WO2024251268A1 - 细胞快速化学重编程技术 - Google Patents

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WO2024251268A1
WO2024251268A1 PCT/CN2024/098193 CN2024098193W WO2024251268A1 WO 2024251268 A1 WO2024251268 A1 WO 2024251268A1 CN 2024098193 W CN2024098193 W CN 2024098193W WO 2024251268 A1 WO2024251268 A1 WO 2024251268A1
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reprogramming
fibroblasts
culture medium
mouse
cells
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祝赛勇
陈希
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Zhejiang University
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Zhejiang University
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts

Definitions

  • the present invention relates to the field of induced pluripotent stem cells, and in particular to a cell rapid chemical reprogramming technology.
  • Small molecules can be used to promote the reprogramming of somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • the small molecules used were VPA, CHIR99021, RepSox, Forskolin, Tranylcypromine and DZNep.
  • This technology is called chemical reprogramming.
  • the earliest chemical reprogramming technology took about 60 days to achieve this process (Hou P.P., et al., Pluripotent Stem Cells Induced from Mouse Somatic Cells by Small-Molecule Compounds. Science, 2013.
  • the purpose of the present invention is to provide a rapid cell chemical reprogramming technology.
  • a chemical reprogramming accelerator is provided, wherein the chemical reprogramming accelerator is selected from the following group A:
  • the chemical reprogramming accelerator is a compound selected from the following group:
  • the chemical reprogramming promoter has a concentration selected from the following group:
  • SR11237 0.05-0.5 ⁇ M
  • CD3254 0.05-0.5 ⁇ M
  • BML-277 5-20 ⁇ M
  • AZD9291 mesylate 1-5 ⁇ M
  • TSA 5-20nM
  • Citarinostat 1-3 ⁇ M
  • TMP269 1-10 ⁇ M
  • a chemical reprogramming promoter for preparing a reagent or a kit for converting fibroblasts into induced pluripotent stem cells; wherein the chemical reprogramming promoter is selected from the following group:
  • the fibroblasts are mammalian fibroblasts; preferably, they are fibroblasts from mice, rats, rabbits, monkeys, or humans.
  • the fibroblasts are mouse fibroblasts, preferably mouse dorsal fibroblasts (MDF), mouse lung fibroblasts (MLF), mouse liver fibroblasts, mouse cardiac fibroblasts or mouse embryonic fibroblasts (MEF).
  • MDF mouse dorsal fibroblasts
  • MEF mouse lung fibroblasts
  • MEF mouse embryonic fibroblasts
  • a culture medium for chemical reprogramming comprising basic culture components and a chemical reprogramming promoter, wherein the chemical reprogramming promoter is selected from the following group A:
  • the basic culture components include basic culture medium, serum or serum substitute, non-essential amino acid solution, penicillin/streptomycin mixture, 1 ⁇ N2 additive, 1 ⁇ B27 additive, glutamine substitute solution or Vc.
  • the basic culture medium is selected from the following group: DMEM basic culture medium, Neurobasal culture medium, or DMEM/F12 culture medium.
  • the culture medium for chemical reprogramming also includes other growth factors and compounds, including but not limited to: ⁇ -mercaptoethanol, basic fibroblast growth factor, CHIR99021, 616452, Forskolin, AM580, EPZ004777, VPA, 5-aza-dC, SGC0946, mouse leukemia inhibitory factor, and PD0325901.
  • a method for reprogramming fibroblasts into induced pluripotent stem cells comprising:
  • the density of the fibroblasts is 10 4 -10 6 cells/well.
  • the first reprogramming cell culture medium comprises a compound selected from the following group: SR11237, CD3254.
  • the first reprogramming cell culture medium further comprises a compound selected from the following group: basic fibroblast growth factor, CHIR99021, 616452, Forskolin, AM580, EPZ004777.
  • the concentration of SR11237 is 0.05-0.5 ⁇ M
  • the concentration of CD3254 is 0.05-0.5 ⁇ M.
  • the culture time is t1, and t1 is 0-3 days; preferably 0.5-2 days.
  • the second reprogramming cell culture medium comprises a compound selected from the following group: CCT129202, R406.
  • the second reprogramming cell culture medium further comprises a compound selected from the following group: basic fibroblast growth factor, CHIR99021, 616452, Forskolin, AM580, SR11237, CD3254, VPA.
  • the concentration of CCT129202 is 0.2-2 ⁇ M.
  • the concentration of R406 is 0.5-2 ⁇ M.
  • the culture time is t2, and t2 is 0-3 days; preferably 0.5-2 days.
  • the third reprogramming cell culture medium contains a compound selected from the following group: DMH1, BML-277, AZD9291 mesylate, TSA, SGC-CBP30, Citarinostat.
  • the third reprogramming cell culture medium further comprises a compound selected from the following group: basic fibroblast growth factor, CHIR99021, 616452, 5-aza-dC, SGC0946.
  • the concentration of DMH1 is 0.1-5 ⁇ M
  • the concentration of BML-277 was 5-20 ⁇ M
  • the concentration of AZD9291 mesylate is 1-5 ⁇ M
  • the concentration of TSA was 5-20 nM
  • the concentration of SGC-CBP30 was 1-10 ⁇ M
  • the concentration of Citarinostat was 1-3 ⁇ M.
  • the culture time is t3, and t3 is 0-3 days; preferably 0.5-2 days.
  • the fourth reprogramming cell culture medium contains a compound selected from the following group: DMH1, BML-277, AZD9291 mesylate, TSA, and TMP269.
  • the fourth reprogramming cell culture medium further comprises a compound selected from the following group: basic fibroblast growth factor, mouse leukemia inhibitory factor, CHIR99021, 616452, 5-aza-dC.
  • the concentration of DMH1 is 0.1-5 ⁇ M
  • the concentration of BML-277 was 5-20 ⁇ M
  • the concentration of AZD9291 mesylate is 1-5 ⁇ M
  • the concentration of TSA was 5-20 nM
  • the concentration of TMP269 was 1-10 ⁇ M.
  • the culture time is t3, and t3 is 0-3 days; preferably 0.5-2 days.
  • the culture time of the fourth intermediate cells (S5) obtained from the fibroblast culture (S1) is 5-10 days, preferably 6-8 days.
  • (S6) includes:
  • the fourth intermediate cells are cultured using the fifth reprogramming cell culture medium to obtain the fifth intermediate cells.
  • the fifth reprogramming cell culture medium contains WS6.
  • (S6) further comprises: culturing the fifth intermediate cells using a sixth reprogramming cell culture medium to obtain induced pluripotent stem cells.
  • the sixth reprogramming cell culture medium comprises WS6.
  • the fifth reprogramming cell culture medium further comprises a compound selected from the following group: mouse leukemia inhibitory factor, CHIR99021, 616452, Vc, PD0325901.
  • the sixth reprogramming cell culture medium further comprises a compound selected from the following group: mouse leukemia inhibitory factor, CHIR99021, Vc, PD0325901.
  • the concentration of WS6 is 0.1-2 ⁇ M.
  • the culture time is t4, and t4 is 0-6 days, preferably 0.5-4 days.
  • the fibroblasts are mammalian fibroblasts; preferably, they are fibroblasts from mice, rats, rabbits, monkeys, or humans.
