WO2025004845A1 - 液体充填済み培養バッグ、液体充填済み培養バッグの製造方法、及び液体充填済み培養バッグの使用方法 - Google Patents

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郷史 田中
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Toyo Seikan Group Holdings Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to cell culture technology, and in particular to a culture bag with minute recesses in the culture area.
  • Patent Document 1 discloses that after a culture medium is filled into a culture bag having a micro recess in the culture section, air is removed from within the culture bag by applying pressure to the culture bag.
  • Patent Document 2 also discloses that a culture bag having micro-recesses in a culture section is filled with a degassed medium filling liquid to remove air bubbles that have accumulated in the micro-recesses. This document also discloses that the culture bag having micro-recesses in a culture section is placed in a vacuum exhaust device and exposed to a vacuum to remove air from the culture bag.
  • the liquid-filled culture bag of the present invention is a liquid-filled culture bag in which a microstructure is formed in at least a part of the culture section and which is housed in an outer packaging section, and which is configured such that a space capable of being depressurized exists between the outside of the culture section and the outer packaging section, and which is degassed and packaged.
  • the liquid-filled culture bag of the present invention is preferably configured to have a plurality of first protrusions on the outside of the culture section, and is also preferably configured to have a plurality of second protrusions in the area of the outer packaging section that faces the outside of the culture section, and is also preferably configured to have a spacer section that forms a space that can be depressurized between the outside of the culture section and the outer packaging section.
  • the liquid-filled culture bag of the present invention is preferably configured so that the oxygen permeability of the material in the region of the outer packaging part facing the outside of the culture part is equal to or lower than the oxygen permeability of the culture part, and it is more preferable that the oxygen permeability of the material in the region of the outer packaging part facing the outside of the culture part has a gas barrier property of 1,000 ml/ m2 -day-atm or less. Furthermore, it is also preferable that the liquid-filled culture bag of the present invention is configured by combining various of the above-mentioned liquid-filled culture bags.
  • the method for manufacturing a liquid-filled culture bag of the present invention is a method for manufacturing a liquid-filled culture bag in which a culture bag having a microstructure formed in at least a part of the culture section is contained in an outer packaging section, a space that can be depressurized exists between the outside of the culture section and the outer packaging section, the culture bag is filled with liquid, and the culture bag is degassed and packaged.
  • the manufacturing method of the liquid-filled culture bag of the present invention is a method in which a plurality of first protrusions are provided on the outside of the culture section, and/or a plurality of second protrusions are provided in an area of the outer packaging section facing the outside of the culture section, and/or a spacer section is provided that forms a space that can be depressurized between the outside of the culture section and the outer packaging section.
  • the method of using the liquid-filled culture bag of the present invention is a method of using the above-mentioned liquid-filled culture bag, which is a method of storing or transporting the bag at room temperature, refrigerated or frozen. Furthermore, the method of using the liquid-filled culture bag of the present invention is a method of using the above-mentioned liquid-filled culture bag, which comprises injecting cells, culture medium, and cytokines such as cell adhesion factors and cell growth factors into the liquid-filled culture bag to carry out culture.
  • the present invention makes it possible to provide a liquid-filled culture bag, a method for manufacturing a liquid-filled culture bag, and a method for using a liquid-filled culture bag that can efficiently remove air bubbles that have accumulated in the micro-recesses in the culture bag without requiring a lot of effort or specialized equipment, and that can reduce cumbersome work and the risk of contamination at the manufacturing site.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a configuration of a liquid-filled culture bag according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing a configuration of a liquid-filled culture bag according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view showing the configuration of a liquid-filled culture bag according to a first modified example of an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a schematic cross-sectional view showing the configuration of a liquid-filled culture bag according to a second modified example of an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a schematic cross-sectional view showing the configuration of a liquid-filled culture bag according to a third modified example of an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 shows photographs illustrating the results of Test 1.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of Test 2.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of Test 3.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of Test 4.
  • the liquid-filled culture bag of this embodiment is a liquid-filled culture bag in which a culture bag having a microstructure formed in at least a part of the culture section is contained in an outer packaging section, and is characterized in that a space that can be reduced in pressure exists between the outside of the culture section and the outer packaging section, and the bag is degassed and packaged. That is, in this liquid-filled culture bag, a culture bag having a microstructure formed in at least a portion of the culture section is filled with liquid, and the culture bag is housed in an exterior packaging section.
  • the liquid-filled culture bag of this embodiment comprises a culture bag 10 and an outer packaging part 20 , and the culture bag 10 is sealed within the outer packaging part 20 .
  • the culture bag 10 is a bag-shaped container made of a soft packaging material for culturing cells or the like, and is provided with a culture section 11 therein having a culture surface which is an area for culturing cells.
  • the outside of the culture unit 11 is the side opposite to the culture surface (the side provided with the first protrusion 112 in FIG. 2 ) in the bag wall portion (the bottom surface portion of the bag in FIG. 2 ) in which the culture unit 11 is provided.
  • the outside of the culture unit 11 is a region corresponding to the culture surface on the outside of the culture bag 10.
  • the culture section 11 is provided only on the bottom side of the culture bag 10, but the culture section 11 may be provided only on the top plate side of the culture bag 10, or on both the bottom side and the top plate side.
  • the outside of the culture section 11 on the top plate side is the area corresponding to the culture surface on the top plate side on the outside of the culture bag 10
  • the outside of the culture section 11 on the bottom side is the area corresponding to the culture surface on the bottom side on the outside of the culture bag 10.
  • the culture bag 10 can be produced, for example, by sandwiching one or more ports between two pieces of film and heat sealing the periphery.
  • the culture bag 10 has a bag seal 12 formed by heat sealing, one port 13, a tube 14 connected to the port 13, and a cap 15 that seals the tube 14.
  • the method of producing the culture bag 10 is not limited to this, and it is also possible to produce the culture bag 10 by other methods, such as using a vacuum-pressure molded film or an inflation molded film.
  • a microstructure 111 is formed in the culture section 11 of the culture bag 10.
  • This microstructure 111 may be, for example, a number of recesses (wells) or a number of grooves.
  • the culture section 11 having this microstructure 111 can be subjected to a low cell adhesion treatment or a cell adhesion treatment.
  • the shape of the multiple recesses is not particularly limited, but can be, for example, a hemisphere, a cone, a pyramid, a shape consisting of a cylinder and a cone, or a shape consisting of a prism and a pyramid.
  • the shape of the multiple grooves is also not particularly limited, but can be, for example, a V-shaped cross section perpendicular to the longitudinal direction of the groove, and can be linear or curved.
  • the shape of the openings of the multiple recesses is preferably a circle, a square, or the like, and the diameter of the circle or inscribed circle can be, for example, 2 mm or less, or may be 1.5 mm or less, or may be 1.0 mm or less.
  • the depth of the multiple recesses can be, for example, 1.5 mm or less, may be 1.0 mm or less, may be 0.5 mm or less, or may be 0.35 mm or less.
  • the width and depth of the multiple grooves can each be, for example, 1.5 mm or less, 1.0 mm or less, 0.5 mm or less, or 0.35 mm or less.
  • the microstructure 111 in the culture section 11 By forming the microstructure 111 in the culture section 11 into a plurality of recesses, it becomes possible to use the culture bag 10 to suitably form spheres consisting of a plurality of iPS cells or other adherent cells. Furthermore, by making the microstructure 111 in the culture section 11 into a plurality of grooves, it is possible to increase the area of the culture surface of the culture bag 10 and allow adherent cells to adhere to the culture section 11 and be cultured suitably.
