WO2024144218A1 - 식물 유래 세포외 소포체의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

식물 유래 세포외 소포체의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2024144218A1
WO2024144218A1 PCT/KR2023/021601 KR2023021601W WO2024144218A1 WO 2024144218 A1 WO2024144218 A1 WO 2024144218A1 KR 2023021601 W KR2023021601 W KR 2023021601W WO 2024144218 A1 WO2024144218 A1 WO 2024144218A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
extracellular vesicles
composition
clause
plant
plants
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/021601
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
정광호
이수연
이다혜
전소희
최선준
사영승
이상일
Original Assignee
(주) 옵트바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020220185063A external-priority patent/KR102646353B1/ko
Priority claimed from KR1020220185422A external-priority patent/KR102646357B1/ko
Application filed by (주) 옵트바이오 filed Critical (주) 옵트바이오
Publication of WO2024144218A1 publication Critical patent/WO2024144218A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/28—Asteraceae or Compositae (Aster or Sunflower family), e.g. chamomile, feverfew, yarrow or echinacea
    • A61K36/286—Carthamus (distaff thistle)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/44—Ebenaceae (Ebony family), e.g. persimmon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/49—Fagaceae (Beech family), e.g. oak or chestnut
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/70—Polygonaceae (Buckwheat family), e.g. spineflower or dock
    • A61K36/704—Polygonum, e.g. knotweed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/74—Rubiaceae (Madder family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A61K8/14—Liposomes; Vesicles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • the purpose of the present invention is to solve all of the above-mentioned problems.
  • the pretreatment step with low-temperature vacuum may be performed at a temperature of about 20 to about 65°C.
  • the pretreatment step with low temperature vacuum may be performed for about 24 to 72 hours.
  • tangential flow filtration may be performed one or more times until the volume of the obtained extract is 1/100 to 1/25.
  • tangential flow filtration may use a TFF filter with a molecular weight cutoff (MWCO) of about 100,000 Da (Dalton) to about 500,000 Da.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • extracellular vesicles prepared by the methods disclosed herein may have one or more properties selected from (1) to (3): (1) about 5.0 Concentration of particles to about 2.0 x 10 11 particles; (2) average particle size of about 100 nm to about 300 nm; and (3) a zeta potential of about -15 mV to about -60 mV.
  • the prepared extracellular vesicles may be free of significant membrane damage.
  • composition for improving skin condition comprising as an active ingredient extracellular vesicles derived from one or more plants selected from the group consisting of buckwheat ( Fagopyrum ) plants and Artemisia plants.
  • extracellular vesicles derived from the juice extract of one or more plants selected from the group consisting of buckwheat ( Fagopyrum ) plants and Artemisia ( Artemisia ) plants may be provided.
  • the buckwheat genus plant may be buckwheat or its sprouts.
  • the Artemisia plant may be Artemisia.
  • the inflammatory cytokine may include one or more selected from the group consisting of IL-1 ⁇ , IL-6, and iNOS.
  • composition for improving skin condition comprising as an active ingredient extracellular vesicles derived from one or more plants selected from the group consisting of Japanese knotweed, coffee beans, persimmon leaves, Yulpi and safflower.
  • antioxidation refers to the process of suppressing the progress of intracellular oxidation due to various causes or alleviating oxidation that has already occurred. Peroxidation can occur due to the free radical reaction of active oxygen, and if it continues, it can accelerate skin aging such as loss of elasticity, inflammation, wrinkles, freckles, and freckles by damaging cell function.
  • anti-inflammatory means preventing, suppressing, relieving, improving or treating inflammation (reaction), and inflammatory diseases include dermatitis, atopic dermatitis, eczema, bacterial infection, viral infection or fungal infection. This may include, but is not limited to, inflammation caused by burns, inflammation caused by burns, wounds, and inflammation caused by wounds.
  • the purification in step (ii) may include one or more tangential flow filtration.
  • tangential flow filtration may be performed 1 to 10 times, 2 to 8 times, 3 to 7 times, or 4 to 6 times. More specifically, tangential flow filtration may be repeatedly performed until the volume of the obtained extract is 1/100 to 1/25.
  • Filtration or refiltration may be performed using filtration membranes or filters. Specifically, filtration may be performed with a filtration membrane or filter containing pores with an average pore size of about 0.22 ⁇ m to 5 ⁇ m. The filtration or re-filtration step may include recovering the filtrate.
  • the filtration step of the (juice) extract may be performed with a filtration membrane or filter with a pore size of about 0.45 ⁇ m, and the subsequent refiltration step may be performed with a filtration membrane or filter with a pore size of about 0.22 ⁇ m.
  • the plant material may be buckwheat and/or mugwort.
  • Extracellular vesicles obtained by a production method comprising the step of pretreating the buckwheat genus plants, mugwort plants, or mixtures thereof with low temperature vacuum may have one or more of the following characteristics: (i) per unit volume of 1 mL a concentration of about 7.0 x 10 8 to about 2.0 x 10 11 particles; (ii) an average particle size of about 135 nm to about 220 nm; and (iii) a zeta potential of about -20 mV to about -60 mV.
  • the plant material may be one or more selected from the group consisting of Japanese knotweed, coffee beans, persimmon leaves, yulpi, and safflower.
  • Extracellular vesicles obtained by a production method comprising the step of pretreating the above Japanese knotweed, coffee beans, persimmon leaves, Yulpi, safflower, or mixtures thereof with a low-temperature vacuum may have one or more of the following characteristics: (i ) Concentration of about 5.0 ⁇ 10 7 to about 2.0 ⁇ 10 10 particles per unit volume of 1 mL; (ii) an average particle size of about 135 nm to about 220 nm; and (iii) a zeta potential of about -15 mV to about -50 mV.
  • a method including a pretreatment step with a low-temperature vacuum can produce a higher concentration of extracellular vesicles compared to a method not including a pretreatment step.
  • concentration of extracellular vesicles prepared by a method including low-temperature vacuum pretreatment was significantly increased compared to extracellular vesicles prepared by a method not including a pretreatment step.
  • a method including a pretreatment step with a low temperature vacuum can produce extracellular vesicles of higher purity compared to a method not including a pretreatment step.
  • extracellular vesicles derived from plant extracts prepared according to a method including low-temperature vacuum pretreatment were observed through TEM (transmission electron microscopy), and it was confirmed that there was no damage to the membrane of the extracted extracellular vesicles. .
  • the extracellular vesicles may be derived from a plant extract, preferably from a juice extract, but are not limited thereto.
  • the buckwheat genus plant may be buckwheat.
  • buckwheat may be, but is not limited to, buckwheat sprouts.
  • the plant of the genus Artemisia can be, but is not limited to, Artemisia.
  • Buckwheat plants and Artemisia plants are known to be a group of plants rich in flavonoids, so for convenience, buckwheat plants and/or Artemisia plants are referred to as flavonoid-containing plants.
  • extracellular vesicles derived from extracts of buckwheat plants and/or mugwort plants can be produced by the above-described “II. Method for producing extracellular vesicles.”
  • extracellular vesicles from flavonoid containing plants may be present at a concentration of about 7.0 ⁇ 10 8 particles/mL to about 2.0 ⁇ 10 11 particles/mL.
  • the extracellular vesicles can be obtained at a concentration of about 7.0 More specifically, a concentration of about 7.5 X 10 8 particles to about 2.0 X 10 9 particles per unit volume of 1 mL can be obtained. More specifically, extracellular vesicles can be obtained at a particle concentration of about 7.0 x 10 9 to about 4.0 x 10 10 particles.
  • the concentration of the extracellular vesicles can be easily changed/adjusted by a person skilled in the art depending on the intended use, formulation, application target, application site, administration route, etc., and for this, it is important to obtain a high concentration of extracellular vesicles.
  • extracellular vesicles from flavonoid-containing plants may have an average particle size of about 135 nm to about 220 nm.
  • the extracellular vesicles may have an average particle size of about 150 nm to about 200 nm. More preferably, the extracellular vesicles may have an average particle size of about 150 nm to about 190 nm, or about 160 nm to about 195 nm. Even more preferably, the extracellular vesicles may have an average particle size of about 150 nm to about 190 nm.
  • extracellular vesicles from flavonoid-containing plants may have a zeta potential of about -20 mV to about -60 mV.
  • the extracellular vesicles may have a zeta potential of about -30 mV to about -50 mV. More preferably, the extracellular vesicles may have a zeta potential of about -35 mV to about -45 mV.
  • a composition for improving skin condition which includes extracellular vesicles derived from flavonoid-containing plants (buckwheat and/or mugwort) disclosed herein as an active ingredient.
  • extracellular vesicles or a composition containing them may inhibit the generation of reactive oxygen species.
  • IL-1 ⁇ , IL-6, and iNOS are all inflammatory cytokines.
  • IL-1 ⁇ acts as a mediator of the host's inflammatory response
  • IL-6 is a cytokine that functions in both innate and adaptive immunity
  • iNOS It binds with calmodulin and is involved in the production of large amounts of nitric oxide (NO).
  • extracellular vesicles derived from one or more plants selected from the group consisting of Japanese knotweed, coffee bean, persimmon leaf, Yulpi and safflower are provided.
  • Knotweed root, coffee beans, persimmon leaves, yulpi, and safflower are known to be plants rich in tannin, so for convenience, Japanese knotweed, coffee beans, persimmon leaves, yulpi, safflower, or a combination thereof are referred to as tannin-containing plants.
  • extracellular vesicles derived from tannin-containing plants may be prepared by the above-described "II. Method for producing extracellular vesicles.”
  • extracellular vesicles derived from tannin-containing plants may have an average particle size of about 135 nm to about 220 nm.
  • the extracellular vesicles may have an average particle size of about 140 nm to about 215 nm. More preferably, the extracellular vesicles may have an average particle size of about 150 nm to about 210 nm.
  • the average particle size of the extracellular vesicles is not limited thereto.
  • a composition for improving skin condition which includes extracellular vesicles derived from tannin-containing plants (Knotweed root, coffee bean, persimmon leaf, Yulpi, safflower, or a combination thereof) as an active ingredient.
  • tannin-containing plants Knotweed root, coffee bean, persimmon leaf, Yulpi, safflower, or a combination thereof
  • CCD-1064SK cells a human fibroblast cell line
  • the expression of COL1A1, COL3A1, and ELASTIN genes significantly increased, resulting in excellent skin wrinkle improvement efficacy.
  • HaCaT cells a human keratinocyte cell line
  • HAS2 and CAS14 genes significantly increased, confirming excellent skin moisturizing efficacy.
  • improving skin condition may include one or more selected from the group consisting of improving skin wrinkles, moisturizing skin, and enhancing skin vitality. That is, a composition for improving skin wrinkles, a composition for moisturizing skin, and/or a composition for improving skin vitality may be provided.
  • the composition for improving skin wrinkles according to the present invention can be used to prevent or improve skin aging, including wrinkles and decreased skin elasticity.
  • the skin moisturizing composition according to the present invention can be used to prevent or improve symptoms caused by skin dryness, such as itching.
  • the composition for improving skin vitality according to the present invention can revitalize the skin and make it healthy, so it can be used for skin care.
  • the compositions for various purposes described above can be used in the fields of cosmetic compositions, pharmaceutical compositions, quasi-drug compositions, and food compositions, as will be described later.
  • extracellular vesicles derived from extracts of flavonoid-containing plants buckwheat plants and/or mugwort plants
  • tannin-containing plants Knotweed root, coffee bean, persimmon leaf, yulpi, safflower, or a combination thereof
  • a cosmetic composition for improving skin condition including the cosmetic composition as an ingredient is provided.
  • the carrier ingredients include water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester, and microcrystals.
  • a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester
  • microcrystals such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester, and polyoxyethylene sorbitan ester
  • Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, or tragacanth may be used.
  • the carrier ingredients include aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, and fatty acid amide.
  • Ether sulfate, alkylamidobetaine, fatty alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivative, or ethoxylated glycerol fatty acid ester may be used.
  • cosmetics of the present invention include feminine cleanser, hand sanitizer, face wash cream, face wash foam, cleansing cream, cleansing milk, cleansing lotion, massage cream, cold cream, moisture cream, emulsion, lotion, pack, aftersaving cream, sunburn prevention.
  • Cream, suntan oil, soap, body shampoo, hair shampoo, hair rinse, hair treatment, wool agent, hair growth agent, hair cream, hair liquid, set lotion, hair spray, hair bridge, color rinse, color spray, permanent wave Examples include liquid, pressed powder, loose powder, eye shadow, hand cream, and lipstick.
  • the skin disease is an inflammatory skin disease (e.g., dermatitis, atopic dermatitis, eczema, inflammation due to bacterial infection, viral infection, or fungal infection, burn, inflammation due to burn, wound, inflammation due to wound, etc.), Skin pigmentation diseases (e.g., freckles, freckles, lentigines, nevus, melanoma, drug-induced pigmentation, post-inflammatory pigmentation, and dermatitis-related pigmentation) or skin dryness (e.g., psoriasis, pruritus, keratosis pilaris) , dry scalp, skin laxity, etc.), but is not limited thereto.
  • atopic dermatitis eczema, inflammation due to bacterial infection, viral infection, or fungal infection, burn, inflammation due to burn, wound, inflammation due to wound, etc.
  • Skin pigmentation diseases e.g., freckles, freckles, lentigines, nevus, mel
  • composition of the present invention may be used interchangeably with the term veterinary composition when applied to animals other than humans.
  • Cellulose hydroxypropyl methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, mineral oils such as methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and silicon dioxide, etc. Examples include, but are not limited to.
  • additives such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives for the formulation may be selected from those commonly used in the pharmaceutical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated in a desired form depending on the method of use, and methods known in the art are adopted to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient, especially after administration to a mammal. It can be formulated as follows. Specific examples of such dosage forms include tablets, pills, powders, granules, syrups, solutions, capsules, suspensions, emulsions, injection solutions, plasters, lotions, liniments, limonade, aerosols, and extracts. There are extracts, elixirs, ointments, fluid extracts, needles, creams, soft or hard gelatin capsules, patches, etc.
  • composition of the present invention is preferably formulated using a suitable method known in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (latest edition), Mack Publishing Company, Easton PA. It can be.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically or veterinarily effective amount.
  • pharmaceutically effective amount or "veterinary effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical or veterinary treatment, and the effective dose level is defined as that of the patient or animal. Weight, gender, age, health status, severity, drug activity, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field. You can.
  • the dosage may be about 0.001 to about 50 mg/kg per day or about 0.01 to about 10 mg/kg per day, but the invention is not limited thereto.
  • Food can be manufactured by conventional methods known in the art.
