WO2024111823A1 - 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체 - Google Patents

더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체 Download PDF

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WO2024111823A1
WO2024111823A1 PCT/KR2023/013430 KR2023013430W WO2024111823A1 WO 2024111823 A1 WO2024111823 A1 WO 2024111823A1 KR 2023013430 W KR2023013430 W KR 2023013430W WO 2024111823 A1 WO2024111823 A1 WO 2024111823A1
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WO
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ultrasound
drug
delivery system
drug delivery
double emulsion
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PCT/KR2023/013430
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박동희
박종률
김가영
원종호
김철우
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(주) 바이오인프라생명과학
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a drug delivery vehicle, and more specifically, to an ultrasound-sensitive drug delivery vehicle with a double emulsion structure for effectively delivering drugs.
  • a drug delivery system can be said to be a dosage formulation for efficiently delivering the amount of drug needed to treat a disease by minimizing the side effects of the drug and optimizing the efficacy and effects of the drug. .
  • These drug delivery systems include transdermal, oral, or vascular methods depending on the drug delivery route. Additionally, a drug delivery system that treats affected areas by introducing micro-sized capsules into blood vessels is attracting attention as a dream treatment technology in the future.
  • the element technology can be said to be the technology to accurately target the drug to the target affected area and the technology to control the release of the drug from the affected area. Therefore, the targeted drug delivery system using ultrasound and ultrasound-sensitive drug delivery systems is a technology that can solve these problems, and has recently been attracting more attention.
  • microbubbles used as ultrasound contrast agents undergo cavitation due to ultrasonic energy, and this phenomenon increases the effect of drug delivery into the skin or cells.
  • the desired drug or receptor is attached to the membrane of microbubbles. An attempt was made to deliver drugs to the human body by binding a receptor to a ligand.
  • this method binds the drug to the membrane surface, the drug may be lost while the microbubbles are moving to the target location, so there is a limitation in that it cannot perfectly perform the role of a drug delivery vehicle. Additionally, there is a limitation in that it cannot carry a large amount of drugs.
  • the purpose of the present invention is to solve all of the above-mentioned problems.
  • Another purpose of the present invention is to protect the drug from the external environment by allowing the drug to be loaded inside the ultrasonic-sensitive drug delivery system.
  • another purpose of the present invention is to allow a certain amount or more of a drug to be loaded into an ultrasound-sensitive drug delivery system in order to exhibit significant drug effects.
  • Another purpose of the present invention is to ensure that the drug is effectively delivered to the target area to which ultrasonic energy is irradiated by exhibiting high responsiveness to ultrasonic energy.
  • another purpose of the present invention is to ensure that the drug is delivered intensively to the target area by preventing the drug loaded in the ultrasound-sensitive drug delivery system from being released naturally.
  • Another object of the present invention is to ensure that a certain amount of hydrophilic drug-carrying particles are included in an ultrasonic-sensitive drug delivery system containing oil in the internal space.
  • the characteristic configuration of the present invention is as follows.
  • an ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure includes: a shell; Oil mounted in the internal space formed by the shell; An ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure is disclosed, which is mounted in the internal space formed by the shell and includes a plurality of hydrophilic drug-carrying particles, each carrying a hydrophilic drug.
  • the hydrophilic drug-carrying particles are mixed with (i) a hydrophilic drug aqueous solution in which the hydrophilic drug is dissolved and (ii) a surfactant-dissolved oil in which the surfactant is dissolved in the oil, and then the first RPM (revolutions per minute) ) is included in an emulsion formed by performing mechanical mixing according to the method, and the ultrasound-sensitive drug carrier of the double emulsion structure is produced by performing the mechanical mixing according to the second RPM after mixing the phospholipid aqueous solution and the emulsion.
  • An ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure is disclosed.
  • an ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure is disclosed, wherein an inert gas is additionally loaded into the internal space formed by the shell.
  • an ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure wherein the size distribution of the hydrophilic drug-carrying particles is a specific size distribution with a value within a predetermined deviation based on a specific size.
  • the size of the hydrophilic drug-carrying particles is adjusted from the first size distribution to the specific size distribution - the specific size distribution has a smaller value than the first size distribution - by a size adjustment device.
  • An ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure is disclosed.
  • the inert gases include perfluoromethane, perfluoroethane, perfluoropropane, perfluorobutane, perfluoropentane, perfluorohexane, perfluoroheptane, perfluorooctane, decafluoropentane, perfluoro(2-methyl-3-pentanone), perfluorotributylamine, perfluoro-15-crown-5-ether, perfluoro1
  • An ultrasound-sensitive drug carrier with a double emulsion structure is disclosed, which includes at least some of 3-dimethylcyclohexane, perfluoromethylcyclopentane, perfluorodecalin, perfluoromethyldecalin, perfluoroperhydrobenzyltetralin, PERFECTA, and sulfur hexafluoride.
  • an ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure wherein the hydrophilic drug includes at least some of an anthracycline-based anticancer agent, an antimetabolite-based anticancer agent, and a hypomethylating agent-based anticancer agent.
  • the anthracycline anticancer agent includes at least some of daunorubicin, doxorubicin, mictoxantrone, epirubicin, and caminomycin, the antimetabolite anticancer agent includes cytarabine, and the hypomethylating agent anticancer agent.
  • an ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure wherein a hydrophobic drug is additionally loaded into the internal space formed by the shell.
  • an ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure is disclosed, wherein an inert gas is additionally loaded into the internal space formed by the shell.
  • an ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure wherein the hydrophilic drug-carrying particle includes a mini-shell formed of a surfactant.
  • an ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure wherein the shell is formed of a phospholipid monolayer.
  • the present invention has the effect of protecting the drug from the external environment by allowing the drug to be loaded inside the ultrasonic-sensitive drug delivery system.
  • the present invention has the effect of allowing a certain amount or more of a drug to be loaded into an ultrasound-sensitive drug delivery system in order to exhibit significant drug effects.
  • the present invention exhibits high responsiveness to ultrasonic energy, which has the effect of effectively delivering drugs to the target area to which ultrasonic energy is irradiated.
  • the present invention has the effect of ensuring that the drug is delivered intensively to the target area by preventing the drug loaded in the ultrasound-sensitive drug delivery system from being released naturally.
  • the present invention has the effect of ensuring that a certain amount or more of hydrophilic drug-carrying particles are included in an ultrasonic-sensitive drug delivery system containing oil in the internal space.
  • Figure 1 shows an ultrasound-sensitive drug delivery system with a double emulsion structure according to an embodiment of the present invention.
  • Figures 2a to 2c illustrate the process of producing an ultrasound-sensitive drug delivery system with a double emulsion structure according to an embodiment of the present invention
  • Figure 3 shows a ternary phase diagram showing the results of confirming the stability of the first emulsion (i.e., the emulsion before size adjustment);
  • Figures 4a to 4c show the results of confirming the effect of surfactant on the stability of hydrophilic drug-carrying particles included in the first emulsion
  • FIGS. 5 to 8 show various experimental results on size-controlled hydrophilic drug-loading particles
  • Figure 9 shows the results of actually observing an ultrasound-sensitive drug delivery system with a double emulsion structure
  • Figure 10 shows the results of confirming the drug release rate when the ultrasound-sensitive drug delivery system with a double emulsion structure according to an embodiment of the present invention was placed in a dialysis bag containing a PBS buffer solution at 37 degrees Celsius.
  • Figures 11a and 11b show the results of applying an ultrasound-sensitive drug delivery system with a double emulsion structure according to an embodiment of the present invention with ultrasound;
  • Figures 12a to 12d show the cancer cell killing effect of the ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure of the present invention
  • Figures 13a to 13d show an ultrasound-sensitive drug delivery system having a double emulsion structure additionally loaded with a hydrophobic drug.
  • the present invention encompasses all possible combinations of the embodiments shown herein. It should be understood that the various embodiments of the invention are different from one another but are not necessarily mutually exclusive. For example, specific shapes, structures and characteristics described herein with respect to one embodiment may be implemented in other embodiments without departing from the spirit and scope of the invention. Additionally, it should be understood that the location or arrangement of individual components within each disclosed embodiment may be changed without departing from the spirit and scope of the invention. Accordingly, the detailed description that follows is not intended to be taken in a limiting sense, and the scope of the invention is limited only by the appended claims, together with all equivalents to what those claims assert, if properly described. Similar reference numbers in the drawings refer to identical or similar functions across various aspects.
  • Figure 1 schematically shows an ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 with a double emulsion structure according to an embodiment of the present invention.
  • the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 having a double emulsion structure may have a shell 1100 formed on its outer surface.
  • the shell 1100 may be formed of a phospholipid monolayer.
  • the internal space surrounded by the shell 1100 may include hydrophilic drug-carrying particles 1200 and oil 1300 carrying the hydrophilic drug 1210.
  • the internal space surrounded by the shell 1100 may additionally contain an inert gas 1400, through which the drug delivery effect due to ultrasonic irradiation can be maximized.
  • the hydrophilic drug 1210 may mean a drug that is soluble only in water and not at all in oil, but is of course not limited thereto, and may include drugs that are more soluble in water even if a small amount is soluble in oil.
  • the hydrophilic drug 1210 may include at least some of an anthracycline-based anticancer agent, an antimetabolite-based anticancer agent, and a hypomethylating agent-based anticancer agent.
  • the anthracycline-based anticancer agent may include at least some of daunorubicin, doxorubicin, mictoxantrone, epirubicin, and caminomycin
  • the antimetabolite-based anticancer agent may include cytarabine
  • the hypomethylating agent-based anticancer agent may include at least some of azacitidine and decitabine.
  • the oil 1300 included in the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure is almond oil, apricot oil, and avocado oil.
  • oil canola oil, castor oil, coconut oil, cocoa oil, corn oil, cottonseed oil, linseed oil. oil), medium-chain triglyceride (MCT) oil, palm oil, soybean oil, and sunflower oil.