  • the fibroblasts are mouse fibroblasts, preferably mouse dorsal fibroblasts (MDF), mouse lung fibroblasts (MLF), mouse liver fibroblasts, mouse cardiac fibroblasts or mouse embryonic fibroblasts (MEF).
  • MDF mouse dorsal fibroblasts
  • MEF mouse lung fibroblasts
  • MEF mouse embryonic fibroblasts
  • an embryonic stem cell prepared by the method of the fourth aspect of the present invention, wherein the cell expresses the following markers: Oct4, Sox2, Rex1, Nanog.
  • C CHIR99021; 6: 616452; F: Forskolin; A: AM580; E: EPZ004777; SR: SR11237; CD: CD3254; V: VPA; CCT: CCT129202; R: R406; D: 5-aza-dC; S: SGC0946; DMH: DMH1; BML: BML-277; AZD: AZD9291 mesylate; CBP: SGC-CBP30; Cit: Citarinostat; TMP: TMP269; WS: WS6; PD: PD0325901.
  • Figure 3 (A) Bright field images of 129 ⁇ C57 MEF and CF1 MEF on day 0 and day 12 of rapid chemical reprogramming. (B) Oct4 immunofluorescence staining images of 129 ⁇ C57 MEF and CF1 MEF on day 12 of rapid chemical reprogramming. (C) Bright field images of iPSC cell lines obtained from 129 ⁇ C57 MEF and CF1 MEF via rapid chemical reprogramming. (D) Oct4, Immunofluorescence staining images of Nanog and Sox2. The scale bar of all the above images is 200 ⁇ m.
  • Figure 4 (A) Bright field images of MLFs from adult mice and MDFs from embryonic day 18.5. (B) Bright field and pOct4-GFP fluorescence images of MLFs and MDFs on day 12 of rapid chemical reprogramming. (C) Bright field and pOct4-GFP fluorescence images of iPSC cell lines obtained by rapid chemical reprogramming of MLFs and MDFs. (D) Immunofluorescence staining images of Oct4, Nanog, and Sox2 of iPSC cell lines obtained by rapid chemical reprogramming of MLFs and MDFs. The scale bar of all the above images is 200 ⁇ m.
  • the inventors unexpectedly discovered for the first time that, using the chemical reprogramming promoter in the present invention, the method of the present invention significantly shortens the time required for chemical reprogramming compared to the prior art; chemical reprogramming can be completed on the 7th day, and 40-90 induced pluripotent stem cell clones can be formed for every 10,000 initial cells; the reprogramming efficiency is increased by 10 times.
  • the method of the present invention can be applied to mouse cells with a wider genetic background and more types. The present invention was completed on this basis.
  • the term “comprising” or “including (comprising)” may be open, semi-closed and closed. In other words, the term also includes “consisting essentially of” or “consisting of”.
  • embryonic stem cells refers to cells isolated from the inner cell mass of mouse blastocysts, which have the potential to differentiate into any cell type in the body.
  • induced pluripotent stem cells refers to pluripotent stem cells obtained by reprogramming somatic cells by overexpressing transcription factors or using small molecules, which have the potential to differentiate into any cell in the body and therefore have great application potential in drug screening, disease models, and regenerative medicine.
  • the marker genes of induced pluripotent stem cells include Oct4, Nanog, Sox2, Rex1, etc.
  • pOct4-GFP refers to a green fluorescent protein gene driven by the Oct4 gene promoter. When Oct4 is activated in cells, green fluorescent protein is produced, so that green fluorescence can be observed under a fluorescence microscope.
  • RT-qPCR refers to a technique for detecting the expression level of a specific gene.
  • RNA-seq refers to a technique that detects the expression levels of all genes in a cell.
  • chemical reprogramming promoter is used to promote the transformation of fibroblasts into induced pluripotent stem cells.
  • it is selected from the following group A:
  • the terms "the method of inducing pluripotent stem cells of the present invention”, “the method of chemically reprogramming mouse fibroblasts of the present invention”, and “the method of rapid chemical reprogramming (FCR) of the present invention” can be used interchangeably, and specifically refer to the method of promoting the transformation of fibroblasts into induced pluripotent stem cells using a chemical reprogramming promoter in the present invention.
  • the method comprises:
  • the first reprogramming cell culture medium comprises a chemical reprogramming promoter selected from the group consisting of: SR11237, CD3254;
  • the second reprogramming cell culture medium contains a chemical reprogramming promoter selected from the group consisting of: CCT129202, R406;
  • the third reprogramming cell culture medium contains a chemical reprogramming promoter selected from the group consisting of DMH1, BML-277, AZD9291 mesylate, TSA, SGC-CBP30, and Citarinostat;
  • the fourth reprogramming cell culture medium comprises a chemical reprogramming promoter selected from the group consisting of DMH1, BML-277, AZD9291 mesylate, TSA, and TMP269;
  • the fifth reprogramming cell culture medium comprises a chemical reprogramming promoter selected from the group consisting of WS6.
  • intermediate cells refers to cells in an intermediate state obtained under different culture conditions during the process of culturing fibroblasts into induced pluripotent stem cells.
  • the fourth intermediate cells express the mouse embryonic stem cell marker Oct4 to varying degrees.
  • the method of the present invention can be applied to mouse embryonic fibroblasts, mouse dorsal fibroblasts, mouse liver fibroblasts, mouse cardiac fibroblasts and mouse lung fibroblasts.
  • the method of the present invention can be applied to mouse embryonic fibroblasts with genetic backgrounds of 129XOG2, 129XC57 and CF1.
  • the method of the present invention can achieve highly efficient chemical reprogramming within 7-12 days, and 40-90 induced pluripotent stem cell clones can be formed for every 10,000 initial cells, which is 8-13 days faster than the technical solutions in the prior art and 10 times more efficient.
  • Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) with a genetic background of 129XOG2 were seeded into 6-well cell culture plates at a density of 2.5 ⁇ 10 5 cells per plate and cultured overnight using MEF medium at 21% O 2 , 5% CO 2 and 37°C.
  • the cells can also be subcultured onto a cell culture plate seeded with feeder cells to expand and obtain induced pluripotent stem cell lines.
  • the culture medium involved in the present invention is as follows:
  • MEF culture medium DMEM basic medium (Gibco, Cat#11965092), 10% fetal bovine serum (v/v) (Gibco, Cat#10099), 1% penicillin/streptomycin mixture (v/v) (Gibco, Cat#15140163).
  • Rapid chemical reprogramming 0-2 days culture medium DMEM basic medium, 10% fetal bovine serum (v/v), 10% serum replacement (v/v) (Gibco, Cat#10828028), 1% non-essential amino acid solution (v/v) (Cat#11140050), 1% penicillin/streptomycin mixture (v/v), 0.055mM ⁇ -mercaptoethanol, 100ng/mL basic fibroblast growth factor, 20 ⁇ M CHIR99021, 10 ⁇ M 616452, 50 ⁇ M Forskolin, 0.5 ⁇ M AM580, 0.1 ⁇ M SR11237, 0.1 ⁇ M CD3254, 5 ⁇ M EPZ004777.
