WO2024117274A1 - 유전자 전달 복합체 - Google Patents

유전자 전달 복합체 Download PDF

Info

Publication number
WO2024117274A1
WO2024117274A1 PCT/KR2022/018959 KR2022018959W WO2024117274A1 WO 2024117274 A1 WO2024117274 A1 WO 2024117274A1 KR 2022018959 W KR2022018959 W KR 2022018959W WO 2024117274 A1 WO2024117274 A1 WO 2024117274A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
kda
gelatin
gene
biocompatible material
gene transfer
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/018959
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
임주섭
김신준
호콩트룩
김성렬
Original Assignee
주식회사 피엘마이크로메드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 피엘마이크로메드 filed Critical 주식회사 피엘마이크로메드
Priority to PCT/KR2022/018959 priority Critical patent/WO2024117274A1/ko
Publication of WO2024117274A1 publication Critical patent/WO2024117274A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles

Definitions

  • the present application relates to gene transfer complexes and pharmaceutical compositions containing the same.
  • Gene therapy refers to treating or preventing disease by delivering a therapeutic gene to a desired organ in the body and causing new proteins to be expressed within the cells.
  • Gene therapy includes methods such as replacing a defective gene in a cell with a normal gene, inserting a new gene to give the body a new function, or controlling the function of an overactive or underactive gene.
  • This gene therapy can have excellent selectivity compared to treatment with general drugs and can be applied for a long period of time by improving the cure rate and speed of diseases that are difficult to control with other treatments.
  • a gene carrier is a vehicle needed to introduce a desired therapeutic gene into target cells.
  • An ideal gene carrier should be harmless to the human body, easy to mass produce, and efficiently deliver genes.
  • Viral gene delivery systems including retrovirus (RV), adenovirus (AV), and complex with adenovirus (AAV), are excellent in terms of expression rate and persistence, but safety due to immune response has been pointed out as a problem.
  • Non-viral gene carriers are mainly composed of cationic lipids or polymers, which form a complex with anionic DNA through ionic bonding and are delivered into cells.
  • Non-viral gene delivery vehicles such as cationic liposomes have advantages such as biodegradability, low toxicity, non-immunogenicity, and ease of use compared to viral delivery vehicles, but have the disadvantage of lower gene transfer efficiency compared to viral delivery vehicles. there is.
  • lipid carriers among non-viral gene delivery technologies, efforts have been made to use liposomes as gene carriers.
  • the conditions for a lipid carrier are that the anionic DNA and the cationic liposome must spontaneously form electrostatic bonds for effective condensation, and the liposome/DNA complex as a whole must be cationic so that it can easily reach the anionic cell surface.
  • the liposome must have fusogenic properties that can melt and destabilize the cytoplasmic membrane to allow DNA to enter the cell.
  • the most important thing in lipid delivery vehicles is to select effective cationic lipids and create a combination with excellent transfection rate.
  • DOTMA and DOTAP which have been extensively studied so far, are the most widely used cationic lipids and are amphiphilic lipids with two chains in which an acyl chain is bonded to a propyl ammonium group.
  • lipid complexes in order to achieve high expression rates, many efforts are being made to combine fusogenic groups that help endosomal escape or ligands that cause receptor mediated endocytosis. .
  • DNA must be successfully transported to the desired target cell without being degraded, and upon reaching the target cell, it must be efficiently endocytized into the cell, and decomposed within the cell by decomposition enzymes present in endosomes or lysosomes. It must safely penetrate the nuclear membrane and enter the nucleus.
  • anionic alginate, cationic chitosan, and cationic carboxymethylcellulose When delivering genes using porous gelatin sponge, anionic alginate, cationic chitosan, and cationic carboxymethylcellulose (CMC), it is more efficient to reach the vascular system of the lesion tissue when injected through the body's vascular tissue and lymphatic vessels.
  • gelatin sponges have a long retention period, and alginate, cationic chitosan, and cationic CMC do not have enzymes to decompose in the body, so side effects such as vascular occlusion, vasoconstriction, and inflammatory reactions due to immune reactions have been reported, making them difficult to use clinically in blood vessels.
  • the present application seeks to provide a gene delivery complex and a pharmaceutical composition containing the same.
  • a first aspect of the disclosure is a gene delivery complex comprising gelatin, a cationic biocompatible material, and an anionic biocompatible material, wherein the gelatin, the cationic biocompatible material, and the anionic biocompatible material are cross-linked to each other.
  • a gene transfer complex that is.
  • a second aspect of the present application provides a pharmaceutical composition comprising the gene transfer complex according to the first aspect of the present application.
  • the gene delivery complex includes gelatin, a biocompatible material, a cationic biocompatible material cross-linked to the gelatin, and an anionic biocompatible material, and contains a gene consisting of a conventional cationic material alone.
  • it reduces cytotoxicity, reduces non-specific binding to blood constituents, exhibits improved gene transfer effects selectively to organs and tissues through blood vessels, and remains in the body for about 30 minutes to about 48 hours at the lesion site. Since it is stored in the body and absorbed into the body without side effects such as inflammatory reaction or vascular occlusion due to antigen-antibody reaction, it can be used as a new gene delivery complex with improved performance.
  • the gene delivery complex according to the embodiments of the present application includes gelatin, a cationic biocompatible material, and an anionic biocompatible material that have been reduced to low molecules by a subcritical water decomposition process, and is easily absorbed in the body and has low toxicity. There is.
  • the gelatin included in the gene delivery complex according to the embodiments of the present application includes a first gelatin and a second gelatin having different molecular weights, and thus has the characteristics of being easily absorbed in the body and having low toxicity.
  • the gene delivery complex according to the embodiments of the present application includes a first gelatin and a second gelatin with different average molecular weights that have been reduced to low molecules through a subcritical water digestion process, and thus has the characteristics of being easily absorbed in the body and having low toxicity.
  • the gene delivery complex according to embodiments of the present application is a cross-linking of a cationic biocompatible material and an anionic biocompatible material capable of reducing the surface charge of the gene delivery complex to gelatin, and includes gelatin, a cationic biocompatible material, and By appropriately adjusting the weight ratio of anionic biocompatible materials, the surface charge is controlled and gene transfer efficiency is improved.
  • the gene delivery complex according to embodiments of the present application can be adjusted to an optimal size that can be selectively used in blood vessels of lesional tissue through microconduits.
  • the gene delivery complex according to the embodiments of the present application is characterized by reduced cytotoxicity by using genipin, which minimizes cytotoxicity, as a cross-linking agent.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing cross-linking of gelatin and genipin in one embodiment of the present application.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing a gene delivery complex in which the charge amount is adjusted through cross-linking of gelatin, chitosan, and fucoidan, according to one embodiment of the present application.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing a gene transfer complex in which a gene transfer complex and a gene are bound, in one embodiment of the present application.
  • Figure 4 is a photograph of gene delivery complex particles according to an example of the present application.
  • Figure 5 is a scanning electron micrograph of microparticles of the gene delivery complex according to an example of the present application.
  • Figure 6 is an FT-IR graph of the gene delivery complex and each raw material (gelatin, fucoidan, chitosan, and genipin) in an example of the present application.
  • 7A to F are graphs of the zeta-potential distribution of the gene transfer complex, according to an example of the present application.
  • step of or “step of” as used throughout the specification herein do not mean “step for.”
  • the term "combination(s) thereof" included in the Markushi format expression means a mixture or combination of one or more selected from the group consisting of the components described in the Markushi format expression, It means containing one or more selected from the group consisting of the above components.
  • average molecular weight means “weight average molecular weight.”
  • a first aspect of the disclosure is a gene delivery complex comprising gelatin, a cationic biocompatible material, and an anionic biocompatible material, wherein the gelatin, the cationic biocompatible material, and the anionic biocompatible material are cross-linked to each other.
  • a gene transfer complex to which the gene transfer complex is bound.
  • the cationic biocompatible material and the anionic biocompatible material may be cross-linked to the gelatin. In one embodiment of the present application, the cationic biocompatible material and the anionic biocompatible material may be cross-linked at the point where the gelatin is cross-linked, as shown in FIG. 1.
  • the gelatin is a low-molecular gelatin, and the average molecular weight of the gelatin may be about 5 kDa to about 40 kDa. In one embodiment of the present application, the gelatin is a low-molecular gelatin, and the average molecular weight of the gelatin is about 5 kDa to about 40 kDa, about 5 kDa to about 35 kDa, about 5 kDa to about 30 kDa, about 5 kDa.
  • the gelatin includes a first gelatin and a second gelatin, and the average molecular weight of the first gelatin may be about 25 kDa to about 50 kDa, and the average molecular weight of the second gelatin is It may be about 1.5 kDa to about 10 kDa.
  • the gelatin may be a cross-linked product of first gelatin and second gelatin.
  • the average molecular weight of the first gelatin can be from about 25 kDa to about 50 kDa, from about 25 kDa to about 45 kDa, from about 25 kDa to about 40 kDa, from about 25 kDa to about 35 kDa, from about 25 kDa to about 30 kDa.
  • kDa about 30 kDa to about 50 kDa, about 30 kDa to about 45 kDa, about 30 kDa to about 40 kDa, about 30 kDa to about 35 kDa, about 35 kDa to about 50 kDa, about 35 kDa to about 45 kDa, It may be about 35 kDa to about 40 kDa, about 40 kDa to about 50 kDa, or about 40 kDa to about 45 kDa.