  • MCT medium-chain triglyceride
  • the inert gas 1400 that may be additionally included in the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of the double emulsion structure according to an embodiment of the present invention is a perfluorocarbon-based gas (e.g., perfluoromethane, perfluoroethane, perfluoropropane, perfluorobutane, perfluoropentane, perfluorohexane, perfluoroheptane, perfluorooctane, decafluoropentane, perfluoro(2-methyl-3-pentanone), perfluorotributylamine, perfluoro-15-crown-5-ether, perfluoro-1,3-dimethylcyclohexane, perfluoromethylcyclopentane, perfluorodecalin, fluoromethyldecalin , perfluoroperhydrobenzyltetralin, PERFECTA, etc.), sulfur hexafluoride, and air.
  • the shell 1100 formed on the outside of the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure according to an embodiment of the present invention shown in FIG. 1 is in the form of a phospholipid single layer. .
  • the head portion of the phospholipid is hydrophilic and the tail portion is hydrophobic
  • the interior of the ultrasound-sensitive drug carrier including a shell formed of a phospholipid monolayer, as shown in FIG. 1 becomes hydrophobic. Therefore, in the past, there was a problem that it was difficult to load a hydrophilic drug into the internal space of a drug delivery vehicle containing a shell formed of a phospholipid monolayer.
  • the solubility in water is more than 10mg/mL, while the solubility in oil is less than 100ug/mL, so doxorubicin, oil, and phospholipid aqueous solution were mechanically mixed according to the conventional technique. Therefore, even if a drug carrier containing a shell formed of a phospholipid monolayer is created, there is a problem that only hydrophobic oil is easily loaded inside the drug carrier created in this way, and hydrophilic doxorubicin is not loaded or is loaded only in a very small amount.
  • the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure includes hydrophilic drug-carrying particles 1200 carrying a hydrophilic drug 1210.
  • the emulsion and the phospholipid aqueous solution are mechanically mixed to achieve the effect of effectively loading the hydrophilic drug-carrying particles 1200 in the internal space.
  • the emulsion can be formed by performing mechanical mixing according to the first RPM (revolutions per minute).
  • the emulsion may include hydrophilic drug-loading particles 1200, and the shell 1220 of the hydrophilic drug-loading particles 1200 may include a surfactant 300.
  • the emulsion containing the hydrophilic drug-carrying particles (1200) is an emulsion in which the dispersed phase is water and the continuous phase is oil, so the hydrophilic drug-carrying particles (1200) may correspond to reverse-phase particles, and these hydrophilic drug-carrying particles (1200) )
  • the exterior of the shell 1220 may be hydrophobic, and the interior of the shell 1220 may be hydrophilic. In this way, a relatively stable emulsion can be formed by using a surfactant with a relatively low hydrophilic-lipophilic balance (HLB).
  • HLB hydrophilic-lipophilic balance
  • the stability of the hydrophilic drug-loading particles 1200 is increased, the size of the hydrophilic drug-loading particles 1200 is uniformly formed, and the amount of the hydrophilic drug 1210 supported on the hydrophilic drug-loading particles 1200 is made uniform.
  • a process of adjusting the size of the hydrophilic drug-carrying particles can be performed, as shown in FIG. 2b.
  • the size distribution of the hydrophilic drug-carrying particles (1200_1) contained in the first emulsion is The first emulsion may be formed to have a first size distribution.
  • the first size distribution may be 1um to 5um.
  • the second size A second emulsion containing distributed hydrophilic drug-carrying particles (1200_2) can be formed as the emulsion. That is, the size of the hydrophilic drug-carrying particles contained in the first emulsion can be adjusted so that the size distribution of the hydrophilic drug-carrying particles has a specific size distribution within a predetermined deviation based on a specific size.
  • the second size distribution (specific size distribution) may be 100 nm or less.
  • a membrane filter and extruder may be used as the size adjustment device, but the present invention is not limited thereto.
  • an ultrasound-sensitive drug delivery system (1000) with an emulsion structure can be produced.
  • a vial mixer or a homogenizer may be used for mechanical mixing to produce the ultrasound-sensitive drug delivery vehicle 1000 of a double emulsion structure, but the present invention is not limited thereto.
  • inert gas 600 may be additionally mixed.
  • emulsion e.g., the second emulsion when the size of the hydrophilic drug-carrying particles is adjusted
  • inert gas 600
  • mechanical mixing is performed according to the second RPM.
  • a hydrophobic drug may be additionally loaded inside the ultrasonic-sensitive drug delivery vehicle 1000 of a double emulsion structure.
  • mechanical mixing is performed according to the second RPM to form a double emulsion structure containing hydrophilic drug-carrying particles, oil, and hydrophobic drug inside.
  • An ultrasound-sensitive drug delivery system (1000) can be produced.
  • a hydrophobic drug-dissolving emulsion may be formed by dissolving the hydrophobic drug in the emulsion after the emulsion is formed, but the present invention is not limited thereto.
  • a hydrophilic drug aqueous solution may be mixed with oil in which a surfactant and a hydrophobic drug are dissolved and then mechanically mixed at a first RPM to form a hydrophobic drug-dissolving emulsion.
  • the ultrasound of the double emulsion structure is used.
  • An inert gas may be additionally loaded into the internal space formed by the shell of the sensitive drug delivery system 1000.
  • hydrophobic drugs include bendamustine, busulfan, carmustine, chlorambucil, cyclophosphamide, dacarbazine, ifosfamide, melphalan, procarbazine, streptozocin, temozolomide, asparaginase, Capecitabine, cytarabine, 5-fluorouracil, fludarabine, gemcitabine, methotrexate, pemetrexed, raltitrexed, actinomycin-D, bleomycin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin , mitomycin, mitoxantrone, etoposide, docetaxel, irinotecan, paclitaxel, topotecan, vinblastine, vincristine, vinorelbine, carboplatin, cisplatin, oxaliplatin, alemtuzumab, BCG, bevacizumab, Cetuximab
  • the phospholipid aqueous solution used to form a shell on the outer surface of the ultrasound-sensitive drug delivery vehicle 1000 having a double emulsion structure may contain at least some of DPPC, DPPA, and cholesterol.
  • the present invention is not limited to this, and the phospholipid aqueous solution includes phosphatidylcholine-based substances (HSPC, DEPC, DOPC, and DMPC, etc.), DMPA-NA, DPPA-Na, DOPA-Na, DSPE, and DSPE-mPEG. , DSPE-mPEG-2000-Na, DSPE-mPEG-5000-Na, and DSPE-Maleimide PEG-2000-Na.
  • the diameter of the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 with a double emulsion structure according to an embodiment of the present invention produced through the above process may be 700 nm to 3 um.
  • the present invention is not limited to this, and the size of the double emulsion-structured ultrasonic-sensitive drug delivery vehicle 1000 may be formed in various ways depending on the rpm value of mechanical mixing or the viscosity of the oil.
  • certain drugs e.g., doxorubicin, etc.
  • certain oils e.g., MCT oil, etc.
  • certain inert gases e.g., perfluorohexane
  • certain phospholipid aqueous solutions e.g., phospholipids, including DPPC, DPPA, and cholesterol.
  • a hydrophilic drug aqueous solution in which doxorubicin is dissolved in distilled water at a concentration of 5 mg/ml and (ii) a surfactant-dissolved oil in which 20 ml of span85 (surfactant) is dissolved in 80 ml of MCT oil at a volume ratio of 20:80. can be mixed.
  • a first emulsion containing hydrophilic drug-carrying particles having a size distribution of 1 may be formed.
  • Figure 3 schematically shows a ternary phase diagram showing the results of confirming the stability of the first emulsion (i.e., the emulsion before size adjustment).
  • the volume occupied by water in the first emulsion is 10% to 20%
  • the volume occupied by oil in the first emulsion is 20% to 80%
  • the interface in the first emulsion It can be confirmed that when the volume occupied by the activator (Span 85) is 10% to 70%, the first emulsion in a stable state is formed.
  • the volume occupied by water in the first emulsion is 20%
  • the volume occupied by oil in the first emulsion is 40%
  • the surfactant in the first emulsion It can be seen that when the volume occupied by (Span 85) is 40%, the first emulsion in a stable state is formed.
  • the volume occupied by water in the first emulsion is 10%
  • the volume occupied by oil in the first emulsion is 20%
  • the surfactant in the first emulsion It can be seen that when the volume occupied by (Span 85) is 70%, the first emulsion in a stable state is formed.
  • Figures 4a to 4c schematically show the results of confirming the effect of surfactant on the stability of hydrophilic drug-carrying particles included in the first emulsion.
  • the size of the particles was observed to be 10um to 35um. Accordingly, it can be seen that the size deviation between particles is very large, and when the surfactant is 10% dissolved in oil, the size deviation between particles is reduced, but it is confirmed that a large size deviation still exists.
  • the target size range for example, 5um to 10um
  • Figures 5 to 8 schematically show various experimental results on hydrophilic drug-carrying particles whose size was adjusted to further increase stability.
  • the hydrophilic drug-loading particles 52 having the first size distribution that is, the hydrophilic drug-loading particles 52 before the size is adjusted, have a size distribution of 1 um to 5 um, while the hydrophilic drug-loading particles 52 having the second size distribution. It was observed that most of the drug-carrying particles 53, that is, the hydrophilic drug-carrying particles 53 after the size was adjusted, had a size distribution of 100 nm or less.
  • Figure 5a shows a case where the size of the hydrophilic drug-carrying particles is adjusted using an extruder 51 and a filter (not shown), but the present invention is not limited thereto, and, for example, at room temperature.
  • the size of the hydrophilic drug-carrying particles can also be adjusted by passing them through a fludizer three times at a pressure of MF 500 bar.