  • Rapid chemical reprogramming 2-4 days culture medium DMEM basic medium, 10% fetal bovine serum, 10% serum replacement, 1% non-essential amino acid solution, 1% penicillin/streptomycin mixture, 0.055mM ⁇ -mercaptoethanol, 100ng/mL basic fibroblast growth factor, 20 ⁇ M CHIR99021, 10 ⁇ M 616452, 50 ⁇ M Forskolin, 0.5 ⁇ M AM580, 0.1 ⁇ M SR11237, 0.1 ⁇ M CD3254, 0.2mM VPA, 0.5 ⁇ M CCT129202, 1 ⁇ M R406.
  • Rapid chemical reprogramming 4-6 days culture medium DMEM basic medium, 10% fetal bovine serum, 10% serum replacement, 1% non-essential amino acid solution, 1% penicillin/streptomycin mixture, 0.055mM ⁇ -mercaptoethanol, 20ng/mL basic fibroblast growth factor, 10 ⁇ M CHIR99021, 10 ⁇ M 616452, 1 ⁇ M DMH1, 10 ⁇ M BML-277, 0.5 ⁇ M 5-aza-dC, 5 ⁇ M AZD9291 mesylate, 10nM TSA, 5 ⁇ M SGC0946, 1 ⁇ M SGC-CBP30, 2 ⁇ M Citarinostat.
  • Rapid chemical reprogramming 6-8 days culture medium DMEM basic medium, 10% fetal bovine serum, 10% serum replacement, 1% non-essential amino acid solution, 1% penicillin/streptomycin mixture, 0.055mM ⁇ -mercaptoethanol, 20ng/mL basic fibroblast growth factor, 1000U/mL mouse leukemia inhibitory factor, 10 ⁇ M CHIR99021, 10 ⁇ M 616452, 1 ⁇ M DMH1, 10 ⁇ M BML-277, 0.5 ⁇ M 5-aza-dC, 5 ⁇ M AZD9291 mesylate, 10nM TSA, 2 ⁇ M TMP269.
  • Rapid chemical reprogramming 8-10 days culture medium 47% DMEM/F12 medium (v/v) (Gibco, Cat#11320033), 47% Neurobasal medium (v/v) (Gibco, Cat#21103049), 1 ⁇ N2 supplement (Gibco, Cat#17502048), 1 ⁇ B27 supplement (Gibco, Cat#17504044), 1% glutamine substitute solution (v/v) (Gibco, Cat#35050079), 1% non-essential amino acid solution, 0.055mM ⁇ -mercaptoethanol, 1% penicillin/streptomycin mixture, 1000U/mL mouse leukemia inhibitory factor, 5 ⁇ M CHIR99021, 0.5 ⁇ M WS6, 250 ⁇ M Vc.
  • Rapid chemical reprogramming 10-12 days culture medium 47% DMEM/F12 medium, 47% Neurobasal medium, 1 ⁇ N2 supplement, 1 ⁇ B27 supplement, 1% glutamine substitute solution, 1% non-essential amino acid solution, 0.055mM ⁇ -mercaptoethanol, 1% penicillin/streptomycin mixture, 1000U/mL mouse leukemia inhibitory factor, 2 ⁇ M CHIR99021, 0.5 ⁇ M WS6, 250 ⁇ M Vc, 1 ⁇ M PD0325901.
  • Mouse embryonic fibroblasts with a genetic background of 129XOG2 were used to detect changes in cell reprogramming efficiency after removing a single small molecule or growth factor every 2 days according to the fast chemical reprogramming (FCR) method of the present invention.
  • FCR fast chemical reprogramming
  • 129XOG2 mouse embryonic fibroblasts were seeded into several 24-well cell culture plates and rapidly chemically reprogrammed. Every 2 days, each small molecule or growth factor added to the culture medium at this stage was removed separately in 3 wells to detect the effect of removing the small molecule or growth factor at this stage on the reprogramming efficiency. On day 12, the obtained induced pluripotent stem cell clones were counted.
  • iPSC clone number indicates the number of induced pluripotent stem cell clones that can be formed per 10,000 initial cells. "All" is a positive control, indicating that when the chemical reprogramming factor combination of the present invention is used, about 90 induced pluripotent stem cell clones can be formed per 10,000 initial cells. After multiple experiments, about 40-90 induced pluripotent stem cell clones can be formed per 10,000 initial cells.
  • FIG. 1C and FIG. 1D show that iPSC clones have gradually emerged on days 6-7 of FCR, suggesting that the method of the present invention can complete chemical reprogramming with high efficiency on day 7.
  • SR11237 0.05-0.5 ⁇ M
  • CD3254 0.05-0.5 ⁇ M
  • BML-277 5-20 ⁇ M
  • AZD9291 mesylate 1-5 ⁇ M
  • TSA 5-20nM
  • Citarinostat 1-3 ⁇ M
  • TMP269 1-10 ⁇ M
  • mice Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) with a genetic background of 129XOG2 were seeded into 6-well cell culture plates at a density of 2.5 ⁇ 10 5 cells per plate and cultured overnight using MEF medium at 21% O 2 , 5% CO 2 and 37°C.
  • MEFs Mouse embryonic fibroblasts
  • iPSCs form arch-shaped clones similar to mouse embryonic stem cells and widely express pOct4-GFP. Afterwards, immunofluorescence staining and RT-qPCR techniques were used to detect the protein and mRNA expression levels of the target markers, respectively. As shown in Figures 2B and 2C, iPSCs highly express markers Oct4, Sox2, Rex1, and Nanog, which are close to the levels of mouse embryonic stem cells. Further, RNA-seq technology was used to detect the expression of all genes in the cells. As shown in Figure 2D, the full gene expression pattern of iPSCs is highly close to that of mouse embryonic stem cells, and shows great differences from mouse embryonic fibroblasts. The overall results prove that iPSCs are highly close to mouse embryonic stem cells at the molecular level.
  • the method of the present invention can be used for rapid chemical reprogramming of mouse embryonic fibroblasts with other genetic backgrounds (129XC57 MEF, CF1 MEF) and other types of mouse cells (MLF, MDF).
  • the experimental method is the same as above.
  • the immunofluorescence staining images of iPSC cell lines obtained by rapid chemical reprogramming of mouse embryonic fibroblasts of other genetic backgrounds (129XC57 MEF, CF1 MEF) are shown in Figure 3.
  • the immunofluorescence staining images of iPSC cell lines obtained by rapid chemical reprogramming of mouse lung fibroblasts (MLF) derived from adult mice and dorsal fibroblasts (MDF) derived from embryonic day 18.5 mice are shown in FIG4 .
  • mouse embryonic fibroblasts with other genetic backgrounds 129XC57 MEF, CF1 MEF
  • mouse lung fibroblasts and mouse back fibroblasts can also be reprogrammed into iPSCs using rapid chemical reprogramming technology, proving that rapid chemical reprogramming technology can be applied to a variety of cell types.
  • the method of the present invention uses mice as model animals and uses mouse embryonic fibroblasts for experiments. In addition to using mouse embryonic fibroblasts, the method of the present invention can also be used to rapidly transform other types of mouse cells.
  • Chemical reprogramming includes mouse dorsal fibroblasts (MDF) and mouse lung fibroblasts (MLF). Specifically, the method of the present invention can be used for rapid chemical reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (129XOG2 MEF, 129XC57 MEF, CF1 MEF) of various genetic backgrounds.