  • medical foods, nutraceutical foods, or health functional foods are tablets, pills, powders, granules, and powders that additionally contain one or more of carriers, diluents, excipients, and additives in addition to extracellular vesicles for the purpose of improving skin condition. It may be formulated as one selected from the group consisting of tablets, capsules, and liquid formulations. Specific examples of carriers, excipients, diluents and additives are well known in the art, and those skilled in the art can prepare them by combining appropriate ingredients according to the formulation.
  • the extracellular vesicle solutions prepared in Preparation Examples A and B were prepared, and particle size distribution analysis was performed using a Nanoparticle Tracking Analysis (NTA; Particle matrix) according to the manufacturer's instructions.
  • NTA Nanoparticle Tracking Analysis
  • the zeta potential value of the extracellular vesicles of Preparation Example A-2 was approximately -41.09 mV, and the extracellular vesicles of Preparation Example A-4 were -35.95 mV (Table 2).
  • the medium for cell culture was DMEM (DMEM) containing 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco, Cat. 12483-020) and 1% Antibiotics (Corning, Cat. 30-004-CI).
  • Dulbecco's Modified Eagle Medium (Welgene, Cat. LM001-05) was used, and cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions. After 24 hours, each well was replaced with serum free medium and extracellular vesicles were treated at different concentrations.
  • HaCaT and RAW 264.7 cells were cultured for 24 hours, and B16-F1 cells were cultured for 72 hours.
  • Extracellular vesicles were treated at three concentrations (1.0E+08, 2.5E+08, and 5.0E+08 particles/mL). After culturing, the cells were treated with DCFDA (Sigma-Aldrich, D6883) to stain reactive oxygen species (ROS) in the dark, and additionally treated with H 2 O 2 for 15 minutes to induce ROS production. In addition, as a control group, untreated wells and wells treated only with H 2 O 2 were prepared and compared. After processing all samples, fluorescence was measured at a wavelength of 485/528 nm (excitation/emission), and the measurement results were calculated using the following formula: (ROS production amount/cell survival rate) x 100.
  • DCFDA Sigma-Aldrich, D6883
  • B16-F1 cells which are mouse melanocytes, were distributed at 1.5x10 5 cells/well in a 6-well plate and cultured for 24 hours.
  • DMEM medium containing fetal bovine serum was used as the cell culture medium.
  • each well was replaced with serum-free medium and treated with ⁇ -MSH, a melanin production inducing substance, with extracellular vesicles (Preparation Example A-4) or arbutin, a raw material for whitening functional cosmetics, and cultured for 72 hours. .
  • CCD-1064SK cells a human fibroblast cell line (Source: American Type Culture Collection, Cat. CRL-2076), and HaCaT cells, a human keratinocyte cell line (Cell Line Service, Cat. 300493GKD), were grown at 1x10 cells each in a 24-well plate. /well and 1.5x10 5 cells/well were distributed and cultured for 24 hours.
  • the medium for cell culture was 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco, Cat. 12483-020) and 1% antibiotics (Source: Corning, Cat. 30-004-CI) for CCD-1064SK cells. ) was used, and for HaCaT cells, 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco, Cat. 12483-020) and 1% antibiotics (Corning, Cat. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Welgene, Cat. LM001-05) containing 30-004-CI) was used, and cultured at 37°C and 5% CO 2 conditions.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • RNA quantification kit Quantification kit
  • cDNA was synthesized and real-time PCR was performed.
  • cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit (PCRBIOSYSTEMS (UK), qPCRBIO cDNA Synthesis Kit).
  • Real-time PCR amplified the gene using a Real-time PCR kit (PCRBIOSYSTEMS (UK), 2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX) and then quantitatively analyzed the amplification product.
  • Real-time PCR conditions were all 40 cycles of 95°C for 5 seconds and 60°C for 30 seconds. Experiments using all kits were conducted according to the protocol provided by the manufacturer.
  • COL1A1, COL3A1, and ELASTIN gene expression results were expressed as a ratio based on the gene expression level of the untreated group (Control).
  • the concentration of extracellular vesicles (preparation example B-4) derived from extracts of Japanese knotweed, coffee bean, persimmon tree leaf, Yulpi and safflower extract was added to CCD-1064SK cells, a human fibroblast cell line.
  • the concentration of extracellular vesicles increased, the expression of genes related to wrinkle improvement, COL1A1, COL3A1, and ELASTIN, increased.
  • RNA quantification kit Quantification kit
  • cDNA was synthesized and real-time PCR was performed.
  • cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit (PCRBIOSYSTEMS (UK), qPCRBIO cDNA Synthesis Kit).
  • Real-time PCR amplified the gene using a Real-time PCR kit (PCRBIOSYSTEMS (UK), 2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX) and then quantitatively analyzed the amplification product.
  • Real-time PCR conditions were all 40 cycles of 95°C for 5 seconds and 60°C for 30 seconds. Experiments using all kits were conducted according to the protocol provided by the manufacturer. HAS2 and CAS14 gene expression results were expressed as a ratio based on the gene expression level of the untreated group.
  • HaCaT cells a human keratinocyte cell line
  • extracellular vesicles (Preparation Example B-4) derived from extracts of Japanese knotweed root, coffee bean, persimmon tree leaf, Yulpi and safflower extract at different concentrations.
  • HAS2 and CAS14 genes genes related to skin moisturization, increased as the concentration of extracellular vesicles increased.
  • JC-1 staining was performed to verify changes in mitochondrial cell membrane potential.
  • HaCaT cells a human keratinocyte cell line
  • DMEM medium containing fetal bovine serum was used as the culture medium for the cells.
  • UVB 50 mJ/cm 2 was irradiated to create a dry environment.
  • each well was replaced with new serum-free medium and treated with extracellular vesicles (Preparation Example B-4). Extracellular vesicles were treated at three concentrations (1.0E+08, 2.5E+08, and 5.0E+08 particles/mL).
  • the cells were washed using HBSS.
  • JC-1 dye was diluted in serum-free medium, treated with cells, and incubated in the dark at 37°C for 2 hours. After the dark reaction, the stained cells were observed through a fluorescence microscope (FIG. 11).
  • the red:green ratio is confirmed to be 1:1 through staining using JC-1 dye.
  • the red fluorescence value is significantly reduced.
  • extracellular vesicles prepared according to a method including low-temperature vacuum pretreatment and TFF have the effect of improving skin vitality by increasing the activity of mitochondria in skin cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

본 발명은 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 식물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 식물을 저온진공법으로 전처리한 후에 세포외 소포체를 제조하여 양질의 세포외 소포체를 고농도 및 고순도로 수득하는 것을 기술적 특징으로 한다. 고농도 및 고순도의 세포외 소포체는 화장료 조성물, 약학 조성물, 식품 조성물 등 다양한 형태로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명은 플라보노이드 함유 식물 또는 탄닌 함유 식물 등 특정 식물(들)로부터 제조된 세포외 소포체가 항산화, 항염증, 미백, 피부 주름 개선, 피부 보습, 피부 활력 증진 등의 탁월한 효과를 나타낸다는 놀라운 발견에 기초한다. 본 발명의 저온진공 전처리는 이러한 탁월한 효과의 세포외 소포체를 고농도 및 고순도로 얻을 수 있도록 한다는 점에서 더욱 유용하다.

Description

식물 유래 세포외 소포체의 제조방법 및 이의 용도
본 출원은 2022년 12월 26일자로 출원된 한국특허출원 제10-2022-0185063호 및 2022년 12월 27일자로 출원된 한국특허출원 제10-2022-0185422호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 식물 유래 세포외 소포체의 제조 방법 및 이의 용도, 구체적으로 본 발명은 저온진공의 전처리 과정을 통해 식물 재료에서 양질의 세포외 소포체를 고농도 및 고순도로 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 식물 유래 세포외 소포체 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 탁월한 약학적 또는 미용학적 효과를 나타내는 식물 유래 세포외 소포체 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 세포 분비체(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비체 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 엑소좀(exosome) 등과 같은 세포외 소포체(extracellular vesicles, EVs)가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다. 특히, 엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 인자들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 인자는 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화를 포함한 다양한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다(문헌 [Thery, Clotilde, Laurence Zitvogel, and Sebastian Amigorena. "Exosomes: composition, biogenesis and function." Nature reviews immunology 2.8 (2002): 569-579.] 참조).
엑소좀을 포함하여 세포외 소포체를 이용한 특정 질환의 치료 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있으나, 식물 추출물 유래 세포외 소포체 및 이의 제조방법 대한 연구는 아직 미진한 상태이다. 종래 밀도 구배 초원심분리를 이용한 방법 또는 여과필터의 기공보다 작은 크기의 물질을 얻는 방법이 사용되었으나 여과 효율이 좋지 않았다. 또한, 고농도의 세포외 소포체를 여과하기 위하여 접선유동여과(tangential-flow filtration, TFF)를 이용한 선행연구가 있지만(한국등록특허 제10-2125567호 참조), 양질의 세포외 소포체를 고농도 및 고순도를 제조하기 위한 방법에 대한 필요성은 여전히 존재한다.
본 발명은 상술한 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 식물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)의 제조 방법을 제공하는 것을 일 목적으로 한다.
본 발명은 식물 유래 세포외 소포체를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 약학적 또는 미용학적으로 탁월한 효능을 갖는 식물 유래 세포외 소포체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 식물 유래 세포외 소포체의 피부 상태 개선 용도를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 식물 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선을 위한 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 식물 재료를 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 식물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)의 제조 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 저온진공으로 전처리하는 단계는 약 20 내지 약 65℃의 온도 조건에서 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, 저온진공으로 전처리하는 단계는 약 -1 Bar 내지 약 2 Bar 범위의 압력 조건에서 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, 저온진공으로 전처리하는 단계는 약 20 내지 약 65℃의 온도 조건 및 약 -1 Bar 내지 약 2 Bar 범위의 압력 조건에서 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 저온진공으로 전처리하는 단계는 약 24 내지 72시간 동안 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 식물 유래 세포외 소포체의 제조 방법은 (i) 전처리된 식물 재료로부터 추출물을 수득하는 단계; 및 (ii) 수득된 추출물에서 세포외 소포체를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 전처리된 식물 재료로부터 추출물을 수득하는 단계는 전처리된 식물 재료를 착즙하는 것을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 수득된 추출물에서 세포외 소포체를 정제하는 단계는 1회 이상의 접선유동여과(tangential-flow filtration, TFF)를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 수득된 추출물에서 세포외 소포체를 정제하는 단계는 다공성 필터를 이용한 여과를 포함하고, 다공성 필터를 이용한 여과는 1회 이상의 접선유동여과 전에 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 수득된 추출물에서 세포외 소포체를 정제하는 단계는 다공성 필터를 이용한 여과, 원심 분리 및 제균 여과를 포함하고, 상기 여과, 원심 분리 및 제균 여과는 상기 1회 이상의 접선유동여과 전에 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 수득된 추출물의 부피가 1/100 내지 1/25의 부피가 될 때까지 1회 이상의 접선유동여과를 수행할 수 있다.
다른 구현예에서, 접선유동여과는 분자량 컷오프(Molecular weight cutoff; MWCO)가 약 100,000 Da(Dalton) 내지 약 500,000 Da인 TFF 필터를 이용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시되는 방법으로 제조된 세포외 소포체는 하기 (1) 내지 (3)으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 가질 수 있다: (1) 1 mL의 단위 부피당 약 5.0 X 107 개 입자 내지 약 2.0 X 1011 개 입자의 농도; (2) 약 100 nm 내지 약 300 nm의 평균 입자 크기; 및 (3) 약 -15 mV 내지 약 -60 mV의 제타 전위.
일 구현예에서, 제조된 세포외 소포체는 유의미한 막 손상이 없는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 메밀속(Fagopyrum) 식물 및 쑥속(Artemisia) 식물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물로부터 유래된 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 메밀속(Fagopyrum) 식물 및 쑥속(Artemisia) 식물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물의 착즙 추출물로부터 유래된 세포외 소포체가 제공될 수 있다.
다른 구현예에서, 메밀속 식물은 메밀 또는 이의 새싹일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 쑥속 식물은 개똥쑥일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포외 소포체는 (i) 메밀속 식물 및 쑥속 식물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물을 저온진공으로 전처리하는 단계; (ii) 전처리된 식물로부터 추출물을 수득하는 단계; 및 (iii) 수득된 추출물에서 세포외 소포체를 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다.
일부 구현예에서, 메밀속(Fagopyrum) 식물 및 쑥속(Artemisia) 식물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물로부터 유래된 세포외 소포체는 하기 (1) 내지 (3)으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 가질 수 있다: (1) 1 mL의 단위 부피당 약 7.0 Х 108 개 입자 내지 약 2.0Х 1011 개 입자의 농도; (2) 약 135 nm 내지 약 220 nm의 평균 입자 크기; 및 (3) 약 -20 mV 내지 약 -60 mV의 제타 전위.
일 구현예에서, 피부 상태 개선은 피부 항산화, 피부 미백 및 피부 항염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 세포외 소포체는 하기 (1) 내지 (3)으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 가질 수 있다: (1) 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성의 억제; (2) 멜라닌 분비 또는 멜라닌 생성의 억제; (3) 일산화질소(Nitric oxide, NO) 생성의 억제; 및 (4) 염증성 사이토카인 발현의 억제.
또 다른 구현예에서, 염증성 사이토카인은 IL-1β, IL-6 및 iNOS로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물로부터 유래된 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물의 착즙 추출물로부터 유래된 세포외 소포체가 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포외 소포체는 (i) 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물을 저온진공으로 전처리하는 단계; (ii) 전처리된 식물로부터 추출물을 수득하는 단계; 및 (iii) 수득된 추출물에서 세포외 소포체를 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다.
일부 구현예에서, 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물로부터 유래된 세포외 소포체는 하기 (1) 내지 (3)으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 가질 수 있다: (1) 1 mL의 단위 부피당 약 5.0 Х 107 개 입자 내지 약 2.0Х 1010 개 입자의 농도; (2) 약 135 nm 내지 약 220 nm의 평균 입자 크기; 및 (3) 약 -15 mV 내지 약 -50 mV의 제타 전위.
일 구현예에서, 피부 상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 보습 및 피부 활력 증진으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 세포외 소포체는 피부 세포에서 하기 (1) 내지 (3)으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 가질 수 있다: (1) COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자 중 하나 이상의 발현 증가; (2) HAS2 및 CAS14 유전자 중 하나 이상의 발현 증가; 및 (3) 미토콘드리아의 활성 증가.