  • the state before centrifugation (before centrifuge) and the state after centrifugation (after centrifuge) for the first emulsion (before extruder) and the second emulsion (after extruder) can be confirmed.
  • centrifugation was performed at 2000 RPM for 10 minutes.
  • the color of the second emulsion shown in Figure 6a is lighter than the color of the first emulsion, so the hydrophilic drug contained in the second emulsion is supported. It can be inferred that the size of the particles is smaller than the size of the hydrophilic drug-carrying particles contained in the first emulsion.
  • Figure 6b is a microscope image of the hydrophilic drug-loading particles before centrifugation
  • Figure 6c is a microscope image of the hydrophilic drug-loading particles after centrifugation
  • 6d is a confocal microscope image of the hydrophilic drug-loading particles after centrifugation. Referring to the results shown in Figures 6b to 6d, the smaller the size of the hydrophilic drug-loading particles, the faster the centrifugation. It can be confirmed that there is no precipitation, and from this, it can be inferred that the smaller the size of the hydrophilic drug-loading particles, the higher the stability of the hydrophilic drug-loading particles.
  • the white scale bar shown at the bottom right of each of FIGS. 6B to 6D indicates a length of 5 ⁇ m.
  • Figure 7 shows (i) a first emulsion (before extruder) containing hydrophilic drug-supporting particles carrying doxorubicin and (ii) a second emulsion (after extruder) containing hydrophilic drug-carrying particles carrying doxorubicin, respectively. After centrifugation was performed, chromatography for each supernatant (i.e., the portion not precipitated by centrifugation) is shown.
  • the peak value at the 6th minute of the second emulsion is significantly higher than the peak value at the 6th minute of the first emulsion. From this, it can be seen that the hydrophilic drug-carrying particles contained in the second emulsion carry significantly more drug (doxorubicin) than the hydrophilic drug-carrying particles contained in the first emulsion, and the stability of the hydrophilic drug-carrying particles contained in the second emulsion is You can see that it is significantly higher.
  • the amount of drug present in the upper layer decreased by more than 58% from the amount of drug present in the upper layer before centrifugation, whereas for the second emulsion, the amount of drug present in the upper layer was reduced by more than 58%. It was confirmed that the amount of drug present in the upper layer after separation was reduced by approximately 18% from the amount of drug present in the upper layer before centrifugation.
  • Figure 8 shows (i) a case where a hydrophilic drug (doxorubicin) is added alone to a dialysis bag containing a PBS buffer solution at 37 degrees Celsius, and (ii) a first emulsion containing hydrophilic drug-carrying particles whose size is not adjusted.
  • a hydrophilic drug doxorubicin
  • a first emulsion containing hydrophilic drug-carrying particles whose size is not adjusted.
  • the results of confirming the drug release rate in which the hydrophilic drug is naturally released to the outside of the dialysis bag are schematically shown. .
  • the natural drug release rate is high, even if the drug is injected into the subject, it will be released from the blood vessels to the surrounding tissues due to osmotic pressure before the drug reaches the target area, effectively delivering the drug to the desired area at the desired timing. There is a problem that makes it difficult to do this.
  • the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure according to an embodiment of the present invention is injected into a subject, the amount lost before the drug reaches the target area is minimized and the drug is delivered to the desired area at the desired timing. This means that the drug can be delivered effectively.
  • Figure 9 shows the results of actually observing the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of the double emulsion structure, matching the picture explained in Figure 1.
  • FIG. 9 a crescent-shaped green area can be seen, which shows that a large amount of hydrophilic drug-carrying particles carrying green doxorubicin are loaded inside the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure.
  • the dark area of the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of the double emulsion structure corresponds to the area occupied by the inert gas.
  • Figure 10 schematically shows the drug release rate when the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure according to an embodiment of the present invention is placed in a dialysis bag containing a PBS buffer solution at 37 degrees Celsius.
  • the drug release rate of the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of the double emulsion structure after 2 hours is about 20%. You can. This corresponds to a value reduced by nearly half compared to the drug release rate of the second emulsion after 2 hours in FIG. 8. From this, it can be seen that the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of the double emulsion structure of the present invention carries the drug very stably by doubly protecting the drug.
  • the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of the double emulsion structure when the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of the double emulsion structure was irradiated with ultrasound (US treated) after 2 hours, the drug release rate increased by nearly 17% compared to the case where ultrasound was not irradiated. From this, it can be seen that the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of the double emulsion structure of the present invention has very high sensitivity to ultrasound.
  • the frequency was set to 1 MHz, intensity to 2.5 watt, duty cycle to 5%, pulse repetition frequency to 10 Hz, and pulse duration to 100 ms, and the drug release rate was confirmed after irradiating ultrasound for 5 minutes.
  • Figure 11a shows the application of the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure according to an embodiment of the present invention to MDA-MB-231 cells, irradiation of ultrasound, and then the double emulsion structure while varying the wavelength of light.
  • This is the result of observing whether the hydrophilic drug-carrying particles contained in the emulsion-structured ultrasound-sensitive drug delivery vehicle (1000) or the drug (doxorubicin) loaded therein are effectively introduced into the cells.
  • the frequency was set to 1 MHz, intensity to 2.5 watt, duty cycle to 5%, pulse repetition frequency to 10 Hz, and pulse duration to 100 ms, and ultrasound was irradiated for 5 minutes.
  • the first column (Bright field) represents the results observed in the visible light region
  • the second column (DOX) represents the results observed for the doxorubicin delivery effect in the wavelength range of 514 nm to 580 nm
  • the third column (DAPI) shows the results of observing the position of the cell nucleus in the wavelength range of 350 nm to 461 nm while the nucleus of the cell was stained using DAPI staining reagent
  • the fourth column ( Merge) indicates the result of confirming whether doxorubicin was effectively injected into the nucleus of the cell or its surroundings by merging the results of the second and third columns.
  • the white scale bar displayed at the bottom right of each of the 16 images indicates a length of 20um.
  • FIG. 11b shows the results of observing the fluorescence intensity.
  • the ultrasound-sensitive drug carrier (1000) of a double emulsion structure is applied to cells while irradiating ultrasound (i.e., DE+US)
  • the fluorescence intensity value is overwhelmingly higher than the other three cases. You can check the point.
  • Figures 12A to 12D schematically show the cancer cell killing effect of the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 having a double emulsion structure of the present invention.
  • the ultrasound-sensitive drug carrier (1000) of a double emulsion structure containing approximately 40 ng of hydrophilic drug is applied to cancer cells without irradiating ultrasound, the hydrophilic drug-carrying particles or hydrophilic drug are inside the cancer cells. As it is injected, it can be confirmed that it shows a viability of 77%.
  • the ultrasound-sensitive drug carrier 1000 of a double emulsion structure containing approximately 40 ng of a hydrophilic drug is applied to cancer cells while irradiating ultrasound, a large amount of hydrophilic drug or hydrophilic drug-carrying particles are injected into the cancer cells, It was confirmed that the viability was 60%.
  • the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 with a double emulsion structure has high sensitivity to ultrasound and is therefore excellent at delivering drugs inside cells.
  • FIGS. 12C and 12D This can also be confirmed through FIGS. 12C and 12D.
  • the ultrasound-sensitive drug carrier 1000 of a double emulsion structure is applied to cancer cells while irradiating ultrasound.
  • the drug delivery system 1000 was applied to cancer cells (FIG. 12D)
  • the frequency was set to 1 MHz, intensity to 2.5 watt, duty cycle to 5%, pulse repetition frequency to 10 Hz, and pulse duration to 100 ms, and ultrasound was irradiated for 5 minutes.
  • the white scale bar displayed at the bottom right of each of FIGS. 12C and 12D indicates a length of 20 ⁇ m.
  • Figures 13a to 13d schematically show an ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure additionally loaded with a hydrophobic drug.
  • FIG. 13a it is overall similar to the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of the double emulsion structure described in FIG. 1, but the hydrophobic drug (e.g., Nile red) is dissolved in the oil 1300, thereby creating an ultrasound-sensitive drug delivery system 1300. It can be seen that it is additionally mounted on the drug delivery system 1000.
  • the hydrophobic drug e.g., Nile red
  • Figures 13b to 13d show the results of an experiment in which fluorescent Nile red was additionally loaded as a hydrophobic drug into the ultrasonic-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure for convenience of experiment. It goes without saying that at least one of the hydrophobic drugs described above can be additionally loaded inside the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure instead of Nile red.
  • Figure 13b shows the results of observing the ultrasound-sensitive drug delivery system (1000) with a double emulsion structure in the wavelength range of 520 nm to 640 nm.
  • Nile red shows the ultrasound-sensitive drug delivery system (1000) with a double emulsion structure through the part marked in red. ) You can see that it is installed in large quantities inside.
  • Figure 13c shows the results of observing the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 with a double emulsion structure in the wavelength range of 480 nm to 550 nm, and the portion marked in green shows that doxorubicin is an ultrasound-sensitive drug delivery system with a double emulsion structure ( 1000) You can see that it is installed in large quantities inside.
  • the hydrophilic drug-carrying particles carrying doxorubicin are distributed in the oil phase, and Nile red is dissolved in the oil, so as shown in Figures 13b to 13d, doxorubicin and Nile red are only colored in the same area. You can see what is observed differently.
  • a synergistic effect can be expected by simultaneously loading a hydrophilic drug and a hydrophobic drug inside the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 of a double emulsion structure.
  • a hydrophilic drug when using only the hydrophilic drug alone, 100 ng is required for effective cancer cell killing, and when a hydrophobic drug is additionally loaded inside the ultrasound-sensitive drug delivery system 1000 with a double emulsion structure, the hydrophilic drug and the hydrophobic drug The same/similar cancer cell killing effect can be expected with just 20ng of each drug.

