WO2024101696A1 - 연속파동 레이저를 이용하는 비선형 현미경 기반의 3차원 이미징 시스템 및 방법 - Google Patents

연속파동 레이저를 이용하는 비선형 현미경 기반의 3차원 이미징 시스템 및 방법 Download PDF

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optical focus
continuous wave
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박정훈
김정모
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Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional imaging system and method based on a nonlinear microscope using a continuous wave laser. More specifically, the present invention relates to a nonlinear microscope using fluorescent particles that exhibit a nonlinear optical response to continuous wave laser excitation. It relates to a system and method for implementing and generating a 3D image based on this.
  • Nonlinear microscopes are the most widely used microscopes in the life sciences field along with confocal microscopes for imaging the three-dimensional fluorescence of samples.
  • Nonlinear microscopy-based 3D imaging techniques utilize the phenomenon of generating significant nonlinear signals at the focus of excitation light through nonlinear excitation or nonlinear scattering of fluorescent materials. Therefore, when using a nonlinear microscope, unlike when using a confocal microscope when imaging a 3D image, a separate pinhole is not required in the detection path.
  • nonlinear excitation has the advantage of relatively less light scattering because it uses excitation light in a long wavelength range when targeting the same fluorescent material compared to microscopy techniques using linear excitation.
  • nonlinear microscope when using a nonlinear microscope to collect fluorescence from a highly scattering sample (e.g., tissues or cells of an organism), compared to using other microscopes (e.g., a confocal microscope), the fluorescence can be collected deeper into the sample. Information can also be collected. Due to these advantages, nonlinear microscopy is essential in various life science research, such as visualization and analysis of cells/tissues and brain science.
  • confocal microscopy has a disadvantage in terms of imaging performance compared to nonlinear microscopy. Since confocal microscopy is based on linear excitation, in order to excite phosphors in the visible light band, light of a shorter wavelength with higher energy than the fluorescence band must be used. Due to the short excitation wavelength of light and the presence of pinholes in the detection path, it is difficult to collect fluorescence information deep in the sample with a confocal microscope, and permanent damage is caused to the entire three-dimensional area of the sample at the same time as measurement. . Nevertheless, confocal microscopy-based 3D imaging techniques are most widely used in life science laboratories because they can be constructed with relatively inexpensive continuous wave lasers (generally about 1k USD).
  • the technical task of the present invention is to construct a nonlinear microscope-based three-dimensional imaging system and method using a continuous wave laser that is cheaper than an ultrafast pulse laser.
  • Another technical problem of the present invention is to provide a nonlinear microscope-based 3D imaging system and method that can reduce damage to samples when using a continuous wave laser during 3D imaging.
  • Another technical task of the present invention is to provide a 3D imaging system and method based on a nonlinear microscope that can acquire high-resolution 3D images even when using a continuous wave laser during 3D imaging.
  • a three-dimensional imaging system includes a memory that stores instructions for executing a computer program, a processor that executes the instructions, a light source configured to generate light, and light generated from the light source, fluorescent particles.
  • An optical path is formed to irradiate the labeled sample, and the light transmitted through the optical path causes an optical focus to be formed in a preset area where the sample labeled with the fluorescent particle is located, and the light irradiated to the optical focus is and a non-linear microscope device for measuring a fluorescent signal emitted from the fluorescent particle, wherein when the instruction is executed by the processor, the processor based on the fluorescent signal emitted from the fluorescent particle and the position of the optical focus.
  • a three-dimensional image is generated, the light source outputs a continuous wave laser configured to generate light having a continuous wave, and the fluorescent particles may be fluorescent particles that exhibit a nonlinear optical response by light having the continuous wave. .
  • the preset area may be an area set based on the intensity of a fluorescence signal emitted from the fluorescent particle compared to the intensity of excitation light incident on the fluorescent particle.
  • the preset area may be an area in which the intensity of a fluorescence signal emitted from the fluorescent particle has a non-linear relationship with the intensity of excitation light incident on the fluorescent particle.
  • the wavelength of light generated from the light source may be longer than the wavelength of the fluorescence signal emitted from the fluorescent particle.
  • the fluorescent particles may be upconversion particles doped with lanthanide ions.
  • the non-linear microscope device includes a plurality of lenses for controlling the optical path, an objective lens for forming the optical focus in the preset area for light transmitted through the plurality of lenses, and an objective lens for controlling the position of the optical focus. It may include a position control unit for; a fluorescence filtering unit for filtering the fluorescence signal emitted from the non-linear fluorescent particles; and a signal measurement unit for measuring the filtered fluorescence signal.
  • the position adjusting unit includes at least one mirror, and the processor controls the position of the at least one mirror to adjust the horizontal position of the optical focus, and at least one of the objective lens and the stage on which the sample is placed. By controlling , the vertical position of the optical focus can be adjusted.
  • the processor may generate the three-dimensional image by matching the fluorescence signal measured at that location to each location of the optical focus.
  • a 3D imaging method using a 3D imaging system includes setting an optical focus to be formed within a preset area and irradiating light generated from a light source to a sample labeled with fluorescent particles; Measuring a fluorescent signal emitted from the fluorescent particle at the optical focus, and providing intensity information of the fluorescent signal emitted from the fluorescent particle and location information of the optical focus, wherein the light source emits a continuous wave.
  • the laser beam is a continuous wave laser configured to generate light
  • the fluorescent particles may be fluorescent particles that exhibit a nonlinear optical response by light having the continuous wave.
  • a computer program stored in a computer-readable recording medium when executed by a processor, sets an optical focus to be formed within a preset area, converting light generated from a light source into fluorescent particles. Irradiating a labeled sample, measuring a fluorescent signal emitted from the fluorescent particle at the optical focus, and providing intensity information of the fluorescent signal emitted from the fluorescent particle and location information of the optical focus.
  • a computer-readable recording medium storing a computer program, wherein the computer program, when executed by a processor, sets the optical focus to be formed within a preset area and generates light from the light source. irradiating light to a sample labeled with a fluorescent particle, measuring a fluorescent signal emitted from the fluorescent particle at the optical focus, intensity information of the fluorescent signal emitted from the fluorescent particle, and the location of the optical focus.
  • a nonlinear microscope-based three-dimensional imaging system can be implemented using a continuous wave laser, and thus the cost can be significantly reduced compared to the case of using an ultra-expensive pulse laser.
  • the inside of biological tissue can be imaged more deeply and high-resolution images can be acquired non-invasively.
  • FIG. 1 is a diagram showing a 3D imaging system according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the structure of a 3D imaging system according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing the intensity of a fluorescence signal emitted compared to the intensity of excitation light of fluorescent particles according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the spatial distribution of excitation light and fluorescence signals according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a diagram showing a general fluorescence signal generated by a continuous wave laser.
  • Figure 6 is a diagram showing a fluorescence signal generated according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a diagram showing a 3D imaging method according to an embodiment of the present invention.
  • 'unit' refers to software or hardware components such as FPGA or ASIC, and the 'unit' performs certain roles.
  • 'wealth' is not limited to software or hardware.
  • the 'part' may be configured to reside on an addressable storage medium and may be configured to run on one or more processors. Therefore, as an example, 'part' refers to components such as software components, object-oriented software components, class components and task components, processes, functions, properties, procedures, Includes subroutines, segments of program code, drivers, firmware, microcode, circuits, data, databases, data structures, tables, arrays, and variables.
  • the functionality provided within the components and 'parts' may be combined into a smaller number of components and 'parts' or may be further separated into additional components and 'parts'.
  • FIG. 1 is a diagram showing a 3D imaging system according to an embodiment of the present invention.
  • a three-dimensional imaging system includes a light source 110, a microscope device 120, and an imaging device 130.
  • the light source 110 is configured to generate light (hereinafter referred to as excitation light) to excite fluorescence in a sample labeled with fluorescent particles.
  • the light source 110 may be implemented as a continuous wave laser that emits light (or beam) having continuous waves.
  • the continuous wave laser may be configured to emit light with a longer wavelength than the wavelength of the fluorescence signal emitted from the fluorescent particle.