일 구현예에서, 피부 상태 개선을 위한 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
일 구현예에서, 피부 상태 개선을 위한 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
본 명세서에 개시되는 세포외 소포체의 제조 방법은 저온진공의 전처리를 통해 추출 효율을 극대화시키고, 접선유동여과를 통해 여과 효율을 극대화시킨 새로운 제조 방법이다. 이론에 얽매임 없이, 저온진공 전처리는 식물 조직에 다공성을 부여함으로써 추출시 용해도 및 수분 복원력을 극적으로 증가시킬 수 있어서, 막 손상 없이 고순도 및 고농도의 세포외 소포체를 수득할 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 동일한 중량의 식물 원료로부터 더 많은 양의 제품 제조가 가능하다는 상업적인 이점이 있으며, 피부에 직접 적용(도포)되는 형태의 제제화에도 유리하다. 따라서, 고농도 및 고순도의 세포외 소포체는 화장료 조성물, 약학 조성물, 식품 조성물 등 다양한 형태로 활용될 수 있다.
도 1은 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조된 세포외 소포체의 NTA(Nanoparticle Tracking Analysis) 분석 결과를 나타내는 도면이다. 도 1a는 메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체의 크기 및 농도를 확인한 그래프이며, 도 1b는 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 세포외 소포체의 크기 및 농도를 확인한 그래프이다.
도 2는 TFF를 포함하는 방법 또는 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물(메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물) 유래 세포외 소포체의 NTA 분석 결과, 제타 전위 분석 결과 및 TEM(투과전자현미경)으로 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2a는 NTA를 통해 세포외 소포체의 크기 및 농도를 확인한 그래프이며, 도 2b는 제타 전위 그래프이고, 도 2c는 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 세포외 소포체의 표면을 TEM으로 확인한 그래프이다(Scale bar: 200 nm).
도 3은 TFF를 포함하는 방법 또는 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물) 유래 세포외 소포체의 NTA 분석 결과, 제타 전위 분석 결과 및 TEM으로 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3a는 NTA를 통해 세포외 소포체의 크기 및 농도를 확인한 그래프이며, 도 3b는 제타 전위 그래프이고, 도 3c는 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 세포외 소포체의 표면을 TEM으로 확인한 그래프이다(Scale bar: 200 nm).
도 4는 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물(메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물) 유래 세포외 소포체 처리 시의 세포 생존율 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 각질세포주인 HaCaT 세포, 마우스 멜라닌세포주인 B16-F1 세포 및 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 세포외 소포체를 농도별로 투여 시 대조군 대비 생존율을 나타낸다.
도 5는 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물(메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물) 유래 세포외 소포체의 항산화 효능 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 농도별 세포외 소포체 또는 대조군을 투여하여 확인한 활성산소종(ROS) 생성량을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물(메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물) 유래 세포외 소포체의 미백 효능에 관한 도면이다. 막대 그래프는 마우스 멜라닌 세포인 B16-F1 세포에 농도별 세포외 소포체 또는 대조군을 투여하여 확인한 멜라닌 분비량(도 6a) 및 생성량(도 6b)을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7d는 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물(메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물) 유래 세포외 소포체의 항염 효능에 관한 도면이다. 도 7a의 막대 그래프는 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 농도별 세포외 소포체 또는 대조군을 투여하여 일산화질소(NO) 생성량을 확인한 결과를 나타낸다. 도 7b 내지 도 7d는 Real-time PCR를 통해 확인한 염증성 사이토카인 유전자의 발현량을 나타낸 그래프로서, 도 7b는 IL-1β를 코딩하는 유전자, 도7c는 IL-6를 코딩하는 유전자, 도 7d는 iNOS를 코딩하는 유전자의 발현량을 각각 도시한다.
도 8은 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물) 유래 세포외 소포체 처리 시의 세포 생존율 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포 및 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 세포외 소포체를 농도별로 투여 시 대조군 대비 생존율을 나타낸다.
도 9a 내지 도9c는 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물) 유래 세포외 소포체의 주름 개선 효능 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포에 세포외 소포체를 농도별로 투여하고 Real-time PCR을 통해 확인한 주름 개선 관련 유전자의 발현량을 나타낸 그래프로서, 도 9a는 COL1A1를 코딩하는 유전자, 도 9b는 COL3A1를 코딩하는 유전자, 도 9c는 ELASTIN을 코딩하는 유전자의 발현량을 각각 도시한다.
도 10a 및 도 10b는 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물) 유래 세포외 소포체의 피부 보습 효능 평가에 관한 도면이다. 막대 그래프는 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 세포외 소포체를 농도별로 투여하고 Real-time PCR을 통해 확인한 피부 보습 관련 유전자의 발현량을 나타낸 그래프로서, 도 10a는 HAS2를 코딩하는 유전자, 도 10b는 CAS14를 코딩하는 유전자의 발현량을 각각 도시한다.
도 11은 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물) 유래 세포외 소포체의 피부 활력 증진 평가에 관한 도면이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여(도면이 있는 경우에 한함) 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 청구항들이 기술하는 것과 동일하거나 균등한 모든 범위에 관하여 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예/실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예/실시예에서 다른 구현예/실시예로 변경되거나 복수의 구현예/실시예가 조합되어 실현될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 기술 및 학술 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서의 해석을 위한 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수형으로 표현된 용어는 문맥상 부적절하지 않는 한 복수형(즉, 적어도 하나)을 또한 지칭하는 것으로 그 의미가 해석되어야 할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
I. 정의
본 명세서에 사용되는 용어 "약"은 당해 기술 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 조건, 조성, 양 등을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "세포외 소포체(extracellular vesicles)"는 세포 내에서 생성되어 외부로 방출되는 소포의 일종으로서, 기원과 분비 기작, 크기 등을 기준으로 엑소좀(exosomes), 미세소포체(microvesicles), 엑토좀(ectosomes), 미세입자(microparticles), 막 소포체(membrane vesicles), 나노소포체(nanovesicles), 외막 소포체(outer membrane vesicles) 등 다양한 명칭으로 불려 오고 있으나, 모두 세포 외부로 분비되는 소포체라는 공통점이 있다. 따라서 이들을 모두 포괄하는 개념으로서 본 명세서에서는 용어 "세포외 소포체"가 사용된다. "세포외 소포체"는 또한 특정한 조건 및 제법에 의해 균일하게 만들어지는, 세포 내 물질을 포함하는 막 구조물도 포함하며, 엑소좀-유사 막 구조체(exosome-like membrane) 또는 엑소좀-유사 소포체(exosome-like vesicle) 등의 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. "엑소좀-유사 막 구조체" 또는 "엑소좀-유사 소포체"는 나노크기의 세포외 소포체를 의미하는 것으로서, 나노크기의 엑소좀을 포함할 뿐만 아니라 나노크기의 소포체 구조 및 그 조성물이 엑소좀과 유사한 소포체를 모두 포함하는 개념일 수 있다.
용어 "메밀속(Fagopyrum) 식물"은 쌍떡잎식물 이판화군 마디풀목의 한 과인 마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 식물을 의미하는 것으로 사용되었으며, 메밀속 식물에는 Fagopyrum tataricum, Fagopyrum esculentum, Fagopyrum cymosum, Fagopyrum gracilipes, Fagopyrum statice, Fagopyrum urophyllum, Fagopyrum gilesii, Fagopyrum leptopodum, Fagopyrum lineare, Fagopyrum kashmirianum, Fagopyrum callianthum, Fagopyrum capillatum, Fagopyrum caudatum, Fagopyrum homotropicum, Fagopyrum macrocarpum, Fagopyrum pleioramosum, Fagopyrum rubrifolium, Fagopyrum zuogongense, Fagopyrum gracilipedoides, Fagopyrum jinshaense, Fagopyrum polychromofolium, Fagopyrum crispatifolium, Fagopyrum densivillosum, Fagopyrum pugense, Fagopyrum qiangcai, Fagopyrum tibeticum, Fagopyrum wenchuanense, Fagopyrum luojishanense, Fagopyrum longzhoushanense, Fagopyrum longistylum 등이 포함된다.
용어“메밀”은 마디풀과에 속하는 한해살이 풀로서 좁게는 Fagopyrum esculentum 종에 속하는 메밀을 의미한다. 메밀의 새싹은 간 세포의 재생을 촉진하여 간의 해독기능을 강화시켜주고, 이뇨작용을 도와 대소변의 배출을 원활하게 해준다고 알려져 있다.
용어 "쑥속(Artemisia) 식물"은 국화과(Asteraceae), 국화족(Anthemideae) 내에 속하는 식물을 의미하는 것으로 사용되었으며, 쑥속 식물에는 Artemisia abrotanum L., Artemisia alaskana, Artemisia annua L., Artemisia arenaria, Artemisia bigelovii, Artemisia chamaemelifolia, Artemisia franserioides, Artemisia glacialis L., Artemisia marschalliana, Artemisia nova, Artemisia papposa, Artemisia pygmaea, Artemisia spiciformis, Artemisia thuscula, Artemisia vulgaris L. 등이 포함된다.
용어 "개똥쑥"은 "개땅쑥", "잔잎쑥" 또는 "비쑥"과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 국화과에 속하는 한해살이 풀로서 좁게는 Artemisia annua L.에 속하는 쑥을 의미한다. 개똥쑥은 주로 유럽과 아시아 전역에서 서식하고 있으며, 그 외 다른 지역에서도 발견된다.
용어 "호장근"은 다년초인 호장(Polygonum cuspidatum), 왕호장(Polygonum sachalinense) 및 둥근잎호장(Polygonum ellipticum) 등 마디풀과(Polygonaceae)에 속하는 호장의 뿌리 및 근경을 말린 것으로, 근경은 옆으로 뻗으며 황갈색이다. 볕이 잘 드는 냇가나 산기슭에서 생육하는 다년생초본이다. 한국이 원산으로 국외로는 일본, 대만, 중국 등지에 분포한다.
용어 "커피콩"은 커피나무 열매의 씨로서, 커피나무 열매가 붉게 익으면 과육이 벌어지면서 푸른빛을 띤 생두가 나온다. 맛은 쓴맛, 신맛, 단맛, 떫은 맛 등 다양한데, 쓴맛은 카페인, 떫은 맛은 탄닌, 신맛은 지방산, 단맛은 당질에서 비롯된다. 커피는 자극제로서 신경계통에 작용해 정신의 활동력과 지각을 활발하게 만들어 사고를 한층 명료하게 하고, 육체적으로는 근육을 긴장시켜 노동력을 증진시키고, 이뇨작용을 도와줘 위장활동을 촉진시키는 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
용어 "감나무잎"은 우리나라 중부 이남 지방에 주로 분포하는 감나무의 잎으로서, 주로 차로 이용되어 동의보감에 혈관질환의 예방, 치료와 함께 자반증(혈관염증)에도 효과가 있다고 기록되어 있다. 또한, 감나무잎에는 비타민 C, 아미노산, 핵산, 페놀성 화합물, 유리당 등 여러 물질들이 다양하게 함유되어 있어 우수한 항균성이 있고, 감기 및 성인병 예방의 약리작용 효과가 있는 것으로 보고되어 있다.
용어 "율피"는 너도 밤나무과(Buna)의 다년생 초목인 밤나무(Castanea crenata)의 과실인 밤의 속껍질로 여러 기능성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 율피는 전체 밤 함량의 약 25%를 차지하고 있지만, 가공식품 제조시 폐기처리되는 일종의 산업 부산물이다. 따라서, 율피를 고부가가치 제품 개발을 위한 소재로 이용한다면 이에 따른 경제적 이점이 상당할 것이다.
용어 "홍화"는 잇꽃이라고도 하며, 예로부터 한의학에서 부인병, 통경, 복통에 사용되어 왔다.
용어 "피부 상태 개선"은 피부 장벽의 모양 또는 기능 손상을 포함한 모든 피부 상태를 개선하는 것을 의미하며, 예를 들어 피부 장벽 기능 강화, 피부 수분 유지 또는 수분 손실 방지, 피부 세포 재생, 피부 활력 증진, 피부의 항산화 작용 증진 또는 피부의 염증 개선 또는 치료 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
용어 "항산화"는 다양한 원인으로 인하여 세포 내 산화가 진행되는 것을 억제하거나 이미 발생한 산화를 완화하는 과정을 의미한다. 과산화는 활성산소의 자유 라디칼 반응으로 인하여 발생할 수 있으며 지속될 경우 세포의 기능을 손상시킴으로써 탄력 감소, 염증, 주름, 기미 및 주근깨 생성 등 피부 노화를 가속시킬 수 있다.
용어 "미백"은 멜라닌 색소의 수준을 감소시켜 피부를 하얗게 만드는 과정을 의미하며, 멜라닌의 생성, 합성 또는 분비를 억제하는 방법을 포함한 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다.
용어 "항염" 또는 "항염증"은 염증(반응)을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 것을 의미하고, 염증성 질환으로는 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염으로 인한 염증, 화상, 화상으로 인한 염증, 상처, 상처로 인한 염증 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
II. 세포외 소포체의 제조 방법
본 발명은 부분적으로 식물 재료로부터 세포외 소포체를 제조함에 있어 식물 재료를 저온 및 진공 조건에서 전처리하는 경우에 막 손상 없이 고순도 및 고농도의 세포외 소포체를 수득할 수 있다는 발견에 기초한다. 저온진공의 전처리(low temperature-vacuum conditioning)를 포함하는 세포외 소포체의 제조 방법을 사용하면 동일한 중량의 식물 원료로부터 더 많은 양의 제품 제조가 가능하다는 상업적인 이점이 있으며, 상대적으로 적은 양의 처방으로도 최대의 효과를 이끌어낼 수 있고, 피부에 직접 적용(예를 들어, 도포)되는 형태의 제제화에도 유리한 이점 또한 가진다. 특히, 저온진공으로 전처리하는 단계는 일반적인 추출 형태인 고온 및 고압에서의 추출이 식물 원료의 영양성분을 파괴하거나 또는 식물 원료에서 추출되는 세포외 소포체의 막을 손상시킬 수 있는 문제점의 해결책이 될 수 있다. 즉, 저온진공으로 전처리하는 단계는 식물 원료의 손상을 최소화시킬 수 있으며, 나아가 식물 원료에서 추출된 세포외 소포체의 막 손상을 최소화시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 태양에 따르면, 식물 재료를 저온 및 진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 식물 유래 세포외 소포체의 제조 방법이 제공된다.