  • the average molecular weight of the second gelatin may be from about 1.5 kDa to about 10 kDa, from about 1.5 kDa to about 8 kDa, from about 1.5 kDa to about 6 kDa, from about 1.5 kDa to about 5 kDa, from about 1.5 kDa to About 4 kDa, about 1.5 kDa to about 3 kDa, about 2 kDa to about 10 kDa, about 2 kDa to about 8 kDa, about 2 kDa to about 6 kDa, about 2 kDa to about 5 kDa, about 2 kDa to about 4 kDa, about 2 kDa to about 3 kDa, about 2.5 kDa to about 10 kDa, about 2.5 kDa to about 8 kDa, about 2.5 kDa to about 6 kDa, about 2.5 kDa to about 5 kDa, about 2.5 kDa to about to about 3
  • the gelatin may be a cross-linked product of the first gelatin and the second gelatin reduced to low molecular weight by a subcritical water decomposition process.
  • the gene delivery complex may include the first gelatin, the second gelatin, the cationic biocompatible material, and the anionic biocompatible material cross-linked to each other.
  • the gene transfer complex may be a multi-gene transfer complex capable of delivering several types of genes separately or simultaneously, and may be in the form of spherical particles, but may not be limited thereto.
  • the gelatin may be in a porous form and may serve as a carrier containing genes.
  • the cationic biocompatible material may include chitosan and/or oligochitosan, but may not be limited thereto.
  • the chitosan and/or oligochitosan may include deacetylated and carboxymethylated chitosan, but may not be limited thereto.
  • the deacetylated and carboxymethylated chitosan may be decomposed in an acidity range of about pH 5 to about pH 7, but may not be limited thereto.
  • the anionic biocompatible material may include one or more selected from fucoidan, sulfonated polysaccharide, and carginan, but may not be limited thereto.
  • the crosslinking is genipin; Tannins selected from tannin, gallic acid, tannic acid, or proanthocyanidin; It may be formed by a cross-linking agent selected from polyphenols selected from catechin, epicatechin, epicatechin gallate, quercetin, resveratrol, isoflavones, flavonoids, and polyphenols derived from seaweed, but may not be limited thereto. In one embodiment of the present application, the cross-linking agent may have low cytotoxicity.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing cross-linking of the gelatin and the genipin, and in one embodiment of the present application, the gelatin may be cross-linked by a cross-linking agent such as the genipin. .
  • the cross-linking rate may increase as the content of the cross-linking agent added during production of the gene transfer complex increases.
  • the gene delivery complex may be a spherical particle, but may not be limited thereto.
  • the gene delivery complex may include a cross-link between the gelatin, a cross-link between the gelatin and the cationic biocompatible material, and a cross-link between the gelatin and the anionic biocompatible material.
  • the total crosslinking rate of the crosslinking may be about 30% to about 70%.
  • the average molecular weight of the anionic biocompatible material is about 5 kDa to about 20 kDa, about 5 kDa to about 15 kDa, about 5 kDa to about 10 kDa, about 10 kDa to about 20 kDa, It may be, but is not limited to, about 10 kDa to about 15 kDa, or about 15 kDa to about 20 kDa.
  • the gelatin, the cationic biocompatible material, and the anionic biocompatible material may each be of low molecular weight, but may not be limited thereto.
  • the gelatin, the cationic biocompatible material, and the anionic biocompatible material are each processed by subcritical water decomposition process, hydrothermal treatment, enzyme treatment, acid/base hydrolysis treatment, or ultrasonic treatment. It may be reduced to a low molecule.
  • the gelatin, the cationic biocompatible material, and the anionic biocompatible material have low molecular weight, so that they can be easily absorbed in the body, and may have little or no toxicity.
  • the average molecular weight of the gene transfer complex may be about 15 kDa to about 50 kDa, but may not be limited thereto.
  • the gene transfer complex serves as a carrier suitable for gene transfer, and preferably has an average molecular weight of about 15 kDa to about 50 kDa, and if the average molecular weight is outside the range, gene transfer occurs. Efficiency decreases, and problems such as inflammation and vascular occlusion due to antigen-antibody reactions may occur due to retention in blood vessels and/or organs in the body.
  • the weight ratio of the gelatin: cationic biocompatible material: anionic biocompatible material may be about 1:0.01:0.01 to about 1:0.1:0.2, but may not be limited thereto. In one embodiment of the present application, if the weight ratio of the gelatin: cationic biocompatible material: anionic biocompatible material is outside the range of about 1:0.01:0.01 to about 1:0.1:0.2, gene transfer efficiency may be reduced. there is.
  • the charge amount of the gene transfer complex may be adjusted depending on the ratio of the cationic biocompatible material and the anionic biocompatible material.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing a gene transfer complex in which the charge amount is controlled through cross-linking of gelatin, chitosan, and fucoidan. Gene transfer complex is cross-linked to the gene transfer complex according to the ratio of cationic chitosan and anionic fucoidan. It shows that the charge amount of the transfer complex is controlled.
  • the cationic biocompatible material and/or the anionic biocompatible material may be bound to the point where the gelatin is cross-linked, but may not be limited thereto.
  • the gene delivery complex can control the amount of charge and the gene binding rate by adjusting the weight ratio of the gelatin, the cationic biocompatible material, and the anionic biocompatible material. Specifically, when the weight ratio of the cationic biocompatible material in the gene transfer complex increases and the positive charge is higher than an appropriate level, the gene binding rate may become excessively high and the gene release effect may be reduced.
  • the gene delivery complex of the present application can control the gene binding rate by controlling the amount of charge by appropriately adjusting the weight ratio of the gelatin, the cationic biocompatible material, and the anionic biocompatible material, and can enable effective release of the gene.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the combination of a gene transfer complex and a gene.
  • the gene delivery complex may selectively release the therapeutic gene for about 30 minutes to about 48 hours, but may not be limited thereto. In one embodiment of the present application, the gene transfer complex selectively releases the therapeutic gene while remaining at the lesion site for about 30 minutes to 48 hours, and after the release, it is decomposed to cause inflammation due to antigen-antibody reaction and blood vessel damage. It can be absorbed into the body without side effects such as blockage.
  • the gene transfer complex may transfer a gene to one or more selected from animal cells, animal tissues, and animal bodies, but may not be limited thereto. In one embodiment of the present application, the gene transfer complex may transfer genes to one or more selected from animal cells, animal tissues, and animal bodies, and the animals may exclude humans, but are not limited thereto. You can.
  • the gene delivery complex may include alginic acid and/or carrageenan coating on the surface, but may not be limited thereto.
  • the gene transfer complex has a total crosslinking rate of the crosslinking; Each average molecular weight of the gelatin, the cationic biocompatible material, and the anionic biocompatible material; average molecular weight of the gene transfer complex; And/or by adjusting the weight ratio of the gelatin: cationic biocompatible material: anionic biocompatible material, it can be adjusted to an optimal size that can be selectively used in blood vessels of lesional tissue through microconduits. If the gene delivery complex forms large particles of an appropriate size, it may be difficult to pass through the lesional blood vessel or new blood vessel through a microconduit, and if it aggregates into larger particles to form a precipitate, vascular occlusion and chronic inflammatory response may occur.
  • the gene transfer complex of the present invention can be prevented by being adjusted to an optimal size.
  • the diameter of the gene transfer complex may be from about 10 ⁇ m to about 1000 ⁇ m, and the diameter may be adjusted depending on the blood vessel used.
  • the size of the gene transfer complex may be adjusted according to process conditions such as the order of addition of each material, stirring speed, and temperature during the manufacturing process.
  • the gene delivery complex includes the crosslinking rate of the crosslinking, the average molecular weight of the gelatin, the average molecular weight of the cationic biocompatible material, the average molecular weight of the anionic biocompatible material, and the gene transfer.
  • the particle size, cross-linking rate, charge amount, and/or body absorption of the gene transfer complex may vary depending on the order in which each component is mixed when preparing the gene transfer complex.
  • the gene transfer complex is combined with a therapeutic gene by mixing it with physiological saline, so that the therapeutic gene can be stably adsorbed and/or ionically bound to the gene transfer complex.
  • a second aspect of the present application provides a pharmaceutical composition comprising the gene transfer complex according to the first aspect of the present application.
  • the concentration of the gene delivery complex in the pharmaceutical composition may be less than about 15 mg/mL, but may not be limited thereto. In one embodiment of the present application, the concentration of the gene delivery complex in the pharmaceutical composition may be less than about 15 mg/mL, or about 1 mg/mL to about 15 mg/mL, but may not be limited thereto.
  • the concentration of the gene transfer complex in the pharmaceutical composition exceeds about 15 mg/mL
  • the size of the gene transfer complex increases due to the viscosity of chitosan, and the particles on the surface harden to form a fine particle. It is difficult to selectively reach the lesion blood vessels through the conduit, and problems may arise such as reduced absorption into lesion tissue cells.
  • the gene transfer complex and/or the pharmaceutical composition is capable of gene transfer not only through blood vessels, but also in vivo, such as tumors and internal organs, and in cultured cells in vitro. Gene transfer may be possible. That is, the gene transfer complex and/or the pharmaceutical composition of the present application can be used for gene transfer into animal cells, animal tissues, and/or animal bodies.