  • the microscope device 120 irradiates light having a continuous wave emitted from the light source 110 onto the sample labeled with fluorescent particles to form an optical focus within a preset area. Additionally, the microscope device 120 measures fluorescence (or fluorescence signal) emitted from the fluorescent particles at the optical focus.
  • the microscope device 120 may be implemented as a non-linear microscope. Nonlinear microscopy may be called multiphoton optical microscopy and may include two-photon fluorescence microscopy and three-photon fluorescence microscopy.
  • the fluorescent particles labeled on the sample may be fluorescent particles that exhibit a nonlinear optical response due to excitation light having a continuous wave emitted from the light source 110.
  • fluorescent particles that exhibit a nonlinear optical response to excitation light are referred to as nonlinear fluorescent particles.
  • the nonlinear fluorescent particles may include upconversion particles doped with lanthanide ions.
  • the microscope device 120 may set a specific area as an area for three-dimensional imaging based on the intensity of fluorescence emitted from the fluorescent particle compared to the intensity of excitation light incident on the fluorescent particle. For example, the microscope device 120 sets the area where the fluorescence is emitted in a non-linear manner with respect to the intensity of the excitation light incident on the fluorescent particle as the area for three-dimensional imaging of the sample. You can.
  • the microscope device 120 can measure the fluorescence signal emitted from the fluorescent particles while moving the position of the optical focus within the set area.
  • the set area includes not only an area on a plane but also an area in three-dimensional space.
  • the microscope device 120 includes a plurality of lenses for controlling the size of light, an objective lens for forming an optical focus on a sample within a preset area, and adjusting the position of the optical focus within a preset area. It may include a position control unit for controlling the fluorescent particles, a fluorescence filtering unit for filtering the fluorescent signal emitted from the fluorescent particles, and a signal measuring unit for measuring the filtered fluorescence signal.
  • the position adjusting unit may include at least one mirror.
  • the mirror may include a galvano mirror.
  • the position adjusting unit includes a first support member for fixing at least one mirror, a first moving member (e.g., motor actuator, etc.) coupled to the first support member to move the position of the first support member, and , It may include a memory containing instructions for controlling the operation of the first moving member, and a processor that executes the instructions stored in the memory to provide a signal for controlling the operation of the first moving member.
  • a first moving member e.g., motor actuator, etc.
  • the movement of at least one mirror can be controlled through a control signal provided by the processor, and the horizontal position of the optical focus, that is, the X-Y axis position, can be adjusted accordingly.
  • the position adjusting unit includes a second support member that fixes the objective lens, a stage on which the sample is placed, a tunable lens, etc., and a second support member that is coupled to the second support member and moves the position of the second support member. It may include moving members (e.g., motor actuators, etc.). Additionally, the memory may further include instructions for controlling the operation of the second moving member, and the processor may execute the instructions stored in the memory to provide a signal for controlling the operation of the second moving member. Accordingly, the movement of the objective lens, the stage on which the sample is placed, the tunable lens, etc. can be controlled through the control signal provided by the processor, and the vertical position of the optical focus, that is, the Z-axis position, can be adjusted. there is.
  • the imaging device 130 may generate a three-dimensional image based on the fluorescence signal emitted from the fluorescent particle and the location of the optical focus where the fluorescence signal is measured.
  • the imaging device 130 includes a memory that stores instructions for executing a program for generating a three-dimensional image, and a fluorescence signal emitted from a fluorescent particle by executing the program stored in the memory and an optical focus at which the fluorescence signal is measured. It may include a processor that generates a 3D image based on the location.
  • the microscope device 120 may provide and/or transmit intensity information of a fluorescence signal emitted from a fluorescent particle and location information of an optical focus where the corresponding fluorescence signal is measured to the imaging device 130.
  • the imaging device 130 may obtain intensity information of the fluorescence signal and location information of the optical focus where the corresponding fluorescence signal is measured from the microscope device 120.
  • the imaging device 130 can generate a three-dimensional image by matching the fluorescence signal measured at that location for each location of the optical focus based on the intensity information of the fluorescence signal and the location information of the optical focus where the corresponding fluorescence signal was measured. there is.
  • the memory and processor provided in the imaging device 130 may be composed of the same entity as the memory and processor provided in the position control unit, or may be independently configured as separate entities.
  • Figure 2 is a diagram showing the structure of a nonlinear microscope device according to an embodiment of the present invention.
  • the nonlinear microscope device includes a plurality of lenses (211, 212, 213, 214, 215, 216), a galvano mirror 220, an objective lens 230, and a plurality of lenses. It includes dichroic mirrors 241 and 242, a bandpass filter 250, and a signal measurement unit 260.
  • the path of light output from the light source 200 is controlled by the angle of incidence and refraction angle of the first lens 211 and the second lens 212 provided in the nonlinear microscope device, so that the light output from the light source 200 is converted into a galvano mirror. It can be sent to (220).
  • the light source 200 is used to excite fluorescence from nonlinear fluorescent particles and may be a device that generates a continuous wave laser.
  • the light path reflected through the galvano mirror 220 is controlled through the objective lens 230 provided in the nonlinear microscope device, and an optical focus is formed on the sample 235 labeled with nonlinear fluorescent particles.
  • the position of the galvano mirror 220 provided in the nonlinear microscope device is adjusted, the horizontal position of the corresponding optical focus can be adjusted and / or changed, and the stage on which the objective lens 230 or the sample 235 is placed ( (not shown), the vertical position of the optical focus can be adjusted and/or changed by controlling the position of a wavefront control device such as a tunable lens.
  • the path of light reflected from the galvano mirror 220 is controlled by the angle of incidence and refraction of the third lens 214 and the fourth lens 214 provided in the nonlinear microscope device, and the path of the light reflected from the galvano mirror 220 is controlled.
  • the reflected light may be transmitted to the objective lens 230.
  • the nonlinear fluorescence signal emitted from the nonlinear fluorescent particles is transmitted through the first color-selecting mirror 241, the fifth lens 215, the second color-selecting mirror 242, the bandpass filter 250, and the sixth lens 216. It may pass through and reach the signal measurement unit 260.
  • the signal measurement unit 260 may be configured to include, for example, a photodiode, a photomultiplier tube, etc., and generates a fluorescence signal through the photodiode, a photomultiplier tube, etc. can be detected.
  • Figure 3 is a diagram showing the intensity of the fluorescence signal emitted compared to the intensity of the excitation light of the fluorescent particle according to an embodiment of the present invention
  • Figure 4 is a diagram showing the spatial distribution of the excitation light and fluorescence signal according to an embodiment of the present invention. It is a drawing.
  • Figure 3 shows a log-log plot of the intensity of fluorescence emitted compared to the intensity of excitation light of fluorescent particles that exhibit a nonlinear optical response to continuous wave laser excitation.
  • I emission refers to the intensity of fluorescence emitted from the fluorescent particle
  • I excitation refers to the intensity of light for excitation of the fluorescent particle.
  • the slope s of the log-log plot representing the emitted fluorescence intensity compared to the excitation light intensity is less than 1. In areas where the excitation intensity is relatively high, the slope s of the log-log plot is greater than 1.
  • area 1 and area 2 is based on the excitation light intensity at the point where the slope s of the log-log plot is 1, and the excitation light intensity at this time is called A.
  • the excitation light intensity with a Gaussian distribution centered on the focal length of the optical system is shown as a dotted line.
  • area 1 and area 2 are divided based on the spatial location where the intensity of excitation light becomes A.
  • the slope s of the log-log plot in region 1 is less than 1. Therefore, the slope s of the emitted fluorescence intensity relative to the excitation light energy at a specific spatial location in region 1 is always lower than the slope of the Gaussian distribution of the excitation light intensity.
  • the expected distribution of fluorescence is shown as a thin solid line. Meanwhile, the slope s of the log-log plot in region 2 is greater than 1.
  • the slope s of the emitted fluorescence intensity relative to the excitation light energy at a specific spatial location in region 2 is always higher than the slope of the Gaussian distribution of the excitation light intensity.