  • the small molecule combination of the present invention can promote reprogramming induced by transcription factors and has a promoting effect on chemical reprogramming of human cells. Therefore, it can be further extended to the application in human embryonic fibroblasts, thereby establishing the reprogramming induction of human iPSC cells.

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Abstract

提供一种细胞快速化学重编程技术。通过提供的化学重编程促进剂和培养方法，使得化学重编程的用时被明显缩短；重编程效率提高10倍以上；提供的方法可以应用于更广泛的遗传背景和更多类型的小鼠细胞。

Description

细胞快速化学重编程技术 技术领域
本发明涉及诱导多能干细胞领域。具体地，涉及一种细胞快速化学重编程技术。
背景技术
小分子可用于促进体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)。2013年，完全使用小分子实现将体细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)的技术最早被邓宏魁课题组报道，使用到的小分子名称为VPA、CHIR99021、RepSox、Forskolin、Tranylcypromine和DZNep。这一技术被称为化学重编程。最早的化学重编程技术需要约60天实现这个过程(Hou P.P.,et al.,Pluripotent Stem Cells Induced from Mouse Somatic Cells by Small-Molecule Compounds.Science,2013.341(6146):p.651-54.)。之后，对这一技术改进的主要进步分别有三个报道。其一，2015年，邓宏魁课题组将AM580、EPZ004777、SGC0946和5-aza-dc这4个小分子加入到这一重编程体系中，将化学重编程过程缩短到约40天(Zhao Y.,et al.,A XEN-like State Bridges Somatic Cells to Pluripotency during Chemical Reprogramming.Cell,2015.163(7):p.1678-91.)；其二，2018年，裴端卿课题组独立建立了一个化学重编程体系，同样需要约40天实现这一过程，相较邓宏魁课题组2015年的报道效率更高(Cao S.,et al.,Chromatin Accessibility Dynamics during Chemical Induction of Pluripotency.Cell Stem Cell,2018.22(4):p.529-42e5.)；其三，2018年，邓宏魁课题组进一步优化2015年的化学重编程体系，并将时间缩短到约20天，但是形成诱导多能干细胞效率偏低(Zhao T.,et al.,Single-Cell RNA-Seq Reveals Dynamic Early Embryonic-like Programs during Chemical Reprogramming.Cell Stem Cell,2018.23(1):p.31-+.)。在2018年之后，本领域未见更快速高效技术的报道。
现有技术中，需要较长时间才能完成整个化学重编程过程。效率较高的技术需要约40天完成。20天左右可以完成化学重编程的技术效率偏低，例如每50000个初始细胞仅能形成约20-30个诱导多能干细胞克隆。
因此，本领域需要提供一种高效、快速的细胞化学重编程技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞快速化学重编程技术。
在本发明的第一方面，提供了一种化学重编程促进剂，所述化学重编程促进剂选自下组A：
(A1)SR11237；
(A2)CD3254；
(A3)CCT129202；
(A4)R406；
(A5)DMH1；
(A6)BML-277；
(A7)AZD9291 mesylate；
(A8)TSA；
(A9)SGC-CBP30
(A10)Citarinostat；
(A11)TMP269；
(A12)WS6；
(A13)(A1)～(A12)的任意组合。
在另一优选例中，所述化学重编程促进剂为选自下组的化合物：
(1)SR11237，CD3254；
(2)CCT129202，R406；
(3)DMH1，BML-277，AZD9291 mesylate，TSA，SGC-CBP30，Citarinostat；
(4)DMH1，BML-277，AZD9291 mesylate，TSA，TMP269；和
(5)WS6。
在另一优选例中，在重编程培养基中，所述化学重编程促进剂具有选自下组的浓度：
SR11237：0.05-0.5μM；
CD3254：0.05-0.5μM；
CCT129202：0.2-2μM；
R406：0.5-2μM；
DMH1：0.1-5μM；
BML-277：5-20μM；
AZD9291 mesylate：1-5μM；
TSA：5-20nM；
SGC-CBP30：0.5-5μM；
Citarinostat：1-3μM；
TMP269：1-10μM；
WS6：0.1-2μM。
在本发明的第二方面，提供了一种化学重编程促进剂的用途，用于制备使成纤维细胞向诱导多能干细胞转化的试剂或试剂盒；其中，所述的化学重编程促进剂选自下组：
(A1)SR11237；
(A2)CD3254；
(A3)CCT129202；
(A4)R406；
(A5)DMH1；
(A6)BML-277；
(A7)AZD9291 mesylate；
(A8)TSA；
(A9)SGC-CBP30
(A10)Citarinostat；
(A11)TMP269；
(A12)WS6；
(A13)(A1)～(A12)的任意组合。
在另一优选例中，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞；较佳地为小鼠、大鼠、兔子、猴、人的成纤维细胞。
在另一优选例中，所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞，较佳地为小鼠背部成纤维细胞(MDF)、小鼠肺成纤维细胞(MLF)、小鼠肝脏成纤维细胞、小鼠心脏成纤维细胞或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
在本发明的第三方面，提供了一种用于化学重编程的培养基，包含基础培养成分和化学重编程促进剂，所述的化学重编程促进剂选自下组A：
(A1)SR11237；
(A2)CD3254；
(A3)CCT129202；
(A4)R406；
(A5)DMH1；
(A6)BML-277；
(A7)AZD9291 mesylate；
(A8)TSA；
(A9)SGC-CBP30
(A10)Citarinostat；
(A11)TMP269；
(A12)WS6；
(A13)(A1)～(A12)的任意组合。
在另一优选例中，所述基础培养成分包括基础培养基、血清或血清替代物、非必须氨基酸溶液、青霉素/链霉素混合液、1×N2添加剂，1×B27添加剂、谷氨酰胺替代物溶液 或Vc。
在另一优选例中，所述基础培养基选自下组：DMEM basic培养基、Neurobasal培养基、或DMEM/F12培养基。
在另一优选例中，所述用于化学重编程的培养基还包括其他的生长因子和化合物，包括但不限于：β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子、CHIR99021、616452、Forskolin、AM580、EPZ004777、VPA、5-aza-dC、SGC0946、小鼠白血病抑制因子、PD0325901。
在本发明的第四方面，提供了一种将成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的方法，包括：
(S1)提供一成纤维细胞；
(S2)利用第一重编程细胞培养基，预培养(S1)中的成纤维细胞，获得第一中间态细胞；
(S3)利用第二重编程细胞培养基，培养上述的第一中间态细胞，获得第二中间态细胞；
(S4)利用第三重编程细胞培养基，培养上述的第二中间态细胞，获得第三中间态细胞；
(S5)利用第四重编程细胞培养基，培养上述的第三中间态细胞，获得第四中间态细胞；和
(S6)扩增上述第四中间态细胞，获得诱导多能干细胞。
在另一优选例中，(S1)中，所述成纤维细胞的密度为104-106个细胞/孔。
在另一优选例中，(S2)中，所述第一重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：SR11237，CD3254。
