固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で、酸性活性化剤としてＮ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（１．０Ｍ）を含むアセトニトリル－イソブチロニトリル（７：３，ｖ／ｖ，２００μＬ）溶液を反応溶媒として加え、１０分間撹拌することで縮合を行った。オキサザホスホリジンモノマーの縮合後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリルとジクロロメタンとで洗浄した。
　（ｉｉ）工程：固相担体を乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で１Ｍ　ｔ－ブチルヒドロペルオキシドを２００μＬ加え、５分間撹拌することで酸化を行った。固相担体をジクロロメタンで洗浄した。
　（ｉｉｉ）工程：前記（ｉｉ）工程後の固相担体について、３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液によりジメトキシトリチル基の脱保護を行った。
　その後、固相担体を、乾燥させたジクロロメタンとアセトニトリルとで洗浄し、乾燥させた。室温下、２５％アンモニア水－エタノール（３：１、ｖ／ｖ）で３時間反応させ固相担体からの切り出しとリン酸部位の脱保護を行い、目的物ＡＰＯＧＰＯＣＰＯＴを含む混合物を得た。混合物はＨＰＬＣにより分析を行なった。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
　表５の中の百分率は、ホスホジエステルの脱保護の進行率を示しており、ＨＰＬＣの分析結果における面積比：ホスホジエステル誘導体（脱保護反応後の脱保護完了体）／（ホスホジエステル誘導体（脱保護反応前の脱保護未完了体）＋ホスホジエステル誘導体（脱保護反応後の脱保護完了体））より算出した。
　図５（ａ）～図５（ｃ）に、比較合成例５及び６並びに合成例５における逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す。比較合成例５では、１時間のアンモニア処理により４％しか脱保護が進行せず、脱保護反応が極めて遅いことが示唆された。比較合成例６に示す通り、ホスホジエステルの脱保護の進行率を１００％にするには、反応温度を５５℃まで高くし、反応時間を１２時間まで長くする必要があった。一方、合成例５では、室温条件下、３時間で脱保護が完了しており、温和な条件下で迅速に反応が進行していた。上記合成例では、３量体又は４量体を合成したが、オリゴマー合成時では、リン酸部位の保護基の数が増えるため、リン酸部位の保護基は簡便に脱保護できる方が望ましく、核酸オリゴマーを合成するためには、合成例５で用いた［Ｎ－Ｔｈｇ，Ｐｈ］－ｔｙｐｅのモノマーの方が適していることが確認された。
（ＨＰＬＣの溶出条件）
比較合成例５及び６並びに合成例５：０－２０％ＣＨ３ＣＮ　ｉｎ　０．１Ｍ　ＴＥＡＡ　ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　６０ｍｉｎ
［実施例１］ＰＢ核酸オリゴマー（４量体）及びＰＢ／ＰＯキメラ型核酸オリゴマー（４量体）の合成
　スクシニルリンカーを介して固相担体に担持された５’－Ｏ－ジメトキシトリチルチミジン（０．５μｍｏｌ）に対して３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液（５回×１２ｓ，１ｍＬ／回）を加えて、脱トリチル化した後に、モレキュラーシーブスによって乾燥させたアセトニトリルとジクロロメタンで固相担体の洗浄を行い、固相担体の真空乾燥を行った。次に、以下の（ｉ）工程、（ｉｉ）工程、及び（ｉｉｉ）工程の組み合わせを３回繰り返すことでオリゴマーの鎖長伸長反応を行った。
　（ｉ）工程：配列に応じて選択されたオキサザホスホリジンモノマー（６０当量、３０μｍｏｌ）を加えた固相担体を５分間乾燥させたのちに、アルゴン雰囲気下で、酸性活性化剤として１－フェニルイミダゾリウムトリフラート（１．０Ｍ）を含むアセトニトリル－イソブチロニトリル（７：３，ｖ／ｖ，１５０μＬ）溶液を反応溶媒として加え、１０分間ボルテックスミキサーで撹拌することで縮合を行った。縮合後、固相担体を、乾燥させたアセトニトリル（１ｍＬ×３回）とジクロロメタン（１ｍＬ×３回）とで洗浄した。
　（ｉｉ）工程：リン酸部位修飾に応じて選択された０．０５Ｍボラン／テトラヒドロフラン錯体テトラヒドロフラン溶液又は１．０Ｍ　ｔ－ブチルテトラヒドロペルオキシド／トルエン溶液を２分間又は５分間アルゴン雰囲気下で反応させた。その後、反応溶液を除去し、反応後の固相担体を、行った反応に応じて、以下の通りに洗浄した。ボラノ化した場合は、固相担体を、乾燥させたテトラヒドロフラン（１ｍＬ×３回）と乾燥させたエタノール（１ｍＬ×３回）とジクロロメタン（１ｍＬ×３回）とで洗浄した。酸化した場合は、固相担体を、ジクロロメタン（１　ｍＬ×６回）で洗浄した。