  • the expected distribution of fluorescence is shown as a thick solid line.
  • the width of the distribution (sum of thick and thin solid lines) of the fluorescence intensity emitted from the fluorescent particle according to the distance is narrower than the width of the Gaussian distribution of the excitation light intensity.
  • the width of the distribution of excitation light intensity is determined by the diffraction limit of the excitation light wavelength, and cannot physically be made smaller than this unless special processing such as super-resolution imaging or near-field control is performed.
  • the width of the distribution of fluorescence intensity emitted from fluorescent particles exhibiting nonlinear optical response according to distance may be smaller than the width of the diffraction limit of the excitation light wavelength. This means that an explosive increase in fluorescence intensity can be expected at the focal plane of the optical system where the excitation light is collected. Additionally, this means that a very small amount of fluorescence intensity is expected at long distances from the focal plane.
  • upconversion particles doped with lanthanide ions exist as fluorescent particles exhibiting a nonlinear optical response as shown in FIG. 3 .
  • the type varies depending on the host crystal, type of doped lanthanide ion, concentration of doped lanthanide ion, etc., and the slope s and excitation light intensity A can be designed accordingly.
  • up-conversion particles it is possible to use excitation light with a longer wavelength than the wavelength of fluorescence light.
  • the wavelength relationship between incident excitation light and emitted fluorescence is defined by Stokes shift, so excitation light with a shorter wavelength than fluorescence must be used.
  • excitation light with a longer wavelength than the fluorescence emitted from nonlinear fluorescent particles deeper inside biological tissues can be imaged non-invasively and with high resolution.
  • all fluorescent particles showing nonlinear optical response shown in FIG. 3 can be used to implement a continuous wave laser-based nonlinear microscope.
  • the excitation light intensity corresponding to the slope s and A in FIG. 3 may also vary depending on the wavelength of the excitation light and the wavelength of the observed fluorescence light.
  • the three-dimensional imaging performance of the nonlinear microscope may vary. For example, the lower the slope s in area 1 of FIG. 3 and the higher the slope s in area 2, the higher the resolution can be obtained during 3D imaging.
  • imaging performance may also change depending on the excitation light intensity at location A.
  • FIG. 5 is a diagram showing a general fluorescence signal generated by a continuous wave laser
  • FIG. 6 is a diagram showing a fluorescence signal generated according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a diagram showing a 3D imaging method according to an embodiment of the present invention.
  • the nonlinear microscope device of the three-dimensional imaging system labels the light generated from the light source with fluorescent particles so that an optical focus is formed within a preset area when the sample is fixed in front of the objective lens.
  • the sample can be investigated (S700).
  • the light source may be configured to emit light having a continuous wave, and for this purpose, the light source may be implemented as a continuous wave laser. Additionally, the continuous wave laser may be configured to emit light with a longer wavelength than the wavelength of the fluorescence signal emitted from the fluorescent particles for non-invasive high-resolution imaging.
  • the light emitted from the light source passes through the objective lens of the nonlinear microscope device and is focused at a specific location on the sample.
  • fluorescence occurs only near the location of the optical focus. Therefore, nonlinear fluorescent particles that exhibit a nonlinear optical response to light having a continuous wave can be used as the fluorescent particles.
  • the nonlinear fluorescent particles may include upconversion particles doped with lanthanide ions.
  • the nonlinear microscope device can measure the nonlinear fluorescence signal emitted from the fluorescent particle at the optical focus (S710). At this time, the nonlinear microscope device can continuously measure nonlinear fluorescence signals generated in three-dimensional space while moving the position of the optical focus within a preset area.
  • the preset area may be set in three-dimensional space based on the intensity of the fluorescence signal emitted from the nonlinear fluorescent particle compared to the intensity of excitation light incident on the nonlinear fluorescent particle.
  • the preset area may encompass any 3D space in which a 3D image is to be realized while moving the optical focus within the 3D space.
  • a nonlinear microscope device may control at least one mirror to adjust the position on the plane of the optical focus, and control the objective lens, the stage on which the sample is placed, a tunable lens, etc. to adjust the depth and/or height of the optical focus. It can be adjusted.
  • the nonlinear microscope device may provide intensity information of the fluorescence signal emitted from the fluorescent particle and location information of the optical focus to the imaging device (S720).
  • the imaging device can generate a 3D image representing the 3D structure of the entire sample based on the intensity information of the fluorescence signal provided from the nonlinear microscope device and the location information at the optical focus where the intensity information was measured. there is.
  • the imaging device can generate a three-dimensional image by matching fluorescence signals measured at each optical focus position and arranging them into voxels in three-dimensional space.
  • each step included in the 3D imaging method according to the above-described embodiment may be implemented as a computer program recorded on a recording medium including instructions for causing a processor to perform these steps.
  • each step included in the 3D imaging method according to the above-described embodiment may be implemented in a computer-readable recording medium on which a computer program including instructions for allowing a processor to perform these steps is recorded.
  • Combinations of each step in each flowchart attached to the present invention may be performed by computer program instructions. Since these computer program instructions can be mounted on the processor of a general-purpose computer, special-purpose computer, or other programmable data processing equipment, the instructions performed through the processor of the computer or other programmable data processing equipment perform the functions described in each step of the flow chart. It creates the means to carry out these tasks.
  • These computer program instructions may also be stored on a computer-usable or computer-readable recording medium that can be directed to a computer or other programmable data processing equipment to implement a function in a particular way, so that the computer program instructions are computer-usable or computer-readable.
  • the instructions stored in the recording medium can also produce manufactured items containing instruction means that perform the functions described in each step of the flowchart.
  • Computer program instructions can also be mounted on a computer or other programmable data processing equipment, so that a series of operational steps are performed on the computer or other programmable data processing equipment to create a process that is executed by the computer, thereby generating a process that is executed by the computer or other programmable data processing equipment. Instructions that perform processing equipment may also provide steps for executing the functions described in each step of the flowchart.
  • each step may represent a module, segment, or portion of code containing one or more executable instructions for executing specified logical function(s). Additionally, it should be noted that in some alternative embodiments it is possible for the functions mentioned in the steps to occur out of order. For example, two steps shown in succession may in fact be performed substantially simultaneously, or the steps may sometimes be performed in reverse order depending on the corresponding function.

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Abstract

일 실시예에 따른 3차원 이미징 시스템은, 컴퓨터 프로그램을 수행하는 명령어를 저장하는 메모리, 상기 명령어를 수행하는 프로세서, 빛이 발생하도록 구성되는 광원, 상기 광원에서 발생되는 빛이, 형광 입자로 표지된 샘플에 조사되도록 하는 광경로를 형성하고, 상기 광경로를 통해 전달되는 빛이 상기 형광 입자로 표지된 샘플이 위치한 미리 설정된 영역에 광초점이 형성되도록 하고, 상기 광초점에 조사된 빛에 의해 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호를 측정하는 비선형 현미경 장치를 포함하되, 상기 프로세서에 의해 상기 명령어가 실행되면, 상기 프로세서는, 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호와 상기 광초점의 위치를 기반으로 3차원 영상을 생성하고, 상기 광원은 연속파동을 가지는 빛이 발생하도록 구성되는 연속파동 레이저를 출력하고, 상기 형광 입자는 상기 연속파동을 가지는 빛에 의해 비선형 광학 반응을 나타내는 형광 입자일 수 있다.

Description

연속파동 레이저를 이용하는 비선형 현미경 기반의 3차원 이미징 시스템 및 방법
본 발명은 연속파동 레이저를 이용하는 비선형 현미경 기반의 3 차원 이미징 시스템 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 연속파동 레이저 여기(excitation)에 비선형 광학 반응(nonlinear optical response)을 나타내는 형광 입자를 이용하여 비선형 현미경을 구현하고, 이를 기반으로 3차원 영상을 생성하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.