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Abstract

더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체에 있어서, 쉘(shell); 상기 쉘에 의해 형성되는 내부 공간에 탑재되는 오일; 상기 쉘에 의해 형성되는 상기 내부 공간에 탑재되며, 친수성 약물을 각각 담지하는 복수의 친수성 약물 담지 입자;를 포함하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.

Description

더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체
본 발명은 약물전달체에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 약물을 효과적으로 전달하기 위한 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체에 관한 것이다.
약물전달시스템(DDS: Drug Delivery System)은 약물의 부작용을 최소화하고 약물이 가지고 있는 효능 및 효과를 최적화하여 질병치료를 위하여 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달하기 위한 제형(dosage formulation)이라 할 수 있다.
이러한 약물전달시스템은 약물전달경로에 따라서 경피, 경구 또는 혈관을 통한 방법 등이 있다. 또한 마이크로 크기의 캡슐을 혈관에 도입하여 환부를 치료하는 약물전달시스템이 앞으로 꿈의 치료기술로서 각광을 받고 있다.
그리고 약물전달시스템의 기술 중에서 요소기술은 약물을 목적하는 환부에 정확히 타겟팅하는 기술과 환부에서의 약물방출을 제어하는 기술이라고 할 수 있다. 따라서 초음파와 초음파 감응형 약물전달체에 의한 표적약물전달 시스템은 이러한 문제점들을 해결할 수 있는 기술로서, 최근에 더욱 관심을 모으고 있다.
특히, 초음파 조영제로 사용되는 미소기포는 초음파 에너지에 의해 공동화 현상(cavitation)이 발생하고 이 현상은 피부나 세포 내부로의 약물전달 효과를 증가시킨다는 연구 결과에 따라 미소기포의 막에 원하는 약물이나 수용체(receptor)를 리간드 결합(ligand binding)하여 약물을 인체에 전달하고자 하였다.
그러나, 이러한 방법은 막 표면에 약물을 결합시키므로, 미소기포가 타겟 위치까지 이동하는 중에 약물의 유실이 발생할 수 있어 약물전달체의 역할을 완벽하게 수행할 수 없다는 한계가 있다. 또한, 많은 양의 약물을 탑재할 수 없다는 점에서 한계가 있다.
따라서, 상기 문제점들을 해결하기 위한 개선 방안이 요구되는 실정이다.
본 발명은 상술한 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 초음파 감응형 약물전달체의 내부에 약물이 탑재되도록 함으로써 외부 환경으로부터 약물을 보호하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 유의한 약물 효과를 나타내기 위해 일정량 이상의 약물이 초음파 감응형 약물전달체에 탑재되도록 하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 초음파 에너지에 높은 반응성을 나타내어 초음파 에너지가 조사되는 표적 영역에서 약물이 효과적으로 전달되도록 하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 초음파 감응형 약물전달체에 탑재된 약물이 자연적으로 방출되지 않도록 함으로써 표적 영역에 약물이 집중적으로 전달되도록 하는 것을 또 다른 목적으로 한다
또한, 본 발명은 내부 공간에 오일을 포함하는 초음파 감응형 약물전달체에 일정량 이상의 친수성 약물 담지 입자가 포함되도록 하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기한 바와 같은 본 발명의 목적을 달성하고, 후술하는 본 발명의 특징적인 효과를 실현하기 위한, 본 발명의 특징적인 구성은 하기와 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체에 있어서, 쉘(shell); 상기 쉘에 의해 형성되는 내부 공간에 탑재되는 오일; 상기 쉘에 의해 형성되는 상기 내부 공간에 탑재되며, 친수성 약물을 각각 담지하는 복수의 친수성 약물 담지 입자;를 포함하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 친수성 약물 담지 입자는, (i) 상기 친수성 약물이 용해된 친수성 약물 수용액 및 (ii) 상기 오일에 계면활성제가 용해된 계면활성제 용해 오일이 혼합된 후, 제1 RPM(revolutions per minute)에 따라 기계적 믹싱이 수행됨으로써 형성되는 에멀젼에 포함되며, 상기 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체는, 인지질 수용액 및 상기 에멀젼이 혼합된 후, 제2 RPM에 따라 상기 기계적 믹싱이 수행됨으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 쉘에 의해 형성되는 상기 내부 공간에 불활성 가스가 추가로 탑재되는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 친수성 약물 담지 입자의 크기 분포는, 특정 크기를 기준으로 하여 소정 편차 이내의 값을 가지는 특정 크기 분포인 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 친수성 약물 담지 입자는, 사이즈 조절 장치에 의해 제1 크기 분포로부터 상기 특정 크기 분포 - 상기 특정 크기 분포는 상기 제1 크기 분포보다 작은 값을 가짐 - 가 되도록 그 크기가 조절된 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 불활성 가스는, perfluoromethane, perfluoroethane, perfluoropropane, perfluorobutane, perfluoropentane, perfluorohexane, perfluoroheptane, perfluorooctane, decafluoropentane, perfluoro(2-methyl-3-pentanone), perfluorotributylamine, perfluoro-15-crown-5-ether, perfluoro1,3-dimethylcyclohexane, perfluoromethylcyclopentane, perfluorodecalin, perfluoromethyldecalin, perfluoroperhydrobenzyltetralin, PERFECTA 및 sulfur hexafluoride 중 적어도 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 친수성 약물은, 안트라사이클린 계 항암제, 대사길항제 계 항암제 및 저메틸화 작용제 계 항암제 중 적어도 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 안트라사이클린 계 항암제는 다우노루비신, 독소루비신, 믹톡산트론, 에피루비신 및 카미노마이신 중 적어도 일부를 포함하고, 상기 대사길항제 계 항암제는 시타라빈을 포함하며, 상기 저메틸화 작용제 계 항암제는 아자시티딘 및 데시타빈 중 적어도 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 쉘에 의해 형성되는 상기 내부 공간에 소수성 약물이 추가로 탑재되는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 쉘에 의해 형성되는 상기 내부 공간에 불활성 가스가 추가로 탑재되는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 친수성 약물 담지 입자는, 계면활성제로 형성된 미니 쉘을 포함하는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
일례로서, 상기 쉘은 인지질 단일층으로 형성된 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체가 개시된다.
본 발명은 초음파 감응형 약물전달체의 내부에 약물이 탑재되도록 함으로써 외부 환경으로부터 약물을 보호하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 유의한 약물 효과를 나타내기 위해 일정량 이상의 약물이 초음파 감응형 약물전달체에 탑재되도록 하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 초음파 에너지에 높은 반응성을 나타내어 초음파 에너지가 조사되는 표적 영역에서 약물이 효과적으로 전달되도록 하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 초음파 감응형 약물전달체에 탑재된 약물이 자연적으로 방출되지 않도록 함으로써 표적 영역에 약물이 집중적으로 전달되도록 하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 내부 공간에 오일을 포함하는 초음파 감응형 약물전달체에 일정량 이상의 친수성 약물 담지 입자가 포함되도록 하는 효과가 있다.
본 발명의 실시예의 설명에 이용되기 위하여 첨부된 아래 도면들은 본 발명의 실시예들 중 단지 일부일 뿐이며, 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자(이하 "통상의 기술자")에게 있어서는 발명적 작업이 이루어짐 없이 이 도면들에 기초하여 다른 도면들이 얻어질 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체를 도시한 것이고,
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체를 생성하는 과정을 도시한 것이고,
도 3은 제1 에멀젼(즉, 사이즈 조절 전의 에멀젼)의 안정성을 확인한 결과를 나타내는 터너리 페이즈 다이어그램(Ternary phase diagram)을 도시한 것이고,
도 4a 내지 도 4c는 제1 에멀젼에 포함되는 친수성 약물 담지 입자의 안정성에 계면활성제가 미치는 영향을 확인한 결과를 도시한 것이고,
도 5 내지 도 8은 사이즈가 조절된 친수성 약물 담지 입자에 대한 여러가지 실험결과들을 도시한 것이고,
도 9는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체를 실제로 관찰한 결과를 도시한 것이고,
도 10은, 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체를 섭씨 37도의 PBS buffer 용액이 담긴 투석백에 넣은 경우의 약물 방출률을 확인한 결과를 도시한 것이고,
도 11a 내지 도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체를 초음파와 함께 적용한 결과를 도시한 것이고,
도 12a 내지 도 12d는 본 발명의 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체의 암세포 사멸 효과를 도시한 것이고,
도 13a 내지 도 13d는, 소수성 약물이 추가로 탑재된 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체를 도시한 것이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명의 목적들, 기술적 해법들 및 장점들을 분명하게 하기 위하여 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다.
또한, 본 발명의 상세한 설명 및 청구항들에 걸쳐, "포함하다"라는 단어 및 그것의 변형은 다른 기술적 특징들, 부가물들, 구성요소들 또는 단계들을 제외하는 것으로 의도된 것이 아니다. 통상의 기술자에게 본 발명의 다른 목적들, 장점들 및 특성들이 일부는 본 설명서로부터, 그리고 일부는 본 발명의 실시로부터 드러날 것이다. 아래의 예시 및 도면은 실례로서 제공되며, 본 발명을 한정하는 것으로 의도된 것이 아니다.
더욱이 본 발명은 본 명세서에 표시된 실시예들의 모든 가능한 조합들을 망라한다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 개략적으로 도시한 것이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)는, 쉘(1100)이 외면에 형성될 수 있다. 이때, 쉘(1100)은 인지질 단일층으로 형성될 수 있다. 또한, 쉘(1100)에 의해 둘러싸인 내부 공간에는, 친수성 약물(1210)을 담지하는 친수성 약물 담지 입자(1200) 및 오일(1300)이 포함될 수 있다. 이때, 쉘(1100)에 의해 둘러싸인 내부 공간에는 불활성 가스(1400)가 추가로 포함될 수 있으며, 이를 통해 초음파 조사에 따른 약물 전달 효과를 극대화할 수 있다.