  • the low molecular weight gelatin is a mixture of 2.5 g of low molecular weight gelatin with a molecular weight of 1.5 kDa to 10 kDa and 2.5 g of high molecular weight gelatin with a molecular weight of 25 kDa to 50 kDa.
  • the ratio of genipin is 0.1 wt% of distilled water and can be adjusted within the range of 0.01 wt% to 0.5 wt%.
  • the raw materials, manufacturers, and molecular weights of the low-molecular-weight gelatin, fucoidan, carboxymethyl chitosan, and genipin are shown in Table 1 below.
  • the gelatin, fucoidan, and carboxymethyl chitosan are all reduced to low molecular weight through subcritical water decomposition.
  • the low-molecularization method may use hydrothermal treatment, enzyme treatment, acid-base hydrolysis, or ultrasonic treatment other than subcritical water decomposition.
  • Figures 4 and 5 are photographs and scanning electron micrographs of the gene delivery complex prepared according to Example 1, respectively. Since the gene delivery complex of the present invention has a porous structure on the surface, it has a large surface area that can bind to the gene delivery material, enabling efficient gene transfer.
  • FT-IR analysis was performed on the gene delivery complex obtained in Example 1 and each raw material (gelatin, fucoidan, chitosan, and genipin) (FIG. 6).
  • the main functional groups are indicated on the graph of each raw material.
  • CF2G is a graph of the gene transfer complex obtained in Example 1, showing the main functional group peaks of each raw material, from which it can be confirmed that the raw materials of the gene transfer complex are well combined.
  • Example 1 100 mg of the gene delivery complex microparticles prepared in Example 1 were mixed with 10 mL of distilled water, and passage through a microconduit (1.5 Fr catheter) was checked. The amount of injection per time was 1 mL, and it was injected into the microconduit using a 1 cc syringe. As a result of repeating it 5 times, it was confirmed that all 1 to 5 passes were passed.
  • the time for decomposition in distilled water was measured after the gene transfer complex was prepared.
  • decomposition refers to the decomposition of the physical form in which the microsphere shape of the gene transfer complex is not maintained.
  • the gene transfer complex was prepared under the conditions of Examples 2-1, 2-2, and 2-3 in Table 2 below, and then 50 mg of each gene transfer complex particle was mixed with 10 mL of distilled water and placed in a petri dish, It was placed in an incubator at 36.1°C and observed.
  • the crosslinking rate can be calculated using Equation 1 below, where A sample is the absorbance of the sample and A control is the absorbance of non-crosslinked gelatin.
  • Example 2-1 35.24 ⁇ 1.21
  • Example 2-2 49.28 ⁇ 0.78
  • Example 2-3 68.84 ⁇ 1.64
  • the decomposition time of the gene delivery complexes of Examples 2-1, 2-2, and 2-3 took more than 1 hour, 10 days, and 14 days, respectively. It can be seen that the higher the content of polymer gelatin, the higher the cross-linking rate and the longer the decomposition time. Additionally, the shorter the cross-linking time, the lower the cross-linking rate and the shorter the decomposition time. In particular, it was confirmed that the gene transfer complex prepared only from polymer gelatin in Example 2-3 did not dissolve in distilled water even after 14 days, and from this, it could be expected that it would take a long time to decompose in the body.
  • the degree of low molecular weight gelatin in order to manufacture a gene transfer complex that stays in the body for an appropriate period of time, the degree of low molecular weight gelatin must be adjusted by adjusting the ratio of high-molecular-weight gelatin and low-molecular-weight gelatin, and the cross-linking rate must be controlled by controlling the cross-linking time.
  • the gene delivery complexes of Examples 3-1 to 3-6 in Table 4 below were prepared, and zeta-potential analysis was performed to measure the charge (FIG. 7, a to f).
  • the gelatin is a mixture of 2.5 g of low molecular weight gelatin with a molecular weight of 1.5 kDa to 10 kDa and 2.5 g of high molecular weight gelatin with a molecular weight of 25 kDa to 50 kDa.
  • the gene delivery complex microparticles contain (+) ions and (-) ions, and the (+) ions and (-) ions have a force that repulses each other.
  • the value of the force that repulses each other is the zeta-potential value, and through this, the amount of charge of the fine particles and the degree of aggregation and dispersion of the fine particles in the solution can be estimated.
  • Example 3-1 5 - - +5.17
  • Example 3-2 5 0.25 0.25 -2.13
  • Example 3-3 5 0.25 0.5 -1.70
  • Example 3-4 5 0.25 0.75 -0.60
  • Example 3-5 5 0.5 - -3.83
  • Example 3-6 5 0.5 0.25 -1.87
  • the gelatin is a mixture of 2.5 g of low molecular weight gelatin with a molecular weight of 1.5 kDa to 10 kDa and 2.5 g of high molecular weight gelatin with a molecular weight of 25 kDa to 50 kDa.
  • Treatment groups 1, 2, and 3 were prepared by mixing vaccinia virus with the complexes of Examples 4-1, 4-2, and 4-3, respectively, and then incubated at room temperature for 10 hours before adding to the cells for constant temperature reaction conditions. Stored for minutes.
  • the detailed evaluation method is as follows:
  • the medium used is DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) + 10% fetal bovine serum (FBS).
  • DMEM Dulbeco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • cells are seeded in 400 ⁇ L of cell culture in a 24-well plate and cultured for 3 days.
  • Both the virus in the supernatant and the intracellular virus are recovered. (Specifically, the virus is removed from the cell by bursting the cell, and the virus is recovered by removing cell debris.)
  • Virus titer is confirmed using the plaque assay method.
  • the virus recovery method refers to the fact that when a virus is infected, the virus replicates and proliferates within the cell and escapes from the cell. This means that the replication, proliferation, and amount of virus coming out of the cell vary depending on the multiplicity of infection (MOI) and infection time.
  • MOI multiplicity of infection
  • Prior experiments on the virus proliferation rate and time of coming out of the cell were not conducted, so the titer was confirmed by conducting the experiment under the conditions of this experiment, a virus infection concentration of 1 MOI and an infection time of 48 hours.
  • the harvest method involves recovering both the supernatant and the virus within the cell to confirm the titer of the virus, and the entire virus is identified and compared.
  • Example Treatment group Titer (pfu/mL) Example 4-1 One 7.23 ⁇ 10 6
  • Example 4-2 2 6.08 ⁇ 10 6
  • Example 4-3 9.08 ⁇ 10 6
  • Example 4-3 Example 4-1 > Example 4-2. Comparing Examples 4-3 and 4-1, the fucoidan content is the same, and the chitosan content is greater in Example 4-3. In other words, the higher the chitosan content, the higher the gene transfer material delivery effect of the gene transfer complex may be. Additionally, comparing Examples 4-1 and 4-2, the chitosan content is the same and the fucoidan content is greater in Example 4-2. In other words, the higher the fucoidan content, the lower the gene transfer material delivery effect of the gene transfer complex.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본원은 유전자 전달 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

유전자 전달 복합체
본원은 유전자 전달 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
유전자 치료란 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하거나 예방하는 것을 의미한다. 유전자 치료는 세포 내에 결손된 유전자를 정상 유전자로 치환하거나, 새 유전자를 집어넣어 신체에 새로운 기능을 부여하거나, 과잉 또는 과소 작용을 하는 유전자의 기능을 조절하는 방법 등을 포함한다. 이러한 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료과 비교하여 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 효과적인 유전자 치료를 위하여 치료 유전자를 원하는 표적 세포로 전달하여 높은 발현 효율을 얻을 수 있도록 하는 유전자 전달 기술을 개발하는 것이 필요하다.
유전자 전달체는 원하는 치료 유전자를 표적 세포에 도입하기 위해 필요한 매개체로서, 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다. 레트로 바이러스 (RV), 아데노 바이러스 (AV), 아데노 바이러스와의 복합체 (AAV) 등을 포함하는 바이러스성 유전자 전달체는 발현율 및 지속성 면에서 매우 우수하나 면역반응에 의한 안전성이 문제점으로 지적되고 있다. 비바이러스성 유전자 전달체는 주로 양이온성 지질 또는 고분자로 이루어지며, 이들은 음이온성인 DNA와 이온결합에 의해 복합체를 형성하여 세포 내로 전달된다. 양이온성 리포좀 등의 비바이러스성 유전자 전달체는, 바이러스성 전달체와 비교하여 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 및 사용상의 간편함 등 장점을 가지고 있으나 바이러스성 전달체에 비하여 유전자의 전달 효율이 낮은 단점이 있다.
비바이러스성 유전자 전달 기술 중 지질 전달체와 관련하여, 리포좀을 유전자 전달체로 사용하기 위한 노력이 이루어져 왔다. 지질 전달체의 조건은 음이온성을 띠는 DNA와 양이온성을 띠는 리포좀이 자발적으로 정전기적 결합을 이루어서 효과적인 응축이 일어나야 하며, 리포좀/DNA 복합체가 전체적으로 양이온성을 가져서 음이온성인 세포 표면에 쉽게 도달할 수 있어야 하며, 리포좀이 세포질 막을 융해하고 불안정화 시킬 수 있는 융해 성질 (fusogenic property)을 가지고 있어 DNA가 세포 안으로 들어갈 수 있도록 해야 한다. 지질전달체에서 가장 중요한 것은 효과적인 양이온성 지질을 선정하여 형질 주입율이 우수한 조합을 만드는 것이다. 지금까지 연구가 많이 이루어진 DOTMA와 DOTAP이 현재 가장 많이 쓰이고 있는 양이온성 지질로서 아실(acyl) 사슬이 프로필 암모늄(propyl ammonium)기에 결합되어 있는 두 개의 사슬을 갖는 양친성 지질이다. 지질 복합체와 마찬가지로 높은 형질 발현율을 얻기 위하여 엔도소말 이스케이프(endosomal escape)를 도와주는 융해성 그룹(fusogenic group) 들이나 수용체 매개 세포 내 섭취(receptor mediated endocytosis)를 일으키는 리간드들을 결합시키려는 노력이 많이 이루어지고 있다.