在另一优选例中，(S2)中，所述第一重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：碱性成纤维细胞生长因子，CHIR99021，616452，Forskolin，AM580，EPZ004777。
在另一优选例中，(S2)中，所述SR11237的浓度为0.05-0.5μM；
在另一优选例中，(S2)中，所述CD3254的浓度为0.05-0.5μM。
在另一优选例中，(S2)中，培养时间为t1，t1为0-3天；较佳地为0.5-2天。
在另一优选例中，(S3)中，所述第二重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：CCT129202，R406。
在另一优选例中，(S3)中，所述第二重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：碱性成纤维细胞生长因子，CHIR99021，616452，Forskolin，AM580，SR11237，CD3254，VPA。
在另一优选例中，(S3)中，所述CCT129202的浓度为0.2-2μM。
在另一优选例中，(S3)中，所述R406的浓度为0.5-2μM。
在另一优选例中，(S3)中，培养时间为t2，t2为0-3天；较佳地为0.5-2天。
在另一优选例中，(S4)中，所述第三重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：DMH1、BML-277、AZD9291 mesylate、TSA、SGC-CBP30，Citarinostat。
在另一优选例中，(S4)中，所述第三重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：碱性成纤维细胞生长因子，CHIR99021，616452，5-aza-dC，SGC0946。
在另一优选例中，(S4)中，所述DMH1的浓度为0.1-5μM；
BML-277的浓度为5-20μM；
AZD9291 mesylate的浓度为1-5μM；
TSA的浓度为5-20nM；
SGC-CBP30的浓度为1-10μM；
Citarinostat的浓度为1-3μM。
在另一优选例中，(S4)中，培养时间为t3，t3为0-3天；较佳地为0.5-2天。
在另一优选例中，(S5)中，所述第四重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：DMH1、BML-277、AZD9291 mesylate、TSA、TMP269。
在另一优选例中，(S5)中，所述第四重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：碱性成纤维细胞生长因子，小鼠白血病抑制因子，CHIR99021，616452，5-aza-dC。
在另一优选例中，(S5)中，所述DMH1的浓度为0.1-5μM；
BML-277的浓度为5-20μM；
AZD9291 mesylate的浓度为1-5μM；
TSA的浓度为5-20nM；
TMP269的浓度为1-10μM。
在另一优选例中，(S5)中，培养时间为t3，t3为0-3天；较佳地为0.5-2天。
在另一优选例中，从(S1)的成纤维细胞培养获得(S5)的第四中间态细胞的培养时间为5-10天，较佳地6-8天。
在另一优选例中，(S6)中，包括：
利用第五重编程细胞培养基培养第四中间态细胞，获得第五中间态细胞。
在另一优选例中，所述第五重编程细胞培养基包含WS6。
在另一优选例中，(S6)中，还包括：利用第六重编程细胞培养基培养第五中间态细胞，获得诱导多能干细胞。
在另一优选例中，所述第六重编程细胞培养基包含WS6。
在另一优选例中，(S6)中，所述第五重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：小鼠白血病抑制因子，CHIR99021，616452，Vc，PD0325901。
在另一优选例中，所述第六重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：小鼠白血病抑制因子，CHIR99021，Vc，PD0325901。
在另一优选例中，(S6)中，所述WS6的浓度为0.1-2μM。
在另一优选例中，(S6)中，培养时间为t4，t4为0-6天，较佳地0.5-4天。
在另一优选例中，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞；较佳地为小鼠、大鼠、兔子、猴、人的成纤维细胞。
在另一优选例中，所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞，较佳地为小鼠背部成纤维细胞(MDF)、小鼠肺成纤维细胞(MLF)、小鼠肝脏成纤维细胞、小鼠心脏成纤维细胞或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
在本发明的第五方面，提供了一种用本发明的第四方面的方法制备获得的胚胎干细胞，所述细胞表达以下的标志物：Oct4、Sox2、Rex1、Nanog。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1(a)快速化学重编程(FCR)过程图示，每2天使用不同的小分子组合实现12天内获得iPSC。(b)每2天移除单个小分子或生长因子后的重编程效率变化散点图。数据以平均值±标准差呈现。生物学重复n＝3。C：CHIR99021；6：616452；F：Forskolin；A：AM580；E：EPZ004777；SR：SR11237；CD：CD3254；V：VPA；CCT：CCT129202；R：R406；D：5-aza-dC；S：SGC0946；DMH：DMH1；BML：BML-277；AZD：AZD9291 mesylate；CBP：SGC-CBP30；Cit：Citarinostat；TMP：TMP269；WS：WS6；PD：PD0325901。(c)FCR第8天、第10天、第12天，pOct4-GFP(左)、Oct4免疫荧光染色(中)和pOct4-GFP、Oct4染色与Hoechst染色合并(右)图像。比例尺为100μm。(d)FCR过程中iPSC克隆数的折线图。数据以平均值±标准差呈现。生物学重复n＝3。
图2(A)由快速化学重编程建立的iPSC细胞系图像，左边为明场，右边为绿色荧光。比例尺为200μm。(B)iPSC免疫荧光染色结果图像，分别检测多能性基因Oct4、Nanog和Sox2的表达。Hoechst是细胞核染料。比例尺为100μm。(C)MEF、小鼠胚胎干细胞(R1 mESC)和3个iPSC细胞系的RT-qPCR结果，分别检测多能性基因Oct4、Nanog、Sox2和Rex1的表达。数据以平均值±标准差呈现。生物学重复n＝3。(D)火山图展示iPSC与R1 mESC(左图)、iPSC与MEF(右图)所有基因的表达相对值。R，皮尔森相关系数。
图3(A)129×C57 MEF和CF1 MEF在快速化学重编程第0天、第12天的明场图像。(B)129×C57 MEF和CF1 MEF在快速化学重编程第12天的Oct4免疫荧光染色图像。(C)129×C57 MEF和CF1 MEF经由快速化学重编程获得的iPSC细胞系的明场图像。(D)129×C57 MEF和CF1 MEF经由快速化学重编程获得的iPSC细胞系的Oct4、 Nanog、Sox2的免疫荧光染色图像。以上所有图片比例尺为200μm。
图4(A)来源于成年小鼠的MLF和来源于胚胎期18.5天MDF的明场图像。(B)MLF和MDF在快速化学重编程第12天的明场和pOct4-GFP荧光图像。(C)MLF和MDF经由快速化学重编程获得的iPSC细胞系的明场和pOct4-GFP荧光图像。(D)MLF和MDF经由快速化学重编程获得的iPSC细胞系的Oct4、Nanog、Sox2的免疫荧光染色图像。以上所有图片比例尺为200μm。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现，利用本发明中的化学重编程促进剂，本发明的方法相比较现有技术，化学重编程的用时被明显缩短；第7天时即可完成化学重编程，并且每10000个初始细胞可以形成40-90个诱导多能干细胞克隆；重编程效率提高10倍。本发明的方法，相较于20天的化学重编程体系，可以应用于具有更广泛的遗传背景和更多类型的小鼠细胞。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指分离自小鼠囊胚期内细胞团的细胞，具有向体内任意一种细胞分化的潜能。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”是指利用过表达转录因子或使用小分子等手段，将体细胞重编程获得的多能干细胞，具有向体内任意一种细胞分化的潜能，因此在药物筛选、疾病模型和再生医学等领域有巨大应用潜能。诱导多能干细胞的标志基因有Oct4、Nanog、Sox2、Rex1等。