본 명세서에 개시되는 세포외 소포체의 제조 방법은 고순도 및 고농도의 세포외 소포체를 얻기 위해 식물 재료를 저온 및 진공에서 전처리하는 것에 특징이 있으므로, 세포외 소포체를 생성, 분비 또는 함유하고 있는 식물 재료라면 식물의 종류에 제한되지 않고 이용될 수 있다. 구체적으로, 식물 재료는 식물 전체이거나, 잎, 줄기, 뿌리, 새싹, 꽃잎, 과실 등의 식물의 일부, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예컨대, 식물은 플라보노이드 함유 식물 또는 탄닌 함유 식물일 수 있다. 예컨대, 식물은 메밀속 식물, 쑥속 식물 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 예컨대, 식물은 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에서, "저온진공(low temperature and vacuum)"조건은 대기압보다 낮은 진공 상태 및 비교적 낮은 온도 조건을 의미하고, 이론에 얽매임 없이, 대기압보다 낮은 진공 상태 및 비교적 낮은 온도 조건에서 식물에 존재하는 성분들이 대기압보다 낮은 진공 상태 및 비교적 낮은 온도 조건에서 음의 압력을 통해 외부로 배출되는 것을 촉진하고, 추출 대상인 식물 조직에 다공성을 부여하여 추출 시에 용해도 및 수분 복원력을 극적으로 증가시킬 수 있는 것으로 이해된다.
일 구현예에서, 저온진공의 전처리는 약 80℃이하의 저온 조건, 구체적으로 약 10 내지 약 80℃, 보다 구체적으로 약 20 내지 약 60℃, 보다 더 구체적으로 약 30 내지 약 50℃, 보다 더 구체적으로 약 40℃의 온도 조건에서 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 저온진공의 전처리는 대기압 이하의 압력 조건, 구체적으로 약 -1 Bar 내지 약 2 Bar, 약 -1 Bar 내지 약 1.5 Bar, 약 -1 Bar 내지 약 1.0 Bar, 약 0 Bar 내지 약 2 Bar, 약 0 Bar 내지 약 1 Bar, 약 0.5 Bar 내지 약 1 Bar, 또는 약 1 Bar의 압력 조건에서 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 저온진공의 전처리는 24시간 내지 72시간, 구체적으로 30시간 내지 60 시간, 보다 구체적으로 36 시간 내지 60시간, 보다 더 구체적으로 48시간 동안 수행될 수 있다.
식물 재료의 물리적, 화학적 특성에 따라 온도, 압력 및 시간 조건은 통상의 기술자에 의해 적절하게 조합될 수 있다. 예를 들어, 저온진공 전처리는 약 20 내지 약 60℃의 온도 및 약 -1 Bar 내지 약 1.5 Bar 범위의 압력에서 24시간 내지 72시간 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 저온진공 전처리는 약 30 내지 약 50℃의 온도 및 약 0.5 Bar 내지 약 1 Bar 범위의 압력에서 30시간 내지 60시간 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 저온진공 전처리는 약 40℃의 온도 및 약 1 Bar의 압력에서 48시간 동안 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, 식물 유래 세포외 소포체의 제조 방법은 (i) 전처리된 식물 재료로부터 추출물을 수득하는 단계; 및 (ii) 수득한 상기 추출물에서 세포외 소포체를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (i)의 추출물을 수득하는 단계는 전처리된 식물 재료를 착즙하는 단계를 포함할 수 있다. 착즙은 당 기술 분야에 알려진 임의의 착즙 방법이 사용될 수 있다. 예컨대, 착즙은 식물 재료를 착즙기에 넣고 저속 회전하는 스크류를 사용하여 수행될 수 있다. 회전 속도는 약 20 내지 약 100 rpm, 약 20 내지 약 50 rpm, 또는 약 30 내지 약 50 rpm, 또는 약 40 내지 45 rpm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 착즙 후 얻어진 결과물을 미세 타공망을 통과시켜 추출물을 수득할 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (ii)의 정제는 1회 이상의 접선유동여과를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 접선유동여과는 1회 내지 10회, 2회 내지 8회, 3회 내지 7회 또는 4회 내지 6회 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 수득된 추출물의 부피가 1/100 내지 1/25의 부피가 될 때까지 접선유동여과를 반복하여 수행할 수 있다.
일 구현예에서, 접선유동여과는 분자량 컷오프(Molecular weight cutoff; MWCO)가 약 100,000 Da(Dalton) 내지 약 500,000 Da인 TFF 필터를 이용하여 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, 단계 (ii)의 정제는, 접선유동여과를 수행하기 전에, 다공성 필터를 이용한 여과, 원심분리, 제균 여과 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단계 (ii)의 정제는, 접선유동여과를 수행하기 전에, 식물 추출물(예컨대, 식물 착즙 추출물)을 여과하여 고형물을 제거하고, 여과물을 원심분리하여 액포를 포함한 잔여물을 제거하고, 잔여물이 제거된 생성물을 재여과하는 것을 포함할 수 있다. 여과, 원심분리, 제균 여과 각각은 필요에 따라 1회 또는 수회 수행될 수 있다. 여과, 원심분리 및 제균 여과는 식물의 화학적, 물리적 성질에 따라 서로 순서를 바꾸어, 다양한 조합으로, 수행 조건(다공성 필터 크기, rpm 등)을 바꾸어 수행될 수 있다. 통상 제균 여과는 균의 제거가 목적이므로 마지막에 수행되는 것이 일반적이다.
여과 또는 재여과는 여과막 또는 필터를 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로 여과는 평균 기공 사이즈가 약 0.22 ㎛ 내지 5 ㎛인 기공을 포함하는 여과막 또는 필터로 수행될 수 있다. 여과 또는 재여과 단계는 여과물을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 착즙 추출물의 여과는 기공 사이즈가 약 0.22 ㎛, 약 0.45 ㎛, 약 0.65 ㎛, 약 0.8 ㎛, 약 1.5 ㎛, 약 3 ㎛ 또는 약 5 ㎛인 여과막 또는 필터를 사용할 수 있고, 잔여물이 제거된 생성물의 재여과는 기공 사이즈가 약 0.025 ㎛, 약 0.1 ㎛, 약 0.22 ㎛, 약 0.45 ㎛, 약 0.65 ㎛, 약 0.8 ㎛, 약 1.5 ㎛, 약 3 ㎛ 또는 약 5 ㎛인 여과막 또는 필터를 사용할 수 있으며, 여과 단계에서 사용되는 여과막 또는 필터의 기공 사이즈보다 재여과 단계에서 사용되는 여과막 또는 필터의 기공 사이즈가 더 작은 것이 바람직하다. 예를 들어, (착즙) 추출물의 여과 단계는 기공 사이즈가 약 0.45 ㎛인 여과막 또는 필터로 수행되고, 이후의 재여과 단계에서는 기공 사이즈가 약 0.22 ㎛인 여과막 또는 필터로 수행될 수 있다.
원심분리는 저속 원심분리(low-speed centrifugation), 고속 원심분리(high-speed centrifugation), 초원심분리(ultracentrifugation) 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있으며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 저속 원심분리는 약 6,000 rpm (6,000 xg) 이하의 속도를 낼 수 있고 주로 세포나 핵 등과 같이 쉽게 침전되는 시료의 원심 분리에 이용되고, 고속 원심분리는 최고속도가 약 20,000 내지 약 25,000 rpm (60,000 xg) 정도이며, 초원심분리는 최고속도가 약 40,000 내지 약 80,000 rpm (600,000 xg) 정도인 원심분리법을 의미한다. 일 실시예에서, 상기 원심분리는 고속 원심분리일 수 있다.
세포외 소포체는 접선유동여과를 통해 수득한 식물 추출물로부터 분리 및/또는 탈염될 수 있으며, TFF법 외에도 공지된 다른 분리/정제 방법이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 저온진공의 전처리를 포함한 제조방법에 의해 제조된 세포외 소포체는 하기 (1) 내지 (3)으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 가질 수 있다:
(1) 1 mL의 단위 부피당 약 5.0 X 107 개 입자 내지 약 2.0 X 1011 개 입자, 구체적으로 약 2.0 X 108 개 입자 내지 약 2.0 X 1011 개 입자, 약 7.0 x 108 개 내지 약 2.0 x 1011 개 입자, 또는 약 5.0 Х 107 개 내지 약 2.0 Х 1010 개 입자, 보다 더 구체적으로 약 2.0 X 108 개 입자 내지 약 2.0 X 1010 개 입자의 농도;
(2) 약 100 nm 내지 약 300 nm, 구체적으로 약 120 nm 내지 약 250 nm, 보다 구체적으로 약 135 nm 내지 약 220 nm, 보다 더 구체적으로 약 150 nm 내지 약 200 nm, 보다 더 구체적으로 약 150 nm 내지 약 190nm의 평균 입자 크기; 및
(3) 약 -15 mV 내지 약 -60 mV, 구체적으로 약 -20 mV 내지 약 -60 mV 또는 약 -15 mV 내지 약 -50 mV의 제타 전위.
본 명세서에 개시된 저온진공의 전처리를 포함한 제조방법에 의해 제조된 세포외 소포체는 유의미한 수준의 막 손상이 관찰되지 않는다. 또한, 본 명세서에 개시된 저온진공의 전처리를 포함한 제조방법에 의해 고순도 및 고농도의 세포외 소포체가 수득될 수 있다.
일 구현예에서, 식물 재료는 메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물일 수 있다. 상기 메밀속 식물, 쑥속 식물 또는 이들의 혼합물을 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 수득된 세포외 소포체는 다음 중 하나 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다: (i) 1 mL의 단위 부피당 약 7.0 x 108 개 내지 약 2.0 x 1011 개 입자의 농도; (ii) 약 135 nm 내지 약 220 nm의 평균 입자 크기; 및 (iii) 약 -20 mV 내지 약 -60 mV의 제타 전위.
다른 구현예에서, 식물 재료는 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화 또는 이들의 혼합물을 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 제조 방법에 의해 수득된 세포외 소포체는 다음 중 하나 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다: (i) 1 mL의 단위 부피당 약 5.0 Х 107 개 내지 약 2.0 Х 1010 개 입자의 농도; (ii) 약 135 nm 내지 약 220 nm의 평균 입자 크기; 및 (iii) 약 -15 mV 내지 약 -50 mV의 제타 전위.
다른 구현예에서, 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 방법은, 전처리 단계를 포함하지 않는 방법과 비교하여, 더 고농도의 세포외 소포체를 제조할 수 있다. 일 실시예에서, 전처리 단계를 포함하지 않는 방법으로 제조한 세포외 소포체에 비해, 저온진공 전처리를 포함하는 방법으로 제조한 세포외 소포체의 농도가 현저히 증가함을 확인하였다.
또 다른 구현예에서, 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 방법은, 전처리 단계를 포함하지 않는 방법과 비교하여, 더 고순도의 세포외 소포체를 제조할 수 있다. 일 실시예에서, 저온진공 전처리를 포함하는 방법에 따라 제조한 식물 추출물 유래 세포외 소포체는, TEM(투과전자현미경)을 통해 관찰한 결과, 추출된 세포외 소포체의 막에 손상이 없음을 확인하였다.
III. 식물 추출물 유래 세포외 소포체 및 이의 피부 상태 개선 용도
1. 메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물 유래 세포외 소포체
본 발명의 일 태양에 따르면, 메밀속(Fagopyrum) 식물 및 쑥속(Artemisia) 식물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물로부터 유래된 세포외 소포체가 제공된다.
일 구현예에서, 세포외 소포체는 식물 추출물로부터 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 착즙 추출물로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 메밀속 식물은 메밀일 수 있다. 구체적으로, 메밀은 메밀 새싹일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 구현예에서, 쑥속 식물은 개똥쑥일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
메밀속 식물 및 쑥속 식물은 플라보노이드가 풍부한 식물군으로 알려져 있으므로, 메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물을 편의상 플라보노이드 함유 식물로 지칭한다.
일 구현예에서, 메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물 추출물 유래 세포외 소포체는 상술한 "II. 세포외 소포체의 제조 방법"에 의해 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 플라보노이드 함유 식물(메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물) 유래 세포외 소포체는 약 7.0 X 108 개 입자/mL 내지 약 2.0 X 1011 개 입자/mL의 농도로 존재할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포외 소포체는 상술한 단계의 일부 또는 전부를 포함하는 방법에 의해 1 mL의 단위 부피당 약 7.0 X 108 개 입자 내지 약 2.0 X 1011 개 입자의 농도로 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, 1 mL의 단위 부피당 약 7.5 X 108 개 입자 내지 약 2.0 X 109 개 입자의 농도로 수득할 수 있다. 보다 더 구체적으로 약 7.0 X 109 개 내지 약 4.0 X 1010 개 입자 농도의 세포외 소포체를 수득할 수 있다. 상기 세포외 소포체의 농도는 목적하는 용도, 제형, 적용 대상, 적용 부위, 투여 경로 등에 따라 당업자에 의해 용이하게 변경/조절될 수 있으며, 이를 위해서는 고농도의 세포외 소포체를 얻는 것이 중요하다.
다른 구현예에서, 플라보노이드 함유 식물(메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물) 유래 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 약 135 nm 내지 약 220 nm일 수 있다. 바람직하게는, 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 약 150 nm 내지 약 200 nm일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 약 150 nm 내지 약 190 nm, 또는 약 160 nm 내지 약 195 nm일 수 있다. 보다 더욱 바람직하게는, 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 약 150 nm 내지 약 190 nm일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 플라보노이드 함유 식물(메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물) 유래 세포외 소포체는 제타 전위가 약 -20 mV 내지 약 -60 mV일 수 있다. 바람직하게는, 세포외 소포체는 제타 전위가 약 -30 mV 내지 약 -50 mV일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포외 소포체는 제타 전위가 약 -35 mV 내지 약 -45 mV일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 본 명세서에 개시되는 플라보노이드 함유 식물(메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물) 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물이 제공된다.
일 실시예에 따르면, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 본 명세서에 개시되는 플라보노이드 함유 식물 유래 세포외 소포체를 처리한 경우, 활성산소종(ROS)의 생성량이 크게 감소하였고, 이로써 항산화 효능이 우수함을 확인하였다. 또한, 마우스 멜라닌 세포인 B16-F1 세포에 본 명세서에 개시되는 플라보노이드 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체를 처리한 경우, 멜라닌 분비량 및 생성량이 현저하게 감소하였고, 이로써 미백 효능이 뛰어남을 확인하였다. 또한, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 본 명세서에 개시되는 플라보노이드 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체를 처리한 경우, 일산화질소(NO) 생성량 및 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 iNOS)의 발현이 크게 감소하여, 이로써 항염 효능이 우수함을 확인하였다(실시예 3 참조).