우수한 비바이러스성 유전자 전달 시스템을 개발하기 위해서는 넘어야 할 장벽이 많다. 목적하는 표적 세포까지 DNA가 분해되지 않게 성공적으로 운반하여야 하고 표적 세포에 도달하여서는 세포 안으로 효율적으로 엔도사이토시스(endocytosis)가 되어야 하며, 세포 내에서는 엔도좀이나 라이소좀에 존재하는 분해효소에 의해 분해되지 않고 안전하게 핵막을 뚫고 핵 속으로 들어가야 한다.
본 기술분야에서는 비바이러스성 전달체의 최대 약점인 형질 발현율을 향상시키고 바이러스성 전달체의 가장 큰 약점인 안정성을 향상시키는 새로운 유전자 전달체를 개발하는데 주력하고 있다. 간암 치료에 우두 바이러스(vaccnia virus) 유전자 전달체를 단독으로 사용한 대조군에 비해 약 1 mm 내지 약 2 mm다공성 생체 유래 펩타이드인 젤라틴스폰지에 흡착시켜 병변 조직의 혈관에 저류시켰을 때 우수한 치료결과가 보고되었다.
다공성 젤라틴 스폰지, 음이온 알지네이트, 양이온 키토산, 및 양이온 카르복시메틸셀룰로오스 (carboxymethylcellulose; CMC)를 이용하여 유전자를 전달할 때 체내의 혈관 부위 조직, 및 림프관 등을 통해 주입 시 더 효율적으로 병변 조직 혈관계에 도달하는 것이 보고되었으나, 젤라틴 스폰지는 저류 기간이 길고, 알지네이트, 양이온 키토산, 양이온 CMC는 체내분해효소가 없어 혈관 폐색, 혈관 수축, 면역반응에 의한 염증반응의 부작용이 보고되어 임상적으로 혈관 내에 사용이 어렵다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
Bohyun Kim, Sang Woo Han, Song-Ee Choi, DaBin Yim, Jong-Ho Kim, Hans M. Wyss, and Jin Woong Kim, "Monodisperse Microshell Structured Gelatin Microparticles for Temporary Chemoembolization", Biomacromolecules 2018, 19, 2, 386-391.
본원은 유전자 전달 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 젤라틴, 양이온성 생체적합성 물질, 및 음이온성 생체적합성 물질을 포함하는, 유전자 전달 복합체로서, 상기 젤라틴, 상기 양이온성 생체적합성 물질 및 상기 음이온성 생체적합성 물질은 서로 가교 결합되는 것인, 유전자 전달 복합체를 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 유전자 전달 복합체를 포함하는, 약학적 조성물을 제공한다.
본원의 구현예들에 따른 유전자 전달 복합체는, 생체 적합한 물질인 젤라틴과 상기 젤라틴에 가교 결합되는 양이온성 생체적합성 물질, 및 음이온성 생체적합성 물질을 포함하는 것으로서, 종래의 양이온성 물질 단독으로 이루어진 유전자 전달 복합체에 비하여 세포 독성을 경감시키고, 혈액 구성 물질과의 비특이적인 결합을 감소시키면서, 혈관을 통해서 선택적으로 장기 및 조직에 향상된 유전자 전달 효과를 나타내고, 병변 부위에서 약 30 분 내지 약 48 시간 동안 체내에 저류하다가 항원-항체반응에 의한 염증반응, 혈관폐색 등의 부작용 없이 체내에 흡수되므로, 개선된 성능의 새로운 유전자 전달 복합체로서 사용될 수 있다.
본원의 구현예들에 따른 유전자 전달 복합체는, 아임계수 분해 공정에 의해 저분자화된, 젤라틴, 양이온성 생체적합성 물질 및 음이온성 생체적합성 물질을 포함하는 것으로서, 생체 내 흡수가 용이하며 독성이 적은 특징이 있다.
본원의 구현예들에 따른 유전자 전달 복합체에 포함되는 젤라틴은 분자량이 서로 다른 제 1 젤라틴 및 제 2 젤라틴을 포함하는 것으로서, 이에 의하여 생체 내 흡수가 용이하며 독성이 적은 특징이 있다.
본원의 구현예들에 따른 유전자 전달 복합체는 아임계수 분해 공정에 의해 저분자화된 평균 분자량이 서로 다른 제 1 젤라틴 및 제 2 젤라틴을 포함함으로써, 생체 내 흡수가 용이하며 독성이 적은 특징이 있다.
본원의 구현예들에 따른 유전자 전달 복합체는, 양이온성 생체적합성 물질 및 유전자 전달 복합체의 표면 전하를 감소시킬 수 있는 음이온성 생체적합성 물질을 젤라틴에 가교 결합한 것으로서, 젤라틴, 양이온성 생체적합성 물질, 및 음이온성 생체적합성 물질의 중량비를 적절하게 조절함으로써 표면 전하량이 조절되고, 유전자 전달 효율이 향상되는 특징이 있다.
본원의 구현예들에 따른 유전자 전달 복합체는 미세 도관을 통해 병변 조직의 혈관에 선택적으로 사용될 수 있는 최적의 크기로 조절될 수 있다.
본원의 구현예들에 따른 유전자 전달 복합체는 가교제로서 세포 독성을 최소화한 제니핀(genipin)을 사용하여 세포 독성이 감소되는 특징이 있다.
도 1은, 본원의 일 구현예에 있어서, 젤라틴 및 제니핀의 가교 결합을 나타내는 모식도이다.
도 2는, 본원의 일 구현예에 있어서, 젤라틴, 키토산, 및 후코이단의 가교 결합을 통하여 전하량이 조절된 유전자 전달 복합체를 나타내는 모식도이다.
도 3은, 본원의 일 구현예에 있어서, 유전자 전달 복합체 및 유전자가 결합한 유전자 전달 복합체를 나타내는 모식도이다.
도 4는, 본원의 일 실시예에 있어서, 유전자 전달 복합체 미립자의 사진이다.
도 5는, 본원의 일 실시예에 있어서, 유전자 전달 복합체 미립자의 주사전자현미경 사진이다.
도 6은, 본원의 일 실시예에 있어서, 유전자 전달 복합체와 각각의 원료(젤라틴, 후코이단, 키토산, 및 제니핀)의 FT-IR 그래프이다.
도 7의 a 내지 f는, 본원의 일 실시예에 있어서, 유전자 전달 복합체의 제타 전위 분포 (Zeta-potential distribution) 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~ 하는 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합(들)"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "평균 분자량"은 "중량 평균 분자량"을 의미한다.