如本文所用，术语“pOct4-GFP”是指Oct4基因启动子所驱动的绿色荧光蛋白基因。在细胞内Oct4被激活时产生绿色荧光蛋白，从而可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光。
如本文所用，术语“RT-qPCR”是指一种检测特定基因表达水平的技术。
如本文所用，术语“RNA-seq”是指一种检测细胞内所有基因表达水平的技术。
本发明的化学重编程促进剂
如本文所用，术语“化学重编程促进剂”用于促进成纤维细胞向诱导多能干细胞转 化，较佳地选自下组A：
(A1)SR11237；
(A2)CD3254；
(A3)CCT129202；
(A4)R406；
(A5)DMH1；
(A6)BML-277；
(A7)AZD9291 mesylate；
(A8)TSA；
(A9)SGC-CBP30
(A10)Citarinostat；
(A11)TMP269；
(A12)WS6；
(A13)(A1)～(A12)的任意组合。
如本文所述，术语“本发明的诱导多能干细胞的方法”、“本发明的小鼠成纤维细胞的化学重编程方法”、“本发明的快速化学重编程(FCR)的方法”可以互换使用，具体地，指本发明中利用化学重编程促进剂促进成纤维细胞向诱导多能干细胞转化的方法。优选地，包括：
(S1)提供一成纤维细胞；
(S2)利用第一重编程细胞培养基，预培养(S1)中的成纤维细胞，获得第一中间态细胞；
(S3)利用第二重编程细胞培养基，培养上述的第一中间态细胞，获得第二中间态细胞；
(S4)利用第三重编程细胞培养基，培养上述的第二中间态细胞，获得第三中间态细胞；
(S5)利用第四重编程细胞培养基，培养上述的第三中间态细胞，获得第四中间态细胞；和
(S6)扩增上述第四中间态细胞，获得诱导多能干细胞。
较佳地，第一重编程细胞培养基中包含选自下组的化学重编程促进剂：SR11237，CD3254；
第二重编程细胞培养基中包含选自下组的化学重编程促进剂：CCT129202，R406；
第三重编程细胞培养基中包含选自下组的化学重编程促进剂：DMH1，BML-277，AZD9291 mesylate，TSA，SGC-CBP30，Citarinostat；
第四重编程细胞培养基中包含选自下组的化学重编程促进剂：DMH1，BML-277，AZD9291 mesylate，TSA，TMP269；
第五重编程细胞培养基中包含选自下组的化学重编程促进剂：WS6。
如本文所用，术语“中间态细胞”是指，从成纤维细胞培养为诱导多能干细胞的过程中，在不同培养条件下获得的中间状态的细胞。其中，第四中间态细胞不同程度地表达小鼠胚胎干细胞的标志物Oct4。
本发明的主要优点包括
(1)本发明首次发现小分子CCT129202、BML-277、TSA、DMH1、AZD9291mesylate、SGC-CBP30、TMP269、Citarinostat、WS6可以促进化学重编程效率。
(2)本发明的方法可以应用于小鼠胚胎成纤维细胞，小鼠背部成纤维细胞、小鼠肝脏成纤维细胞、小鼠心脏成纤维细胞和小鼠肺成纤维细胞。
(3)本发明的方法可以应用于遗传背景为129XOG2，129XC57和CF1的小鼠胚胎成纤维细胞。
(4)本发明的方法实现在7-12天内实现较高效率完成化学重编程，每10000个初始细胞可以形成40-90个诱导多能干细胞克隆，比现有技术中的技术方案快8-13天，同时效率高10倍。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明涉及的化合物的名称和结构
表1


本发明的快速化学重编程(FCR)的方法
(1)将遗传背景为129XOG2的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)按照每板2.5×105个细胞的密度种到6孔细胞培养板中，并使用MEF培养基培养过夜。培养条件为21％ O2，5％ CO2和37℃。
(2)一天以后，将细胞培养基替换为快速化学重编程0-2天培养基，记为重编程第0天。
(3)重编程第2天，将细胞培养基替换为快速化学重编程2-4天培养基。
(4)重编程第4天，将细胞培养基替换为快速化学重编程4-6天培养基，并在第5天更新培养基。
(5)重编程第6天，将细胞培养基替换为快速化学重编程6-8天培养基，并在第7天更新培养基。
(6)重编程第8天，将细胞培养基替换为快速化学重编程8-10天培养基。
(7)重编程第10天，将细胞培养基替换为快速化学重编程10-12天培养基。
(8)重编程第12天，根据GFP荧光在显微镜下数多能干细胞细胞克隆的数目。
也可传代到种有饲养层细胞的细胞培养板上扩增，获得诱导多能干细胞细胞系。
本发明涉及的培养基如下：
MEF培养基：DMEM basic培养基(Gibco,Cat#11965092)，10％胎牛血清(v/v)(Gibco,Cat#10099)，1％青霉素/链霉素混合液(v/v)(Gibco,Cat#15140163)。
快速化学重编程0-2天培养基：DMEM basic培养基，10％胎牛血清(v/v)，10％血清替代物(v/v)(Gibco,Cat#10828028)，1％非必须氨基酸溶液(v/v)(Cat#11140050)，1％青霉素/链霉素混合液(v/v)，0.055mMβ-巯基乙醇，100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子， 20μM CHIR99021，10μM 616452，50μM Forskolin，0.5μM AM580，0.1μM SR11237，0.1μM CD3254，5μM EPZ004777。
快速化学重编程2-4天培养基：DMEM basic培养基，10％胎牛血清，10％血清替代物，1％非必须氨基酸溶液，1％青霉素/链霉素混合液，0.055mMβ-巯基乙醇，100ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，20μM CHIR99021，10μM 616452，50μM Forskolin，0.5μM AM580，0.1μM SR11237，0.1μM CD3254，0.2mM VPA，0.5μM CCT129202，1μM R406。
快速化学重编程4-6天培养基：DMEM basic培养基，10％胎牛血清，10％血清替代物，1％非必须氨基酸溶液，1％青霉素/链霉素混合液，0.055mMβ-巯基乙醇，20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，10μM CHIR99021，10μM 616452，1μM DMH1，10μM BML-277，0.5μM 5-aza-dC，5μM AZD9291 mesylate，10nM TSA，5μM SGC0946，1μM SGC-CBP30，2μM Citarinostat。
快速化学重编程6-8天培养基：DMEM basic培养基，10％胎牛血清，10％血清替代物，1％非必须氨基酸溶液，1％青霉素/链霉素混合液，0.055mMβ-巯基乙醇，20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，1000U/mL小鼠白血病抑制因子，10μM CHIR99021，10μM 616452，1μM DMH1，10μM BML-277，0.5μM 5-aza-dC，5μM AZD9291 mesylate，10nM TSA，2μM TMP269。
快速化学重编程8-10天培养基：47％ DMEM/F12培养基(v/v)(Gibco,Cat#11320033)，47％ Neurobasal培养基(v/v)(Gibco,Cat#21103049)，1×N2添加剂(Gibco,Cat#17502048)，1×B27添加剂(Gibco,Cat#17504044)，1％谷氨酰胺替代物溶液(v/v)(Gibco,Cat#35050079)，1％非必须氨基酸溶液，0.055mMβ-巯基乙醇，1％青霉素/链霉素混合液，1000U/mL小鼠白血病抑制因子，5μM CHIR99021，0.5μM WS6，250μM Vc。
快速化学重编程10-12天培养基：47％ DMEM/F12培养基，47％ Neurobasal培养基，1×N2添加剂，1×B27添加剂，1％谷氨酰胺替代物溶液，1％非必须氨基酸溶液，0.055mMβ-巯基乙醇，1％青霉素/链霉素混合液，1000U/mL小鼠白血病抑制因子，2μM CHIR99021，0.5μM WS6，250μM Vc，1μM PD0325901。
实施例1单个小分子对重编程效率的影响探索
1.1单个小分子对重编程效率的影响
利用遗传背景为129XOG2的小鼠胚胎成纤维细胞，根据本发明的快速化学重编程(FCR)的方法，每2天移除单个小分子或生长因子后，检测细胞的重编程效率变化。
实验方法：将129XOG2小鼠胚胎成纤维细胞种到数个24孔细胞培养板中并进行快速化学重编程。每2天，每一个该阶段培养基中添加的小分子或生长因子都在3个孔中被单独移除，用以检测在该阶段移除该小分子或生长因子后对重编程效率的影响。第 12天，对获得的诱导多能干细胞克隆进行计数。