일 구현예에서, 피부 상태 개선은 피부 항산화, 피부 미백 및 피부 항염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명은 피부 항산화용 조성물, 피부 미백용 조성물 및/또는 피부 항염용 조성물을 제공할 수 있다. 구체적으로, 피부 항산화용 조성물은 피부 탄력 감소, 염증, 주름, 기미 및/또는 주근깨 생성 등을 포함하는 피부 노화의 예방 또는 개선에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부 미백용 조성물은 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 흑색종, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착 및 피부염에서 발생하는 색소 침착 등을 포함하는 피부 색소 침착 질환의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부 항염용 조성물은 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염으로 인한 염증, 화상, 화상으로 인한 염증, 상처, 상처로 인한 염증 등의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있다. 상술한 다양한 용도의 조성물은 후술하는 바와 같이 화장료 조성물, 약학 조성물, 의약외품 조성물, 식품 조성물에 이용될 수 있다.
다른 구현예에서, 세포외 소포체 또는 이를 포함하는 조성물은 활성산소종의 발생을 억제하는 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 세포외 소포체는 멜라닌 분비 또는 멜라닌 생성을 억제하는 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 세포외 소포체는 일산화질소의 생성을 억제하는 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 세포외 소포체는 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 염증성 사이토카인에는 IL-1β(Interleukin 1 beta), IL-6(Interleukin 6) 및 iNOS(inducible nitric oxide synthase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
IL-1β, IL-6 및 iNOS는 모두 염증성 사이토카인으로서, IL-1β는 숙주의 염증반응 매개자로서의 역할을 하고, IL-6는 선천면역과 적응면역 모두에서 기능을 하는 사이토카인이며, iNOS는 칼모듈린과 결합하여 많은 양의 일산화 질소(NO)의 생성에 관여한다.
(2) 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및/또는 홍화 추출물 유래 세포외 소포체
본 발명의 일 태양에 따르면, 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물로부터 유래된 세포외 소포체가 제공된다.
일 구현예에서, 세포외 소포체는 식물 추출물로부터 유래될 수 있고, 바람직하게는 식물 착즙 추출물로부터 유래될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화는 탄닌이 풍부한 식물로 알려져 있으므로, 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화 또는 이들의 조합을 편의상 탄닌 함유 식물로 지칭한다.
일부 구현예에서, 탄닌 함유 식물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화 또는 이들의 조합) 유래 세포외 소포체는 상술한 "II. 세포외 소포체 제조 방법"에 의해 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 탄닌 함유 식물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화 또는 이들의 조합) 유래 세포외 소포체는 약 5.0 Х 107 개 입자/mL 내지 약 3.0 Х 1010 개 입자/mL의 농도로 존재할 수 있다. 구체적으로, 세포외 소포체는 상술한 단계의 일부 또는 전부를 포함하는 방법에 의해 1 mL의 단위 부피당 약 약 5.0 Х 107 개 입자 내지 약 2.0 Х 1010 개 입자의 농도로 수득할 수 있다. 보다 구체적으로 약 2.0 Х 108개 입자 내지 약 2.0 Х 109 개 입자 농도의 세포외 소포체를 수득할 수 있다. 상기 세포외 소포체의 농도는 목적하는 용도, 제형, 적용 대상, 적용 부위, 투여 경로 등에 따라 당업자에 의해 용이하게 변경/조절될 수 있으며, 이를 위해서는 고농도의 세포외 소포체를 얻는 것이 중요하다.
다른 구현예에서, 탄닌 함유 식물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화 또는 이들의 조합) 유래 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 약 135 nm 내지 약 220 nm일 수 있다. 바람직하게는, 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 약 140 nm 내지 약 215 nm일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포외 소포체는 평균 입자 크기가 약 150 nm 내지 약 210 nm일 수 있다. 그러나, 상기 세포외 소포체의 평균 입자 크기는 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 탄닌 함유 식물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화 또는 이들의 조합) 유래 세포외 소포체는 제타 전위가 약 -15 mV 내지 약 -50 mV일 수 있다. 바람직하게는, 세포외 소포체는 제타 전위가 약 -20 mV 내지 약 -40 mV일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포외 소포체는 제타 전위가 약 -25 mV 내지 약 -35 mV일 수 있다. 그러나, 상기 세포외 소포체의 제타 전위는 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 탄닌 함유 식물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화 또는 이들의 조합) 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물이 제공된다.
일 실시예에 따르면, 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포에 본 발명의 탄닌 함유 식물 유래 세포외 소포체를 처리한 경우, COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자의 발현이 크게 증가하였고, 이로써 피부 주름 개선 효능이 우수함을 확인하였다. 또한, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 본 발명의 탄닌 함유 식물 유래 세포외 소포체를 처리한 경우, HAS2 및 CAS14 유전자의 발현이 크게 증가하였고, 이로써 피부 보습 효능이 우수함을 확인하였다. 또한, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 UVB 50 mJ/cm2을 조사한 후 본 발명의 탄닌 함유 식물 유래 세포외 소포체를 처리한 경우, 미토콘드리아 활성이 증가하였고, 이로써 피부 활력 증진 효능이 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).
일 구현예에서, 피부 상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 보습 및 피부 활력 증진으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 즉, 피부 주름 개선용 조성물, 피부 보습용 조성물 및/또는 피부 활력 증진용 조성물이 제공될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 피부 주름 개선용 조성물은 주름, 피부 탄력 감소 등을 포함하는 피부 노화의 예방 또는 개선에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부 보습용 조성물은 가려움 등의 피부 건조로 인한 증상의 예방 또는 개선에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 피부 활력 증진용 조성물은 피부에 생기를 주어 건강한 피부가 되게 할 수 있어서 피부 미용에 사용될 수 있다. 상술한 다양한 용도의 조성물은 후술하는 바와 같이 화장료 조성물, 약학 조성물, 의약외품 조성물, 식품 조성물의 분야에 이용될 수 있다.
다른 구현예에서, 세포외 소포체 또는 이를 포함하는 조성물은 주름 개선 관련 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 주름 개선 관련 유전자에는 COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. COL1A1 및 COL3A1은 각각 I형 콜라겐 및 III형 콜라겐을 발현하고, ELASTIN은 엘라스틴을 발현한다. 콜라겐 및 엘라스틴은 모두 피부 탄력을 증진시켜 피부 주름을 방지할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 세포외 소포체 또는 이를 포함하는 조성물은 피부 보습과 관련된 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 피부 보습과 관련된 유전자에는 HAS2 및 CAS14 중 하나 이상이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. HAS2는 히알루론산 합성효소를 발현하고, CAS14는 천연 보습 인자의 생성에 관여한다.
IV. 화장료 조성물
본 발명의 다른 태양에 따르면, 플라보노이드 함유 식물(메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물) 또는 탄닌 함유 식물(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화 또는 이들의 조합) 추출물 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명의 조성물은 피부 주름 개선, 피부 보습 및 피부 활력 증진 중 하나 이상을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분인 세포외 소포체 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 이러한 성분에는 예컨대 (추가적) 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및/또는 담체가 포함된다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀전, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 에멀전 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센셜 오일, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 오일, 식물성 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 사용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 에멀전인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 에멀전화제가 사용되고, 그 예로는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화장품의 구체적인 예로는 여성청결제, 손세정제, 세안크림, 세안폼, 클렌징크림, 클렌징밀크, 클렌징로션, 마사지크림, 콜드크림, 모이스처크림, 유액, 화장수, 팩, 에프터세이빙크림, 썬텐방지크림, 썬텐용 오일, 비누, 보디샴푸, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 양모료, 육모료, 헤어크림, 헤어리퀴드, 세트로션, 헤어 스프레이, 헤어브리지, 컬러린스, 컬러스프레이, 퍼머넌트웨이브액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도, 핸드 크림, 및 립스틱 등을 들 수 있다.
V. 약학 조성물/의약외품 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 플라보노이드 함유 식물(메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물) 또는 탄닌 함유 식물 (호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화, 또는 이들의 조합) 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
용어 "치료"는 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미한다. 이러한 효과는 질환 및/또는 이러한 질환으로 인한 유해 효과를 부분적으로 또는 완전히 치유하는 점에서 치료적 효과를 가진다. 바람직한 치료적 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 "치료"는 이미 나타난 질환 또는 장애의 의료적 개입을 의미할 수 있다.
용어 "예방"은 질병 또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 예방한다는 관점에서 목적하는 예방적인 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미한다.
일 구현예에서, 피부 질환은 염증성 피부 질환(예컨대, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염으로 인한 염증, 화상, 화상으로 인한 염증, 상처, 상처로 인한 염증 등), 피부 색소 침착 질환(예컨대, 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 흑색종, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착 및 피부염에서 발생하는 색소 침착 등) 또는 피부 건조증(예컨대, 건선, 소양증, 모공각화증, 두피건조증, 피부이완증 등)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 인간을 제외한 동물에 적용되는 경우에 수의학적 조성물이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제는 당업계에 통상적으로 사용되는 것일 수 있다. 담체, 부형제 또는 희석제로는, 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 이산화규소 등의 광물유 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
제제화할 경우에는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 첨가제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 제제화를 위한 첨가제는 약제 분야에서 통상 사용하는 것 중에서 적합한 것을 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 사용 방법에 따라 바람직한 형태로 제형화될 수 있으며, 특히 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화될 수 있다. 그러한 제형의 구체적인 예로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 캡슐제, 현탁제, 유제, 주사용액, 경고제(Plasters), 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 에어로졸제, 엑스제(Extracts), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 침제, 크림제, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 패치제 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 약학 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최신판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 또는 수의학적으로 유효한 양으로 투여된다. 용어 "약학적으로 유효한 양" 또는 "수의학적으로 유효한 양"은 의학적 또는 수의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자 또는 동물의 체중, 성별, 연령, 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 투여량은 1일 약 0.001 내지 약 50 mg/kg 또는 약 0.01 내지 약 10 mg/kg일 수 있지만, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 적용/투여하거나 다른 치료제와 병용하여 적용/투여될 수 있고 순차적 또는 동시에 적용/투여될 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 필요에 따라 단일 또는 다중 적용/투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이러한 양은 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 플라보노이드 함유 식물 (메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물) 또는 탄닌 함유 식물 (호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피, 홍화, 또는 이들의 조합) 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물이 제공된다.
용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병 또는 상태를 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미한다. 구체적으로, 약사법에 따른 의약외품은 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람/동물의 질병 또는 상태의 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다. 의약외품 조성물의 예로는 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스, 스프레이, 팩제, 코팅제, 청결제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물을 의약외품 조성물로 사용할 경우, 상기 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 증진 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
VI. 식품 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 플라보노이드 함유 식물(예컨대, 메밀속 식물 및/또는 쑥속 식물) 또는 탄닌 함유 식물(예컨대, 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화) 추출물 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 식품 조성물이 제공된다. 이러한 식품 조성물은 의료용 또는 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 식품 조성물을 포함한다.
용어 "의료용 식품" 또는 "뉴트라슈티컬 식품"은 인체에 유익한 기능을 할 가능성이 있는 원료 또는 성분으로 제조된 식품으로서, 정상적인 기능을 유지하거나 인체의 생리적 기능을 활성화함으로써 건강을 유지시키거나 개선시키는 식품을 지칭하고, 식품의약품안전처에 의해 규정되지만 이로 한정되지 않으며, 임의의 통상적인 건강 식품을 그 의미에서 배제하지 않는다.
식품에는 각종 식품류, 식품 첨가제, 음료(예를 들어, 기능성 음료, 천연 과일 주스 및 야채 음료), 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품, 기타 기능성 식품 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
식품은 당업계에 알려진 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 예컨대, 의료용 식품, 뉴트라슈티컬 식품 또는 건강기능식품은 피부 상태를 개선시킬 목적으로 세포외 소포체에 더하여 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 추가로 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형화될 수 있다. 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 통상의 기술자는 그 제형에 따라 적절한 성분을 조합하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 세포외 소포체의 유효 함량은 사용 형태 및 목적, 환자의 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 약 0.001 내지 약 99.9 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 50 중량% 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 식품의 섭취/투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 섭취/투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 약 10 내지 약 1000 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 섭취량/투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 섭취량/투여량이 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 건강기능식품의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없을 수 있으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것으로, 어떠한 방식으로든 이의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 제한하려는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
제법 1. 착즙 및 여과 방법
식물 시료 또는 식물 혼합물을 착즙기(HUROM, H-AF-EBF19A)에 넣고 착즙 및 여과하고, 여과물을 0.45 μm 필터(Millipore, Durapore PVDF Filter Cat. HVLP04700)를 이용하여 다시 여과한다. 추출한 여과물을 3,000 x g로 30분 및 10,000 x g로 60분간 원심 분리하여 액포를 포함한 파쇄 잔여물을 제거하고 상등액을 0.22 μm 필터(Millipore, Durapore PVDF Filter Cat. GVWP04700)로 제균 여과하여 세포외 소포체를 수득한다.
제법 2. 접선유동여과(TFF) 방법
세포외 소포체의 분리, 농축, 탈염 및/또는 버퍼교환(diafiltration)을 위해, 식물 시료 또는 식물 혼합물로부터 제법 1에 따라 수득된 세포외 소포체 조성물에 접선유동여과(Tangential Flow Filtration, TFF) 방법을 사용하여 추가로 여과한다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(GE Healthcare, cartridge filter) 또는 카세트 필터(Sartorius, cassette filter)를 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터는 다양한 분자량 컷오프(molecular weight cutoff, MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 세포외 소포체를 분리 및 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다. 추출물로부터 세포외 소포체를 분리 및 농축하기 위하여 MWCO 약 100,000 Da(Dalton) 내지 약 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. TFF 방법에 따라 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질을 제거하여 세포외 소포체를 수득하였다.
제법 3. 저온진공 전처리 방법
세포외 소포체의 제조 과정에서 세포외 소포체의 파괴를 최소화하기 위하여, 식물 시료 또는 식물 혼합물을 착즙 전에 저온진공기(㈜에스이씨)에 넣어 온도 약 40℃ 및 약 1 Bar 압력조건에서 약 48시간 동안 전처리 과정을 진행한다. 저온진공법(Low Temperature Pressure Squeeze, LTPS)은 추출 용해도 및 수분 복원력을 극적으로 증가시킬 수 있는 추출 방법이다. 본 실시예에서 사용된 저온진공기에 대한 상세한 설명은 한국등록특허 제10-1417655호를 참조할 수 있다.
제조예 A. 메밀 새싹 및 개똥쑥의 혼합물로부터 세포외 소포체의 제조
메밀 새싹(메밀속 식물) 및 개똥쑥(쑥속 식물)의 혼합물 유래 세포외 소포체를 제조하기 위하여 5월 내지 6월에 채취한 개똥쑥(고성 개똥쑥) 및 7월에 채취한 메밀 새싹(봉평 메밀 새싹) 시료를 구입 후 세척하여 준비하였다.