  • the culture bag 10 is filled with a liquid L.
  • a liquid L it is preferable to use a culture medium, water for injection, a phosphate buffer solution, physiological saline, or the like.
  • a culture medium water for injection, a phosphate buffer solution, physiological saline, or the like.
  • the liquid-filled culture bag of this embodiment once air bubbles are removed from the microstructure 111 in the culture section 11 and the surface of the microstructure 111 becomes wet, air bubbles usually do not re-appear in the microstructure 111. For this reason, it is also preferable to fill the liquid L with not only the culture medium but also other liquids such as water for injection.
  • the material in the region where the culture section 11 is provided is made of a gas-permeable material so that air bubbles accumulated in the microstructure 111 can be removed to the outside of the culture bag 10.
  • the oxygen transmission rate at 37°C of the material in the region of the culture section 11 is preferably 3,000 ml/ m2 -day-atm or more, more preferably 5,000 ml/ m2 -day-atm or more, and even more preferably 8,000 ml/ m2 -day-atm or more.
  • a space S that can be depressurized exists between the outside of the culture section 11 and the exterior packaging section 20 .
  • the outside of the culture section 11 is the area corresponding to the culture surface on the outside of the culture bag 10 .
  • the liquid-filled culture bag of this embodiment can be advantageously provided with a plurality of first protrusions 112 on the outside of the culture section 11, so that a reduced pressure space S is formed between the outside of the culture section 11 and the outer packaging section 20.
  • the liquid-filled culture bag of this embodiment has a bottom portion of the culture bag 10 as a continuous U-shape, as shown in variant example 1 of Figure 3, and has both a recess (microstructure 111) inside the bag and a protrusion (first protrusion 112) outside the bag.
  • the liquid-filled culture bag of this embodiment can also be provided with a plurality of second protrusions 22 in the area of the outer packaging section 20 facing the outside of the culture section 11, as shown in variant example 2 of Figure 4, so that a reduced pressure space S is preferably formed between the outside of the culture section 11 and the outer packaging section 20.
  • the first protrusion 112 and the second protrusion 22 may be any protrusion capable of forming a reduced pressure space S between the outside of the culture section 11 and the outer packaging section 20, and there are no particular limitations on their shape, size, or number.
  • liquid-filled culture bag of this embodiment may be double-packaged by enclosing the culture bag 10 in another outer packaging section and enclosing this outer packaging section in the outer packaging section 20. Even if the liquid-filled culture bag of this embodiment is configured in this manner, it is possible to effectively remove air bubbles from the culture section 11, for example, if the other outer packaging section performs the function of the spacer section 30 described above, thereby forming a reduced pressure space S between the outside of the culture section 11 and the outer packaging section 20.
  • first protrusions 112 on the outside of the culture section 11 and multiple second protrusions 22 in the area of the outer packaging section 20 facing the outside of the culture section 11 it is also preferable to provide multiple first protrusions 112 on the outside of the culture section 11 and a spacer section 30 that forms a space between the outside of the culture section 11 and the outer packaging section 20 where the pressure can be reduced
  • second protrusions 22 in the area of the outer packaging section 20 facing the outside of the culture section 11 and a spacer section 30 that forms a space between the outside of the culture section 11 and the outer packaging section 20 where the pressure can be reduced it is also preferable to have all of these configurations at the same time.
  • the liquid-filled culture bag of this embodiment is degassed and packaged in a state in which the culture bag 10 is sealed in the outer packaging section 20 . That is, in the liquid-filled culture bag of this embodiment, the inside of the exterior packaging section 20 is in a vacuum or reduced pressure state, and is generally in a vacuum state.
  • This vacuum packaging can be carried out using a commercially available heat sealing device, etc. For example, a commercial vacuum sealer manufactured by Fuji Impulse Co., Ltd. can be suitably used.
  • an exterior sealing portion 21 is formed on the peripheral edge of the exterior packaging portion 20.
  • the exterior packaging part 20 does not need to have gas barrier properties, but it is preferable that it has gas barrier properties. As described later in the examples, by using a material with gas barrier properties for the outer packaging portion 20, the time required to remove air bubbles accumulated in the microstructure 111 can be shortened compared to when a material without gas barrier properties is used.
  • the oxygen permeability of the components of the area of the outer packaging section 20 facing the outside of the culture section 11 is preferably less than the oxygen permeability of the culture section 11, more preferably less than 8,000 ml/ m2 -day-atm, even more preferably less than 1,000 ml/ m2 -day-atm, and particularly preferably less than 100 ml/ m2 -day-atm.
  • Test 3 it has been shown that even if the oxygen permeability of the film in the culture section and the oxygen permeability of the outer packaging section are the same, it takes time, but it is possible to remove air bubbles from the culture section. Furthermore, the more the oxygen permeability of the outer packaging section is set to be lower than the oxygen permeability of the film in the culture section and the greater the difference between them, the greater the amount of gas leaving the reduced pressure space S from the culture section side becomes compared to the amount of gas entering the reduced pressure space S from outside the outer packaging section, making it possible to shorten the time required to remove air bubbles that have accumulated in the culture section.
  • the culture bag 10 is preferably made of a resin film, and polyolefin resins such as polyethylene, polypropylene, and polymethylpentene can be used.
  • polyolefin resins such as polyethylene, polypropylene, and polymethylpentene
  • polyethylene, copolymers of ethylene and ⁇ -olefin, copolymers of ethylene and vinyl acetate, ionomers using ethylene, acrylic acid or methacrylic acid copolymers, and metal ions can be used.
  • Styrene-based elastomers, polyester-based thermoplastic elastomers, etc. can also be used.
  • soft polyvinyl chloride resin polybutadiene resin, chlorinated polyethylene resin, polyurethane-based thermoplastic elastomers, silicone-based thermoplastic elastomers, styrene-based elastomers, such as SBS (styrene-butadiene-styrene), SIS (styrene-isoprene-styrene), SEBS (styrene-ethylene-butylene-styrene), SEPS (styrene-ethylene-propylene-styrene), and fluorine-based resins can also be used.
  • SBS styrene-butadiene-styrene
  • SIS styrene-isoprene-styrene
  • SEBS styrene-ethylene-butylene-styrene
  • SEPS styrene-ethylene-propylene-styrene
  • the material of the exterior packaging part 20 can be, for example, polyethylene, polypropylene, a laminated film having a sealant layer and a barrier layer, or a vapor deposition film (barrier layer examples: ethylene-vinyl alcohol copolymer (EVOH), nylon, polyamide; vapor deposition examples: aluminum vapor deposition, alumina vapor deposition, silica vapor deposition, etc.).
  • carrier layer examples ethylene-vinyl alcohol copolymer (EVOH), nylon, polyamide
  • vapor deposition examples aluminum vapor deposition, alumina vapor deposition, silica vapor deposition, etc.
  • the manufacturing method of the liquid-filled culture bag of the present embodiment is a manufacturing method of a liquid-filled culture bag in which a culture bag having a microstructure formed in at least a part of the culture section is contained in an outer packaging section, and is characterized in that a space that can be depressurized exists between the outside of the culture section and the outer packaging section, the culture bag is filled with liquid, and the culture bag is degassed and packaged.
  • the manufacturing method of the liquid-filled culture bag of this embodiment is preferably a method in which a plurality of first protrusions are provided on the outside of the culture section, and/or a plurality of second protrusions are provided in an area of the outer packaging section facing the outside of the culture section, and/or a spacer section is provided that forms a space that can be depressurized between the outside of the culture section and the outer packaging section.