이하, 본원의 구현예를 상세히 설명하였으나, 본원이 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 젤라틴, 양이온성 생체적합성 물질, 및 음이온성 생체적합성 물질을 포함하는, 유전자 전달 복합체로서, 상기 젤라틴, 상기 양이온성 생체적합성 물질, 및 상기 음이온성 생체적합성 물질은 서로 가교 결합되는 것인, 유전자 전달 복합체를 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 생체적합성 물질 및 상기 음이온성 생체적합성 물질은 상기 젤라틴에 가교 결합되는 것일 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 생체적합성 물질 및 상기 음이온성 생체적합성 물질은, 도 1에 도시된 바와 같이, 상기 젤라틴이 가교된 지점에 가교 결합되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴은 저분자화된 젤라틴으로서, 상기 젤라틴의 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 40 kDa일 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴은 저분자화된 젤라틴으로서, 상기 젤라틴의 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 40 kDa, 약 5 kDa 내지 약 35 kDa, 약 5 kDa 내지 약 30 kDa, 약 5 kDa 내지 약 25 kDa, 약 5 kDa 내지 약 20 kDa, 약 5 kDa 내지 약 15 kDa, 약 10 kDa 내지 약 40 kDa, 약 10 kDa 내지 약 35 kDa, 약 10 kDa 내지 약 30 kDa, 약 10 kDa 내지 약 25 kDa, 약 10 kDa 내지 약 20 kDa, 약 10 kDa 내지 약 15 kDa, 약 15 kDa 내지 약 40 kDa, 약 15 kDa 내지 약 35 kDa, 약 15 kDa 내지 약 30 kDa, 약 15 kDa 내지 약 25 kDa, 또는 약 15 kDa 내지 약 20 kDa일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴은 제 1 젤라틴 및 제 2 젤라틴을 포함하는 것으로서, 상기 제 1 젤라틴의 평균 분자량은 약 25 kDa 내지 약 50 kDa일 수 있으며, 상기 제 2 젤라틴의 평균 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 10 kDa일 수 있다. 상기 젤라틴은 제 1 젤라틴 및 제 2 젤라틴이 서로 가교된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 젤라틴의 평균 분자량은 약 25 kDa 내지 약 50 kDa, 약 25 kDa 내지 약 45 kDa, 약 25 kDa 내지 약 40 kDa, 약 25 kDa 내지 약 35 kDa, 약 25 kDa 내지 약 30 kDa, 약 30 kDa 내지 약 50 kDa, 약 30 kDa 내지 약 45 kDa, 약 30 kDa 내지 약 40 kDa, 약 30 kDa 내지 약 35 kDa, 약 35 kDa 내지 약 50 kDa, 약 35 kDa 내지 약 45 kDa, 약 35 kDa 내지 약 40 kDa, 약 40 kDa 내지 약 50 kDa, 또는 약 40 kDa 내지 약 45 kDa일 수 있다. 또한, 예를 들어, 상기 제 2 젤라틴의 평균 분자량은 약 1.5 kDa 내지 약 10 kDa, 약 1.5 kDa 내지 약 8 kDa, 약 1.5 kDa 내지 약 6 kDa, 약 1.5 kDa 내지 약 5 kDa, 약 1.5 kDa 내지 약 4 kDa, 약 1.5 kDa 내지 약 3 kDa, 약 2 kDa 내지 약 10 kDa, 약 2 kDa 내지 약 8 kDa, 약 2 kDa 내지 약 6 kDa, 약 2 kDa 내지 약 5 kDa, 약 2 kDa 내지 약 4 kDa, 약 2 kDa 내지 약 3 kDa, 약 2.5 kDa 내지 약 10 kDa, 약 2.5 kDa 내지 약 8 kDa, 약 2.5 kDa 내지 약 6 kDa, 약 2.5 kDa 내지 약 5 kDa, 약 2.5 kDa 내지 약 4 kDa, 또는 약 2.5 kDa 내지 약 3 kDa일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴은 아임계수 분해 공정에 의하여 저분자화된 상기 제 1 젤라틴 및 상기 제 2 젤라틴을 가교 결합한 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 상기 제 1 젤라틴, 상기 제 2 젤라틴, 상기 양이온성 생체적합성 물질, 및 상기 음이온성 생체적합성 물질이 서로 가교 결합된 것을 포함할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 여러 종류의 유전자를 각각 또는 동시에 전달할 수 있는 다중 유전자 전달 복합체일 수 있고, 구형의 미립자 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴은 다공성 형태일 수 있으며, 유전자를 포함하는 담체 역할을 할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 생체적합성 물질은 키토산 및/또는 올리고키토산을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 키토산 및/또는 올리고키토산은 탈아세틸화 및 카르복시메틸화된 키토산을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 탈아세틸화 및 카르복시메틸화된 키토산은 약 pH 5 내지 약 pH 7의 산도 범위에서 분해되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 음이온성 생체적합성 물질은 후코이단, 설폰화 다당류, 및 카르기난에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 가교 결합은 제니핀; 탄닌, 갈산, 탄닌산, 또는 프로안토시아니딘으로부터 선택되는 탄닌류; 카테킨, 에피카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 퀘르세틴, 레스베라트롤, 이소플라본, 플라보노이드류, 및 해조류 유래 폴리페놀으로부터 선택되는 폴리페놀류에서 선택되는 가교제에 의해 형성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 가교제는 세포 독성이 적은 것일 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 도 1은, 상기 젤라틴 및 상기 제니핀의 가교 결합을 나타내는 모식도이며, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴은 상기 제니핀 등의 가교제에 의하여 가교된 것일 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체의 제조 시 첨가되는 상기 가교제의 함량이 높을수록 상기 가교율은 증가할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 구형의 미립자일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 상기 젤라틴 간의 가교 결합, 상기 젤라틴과 상기 양이온성 생체적합성 물질 간의 가교 결합, 및 상기 젤라틴과 상기 음이온성 생체적합성 물질 간의 가교 결합을 포함할 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 가교 결합의 총 가교율은 약 30% 내지 약 70%일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 생체적합성 물질의 평균 분자량은 약 3 kDa 내지 약 20 kDa이고, 상기 음이온성 생체적합성 물질의 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 20 kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 생체적합성 물질의 평균 분자량은 약 3 kDa 내지 약 20 kDa, 약 3 kDa 내지 약 15 kDa, 약 3 kDa 내지 약 10 kDa, 약 5 kDa 내지 약 20 kDa, 약 5 kDa 내지 약 15 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 약 10 kD일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 음이온성 생체적합성 물질의 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 20 kDa, 약 5 kDa 내지 약 15 kDa, 약 5 kDa 내지 약 10 kDa, 약 10 kDa 내지 약 20 kDa, 약 10 kDa 내지 약 15 kDa, 또는 약 15 kDa 내지 약 20 kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴, 상기 양이온성 생체적합성 물질, 및 상기 음이온성 생체적합성 물질은 각각 저분자화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴, 상기 양이온성 생체적합성 물질, 및 상기 음이온성 생체적합성 물질은 각각 아임계수 분해 공정, 열수처리, 효소처리, 산/염기 가수분해처리, 또는 초음파 처리 등에 의해 저분자화되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴, 상기 양이온성 생체적합성 물질, 및 상기 음이온성 생체적합성 물질은 저분자화됨으로써 생체 내 흡수가 용이하며, 독성이 적거나 없는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체의 평균 분자량은 약 15 kDa 내지 약 50 kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 유전자의 전달에 적합한 담체의 역할을 하는 것으로서, 약 15 kDa 내지 약 50 kDa의 평균 분자량을 갖는 것이 바람직하며, 상기 평균 분자량 범위를 벗어나는 경우 유전자 전달 효율이 감소하며 혈관 내 및/또는 체내 장기 저류에 의하여 항원항체 반응에 의한 염증 및 혈관 폐색 등의 문제점이 발생할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴 : 양이온성 생체적합성 물질 : 음이온성 생체적합성 물질의 중량비가 약 1 : 0.01 : 0.01 내지 약 1 : 0.1 : 0.2일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 젤라틴 : 양이온성 생체적합성 물질 : 음이온성 생체적합성 물질의 중량비가 약 1 : 0.01 : 0.01 내지 약 1 : 0.1 : 0.2의 범위를 벗어나는 경우 유전자 전달 효율이 감소할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 생체적합성 물질 및 상기 음이온성 생체적합성 물질의 비율에 따라 상기 유전자 전달 복합체의 전하량이 조절되는 것일 수 있다. 예를 들어, 도 2는, 젤라틴, 키토산, 및 후코이단의 가교 결합을 통하여 전하량이 조절된 유전자 전달 복합체를 나타내는 모식도로서, 양이온성의 키토산 및 음이온성의 후코이단의 비율에 따라 유전자 전달 복합체에 가교 결합됨으로써 유전자 전달 복합체의 전하량이 조절되는 것을 나타낸다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양이온성 생체적합성 물질 및/또는 상기 음이온성 생체적합성 물질은 상기 젤라틴이 가교된 지점에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 상기 젤라틴, 상기 양이온성 생체적합성 물질, 및 상기 음이온성 생체적합성 물질의 중량비를 조절함으로써 전하량을 조절할 수 있으며, 유전자 결합률을 조절할 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자 전달 복합체는 상기 양이온성 생체적합성 물질의 중량비가 높아져 양의 전하량이 적정 수준 이상으로 높을 때, 유전자 결합률이 지나치게 높아지고 유전자 방출 효과가 낮아지는 문제점이 발생할 수 있다. 본원의 유전자 전달 복합체는 상기 젤라틴, 상기 양이온성 생체적합성 물질, 및 상기 음이온성 생체적합성 물질의 중량비를 적절하게 조절함으로써 전하량을 조절하여 유전자 결합률을 조절할 수 있으며 유전자의 효과적인 방출이 가능할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체를 사용하여 유전자를 표적 세포에 전달하면, 종래의 유전자 전달 물질만을 이용하여 유전자를 전달하는 경우와 비교하여 전달 효율이 높아지고, 이에 따라 표적 세포에서 유전자의 방출이 일어나 유전자 발현율이 높아질 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 도 3은, 유전자 전달 복합체 및 유전자가 결합한 것을 나타내는 모식도이다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 치료 유전자를 약 30 분 내지 약 48 시간 동안 선택적으로 방출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 약 30 분 내지 48 시간 동안 병변 부위에서 저류하면서 치료 유전자를 선택적으로 방출하고, 상기 방출 후에는 분해되어 항원-항체반응에 의한 염증반응, 및 혈관폐색 등의 부작용 없이 체내에 흡수될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 동물 세포, 동물 조직, 및 동물체에서 선택되는 하나 이상에 유전자를 전달하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 동물 세포, 동물 조직, 및 동물체에서 선택되는 하나 이상에 유전자를 전달하는 것일 수 있으며, 상기 동물은 인간을 제외하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 표면에 알진산 (alginic acid) 및/또는 카라기난 (carrageenan) 코팅을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는, 상기 가교 결합의 총 가교율; 상기 젤라틴, 상기 양이온성 생체적합성 물질, 및 상기 음이온성 생체적합성 물질의 각각의 평균 분자량; 상기 유전자 전달 복합체의 평균 분자량; 및/또는 상기 젤라틴 : 양이온성 생체적합성 물질 : 음이온성 생체적합성 물질의 중량비를 조절함으로써, 미세 도관을 통해 병변 조직의 혈관에 선택적으로 사용될 수 있는 최적의 크기로 조절될 수 있다. 유전자 전달 복합체가 적정 크기 이상의 거대 입자를 형성하면 미세 도관을 통하여 병변 혈관 및 신생 혈관을 통과하기가 어려운 문제점이 발생할 수 있고, 더 큰 입자로 응집되어 침전이 형성되면 혈관 폐색 및 만성 염증 반응이 나타나는 문제점이 발생할 수 있으나, 본원의 유전자 전달 복합체는 최적의 크기로 조절됨으로써 상기 문제점을 예방할 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체의 직경은 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛일 수 있고, 사용되는 혈관에 따라 상기 직경은 조절될 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체의 크기는 제조 공정에서 각각의 물질의 첨가 순서, 교반 속도, 및 온도 등의 공정 조건에 따라 조절될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는, 상기 가교 결합의 가교율, 상기 젤라틴의 평균 분자량, 상기 양이온성 생체적합성 물질의 평균 분자량, 상기 음이온성 생체적합성 물질의 평균 분자량, 상기 유전자 전달 복합체의 평균 분자량, 상기 젤라틴 : 양이온성 생체적합성 물질 : 음이온성 생체적합성 물질의 중량비, 상기 유전자 전달 복합체의 크기, 상기 유전자 전달 복합체의 표면 전하량, 치료 유전자의 순도, 및/또는 치료 유전자의 전하 특성을 조절함으로써 유전자 전달 효율을 극대화 할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체를 제조할 때 각각의 성분을 혼합하는 순서에 따라 유전자 전달 복합체의 입자 크기, 가교율, 전하량, 및/또는 체내 흡수성이 달라질 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 치료 유전자를 생리 식염수와 혼합하여 결합함으로써, 상기 치료 유전자가 상기 유전자 전달 복합체에 안정적으로 흡착 및/또는 이온 결합할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 유전자 전달 복합체를 포함하는, 약학적 조성물을 제공한다.