본 연구는 2020년도 과학기술정보통신부(정부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구사업의 3차원 볼륨 동시 측정 홀로그래픽 in-vivo 이광자 현미경을 통한 뇌활성지도 작성(No. 1711170194)과 관련된다.
비선형 현미경은 샘플(시료)의 3차원 형광을 이미징하는데 있어서 공초점 현미경과 함께 생명과학 분야에서 가장 널리 사용되는 현미경이다. 비선형 현미경 기반의 3차원 이미징 기법은 형광 물질의 비선형 여기 또는 비선형 산란을 통해 여기 빛이 모이는 초점에서 유의미한 비선형 신호가 발생하는 현상을 이용한다. 따라서 비선형 현미경을 이용하는 경우, 3차원 영상을 이미징 시 공초점 현미경을 이용하는 경우와는 달리, 검출 경로에 별도의 핀홀이 필요하지 않다. 또한, 비선형 여기의 경우 선형 여기를 사용하는 현미경 기법들에 비해 동일한 형광 물질을 대상으로 할 때 긴 파장대의 여기 빛을 사용하므로 상대적으로 빛의 산란이 적다는 이점이 있다. 따라서, 산란이 심한 시료(예를 들어, 생물체의 조직 혹은 세포)의 형광을 수집하는데 있어서 비선형 현미경을 이용하면 여타 현미경(예를 들어, 공초점 현미경)을 이용하는 경우에 비해 시료의 더 깊은 곳에 있는 정보까지 수집할 수 있다. 이러한 장점으로 인해 비선형 현미경은 세포/조직의 시각화 및 분석, 그리고 뇌 과학 등 다양한 생명과학 연구에서 필수적이다.
하지만 형광 물질의 비선형 신호 여기의 흡수 단면은 굉장히 작기 때문에, 비선형 현미경으로 3차원 이미징 기법을 구현함에 있어서 매우 높은 여기 세기를 지닌 광원(102 MWcm-2 내지 GWcm-2)이 필수적이다. 일반적으로 이러한 높은 세기의 여기 빛은 연속파동 레이저로는 얻을 수 없다. 따라서, 종래의 비선형 현미경 기반 3차원 이미징에는 비선형 신호 여기에 필요한 여기 세기를 얻을 수 있는 초고속 펄스 레이저가 필수적이다. 하지만, 고품질의 초고속 펄스 레이저는 수억 원(일반적으로 100k USD 이상)을 호가하며, 추가적으로 레이저의 유지/관리에 전문적인 인력과 비용이 수반된다. 이러한 경제적인 문제로 기존의 비선형 현미경 기반 3차원 이미징 기법은 그 편리성과 탁월성에도 불구하고 널리 보급되어 있지 않다.
한편, 공초점 현미경은 비선형 현미경에 비해 이미징 성능 측면에서 그 원리상 불리한 점을 가진다. 공초점 현미경은 선형 여기에 기반하기 때문에 가시광선 대역의 형광체들을 여기시키기 위해서는 형광 대역보다 에너지가 높은 짧은 파장의 빛을 사용해야 한다. 이처럼 짧은 파장대의 여기 파장의 빛 및 검출경로 상 핀홀의 존재로 인해, 공초점 현미경으로는 시료의 깊은 곳에 있는 형광 정보를 수집하기 어려우며, 측정과 동시에 시료의 3차원 전 영역에 영구적인 피해를 준다. 그럼에도 불구하고 공초점 현미경 기반 3차원 이미징 기법은 상대적으로 저렴한 가격의 연속파동 레이저(일반적으로 약 1k USD)로 구축이 가능하기 때문에, 생명과학 연구실에 가장 많이 보급되어 있는 실정이다.
본 발명의 기술적 과제는 초고속 펄스 레이저 대비 저렴한 연속파동 레이저를 이용하여 비선형 현미경 기반의 3차원 이미징 시스템 및 방법을 구축함에 있다.
본 발명의 다른 기술적 과제는 3차원 이미징 시 연속파동 레이저를 이용하는 경우 샘플에 발생하는 손상을 줄일 수 있는 비선형 현미경 기반의 3차원 이미징 시스템 및 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 기술적 과제는 3차원 이미징 시 연속파동 레이저를 이용하는 경우에도 고해상도의 3차원 영상을 획득할 수 있는 비선형 현미경 기반의 3차원 이미징 시스템 및 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 해결하고자 하는 과제는 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 3차원 이미징 시스템은 컴퓨터 프로그램을 수행하는 명령어를 저장하는 메모리, 상기 명령어를 수행하는 프로세서, 빛이 발생하도록 구성되는 광원, 상기 광원에서 발생되는 빛이, 형광 입자로 표지된 샘플에 조사되도록 하는 광경로를 형성하고, 상기 광경로를 통해 전달되는 빛이 상기 형광 입자로 표지된 샘플이 위치한 미리 설정된 영역에 광초점이 형성되도록 하고, 상기 광초점에 조사된 빛에 의해 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호를 측정하는 비선형 현미경 장치를 포함하되, 상기 프로세서에 의해 상기 명령어가 실행되면, 상기 프로세서는, 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호와 상기 광초점의 위치를 기반으로 3차원 영상을 생성하고, 상기 광원은 연속파동을 가지는 빛이 발생하도록 구성되는 연속파동 레이저를 출력하고, 상기 형광 입자는 상기 연속파동을 가지는 빛에 의해 비선형 광학 반응을 나타내는 형광 입자일 수 있다.
여기서, 상기 미리 설정된 영역은 상기 형광 입자로 입사되는 여기 빛의 세기 대비 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기를 기반으로 설정되는 영역일 수 있다.
또한, 상기 미리 설정된 영역은 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기가 상기 형광 입자로 입사되는 여기 빛의 세기와 비선형 관계를 갖는 영역일 수 있다.
또한, 상기 광원에서 발생되는 빛의 파장은 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 파장보다 길 수 있다.
또한, 상기 형광 입자는 란탄족 이온이 도핑된 상향변환 입자일 수 있다.
또한, 상기 비선형 현미경 장치는 상기 광경로를 조절하는 복수개의 렌즈, 상기 복수개의 렌즈를 통해 전달된 광이, 상기 미리 설정된 영역에 상기 광초점을 형성하기 위한 대물렌즈, 상기 광초점의 위치를 조절하기 위한 위치 조절부;, 상기 비선형 형광 입자에서 방출되는 형광 신호를 필터링하기 위한 형광 필터링부, 및 상기 필터링된 형광 신호를 측정하기 위한 신호 측정부를 포함할 수 있다.
여기서, 상기 위치 조절부는 적어도 하나의 거울을 포함하고, 상기 프로세서는, 상기 적어도 하나의 거울의 위치를 제어하여 상기 광초점의 수평 위치를 조절하고, 상기 대물렌즈 및 상기 샘플이 놓이는 스테이지 중 적어도 하나를 제어하여, 상기 광초점의 수직 위치를 조절할 수 있다.