  • the method of using the liquid-filled culture bag of this embodiment is the method of using the liquid-filled culture bag of this embodiment described above, characterized in that it is stored or transported at room temperature, refrigerated or frozen.
  • the method of using the liquid-filled culture bag of this embodiment is a method of injecting the target cells, culture medium, cell adhesion factors, cytokines such as cell growth factors, etc. into the liquid-filled culture bag of this embodiment described above to perform culture.
  • the culture bag can be stored or transported in a state where it is filled with liquid, and air bubbles can be removed during storage and transport.
  • the liquid-filled culture bag of the present embodiment has air bubbles removed in advance, making it possible to perform cell culture suitably without the need to remove air bubbles from the recesses prior to cell culture.
  • liquid-filled culture bag according to an embodiment of the present invention, the method for manufacturing the liquid-filled culture bag, and the test conducted to confirm the effect of removing air bubbles by using the liquid-filled culture bag.
  • Tests were conducted to confirm that this embodiment can provide liquid-filled culture bags with no air bubbles. Specifically, first, a culture bag was prepared as shown in Figures 1 and 3. A polyethylene film (manufactured by Toyo Seikan Group Holdings, Ltd.) was used as the material for the culture bag, and two sheets of film measuring 100 mm x 70 mm x 0.10 mm were prepared.
  • a polyethylene film manufactured by Toyo Seikan Group Holdings, Ltd.
  • a plurality of hemispherical recesses were formed in the culture portion of the culture bag.
  • the opening of the recesses had a diameter of 0.5 mm and a depth of 0.25 mm, and approximately 18,000 of these recesses were formed.
  • the outer side of the culture area of the culture bag had hemispherical convex portions with a height of 250 ⁇ m and intervals of about 500 ⁇ m.
  • the oxygen permeability of the film of the culture bag was 8,500 ml/ m2 ⁇ day ⁇ atm (37°C-50%RH).
  • the film with the culture surface formed was attached to the other film by heat sealing.
  • one port was formed, and a needleless connector (Qosina) was connected to this port via a tube.
  • the prepared culture bag was filled with 15 mL of medium (StemFit AK02N (Ajinomoto Co., Inc., product number RCAK02N)), and only large air bubbles were removed by sucking them out with a syringe.
  • the culture bag filled with the medium was then sealed in an outer packaging section (Co-pack® ST1525, Asahi Kasei Pax Corporation), and vacuum-packed using a commercially available vacuum sealer (V301, Fuji Impulse Corporation) to produce the liquid-filled culture bag of this embodiment.
  • the film composition of the exterior packaging part was ONy#15/LDPE20/L-LDPE#40 (total 75 ⁇ m), and its oxygen permeability was 23 ml/m 2 ⁇ day ⁇ atm (23°C-50% RH).
  • the resulting liquid-filled culture bag was then stored in a refrigerator at 4°C, and micrographs of the recesses on the culture surface of the liquid-filled culture bag were taken at the start of storage, after 2.5 hours, and after 5.5 hours. The results are shown in Figure 6.
  • Test 2 A test was carried out to confirm that cell culture could be carried out using the liquid-filled culture bag obtained according to this embodiment. Specifically, the liquid-filled culture bag prepared in Test 1 was stored for three months and used to culture cells.
  • the culture medium was completely removed from the liquid-filled culture bag that had been stored for three months, and the culture bag was filled with 20 ml of StemFit AK02N (Ajinomoto Co., Inc., product number RCAK02N) containing 10 mM Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and human induced pluripotent stem (iPS) cells (1231A3 strain) were seeded so that each well contained approximately 150 cells.
  • StemFit AK02N Alignomoto Co., Inc., product number RCAK02N
  • 10 mM Y-27632 Wi-Fi Pure Chemical Industries, Ltd.
  • iPS human induced pluripotent stem
  • FIG. 7 shows the state of the culture surface before removing the medium from the liquid-filled culture bag stored for three months. As shown in this photograph, no air bubbles were present in the recesses of the culture surface.
  • the upper and lower photographs in the center of FIG. 7 show the state of the culture surface at the start of culture (0 hr). In the enlarged view at the bottom, the multiple small particles in the recesses are cells.
  • the top and bottom photographs on the right side of FIG. 7 show the state of the culture surface 24 hours (24 hr) after the start of culture, and spheroids can be observed to have been formed in the center of each well.
  • Test 3 A test was carried out to confirm whether air bubbles are removed when a gas-permeable material is used as the material for the exterior packaging part of the liquid-filled culture bag of this embodiment. Specifically, first, the same culture bag was prepared as in Test 1. A polyethylene film (manufactured by Toyo Seikan Group Holdings, Ltd.) was used as the material for the culture bag, and two sheets of film measuring 100 mm x 70 mm x 0.10 mm were prepared.
  • a plurality of semi-spherical recesses were formed on the culture surface of the culture bag.
  • the opening of each recess had a diameter of 0.5 mm and a depth of 0.25 mm, and approximately 18,000 of these recesses were formed.
  • the outer side of the culture area of the culture bag had hemispherical convex portions with a height of 250 ⁇ m and intervals of about 500 ⁇ m.
  • the oxygen permeability of the film of the culture bag was 8,500 ml/ m2 ⁇ day ⁇ atm (37°C-50%RH).
  • the film with the culture surface formed was attached to the other film by heat sealing.
  • one port was formed, and a needleless connector (Qosina) was connected to this port via a tube.
  • the prepared culture bag was filled with 15 mL of medium (StemFit AK02N (Ajinomoto Co., Inc., product number RCAK02N)), and only large air bubbles were removed by sucking them out with a syringe.
  • the culture bag filled with the medium was then sealed in a gas-permeable outer packaging section, and vacuum packaging was performed using a commercially available vacuum sealer (V301, Fuji Impulse Co., Ltd.) to produce the liquid-filled culture bag of this embodiment.
  • the outer packaging section was made of the same polyethylene film (manufactured by Toyo Seikan Group Holdings Co., Ltd.) used for the culture bag, which was heat-sealed to the same size as the Corpac® ST1525 used in Test 1.
  • the oxygen permeability of the film for this outer packaging section was 8,500 ml/ m2 -day-atm (37°C-50% RH).
  • the resulting liquid-filled culture bag was then stored in a refrigerator at 4°C, and micrographs of the recesses on the culture surface of the liquid-filled culture bag were taken at the start of storage, 2.5 hours, 6 hours, and 70 hours later. The results are shown in Figure 8.
  • FIG. 8 The photograph of FIG. 8 taken at the start of storage (0 hr) shows air bubbles trapped within the black circle in the recess.
  • the black circles in the recesses in the photographs taken 2.5 hours (2.5 hr) and 6 hours (6 hr) in FIG. 8 show that air bubbles are still trapped within the recesses.
  • the photograph taken 70 hours later (70 hr) in FIG. 8 no black circles indicating air bubbles are visible in the recesses, and it is apparent that the air bubbles have been completely removed.
  • the film with the culture surface formed was attached to the other film by heat sealing.
  • one port was formed, and a needleless connector (Qosina) was connected to this port via a tube.
  • the prepared culture bag was filled with 15 mL of medium (StemFit AK02N (Ajinomoto Co., Inc., product number RCAK02N)), and only large air bubbles were removed by sucking them out with a syringe.