结果如图1所示。其中，图1B中的纵坐标“iPSC克隆数”表示每10000个初始细胞可以形成诱导多能干细胞克隆的数量。“All”为阳性对照，表示利用本发明的化学重编程因子组合时，每10000个初始细胞可以形成约90个诱导多能干细胞克隆。经多次实验，每10000个初始细胞可以形成约40-90个诱导多能干细胞克隆。
图1B的表格数据如下表2所示：
表2

结果表明，小分子CCT129202、BML-277、TSA、DMH1、AZD9291 mesylate、SGC-CBP30、TMP269、Citarinostat、WS6可以有效提高化学重编程效率。
此外，图1C和图1D的结果表明iPSC克隆在FCR第6-7天已经逐渐出现，这提示本发明的方法可以在第7天时以较高效率完成化学重编程。
1.2小分子浓度对结果的影响的内容
利用本发明的快速化学重编程(FCR)的方法，经实验，在不同的快速化学重编程培养基中，本发明涉及的小分子浓度适合的范围如下：
SR11237：0.05-0.5μM；
CD3254：0.05-0.5μM；
CCT129202：0.2-2μM；
R406：0.5-2μM；
DMH1：0.1-5μM；
BML-277：5-20μM；
AZD9291 mesylate：1-5μM；
TSA：5-20nM；
SGC-CBP30：0.5-5μM；
Citarinostat：1-3μM；
TMP269：1-10μM；
WS6：0.1-2μM。
实施例2获得的iPSC的鉴定
实验方法：(1)将遗传背景为129XOG2的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)按照每板2.5×105个细胞的密度种到6孔细胞培养板中，并使用MEF培养基培养过夜。培养条件为21％ O2，5％ CO2和37℃。
(2)一天以后，将细胞培养基替换为快速化学重编程0-2天培养基，记为重编程第0天。
(3)重编程第2天，将细胞培养基替换为快速化学重编程2-4天培养基。
(4)重编程第4天，将细胞培养基替换为快速化学重编程4-6天培养基，并在第5天更新培养基。
(5)重编程第6天，将细胞培养基替换为快速化学重编程6-8天培养基，并在第7天更新培养基。
(6)重编程第8天，将细胞培养基替换为快速化学重编程8-10天培养基。
(7)重编程第10天，将细胞培养基替换为快速化学重编程10-12天培养基。
(8)重编程第12天，根据GFP荧光在显微镜下数多能干细胞细胞克隆的数目。
观察获得的iPSC形成的克隆形态和pOct4-GFP表达情况。
如图2A所示，iPSC形成与小鼠胚胎干细胞类似的拱状克隆，并且广泛表达pOct4-GFP。之后，利用免疫荧光染色和RT-qPCR技术分别检测目的标志物的蛋白质和mRNA表达水平。如图2B、2C所示，iPSC高表达与小鼠胚胎干细胞水平接近的标志物Oct4、Sox2、Rex1、Nanog。进一步，利用RNA-seq技术，检测细胞所有基因表达情况。如图2D所示，iPSC全基因表达模式与小鼠胚胎干细胞高度接近，与小鼠胚胎成纤维细胞呈现较大差异。整体结果证明iPSC与小鼠胚胎干细胞的分子水平高度接近。
结果表明，获得的iPSC和原始的小鼠iPSC类似，表达以下的标志物：Oct4、Sox2、Rex1、Nanog。
实施例3在其他遗传背景和类型的小鼠细胞上的应用
本发明的方法可用于其他遗传背景小鼠胚胎成纤维细胞(129XC57 MEF，CF1 MEF)和其他类型小鼠细胞(MLF，MDF)进行快速化学重编程。
实验方法同上。其他遗传背景小鼠胚胎成纤维细胞(129XC57 MEF，CF1 MEF)通过快速化学重编程获得的iPSC细胞系的免疫荧光染色图像如图3所示。
来源于成年小鼠的小鼠肺成纤维细胞(MLF)和来源于胚胎期18.5天小鼠背部成纤维细胞(MDF)，通过快速化学重编程获得的iPSC细胞系的免疫荧光染色图像如图4所示。
结果表明：其他遗传背景小鼠胚胎成纤维细胞(129XC57 MEF，CF1 MEF)利用快速化学重编程技术也可以被重编程为iPSC，证明了快速化学重编程技术不受细胞遗传背景限制。小鼠肺成纤维细胞和小鼠背部成纤维细胞利用快速化学重编程技术也可以被重编程为iPSC，证明了快速化学重编程技术可以应用到多种类型细胞。
讨论
本发明的方法利用小鼠作为模式动物，利用小鼠胚胎成纤维细胞进行实验。除用小鼠胚胎成纤维细胞以外，本发明的方法也可以用于其他类型小鼠细胞进行快速化 学重编程，包括小鼠背部成纤维细胞(MDF)和小鼠肺成纤维细胞(MLF)。具体地，本发明的方法可以用于多种遗传背景小鼠胚胎成纤维细胞(129XOG2 MEF，129XC57 MEF，CF1 MEF)进行快速化学重编程。
本发明的小分子组合能够促进利用转录因子诱导的重编程，并且对用人细胞进行的化学重编程存在促进作用。因此，可以进一步地推广至人的胚胎成纤维细胞中的应用，进而建立人的iPSC细胞的重编程诱导。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (18)

  1. 一种化学重编程促进剂，其特征在于，所述化学重编程促进剂选自下组A：
    (A1)SR11237；
    (A2)CD3254；
    (A3)CCT129202；
    (A4)R406；
    (A5)DMH1；
    (A6)BML-277；
    (A7)AZD9291 mesylate；
    (A8)TSA；
    (A9)SGC-CBP30
    (A10)Citarinostat；
    (A11)TMP269；
    (A12)WS6；
    (A13)(A1)～(A12)的任意组合。
  2. 如权利要求1所述的化学重编程促进剂，其特征在于，所述化学重编程促进剂为选自下组的化合物：
    (1)SR11237，CD3254；
    (2)CCT129202，R406；
    (3)DMH1，BML-277，AZD9291 mesylate，TSA，SGC-CBP30，Citarinostat；
    (4)DMH1，BML-277，AZD9291 mesylate，TSA，TMP269；或
    (5)WS6。
  3. 一种化学重编程促进剂的用途，其特征在于，用于制备使成纤维细胞向诱导多能干细胞转化的试剂或试剂盒；其中，所述的化学重编程促进剂选自下组：
    (A1)SR11237；
    (A2)CD3254；
    (A3)CCT129202；
    (A4)R406；
    (A5)DMH1；
    (A6)BML-277；
    (A7)AZD9291 mesylate；
    (A8)TSA；
    (A9)SGC-CBP30
    (A10)Citarinostat；
    (A11)TMP269；
    (A12)WS6；
    (A13)(A1)～(A12)的任意组合。
  4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述成纤维细胞为哺乳动物成纤维细胞；较佳地为小鼠、大鼠、兔子、猴、人的成纤维细胞。
  5. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞，较佳地为小鼠背部成纤维细胞(MDF)、小鼠肺成纤维细胞(MLF)、小鼠肝脏成纤维细胞、小鼠心脏成纤维细胞或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
  6. 一种用于化学重编程的培养基，其特征在于，包含基础培养成分和化学重编程促进剂，所述的化学重编程促进剂选自下组A：
    (A1)SR11237；
    (A2)CD3254；
    (A3)CCT129202；
    (A4)R406；
    (A5)DMH1；
    (A6)BML-277；
    (A7)AZD9291 mesylate；
    (A8)TSA；
    (A9)SGC-CBP30
    (A10)Citarinostat；
    (A11)TMP269；
    (A12)WS6；
    (A13)(A1)～(A12)的任意组合。
  7. 如权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述用于化学重编程的培养基还包括其他的生长因子和化合物，包括但不限于：β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子、CHIR99021、616452、Forskolin、AM580、EPZ004777、VPA、5-aza-dC、SGC0946、小鼠白血病抑制因子、PD0325901。
  8. 一种将成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括：
    (S1)提供一成纤维细胞；
    (S2)利用第一重编程细胞培养基，预培养(S1)中的成纤维细胞，获得第一中间态细胞；
    (S3)利用第二重编程细胞培养基，培养上述的第一中间态细胞，获得第二中间态细胞；
    (S4)利用第三重编程细胞培养基，培养上述的第二中间态细胞，获得第三中间态细胞；