또한, 상기 상기 프로세서는, 상기 광초점의 위치 별로 해당 위치에서 측정된 형광 신호를 대응시켜 상기 3차원 영상을 생성할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 3차원 이미징 시스템에 의한 3차원 이미징 방법은 미리 설정된 영역 내에서 광초점이 형성되도록 설정하여, 광원에서 발생되는 빛을 형광 입자로 표지된 샘플에 조사하는 단계, 상기 광초점에서 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호를 측정하는 단계, 및 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기 정보와 상기 광초점의 위치 정보를 제공하는 단계를 포함하되, 상기 광원은 연속파동을 가지는 빛이 발생하도록 구성되는 연속파동 레이저이고, 상기 형광 입자는 상기 연속파동을 가지는 빛에 의해 비선형 광학 반응을 나타내는 형광 입자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 컴퓨터 판독 가능 기록매체에 저장되는 컴퓨터 프로그램은, 프로세서에 의해 실행되면, 미리 설정된 영역 내에서 광초점이 형성되도록 설정하여, 광원에서 발생되는 빛을 형광 입자로 표지된 샘플에 조사하는 단계와, 상기 광초점에서 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호를 측정하는 단계와, 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기 정보와 상기 광초점의 위치 정보를 제공하는 단계를 포함하는 3차원 이미징 방법을 상기 프로세서가 수행하도록 하기 위한 명령어를 포함하되, 상기 광원은 연속파동을 가지는 빛이 발생하도록 구성되는 연속파동 레이저이고, 상기 형광 입자는 상기 연속파동을 가지는 빛에 의해 비선형 광학 반응을 나타내는 형광 입자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 컴퓨터 프로그램을 저장하고 있는 컴퓨터 판독 가능 기록매체로서, 상기 컴퓨터 프로그램은, 프로세서에 의해 실행되면, 미리 설정된 영역 내에서 광초점이 형성되도록 설정하여, 광원에서 발생되는 빛을 형광 입자로 표지된 샘플에 조사하는 단계와, 상기 광초점에서 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호를 측정하는 단계와, 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기 정보와 상기 광초점의 위치 정보를 제공하는 단계를 포함하는 3차원 이미징 방법을 상기 프로세서가 수행하도록 하기 위한 명령어를 포함하되, 상기 광원은 연속파동을 가지는 빛이 발생하도록 구성되는 연속파동 레이저이고, 상기 형광 입자는 상기 연속파동을 가지는 빛에 의해 비선형 광학 반응을 나타내는 형광 입자일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 연속파동 레이저를 이용하여 비선형 현미경 기반의 3차원 이미징 시스템을 구현할 수 있기 때문에 초고가의 펄스 레이저를 이용하는 경우에 비해 비용을 현저히 줄일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 형광 입자로부터 방출되는 형광보다 긴 파장대의 여기 빛을 사용하기 때문에 생체조직 내부를 보다 깊이 영상화할 수 있으며, 비침습적으로 고해상도의 영상을 획득할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 이미징 시스템을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 이미징 시스템의 구조를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광 입자의 여기 빛 세기 대비 방출되는 형광 신호의 세기를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 여기 빛과 형광 신호의 공간 분포를 나타내는 도면이다.
도 5는 연속파동 레이저에 의해 발생되는 일반적인 형광 신호를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 발생되는 형광 신호를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 이미징 방법을 나타내는 도면이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 문서에서 사용되는 용어에 대해 간략히 설명하고, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 문서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 '포함'한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
또한, 본 문서에서 사용되는 '부'라는 용어는 소프트웨어 또는 FPGA나 ASIC과 같은 하드웨어 구성요소를 의미하며, '부'는 어떤 역할들을 수행한다. 그렇지만 '부'는 소프트웨어 또는 하드웨어에 한정되는 의미는 아니다. '부'는 어드레싱할 수 있는 저장 매체에 있도록 구성될 수도 있고 하나 또는 그 이상의 프로세서들을 재생시키도록 구성될 수도 있다. 따라서, 일 예로서 '부'는 소프트웨어 구성요소들, 객체지향 소프트웨어 구성요소들, 클래스 구성요소들 및 태스크 구성요소들과 같은 구성요소들과, 프로세스들, 함수들, 속성들, 프로시저들, 서브루틴들, 프로그램 코드의 세그먼트들, 드라이버들, 펌웨어, 마이크로 코드, 회로, 데이터, 데이터베이스, 데이터 구조들, 테이블들, 어레이들 및 변수들을 포함한다. 구성요소들과 '부'들 안에서 제공되는 기능은 더 작은 수의 구성요소들 및 '부'들로 결합되거나 추가적인 구성요소들과 '부'들로 더 분리될 수 있다.
아래에서는 첨부한 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 이미징 시스템을 나타내는 도면이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 이미징 시스템은 광원(110), 현미경 장치(120) 및 이미징 장치(130)를 포함한다.
광원(110)은 형광 입자가 표지된 샘플에서 형광을 여기시키기 위한 빛(이하, 여기 빛이라 함)이 발생하도록 구성된다. 본 실시예에서 광원(110)은 연속적인 파동을 가지는 빛(또는 빔)을 방출하는 연속파동 레이저로 구현될 수 있다. 상기 연속파동 레이저는 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 파장보다 긴 파장의 빛을 방출하도록 구성될 수 있다.
현미경 장치(120)는 광원(110)에서 방출되는 연속파동을 가지는 빛을 형광 입자로 표지된 샘플에 조사하여 미리 설정된 영역 내에서 광초점이 형성되도록 한다. 또한 현미경 장치(120)는 광초점에서 형광 입자로부터 방출되는 형광(또는 형광 신호)을 측정한다. 본 실시예에서 현미경 장치(120)는 비선형 현미경으로 구현될 수 있다. 비선형 현미경은 다광자(multiphoton) 광학 현미경이라 불릴 수 있으며, 이광자(two-photon) 형광 현미경 및 삼광자(three-photon) 형광 현미경을 포함할 수 있다.
한편, 본 실시예에서 샘플(관찰 대상)에 표지되는 형광 입자는 광원(110)으로부터 방출되는 연속파동을 가지는 여기 빛에 의해 비선형 광학 반응을 나타내는 형광 입자일 수 있다. 이하에서, 여기 빛에 비선형 광학 반응을 보이는 형광 입자를 비선형 형광 입자라 한다. 일 예로, 비선형 형광 입자는 란탄족 이온이 도핑된 상향변환 입자를 포함할 수 있다.
현미경 장치(120)는 형광 입자로 입사되는 여기(excitation) 빛의 세기 대비 해당 형광 입자로부터 방출되는 형광의 세기를 기반으로 특정 영역을 3차원 이미징을 위한 영역으로 설정할 수 있다. 예를 들어, 현미경 장치(120)는 형광 입자로부터 방출되는 형광의 세기가 해당 형광 입자로 입사되는 여기 빛의 세기에 대해 비선형으로 형광이 방출되는 영역을 샘플에 대한 3차원 이미징을 위한 영역으로서 설정할 수 있다.
현미경 장치(120)는 상기 설정된 영역 내에서 광초점의 위치를 이동시키면서 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호를 측정할 수 있다. 여기서 상기 설정된 영역은 평면 상의 영역뿐만 아니라 3차원 공간 상의 영역을 포함한다.
일 실시예로서, 현미경 장치(120)는 빛의 크기를 조절하기 위한 복수개의 렌즈, 미리 설정된 영역 내에서 샘플 상에 광초점을 형성하기 위한 대물렌즈, 미리 설정된 영역 내에서 광초점의 위치를 조절하기 위한 위치 조절부, 형광 입자에서 방출되는 형광 신호를 필터링하기 위한 형광 필터링부, 및 상기 필터링된 형광 신호를 측정하기 위한 신호 측정부를 포함할 수 있다.
상기 위치 조절부는 적어도 하나의 거울을 포함할 수 있다. 여기서, 거울은 갈바노(galvano) 거울을 포함할 수 있다.
또한, 상기 위치 조절부는, 적어도 하나의 거울을 고정하는 제1지지부재와, 상기 제1지지부재에 결합되어 상기 제1지지부재의 위치를 이동시키는 제1이동부재(예, 모터 액추에이터 등)와, 상기 제1이동부재의 동작을 제어하는 명령어를 수록한 메모리와, 상기 메모리에 저장된 명령어를 실행하여 제1이동부재의 동작을 제어하는 신호를 제공하는 프로세서를 포함할 수 있다.
상기 프로세서가 제공하는 제어신호를 통해 적어도 하나의 거울의 이동이 제어될 수 있으며, 이에 따라 광초점의 수평 위치, 즉, X-Y축 위치가 조절될 수 있다.
또한, 상기 위치 조절부는 대물렌즈, 샘플이 놓이는 스테이지, 튜너블(tunable) 렌즈 등을 고정하는 제2지지부재와, 상기 제2지지부재에 결합되어 상기 제2지지부재의 위치를 이동시키는 제2이동부재(예, 모터 액추에이터 등)를 포함할 수 있다. 그리고, 메모리는 제2이동부재의 동작을 제어하는 명령어를 더 포함할 수 있으며, 상기 프로세서는, 상기 메모리에 저장된 명령어를 실행하여 제2이동부재의 동작을 제어하는 신호를 제공할 수 있다. 이에 따라, 상기 프로세서가 제공하는 제어신호를 통해 대물렌즈, 샘플이 놓이는 스테이지, 튜너블(tunable) 렌즈 등의 이동이 제어될 수 있으며, 광초점의 수직 위치, 즉, Z축 위치가 조절될 수 있다.