  • the culture bag filled with the medium was then sealed in an outer packaging section (Co-pack® ST1525, Asahi Kasei Pax Co., Ltd.) and packaged without degassing using a commercially available vacuum sealer (V301 Fuji Impulse Co., Ltd.) to produce a liquid-filled culture bag as a comparative example.
  • the obtained liquid-filled culture bag of the comparative example was stored in a refrigerator at 4° C., and micrographs of the recesses on the culture surface of the liquid-filled culture bag were taken at the start of storage, and after 2.5 hours, 6 hours, and 70 hours. The results are shown in FIG.
  • FIG. 9 taken 6 hours (6 hr) and 70 hours (70 hr) also show air bubbles trapped within the black circles in the recesses.
  • simply packaging and storing the culture bag without providing a space that can be depressurized between the outside of the culture section of the culture bag and the outer packaging section cannot remove the air bubbles in the microstructure formed in the culture section of the culture bag.
  • a culture bag of a size capable of forming, for example, 500,000 to 1,000,000 spheres can be selected, and this can be sealed in an outer packaging section to produce a liquid-filled culture bag.
  • the present invention can be suitably used when using a liquid-filled culture bag in which culture medium or the like has been filled in advance and air bubbles have been removed from the culture area.

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Abstract

多くの手間や専用の設備を要することなく、培養バッグ内の微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去することができ、製造現場での煩わしい作業やコンタミネーションのリスクを低減することが可能な液体充填済み培養バッグを提供する。培養部の少なくとも一部に微細構造が形成された培養バッグが外装包装部に収容された液体充填済み培養バッグであって、培養部の外側と外装包装部の間に減圧可能な空間が存在し、脱気包装されている液体充填済み培養バッグ。培養部の外側に複数の第一突起部を備えることが好ましい。また、外装包装部における培養部の外側に対面する領域に複数の第二突起部を備えることが好ましい。さらに培養部の外側と外装包装部の間に減圧可能な空間を形成するスペーサー部を備えることが好ましい。

Description

液体充填済み培養バッグ、液体充填済み培養バッグの製造方法、及び液体充填済み培養バッグの使用方法
　本発明は、細胞培養技術に関し、特に培養部に微小な凹部等を備えた培養バッグに関する。
　ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の接着細胞のスフェロイドやオルガノイドを培養する場合に、培養部に微小な凹部（ウェル）が多数形成された培養バッグなどが使用されることがある。このような培養バッグに培地を充填すると、微小凹部に気泡が閉じ込められて溜まってしまい、細胞培養に支障が出るという問題があった。すなわち、培養バッグの微小凹部に気泡が残ると、ｉＰＳ細胞等からなるスフェア（細胞凝集塊）の形成が阻害されてしまうといった問題が生じるものの、微小凹部から全ての気泡を除去することは、極めて困難であった。
国際公開第２０２１／２４１６６５号パンフレット 特開２０２０－８０６７０号公報
　微小凹部に溜まった気泡を除去する手段としては、例えばマイクロピペットなどを用いて気泡に液を拭きかけることによって、水圧で気泡を除去する方法がある。しかしながら、このようなマイクロピペットによる操作では、特に凹部が小さい場合に気泡を十分に除去できない場合があった。
　また、この方法は開放系の容器にのみ可能な方法であり、培養バッグ内の培養部に溜まった気泡の除去に適するものではなかった。
　ここで、特許文献１には、培養部に微小凹部を備えた培養バッグに培地を充填した後、培養バッグに圧力を印加することによって、培養バッグ内から空気を除去することが開示されている。
　また、特許文献２には、培養部に微小凹部を備えた培養バッグに脱気した培地充填液を充填することによって、微小凹部に溜まった気泡を除去することが開示されている。さらに、この文献には、培養部に微小凹部を備えた培養バッグを真空排気装置に配置して真空にさらすことにより、培養バッグ内から空気を除去することも開示されている。
　しなしながら、これらの方法は、気泡の除去に多くの手間がかかるという問題や、専用の設備が必要になるという問題があった。また、再生医療や細胞医薬品の製造においては、現場で培養バッグから気泡を除去する調整作業が必要となるため、製造工程などが煩雑になることやコンタミネーションが発生するおそれがあるという問題もあった。
　そこで、本発明者は鋭意研究して、これらの問題を解消可能な液体充填済み培養バッグを開発し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、多くの手間や専用の設備を要することなく、培養バッグ内の微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去することができ、製造現場での煩わしい作業やコンタミネーションのリスクを低減することが可能な液体充填済み培養バッグ、液体充填済み培養バッグの製造方法、及び液体充填済み培養バッグの使用方法の提供を目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の液体充填済み培養バッグは、培養部の少なくとも一部に微細構造が形成された培養バッグが外装包装部に収容された液体充填済み培養バッグであって、前記培養部の外側と前記外装包装部の間に減圧可能な空間が存在し、脱気包装されている構成としてある。
　また、本発明の液体充填済み培養バッグを、前記培養部の外側に複数の第一突起部が備えられた構成とすることが好ましく、前記外装包装部における前記培養部の外側に対面する領域に複数の第二突起部が備えられた構成とすることも好ましく、前記培養部の外側と前記外装包装部の間に減圧可能な空間を形成するスペーサー部が備えられた構成とすることも好ましい。
　また、本発明の液体充填済み培養バッグを、前記微細構造が、複数の凹部又は複数の溝である構成とすることが好ましい。
　また、本発明の液体充填済み培養バッグを、前記培養バッグにおける前記培養部が備えられた領域の部材の酸素透過度が、３，０００ml/m2・day・atm以上である構成とすることが好ましい。
　また、本発明の液体充填済み培養バッグを、前記外装包装部における前記培養部の外側に対面する領域の部材の酸素透過度が、前記培養部の酸素透過度以下である構成とすることが好ましく、前記外装包装部における前記培養部の外側に対面する領域の部材の酸素透過度が、１，０００ml/m2・day・atm以下のガスバリア性を有する構成とすることがより好ましい。