　（ｉｉｉ）工程：前記（ｉｉ）工程後の固相担体を、３％ジクロロ酢酸／ジクロロメタン―トリエチルシラン（１：１、ｖ／ｖ）溶液（１ｍＬ）と１２秒間反応させた。同様の操作を５回繰り返した後、ジクロロメタン（１ｍＬ）で３回、アセトニトリル（１ｍＬ）で３回洗浄を行い、固相担体を真空乾燥させた。
　（ＩＶ）工程：その後、固相担体を、乾燥させたジクロロメタン（１ｍＬ×３回）とアセトニトリル（１ｍＬ×３回）とで洗浄し、５分間乾燥させた。遊離となった５’－水酸基に対して４－ジメチルアミノピリジン１０ｍｇ、２，６－ルチジン４５０μＬ、無水酢酸５０μＬを加えて１分間アセチル化を行った。固相担体を、乾燥させたジクロロメタン（１ｍＬ×３回）とアセトニトリル（１ｍＬ×３回）とで洗浄し、５分間乾燥させた。予め調整しておいた１０％ジアザビシクロウンデセン／アセトニトリル溶液を加えて６０分間リン酸部位の保護基の除去を行い、ボラノホスホジエステル結合又はホスホジエステル結合へと変換させた。その後、アセトニトリル（１ｍＬ×３回）で洗浄した。
　洗浄後の固相担体に対して、２５％アンモニア水－エタノール（３：１、ｖ／ｖ）を室温条件で３時間、５０℃で１７時間、核酸塩基部の脱保護、核酸塩基部の窒素原子とボランとの配位結合の切断、及び固相担体からの核酸オリゴマーの切り出しを行った。固相担体をろ別し、ろ液を回収した後、溶媒の減圧留去を行った。
　溶媒の減圧留去後、粗生成物を逆相ＨＰＬＣにて分析した。逆相ＨＰＬＣは、０．１Ｍ　ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７）中で、０～６０％アセトニトリルの直線濃度勾配を使用して、６０分間、３０℃にて、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで行った。このようにして、ＰＢ核酸オリゴマーＣＰＢＡＰＢＧＰＢＴとＰＢ／ＰＯキメラ型核酸オリゴマーＣＰＢＡＰＯＧＰＢＴを得た。
・ＰＢ核酸オリゴマーＣＰＢＡＰＢＧＰＢＴについて
収率：２８％
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　［Ｍ－２Ｈ］２－，５８２．６７２９；ｆｏｕｎｄ，５８２．６７４２
・ＰＢ /ＰＯキメラ型核酸ＣＰＢＡＰＯＧＰＢＴについて
収率：３３％
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　［Ｍ－２Ｈ］２－，５８３．６５４０；ｆｏｕｎｄ，５８３．６５５９
［実施例２］ＰＢ／ＰＯキメラ型核酸オリゴマー（１２量体）の合成
　（ｉ）工程、（ｉｉ）工程、及び（ｉｉｉ）工程の組み合わせを１１回繰り返す以外は［実施例１］と同様の条件でオリゴマーを合成した。
　得られたＰＢ／ＰＯキメラ型核酸オリゴマー（１２量体）を逆相ＨＰＬＣにて分離精製した。逆相ＨＰＬＣ及び分離精製は、６０℃で、５～４０％メタノールの０．１Ｍヘキサフルオロイソプロパノール－０．００８Ｍトリエチルアミン緩衝溶液を移動相として用いて流速０．５ｍＬ／分で２０分間行った。このようにして、ＰＢ／ＰＯキメラ型核酸オリゴマーＣＰＢＡＰＯＧＰＢＴＰＯＣＰＢＡＰＯＧＰＢＴＰＯＣＰＢＡＰＯＧＰＢＴ（配列番号１）を得た。
収率：３％
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　［Ｍ－４Ｈ］４－，９０７．２１３３；ｆｏｕｎｄ，９０７．２１２９
［実施例３］ＰＯ核酸オリゴマー（１２量体）の合成
　（ｉ）工程、（ｉｉ）工程、及び（ｉｉｉ）工程の組み合わせを１１回繰り返し、（ＩＶ）工程を行わない以外は［実施例１］と同様の条件でオリゴマーを合成した。
　得られたＰＯ核酸オリゴマー（１２量体）を逆相ＨＰＬＣにて分離精製した。逆相ＨＰＬＣ及び分離精製は、５０℃で、５～２５％メタノールの０．４Ｍヘキサフルオロイソプロパノール－０．０１６Ｍトリエチルアミン緩衝溶液を移動相として用いて流速０．５ｍＬ／分で１０分間行った。このようにして、ＰＯ核酸オリゴマーＣＰＯＡＰＯＧＰＯＴＰＯＣＰＯＡＰＯＧＰＯＴＰＯＣＰＯＡＰＯＧＰＯＴ（配列番号２）を得た。
収率：１４％
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　［Ｍ－４Ｈ］４－，９１０．１５３０；ｆｏｕｎｄ，９１０．１５６５

Claims (10)