이미징 장치(130)는 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호와 상기 형광 신호가 측정된 광초점의 위치를 기반으로 3차원 영상을 생성할 수 있다. 예컨대, 이미징 장치(130)는, 3차원 영상을 생성하는 프로그램을 실행하는 명령어를 저장한 메모리와, 상기 메모리에 저장된 프로그램을 실행하여 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호와 상기 형광 신호가 측정된 광초점의 위치를 기반으로 3차원 영상을 생성하는 프로세서를 포함할 수 있다.
일 실시예로서, 현미경 장치(120)는 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기 정보와 해당 형광 신호가 측정된 광초점의 위치 정보를 이미징 장치(130)로 제공 및/또는 전달할 수 있다. 또는 다른 실시예로서, 이미징 장치(130)가 현미경 장치(120)로부터 상기 형광 신호의 세기 정보와 상기 해당 형광 신호가 측정된 광초점의 위치 정보를 획득할 수 있다.
이미징 장치(130)는 상기 형광 신호의 세기 정보와 상기 해당 형광 신호가 측정된 광초점의 위치 정보를 기반으로 광초점의 위치 별로 해당 위치에서 측정된 형광 신호를 대응시켜 3차원 영상을 생성할 수 있다.
나아가, 이미징 장치(130)에 구비된 메모리와 프로세서는, 상기 위치 조절부에 구비된 메모리와 프로세서와 동일한 개체로 구성되거나, 별도의 다른 개체로서 각각 독립적으로 구성된 메모리와 프로세서일 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 비선형 현미경 장치의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 비선형 현미경 장치는 복수개의 렌즈(211, 212, 213, 214, 215, 216), 갈바노 거울(220), 대물렌즈(230), 복수개의 색선별(dichroic) 거울(241, 242), 밴드패스 필터(250) 및 신호 측정부(260)를 포함한다.
비선형 현미경 장치에 구비된 제1 렌즈(211)와 제2 렌즈(212)의 입사각과 굴절각에 의해 광원(200)에서 출력되는 광의 경로가 제어되어, 광원(200)에서 출력되는 광이 갈바노 거울(220)로 전달될 수 있다. 여기서, 광원(200)은 비선형 형광 입자로부터 형광을 여기시키기 위한 것으로서 연속파동 레이저를 생성하는 장치일 수 있다.
갈바노 거울(220)을 통해 반사된 광은 비선형 현미경 장치에 구비된 대물렌즈(230)를 통해 광 경로가 제어되어, 비선형 형광 입자로 표지된 샘플(235)에 광초점이 형성된다. 이때, 비선형 현미경 장치에 구비된 갈바노 거울(220)의 위치가 조절되면, 해당 광 초점의 수평 위치를 조절 및/또는 변경될 수 있으며, 대물렌즈(230) 또는 샘플(235)이 놓이는 스테이지(도시되지 않음), 튜너블 렌즈 등의 파면 제어 장치의 위치를 제어하여 광 초점의 수직 위치를 조절 및/또는 변경할 수 있다. 이 때, 비선형 현미경 장치에 구비된 제3 렌즈(214) 및 제4 렌즈(214)의 입사각과 굴절각에 의해 갈바노 거울(220)에서 반사된 광의 경로가 제어되어, 갈바노 거울(220)에서 반사된 광이 대물렌즈(230)로 전달될 수 있다.
비선형 형광 입자에서 방출되는 비선형의 형광 신호는 제1 색선별 거울(241), 제5 렌즈(215), 제2 색선별 거울(242), 밴드패스 필터(250) 및 제6 렌즈(216)를 통과하여 신호 측정부(260)에 도달될 수 있다. 신호 측정부(260)는 일 예로, 포토다이오드(photodiode), 광전자증폭관(photomultiplier tube) 등을 포함하여 구성될 수 있으며, 포토다이오드(photodiode), 광전자증폭관(photomultiplier tube) 등을 통해 형광 신호를 검출할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 형광 입자의 여기 빛 세기 대비 방출되는 형광 신호의 세기를 나타내는 도면이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 여기 빛과 형광 신호의 공간 분포를 나타내는 도면이다.
도 3에는 연속파동 레이저 여기에 비선형 광학 반응을 보이는 형광 입자의 여기 빛 세기 대비 방출되는 형광 세기의 로그-로그 플롯(log-log plot)이 도시되어 있다. 도 3에서 Iemission은 형광 입자로부터 방출되는 형광의 세기를 의미하고, Iexcitation은 형광 입자의 여기를 위한 빛의 세기를 의미한다. 도 3에서 로그-로그 플롯의 기울기는 (Iemission = Iexcitation s)의 방정식에 따라 s 값으로 표시된다.
도 3을 참조하면, 상대적으로 여기 세기가 낮은 영역에서는 여기 빛 세기 대비 방출되는 형광 세기를 나타내는 로그-로그 플롯의 기울기 s는 1 보다 작다. 상대적으로 여기 세기가 높은 영역에서는 로그-로그 플롯의 기울기 s는 1보다 크다. 영역 1과 영역 2의 구분은 로그-로그 플롯의 기울기 s가 1이 되는 지점의 여기 빛 세기를 기준으로 하며, 이 때의 여기 빛 세기를 A라 한다.
한편, 도 4에는 광학 시스템의 초점거리를 중심으로 하는 가우시안(Gaussian) 분포를 가진 여기 빛 세기가 점선으로 도시되어 있다. 도 3에서의 설명과 같이, 여기 빛의 세기가 A가 되는 공간상 위치를 기준으로 영역 1과 영역 2가 구분된다. 영역 1에서의 로그-로그 플롯의 기울기 s는 1보다 작다. 따라서, 영역 1의 특정 공간 위치에서 여기 빛 에너지 대비 방출되는 형광 세기의 기울기 s는 여기 빛 세기의 가우시안 분포의 기울기보다 항상 낮다. 이 때, 예상되는 형광의 분포는 가는 실선으로 도시되어 있다. 한편, 영역 2에서의 로그-로그 플롯의 기울기 s는 1보다 크다. 따라서, 영역 2의 특정 공간 위치에서 여기 빛 에너지 대비 방출되는 형광 세기의 기울기 s는 여기 빛 세기의 가우시안 분포의 기울기보다 항상 높다. 이 때, 예상되는 형광의 분포는 굵은 실선으로 도시되어 있다. 결과적으로 도 4에 도시된 것과 같이, 형광 입자에서 방출되는 형광 세기의 거리에 따른 분포(굵은 실선과 가는 실선의 합)의 폭은 여기 빛 세기의 가우시안 분포의 폭보다 좁다.
광학 시스템에서 여기 빛 세기의 분포의 폭은 여기 빛 파장의 회절 한계에 의해 결정되며, 초고해상도 영상법, 근접장 제어 등의 특별한 처리를 하지 않는 이상 물리적으로 이보다 작아질 수 없다. 그러나 도 4에 도시된 것과 같이, 비선형 광학 반응을 보이는 형광 입자에서 방출되는 형광 세기의 거리에 따른 분포의 폭은 여기 빛 파장의 회절 한계의 폭보다 작아질 수 있다. 이는 여기 빛이 모이는 광학 시스템의 초점면에서는 폭발적으로 증가하는 형광 세기를 기대할 수 있음을 의미한다. 또한, 초점면에서 먼 거리에서는 굉장히 적은 양의 형광 세기가 기대됨을 의미한다. 결과적으로, 광학 시스템의 여기 빛이 모이는 초점에서만 강한 형광이 발생하게 되며, 이는 비선형 현미경이 기반으로 하는 비선형 여기에 따른 결과와 일치한다. 따라서, 연속파동 레이저 여기 시에 도 3의 광학 반응을 보이는 형광 입자를 이용하는 경우 연속파동 레이저로 구동하는 비선형 현미경을 구축할 수 있다.