참고로, 친수성 약물(1210)이란, 물에만 녹고 오일에는 전혀 녹지 않는 약물을 의미할 수도 있으나, 당연히 이에 한정되는 것은 아니며, 오일에 소량이 녹더라도 물에 더 잘 녹는 약물을 포함한다 할 것이다.
일례로, 친수성 약물(1210)은, 안트라사이클린 계 항암제, 대사길항제 계 항암제 및 저메틸화 작용제 계 항암제 중 적어도 일부를 포함할 수 있다.
이때, 안트라사이클린 계 항암제는 다우노루비신, 독소루비신, 믹톡산트론, 에피루비신 및 카미노마이신 중 적어도 일부를 포함할 수 있고, 대사길항제 계 항암제는 시타라빈을 포함할 수 있으며, 저메틸화 작용제 계 항암제는 아자시티딘 및 데시타빈 중 적어도 일부를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000) 내부에 포함되는 오일(1300)은, 아몬드 오일(almond oil), 살구 오일(apricot oil), 아보카도 오일(avocado oil), 카놀라 오일(canola oil), 피마자 오일(castor oil), 코코넛 오일(coconut oil), 코코아 오일(cocoa oil), 옥수수 오일(corn oil), 목화씨 오일(cottonseed oil), 아마인 오일(linseed oil), 중쇄 중성지방 오일(medium-chain triglyceride (MCT) oil), 팜 오일(palm oil), 콩 오일(soybean oil), 해바라기 오일(sunflower oil) 중 적어도 일부를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000) 내부에 추가로 포함될 수 있는 불활성 가스(1400)는, 퍼플루오로카본 계열의 가스(가령, perfluoromethane, perfluoroethane, perfluoropropane, perfluorobutane, perfluoropentane, perfluorohexane, perfluoroheptane, perfluorooctane, decafluoropentane, perfluoro(2-methyl-3-pentanone), perfluorotributylamine, perfluoro-15-crown-5-ether, perfluoro-1,3-dimethylcyclohexane, perfluoromethylcyclopentane, perfluorodecalin, perfluoromethyldecalin, perfluoroperhydrobenzyltetralin, PERFECTA 등), sulfur hexafluoride 및 air 중 적어도 일부를 포함할 수 있다. 참고로, 불활성 가스(1400)는 액체 상태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 기체 상태일 수도 있다.
한편, 도 1에 도시된 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)의 외부에 형성되는 쉘(1100)은 인지질 단일층(single layer) 형태인 것을 확인할 수 있다.
참고로, 인지질의 머리 부분은 친수성, 꼬리 부분은 소수성의 성질을 가지므로, 도 1에서 도시하듯 인지질 단일층으로 형성된 쉘을 포함하는 초음파 감응형 약물전달체의 내부는 소수성을 띄게 된다. 따라서, 종래에는, 인지질 단일층으로 형성된 쉘을 포함하는 약물전달체의 내부 공간에 친수성 약물이 탑재되기 어려운 문제점이 있었다.
예를 들어, 친수성 약물 중 하나인 독소루비신의 경우, 물에 대한 용해도는 10mg/mL 이상인 반면에, 오일에 대한 용해도는 100ug/mL 이하이므로, 종래의 기술에 따라 독소루비신, 오일 및 인지질 수용액을 기계적 믹싱하여 인지질 단일층으로 형성된 쉘을 포함하는 약물전달체를 생성하더라도, 이렇게 생성된 약물전달체 내부에는 소수성의 오일만 쉽게 탑재될 뿐, 친수성의 독소루비신은 탑재되지 않거나 극소량만 탑재되는 문제점이 있었다.
반면에, 후술할 과정에 따라 생성되는 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)는, 친수성 약물(1210)을 담지하는 친수성 약물 담지 입자(1200)를 포함하는 에멀젼을 먼저 형성한 이후에, 에멀젼 및 인지질 수용액을 기계적 믹싱함으로써, 내부 공간에 친수성 약물 담지 입자(1200)를 효과적으로 탑재할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
아래에서는, 도 2a 내지 도 2c를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 생성하는 과정에 대해 설명하기로 한다.
먼저, 도 2a에서 도시하는 바와 같이, (i) 친수성 약물이 용해된 친수성 약물 수용액(100) 및 (ii) 오일(200)에 계면활성제(300)가 용해된 계면활성제 용해 오일을 혼합한 후, 제1 RPM(revolutions per minute)에 따라 기계적 믹싱을 수행함으로써 에멀젼을 형성할 수 있다. 이때, 에멀젼은 친수성 약물 담지 입자(1200)를 포함할 수 있으며, 친수성 약물 담지 입자(1200)의 쉘(1220)은 계면활성제(300)를 포함할 수 있다. 참고로, 친수성 약물 담지 입자(1200)가 포함되는 에멀젼은, 분산상이 물이며 연속상이 오일인 에멀젼이므로, 친수성 약물 담지 입자(1200)는 역상 입자에 해당할 수 있으며, 이러한 친수성 약물 담지 입자(1200)의 쉘(1220)의 외부는 소수성이고, 쉘(1220)의 내부는 친수성일 수 있다. 이처럼, 상대적으로 낮은 hydrophilic-lipophilic balance(HLB)를 가지는 계면활성제를 사용하여 상대적으로 안정한 에멀젼을 형성할 수 있다.
또한, 에멀젼을 형성하기 위한 기계적 믹싱에는. 바이알 믹서(vial mixer) 및 호모게나이저(homogenizer) 중 어느 하나가 이용될 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
이때, 친수성 약물 담지 입자(1200)의 안정성을 높이고, 친수성 약물 담지 입자(1200)의 크기를 균일하게 형성하며, 친수성 약물 담지 입자(1200)에 담지되는 친수성 약물(1210)의 양을 균일하게 하기 위하여, 도 2b에서 도시하는 바와 같이 친수성 약물 담지 입자의 사이즈를 조절하는 과정이 수행될 수 있다.
일례로, 친수성 약물 수용액 및 계면활성제 용해 오일을 혼합한 후, 제1 RPM에 따라 기계적 믹싱을 수행함으로써 제1 에멀젼을 형성하되, 제1 에멀젼에 포함된 친수성 약물 담지 입자(1200_1)의 크기 분포가 제1 크기 분포가 되도록 제1 에멀젼을 형성할 수 있다. 참고로, 제1 크기 분포는, 1um 내지 5um일 수 있다.
그리고, 사이즈 조절 장치를 이용하여 제1 크기 분포를 가지는 친수성 약물 담지 입자(1200_1)의 크기 분포가 제2 크기 분포가 되도록 제1 에멀젼에 포함된 친수성 약물 담지 입자의 크기를 조절함으로써, 제2 크기 분포를 가지는 친수성 약물 담지 입자(1200_2)를 포함하는 제2 에멀젼을 상기 에멀젼으로서 형성할 수 있다. 즉, 친수성 약물 담지 입자의 크기 분포가 특정 크기를 기준으로 하여 소정 편차 이내의 값을 가지는 특정 크기 분포가 되도록 제1 에멀젼에 포함된 친수성 약물 담지 입자의 크기를 조절할 수 있다.
참고로, 제2 크기 분포(특정 크기 분포)는, 100nm 이하일 수 있다.
이때, 사이즈 조절 장치로는, (i) 멤브레인 필터 및 압출기(extruder), (ii) 플루다이저(fluidizer) 중 적어도 일부가 이용될 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
그리고, 도 2c에서 도시하는 바와 같이, 인지질 수용액(400) 및 에멀젼(500)을 혼합한 후, 제2 RPM에 따라 기계적 믹싱을 수행함으로써 친수성 약물 담지 입자(1200) 및 오일을 내부에 포함하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 생성할 수 있다. 참고로, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 생성하기 위한 기계적 믹싱에는, 바이알 믹서 및 호모게나이저 중 어느 하나가 이용될 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
이때, 앞서 간단하게 설명한 바와 같이, 초음파 조사에 따른 약물 전달 효과를 극대화하기 위하여, 불활성 가스(600)가 추가로 혼합될 수 있다. 일례로, 인지질 수용액(400), 에멀젼(가령, 친수성 약물 담지 입자의 크기가 조절된 경우에는 제2 에멀젼)(500) 및 불활성 가스(600)를 혼합한 후, 제2 RPM에 따라 기계적 믹싱을 수행함으로써 친수성 약물 담지 입자(1200), 불활성 가스 및 오일을 내부에 포함하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 생성할 수 있다.
이때, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000) 내부에 소수성 약물이 추가로 탑재되도록 할 수 있다. 일례로, 에멀젼에 소수성 약물이 용해된 소수성 약물 용해 에멀젼 및 인지질 수용액을 혼합한 후, 제2 RPM에 따라 기계적 믹싱을 수행함으로써 친수성 약물 담지 입자, 오일 및 소수성 약물을 내부에 포함하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 생성할 수 있다.
참고로, 에멀젼이 형성된 이후에 소수성 약물이 에멀젼에 용해됨으로써 소수성 약물 용해 에멀젼이 형성될 수 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 가령, 계면활성제 및 소수성 약물이 용해된 오일에 친수성 약물 수용액을 혼합한 후 제1 RPM에 따라 기계적 믹싱을 수행함으로써 소수성 약물 용해 에멀젼이 형성될 수도 있다.
참고로, 위와 같이 소수성 약물이 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)에 추가로 탑재되는 경우에도, 앞서 설명한 바와 같이, 초음파 조사에 따른 약물 전달 효과를 극대화하기 위하여, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)의 쉘에 의해 형성되는 내부 공간에 불활성 가스가 추가로 탑재될 수 있다.