본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 본원의 제 1 측면에 대해 설명한 내용은 본원의 제 2 측면에서 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 상기 유전자 전달 복합체 농도는 약 15 mg/mL 미만일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 상기 유전자 전달 복합체 농도는 약 15 mg/mL 미만, 또는 약 1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 상기 유전자 전달 복합체 농도가 약 15 mg/mL 초과인 경우, 키토산의 점도에 의하여 상기 유전자 전달 복합체의 크기가 증가하고, 표면의 입자가 경화되어 미세도관을 통한 병변 혈관으로의 선택적 도달이 어려우며, 병변 조직 세포로의 흡수력이 감소하는 문제점이 발생할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체는 및/또는 상기 약학적 조성물은 혈관을 통한 유전자 전달뿐만 아니라, 종양 및 내부 장기 등의 생체 내에서 유전자 전달이 가능하며, 시험관 내의 배양세포 등에서도 유전자 전달이 가능할 수 있다. 즉, 본원의 유전자 전달 복합체는 및/또는 상기 약학적 조성물은 동물 세포, 동물 조직, 및/또는 동물체로의 유전자 전달에 사용할 수 있다.
이하, 본원에 대하여 실시예를 이용하여 좀더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예 1: 유전자 전달 복합체의 제조>
1) 저분자 젤라틴 5 g 및 증류수 100 mL를 혼합하고, 75℃, 300 rpm 내지 400 rpm에서 1 시간 동안 교반한다. 이때, 저분자 젤라틴의 비율은 증류수의 5 wt%이고, 3 wt% 내지 7 wt%의 범위 내에서 조절될 수 있다. 이때, 상기 저분자 젤라틴은, 분자량 1.5 kDa 내지 10 kDa의 저분자 젤라틴 2.5 g 및 분자량 25 kDa 내지 50 kDa의 고분자 젤라틴 2.5 g을 혼합한 것이다.
2) 1)에서 수득한 용액에 음이온성 생분해성 물질인 후코이단 0.25 g을 첨가하고, 75℃, 300 rpm 내지 400 rpm에서 15 분 동안 교반한다. 이때, 후코이단의 비율은 증류수의 0.25 wt%이고, 0.1 wt% 내지 5 wt%의 범위 내에서 조절될 수 있다.
3) 2)에서 수득한 용액에 양이온성 물질인 카르복시메틸 키토산 0.25 g을 첨가하고, 75℃, 300 rpm 내지 400 rpm에서 30 분 내지 60 분 동안 교반한다. 이때, 키토산의 비율은 증류수의 0.25 wt%이고, 0.1 wt% 내지 5 wt%의 범위 내에서 조절될 수 있다.
4) 3)에서 수득한 용액에 제니핀 0.1 g을 첨가하고, 300 rpm 내지 400 rpm에서 2 분 내지 3 분 동안 교반한다. 이때, 제니핀의 비율은 증류수의 0.1 wt%이고, 0.01 wt% 내지 0.5 wt%의 범위 내에서 조절될 수 있으며, 가교제인 제니핀의 함량이 높을수록 가교율이 증가할 수 있다.
5) 4)에서 수득한 용액에 60℃의 파라핀오일 400 mL을 첨가하고, 300 rpm에서 10 분 동안 교반한다. 이때, 파라핀오일의 질량은 증류수의 4 배이며, 1 배 내지 10 배의 범위 내에서 조절될 수 있다.
6) 5)에서 수득한 용액을 30℃, 300 rpm에서 16 시간 동안 교반하며 가교한다. 이때, 가교 시간이 증가할수록 가교율이 증가할 수 있다. 또한, 본 단계에서 젤라틴, 후코이단, 및 키토산이 동시에 가교된다.
7) 가교가 완료된 용액을 5℃ 내지 10℃로 냉각한다.
8) 7)에서 수득한 용액에 동량의 IPA(iso propyl alcohol)를 천천히 첨가하고, 400 rpm에서 6 분 동안 교반한 후 3 분 동안 방치한다. 입자가 침전되면 상층액의 1/2를 제거한다.
9) 8)에서 수득한 용액에 IPA를 첨가하고 400 rpm으로 3 분 동안 교반 한 후 3 분 동안 방치한다. 입자가 침전되면 상층액을 모두 제거한다.
10) 9)를 2 회 더 반복한다.
11) 형성된 입자를 여과 종이와 진공 감압기를 이용하여 거른다.
12) 11)에서 수득한 입자를 동결 건조하여 유전자 전달 복합체를 수득한다.
상기 저분자 젤라틴, 후코이단, 카르복시메틸 키토산, 및 제니핀의 원재료, 제조사, 및 분자량을 하기 표 1에 나타냈다. 상기 젤라틴, 후코이단, 및 카르복시메틸 키토산은 모두 아임계수 분해에 의하여 저분자화된 것이다. 저분자화 방법은 아임계수 분해 이외의 열수 처리, 효소 처리, 산염기 가수분해, 또는 초음파 처리 등을 이용할 수 있다.
저분자 젤라틴 후코이단 카르복시메틸 키토산 제니핀
원재료 어류 젤라틴 감마선 조사 미역귀 (Undaria pinnatifida sporophyll) 균계 소스(Fungal source) 치자나무 (Gardenia jasminoides Ellis)
제조사 Geltech MSC Beijing Be-better Technology Xian plant bio-engineering
분자량 약 30 kDa 약 8 kDa 약 3 kDa 내지 약 20 kDa -
도 4 및 도 5는, 각각 상기 실시예 1에 따라 제조된 유전자 전달 복합체의 사진 및 주사전자현미경 사진이다. 본원의 유전자 전달 복합체는 표면에 다공성 구조를 가지므로 유전자 전달 물질과 결합할 수 있는 표면적이 커 효율적으로 유전자를 전달할 수 있다.
FT-IR 분석
실시예 1에서 수득한 유전자 전달 복합체와 각각의 원료(젤라틴, 후코이단, 키토산, 및 제니핀)의 FT-IR 분석을 수행하였다 (도 6). 각 원료의 그래프에 주요 작용기를 표시하였다. CF2G는 실시예 1에서 수득한 유전자 전달 복합체의 그래프로서 각 원료의 주요 작용기 피크가 나타났으며, 이로부터 유전자 전달 복합체의 원료가 잘 결합된 것을 확인할 수 있다.
유전자 전달 복합체의 미세도관 통과 여부 확인
실시예 1에서 제조한 유전자 전달 복합체 미립자 100 mg을 증류수 10 mL와 혼합하고, 미세도관 (1.5 Fr 카테터)의 통과 여부를 확인하였다. 1 회 주입량은 1 mL이며, 1 cc 주사기를 이용하여 미세도관에 주입하였다. 5 회 반복한 결과, 1 회차 내지 5 회차 모두 통과하는 것을 확인하였다.
<실시예 2: 유전자 전달 복합체의 분해되는 시간 측정>
유전자 전달 복합체가 생체 내에서 분해되는 시간을 측정하기 위하여, 유전자 전달 복합체를 제조한 후 증류수에서 분해되는 시간을 측정하였다. 여기서, 분해는 유전자 전달 복합체의 마이크로스피어 형태가 유지되지 못하는 물리적인 형태의 분해를 의미한다. 먼저, 유전자 전달 복합체를 하기 표 2의 실시예 2-1, 2-2 및 2-3의 조건으로 제조한 후, 각각의 유전자 전달 복합체 미립자 50 mg와 증류수 10 mL를 혼합하여 페트리 디쉬에 담고, 36.1℃의 인큐베이터에 두고 관찰하였다.