연속파동 레이저 여기 시에 도 3에 도시된 비선형 광학 반응을 보이는 형광 입자로서 란탄족 이온들이 도핑된 상향변환 입자가 존재한다. 그 종류는 호스트 결정, 도핑된 란탄족 이온의 종류, 도핑된 란탄족 이온의 농도 등에 따라 다양하며, 이에 따라 기울기 s와 여기 빛 세기 A의 설계가 가능하다. 특히 상향변환 입자를 이용하면, 형광 빛의 파장보다 긴 파장의 여기 빛을 사용할 수 있게 된다. 기존 선형 형광 입자를 활용한 영상 기술의 경우 스토크스 시프트(stokes shift)로 입사되는 여기 빛과 방출되는 형광의 파장 관계가 정의되어 형광보다 짧은 파장의 여기 빛을 사용해야 한다. 그러나 본 발명에서는 비선형 형광 입자에서 방출되는 형광보다 긴 파장대의 여기 빛을 사용함으로써 보다 깊은 생체조직 내부를 비침습적이며 고해상도로 영상화할 수 있다.
한편, 앞서 언급한 란탄족 이온들이 도핑된 상향변환 입자 이외에도, 도 3에 도시된 비선형 광학 반응을 보이는 형광 입자는 모두 연속파동 레이저 기반의 비선형 현미경을 구현하는데 사용 가능하다. 일 예로, 동일한 형광 입자라 할지라도 여기 빛의 파장 및 관찰하는 형광 빛의 파장에 따라 도 3에서의 기울기 s와 A에 해당하는 여기 빛 세기 또한 달라질 수 있다. 또한, 형광 입자의 종류 및 실험 조건에 따라, 비선형 현미경의 삼차원 이미징 성능이 달라질 수 있다. 예를 들어, 도 3의 영역 1에서 기울기 s가 낮을수록 그리고 영역 2에서 기울기 s가 높을수록 3차원 이미징 시 보다 높은 해상도를 얻을 수 있다. 더불어, A 위치의 여기 빛 세기에 따라서도 이미징 성능 또한 변화할 수 있다.
도 5는 연속파동 레이저에 의해 발생되는 일반적인 형광 신호를 나타내는 도면이고, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 발생되는 형광 신호를 나타내는 도면이다.
기존의 형광 이미징은 형광 입자에 입사되는 빛과 형광 입자로부터 방출되는 형광의 세기가 선형 관계를 갖게 된다. 형광 입자에 입사되는 여기 빛과 형광 입자로부터 방출되는 형광 세기 사이에 비선형 관계를 갖게 하기 위해서는 초고속 펄스 레이저를 이용하여 형광 입자에 높은 에너지를 순간적으로 입사시켜야 하기 때문에, 연속파동 레이저로는 비선형 형광 신호를 얻기가 거의 불가능하다. 따라서 연속 파동 레이저로 일반 형광 입자를 여기시키면 도 5에 도시된 것과 같이 레이저가 통과하는 모든 깊이면에서 형광이 발생하게 된다. 이는 해당 광원 및 형광원을 활용한 이미징 시스템은 깊이 분해능을 상실하게 됨을 의미한다.
이에 반해 본 발명에 따른 이미징 방법을 사용하면, 도 6에 도시된 것과 같이 연속파동 레이저를 이용하더라도 초점이 생기는 깊이면(600)에서만 형광이 발생하며, 이와 같은 원리를 기반으로 연속 파동 레이저를 이용한 3차원 이미징이 가능해진다. 이와 같은 장점은 비단 3차원 이미징을 가능케 할 뿐만 아니라 샘플(특히 생체조직)에 대한 손상을 줄일 수 있다. 기존의 선형 형광 이미징의 경우 여기 빛이 통과하는 샘플의 모든 깊이 영역에 대해 에너지가 흡수되어 광독성(phototoxicity) 및 광표백(photobleaching) 현상이 유도되지만, 비선형 입자를 사용할 경우 여기 빛이 통과하는 모든 깊이가 아닌 초점면에서만 에너지가 유의미하게 흡수 또는 방출되어 광독성 및 광표백을 현저히 줄일 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 이미징 방법을 나타내는 도면이다.
도 7을 참조하면 본 발명의 일실시예에 따른 3차원 이미징 시스템의 비선형 현미경 장치는 대물렌즈 앞에 샘플이 고정되면, 미리 설정된 영역 내에서 광초점이 형성되도록 광원에서 발생되는 빛을 형광 입자로 표지된 샘플에 조사할 수 있다(S700). 여기서, 상기 광원은 연속파동을 가지는 빛을 방출하도록 구성될 수 있으며, 이를 위하여 상기 광원은 연속파동 레이저로 구현될 수 있다. 또한, 상기 연속파동 레이저는 비침습적 고해상도 이미징을 위해 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 파장보다 긴 파장을 빛을 방출하도록 구성될 수 있다.
광원에서 방출된 빛은 비선형 현미경 장치의 대물렌즈를 통과한 후 샘플의 특정 위치에서 초점을 맺게 되며, 비선형 형광 입자로 표지된 샘플에서는 광초점의 위치 근방에서만 형광이 발생하게 된다. 따라서, 상기 형광 입자로서 연속파동을 가지는 빛에 의해 비선형 광학 반응을 나타내는 비선형 형광 입자가 사용될 수 있다. 상기 비선형 형광 입자는 란탄족 이온이 도핑된 상향변환 입자를 포함할 수 있다.
광원으로부터 방출되는 빛이 상기 형광 입자로 표지된 샘플에 조사되면, 비선형 현미경 장치는 광초점에서 형광 입자로부터 방출되는 비선형의 형광 신호를 측정할 수 있다(S710). 이 때, 비선형 현미경 장치는 상기 광초점의 위치를 미리 설정된 영역 내에서 이동시키면서 3차원 공간 내에서 발생하는 비선형 형광 신호를 연속적으로 측정할 수 있다. 여기서, 상기 미리 설정된 영역은 비선형 형광 입자로 입사되는 여기 빛의 세기 대비 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기를 기반으로 3차원 공간 상에 설정될 수 있다. 일례로, 상기 미리 설정된 영역은 광초점을 3차원 공간내에서 이동시키면서 3차원 영상을 구현하고자 하는 임의의 3차원 공간을 아우를 수 있다.
예를 들어, 비선형 현미경 장치는 적어도 하나의 거울을 제어하여 광초점의 평면 상의 위치를 조절할 수 있으며, 대물렌즈, 샘플이 놓이는 스테이지, 튜너블 렌즈 등을 제어하여 광초점의 깊이 및/또는 높이를 조절할 수 있다.
이후, 비선형 현미경 장치는 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기 정보와 상기 광초점의 위치 정보를 이미징 장치로 제공할 수 있다(S720).
3차원 영상 시스템에서 이미징 장치는 비선형 현미경 장치로부터 제공받은 형광 신호의 세기 정보와 해당 세기 정보가 측정된 광초점에서의 위치 정보를 기반으로 샘플 전체의 3차원 구조를 나타내는 3차원 영상을 생성할 수 있다. 예를 들어, 상기 이미징 장치는 광초점의 위치 별로 해당 위치에서 측정된 형광 신호를 대응시켜 3차원 공간상의 복셀(voxel)에 배치함으로써 3차원 영상을 생성할 수 있다.
한편, 전술한 실시예에 따른 3차원 이미징 방법에 포함된 각각의 단계는, 이러한 단계를 프로세서가 수행하도록 하기 위한 명령어를 포함하여 기록매체에 기록된 컴퓨터 프로그램으로 구현될 수 있다.
또한, 전술한 실시예에 따른 3차원 이미징 방법에 포함된 각각의 단계는, 이러한 단계를 프로세서가 수행하도록 하기 위한 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램이 기록된 컴퓨터 판독 가능한 기록매체에서 구현될 수 있다.