　さらに、本発明の液体充填済み培養バッグを、上記の液体充填済み培養バッグを様々に組み合わせた構成とすることも好ましい。
　本発明の液体充填済み培養バッグの製造方法は、培養部の少なくとも一部に微細構造が形成された培養バッグが外装包装部に収容された液体充填済み培養バッグの製造方法であって、前記培養部の外側と前記外装包装部の間に減圧可能な空間が存在し、前記培養バッグに液体を充填し、前記培養バッグを脱気包装する方法としてある。
　また、本発明の液体充填済み培養バッグの製造方法を、前記培養部の外側に複数の第一突起部が備えられ、及び／又は、前記外装包装部における前記培養部の外側に対面する領域に複数の第二突起部が備えられ、及び／又は、前記培養部の外側と前記外装包装部の間に減圧可能な空間を形成するスペーサー部が備えられた方法とすることが好ましい。
　本発明の液体充填済み培養バッグの使用方法は、上記の液体充填済み培養バッグの使用方法であって、常温又は冷蔵若しくは冷凍で、保管し又は輸送する方法としてある。
　また、本発明の液体充填済み培養バッグの使用方法は、上記の液体充填済み培養バッグの使用方法であって、前記液体充填済み培養バッグに、細胞や培地、細胞接着因子、細胞増殖因子等のサイトカイン類を注入して培養を行う方法としてある。
　本発明によれば、多くの手間や専用の設備を要することなく、培養バッグ内の微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去することができ、製造現場での煩わしい作業やコンタミネーションのリスクを低減することが可能な液体充填済み培養バッグ、液体充填済み培養バッグの製造方法、及び液体充填済み培養バッグの使用方法の提供が可能となる。
本発明の実施形態に係る液体充填済み培養バッグの構成を示す模式図である。 本発明の実施形態に係る液体充填済み培養バッグの構成を示す模式断面図である。 本発明の実施形態に係る液体充填済み培養バッグの変形例１の構成を示す模式断面図である。 本発明の実施形態に係る液体充填済み培養バッグの変形例２の構成を示す模式断面図である。 本発明の実施形態に係る液体充填済み培養バッグの変形例３の構成を示す模式断面図である。 試験１の結果を表す写真を示す図である。 試験２の結果を表す写真を示す図である。 試験３の結果を表す写真を示す図である。 試験４の結果を表す写真を示す図である。
　以下、本発明の液体充填済み培養バッグ、液体充填済み培養バッグの製造方法、及び液体充填済み培養バッグの使用方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態及び実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
　まず、本発明の実施形態に係る液体充填済み培養バッグについて、図面を参照して詳細に説明する。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグは、培養部の少なくとも一部に微細構造が形成された培養バッグが外装包装部に収容された液体充填済み培養バッグであって、培養部の外側と外装包装部の間に減圧可能な空間が存在し、脱気包装されていることを特徴とする。
　すなわち、この液体充填済み培養バッグは、培養部の少なくとも一部に微細構造が形成された培養バッグに液体が充填され、その培養バッグが外装包装部に収容されている。
　具体的には、図１及び図２に示すように、本実施形態の液体充填済み培養バッグは、培養バッグ１０と外装包装部２０とからなり、培養バッグ１０は外装包装部２０内に封入されている。
　培養バッグ１０は、細胞などを培養するための軟包材からなる袋状の容器であり、その内部に細胞を培養する領域である培養面を有する培養部１１を備えている。
　培養部１１の外側とは、培養部１１が備えられたバッグ壁部（図２ではバッグの底面部）における培養面の反対側（図２では第一突起部１１２が備えられた側）である。すなわち、培養部１１の外側とは、培養バッグ１０の外側における培養面に対応する領域である。
　なお、図２では培養部１１が培養バッグ１０の底面側にのみ備えられているが、培養バッグ１０の天板側にのみ培養部１１を備えてもよく、底面側と天板側の両方に培養部１１を備えてもよい。これらの場合においても、天板側の培養部１１の外側とは、培養バッグ１０の外側における天板側の培養面に対応する領域であり、底面側の培養部１１の外側とは、培養バッグ１０の外側における底面側の培養面に対応する領域である。図３～５に示す変形例においても同様である。
　培養バッグ１０は、例えば二枚のフィルムに１つ又は複数のポートを挟み込み、周縁部をヒートシールを行うことによって作製することができる。図１において、培養バッグ１０は、ヒートシールによって形成されたバッグ封止部１２と、１つのポート１３と、このポート１３に連通されたチューブ１４と、チューブ１４を封止するキャップ１５とを備えている。なお、培養バッグ１０の作製方法はこれに限定されず、例えば真空圧空成形されたフィルムやインフレーション成形されたフィルムを用いるなどその他の方法によって培養バッグ１０を作製することも可能である。
　また、培養バッグ１０に備えられるポートの個数は１つに限定されず、２つのポートやそれ以上の個数であってもよい。
　さらに、チューブ１４の封止はキャップ１５による方法に限定されず、例えばキャップ機能を有するコネクタを用いてチューブ１４を封止したり、チューブ１４に一般的なコネクタを接続し、コネクタを封止するキャップを備えるようにしてもよい。
　培養バッグ１０の培養部１１には、微細構造１１１が形成されている。この微細構造１１１は、例えば複数の凹部（ウェル）又は複数の溝である場合がある。また、この微細構造１１１を有する培養部１１に、細胞低接着処理や細胞接着処理などを施すことも可能である。
　複数の凹部の形状は、特に限定されないが、例えば半球状、円錐状、角錐状、円柱及び円錐からなる形状、又は角柱及び角錐からなる形状等とすることができる。また、複数の溝の形状も、特に限定されないが、例えば溝の長手方向に垂直な断面がＶ字形状であって、直線状又は曲線状のものとすることができる。
　複数の凹部における開口部の形状は円や四角形状等が好ましく、円又は内接円の直径は、例えば２ｍｍ以下にすることができ、１．５ｍｍ以下にしてもよく、１．０ｍｍ以下にしてもよい。
　また、複数の凹部の深さは、例えば１．５ｍｍ以下にすることができ、１．０ｍｍ以下にしてもよく、０．５ｍｍ以下にしてもよく、０．３５ｍｍ以下にしてもよい。
　さらに、複数の溝の幅及び深さも同様に、それぞれ例えば１．５ｍｍ以下にすることができ、１．０ｍｍ以下にしてもよく、０．５ｍｍ以下にしてもよく、０．３５ｍｍ以下にしてもよい。
　培養部１１における微細構造１１１を複数の凹部にすることにより、培養バッグ１０を用いて、複数のｉＰＳ細胞やその他の接着細胞などからなるスフェアを好適に形成させることが可能となる。
　また、培養部１１における微細構造１１１を複数の溝とすることにより、培養バッグ１０の培養面の面積を増大させた状態で、接着細胞を培養部１１に接着させて好適に培養することが可能となる。
　培養バッグ１０には、液体Ｌが充填されている。液体Ｌとしては、培地、注射用水、リン酸緩衝液、生理食塩水等を用いることが好ましい。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグは、培養部１１における微細構造１１１から一旦気泡が除去されて微細構造１１１の表面が濡れてしまうと、通常、微細構造１１１に再び気泡が生じることがない。このため、液体Ｌとして、培地のみならず、注射用水などの他の液体を充填しておくことも好ましい。
　培養バッグ１０は、微細構造１１１に溜まった気泡を培養バッグ１０の外部に除去できるように、少なくとも培養部１１が備えられた領域の部材が、ガス透過性部材からなるものとすることが好ましい。例えば、培養部１１の領域の部材の３７℃での酸素透過度が、３，０００ml/m2・day・atm以上であることが好ましく、５，０００ml/m2・day・atm以上であることがより好ましく、８，０００ml/m2・day・atm以上であることがさらに好ましい。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグは、培養部１１の外側と外装包装部２０の間に減圧可能な空間（減圧空間）Ｓが存在している。
　培養部１１の外側とは、上記のとおり、培養バッグ１０の外側における培養面に対応する領域である。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグは、図２に示すように、培養部１１の外側に複数の第一突起部１１２を備えることによって好適に、培養部１１の外側と外装包装部２０の間に減圧空間Ｓが形成されたものとすることができる。