이때, 소수성 약물은, 벤다무스틴, 부설판, 카무스틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 다카바진, 이포스파미드, 멜팔란, 프로카바진, 스트렙토조신, 테모졸로미드, 아스파라기나제, 카페시타빈, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 액티노마이신-D, 블레오마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신, 미토잔트론, 에토포시드, 도세탁셀, 이리노테칸, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 알렘투자맙, 비씨지, 베바시주맙, 세툭시맙, 데노수맙, 엘로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 인터페론, 이필리무맙, 라파티닙, 파니투무맙, 리툭시맙, 수니티닙, 소라페닙, 템시롤리무스, 트라스투주맙, 클로드로네이트, 이반드론산, 파미드로네이트 및 졸레드론산 중 적어도 일부를 포함할 수 있다.
또한, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)의 외면에 쉘을 형성하기 위해 이용되는 인지질 수용액에는, DPPC, DPPA, 콜레스테롤 중 적어도 일부가 포함될 수 있다. 다만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 인지질 수용액에는, 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine) 계열의 물질(HSPC, DEPC, DOPC 및 DMPC 등), DMPA-NA, DPPA-Na, DOPA-Na, DSPE, DSPE-mPEG, DSPE-mPEG-2000-Na, DSPE-mPEG-5000-Na, DSPE-Maleimide PEG-2000-Na 중 적어도 일부를 포함할 수 있다.
위와 같은 과정을 통해 생성되는 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)의 직경은 700nm 내지 3um일 수 있다. 다만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 기계적 믹싱의 rpm 수치 또는 오일의 점도에 따라 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)의 사이즈가 다양하게 형성될 수 있다.
아래에서는, 특정 약물(가령, 독소루비신 등), 특정 오일(가령, MCT oil 등), 특정 불활성 가스(가령, 퍼플루오로헥산) 및 특정 인지질 수용액(가령, DPPC, DPPA 및 콜레스테롤 등을 포함하는 인지질 수용액)을 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 생성하는 과정에 대해 설명하기로 한다. 참고로, 아래에서 설명하는 초음파 감응형 약물전달체(1000)의 생성 과정은 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 기술자는 과도한 노력을 기울이지 않고도, 앞서 설명했던 다른 약물, 다른 오일, 다른 불활성 가스 및 다른 인지질 수용액의 조합을 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 생성하는 방식을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
일례로, (i) 독소루비신이 증류수에 5mg/ml의 농도로 용해된 친수성 약물 수용액 및 (ii) 80ml의 MCT 오일에 20ml의 span85(계면활성제)가 용해된 계면활성제 용해 오일을 20:80의 부피비로 혼합할 수 있다.
그리고 혼합된 용액에 대해, (i) 바이알 믹서를 이용하여 4500 RPM에 따라 45초동안 기계적 믹싱을 수행하거나, (ii) 호모게나이저를 이용하여 35000 RPM에 따라 5분동안 기계적 믹싱을 수행함으로써 제1 크기 분포를 가지는 친수성 약물 담지 입자를 포함하는 제1 에멀젼을 형성할 수 있다.
그리고, 2ml의 제1 에멀젼을 8ml의 MCT 오일에 희석한 후, mini-extruder 및 100nm의 pore-sized 필터를 이용하여 20회의 압출을 수행함으로써, 제2 크기 분포를 가지는 친수성 약물 담지 입자를 포함하는 제2 에멀젼을 형성할 수 있다.
그리고, 20mg의 DPPA, 200mg의 DPPC 및 35mg의 콜레스테롤을 프로필렌글리콜 30ml에 넣고, 초음파수조를 이용하여 20mg의 DPPA, 200mg의 DPPC 및 35mg의 콜레스테롤의 용해를 1시간 동안 진행한 후, 70ml의 증류수를 추가함으로써 인지질 수용액을 제조할 수 있다.
그리고, 0.1ml의 제2 에멀젼, 1.8ml의 인지질 수용액 및 0.1ml의 액체 불활성 가스를 혼합한 후, (i) 바이알 믹서를 이용하여 4500 RPM에 따라 45초 동안 기계적 믹싱을 수행하거나, (ii) 호모게나이저를 이용하여 35000 RPM에 따라 5분 동안 기계적 믹싱을 수행함으로써 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 생성할 수 있다.
지금까지, 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 생성하는 과정에 대해서 설명하였으며, 아래에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)에 대한 각종 실험 결과 등에 대해서 도 3 내지 도 13d를 참조하여 설명하기로 한다.
도 3은, 제1 에멀젼(즉, 사이즈 조절 전의 에멀젼)의 안정성을 확인한 결과를 나타내는 터너리 페이즈 다이어그램(Ternary phase diagram)을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3을 참조하면, (i) 제1 에멀젼에서 물이 차지하는 부피가 10% 내지 20%, (ii) 제1 에멀젼에서 오일이 차지하는 부피가 20% 내지 80%, (iii) 제1 에멀젼에서 계면활성제(Span 85)가 차지하는 부피가 10% 내지 70%일 때, 안정한 상태의 제1 에멀젼이 형성되는 것을 확인할 수 있다.
일례로, 도면부호 31에서 확인할 수 있듯이, (i) 제1 에멀젼에서 물이 차지하는 부피가 20%, (ii) 제1 에멀젼에서 오일이 차지하는 부피가 40%, (iii) 제1 에멀젼에서 계면활성제(Span 85)가 차지하는 부피가 40%일 때, 안정한 상태의 제1 에멀젼이 형성되는 것을 확인할 수 있다.
다른 예로, 도면부호 32에서 확인할 수 있듯이, (i) 제1 에멀젼에서 물이 차지하는 부피가 10%, (ii) 제1 에멀젼에서 오일이 차지하는 부피가 20%, (iii) 제1 에멀젼에서 계면활성제(Span 85)가 차지하는 부피가 70%일 때, 안정한 상태의 제1 에멀젼이 형성되는 것을 확인할 수 있다.
반면에, 도면부호 33에서 확인할 수 있듯이, 제1 에멀젼에서 물이 차지하는 부피가 클 경우(가령, 50%), 오일이 분산상이며, 물이 연속상이 됨에 따라, 안정한 상태의 제1 에멀젼(즉, 오일이 연속상이며, 물이 분산상인 에멀젼)이 형성되지 않음을 확인할 수 있다.
따라서, 위와 같은 실험 결과에 기초하여, 수상 20%, 오일상(즉, 계면활성제가 용해된 오일) 80%의 제1 에멀젼을 이용하여 후술할 실험을 진행하였다. 참고로, 오일에 용해되는 계면활성제의 양은 20% 이하로 하였다.
도 4a 내지 도 4c는, 제1 에멀젼에 포함되는 친수성 약물 담지 입자의 안정성에 계면활성제가 미치는 영향을 확인한 결과를 개략적으로 도시한 것이다.
도 4a를 참조하면, 수상 20%, 오일상 80%의 제1 에멀젼을 형성함에 있어서, 오일(MCT 오일)에 포함되는 계면활성제(SPAN85)의 함량별로, 제1 에멀젼의 안정성이 달라지는 결과를 확인할 수 있다. 참고로, 5개의 이미지 각각의 우측 하단에 표시된 하얀색 스케일바(scale bar)는, 10um의 길이를 나타낸다.
가령, 계면활성제가 오일에 0% 용해된 경우, 물과 오일이 명확하게 분리(상분리)되는 반면에, 계면활성제가 오일에 15% 내지 20% 용해된 경우, 구 형태의 입자(가령, 친수성 약물 담지 입자)가 효과적으로 생성되는 것을 확인할 수 있다. 다만, 계면활성제가 오일에 너무 많이 포함될 경우(가령, 계면활성제가 오일에 20%를 초과하여 용해된 경우), 구 형태의 입자 간 응집력이 과도하게 증가하여 제1 에멀젼의 안정성이 다소 감소하는 경향을 확인하였다.
또한, 도 4b를 참조하면, 수상 20%, 오일상 80%의 제1 에멀젼을 형성함에 있어서, 오일(MCT 오일)에 포함되는 계면활성제(SPAN85)의 함량별로, 시간 경과에 따른 상분리 발생 여부를 관찰할 수 있다. 가령, 계면활성제가 오일에 0% 용해된 경우, 제1 에멀젼을 형성한지 3시간만에 상분리가 관찰되고, 계면활성제가 오일에 5% 용해된 경우, 제1 에멀젼을 형성한지 24시간만에 상분리가 관찰된 반면에, 계면활성제가 오일에 15% 내지 20% 용해된 경우, 24시간이 경과하더라도 상분리가 관찰되지 않고 구 형태의 입자가 안정적으로 유지되는 점이 관찰되었다.
또한, 도 4c를 참조하면, 수상 20%, 오일상 80%의 제1 에멀젼을 형성함에 있어서, 오일(MCT 오일)에 포함되는 계면활성제(SPAN85)의 함량별로, 제1 에멀젼에 포함되는 구 형태의 입자(가령, 친수성 약물 담지 입자)의 사이즈 각각을 확인할 수 있다.
가령, 계면활성제가 오일에 0% 용해된 경우, 상분리가 발생함에 따라 입자가 소멸(unstable)한 것으로 확인되었고, 계면활성제가 오일에 5% 용해된 경우, 입자의 사이즈가 10um 내지 35um로 관찰됨에 따라 입자간 사이즈 편차가 매우 큰 것을 알 수 있고, 계면활성제가 오일에 10% 용해된 경우, 입자간 사이즈 편차가 감소하기는 했지만 여전히 큰 사이즈 편차가 존재하는 것으로 확인된 반면에, 계면활성제가 오일에 15% 내지 20% 용해된 경우, 입자의 안정성이 증가됨에 따라 입자간 사이즈 편차가 거의 없으면서도 목표하는 사이즈 범위(가령, 5um 내지 10um) 내로 형성된 점이 확인되었다.
한편, 도 5 내지 도 8은, 안정성을 보다 더 높이기 위해서 사이즈가 조절된 친수성 약물 담지 입자에 대한 여러가지 실험결과들을 개략적으로 도시한 것이다.