증류수 100mL 기준
분자량에 따른 젤라틴 함량 (g) 후코이단 (g) 카르복시메틸 키토산(g) 제니핀 (g) 가교 시간 (h)
고분자 젤라틴 (분자량 25 kDa 내지 50 kDa) 저분자 젤라틴
(분자량 1.5 kDa 내지 10 kDa)
실시예 2-1 1.5 3.5 0.25 0.25 0.1 1
실시예 2-2 2.5 2.5 0.25 0.25 0.1 16
실시예 2-3 5 - 0.25 0.25 0.1 16
상기 실시예 2-1, 2-2, 및 2-3의 유전자 전달 복합체의 가교율은 하기의 TNBS (trinitrobenzene sulphonic acid) 검정 방법을 사용하여 측정하였으며, 가교율을 하기 표 3에 정리하였다:
1) 5 mg의 샘플을 테스트 튜브에 넣는다.
2) 1 mL의 NaHCO3을 첨가한 후 30 분 동안 반응한다.
3) 1 mL의 0.5% TNBS 용액을 첨가한 후, 인큐베이터에서 40℃의 온도에서 120 분 동안 반응한다.
4) 3 mL의 6 M 염산 용액을 첨가한 후, 인큐베이터에서 60℃의 온도에서 90 분 동안 반응한다.
5) 5 mL의 증류수를 첨가한 후, 상온 (25℃)까지 냉각한다.
6) 5)에서 수득한 용액을 마이크로플레이트 리더(microplate reader)기를 이용하여 345 nm의 흡광도를 측정한다.
이때, 가교율은 하기 식 1로써 계산될 수 있으며, Asample는 샘플의 흡광도이고, Acontrol은 가교되지 않은 젤라틴의 흡광도이다.
[식 1]
가교율 (%) = (1-Asample/Acontrol)×100(%)
구분 가교율 (%)
실시예 2-1 35.24±1.21
실시예 2-2 49.28±0.78
실시예 2-3 68.84±1.64
관찰 결과, 실시예 2-1, 2-2, 및 2-3의 유전자 전달 복합체의 분해 시간은 각각 1 시간, 10 일, 및 14 일 이상이 소요된 것을 확인하였다. 고분자 젤라틴의 함량이 높을수록 가교율이 높아지고 분해 시간은 길어지며, 또한, 가교 시간이 짧을수록 가교율이 낮고 분해 시간이 짧아지는 것을 확인할 수 있다. 특히, 실시예 2-3의 고분자 젤라틴으로만 제조된 유전자 전달 복합체는 14 일 이후에도 증류수에 녹지 않는 것을 확인하였으며, 이로부터 체내에서 분해되는 시간이 오래 걸릴 것을 예상할 수 있다. 즉, 체내에서 적절한 시간 동안 체류하는 유전자 전달 복합체를 제조하기 위하여, 고분자 젤라틴 및 저분자 젤라틴의 비율을 조절하여 젤라틴의 저분자화 정도를 조절하고, 가교 시간을 조절하여 가교율을 조절해야 한다.
<실시예 3: 유전자 전달 복합체의 제타-전위 (Zeta-potential) 분석>
하기 표 4의 실시예 3-1 내지 3-6의 유전자 전달 복합체를 제조하고, 전하량 측정을 위하여 제타-전위(Zeta-potential) 분석을 수행하였다 (도 7의 a 내지 f). 이때, 젤라틴은, 분자량 1.5 kDa 내지 10 kDa의 저분자 젤라틴 2.5 g 및 분자량 25 kDa 내지 50 kDa의 고분자 젤라틴 2.5 g을 혼합한 것이다. 유전자 전달 복합체 미립자는 (+) 이온 및 (-) 이온을 포함하며, (+) 이온 및 (-) 이온은 서로 반발하는 힘을 갖는다. 이때, 서로 반발하는 힘의 값이 제타-전위 값이며, 이를 통하여 미립자의 전하량 및 용액 내에서 미립자의 응집 및 분산 정도를 추측할 수 있다.
젤라틴 (g) 후코이단 (g) 카르복시메틸 키토산 (g) 제타-전위 (mV)
실시예 3-1 5 - - +5.17
실시예 3-2 5 0.25 0.25 -2.13
실시예 3-3 5 0.25 0.5 -1.70
실시예 3-4 5 0.25 0.75 -0.60
실시예 3-5 5 0.5 - -3.83
실시예 3-6 5 0.5 0.25 -1.87
표 4 및 도 7의 a 내지 f를 참조하여 설명하면, 제타-전위의 경우 젤라틴만을 이용하여 가교하여 만든 유전자 전달 복합체의 경우 (+)의 값을 나타냈다. 음이온 생체 적합 물질인 후코이단과 양이온 생체 적합 물질인 키토산을 첨가한 후, 제타-전위 결과가 변화하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 젤라틴과 후코이단이 첨가된 실시예 3-5의 경우, 제타-전위 값이 가장 낮다. 이로부터, 음이온 생체적합성 물질인 후코이단이 최종 제조된 유전자 전달 복합체의 전하량을 낮추는 역할을 할 수 있는 것으로 판단된다. 또한, 동량의 후코이단 함량 (0.25 g)을 갖는 실시예 3-2, 3-3, 및 3-4의 경우, 키토산 함량이 증가함에 따라 제타-전위 값이 증가하는 것을 확인하였다. 이로부터, 양이온 생체적합성 물질인 키토산이 최종 제조된 유전자 전달 복합체의 전하량을 증가시키는 역할을 할 수 있는 것으로 판단된다. 또한, 동량의 후코이단 함량 (0.5 g)을 갖는 실시예 3-5 및 3-6의 경우, 키토산 함량이 증가함에 따라 제타-전위 값이 증가하는 것을 확인하였다. 결과적으로 후코이단과 키토산 첨가 함량 및 첨가 비율에 따라 최종 제조된 유전자 전달 복합체의 전하량이 조절될 수 있다.
<실시예 4: 인-비트로 (in-vitro) 실험>
하기 표 5의 실시예 4-1 내지 4-3의 유전자 전달 복합체를 제조한 후, 각각의 유전자 전달 복합체를 사용할 때 백시니아 바이러스(바이오녹스 사)의 바이러스 발현율의 증가 여부를 확인하였다. 이때, 젤라틴은, 분자량 1.5 kDa 내지 10 kDa의 저분자 젤라틴 2.5 g 및 분자량 25 kDa 내지 50 kDa의 고분자 젤라틴 2.5 g을 혼합한 것이다.
구분 젤라틴(g) 후코이단(g) 카르복시메틸 키토산(g)
실시예 4-1 5 0.25 0.25
실시예 4-2 5 0.5 0.25
실시예 4-3 5 0.25 0.5
유전자 전달 복합체를 이용한 생산 세포로의 백시니아 바이러스 전달 효과를 생산된 백시니아 바이러스 역가를 통해 평가하였다. 실시예 4-1, 4-2, 및 4-3의 복합체에 각각 백시니아 바이러스를 혼합하여 처리군 1, 2, 및 3을 제조한 후, 항온 반응 조건을 위하여 세포에 첨가하기 전 상온에서 10 분 동안 보관하였다. 상세한 평가 방법은 하기와 같다:
1) 세포배양(cell culture) 제조
배지는 DMEM(Dulbeco`s Modified Eagle`s Medium) + 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum; FBS)를 이용한다.
2) 세포 시딩(cell seeding)
세포 시딩은 24홈판(24-well plate)의 세포배양 400 μL에 세포를 시딩 (seeding)하여, 3 일 동안 배양한다.
3) 바이러스 접종물 제조 및 세포와 반응
(1) 실시예 4-1, 4-2, 및 4-3의 유전자 전달 복합체를 각각 1 mg/mL 농도로 DMEM 배지를 사용하여 접종물을 제조한다.
(2) 각 접종물에 1MOI의 백시니아 바이러스를 첨가하고, 10 분간 상온에서 항온 반응하여 바이러스 접종물을 제조한다.
(3) 2)의 24-well plate의 세포배양은 제거하고, 바이러스 접종물 400 μL을 첨가한다.
(4) CO2 인큐베이터 (incubator)에 48 시간 동안 배양한다.
4) 바이러스 회수 (virus harvest)
상층액에 있는 바이러스와 세포 내 바이러스를 모두 회수한다. (구체적으로 세포를 터트려 세포 안에 있는 바이러스를 꺼내고, 세포 잔해(debris)는 제거하여 바이러스를 회수한다.)
5) 시험 검정(test-titration)
플라크 검정 방법으로 바이러스 역가 확인한다.
상기 바이러스 회수 방법이란, 바이러스 감염 시 세포 내에서 바이러스는 복제, 증식하여 세포 밖으로 빠져나오게 된다. 이는 바이러스 감염다중농도 (multiplicity of infection, MOI) 및 감염 시간에 따라 바이러스의 복제, 증식과 세포 밖으로 나오는 양은 상이하다. 유전자 전달 복합체를 사용 시 바이러스 증식 속도와 세포 밖으로 나오는 시점에 대한 선행 실험이 이루어지지 않아, 본 실험 조건인 바이러스 감염 농도 1 MOI, 감염시간 48 시간 조건으로 진행하여 역가를 확인하였다. 회수(harvest) 방법은 상등액과 세포 내의 바이러스 모두 회수하여 바이러스의 역가를 확인한 것으로 전체 바이러스를 확인하여 비교한 것이다.