제조예 A-1
메밀 새싹 및 개똥쑥의 혼합물로부터 제법 1의 방법으로 착즙 및 여과하여 세포외 소포체를 수득하였다.
제조예 A-2
메밀 새싹 및 개똥쑥의 혼합물을 제법 1의 방법으로 착즙 및 여과하고 제법 2의 TFF 방법으로 정제하여 세포외 소포체를 수득하였다.
제조예 A-3
메밀 새싹 및 개똥쑥의 혼합물을 제법 3의 저온진공 방법으로 전처리한 후에 제법 1의 방법으로 착즙 및 여과하였다.
제조예 A-4
메밀 새싹 및 개똥쑥의 혼합물을 제법 3의 저온진공 방법으로 전처리한 후에 제법 1의 방법으로 착즙 및 여과하고 제법 2의 TFF 방법으로 정제하여 세포외 소포체를 수득하였다.
제조예 B. 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화의 혼합물로부터 세포외 소포체의 제조
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화의 혼합물로부터 세포외 소포체를 제조하기 위하여 호장근 50g, 커피콩 40g, 감나무잎 5g, 율피 4g, 홍화 1g을 혼합하여 준비하였다. 커피콩은 워너빈로스터리㈜의 베트남산 커피콩이고, 나머지는 한약재시장에서 구입하였다.
제조예 B-1
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화의 혼합물로부터 제법 1의 방법으로 착즙 및 여과하여 세포외 소포체를 수득하였다.
제조예 B-2
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화의 혼합물을 제법 1의 방법으로 착즙 및 여과하고 제법 2의 TFF 방법으로 정제하여 세포외 소포체를 수득하였다.
제조예 B-3
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화의 혼합물을 제법 3의 저온진공 방법으로 전처리한 후에 제법 1의 방법으로 착즙 및 여과하여 세포외 소포체를 수득하였다.
제조예 B-4
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화의 혼합물을 제법 3의 저온진공 방법으로 전처리한 후에 제법 1의 방법에 따라 착즙 및 여과하고 제법 2의 TFF 방법으로 정제하여 세포외 소포체를 수득하였다.
실시예 1. 세포외 소포체의 특성 분석: NTA 분석 및 투과전자현미경(TEM) 관찰
실시예 1.1. NTA 분석
상기 제조예 A 및 B에서 제조한 세포외 소포체 용액을 준비하고, 나노입자 추적 분석기(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA; Particle metrix)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 입자의 크기 분포 분석을 진행하였다.
표 1을 참조하면, 세포외 소포체의 NTA 분석 결과, 입자들의 평균 크기는 약 100 내지 300 nm로 분포되어 있었으며, 제법 1에 따라 제조한 세포외 소포체 용액과 비교하였을 때, 저온진공 전처리를 적용하여 제조한 세포외 소포체가 1 mL의 단위 부피당 세포외 소포체의 농도가 현저하게 상승하였음을 확인하였다. 특히, 제법 1과 비교하였을 때 저온진공 전처리 및 TFF 방법을 추가로 사용한 경우에, 세포외 소포체를 추출시 1 mL의 단위 부피당 최대 200배 이상 개선된 수율로 세포외 소포체를 제조할 수 있었다. 이를 통해, 저온진공 전처리를 진행하면 추출 용해도가 상승하여 고농도의 세포외 소포체를 분리할 수 있으며, 저온진공 전처리 및 TFF를 함께 진행하면, 현저히 높은 농도의 세포외 소포체를 제조할 수 있음이 증명되었다. 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조된 세포외 소포체의 크기 및 농도 그래프는 도 1a(제조예 A-4) 및 도 1b(제조예 B-4)에 도시하였다.
시료 세포외 소포체 농도(Particles/ml)
제법 1 제법 1 + 제법 3 제법 1 + 제법 2 + 제법 3
메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체 5.0 x 107
(제조예 A-1)		 8.0 x 108
(제조예 A-3)		 2.0 x 1010
(제조예 A-4)
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 세포외 소포체 3.0 x 106(제조예 B-1) 2.4 x 108
(제조예 B-3)		 1.6 x 109
(제조예 B-4)
또한, 저온진공 전처리를 진행하지 않고 TFF만 포함하는 방법에 따라 제조된 세포외 소포체와 저온진공 전처리 및 TFF를 모두 포함하는 방법에 따라 제조된 세포외 소포체의 특성을 비교 분석하기 위하여 세포외 소포체의 크기, 농도 및 제타 전위를 측정하였다.
제타 전위는 수용액 내 세포외 소포체의 분산 및 응집을 확인하기 위해 측정하였다. 수용액 내 분산되어 있는 콜로이드 입자는 표면 극성기의 해리 및 이온의 흡착에 의하여 전하를 나타내며, 입자들 간의 반발력의 정도가 콜로이드의 안정성을 평가하는 중요한 척도로 사용된다. 즉, 음(-) 또는 양(+)의 제타 전위 값이 크다면 입자들 간의 반발력이 크고 분산 안정성이 좋다고 볼 수 있고, 작으면 입자들 간의 인력이 크게 작용하여 응집력이 크다고 볼 수 있다.
제조예 A (메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체)의 경우에, 입자들의 평균 크기는 제조예 A-2의 세포외 소포체가 약 192.3 nm로 측정되고, 제조예 A-4의 세포외 소포체가 약 160.1 nm로 측정되었다. 1 mL의 단위 부피당 농도는 제조예 A-2의 세포외 소포체가 약 7.8 x 109 개로 측정되고, 제조예 A-4의 세포외 소포체가 약 2.0 x 1010 개의 농도로 측정되었다. 또한, 제타 전위 값은 제조예 A-2의 세포외 소포체가 약 -41.09 mV를 나타내었으며, 제조예 A-4의 세포외 소포체가 -35.95 mV를 나타내었다(표 2).
메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체
제법 평균 크기 농도(Particles/mL) 제타 전위
제조예 A-2 192.3 nm 7.8 x 109 -41.09 mV
제조예 A-4 160.1 nm 2.0 x 1010 -35.95 mV
제조예 B(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 유래 세포외 소포체)의 경우, 입자들의 평균 크기는 제조예 B-2의 세포외 소포체가 약 205.7 nm로 측정되었고, 제조예 B-4의 세포외 소포체가 151.8 nm로 측정되었다. 1 mL의 단위 부피당 농도는 제조예 B-2의 세포외 소포체가 약 6.0 x 108 개 및 제조예 B-4의 세포외 소포체가 약 1.6 x 109 개의 농도로 측정되었다. 또한, 제타 전위 값은 제조예 B-2의 세포외 소포체가 약 -34.16 mV로 측정되었고, 제조예 B-4의 세포외 소포체가 약 -29.18 mV를 측정되었다(표 3).
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 세포외 소포체
제법 평균 크기 농도(Particles/mL) 제타 전위
제조예 B-2 205.7 nm 6.0 x 108 -34.16 mV
제조예 B-4 151.8 nm 1.6 x 109 -29.18 mV
결과적으로, 저온진공 전처리 및 TFF를 모두 포함하는 방법에 따라 제조한 세포외 소포체는 저온진공 전처리 없이 제조한 세포외 소포체에 비해 약 2.6배(메밀 새싹 및 개똥쑥 유래) 또는 약 2.7배(호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화) 높은 농도로 수득되었다. 이로부터 저온진공 전처리의 도입으로 세포외 소포체의 제조 수율이 증가하였음을 확인하였다. 세포외 소포체의 크기 및 농도 그래프는 도 2a(제조예 A-2 및 A-4) 및 도 3a(제조예 B-2 및 B-4)에 도시하였으며, 제타 전위 그래프는 도 2b(제조예 A-2 및 A-4) 및 도 3b(제조예 B-2 및 B-4)에 도시하였다.
실시예 1.2. 투과전자현미경(TEM) 관찰
저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 세포외 소포체의 모양을 확인하기 위하여, 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)으로 세포외 소포체를 측정하였다. 도 2c(제조예 A-4) 및 도 3c(제조예 B-4)를 참조하면, 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 세포외 소포체는 막 손상이 없음이 확인되었다.
실시예 2. 식물 유래 세포외 소포체의 세포 독성 평가(제조예 A)
저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT 분석을 통하여 세포 생존율을 평가하였다. 먼저, 인간 각질세포주인 HaCaT(Cell Line Service, Cat. 300493), 마우스 멜라닌세포인 B16-F1(한국세포주은행, Cat. 80007) 및 대식세포주인 RAW 264.7 세포(한국세포주은행, Cat. 40071)를 24 웰 플레이트에 각각 7.5x105 cells/well, 8x105 cells/well 및 1.5x105 cells/well 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양을 위한 배지는 10% 소 태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) (Gibco, Cat. 12483-020) 및 1% 항생제(Antibiotics)(Corning, Cat. 30-004-CI)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Welgene, Cat. LM001-05) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 각 웰을 무혈청 배지(serum free medium)로 교체하고 세포외 소포체를 농도별로 처리하여 HaCaT 및 RAW 264.7 세포는 24시간 동안 배양하고, B16-F1세포는 72시간 동안 배양하였다. 다음, 배양액을 제거한 웰에 무혈청 배지를 이용하여 희석한 MTT 용액(0.1 mg/mL 농도) 500 μL를 분주한 후 4시간 동안 암반응하였다. 반응이 끝난 후, 반응액을 제거한 웰에 DMSO를 500 μL 분주하여 생성된 포르마잔(Formazan)을 녹여 흡광도 570 nm에서 측정하였다.
MTT 분석 결과, 도 4를 참조하면, HaCaT, B16-F1 및 RAW 264.7 세포에 세포외 소포체를 5.0E+07 particles/mL 농도에서부터 1.0E+09 particles/mL 농도까지 농도별로 확인한 결과, 세 가지 세포 모두 1.0E+09 particles/mL 농도에서부터 약 10% 이상의 세포 생존율 감소가 관찰되어 효능 실험 농도를 mL당 5.0E+08 개 입자의 농도까지 설정하여 실시예 3의 실험을 진행하였다.
실시예 3. 식물 유래 세포외 소포체의 효능 평가(제조예 A)
실시예 3.1. 항산화 효능 평가
저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체의 항산화 효능을 평가하기 위하여 인간 각질세포주인 HaCaT 세포를 96 웰 플레이트에 3x104 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포의 배양 배지는 소 태아혈청이 함유된 DMEM 배지를 사용하였다. 다음, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 강력한 항산화제로 알려져 있는 양성 대조군인 녹차추출물 EGCG(Epigallro Catechine Gallate) 및 세포외 소포체(제조예 A-4)를 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포외 소포체는 3가지 농도(1.0E+08, 2.5E+08 및 5.0E+08 particles/mL)로 처리하였다. 배양 후 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)을 염색하기 위하여 DCFDA(Sigma-Aldrich, D6883)를 처리하여 암반응하였고, 추가적으로 H2O2를 15분 동안 처리하여 ROS 생성을 유도하였다. 또한, 대조군으로 무처리(control)와 H2O2 만 처리한 웰을 준비하여 비교하였다. 모든 시료를 처리한 후, 형광 485/528 nm (excitation/emission) 파장에서 측정하였으며, 측정 결과는 다음의 계산식으로 산출하였다: (ROS 생성량/세포 생존율)x100.
그 결과, 표 4 및 도 5를 참조하면, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 H2O2를 처리한 결과 ROS 생성이 유도되었으며, 이는 아무것도 처리하지 않은 무처리 군과 비교했을 시 ROS 생성량이 증가한 것을 확인하였다. 반면, 세포외 소포체를 농도별로 처리한 결과, 세포외 소포체의 농도가 증가함에 따라 ROS 생성 감소 효과가 큰 것을 확인하였고, 5.0E+08 particles/ml 농도 처리 시 최대 57.36%의 ROS 생성 감소를 확인하였다. 이 결과는 강력한 항산화제인 EGCG와 비슷한 효능 수치였으므로, 메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체는 항산화 효과가 우수함을 검증하였다.
시료 농도 세포 생존율(%) ROS 생성량(%) 오차
무처리(Control) 102.1 78.75 6.89
H2O2 100 μM 100 100.00 10.17
H2O2 + 제조예 A-4 1.0E+08 Particles/mL 103.2 70.15 15.47
2.5E+08 Particles/mL 107.5 58.88 12.67
5.0E+08 Particles/mL 102.7 42.64 11.97
LPS + EGCG 2.5 μg/mL 110.2 47.24 15.85
실시예 3.2. 미백 효능 평가
메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체의 피부 미백 효능을 평가하기 위하여 마우스 멜라닌 세포인 B16-F1 세포를 6웰 플레이트에 1.5x105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포의 배양 배지는 소 태아혈청이 함유된 DMEM 배지를 사용하였다. 다음, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 멜라닌 생성 유도 물질인 α-MSH과 함께 세포외 소포체(제조예 A-4) 또는 미백 기능성 화장품의 원료인 알부틴(Arbutin)을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 세포외 소포체는 3가지 농도(1.0E+08, 2.5E+08 및 5.0E+08 particles/mL)로 처리하였다. 또한, 대조군으로 무처리와 α-MSH만 처리한 웰을 준비하여 비교하였다. 배양 후 배양액을 이용하여 흡광도 450 nm에서 멜라닌 분비량을 측정하였으며, 배양 세포를 수거한 후 1N NaOH를 이용하여 멜라닌을 녹여 멜라닌 생성량을 측정하였다. 멜라닌 분비량 또는 멜라닌 생성량에 관한 측정 결과는 다음의 계산식으로 산출하였다: (멜라닌 분비량/세포 생존율)x100 및 (멜라닌 생성량/세포 생존율)x100.
그 결과, 표 5 및 도 6을 참조하면, 마우스 멜라닌 세포주인 B16-F1 세포에 α-MSH를 처리한 결과 멜라닌 생성이 유도되었으며, 아무것도 처리하지 않은 무처리 군과 비교했을 시 멜라닌 생성량이 증가한 것을 확인하였다. 반면, 메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체(제조예 A-4)를 농도별로 처리한 결과, 세포외 소포체의 농도가 증가함에 따라 멜라닌 분비량 및 생성량의 감소 효과가 큰 것을 확인하였다. 특히, 세포외 소포체를 5.0E+08 particles/ml 농도로 처리 시 멜라닌 분비량은 최대 24.77% 감소하였으며(도 6a), 멜라닌 생성량은 최대 71.41% 감소하였다(도 6b). 이 결과는 미백 기능성 화장품의 원료인 알부틴과 비슷한 효능 수치였으므로, 메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체는 피부 미백 효과가 우수함을 검증하였다.