  1. 　下記一般式（１）で表されるヌクレオチドモノマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （一般式（１）中、Ｒ１は、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリヒドロカルビルシリルオキシ基、アルコキシアルコキシ基、ハロアルコキシアルコキシ基、又はハロゲニル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表し、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成し、Ｒ３は、水素原子又は水酸基の保護基を表し、Ｒ４は、置換基を有し又は有しないアリール基を表し、Ｒ５は、水素原子、ハロゲニル基、又は置換基を有し若しくは有しないアルキル基を表し、Ｒ６は、置換基を有し又は有せず、かつ、分子鎖中にヘテロ原子を有し又は有しない炭素原子数３以上のアルキル基を表し、又は、Ｒ５及びＲ６は、互いに結合して、分岐鎖を有し、かつ、前記分岐鎖以外に置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成し、ＢＮＨ２は、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン、及びウラシルからなる群より選ばれる核酸塩基を表し、該アデニン、該グアニン、該シトシン、及び該５－メチルシトシン中のアミノ基は、置換されていない。）
  2. 　前記Ｒ６が表すアルキル基は、分岐状である請求項１に記載のヌクレオチドモノマー。
  3. 　前記Ｒ６が表すアルキル基は、炭素原子数が６以上１４以下である請求項１に記載のヌクレオチドモノマー。
  4. 　Ｒ１は、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリヒドロカルビルシリルオキシ基、アルコキシアルコキシ基、ハロアルコキシアルコキシ基、又はハロゲニル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表し、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、下記一般式（２）で表される二価の基を形成する請求項１に記載のヌクレオチドモノマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （一般式（２）中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～１０のアルキル基を表し、又は、互いに結合して環を形成し、＊及び＊＊は、結合手を表し、＊で表される結合手は、一般式（１）において、Ｒ１が直結する炭素原子に結合し、＊＊で表される結合手は、一般式（１）において、Ｒ２が直結する炭素原子に結合する。）
  5. 　前記ヌクレオチドモノマーにおいてリン原子の立体化学は制御されている請求項１～４のいずれかに記載のヌクレオチドモノマー。
  6. 　下記一般式（１ａ）で表されるヌクレオチドモノマーを縮合させて、下記一般式（３ａ）で表されるヌクレオチド単位を含む第一の前駆体核酸オリゴマーを得る縮合工程と、
    　前記第一の前駆体核酸オリゴマーをボラノ化剤によりボラノ化して、下記一般式（４ａ）で表されるヌクレオチド単位を含む第二の前駆体核酸オリゴマーを得るボラノ化工程、又は
    　前記第一の前駆体核酸オリゴマーを酸化剤により酸化して、下記一般式（５ａ）で表されるヌクレオチド単位を含む第三の前駆体核酸オリゴマーを得る酸化工程と、
    　前記第二の前駆体核酸オリゴマー又は前記第三の前駆体核酸オリゴマーから、Ｒ３ａで表される保護基を脱離させて、下記一般式（４ｂ）で表されるヌクレオチド単位を含む第四の前駆体核酸オリゴマー、又は下記一般式（５ｂ）で表されるヌクレオチド単位を含む第五の前駆体核酸オリゴマーを得る脱保護工程と、
    の組み合わせを１回実行し又は２回以上繰り返し実行する鎖長伸長工程、並びに
    　前記第四の前駆体核酸オリゴマー又は前記第五の前駆体核酸オリゴマーにおいて、５’－水酸基及びアミノ基に対し保護基によるキャッピングを行って又は行わないで、下記一般式（４ｃ）で表されるヌクレオチド単位を含む第六の前駆体核酸オリゴマー又は下記一般式（５ｃ）で表されるヌクレオチド単位を含む第七の前駆体核酸オリゴマーから、下記一般式（６）で表されるリン酸保護基を脱離させて、更に、前記キャッピングを行った場合には前記保護基を脱離させて、下記一般式（７）で表されるヌクレオチド単位及び下記一般式（８）で表されるヌクレオチド単位からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む核酸オリゴマーを得る核酸オリゴマー生成工程