　また、本実施形態の液体充填済み培養バッグを、図３の変形例１に示すように、培養バッグ１０の底面部がU字形状の連続体として、バッグ内の凹部（微細構造１１１）とバッグ外の凸部（第一突起部１１２）とが兼ね備わった形状とすることも好ましい。
　さらに、本実施形態の液体充填済み培養バッグは、図４の変形例２に示すように、外装包装部２０における培養部１１の外側に対面する領域に複数の第二突起部２２を備えることによって好適に、培養部１１の外側と外装包装部２０の間に減圧空間Ｓが形成されたものとすることもできる。
　第一突起部１１２及び第二突起部２２は、培養部１１の外側と外装包装部２０の間に減圧空間Ｓを形成可能なものであればよく、その形状やサイズ、個数については、特に限定されない。
　さらにまた、本実施形態の液体充填済み培養バッグは、図５の変形例３に示すように、培養部１１の外側と外装包装部２０の間に減圧可能な空間を形成するスペーサー部３０を備えることによって好適に、培養部１１の外側と外装包装部２０の間に減圧空間Ｓが形成されたものとすることもできる。
　スペーサー部３０は、培養部１１の外側と外装包装部２０の間に減圧可能な空間を形成できるものであればよく、その具体的な構造は特に限定されないが、例えば、複数の貫通孔を備えた板状部材や多孔質部材などを好適に用いることが可能である。
　なお、本実施形態の液体充填済み培養バッグは、培養バッグ１０をその他の外装包装部に封入すると共に、この外装包装部を外装包装部２０に封入して、培養バッグ１０を二重包装にしたものとしてもよい。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグをこのようにしても、例えばその他の外装包装部が上述したスペーサー部３０の機能を果たし、それによって培養部１１の外側と外装包装部２０の間に減圧空間Ｓが形成されたものとする場合には、培養部１１から気泡を好適に除去することが可能である。
　さらに、本実施形態の液体充填済み培養バッグにおいて、培養部１１の外側に複数の第一突起部１１２を備えると共に、外装包装部２０における培養部１１の外側に対面する領域に複数の第二突起部２２を備えることも好ましく、培養部１１の外側に複数の第一突起部１１２を備えると共に、培養部１１の外側と外装包装部２０の間に減圧可能な空間を形成するスペーサー部３０を備えることも好ましく、外装包装部２０における培養部１１の外側に対面する領域に複数の第二突起部２２を備えると共に、培養部１１の外側と外装包装部２０の間に減圧可能な空間を形成するスペーサー部３０を備えることも好ましく、これら全ての構成を同時に備えることも好ましい。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグによれば、このような減圧空間Ｓを形成することによって、培養部１１の外側と外装包装部２０とが最終的に完全に密着することなく、外装包装部２０内に真空乃至減圧状態の空間が生じるようになっており、微細構造１１１に溜まった気泡を減圧空間Ｓに効率的に除去することが可能になっている。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグは、培養バッグ１０が外装包装部２０に封入された状態で、脱気包装されている。
　すなわち、本実施形態の液体充填済み培養バッグにおいて、外装包装部２０内は、真空乃至減圧の状態となっており、概ね真空状態となっている。
　この脱気包装は、市販のヒートシール器具などを用いて行うことができる。例えば、富士インパルス株式会社製の業務用の脱気シーラーなどを好適に用いることが可能である。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグにおいて、外装包装部２０の周縁部には、外装封止部２１が形成されている。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグにおいて、外装包装部２０はガスバリア性を有していなくてもよいが、ガスバリア性を有することが好ましい。
　実施例において後述するように、外装包装部２０にガスバリア性を有する材料を用いることにより、ガスバリア性を有していないものを用いる場合に比較して、微細構造１１１に溜まった気泡を除去する時間を短縮することができるためである。
　具体的には、本実施形態の液体充填済み培養バッグにおいて、外装包装部２０における培養部１１の外側に対面する領域の部材の酸素透過度は、培養部１１の酸素透過度以下であることが好ましく、８，０００ml/m2・day・atm以下であることがより好ましく、１，０００ml/m2・day・atm以下であることがさらに好ましく、１００ml/m2・day・atm以下であることが特に好ましい。
　ここで、後述する試験３において、培養部のフィルムの酸素透過度と外装包装部の酸素透過度が同じであっても、時間はかかるが、培養部から気泡を除去できることが示されている。また、外装包装部の酸素透過度を培養部のフィルムの酸素透過度以下とし、かつその差を大きくするほど、外装包装部の外側から減圧空間Ｓに入ってくる気体量よりも、培養部側から減圧空間Ｓに出ていく気体量の方が大きくなるため、培養部に溜まった気泡を除去する時間を短縮することが可能である。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグにおいて、培養バッグ１０の材料としては、樹脂フィルムなどを好適に用いることができ、ポリエチレンやポリプロピレン、ポリメチルペンテンなどのポリオレフィン系樹脂等を用いることができる。例えば、ポリエチレン、エチレンとα－オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等を挙げることができる。また、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー等を用いることもできる。さらに、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、シリコン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）、フッ素系樹脂等を用いてもよい。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグにおいて、外装包装部２０の材料としては、例えば、ポリエチレンやポリプロピレン、シーラント層とバリア層を有した積層フィルムや蒸着フィルム（バリア層例：エチレン-ビニルアルコール共重合体（EVOH）やナイロン、ポリアミド、蒸着例：アルミニウム蒸着、アルミナ蒸着、シリカ蒸着等）などを用いることができる。
　このような本実施形態の液体充填済み培養バッグによれば、多くの手間や専用の設備を要することなく、培養バッグ内の微小凹部に溜まった気泡を効率よく除去することができ、製造現場での煩わしい作業やコンタミネーションのリスクを低減することが可能となる。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグの製造方法は、培養部の少なくとも一部に微細構造が形成された培養バッグが外装包装部に収容された液体充填済み培養バッグの製造方法であって、培養部の外側と外装包装部の間に減圧可能な空間が存在し、培養バッグに液体を充填し、培養バッグを脱気包装することを特徴とする。
　また、本実施形態の液体充填済み培養バッグの製造方法は、培養部の外側に複数の第一突起部が備えられ、及び／又は、外装包装部における培養部の外側に対面する領域に複数の第二突起部が備えられ、及び／又は、培養部の外側と外装包装部の間に減圧可能な空間を形成するスペーサー部が備えられた方法とすることが好ましい。
　このような本実施形態の液体充填済み培養バッグの製造方法によれば、培養バッグの培養部に形成された微細構造に存在していた気泡を培養部の外側と外装包装部の間の空間に除去することができ、微細構造から気泡が除去された液体充填済み培養バッグを得ることが可能である。
　また、培養部の外側と外装包装部の間に減圧可能な空間を設けて、培養バッグに液体を充填した状態で培養バッグを脱気包装することにより、培養バッグからの液漏れのチェックを行うことも可能になっている。
　本実施形態の液体充填済み培養バッグの使用方法は、上述した本実施形態の液体充填済み培養バッグの使用方法であって、常温又は冷蔵若しくは冷凍で、保管し又は輸送することを特徴とする。
　また、本実施形態の液体充填済み培養バッグの使用方法を、上述した本実施形態の液体充填済み培養バッグに、目的の細胞や培地、細胞接着因子、細胞増殖因子等のサイトカイン類を注入して培養を行う方法とすることも好ましい。
　さらに、充填済みの液体を培養バッグから一旦除去した後、目的の細胞や培地類を注入して培養を行う方法とすることも好ましい。