먼저, 도 5를 참조하면, 압출기(mini-extruder)(51) 및 100nm의 pore-sized 필터(미도시)를 이용하여 상온/상압 조건에서 20회의 압출을 수행함으로써, 제1 크기 분포를 가지는 친수성 약물 담지 입자의 크기 분포가 제2 크기 분포가 되도록 사이즈를 조절한 결과를 확인할 수 있다.
구체적으로, 제1 크기 분포를 가지는 친수성 약물 담지 입자(52), 즉, 사이즈가 조절되기 전의 친수성 약물 담지 입자(52)는 1um 내지 5um의 크기 분포를 가지는 반면에, 제2 크기 분포를 가지는 친수성 약물 담지 입자(53), 즉, 사이즈가 조절된 이후의 친수성 약물 담지 입자(53)는 대부분 100nm이하의 크기 분포를 가지는 점이 관찰되었다. 참고로, 설명의 편의상, 도 5a에서는 압출기(51) 및 필터(미도시)를 이용하여 친수성 약물 담지 입자의 크기를 조절하는 경우를 도시하고 있으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 가령, 상온에서 MF 500 bar의 압력으로 플루다이저에 3회 통과시킴으로써 친수성 약물 담지 입자의 크기를 조절할 수도 있다.
또한, 도 6a를 참조하면, 제1 에멀젼(before extruder) 및 제2 에멀젼(after extruder)에 대한, 원심 분리 수행 전 상태(before centrifuge) 및 원심 분리 수행 후 상태(after centrifuge)를 확인할 수 있다. 참고로, 2000 RPM에서 10분간 원심 분리를 수행하였다.
구체적으로, 입자의 사이즈가 작을수록 낮은 파장의 빛을 흡수한다는 점을 고려할 때, 도 6a에 도시된 제2 에멀젼의 색이 제1 에멀젼의 색보다 옅으므로, 제2 에멀젼에 포함된 친수성 약물 담지 입자의 크기가 제1 에멀젼에 포함된 친수성 약물 담지 입자의 크기보다 작다는 점을 유추할 수 있다.
또한, 제1 에멀젼의 경우, 원심 분리를 수행함으로써 응집된 친수성 약물 담지 입자들이 바닥에 침전된 것을 확인할 수 있는데, 이로부터, 사이즈가 조절되지 않은 친수성 약물 담지 입자의 안정성이 낮다는 점을 알 수 있다. 반면에, 제2 에멀젼의 경우, 원심 분리를 수행했음에도 불구하고, 친수성 약물 담지 입자들이 바닥에 침전되지 않은 것을 확인할 수 있는데, 이로부터, 사이즈가 조절된 친수성 약물 담지 입자의 안정성이 높다는 점을 알 수 있다.
또한, 도 6b는 원심분리를 수행하기 전의 친수성 약물 담지 입자들에 대한 마이크로스코프 이미지(microscope image)이고, 도 6c는 원심분리를 수행한 이후의 친수성 약물 담지 입자들에 대한 마이크로스코프 이미지이며, 도 6d는 원심분리를 수행한 이후의 친수성 약물 담지 입자들에 대한 공초점 현미경 이미지(confocal image)인데, 도 6b 내지 도 6d에 도시된 결과를 참조하면, 친수성 약물 담지 입자의 사이즈가 작을수록 원심분리에 의해 침전되지 않는 것을 확인할 수 있고, 이로부터, 친수성 약물 담지 입자의 사이즈가 작을수록 친수성 약물 담지 입자의 안정성이 높다는 점을 유추할 수 있다. 참고로, 도 6b 내지 도 6d 각각의 우측 하단에 표시된 하얀색 스케일바(scale bar)는, 5um의 길이를 나타낸다.
또한, 도 7은, (i) 독소루비신을 담지한 친수성 약물 담지 입자를 포함하는 제1 에멀젼(before extruder) 및 (ii) 독소루비신을 담지한 친수성 약물 담지 입자를 포함하는 제2 에멀젼(after extruder) 각각에 대해서 원심 분리를 수행한 이후, 각각의 상층액(즉, 원심 분리에 의해 침전되지 않은 부분)에 대한 크로마토그래피(chromatography)를 도시하고 있다.
도 7을 참조하면, 제1 에멀젼의 6분대에서의 피크 값보다 제2 에멀젼의 6분대에서의 피크 값이 월등하게 높은 점을 확인할 수 있다. 이로부터, 제2 에멀젼에 포함된 친수성 약물 담지 입자가 제1 에멀젼에 포함된 친수성 약물 담지 입자보다 월등하게 많은 약물(독소루비신)을 담지하고 있으며, 제2 에멀젼에 포함된 친수성 약물 담지 입자의 안정성이 월등하게 높다는 점을 알 수 있다. 구체적으로, 제1 에멀젼에 대해서 원심 분리를 수행한 이후에 상층부에 존재하는 약물의 양은, 원심 분리를 수행하기 전에 상층부에 존재하는 약물의 양으로부터 58% 이상 감소한 반면에, 제2 에멀젼에 대해서 원심 분리를 수행한 이후에 상층부에 존재하는 약물의 양은, 원심 분리를 수행하기 전에 상층부에 존재하는 약물의 양으로부터 18%가량 감소한 점을 확인하였다.
또한, 도 8은, 섭씨 37도의 PBS buffer 용액이 담긴 투석백에, (i) 친수성 약물(독소루비신)을 단독으로 넣은 경우, (ii) 사이즈가 조절되지 않은 친수성 약물 담지 입자를 포함하는 제1 에멀젼을 넣은 경우, (iii) 사이즈가 조절된 친수성 약물 담지 입자를 포함하는 제2 에멀젼을 넣은 경우 각각에 대해서, 친수성 약물이 투석백 외부로 자연적으로 방출되는 약물 방출률을 확인한 결과를 개략적으로 도시하고 있다.
도 8을 참조하면, (i) 친수성 약물(독소루비신)을 단독으로 투석백에 넣은 경우, 2시간만에 74%이상의 약물이 투석백 외부로 방출된 반면에, (ii) 사이즈가 조절되지 않은 친수성 약물 담지 입자를 포함하는 제1 에멀젼을 투석백에 넣은 경우, 상기 (i)의 경우와 비교하여 약물 방출률이 9% 감소된 점이 확인되었고, (iii) 사이즈가 조절된 친수성 약물 담지 입자를 포함하는 제2 에멀젼을 투석백에 넣은 경우, 상기 (i)의 경우와 비교하여 약물 방출률이 32% 감소된 점이 확인되었다. 이를 통해, 사이즈가 조절된 친수성 약물 담지 입자의 안정성이 뛰어난 점을 확인할 수 있다.
만약, 자연적인 약물 방출률이 높을 경우, 약물을 대상체에 주입하더라도, 약물이 타겟 부위에 도달하기도 전에 삼투압 현상 등으로 인해 혈관에서 주변 조직으로 방출되어 버리므로, 원하는 타이밍에 원하는 부위로 약물을 효과적으로 전달하는 것이 어려운 문제점이 존재한다.
반면에, 사이즈가 조절된 친수성 약물 담지 입자를 포함하는 제2 에멀젼의 경우, 현저하게 낮은 약물 방출률을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이는, 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 대상체에 주입할 경우, 약물이 타겟 부위에 도달하기 전에 유실되는 양을 최소화하고, 원하는 타이밍에 원하는 부위로 약물을 효과적으로 전달할 수 있는 것을 의미한다.
한편, 도 9는, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 실제로 관찰한 결과를, 도 1을 통해 설명했던 그림과 매칭되도록 도시하고 있다.
도 9를 참조하면, 초승달 모양의 초록색 영역을 확인할 수 있는데, 이를 통해, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000) 내부에 초록색을 띄는 독소루비신을 담지한 친수성 약물 담지 입자가 대량으로 탑재된 것을 알 수 있다. 참고로, 도 9에서, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)의 어두운 영역은, 불활성 가스가 점유하는 영역에 해당한다.
한편, 도 10은, 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 섭씨 37도의 PBS buffer 용액이 담긴 투석백에 넣은 경우의 약물 방출률을 개략적으로 도시한 것이다.
도 10을 참조하면, 초음파가 조사되지 않는 경우(No-US)에는, 2시간이 경과한 시점에서의 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)의 약물 방출률이 20%가량인 점을 확인할 수 있다. 이는, 도 8에서 2시간이 경과한 시점에서의 제2 에멀젼의 약물 방출률보다도 절반 가까이 감소한 수치에 해당한다. 이로부터, 본 발명의 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)가 이중으로 약물을 보호함으로써 매우 안정적으로 약물을 담지하고 있다는 점을 알 수 있다.
또한, 2시간이 경과한 시점에서의 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)에 초음파가 조사되는 경우(US treated)에는, 초음파를 조사하지 않은 경우보다 17% 가까이 약물 방출률이 증가하였는데, 이로부터, 본 발명의 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)가 초음파에 매우 높은 감응성을 가지는 것을 알 수 있다. 참고로, US treated의 경우, 주파수를 1MHz, intensity를 2.5 watt, duty cycle을 5%, pulse repetition frequency를 10Hz, pulse duration을 100ms로 설정하여 5분간 초음파를 먼저 조사한 후에 약물 방출률을 확인하였다.
한편, 도 11a는, MDA-MB-231 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 적용하고, 초음파를 조사한 후, 빛의 파장을 달리하면서, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)에 포함된 친수성 약물 담지 입자 또는 그 내부에 탑재된 약물(독소루비신)이 세포 내부에 효과적으로 유입되는지 여부 등을 관찰한 결과이다. 참고로, 주파수를 1MHz, intensity를 2.5 watt, duty cycle을 5%, pulse repetition frequency를 10Hz, pulse duration을 100ms로 설정하여 5분간 초음파를 조사하였다.