    (S5)利用第四重编程细胞培养基，培养上述的第三中间态细胞，获得第四中间态细胞；和
    (S6)扩增上述第四中间态细胞，获得诱导多能干细胞。
  9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，(S1)中，所述成纤维细胞的密度为104-106个细胞/孔。
  10. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，(S2)中，所述第一重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：SR11237，CD3254。
  11. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，(S2)中，培养时间为t1，t1为0-3天；较佳地为0.5-2天。
  12. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，(S3)中，所述第二重编程细胞培养基还包含选自下组的化合物：碱性成纤维细胞生长因子，CHIR99021，616452，Forskolin，AM580，SR11237，CD3254，VPA。
  13. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，(S3)中，培养时间为t2，t2为0-3天；较佳地为0.5-2天。
  14. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，(S4)中，所述第三重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：DMH1、BML-277、AZD9291 mesylate、TSA、SGC-CBP30，Citarinostat。
  15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，(S4)中，所述DMH1的浓度为0.1-5μM；
    BML-277的浓度为5-20μM；
    AZD9291 mesylate的浓度为1-5μM；
    TSA的浓度为5-20nM；
    SGC-CBP30的浓度为1-10μM；
    Citarinostat的浓度为1-3μM。
  16. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，(S5)中，所述第四重编程细胞培养基包含选自下组的化合物：DMH1、BML-277、AZD9291 mesylate、TSA、TMP269。
  17. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，(S4)中，所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞，较佳地为小鼠背部成纤维细胞(MDF)、小鼠肺成纤维细胞(MLF)、小鼠肝脏成纤维细胞、小鼠心脏成纤维细胞或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。
  18. 一种用权利要求8所述的方法制备获得的胚胎干细胞，其特征在于，所述细胞表达以下的标志物：Oct4、Sox2、Rex1、Nanog。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116676256A (zh) * 2023-06-07 2023-09-01 浙江大学 细胞快速化学重编程技术
CN117645970A (zh) * 2023-11-17 2024-03-05 广州百康细胞生命科技有限公司 一种使用化学重编辑方法高效快速获得人多能干细胞

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104530413A (zh) * 2014-10-01 2015-04-22 厦门赛诺邦格生物科技有限公司 一种多官能化h型聚乙二醇衍生物修饰的生物相关物质
CN108998417A (zh) * 2018-07-06 2018-12-14 广州医大新药创制有限公司 多能干细胞诱导剂及其应用
WO2022173932A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of treating cancers using sting agonists
WO2022213731A1 (en) * 2021-04-08 2022-10-13 Peking University Chemical reprogramming of human somatic cells into pluripotent cells
CN115725495A (zh) * 2021-08-26 2023-03-03 清华大学 诱导全能性干细胞及其制备方法
CN116024162A (zh) * 2023-02-27 2023-04-28 山东大学 Egcg联合chk2抑制剂在改善卵成熟或胚胎发育中的应用
CN116574674A (zh) * 2023-04-27 2023-08-11 浙江大学 利用cd3254激活rna外切体驱动体细胞重建多能性
CN116676256A (zh) * 2023-06-07 2023-09-01 浙江大学 细胞快速化学重编程技术

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104530413A (zh) * 2014-10-01 2015-04-22 厦门赛诺邦格生物科技有限公司 一种多官能化h型聚乙二醇衍生物修饰的生物相关物质
CN108998417A (zh) * 2018-07-06 2018-12-14 广州医大新药创制有限公司 多能干细胞诱导剂及其应用
WO2022173932A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of treating cancers using sting agonists
WO2022213731A1 (en) * 2021-04-08 2022-10-13 Peking University Chemical reprogramming of human somatic cells into pluripotent cells
CN115725495A (zh) * 2021-08-26 2023-03-03 清华大学 诱导全能性干细胞及其制备方法
CN116024162A (zh) * 2023-02-27 2023-04-28 山东大学 Egcg联合chk2抑制剂在改善卵成熟或胚胎发育中的应用
CN116574674A (zh) * 2023-04-27 2023-08-11 浙江大学 利用cd3254激活rna外切体驱动体细胞重建多能性
CN116676256A (zh) * 2023-06-07 2023-09-01 浙江大学 细胞快速化学重编程技术

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SODRE L: "Abstract 638: Epigenetic reprograming of immune cells through selective inhibition of HDAC6 reduces suppressive phenotypes and augments anti-tumor properties of T-cells ", CANCER RESEARCH, UNIVERSITY OF CHICAGO PRESS, vol. 77, no. 11 suppl., 1 July 2017 (2017-07-01), pages 1 - 3, XP093246467, ISSN: 0008-5472 *
YAN JIN, YUNKUN LUA,1 , LIANYU LINA , CHAO LIUB,C, XIAOJIE MAA , XI CHENA , ZIYU ZHOUA , ZHENSHENG HUA , JIAQI PUA,D, GUO CHENA , : "Harnessing endogenous transcription factors directly by small molecules for chemically induced pluripotency inception", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES (PNAS), NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 120, no. 21, 16 May 2023 (2023-05-16), pages 1 - 12, XP093246464, ISSN: 0027-8424 *

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