　このような本実施形態の液体充填済み培養バッグの使用方法によれば、培養バッグに液体を充填した状態で保管や輸送を行うことができ、保管輸送時において気泡の除去を行うことが可能になっている。
　そして、このような使用方法における本実施形態の液体充填済み培養バッグは、気泡が予め除去されているため、細胞培養に先立って凹部から気泡の除去作業を行うことなく、細胞培養を好適に行うことが可能になっている。
　以下、本発明の実施形態に係る液体充填済み培養バッグ、液体充填済み培養バッグの製造方法、及び液体充填済み培養バッグの使用方法による気泡除去の効果を確認するために行った試験について説明する。
（試験１）
　本実施形態によって、気泡が除去された液体充填済み培養バッグを得ることができることを確認するための試験を行った。
　具体的には、まず図１及び図３に示す培養バッグを作製した。培養バッグの材料としてポリエチレン製フィルム（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）を使用し、１００ｍｍ×７０ｍｍ×０．１０ｍｍの２枚のフィルムを作成した。
　また、培養バッグの培養部に複数の半球状の凹部を形成した。凹部の開口部の直径は０．５ｍｍ、深さは０．２５ｍｍであり、これらを約１８，０００個形成した。
　培養バッグの培養部の外側には、半球状で高さが２５０μｍ、間隔が約５００μｍの凸部を形成した。また、培養バッグのフィルムの酸素透過度は８，５００ml/m2・day・atm（37℃-50％RH）であった。
　そして、培養面を形成したフィルムと、もう一方のフィルムをヒートシールにより貼り合わせた。このとき、ポートを１つ形成し、このポートにチューブを介してニードルレスコネクタ（Qosina社製）を接続した。
　次に、作製した培養バッグに培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））１５ｍLを充填し、大きな気泡のみをシリンジで吸い出すことにより除去した。
　そして、培地を充填した培養バッグを外装包装部（コーパック（Ｒ）ＳＴ１５２５，旭化成パックス株式会社）に封入し、市販の脱気シーラー（Ｖ３０１，富士インパルス株式会社）を用いて脱気包装を行って、本実施形態の液体充填済み培養バッグを製造した。
　外装包装部のフィルムの構成は、ONy#15/LDPE20/L-LDPE#40（計７５μｍ）であり、その酸素透過度は、２３ml/m2・day・atm（23℃-50％RH）であった。
　次いで、得られた液体充填済み培養バッグを冷蔵庫にて４℃で保管し、保管開始時点、２．５時間後、及び５．５時間後における液体充填済み培養バッグの培養面の凹部の顕微鏡写真を撮影した。その結果を図６に示す。
　図６の保管開始時点（０ｈｒ）の写真の凹部における黒い円内に気泡が溜まっている状態が示されている。なお、中央の白い円は光の反射によるものであるが、この部分には気泡が存在している。
　次に、図６の２．５時間後（２．５ｈｒ）の写真の凹部において、略三日月状の粒が写っているが、これは小さくなった気泡であり、部分的に気泡が除去されていることが分かる。なお、この写真には結露によって生じた外部の水滴が映り込んでいる。
　さらに、図６の５．５時間後（５．５ｈｒ）の写真の凹部には黒い円が写っておらず、気泡が完全に除去されていることが観察される。
　この結果から、本実施形態によれば、気泡が除去された液体充填済み培養バッグが好適に得られることが分かった。
（試験２）
　本実施形態によって得られた液体充填済み培養バッグを使用して、細胞培養が行えることを確認するための試験を行った。
　具体的には、試験１で作製した液体充填済み培養バッグを３ヶ月間保管したものを使用して、細胞培養を行った。
　３ヶ月間保管した液体充填済み培養バッグから培地を全て排出し、培養バッグに10 mM Y-27632（和光純薬工業株式会社）を含むStemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N）２０ｍｌを充填すると共に、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞（1231A3株）を凹部に約150個ずつ収容されるように播種した。
　そして、培養開始から２４時間後における液体充填済み培養バッグの培養面の凹部の顕微鏡写真を撮影した。その結果を図７に示す。
　図７の左端の写真は、３ヶ月間保管した液体充填済み培養バッグから培地を除去する前の培養面の状態を示している。この写真に示されるように、培養面の凹部に気泡は存在していなかった。
　図７の中央の上下の写真は、培養開始時点（０ｈｒ）の培養面の状態を示しており、下の拡大図における凹部内の複数の小さな粒が細胞である。
　図７の右端の上下の写真は、培養開始から２４時間後（２４ｈｒ）の培養面の状態を示しており、各凹部内の中央にスフェロイドが形成されている様子が観察される。
　この結果から、本実施形態の液体充填済み培養バッグによれば、気泡が予め除去されているため、細胞培養に先立って凹部から気泡の除去作業を行うことなく、細胞培養を好適に行えることが明らかとなった。
（試験３）
　本実施形態の液体充填済み培養バッグの外装包装部の材料として、ガス透過性を有するものを用いた場合に、気泡が除去されるかを確認するための試験を行った。
　具体的には、まず試験１と同じ培養バッグを作製した。培養バッグの材料としてポリエチレン製フィルム（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）を使用し、１００ｍｍ×７０ｍｍ×０．１０ｍｍの２枚のフィルムを作成した。
　また、培養バッグの培養面に複数の半球状の凹部を形成した。凹部の開口部の直径は０．５ｍｍ、深さは０．２５ｍｍであり、これらを約１８，０００個形成した。
　培養バッグの培養部の外側には、半球状で高さが２５０μｍ、間隔が約５００μｍの凸部を形成した。また、培養バッグのフィルムの酸素透過度は８，５００ml/m2・day・atm（37℃-50％RH）であった。
　そして、培養面を形成したフィルムと、もう一方のフィルムをヒートシールにより貼り合わせた。このとき、ポートを１つ形成し、このポートにチューブを介してニードルレスコネクタ（Qosina社製）を接続した。
　次に、作製した培養バッグに培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））１５ｍLを充填し、大きな気泡のみをシリンジで吸い出すことにより除去した。
　そして、培地を充填した培養バッグをガス透過性を有する外装包装部に封入し、市販の脱気シーラー（Ｖ３０１，富士インパルス株式会社）を用いて脱気包装を行って、本実施形態の液体充填済み培養バッグを製造した。外装包装部としては、培養バッグに使用したものと同じポリエチレン製フィルム（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）を試験１で用いたコーパック（Ｒ）ＳＴ１５２５と同サイズにヒートシールにより製袋したものを使用した。この外装包装部のフィルムの酸素透過度は、８，５００ml/m2・day・atm（37℃-50％RH）であった。
　次いで、得られた液体充填済み培養バッグを冷蔵庫にて４℃で保管し、保管開始時点、２．５時間後、６時間後、及び７０時間後における液体充填済み培養バッグの培養面の凹部の顕微鏡写真を撮影した。その結果を図８に示す。
　図８の保管開始時点（０ｈｒ）の写真の凹部における黒い円内に気泡が溜まっている状態が示されている。
　また、図８の２．５時間後（２．５ｈｒ）と６時間後（６ｈｒ）の写真の凹部における黒い円内には、まだ気泡が溜まっている状態が示されている。
　一方、図８の７０時間後（７０ｈｒ）の写真の凹部には気泡を示す黒い円が写っておらず、気泡が完全に除去されていることが観察される。
　この結果から、本実施形態の液体充填済み培養バッグの外装包装部の材料として、ガス透過性を有するものを用いた場合、ガスバリア性を有するものを用いた場合に比較して、気泡の除去に時間がかかるものの、気泡は除去されることが確認された。
（試験４）
　本実施形態の液体充填済み培養バッグを用いることなく、培養バッグを保管した場合に、気泡が除去された液体充填済み培養バッグを得ることができるか否かを確認するための試験を行った。
　具体的には、まず試験１と同じ培養バッグを作製した。培養バッグの材料としてポリエチレン製フィルム（東洋製罐グループホールディングス株式会社製）を使用し、１００ｍｍ×７０ｍｍ×０．１０ｍｍの２枚のフィルムを作成した。
　培養バッグの培養面に微細構造として複数の半球状の凹部を形成した。凹部の開口部の直径は０．５ｍｍ、深さは０．２５ｍｍであり、これらを約１８，０００個形成した。