도 11a의 (i) 첫번째 행(Free DOX, US-))은, 초음파를 조사하지 않으면서, 독소루비신을 세포에 적용한 경우를 관찰한 결과를 도시하고, (ii) 두번째 행(Free DOX, US+)은, 초음파를 조사하면서 독소루비신을 세포에 적용한 경우를 관찰한 결과를 도시하며, (iii) 세번째 행(DE, US-)은, 초음파를 조사하지 않으면서 독소루비신을 탑재한 본 발명의 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 세포에 적용한 경우를 관찰한 결과를 도시하고, (iv) 네번째 행(DE, US+)은, 초음파를 조사하면서 독소루비신을 탑재한 본 발명의 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 세포에 적용한 경우를 관찰한 결과를 도시한다.
또한, (i) 첫번째 열(Bright field)은, 가시광선 영역에서 관찰한 결과를 나타내고, (ii) 두번째 열(DOX)은, 514nm 내지 580nm의 파장 영역에서 독소루비신 전달 효과를 관찰한 결과를 나타내며, (iii) 세번째 열(DAPI)은, DAPI 염색 시약을 이용하여 세포의 핵을 염색한 상태에서, 350nm 내지 461nm의 파장 영역에서 세포의 핵의 위치를 관찰한 결과를 나타내고, (iv) 네번째 열(Merge)은, 두번째 열 및 세번째 열의 결과를 병합함으로써, 세포의 핵 또는 그 주변에 독소루비신이 효과적으로 주입되었는지를 확인한 결과를 나타낸다. 참고로, 16개의 이미지 각각의 우측 하단에 표시된 하얀색 스케일바(scale bar)는, 20um의 길이를 나타낸다.
먼저, 도면부호 111 내지 113을 참조하면, 세포의 핵 또는 그 근처에 독소루비신이 거의 유입되지 않은 점을 확인할 수 있다. 반면에, 도면부호 114를 참조하면, 세포의 핵 또는 그 근처에 독소루비신이 대량으로 유입된 점을 확인할 수 있다. 이를 통해, 초음파를 조사하면서 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 세포에 적용하는 경우(즉, 도면부호 114의 경우)에, 타겟 부위에 약물이 효과적으로 전달된다는 점을 알 수 있다.
이에 대해서는, 형광의 세기(Fluorescent intensity)를 관찰한 결과를 나타내는 도 11b를 통해서도 알 수 있다. 도 11b를 참조하면, 초음파를 조사하면서 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 세포에 적용하는 경우(즉, DE+US), 형광의 세기 값이 나머지 3개의 경우에 비해 압도적으로 높은 점을 확인할 수 있다.
한편, 도 12a 내지 도 12d는 본 발명의 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)의 암세포 사멸 효과를 개략적으로 도시하고 있다.
먼저, 도 12a에서 도시하듯, 독소루비신만 단독으로 암세포에 적용하거나(free DOX), 초음파만 단독으로 암세포에 조사한 경우(1.5W 및 2.5W)에는, 대조군(control)과 비교하여 암세포의 viability에 유의미한 변화가 없었다. 이를 통해, 다양한 세기의 초음파를 조사하더라도 세포 독성(손상)에 큰 영향을 미치지 않는 점을 확인하였다.
이와 같이 확인한 상태에서, 도 12b에서 도시하듯, 본 발명의 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 암세포에 적용한 결과를 확인하였다.
먼저, 초음파를 조사하지 않고, 친수성 약물이 대략 40ng씩 포함된 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 암세포에 적용한 경우, 친수성 약물을 담지하는 친수성 약물 담지 입자 또는 친수성 약물이 암세포 내부에 주입됨에 따라, 77%의 viability를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
반면, 초음파를 조사하면서, 친수성 약물이 대략 40ng씩 포함된 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 암세포에 적용한 경우, 암세포 내부에 친수성 약물 또는 친수성 약물 담지 입자가 대량으로 주입됨에 따라, 60%의 viability를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 일 실시예에 따른 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)가 초음파에 높은 감응성을 가짐으로 인해서 세포 내부에 약물을 전달하는 효과가 뛰어난 점을 알 수 있다.
이는 도 12c 및 도 12d를 통해서도 확인할 수 있는데, 초음파 없이 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)만 암세포에 적용한 경우(도 12c)와 비교하여, 초음파를 조사하면서 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 암세포에 적용한 경우(도 12d)에 암세포가 대량으로 사멸되는 것을 확인할 수 있었다. 참고로, 주파수를 1MHz, intensity를 2.5 watt, duty cycle을 5%, pulse repetition frequency를 10Hz, pulse duration을 100ms로 설정하여 5분간 초음파를 조사하였다. 또한, 도 12c 및 도 12d 각각의 우측 하단에 표시된 하얀색 스케일바(scale bar)는, 20um의 길이를 나타낸다.
한편, 도 13a 내지 도 13d는, 소수성 약물이 추가로 탑재된 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 개략적으로 도시하고 있다.
먼저, 도 13a를 참조하면, 도 1을 통해 설명했던 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)와 전체적으로 유사하되, 소수성 약물(가령, Nile red)이 오일(1300)에 용해됨으로써 초음파 감응형 약물전달체(1000)에 추가로 탑재되는 점을 확인할 수 있다.
참고로, 후술할 도 13b 내지 도 13d는, 실험의 편의상, 형광성의 Nile red가 소수성 약물로서 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000) 내부에 추가로 탑재되도록 실험한 결과를 도시하고 있으나, Nile red를 대신하여 앞서 설명한 소수성 약물들 중 적어도 하나가 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000) 내부에 추가로 탑재될 수 있음은 물론이라 할 것이다.
도 13b는, 520nm 내지 640nm의 파장 영역에서 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 관찰한 결과를 나타내며, 빨간색으로 표시된 부분을 통해 Nile red가 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000) 내부에 대량으로 탑재된 점을 확인할 수 있다. 또한, 도 13c는, 480nm 내지 550nm의 파장 영역에서 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000)를 관찰한 결과를 나타내며, 초록색으로 표시된 부분을 통해 독소루비신이 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000) 내부에 대량으로 탑재된 점을 확인할 수 있다.
참고로, 독소루비신이 담지된 친수성 약물 담지 입자가 오일상에 분포하고 있으며, Nile red는 오일에 용해된 상태이므로, 도 13b 내지 도 13d에서 도시하는 바와 같이, 독소루비신 및 Nile red가 동일한 영역에서 색깔만 달리하여 관찰되는 것을 알 수 있다.
이처럼, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000) 내부에 친수성 약물 및 소수성 약물을 동시에 탑재함으로써 시너지 효과를 기대할 수 있다. 가령, 친수성 약물만을 단독으로 사용할 경우에는 효과적인 암세포 사멸을 위해서 100ng이 필요하다고 할 때, 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체(1000) 내부에 소수성 약물을 추가로 탑재할 경우에는, 친수성 약물 및 소수성 약물 각각 20ng씩만으로도 동일/유사한 암세포 사멸 효과를 기대할 수 있다.
이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있다.
따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명의 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체에 있어서,
    쉘(shell);
    상기 쉘에 의해 형성되는 내부 공간에 탑재되는 오일;
    상기 쉘에 의해 형성되는 상기 내부 공간에 탑재되며, 친수성 약물을 각각 담지하는 복수의 친수성 약물 담지 입자;
    를 포함하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 약물 담지 입자는, (i) 상기 친수성 약물이 용해된 친수성 약물 수용액 및 (ii) 상기 오일에 계면활성제가 용해된 계면활성제 용해 오일이 혼합된 후, 제1 RPM(revolutions per minute)에 따라 기계적 믹싱이 수행됨으로써 형성되는 에멀젼에 포함되며,
    상기 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체는, 인지질 수용액 및 상기 에멀젼이 혼합된 후, 제2 RPM에 따라 상기 기계적 믹싱이 수행됨으로써 생성되는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 쉘에 의해 형성되는 상기 내부 공간에 불활성 가스가 추가로 탑재되는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 친수성 약물 담지 입자의 크기 분포는, 특정 크기를 기준으로 하여 소정 편차 이내의 값을 가지는 특정 크기 분포인 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 친수성 약물 담지 입자는, 사이즈 조절 장치에 의해 제1 크기 분포로부터 상기 특정 크기 분포 - 상기 특정 크기 분포는 상기 제1 크기 분포보다 작은 값을 가짐 - 가 되도록 그 크기가 조절된 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 불활성 가스는, perfluoromethane, perfluoroethane, perfluoropropane, perfluorobutane, perfluoropentane, perfluorohexane, perfluoroheptane, perfluorooctane, decafluoropentane, perfluoro(2-methyl-3-pentanone), perfluorotributylamine, perfluoro-15-crown-5-ether, perfluoro1,3-dimethylcyclohexane, perfluoromethylcyclopentane, perfluorodecalin, perfluoromethyldecalin, perfluoroperhydrobenzyltetralin, PERFECTA 및 sulfur hexafluoride 중 적어도 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 약물은, 안트라사이클린 계 항암제, 대사길항제 계 항암제 및 저메틸화 작용제 계 항암제 중 적어도 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 안트라사이클린 계 항암제는 다우노루비신, 독소루비신, 믹톡산트론, 에피루비신 및 카미노마이신 중 적어도 일부를 포함하고,
    상기 대사길항제 계 항암제는 시타라빈을 포함하며,
    상기 저메틸화 작용제 계 항암제는 아자시티딘 및 데시타빈 중 적어도 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 쉘에 의해 형성되는 상기 내부 공간에 소수성 약물이 추가로 탑재되는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 쉘에 의해 형성되는 상기 내부 공간에 불활성 가스가 추가로 탑재되는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 약물 담지 입자는, 계면활성제로 형성된 미니 쉘을 포함하는 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 쉘은 인지질 단일층으로 형성된 것을 특징으로 하는 더블 에멀젼 구조의 초음파 감응형 약물전달체.
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