결과
실시예 처리군 역가(pfu/mL)
실시예 4-1 1 7.23 × 106
실시예 4-2 2 6.08 × 106
실시예 4-3 3 9.08 × 106
1 MOI의 바이러스 접종물 감염 후 48 시간 배양하여 세포 밖으로 빠져나온 바이러스와 세포 내에 남아있는 바이러스를 회수하여 역가를 측정하였다. 표 6을 참조하여 설명하면, 실시예 4-3 > 실시예 4-1 > 실시예 4-2 순으로 바이러스 생산량이 높게 나왔다. 실시예 4-3와 4-1를 비교하면, 후코이단 함량은 동일하고, 키토산 함량은 실시예 4-3가 많다. 즉, 키토산 함량이 높을수록 유전자 전달 복합체의 유전자 전달 물질 전달 효과가 높을 수 있다. 또한, 실시예 4-1와 4-2을 비교하면, 키토산 함량은 동일하고 후코이단 함량은 실시예 4-2이 많다. 즉, 후코이단 함량이 높을수록 유전자 전달 복합체의 유전자 전달 물질 전달 효과가 낮아질 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수도 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 젤라틴, 양이온성 생체적합성 물질, 및 음이온성 생체적합성 물질을 포함하는, 유전자 전달 복합체로서,
    상기 젤라틴, 상기 양이온성 생체적합성 물질, 및 상기 음이온성 생체적합성 물질은 서로 가교 결합되는 것인, 유전자 전달 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 젤라틴은 저분자화된 젤라틴으로서,
    상기 젤라틴의 평균 분자량은 5 kDa 내지 40 kDa인 것인, 유전자 전달 복합체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 젤라틴은 제 1 젤라틴 및 제 2 젤라틴을 포함하는 것으로서,
    상기 제 1 젤라틴의 평균 분자량은 25 kDa 내지 50 kDa인 것이며,
    상기 제 2 젤라틴의 평균 분자량은 1.5 kDa 내지 10 kDa인 것인, 유전자 전달 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 양이온성 생체적합성 물질은 키토산 및/또는 올리고키토산을 포함하는 것인, 유전자 전달 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 음이온성 생체적합성 물질은 후코이단, 설폰화 다당류, 및 카르기난에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 유전자 전달 복합체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 가교 결합은 제니핀; 탄닌, 갈산, 탄닌산, 또는 프로안토시아니딘으로부터 선택되는 탄닌류; 카테킨, 에피카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 퀘르세틴, 레스베라트롤, 이소플라본, 플라보노이드류, 및 해조류 유래 폴리페놀으로부터 선택되는 폴리페놀류에서 선택되는 가교제에 의해 형성되는 것인, 유전자 전달 복합체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자 전달 복합체는 구형의 미립자인 것인, 유전자 전달 복합체.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 가교 결합의 가교율은 30% 내지 70%인 것인, 유전자 전달 복합체.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 양이온성 생체적합성 물질의 평균 분자량은 3 kDa 내지 20 kDa이고,
    상기 음이온성 생체적합성 물질의 평균 분자량은 5 kDa 내지 20 kDa인, 유전자 전달 복합체.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자 전달 복합체의 평균 분자량은 15 kDa 내지 50 kDa인, 유전자 전달 복합체.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 젤라틴 : 양이온성 생체적합성 물질 : 음이온성 생체적합성 물질의 중량비가 1 : 0.01 : 0.01 내지 1 : 0.1 : 0.2인 것인, 유전자 전달 복합체.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자 전달 복합체는 치료 유전자를 30 분 내지 48 시간 동안 선택적으로 방출하는 것인, 유전자 전달 복합체.
  13. 제 1 항에 있어서,
    동물 세포, 동물 조직, 및 동물체에서 선택되는 하나 이상에 유전자를 전달하는 것으로서,
    상기 동물은 인간을 제외한 것인, 유전자 전달 복합체.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자 전달 복합체의 표면에 알진산 및/또는 카라기난 코팅을 포함하는, 유전자 전달 복합체.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 유전자 전달 복합체를 포함하는, 약학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 유전자 전달 복합체 농도는 15 mg/mL 미만인 것인, 약학적 조성물.
PCT/KR2022/018959 2022-11-28 2022-11-28 유전자 전달 복합체 WO2024117274A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2022/018959 WO2024117274A1 (ko) 2022-11-28 2022-11-28 유전자 전달 복합체

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2022/018959 WO2024117274A1 (ko) 2022-11-28 2022-11-28 유전자 전달 복합체

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024117274A1 true WO2024117274A1 (ko) 2024-06-06

Family

ID=91323940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/018959 WO2024117274A1 (ko) 2022-11-28 2022-11-28 유전자 전달 복합체

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024117274A1 (ko)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050030371A (ko) * 2003-09-25 2005-03-30 한국생명공학연구원 전이성 암세포에 특이성을 갖는 유전자 전달복합체
KR100819184B1 (ko) * 2007-08-24 2008-04-04 한양대학교 산학협력단 약물전달용 인체유래 재조합 젤라틴 나노입자
KR20150017048A (ko) * 2013-08-05 2015-02-16 한국과학기술연구원 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체 및 그 제조방법
KR20160049682A (ko) * 2014-10-28 2016-05-10 (주)헵틸와이 이중 가교구조의 생체친화형 다공성 시트 및 그 제조방법
KR20210067188A (ko) * 2019-11-29 2021-06-08 대구대학교 산학협력단 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050030371A (ko) * 2003-09-25 2005-03-30 한국생명공학연구원 전이성 암세포에 특이성을 갖는 유전자 전달복합체
KR100819184B1 (ko) * 2007-08-24 2008-04-04 한양대학교 산학협력단 약물전달용 인체유래 재조합 젤라틴 나노입자
KR20150017048A (ko) * 2013-08-05 2015-02-16 한국과학기술연구원 siRNA의 종양 표적화된 전달을 위한 젤라틴 기반 나노입자 복합체 및 그 제조방법
KR20160049682A (ko) * 2014-10-28 2016-05-10 (주)헵틸와이 이중 가교구조의 생체친화형 다공성 시트 및 그 제조방법
KR20210067188A (ko) * 2019-11-29 2021-06-08 대구대학교 산학협력단 난용성 약제를 담지한 알부민-푸코이단-키토산 나노입자

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang et al. A conductive dual-network hydrogel composed of oxidized dextran and hyaluronic-hydrazide as BDNF delivery systems for potential spinal cord injury repair
O’Rorke et al. Non-viral polyplexes: Scaffold mediated delivery for gene therapy
KR100314488B1 (ko) 다당류겔조성물
EP1257257B1 (en) Method for producing delivery systems using preformed biodegradable polymer compositions
CN108653741B (zh) 一种金属有机配位聚合物包裹的天然丝胶蛋白微球及其制备方法和应用
US8790695B2 (en) Medicinal carriers, and preparation method and uses thereof
JP2012528150A (ja) フラボノイドハイドロゲル
CN101417134A (zh) 一种透明质酸修饰的新型三元结构非病毒基因传输系统及其应用
Zhang et al. Chitosan/casein based microparticles with a bilayer shell–core structure for oral delivery of nattokinase
Aminabhavi et al. Polysaccharide-based hydrogels as biomaterials
Mi et al. Postsurgical wound management and prevention of triple-negative breast cancer recurrence with a pryoptosis-inducing, photopolymerizable hydrogel
CN114524950A (zh) 一种磁靶向疏水药物载体水凝胶及其制备方法和应用
WO2014182101A1 (ko) 저분자 메틸셀룰로오스 기반의 비경구 약물 전달 시스템
WO2024117274A1 (ko) 유전자 전달 복합체
Du et al. Enhanced delivery of biodegradable mPEG-PLGA-PLL nanoparticles loading Cy3-labelled PDGF-BB siRNA by UTMD to rat retina
Erel-Akbaba et al. Octaarginine functionalized nanoencapsulated system: In vitro and in vivo evaluation of bFGF loaded formulation for wound healing
WO2019182278A1 (ko) 친수성 및 소수성 약물의 동시 전달을 위한 온도민감성 나노스펀지 플랫폼 및 이의 용도
Sezer et al. Comparison on in vitro characterization of fucospheres and chitosan microspheres encapsulated plasmid DNA (pGM-CSF): Formulation design and release characteristics
CN114642765B (zh) 一种治疗软组织损伤的可注射水凝胶细胞支架材料及其制备方法和应用
Veronese et al. Influence of PEGylation on the release of low and high molecular-weight proteins from PVA matrices
WO2017078277A1 (ko) 약물 지속 방출형 나노 입자 및 상기 나노입자로 표면 개질된 췌장소도세포를 포함하는 당뇨병 치료용 약학 조성물
Sui et al. Esterase‐Activatable and Glutathione‐Responsive Triptolide Nano‐Prodrug for the Eradication of Pancreatic Cancer
KR101755680B1 (ko) 단백질 약물 전달용 다당류 나노겔 및 이의 제조방법
KR20240079260A (ko) 유전자 전달 복합체
WO2022114348A1 (ko) 콜라겐-알지네이트 창상피복재 및 이의 제조방법