　培養バッグの培養部の外側には、半球状で高さが２５０μｍ、間隔が約５００μｍの凸部を形成した。また、培養バッグのフィルムの酸素透過度は８，５００ml/m2・day・atm（37℃-50％RH）であった。
　そして、培養面を形成したフィルムと、もう一方のフィルムをヒートシールにより貼り合わせた。このとき、ポートを１つ形成し、このポートにチューブを介してニードルレスコネクタ（Qosina社製）を接続した。
　次に、作製した培養バッグに培地（StemFit AK02N（味の素株式会社，品番RCAK02N））１５ｍLを充填し、大きな気泡のみをシリンジで吸い出すことにより除去した。
　そして、培地を充填した培養バッグを外装包装部（コーパック（Ｒ）ＳＴ１５２５，旭化成パックス株式会社）に封入し、市販の脱気シーラー（Ｖ３０１富士インパルス株式会社）を用いて脱気せずに包装し、比較例としての液体充填済み培養バッグを製造した。
　次いで、得られた比較例の液体充填済み培養バッグを冷蔵庫にて４℃で保管し、保管開始時点、及び２．５時間後、６時間後、及び７０時間後における液体充填済み培養バッグの培養面の凹部の顕微鏡写真を撮影した。その結果を図９に示す。
　図９の保管開始時点（０ｈｒ）の写真の凹部における黒い円内に気泡が溜まっている状態が示されている。
　また、図９の２．５時間後（２．５ｈｒ）の写真の凹部においても、黒い円内に気泡が溜まっている状態が示されている。
　さらに、図９の６時間後（６ｈｒ）及び７０時間後（７０ｈｒ）の写真の凹部においても、黒い円内に気泡が溜まっている状態が示されている。
　このように、培養バッグの培養部の外側と外装包装部の間に減圧可能な空間を設けることなく、単に培養バッグを包装・保管したのみでは、培養バッグの培養部に形成された微細構造における気泡は除去できないことが分かった。
　本発明は、以上の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、培養バッグとして例えば５０万個～１００万個のスフェアを形成可能な大きさのものを選択し、これを外装包装部に封止して液体充填済み培養バッグを製造するなど適宜変更することが可能である。
　本発明は、予め培地などが充填されて培養部から気泡が除去された液体充填済み培養バッグを用いる場合に、好適に利用することが可能である。
　この明細書に記載の文献及び本願の日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
　１０　培養バッグ
　１１　培養部
　１１１　微細構造
　１１２　第一突起部
　１２　バッグ封止部
　１３　ポート
　１４　チューブ
　１５　キャップ
　２０　外装包装部
　２１　外装封止部
　２２　第二突起部
　３０　スペーサー部
　Ｓ　減圧空間
　Ｌ　液体

Claims (12)

  1. 　培養部の少なくとも一部に微細構造が形成された培養バッグが外装包装部に収容された液体充填済み培養バッグであって、前記培養部の外側と前記外装包装部の間に減圧可能な空間が存在し、脱気包装されていることを特徴とする液体充填済み培養バッグ。
  2. 　前記培養部の外側に複数の第一突起部が備えられたことを特徴とする請求項１記載の液体充填済み培養バッグ。
  3. 　前記外装包装部における前記培養部の外側に対面する領域に複数の第二突起部が備えられたことを特徴とする請求項１又は２記載の液体充填済み培養バッグ。
  4. 　前記培養部の外側と前記外装包装部の間に減圧可能な空間を形成するスペーサー部が備えられたことを特徴とする請求項１又は２記載の液体充填済み培養バッグ。
  5. 　前記微細構造が、複数の凹部又は複数の溝であることを特徴とする請求項１又は２記載の液体充填済み培養バッグ。
  6. 　前記培養バッグにおける前記培養部が備えられた領域の部材の酸素透過度が、３，０００ml/m2・day・atm以上であることを特徴とする請求項１又は２記載の液体充填済み培養バッグ。
  7. 　前記外装包装部における前記培養部の外側に対面する領域の部材の酸素透過度が、前記培養部の酸素透過度以下であることを特徴とする請求項１又は２記載の液体充填済み培養バッグ。
  8. 　前記外装包装部における前記培養部の外側に対面する領域の部材の酸素透過度が、１，０００ml/m2・day・atm以下のガスバリア性を有することを特徴とする請求項７記載の液体充填済み培養バッグ。
  9. 　培養部の少なくとも一部に微細構造が形成された培養バッグが外装包装部に収容された液体充填済み培養バッグの製造方法であって、
    　前記培養部の外側と前記外装包装部の間に減圧可能な空間が存在し、
    　前記培養バッグに液体を充填し、
    　前記培養バッグを脱気包装する
    　ことを特徴とする液体充填済み培養バッグの製造方法。
  10. 　前記培養部の外側に複数の第一突起部が備えられ、及び／又は、前記外装包装部における前記培養部の外側に対面する領域に複数の第二突起部が備えられ、及び／又は、前記培養部の外側と前記外装包装部の間に減圧可能な空間を形成するスペーサー部が備えられた
    　ことを特徴とする請求項９記載の液体充填済み培養バッグの製造方法。
  11. 　請求項１又は２記載の液体充填済み培養バッグの使用方法であって、
    　常温又は冷蔵若しくは冷凍で、保管し又は輸送する
    　ことを特徴とする液体充填済み培養バッグの使用方法。
  12. 　請求項１又は２記載の液体充填済み培養バッグの使用方法であって、
    　前記液体充填済み培養バッグに、細胞や培地、細胞接着因子、細胞増殖因子等のサイトカイン類を注入して培養を行う
    　ことを特徴とする液体充填済み培養バッグの使用方法。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03172169A (ja) * 1989-11-30 1991-07-25 Koojin Bio Kk 保存兼組織培養用容器
JP2005323588A (ja) * 2004-04-13 2005-11-24 Toyo Seikan Kaisha Ltd 培養二重容器および培養方法
JP2012239401A (ja) * 2011-05-17 2012-12-10 Toyo Seikan Kaisha Ltd 細胞培養方法、及び細胞培養システム
WO2013114845A1 (ja) * 2012-02-01 2013-08-08 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養用キット、及び細胞培養用キットの使用方法
WO2021241665A1 (ja) * 2020-05-28 2021-12-02 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養バッグ内の空気を除去することを含む細胞培養システム
JP2022016210A (ja) * 2020-07-11 2022-01-21 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の製造方法、及び細胞培養装置

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03172169A (ja) * 1989-11-30 1991-07-25 Koojin Bio Kk 保存兼組織培養用容器
JP2005323588A (ja) * 2004-04-13 2005-11-24 Toyo Seikan Kaisha Ltd 培養二重容器および培養方法
JP2012239401A (ja) * 2011-05-17 2012-12-10 Toyo Seikan Kaisha Ltd 細胞培養方法、及び細胞培養システム
WO2013114845A1 (ja) * 2012-02-01 2013-08-08 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養用キット、及び細胞培養用キットの使用方法
WO2021241665A1 (ja) * 2020-05-28 2021-12-02 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養バッグ内の空気を除去することを含む細胞培養システム
JP2022016210A (ja) * 2020-07-11 2022-01-21 東洋製罐グループホールディングス株式会社 細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の製造方法、及び細胞培養装置

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