시료 농도 세포 생존율(%) 멜라닌 분비량 (%) 멜라닌 생성량 (%)
무처리 (Control) 93.00 63.87 37.37
α-MSH 100 nM 100.00 100.00 100.00
α-MSH + 제조예 A-4 1.0E+08 Particles/mL 98.49 82.61 76.28
2.5E+08 Particles/mL 101.84 78.92 53.86
5.0E+08 Particles/mL 106.72 75.23 28.59
α-MSH + 알부틴 2.5 μg/mL 102.35 74.92 44.41
실시예 3.3. 항염 효능 평가
일산화탄소(NO) 생성 억제 효능 평가
메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체의 항염증 효능을 평가하기 위하여 염증 유발에 관여하는 대표적인 세포 독성물질인 일산화질소(Nitric oxide, NO)의 생성량을 측정하였다. 먼저, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 24웰 플레이트에 5x105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포의 배양 배지는 소 태아혈청이 함유된 DMEM 배지를 사용하였다. 다음, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 염증 유발 환경을 조사하기 위하여 내독소로 알려진 LPS(Lipopolysaccharide)와 함께 세포외 소포체(제조예 A-4) 또는 양성 대조군인 인도메타신(Indomethacin)을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 세포외 소포체는 3가지 농도(1.0E+08, 2.5E+08 및 5.0E+08 particles/mL)로 처리하였다. 또한, 대조군으로 무처리와 LPS만 처리한 웰을 준비하여 비교하였다. 배양 후 각각의 배양액 100 μl와 Griess reagent solution 100 μl를 반응시키고 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 NO 생성량을 측정하였다. NO 생성량에 관한 측정 결과는 다음의 계산식으로 산출하였다: (NO 생성량/세포 생존율)x100.
그 결과, 표 6 및 도 7a를 참조하면, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 LPS를 처리한 결과 멜라닌 세포 내 염증발현 물질인 NO 생성이 유도되었으며, 아무것도 처리하지 않은 무처리 군과 비교했을 시 NO 생성량이 증가한 것을 확인하였다. 반면, 메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체(제조예 A-4)를 농도별로 처리한 결과, 세포외 소포체의 농도가 증가함에 따라 NO 생성량이 감소한 것을 확인하였다. 특히, 세포외 소포체를 5.0E+08 particles/ml 농도로 처리 시 NO 생성량은 최대 88.2% 감소하였다. 이 결과는 염증 생성을 억제하는 양성대조군인 인도메타신보다 훨씬 우수한 효능을 나타내었으므로, 메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체는 항염 효과가 우수함을 검증하였다.
시료 농도 세포 생존율(%) NO 생성량(%) 오차
무처리 (Control) 145.6 6.1 0.16
LPS 0.1 μg/mL 100 100.0 3.61
LPS + 제조예 A-4 1.0E+08 Particles/mL 114.1 70.1 3.79
2.5E+08 Particles/mL 119.2 34.9 0.16
5.0E+08 Particles/mL 121.6 11.8 0.28
LPS + 인도메타신 5 μg/mL 111.0 74.7 2.53
염증성 사이토카인 유전자 발현 억제 효능 평가
메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체의 항염증 효능 평가의 일환으로 염증성 사이토카인 유전자(IL-1β, IL-6 및 iNOS를 코딩하는 유전자)의 발현 억제 효능을 확인하였다. 먼저, 상술한 NO 생성 억제 효능을 확인한 RAW 264.7 세포에서 RNA를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다. 양성대조군 및 세포외 소포체가 처리된 세포는 PBS(Phosphate buffered saline)를 이용하여 세척한 후, 배양된 세포에 QIAzol®(QIAGEN, USA)를 처리하여 세포 용해(cell lysis)를 진행하였다. 분리된 RNA는 RNA 정량 키트(Qubit® fluorometer with RNA BR Assay kit)를 이용하여 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. cDNA의 합성은 cDNA 합성 키트(PCRBIOSYSTEMS(UK), qPCRBIO cDNA Synthesis Kit)를 사용하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR 키트(PCRBIOSYSTEMS(UK), 2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX)를 이용하여 500 ng의 cDNA를 최종 20 ul로 혼합물을 만들어 유전자를 증폭한 후 프라이머 서열(IL-1β Sense: TGGACCTTCCAGGATGAGGACA (SEQ ID NO: 1) 및 Antisense: GTTCATCTCGGAGCCTGTAGTG (SEQ ID NO: 2); IL-6 Sense: TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC (SEQ ID NO: 3) 및 Antisense: TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC (SEQ ID NO: 4); iNOS Sense: GAGACAGGGAAGTCTGAAGCAC (SEQ ID NO: 5) 및 Antisense: CCAGCAGTAGTTGCTCCTCTTC (SEQ ID NO: 6); 및 GAPDH Sense: CACCATCTTCCAGGAGCGAG (SEQ ID NO: 7) 및 Antisense: GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC (SEQ ID NO: 8), 서열은 모두 5'방향에서 3'방향으로 기재)을 이용하여 증폭산물을 정량 분석하였다. Real-time PCR 조건은 모두 95℃에서 5초 및 60℃에서 30초를 40 사이클로 진행하였다. 모든 키트를 사용한 실험은 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 진행하였다. 3 종의 염증성 사이토카인의 유전자 발현량 결과는 GAPDH의 mRNA 발현량을 기준으로 보정하였으며, (샘플 처리군/LPS만 처리한 군)x100의 비율로 계산하여 값을 나타내었다.
그 결과, 표 7 및 도 7b 내지 도 7d를 참조하면, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 LPS를 처리한 결과 멜라닌 세포 내 염증 발현 유전자인 IL-1β, IL-6 및 iNOS 유전자의 발현이 유도되었으며, 무처리 군과 비교했을 시 염증성 사이토카인의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 반면, 메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체(제조예 A-4)를 농도별로 처리한 결과, 세포외 소포체의 농도가 증가함에 따라 염증성 사이토카인의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 특히, 세포외 소포체를 5.0E+08 particles/ml 농도로 처리 시 각 염증성 사이토카인의 발현은 IL-1β가 최대 28.5%, IL-6가 최대 85.2% 및 iNOS가 최대 75.0% 감소하였다. 이 결과는 염증 생성을 억제하는 양성대조군인 인도메타신과 비슷하거나 훨씬 우수한 효능을 나타내었으므로, 메밀 새싹 및 개똥쑥 추출물 유래 세포외 소포체는 항염 효과가 우수함을 다시 한번 확인하였다.
시료 농도 유전자 발현량 (% of LPS)
IL-1β IL-6 iNOS
무처리 (Control) 0.04 0.15 2.92
LPS 0.1 μg/mL 100 100 100
LPS + 제조예 A-4 1.0E+08 Particles/mL 108.9 105.6 82.8
2.5E+08 Particles/mL 80.5 60.2 55.7
5.0E+08 Particles/mL 71.5 14.8 25.0
LPS + 인도메타신 5 μg/mL 61.4 38.1 66.1
실시예 4. 식물 유래 세포외 소포체의 세포 독성 평가(제조예 B)
저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한, 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 세포외 소포체의 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT 분석을 통하여 세포 생존율을 평가하였다. 먼저, 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포(입수처: American Type Culture Collection, Cat. CRL-2076) 및 인간 각질세포주인 HaCaT 세포(Cell Line Service, Cat. 300493GKD)를 24 웰 플레이트에 각각 1x105 cells/well 및 1.5x105 cells/well 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포 배양을 위한 배지는 CCD-1064SK 세포의 경우 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)(Gibco, Cat. 12483-020) 및 1% 항생제(입수처: Corning, Cat. 30-004-CI)가 함유된 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지를 사용하였고, HaCaT 세포의 경우 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)(Gibco, Cat. 12483-020) 및 1% 항생제(Corning, Cat. 30-004-CI)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Welgene, Cat. LM001-05) 배지를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 후, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 세포외 소포체(제조예 B-4)를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 다음, 배양액을 제거한 웰에 무혈청 배지를 이용하여 희석한 MTT 용액(0.1 mg/mL 농도) 500 μL를 분주한 후 4시간 동안 암반응시켰다. 반응이 끝난 후, 반응액을 제거한 웰에 DMSO를 500 μL 분주하여 생성된 포르마잔을 녹여 흡광도 570 nm에서 측정하였다.
MTT 분석 결과, 도 8을 참조하면, CCD-1064SK 세포와 HaCaT 세포에 세포외 소포체를 5.0E+07 particles/mL 농도에서부터 1.0E+09 particles/mL 농도까지 처리하여 농도별로 세포 생존율을 확인한 결과, 두 가지 세포 모두 1.0E+09 particles/mL 농도에서부터 약 10% 이상의 세포 생존율 감소가 관찰되어 효능 실험 농도를 mL당 5.0E+08 개 입자의 농도까지 설정하여 실시예 5의 실험을 진행하였다.
실시예 5. 식물 유래 세포외 소포체의 효능 평가(제조예 B)
실시예 5.1. 주름 개선 효능 평가
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 세포외 소포체의 주름 개선 효능을 확인하기 위하여 주름 개선 관련 유전자(COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN을 코딩하는 유전자)의 발현을 관찰하였다. 먼저, 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포를 24웰 플레이트에 5x105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포의 배양 배지는 소 태아혈청이 함유된 IMDM 배지를 사용하였다. 다음, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 세포외 소포체(제조예 B-4)와 양성 대조군인 아스코르브산(Ascorbic acid)을 처리하였다. 세포외 소포체는 3가지 농도(1.0E+08, 2.5E+08 및 5.0E+08 particles/mL)로 처리하였다. 24시간 추가 배양한 후, COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자 발현을 관찰하였다.
CCD-1064SK 세포에서 RNA를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다. 양성대조군 및 세포외 소포체가 처리된 세포는 PBS를 이용하여 세척한 후, 배양된 세포에 QIAzol®(QIAGEN, USA)를 처리하여 세포 용해를 진행하였다. 다음, 제조사에서 제공하는 프로토콜을 이용하여 RNA를 분리하였다.
분리된 RNA는 RNA 정량 키트(Qubit® fluorometer with RNA BR Assay kit)를 이용하여 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. cDNA의 합성은 cDNA 합성 키트(PCRBIOSYSTEMS(UK), qPCRBIO cDNA Synthesis Kit)를 사용하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR 키트(PCRBIOSYSTEMS(UK), 2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. Real-time PCR 조건은 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 30초를 40 사이클로 진행하였다. 모든 키트를 사용한 실험은 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 진행하였다. COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자 발현량 결과는 무처리군(Control)의 유전자 발현량을 기준으로 비율로 나타내었다.
그 결과, 표 8 및 도 9a 내지 도 9c를 참조하면, 인간 섬유아세포주인 CCD-1064SK 세포에 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 세포외 소포체(제조예 B-4)를 농도별로 처리한 결과, 세포외 소포체의 농도가 증가함에 따라 주름 개선 관련 유전자인 COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 특히, 세포외 소포체를 5.0E+08 particles/ml 농도로 처리 시 무처리군과 비교하여 COL1A1의 경우 최대 60.97%, COL3A1의 경우 최대 80.78% 그리고 ELASTIN의 경우 최대 266.56%까지 발현이 증가하였다. 이 결과는 양성대조군인 아스코르브산과 비교해 보아도 월등히 우수한 효능을 나타내므로, 제조예 B-4의 세포외 소포체는 뛰어난 피부 주름 개선 효능을 가짐을 알 수 있다.
시료 농도 유전자 발현량(% of control)
COL1A1 COL3A1 ELASTIN
무처리 (Control) 100.0 100.00 100.00
제조예 B-4 1.0E+08 Particles/mL 126.67 160.22 322.50
2.5E+08 Particles/mL 150.27 171.76 350.85
5.0E+08 Particles/mL 160.97 180.78 366.56
아스코르브산 100 μg/mL 113.88 106.07 168.54
실시예 5.2. 피부 보습 효능 평가
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 세포외 소포체의 피부 보습 효능을 확인하기 위하여, 피부 보습 관련 유전자(HAS2 및 CAS14를 코딩하는 유전자)의 발현을 관찰하였다. 먼저, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포를 6웰 플레이트에 5x105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포의 배양 배지는 소 태아혈청이 함유된 DMEM 배지를 사용하였다. 다음, 각 웰을 무혈청 배지로 교체하고 상기 세포외 소포체와 양성 대조군인 레티노산(Retinoic acid)을 처리하였다. 세포외 소포체는 3가지 농도(1.0E+08, 2.5E+08 및 5.0E+08 particles/mL)로 처리하였다. 24시간 추가 배양한 후, HAS2 및 CAS14 유전자 발현을 관찰하였다.
HaCaT 세포에서 RNA를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다. 양성대조군 및 세포외 소포체가 처리된 세포는 PBS를 이용하여 세척한 후, 배양된 세포에 QIAzol®(QIAGEN, USA)를 처리하여 세포 용해를 진행하였다. 다음, 제조사에서 제공하는 프로토콜을 이용하여 RNA를 분리하였다.
분리된 RNA는 RNA 정량 키트(Qubit® fluorometer with RNA BR Assay kit)를 이용하여 정량한 뒤 cDNA를 합성하여 Real-time PCR을 실시하였다. cDNA의 합성은 cDNA 합성 키트(PCRBIOSYSTEMS(UK), qPCRBIO cDNA Synthesis Kit)를 사용하였다. Real-time PCR은 Real-time PCR 키트(PCRBIOSYSTEMS(UK), 2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. Real-time PCR 조건은 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 30초를 40 사이클로 진행하였다. 모든 키트를 사용한 실험은 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 진행하였다. HAS2 및 CAS14 유전자 발현량 결과는 무처리군의 유전자 발현량을 기준으로 비율로 나타내었다.
그 결과, 표 9 및 도 10a와 도 10b를 참조하면, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포에 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 세포외 소포체(제조예 B-4)를 농도별로 처리한 결과, 세포외 소포체의 농도가 증가함에 따라 피부 보습 관련 유전자인 HAS2 및 CAS14 유전자의 발현이 증가한 것을 확인하였다. 특히, 세포외 소포체를 5.0E+08 particles/ml 농도로 처리 시 무처리군과 비교하여 HAS2의 경우 최대 74.9% 및 CAS14의 경우 최대 283.8%까지 발현이 증가하였다. 이 결과는 양성대조군인 레티노산과 비교해 보아도 월등히 우수한 효능을 나타내므로, 제조예 B-4의 세포외 소포체는 뛰어난 피부 보습 효능을 가짐을 알 수 있다.