    を含む核酸オリゴマーの製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （一般式（１ａ）中、Ｒ１は、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリヒドロカルビルシリルオキシ基、アルコキシアルコキシ基、ハロアルコキシアルコキシ基、又はハロゲニル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表し、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成し、Ｒ３ａは、水酸基の保護基を表し、Ｒ４は、置換基を有し又は有しないアリール基を表し、Ｒ５は、水素原子、ハロゲニル基、又は置換基を有し若しくは有しないアルキル基を表し、Ｒ６は、置換基を有し又は有せず、かつ、分子鎖中にヘテロ原子を有し又は有しない炭素原子数３以上のアルキル基を表し、又は、Ｒ５及びＲ６は、互いに結合して、分岐鎖を有し、かつ、前記分岐鎖以外に置換基を有し又は有せず、かつ、ヘテロ原子を有し又は有しない５員以上の環を形成し、ＢＮＨ２は、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン、及びウラシルからなる群より選ばれる核酸塩基を表し、該アデニン、該グアニン、該シトシン、及び該５－メチルシトシン中のアミノ基は、置換されていない。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （一般式（３ａ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ４～Ｒ６、及びＢＮＨ２は、前記の通りである。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （一般式（４ａ）、（５ａ）、（４ｂ）、及び（５ｂ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ａ、Ｒ４～Ｒ６、及びＢＮＨ２は、前記の通りである。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （一般式（４ｃ）及び（５ｃ）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４～Ｒ６は、前記の通りであり、
    前記キャッピングを行った場合、Ｒ９は、水酸基の保護基を表し、Ｒ１０は、アミノ基の保護基を表し、Ｂｓは、アデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、チミン、及びウラシルからなる群より選ばれる核酸塩基を表し、該アデニン、該グアニン、該シトシン、及び該５－メチルシトシン中のアミノ基は、アミノ基の保護基で置換されており、
    前記キャッピングを行わなかった場合、Ｒ９及びＲ１０は、水素原子を表し、Ｂｓは、ＢＮＨ２を表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （一般式（６）中、Ｒ４～Ｒ６及びＲ１０は、前記の通りである。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （一般式（７）及び（８）中、Ｒ１、Ｒ２、及びＢＮＨ２は、前記の通りであり、Ｘ＋は、カウンターカチオンを表す。）
  7. 　前記Ｒ６が表すアルキル基は、分岐状である請求項６に記載の製造方法。
  8. 　前記Ｒ６が表すアルキル基は、炭素原子数が６以上１４以下である請求項６に記載の製造方法。
  9. 　Ｒ１は、水素原子、水酸基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アシルオキシ基、トリヒドロカルビルシリルオキシ基、アルコキシアルコキシ基、ハロアルコキシアルコキシ基、又はハロゲニル基を表し、Ｒ２は、水素原子を表し、又は、Ｒ１及びＲ２は、互いに結合して、下記一般式（２）で表される二価の基を形成する請求項６に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （一般式（２）中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～１０のアルキル基を表し、又は、互いに結合して環を形成し、＊及び＊＊は、結合手を表し、＊で表される結合手は、一般式（１ａ）において、Ｒ１が直結する炭素原子に結合し、＊＊で表される結合手は、一般式（１ａ）において、Ｒ２が直結する炭素原子に結合する。）
  10. 　前記ヌクレオチドモノマー及び前記ヌクレオチド単位においてリン原子の立体化学は制御されている請求項６～９のいずれかに記載の製造方法。
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