본 발명에 첨부된 각 흐름도의 각 단계의 조합들은 컴퓨터 프로그램 인스트럭션들에 의해 수행될 수도 있다. 이들 컴퓨터 프로그램 인스트럭션들은 범용 컴퓨터, 특수용 컴퓨터 또는 기타 프로그램 가능한 데이터 프로세싱 장비의 프로세서에 탑재될 수 있으므로, 컴퓨터 또는 기타 프로그램 가능한 데이터 프로세싱 장비의 프로세서를 통해 수행되는 그 인스트럭션들이 흐름도의 각 단계에서 설명된 기능들을 수행하는 수단을 생성하게 된다. 이들 컴퓨터 프로그램 인스트럭션들은 특정 방식으로 기능을 구현하기 위해 컴퓨터 또는 기타 프로그램 가능한 데이터 프로세싱 장비를 지향할 수 있는 컴퓨터 이용 가능 또는 컴퓨터 판독 가능 기록매체에 저장되는 것도 가능하므로, 그 컴퓨터 이용가능 또는 컴퓨터 판독 가능 기록매체에 저장된 인스트럭션들은 흐름도의 각 단계에서 설명된 기능을 수행하는 인스트럭션 수단을 내포하는 제조 품목을 생산하는 것도 가능하다. 컴퓨터 프로그램 인스트럭션들은 컴퓨터 또는 기타 프로그램 가능한 데이터 프로세싱 장비 상에 탑재되는 것도 가능하므로, 컴퓨터 또는 기타 프로그램 가능한 데이터 프로세싱 장비 상에서 일련의 동작 단계들이 수행되어 컴퓨터로 실행되는 프로세스를 생성해서 컴퓨터 또는 기타 프로그램 가능한 데이터 프로세싱 장비를 수행하는 인스트럭션들은 흐름도의 각 단계에서 설명된 기능들을 실행하기 위한 단계들을 제공하는 것도 가능하다.
또한, 각 단계는 특정된 논리적 기능(들)을 실행하기 위한 하나 이상의 실행 가능한 인스트럭션들을 포함하는 모듈, 세그먼트 또는 코드의 일부를 나타낼 수 있다. 또, 몇 가지 대체 실시예들에서는 단계들에서 언급된 기능들이 순서를 벗어나서 발생하는 것도 가능함을 주목해야 한다. 예컨대, 잇달아 도시되어 있는 두 개의 단계들은 사실 실질적으로 동시에 수행되는 것도 가능하고 또는 그 단계들이 때때로 해당하는 기능에 따라 역순으로 수행되는 것도 가능하다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 품질에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 균등한 범위 내에 있는 모든 기술사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (16)

  1. 3차원 이미징 시스템에 있어서,
    컴퓨터 프로그램을 수행하는 명령어를 저장하는 메모리;
    상기 명령어를 수행하는 프로세서;
    빛이 발생하도록 구성되는 광원; 및
    상기 광원에서 발생되는 빛이, 형광 입자로 표지된 샘플에 조사되도록 하는 광경로를 형성하고, 상기 광경로를 통해 전달되는 빛이 상기 형광 입자로 표지된 샘플이 위치한 미리 설정된 영역에 광초점이 형성되도록 하고, 상기 광초점에 조사된 빛에 의해 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호를 측정하는 비선형 현미경 장치
    를 포함하되,
    상기 프로세서에 의해 상기 명령어가 실행되면, 상기 프로세서는,
    상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호와 상기 광초점의 위치를 기반으로 3차원 영상을 생성하고,
    상기 광원은 연속파동을 가지는 빛이 발생하도록 구성되는 연속파동 레이저를 출력하고,
    상기 형광 입자는 상기 연속파동을 가지는 빛에 의해 비선형 광학 반응을 나타내는 형광 입자인 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미리 설정된 영역은,
    상기 형광 입자로 입사되는 여기(excitation) 빛의 세기 대비 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기를 기반으로 설정되는 영역인 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 시스템.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 미리 설정된 영역은,
    상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기가 상기 형광 입자로 입사되는 여기 빛의 세기와 비선형 관계를 갖는 영역인 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 광원에서 발생되는 빛의 파장은 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 파장보다 긴 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 시스템.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 형광 입자는,
    란탄족 이온이 도핑된 상향변환 입자인 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 시스템.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 비선형 현미경 장치는,
    상기 광경로를 조절하는 복수개의 렌즈;
    상기 복수개의 렌즈를 통해 전달된 광이, 상기 미리 설정된 영역에 상기 광초점을 형성하기 위한 대물렌즈;
    상기 광초점의 위치를 조절하는 위치 조절부;
    상기 비선형 형광 입자에서 방출되는 형광 신호를 필터링하기 위한 형광 필터링부; 및
    상기 필터링된 형광 신호를 측정하기 위한 신호 측정부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 시스템.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 위치 조절부는,
    적어도 하나의 거울을 포함하고,
    상기 프로세서는,
    상기 적어도 하나의 거울의 위치를 제어하여 상기 광초점의 수평 위치를 조절하고,
    상기 대물렌즈 및 상기 샘플이 놓이는 스테이지 중 적어도 하나를 제어하여, 상기 광초점의 수직 위치를 조절하는,
    3차원 이미징 시스템.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 프로세서는,
    상기 광초점의 위치 별로 해당 위치에서 측정된 형광 신호를 대응시켜 상기 3차원 영상을 생성하는 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 시스템.
  9. 비선형 현미경을 이용한 3차원 이미징 방법에 있어서,
    미리 설정된 영역 내에서 광초점이 형성되도록 설정하여, 광원에서 발생되는 빛을 형광 입자로 표지된 샘플에 조사하는 단계;
    상기 광초점에서 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호를 측정하는 단계; 및
    상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기 정보와 상기 광초점의 위치 정보를 제공하는 단계를 포함하되,
    상기 광원은 연속파동을 가지는 빛이 발생하도록 구성되는 연속파동 레이저를 출력하고,
    상기 형광 입자는 상기 연속파동을 가지는 빛에 의해 비선형 광학 반응을 나타내는 형광 입자인 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 미리 설정된 영역은,
    상기 형광 입자로 입사되는 여기 빛의 세기 대비 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기를 기반으로 설정되는 영역인 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 미리 설정된 영역은,
    상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기가 상기 형광 입자로 입사되는 여기 빛의 세기와 비선형 관계를 갖는 영역인 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 광원에서 발생되는 빛의 파장은 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 파장보다 긴 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 비선형 형광 입자는,
    란탄족 이온이 도핑된 상향변환 입자인 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 측정하는 단계 이후에,
    상기 미리 설정된 영역 내에서 상기 광초점의 위치를 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 생성하는 단계 이후에,
    상기 형광 신호의 세기 정보와 상기 광초점의 위치 정보를 기반으로 상기 광초점의 위치 별로 해당 위치에서 측정된 형광 신호를 대응시켜 3차원 영상을 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 이미징 방법.
  16. 컴퓨터 프로그램을 저장하고 있는 컴퓨터 판독 가능 기록매체로서,
    상기 컴퓨터 프로그램은, 프로세서에 의해 실행되면,
    미리 설정된 영역 내에서 광초점이 형성되도록 설정하여, 광원에서 발생되는 빛을 형광 입자로 표지된 샘플에 조사하는 단계와,
    상기 광초점에서 상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호를 측정하는 단계와,
    상기 형광 입자로부터 방출되는 형광 신호의 세기 정보와 상기 광초점의 위치 정보를 제공하는 단계를 포함하는 비선형 현미경을 이용한 3차원 이미징 방법을 상기 프로세서가 수행하도록 하기 위한 명령어를 포함하되,
    상기 광원은 연속파동을 가지는 빛이 발생하도록 구성되는 연속파동 레이저이고,
    상기 형광 입자는 상기 연속파동을 가지는 빛에 의해 비선형 광학 반응을 나타내는 형광 입자인 것을 특징으로, 컴퓨터 판독 가능 기록매체.
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