시료 농도 유전자 발현량(% of control)
HAS2 CAS14
무처리(Control) 100.0 100.00
제조예 B-4 1.0E+08 Particles/mL 121.0 211.3
2.5E+08 Particles/mL 138.4 262.9
5.0E+08 Particles/mL 174.9 383.8
레티노산 1 μM 110.4 110.50
실시예 5.3. 피부 활력 증진 효능 평가
호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화 추출물 유래 세포외 소포체의 피부 활력 증진 평가를 위하여, JC-1 염색을 진행하여 미토콘드리아의 세포막 전위 변화를 검증하였다.
먼저, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포를 6웰 플레이트에 5x105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 세포의 배양 배지는 소 태아혈청이 함유된 DMEM 배지를 사용하였다. 다음, UVB 50 mJ/cm2을 조사하여 건조한 환경을 만들어주었다. 다음, 각 웰을 새로운 무혈청 배지로 교체하고 세포외 소포체(제조예 B-4)를 처리하였다. 세포외 소포체는 3가지 농도(1.0E+08, 2.5E+08 및 5.0E+08 particles/mL)로 처리하였다. 24시간 추가 배양한 후, HBSS를 이용하여 세척하였다. 다음, 무혈청 배지에 JC-1 염료를 희석하여 세포에 처리하고, 2시간 동안 37℃에서 암반응시켰다. 암반응 후, 염색된 세포를 형광 현미경을 통해 관찰하였다(도 11).
미토콘드리아의 상태가 건강한 경우, JC-1 염료를 이용한 염색을 통해 레드:그린(Red:Green)의 비가 1:1로 확인된다. 그러나, 미토콘드리아의 기능 장애를 유도할 수 있는 스트레스가 가해진 상태나 세포의 손상이 유도된 상태인 경우, 레드 형광 값이 현저하게 줄어들게 된다.
도 11을 참조하면, UVB 조사에 의한 세포 손상 시 레드형광이 줄어들고, 세포외 소포체 처리시 레드 형광이 다시 발광함을 확인하였다. 따라서, 제법 저온진공 전처리 및 TFF를 포함하는 방법에 따라 제조한 세포외 소포체는 피부 세포의 미토콘드리아의 활성을 증가시킴으로 피부 활력 증진 효능이 있음을 알 수 있다.

Claims (33)

  1. 식물 재료를 저온진공으로 전처리하는 단계를 포함하는 식물 유래 세포외 소포체(extracellular vesicles)의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 저온진공으로 전처리하는 단계는 약 20 내지 약 65℃의 온도 조건에서 수행되는
    제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 저온진공으로 전처리하는 단계는 약 -1 Bar 내지 약 2 Bar 범위의 압력 조건에서 수행되는
    제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 저온진공으로 전처리하는 단계는 약 20 내지 약 65℃의 온도 조건 및 약 -1 Bar 내지 약 2 Bar 범위의 압력 조건에서 수행되는
    제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 저온진공으로 전처리하는 단계는 24 내지 72시간 동안 수행되는
    제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 (i) 상기 전처리된 식물 재료로부터 추출물을 수득하는 단계; 및 (ii) 상기 수득된 추출물에서 세포외 소포체를 정제하는 단계를 추가로 포함하는
    제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (i)의 추출물을 수득하는 단계는 전처리된 식물 재료를 착즙하는 단계를 포함하는
    제조 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (ii)의 정제는 1회 이상의 접선유동여과(tangential-flow filtration, TFF)를 포함하는
    제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단계 (ii)의 정제는 다공성 필터를 이용한 여과를 포함하고, 상기 다공성 필터를 이용한 여과는 상기 1회 이상의 접선유동여과 전에 수행되는
    제조 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 단계 (ii)의 정제는 다공성 필터를 이용한 여과, 원심 분리 및 제균 여과를 포함하고, 상기 여과, 원심 분리 및 제균 여과는 상기 1회 이상의 접선유동여과 전에 수행되는
    제조 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 수득된 추출물의 부피가 1/100 내지 1/25의 부피가 될 때까지 1회 이상의 접선유동여과를 수행하는
    제조 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 접선유동여과는 분자량 컷오프(Molecular weight cutoff; MWCO)가 약 100,000 Da(Dalton) 내지 약 500,000 Da인 TFF 필터를 이용하는
    제조 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 세포외 소포체는 하기 (1) 내지 (3)으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 갖는 제조 방법:
    (1) 1 mL의 단위 부피당 약 5.0 X 107 개 입자 내지 약 2.0 X 1011 개 입자의 농도;
    (2) 약 100 nm 내지 약 300 nm의 평균 입자 크기; 및
    (3) 약 -15 mV 내지 약 -60 mV의 제타 전위.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 방법에 의해 제조된 세포외 소포체의 유의미한 수준의 막 손상이 없는
    제조 방법.
  15. 메밀속(Fagopyrum) 식물 및 쑥속(Artemisia) 식물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물로부터 유래된 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는
    피부 상태 개선용 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 세포외 소포체는 상기 식물의 착즙 추출물로부터 유래된 것인
    피부 상태 개선용 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 메밀속 식물은 메밀 또는 이의 새싹인
    피부 상태 개선용 조성물.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 쑥속 식물은 개똥쑥인
    피부 상태 개선용 조성물.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 세포외 소포체는
    (i) 메밀속 식물 및 쑥속 식물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물을 저온진공으로 전처리하는 단계;
    (ii) 전처리된 식물로부터 추출물을 수득하는 단계; 및
    (iii) 수득된 추출물에서 세포외 소포체를 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 것인
    피부 상태 개선용 조성물.
  20. 제15항에 있어서,
    상기 세포외 소포체는 하기 (1) 내지 (3)으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 갖는, 피부 상태 개선용 조성물:
    (1) 1 mL의 단위 부피당 약 7.0 Х 108 개 입자 내지 약 2.0 X 1011 개 입자의 농도;
    (2) 약 135 nm 내지 약 220 nm의 평균 입자 크기; 및
    (3) 약 -20 mV 내지 약 -60 mV의 제타 전위.
  21. 제15항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선은 피부 항산화, 피부 미백 및 피부 항염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는
    피부 상태 개선용 조성물.
  22. 제15항에 있어서,
    상기 세포외 소포체는 하기 (1) 내지 (4)로부터 선택된 하나 이상의 활성을 갖는, 피부 상태 개선용 조성물:
    (1) 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성의 억제;
    (2) 멜라닌 분비 또는 멜라닌 생성의 억제;
    (3) 일산화질소(Nitric oxide, NO) 생성의 억제; 및
    (4) 염증성 사이토카인 발현의 억제.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 염증성 사이토카인은 IL-1β, IL-6 및 iNOS로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인
    피부 상태 개선용 조성물.
  24. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 화장료 조성물인
    조성물.
  25. 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 약학 조성물인
    조성물.
  26. 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물로부터 유래된 세포외 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는
    피부 상태 개선용 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 세포외 소포체는 상기 식물의 착즙 추출물로부터 유래된 것인
    피부 상태 개선용 조성물.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 세포외 소포체는
    (i) 호장근, 커피콩, 감나무잎, 율피 및 홍화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물을 저온진공으로 전처리하는 단계;
    (ii) 전처리된 식물로부터 추출물을 수득하는 단계; 및
    (iii) 수득된 추출물에서 세포외 소포체를 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 것인
    피부 상태 개선용 조성물.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 세포외 소포체는 하기 (1) 내지 (3)으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 갖는, 피부 상태 개선용 조성물:
    (1) 1 mL의 단위 부피당 약 5.0 Х 107 개 입자 내지 약 2.0 X 1010 개 입자의 농도;
    (2) 약 135 nm 내지 약 220 nm의 평균 입자 크기; 및
    (3) 약 -15 mV 내지 약 -50 mV의 제타 전위.
  30. 제26항에 있어서,
    상기 피부 상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 보습 및 피부 활력 증진으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는
    피부 상태 개선용 조성물.
  31. 제26항에 있어서,
    상기 세포외 소포체는 피부 세포에서 하기 (1) 내지 (3)으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 갖는, 피부 상태 개선용 조성물:
    (1) COL1A1, COL3A1 및 ELASTIN 유전자 중 하나 이상의 발현 증가;
    (2) HAS2 및 CAS14 유전자 중 하나 이상의 발현 증가; 및
    (3) 미토콘드리아의 활성 증가.
  32. 제26항에 있어서,
    상기 조성물은 화장료 조성물인
    조성물.
  33. 제26항에 있어서,
    상기 조성물은 약학 조성물인
    조성물.
PCT/KR2023/021601 2022-12-26 2023-12-26 식물 유래 세포외 소포체의 제조방법 및 이의 용도 WO2024144218A1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020220185063A KR102646353B1 (ko) 2022-12-26 2022-12-26 플라보노이드 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체 및 이의 피부 상태 개선 용도
KR10-2022-0185063 2022-12-26
KR1020220185422A KR102646357B1 (ko) 2022-12-27 2022-12-27 탄닌 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체 및 이의 피부 상태 개선 용도
KR10-2022-0185422 2022-12-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024144218A1 true WO2024144218A1 (ko) 2024-07-04

Family

ID=91718408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2023/021601 WO2024144218A1 (ko) 2022-12-26 2023-12-26 식물 유래 세포외 소포체의 제조방법 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024144218A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150102362A (ko) * 2014-02-28 2015-09-07 (주)라누베 파상된 산양산삼으로부터 최대함량 진세노사이드 추출방법
KR20170037380A (ko) * 2015-09-25 2017-04-04 (주)프로스테믹스 식물 착즙물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 개선 및 탈모 방지용 조성물
KR20220019228A (ko) * 2020-08-07 2022-02-16 주식회사 엑소스템텍 브로콜리 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 항노화, 항산화 화장료 조성물 및 이를 포함하는 기능성 화장품

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150102362A (ko) * 2014-02-28 2015-09-07 (주)라누베 파상된 산양산삼으로부터 최대함량 진세노사이드 추출방법
KR20170037380A (ko) * 2015-09-25 2017-04-04 (주)프로스테믹스 식물 착즙물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 개선 및 탈모 방지용 조성물
KR20220019228A (ko) * 2020-08-07 2022-02-16 주식회사 엑소스템텍 브로콜리 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 항노화, 항산화 화장료 조성물 및 이를 포함하는 기능성 화장품

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKVILĖ VIRŠILĖ, GIEDRĖ SAMUOLIENĖ, KRISTINA LAUŽIKĖ, EMILIJA ŠIPAILAITĖ, ZBIGNIEV BALION. AISTĖ JEKABSONE: "Species-Specific Plant-Derived Nanoparticle Characteristics", PLANTS, MDPI AG, vol. 11, no. 22, 16 November 2022 (2022-11-16), pages 3139, XP093163275, ISSN: 2223-7747, DOI: 10.3390/plants11223139 *
JUNG SO YOUNG, KANG HAE-RAN, YOO HAN JUN, CHOI HYEONG, HEO HYOJIN, CHA BYUNGSUN, BRITO SOFIA, LEE SO MIN, YEO HYE LIM, KANG SEO JE: "Application of Nanoparticles Derived from Artemisia princeps for Cosmetic Products", JOURNAL OF THE SOCIETY OF COSMETIC SCIENTISTS OF KOREA, SOCIETY OF COSMETIC SCIENTISTS OF KOREA, KOREA, vol. 47, no. 3, 1 September 2021 (2021-09-01), Korea , pages 265 - 271, XP093115400, ISSN: 1226-2587, DOI: 10.15230/SCSK.2021.47.3.265 *
LEE BO-MI , GYEONG-ROK LEE, SEUNG-BIN KWON, JI-HYUN KIM, JEONG-YEON YOON, SOO-YEON KIM, YU-NA LEE, GYU-JUNG AHN, KYEONG-JA JANG: "The Safety and Human Efficacy Evaluation of Cosmetics Containing Extracts of Diospyros kaki, Castanea crenata, and Polygonum cuspidatum.", ASIAN JOURNAL OF BEAUTY AND COSMETOLOGY, KOREA DERMATOLOGICAL RESEARCH INSTITUTE, vol. 12, no. 3, 1 June 2014 (2014-06-01), pages 361 - 370, XP093187536, ISSN: 2466-2046 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017052267A1 (ko) 식물 착즙물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 개선 및 탈모 방지용 조성물
WO2021137677A1 (ko) 식물 추출물을 함유하는 조성물
WO2022065774A1 (ko) 식물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법
WO2013019049A1 (ko) 스테비올 배당체 또는 감초, 및 난용성 물질을 포함하는 복합체
WO2020218781A1 (ko) 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물
WO2019098468A1 (ko) 양태반 분말과 식물의 복합물을 함유하는 피부 미백용, 피부 보습용 또는 피부주름 개선용 식품 또는 화장료 조성물
WO2017146414A1 (ko) α-테르피네올을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 피부 주름 개선용 조성물
WO2017111211A1 (ko) 톱니모자반 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물
WO2024181725A1 (ko) 홍국균으로 발효시킨 적색 병풀 및 이의 용도
KR101908077B1 (ko) 천연 한방 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백, 피부 노화 방지 또는 피부 주름 개선용 조성물
WO2014168433A2 (ko) 발모 및 흰머리 멜라닌 색소 재생과 피부 재생 촉진용 물질 조성물
WO2024181633A1 (ko) 몰로키아 추출물과 민들레 및 보리 복합 추출물을 포함하는 팽창선조 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2022085858A1 (ko) 황칠 추출물을 포함하는 미백 또는 주름 개선용 조성물
WO2018186641A1 (ko) 피페로날 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선, 보습, 탄력증진, 각질제거, 홍반억제 또는 피부광노화 개선용 조성물
WO2024144218A1 (ko) 식물 유래 세포외 소포체의 제조방법 및 이의 용도
WO2017142265A1 (ko) 아디프산을 유효성분으로 함유하는 피부주름개선 및 피부탄력증진용 조성물
WO2020032296A1 (ko) 기능성 조성물
WO2019168348A1 (ko) 탈모 치료 및 발모 촉진용 조성물
KR102264006B1 (ko) 멜라닌 생성 억제 및 분해 촉진용 조성물
JP2004352697A (ja) チロシナーゼ発現抑制剤
WO2013024960A1 (ko) 멀꿀 추출물을 포함하는 의약 조성물
WO2021002642A1 (ko) 뱀독을 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2020040621A1 (ko) 인간지방줄기세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물
WO2016175559A2 (ko) 지모와 두릅의 복합 추출물을 함유하는 탈모 방지 및 발모 개선용 조성물
KR102646353B1 (ko) 플라보노이드 함유 식물 추출물 유래 세포외 소포체 및 이의 피부 상태 개선 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23912893

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1